CN113388636B

CN113388636B - 一种外源基因瞬时转化杨树茎段的方法

Info

Publication number: CN113388636B
Application number: CN202110406728.4A
Authority: CN
Inventors: 卢孟柱; 安轶; 李晓军
Original assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Current assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Priority date: 2021-04-15
Filing date: 2021-04-15
Publication date: 2022-12-09
Anticipated expiration: 2041-04-15
Also published as: CN113388636A

Abstract

本发明公开了一种外源基因瞬时转化杨树茎段的方法，本发明建立了高效农杆菌介导的银腺杨84K茎段真空渗透侵染瞬时转化方法。本方法在不破坏植物材料的基础上，可快速、便捷、高效地获得瞬时转化材料，特别有助于研究维管组织发育相关基因。可快速鉴定参与维管组织分化相关基因的功能，有助于揭示木质部发育的调控机制，对揭示木材形成的分子机制有重要意义，同时该方法也为研究其它木本植物的木材形成相关基因提供了借鉴。

Description

一种外源基因瞬时转化杨树茎段的方法

技术领域

本发明涉及植物基因瞬时转化技术领域，具体地，涉及一种外源基因瞬时转化杨树茎段的方法。

背景技术

杨树(Populus L.)是主要造林树种之一，是目前再生生物资源和森林碳汇的重要组分，具有重要的经济和生态价值。另外，杨树生长快、适应性强、成材早、木材蓄积量大，且遗传背景丰富、易于无性化扩繁和遗传转化，成为木本植物研究的模式物种。随着毛果杨(Populus trichocarpa)、胡杨(Populus euphratica)、新疆杨(Populus bolleana)、银腺杨84K(Populus alba×Populus glandulosa‘84K’)全基因组测序的完成，为利用杨树这一木本模式植物功能基因组的研究提供了基础。对木本植物来说，高大的树体需要庞大的维管组织来支撑、同时进行水分和营养物质的运输。木材就是这些庞大的维管组织的产物，来源于维管形成层的活动。所以了解维管形成层活动的调控机制及木质部的分化是现代生物技术对木材进行遗传改良的基础。但获得稳定转基因植株的效率低、周期长，这些限制阻碍了对木本植物木材相关基因功能的大规模高效率鉴定。因此，建立一种快速、便捷、高效的方法，用以揭示木材形成分子机制，变得尤为重要。

瞬时转化技术可以避开冗长的转基因过程，只需将目的基因导入组织或个体，不涉及再生过程，转化之后直接进行基因表达分析或表型鉴定，具有操作简单、周期短、通量高的优点，可作为稳定转化的补充，特别适合应用于植物自身或异源基因功能及代谢途径的大规模遗传研究，并且可对无性繁殖困难的木本植株及同源植物系统进行基因功能分析。近年来已有木本植物建立了瞬时转化体系，用于品种的选育与开发，基因枪转化、PEG介导原生质体转化、植物病毒载体介导转化和基于农杆菌介导的转化方法已成功应用于梨、柑橘、白桦、柽柳、软木、桑树、桂花、柿树、桃等。在杨树中，通过PEG介导法成功获得了瞬时转化的叶片原生质体(Tan B,Xu M,Chen Y,et al.2013.Transient expression forfunctional gene analysis using Populus protoplasts.Plant Cell Tissue&OrganCulture,114(1):11-18.；Guo Y,Song X,Zhao S,et al.2015.A transient geneexpression system in Populus euphratica Oliv.protoplasts prepared fromsuspension cultured cells.Acta Physiologiae Plantarum,37(8):1-8.)；通过基因枪转化法成功获得了瞬时转化的叶片表皮细胞和保卫细胞(Nowak K,Luniak N,Meyer S,etal.2004.Fluorescent proteins in poplar:a useful tool to study promoterfunction and protein localization.Plant Biology,6(1):65-73.)；通过农杆菌侵染技术获得了瞬时转化的叶片(Takata N,Eriksson M E.2012.A simple and efficienttransient transformation for hybrid aspen(Populus tremula x P.tremuloides).Plant Methods,8(1):30-30.)和芽(Yang L,Sun Y,Xie L,et al.2009.A novelapproach for in situ bud transformation of Populus byAgrobacterium.Scandinavian Journal of Forest Research,25(1):3-9.)，这都为木本植物的基因调控研究提供了快速可靠的技术支持。

