CN117402906A - 一种借助细胞穿透肽建立杉木外源基因高效瞬时转化体系的方法 - Google Patents
一种借助细胞穿透肽建立杉木外源基因高效瞬时转化体系的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117402906A CN117402906A CN202311340157.4A CN202311340157A CN117402906A CN 117402906 A CN117402906 A CN 117402906A CN 202311340157 A CN202311340157 A CN 202311340157A CN 117402906 A CN117402906 A CN 117402906A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fir
- gene
- tac3
- cell penetrating
- penetrating peptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000009466 transformation Effects 0.000 title claims abstract description 56
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 54
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 45
- 102000020313 Cell-Penetrating Peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 26
- 108010051109 Cell-Penetrating Peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 26
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 title claims abstract description 22
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims abstract description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 17
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 238000003208 gene overexpression Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims abstract description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 51
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 7
- 239000002023 wood Substances 0.000 claims description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 6
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 5
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 244000050510 Cunninghamia lanceolata Species 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 9
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 abstract 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 101150100415 Tac3 gene Proteins 0.000 description 12
- 230000006870 function Effects 0.000 description 11
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 9
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 8
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 8
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 8
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 7
- 101000655188 Homo sapiens Tachykinin-3 Proteins 0.000 description 7
- 102100033009 Tachykinin-3 Human genes 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 241000219000 Populus Species 0.000 description 3
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 3
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 3
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 3
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N (+)-Abscisic acid Chemical compound OC(=O)/C=C(/C)\C=C\[C@@]1(O)C(C)=CC(=O)CC1(C)C JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- 241000207199 Citrus Species 0.000 description 2
- 241000218631 Coniferophyta Species 0.000 description 2
- 235000000100 Hibiscus rosa sinensis Nutrition 0.000 description 2
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 2
- 244000070406 Malus silvestris Species 0.000 description 2
- 244000183278 Nephelium litchi Species 0.000 description 2
- 244000025272 Persea americana Species 0.000 description 2
- 235000008673 Persea americana Nutrition 0.000 description 2
- 244000007021 Prunus avium Species 0.000 description 2
- 235000010401 Prunus avium Nutrition 0.000 description 2
- 240000008254 Rosa chinensis Species 0.000 description 2
- 235000000664 Rosa chinensis Nutrition 0.000 description 2
- 235000016785 Rosa della China Nutrition 0.000 description 2
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 101100010912 Arabidopsis thaliana ERF109 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000167549 Aralia chinensis Species 0.000 description 1
- 244000274847 Betula papyrifera Species 0.000 description 1
- 235000009