但是，上述瞬时转化技术只局限于原生质体、离体的叶片或芽，其转化方法不适于以茎段为材料进行瞬时转化，不利于研究木本植物形成层活动和木质部分化相关基因的功能，限制了相关领域研究的进展。所以，缺乏一种适用于木本植物形成层活动和木质部分化相关基因研究的瞬时转化方法。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种外源基因瞬时转化杨树茎段的方法，本发明以银腺杨84K(P.alba×P.glandulos‘84K’)一年生休眠茎段为研究材料，通过水培观察，表明其具有典型的形成层活动和木质部分化。以人工增强型绿色荧光蛋白(eYGFP)基因作为报告基因，建立了农杆菌介导的真空渗透侵染茎段的转化体系，实现了在形成层区域的外源基因表达，为木材形成和生长发育相关基因的研究提供了一种快速、高效的转化方法，可以促进木本植物木材形成机制研究的发展。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

本发明不破坏茎段结构，未用超声波处理、未对表皮割伤操作，在不破坏植物材料的前提下，通过真空渗透侵染的方法，探索菌液浓度、真空渗透侵染时间、真空渗透侵染次数、侵染后水培天数等因素，建立了农杆菌介导的银腺杨84K茎段瞬时转化体系。该方法通过真空压力把农杆菌菌液从茎段下端抽至茎段上端，此操作方便快捷且可批量转化。常规下将茎段浸泡重悬液进入茎段需要几天时间，而本发明利用真空渗透法重悬液可在几分钟时间就进入茎段。此方法增加了84K茎段导管的运输能力和细胞的渗透性，使载体更容易进入植物细胞。侵染后的茎段切片观察结果表明报告基因eYGFP主要在在恢复活力的形成层区域中表达。说明相较于叶或芽等材料的其它的瞬时转化体系，本体系能提供形成层细胞相关基因的原位表达，这都有利于鉴定它们在形成层活动方面的作用。

实验结果表明，侵染后水培9至20天后目标基因的表达水平都较高，农杆菌转化后直接进行水培，15天之前休眠茎段的主要活动是形成层恢复活力，形成层层数和宽度都有所增加。如果研究的目标基因是参与形成层细胞活动，则可在15天之前进行形成层细胞的早期表型变化观察。而15天左右可观察到新形成的次生木质部。因此对研究木质部发育相关基因的功能，可在15天后再进行维管组织发育的表型变化观察。本体系的建立可以追踪木质部形成的全过程，所以可利用它研究形成层及木质部发育的相关基因功能，但需要注意观察分析时间。

因此本发明要求保护一种外源基因瞬时转化杨树茎段的方法，采用农杆菌介导真空渗透侵染方法进行杨树茎段的瞬时转化。

优选地，所述杨树为84K杨树。

优选地，包括以下步骤：

S1.重悬农杆菌菌体，得到侵染用菌液；

S2.将4～6℃保存的茎段在含20～30％蔗糖的1/2MS溶液中浸泡1～3h；

S3.将步骤S2浸泡过的茎段放入有侵染用菌液的容器中，茎段形态学下端浸入侵染用菌液中，形态学上端与抽真空装置的抽真空通路密封连接；即茎段形态学上端通过橡胶管与抽真空装置的抽真空通路的抽气口通过气管密封连接。

S4.抽真空处理，侵染用菌液从茎段形态学下端抽至形态学上端以侵染茎段；

S5.步骤S4转化完毕的茎段进行水培。

优选地，步骤S2中，将4℃低温保存的茎段在含25％蔗糖的1/2MS溶液中浸泡3h；

优选地，将活化后的农杆菌菌液按照体积比1:50～100接种于YEB液体培养基，27～29℃、200～250/min的振荡培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8。

更优选地，将活化后的农杆菌菌液按照体积比1:100接种于YEB液体培养基，28℃、200r/min的振荡培养至OD₆₀₀＝0.8。

优选地，步骤S1中用菌体悬浮液重悬活化后的农杆菌菌体，所述菌体悬浮液为含有20～30g/L蔗糖，5～10mmol/L MES，100～300μmol/L AS，pH值5.6～5.8的1/2MS。

更优选地，用菌体悬浮液重悬活化后的农杆菌菌体，所述菌体悬浮液为含有25g/L蔗糖，10mmol/L MES，200μmol/L AS，pH值5.6的1/2MS。

优选地，步骤S1中，侵染用菌液的OD值为0.3～1.5。

更优选地，步骤S1中，侵染用菌液的OD值为0.9。

优选地，步骤S4中，0.08MPa压强下，抽真空处理5到30分钟。

更优选地，步骤S4中，0.08MPa压强下，抽真空处理5到20分钟。

优选地，步骤S4中，抽真空处理1～5次，两次之间间隔1～3天。

更优选地，步骤S4中，抽真空处理2～4次，两次之间间隔3天。

优选地，步骤S5中，水培9～25天。

优选地，步骤S5中，水培12～20天。

进一步更优选地，步骤S1中，用菌体悬浮液重悬活化后的农杆菌菌体，得到OD值为0.9的侵染用菌液，所述菌体悬浮液为含有25g/L蔗糖，10mmol/L MES，200μmol/L AS，pH值5.6的1/2MS；步骤S4中，抽真空处理2～4次，两次之间间隔3天，0.08MPa压强下，抽真空处理20分钟；步骤S5中，水培12～20天。

最优选地，步骤S1中，用菌体悬浮液重悬活化后的农杆菌菌体，得到OD值为0.9的侵染用菌液，所述菌体悬浮液为含有25g/L蔗糖，10mmol/L MES，100～300μmol/L AS，pH值5.6的1/2MS；步骤S4中，抽真空处理2次，两次之间间隔3天，0.08MPa压强下，抽真空处理20分钟；步骤S5中，水培15天。

以上任一所述方法得到的瞬时转化杨树茎段。

优选地，所用的农杆菌能够表达报告基因蛋白。

所述报告基因为一个分子生物学概念，它是指一类在细胞、组织/器官或个体处于特定情况下会表达并使得他们产生易于检测、且实验材料原本不会产生的性状的基因，该基因序列可以插入到基因表达调节序列(如启动子、增强子)之后形成嵌合基因，或与其他目的基因序列相连接形成融合蛋白的基因序列，进而通过检测该报告基因的表达来定性或定量测定目的基因的表达情况。

所述报告基因包括但不限于，β-葡萄糖苷酸酶基因、荧光素酶、荧光蛋白等。

更优选地，所述所用的农杆菌能够表达荧光蛋白

所述的瞬时转化杨树茎段作为研究木本植物维管束组织相关基因中的模型的应用，也属于本发明的保护范围。

所述模型用于相较于其它的叶或芽等材料的瞬时转化体系，本体系能提供形成层细胞相关基因的原位表达，这都有利于鉴定它们在形成层活动方面的作用。

相较于其它的叶或芽等材料的瞬时转化体系，本体系能提供形成层细胞相关基因的原位表达，这都有利于鉴定它们在形成层活动方面的作用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明建立了高效农杆菌介导的银腺杨84K茎段真空渗透侵染瞬时转化方法。本方法在不破坏植物材料的基础上，可快速、便捷、高效地获得瞬时转化材料，特别有助于研究维管组织发育相关基因。可快速鉴定参与维管组织分化相关基因的功能，有助于揭示木质部发育的调控机制，对揭示木材形成的分子机制有重要意义，同时该方法也为研究其它木本植物的木材形成相关基因提供了借鉴。

附图说明

图1为室温水培解除休眠后茎段形成层的活动和木质部分化。

图2为pK2GW7-eYGFP表达载体示意图。

图3为分别对不带载体，带有pK2GW7和带有pK2GW7-eYGFP的三种GV3101农杆菌菌液本底表达的观察，标尺＝100μm。

图4为不同因素对84K茎段真空渗透转化的影响；A：乙酰丁香酮对转化率的影响；B：菌液浓度对转化率的影响；C：侵染时间对转化率的影响；D：侵染次数对转化率的影响；E：培养天数对转化率的影响。每个处理至少3次重复，每个重复至少6个茎段(P<0.05；ANOVA)。

图5为84K杨茎段eYGFP表达情况观察；A：正常光下茎段情况(对照为pK2GW7农杆菌侵染茎段；样品为pK2GW7-eYGFP农杆菌侵染茎段)；B：激发光照射后茎段形成层区域eYGFP表达情况；C：正常光下茎段横截面情况；D：荧光照射后茎段横截面情况；标尺＝1cm。

图6为瞬时转化后eYGFP在不同部位的表达情况；A：周皮、皮层、韧皮部；B：形成层区域；C：木质部；D：髓；E：髓射线；标尺＝50μm。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

于2019年11月，在河北任丘中国林业科学研究院林业研究所试验基地，采集了一年生银腺杨无性系84K休眠期枝条。截取直径约1cm，长度约10cm的茎段，封口膜包裹茎段两端以防止失水，并低温(4℃)保存。

实施例1解除休眠后茎段形成层的活动及木质部分化的观察

一、实验方法

将尚未转化的休眠茎段从低温环境取出，将其垂直培养在水中。对水培0、5、10、15、20、25、30d的茎段1/2处进行切片(40μm，LEICA VT1200S)、20倍数显微镜下观察形成层活动(LEICA DM6)。培养条件为：16h光照/8h黑暗，23～25℃，光照强度50μmol m^-2s^-1。

二、实验结果

对休眠的茎段进行水培。如图1A所示，培养0天时，形成层排列紧密，呈皱缩状；随着培养天数增加，第5天时的形成层细胞吸水逐渐恢复扁平状态，形成层宽度和层数较0天时变化不显著(图1B，1C)；培养10天时，形成层层数显著增加，宽度增加不显著；培养15天时，可观察到新形成的次生木质部，相较之前形成的木质部细胞，其细胞壁较薄。其中可见体积膨大的细胞，为新形成的导管。随着培养天数增加，新形成的次生木质部区域逐渐增加，并伴随着大量新导管产生。培养20天至30天期间，形成层宽度增加显著，层数为5或6层。这表明一个月内水培休眠枝条可以模拟正常木材形成过程，新生的木质部细胞与前期形成的木质部没有显著差异。

实施例1表达载体pK2GW7-eYGFP的构建和根癌农杆菌转化及鉴定

一、实验方法

首先根据Chin等(2018)所用载体，克隆载体中eYGFP表达序列：35S-COR47-5’-UTR-eYGFP-HSP-T878(1991bp)，并通过酶切位点StuI，使用同源重组方法将此序列构建到pK2GW7载体中(pK2GW7载体由浙江农林大学韩潇博士惠赠)。

引物为：

F1(5’-CTGACCCACAGATGGTTAGAGAGGTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATTT-3’)，R1(5’-GATGAGACCTGCCGCGTAGGTGTGTACAGATATATGTTGAATTATTGA-3’)。

转化大肠杆菌后，在含壮观霉素(50mg/L)的LB固体培养基中培养12h，挑选阳性单克隆进行PCR鉴定。

鉴定引物为F2(5’-CAGATGGTTAGAGAGGTGAGACTTTT-3’)和R2(5’-GACCTGCCGCGTAGGTGTGTACAGATAT-3’)。

二、实验结果

鉴定成功后得到重组载体质粒pK2GW7-eYGFP，其载体示意图如图2所示。

实施例3重组质粒转化农杆菌

一、实验方法

采用冻融转化法，将实施例2制备得到的含eYGFP基因的双元重组载体质粒pK2GW7-eYGFP和空表达载体质粒pK2GW7分别转入农杆菌GV3101，感受态细胞中，然后将农杆菌于固体LB培养基(50mg/L壮观霉素)上培养2d，培养温度为28℃。挑取单克隆进行PCR检测。

挑取检测阳性的农杆菌单克隆于2mLYEB(50mg/L利福平和50mg/L壮观霉素)液体培养基中过夜培养16～20h，28℃，200r/min。然后按1:100(v/v)的比例取活化菌液接种于200mL YEB液体培养基(50mg/L利福平和50mg/L壮观霉素)中，并置于28℃、200r/min的摇床内过夜，摇菌至OD₆₀₀＝0.8。分别对未转化质粒、转化质粒pK2GW7、转化质粒pK2GW7-eYGFP的三种GV3101农杆菌菌液，在激光共聚焦显微镜(ZEISS，LSM 880)下观察。

二、实验结果

结果如图3所示，不带载体的农杆菌菌液、转化质粒pK2GW7、转化质粒pK2GW7-eYGFP的三种GV3101农杆菌菌液，在激光共聚焦显微镜(ZEISS，LSM 880)下观察，均未发现任何信号，故排除农杆菌本底表达的影响。

实施例4不同因素对84K茎段真空渗透转化的影响

一、实验方法

收集实施例3制备的转化了pK2GW7或pK2GW7-eYGFP质粒的GV3101农杆菌菌体，菌体用重悬液(1/2MS，25g/L蔗糖，10mmol/L MES，200μmol/L AS，pH值5.6)重悬到一定浓度。转化前将低温保存的84K茎段在含25％蔗糖的1/2MS溶液中浸泡3h。将浸泡过的茎段竖直放入装有重悬液的三角瓶中，茎段形态学下端浸入重悬液中，形态学上端与真空仪器通过橡胶管连接，在真空压力作用下，三角瓶中的重悬液从茎段下端吸至茎段上端，在0.08MPa压强下，悬浮液从茎段形态学下端被抽滤至形态学上端，进行真空渗透侵染，侵染完毕的茎段进行水培，培养条件为：16h光照/8h黑暗，23～25℃，光照强度50μmol m^-2s^-1。

选择了影响农杆菌介导的84K杨茎段瞬时转化效率的转化因子进行研究：重悬液中的乙酰丁香酮(AS)浓度(100、200、300μmol/L)、重悬液的农杆菌浓度(OD₆₀₀为0.3、0.6、0.8、0.9、1.2)、真空渗透侵染时间(5、10、15、20、25、30min)、真空渗透侵染次数(1、2、3、4、5次，每两次侵染间隔3天)、侵染后培养时间(3、6、9、12、15、25、30天)。所有因子均设某单一因素为变量进行筛选，以报告基因eYGFP瞬时表达反映各因素对瞬时转化率的影响，每个处理3次重复，每个重复至少6个茎段(P<0.05；ANOVA)。

转化后的84K杨茎段可用LUYOR-3415RC手持荧光灯进行eYGFP初步观察分析。在茎段1/2处进行切片，切片厚度为40μm，并使用共聚焦显微镜(ZEISS，LSM 880)在493～558nm的蓝色激发光下观察荧光信号。统计观察到的eYGFP荧光信号，计算瞬时转化率。

其中，瞬时转化率＝观察到eYGFP绿色荧光信号的茎段数目/总转化茎段数目

二、实验结果

1、当其他转化因子相同的情况下(农杆菌浓度OD₆₀₀为0.8时进行瞬时转化，真空渗透侵染时间15min，真空渗透侵染2次。每两次侵染间间隔3天，侵染后培养12天)，添加AS与不添加AS相比，eYGFP基因瞬时转化效率明显增加。当AS浓度为100、200、300μmol/L时，转化效率无显著变化(图4A)。故添加AS进行后续试验，选择AS浓度为200μmol/L。

2、当其他转化因子相同的情况下(重悬液中的乙酰丁香酮(AS)浓度200μmol/L，真空渗透侵染时间15min，真空渗透侵染2次。每两次侵染间间隔3天，侵染后培养12天)，农杆菌浓度OD₆₀₀为0.3时瞬时转化eYGFP基因成功率最低，随着农杆菌浓度增加，转化率增加；当农杆菌浓度OD₆₀₀增加到0.9时，瞬时转化效率达到最高。随着农杆菌浓度进一步提高到1.2或1.5时，转化效率降低(图4B)。说明菌液浓度过高或过低均会影响转化效率。农杆菌浓度过高，加快了茎段的腐烂速度，导致茎段生理状态较差从而影响转化率。

3、如图4C所示，当其他转化因子相同的情况下(农杆菌浓度OD₆₀₀为0.9时进行瞬时转化，重悬液中的乙酰丁香酮(AS)浓度200μmol/L，真空渗透侵染2次。每两次侵染间间隔3天，侵染后培养12天)，瞬时转化率在真空渗透侵染时间5～15min时较低，在达到20min时显著增加，在延长到30min时反而下降。表明，真空渗透侵染达到一定时间后处于侵染饱和状态，抽吸时间过长反而引起茎段结构损伤，影响转化率。

4、当其他转化因子相同的情况下(农杆菌浓度OD₆₀₀为0.9时进行瞬时转化，重悬液中的乙酰丁香酮(AS)浓度200μmol/L，真空渗透侵染时间20min，每两次侵染间间隔3天，侵染后培养12天)，随着真空渗透侵染次数增加(每两次真空渗透侵染间隔72h)，转化率呈现出先增后降的趋势。当用农杆菌重悬液真空渗透侵染2次时，瞬时转化率最高；减少或增加真空渗透侵染次数，转化率未显著增加；且当真空渗透侵染5次时的瞬时转化率最低(图4D)。表明真空渗透侵染会不同程度地损伤茎段，抽吸次数越多损伤越大，导致转化率越低。

5、当其他转化因子相同的情况下(农杆菌浓度OD₆₀₀为0.9时进行瞬时转化，重悬液中的乙酰丁香酮(AS)浓度200μmol/L，真空渗透侵染时间20min，真空渗透侵染2次，每两次侵染间间隔3天)，真空渗透侵染后，将茎段进行水培。结果如图4E所示，水培天数对瞬时转化率也有较大影响。当水培天数较短时，如3和6天，均观察不到绿色荧光信号。当培养到第9天时，则可观察到绿色荧光。水培至12天时瞬时转化率最高。随后，随培养时间增加，转化率降低。

实施例5农杆菌介导的84K杨茎段瞬时转化因子正交试验

一、实验方法

不同因素正交实验以选择最优的因子组合。以eYGFP瞬时转化率为考察指标，采用L₉(3⁴)正交实验进行试验设计(表1)。正交试验每个处理3次重复，每个重复至少6个茎段。采用SPSS17.0软件对数据进行分析。

二、实验结果

根据上述单因素试验结果，通过L₉(3⁴)的正交试验设计(表1)，共进行了9组不同水平处理的转化因子组合试验。表明水培天数、真空渗透侵染时间均对eYGFP瞬时转化率有显著影响(P<0.05)，即水培天数和真空渗透侵染时间显著影响农杆菌介导银腺杨84K茎段瞬时转化率，而菌液浓度和真空渗透侵染次数的影响不显著(表2)。4个因素对转化率的影响为：侵染后水培天数>真空渗透侵染时间>菌液浓度>真空渗透侵染次数。

表1：84K杨茎段瞬时转化因子正交实验设计(均值±标准误)

表2：转化因子正交试验eYGFP瞬时表达方差分析

实施例6转化后的茎段维管组织发育情况

一、实验方法

实施例5正交实验第5号瞬时转化法，瞬时转化后进行水培的茎段，按照实施例1的方法经切片显微观察，维管组织发育情况。

二、实验结果

瞬时转化后进行水培，经切片显微观察，维管组织发育情况与休眠茎段水培的维管组织发育情况类似。形成层细胞从最初的皱缩状恢复到扁平状，形成层层数也随之增加，培养15天可观察到新形成的次生木质部细胞。瞬时转化后的茎段维管发育也可追踪从形成层活动到木质部形成的全过程。84K杨茎段瞬时转化后水培15天时的eYGFP表达情况初步观察如图5所示。图5A为正常光下茎段整体情况，茎段下部剥掉部分树皮，露出形成层区域。经激发光照射在已转化的茎段形成层区域可观察到eYGFP绿色荧光信号(图5B中红箭头所示)，红色为自发荧光。正常光下茎段横截面如图5C所示，照射激发光后在茎段横截面上也可观察到明显的eYGFP绿色荧光信号(图5D)。

为进一步明确84K茎段转化后eYGFP绿色荧光信号具体部位，对茎段1/2处进行切片观察。通过共聚焦显微镜观察不同部位eYGFP的表达情况，表明在周皮、皮层、韧皮部、木质部、髓中未观察到绿色荧光信号(图6A，C，D)。而在形成层区域细胞中可观察到较多的绿色荧光信号(图6B)，同时在髓射线中也可观察到较少的微弱荧光信号(图6E)。结果显示瞬时转化后eYGFP的表达主要集中在形成层区域。说明外源基因可以在形成层细胞中表达，有利于鉴定它们在形成层活动及分化为木质部中的作用。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims

1.一种外源基因瞬时转化银腺杨无性系84k杨树茎段的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.利用菌体悬浮液重悬活化后的农杆菌菌体，得到侵染用菌液；所述菌体悬浮液为含有25 g/L蔗糖，10 mmol/L MES，200 μmol/L AS，pH值为5.6的1/2MS；

S2.将4～6℃保存的茎段在含20～30%蔗糖的1/2MS溶液中浸泡1～3h；

S3.将步骤S2浸泡过的茎段放入有侵染用菌液的容器中，茎段形态学下端浸入侵染用菌液中，形态学上端与抽真空装置的抽真空通路密封连接；即茎段形态学上端通过橡胶管与抽真空装置的抽真空通路的抽气口通过气管密封连接；

S5.步骤S4转化完毕的茎段进行水培。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，侵染用菌液的OD值为0.3～1.5。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4中，0 .08MPa压强下，抽真空处理5到30分钟。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4中，抽真空处理1～5次，两次之间间隔1～3天。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S5中，水培9～25天。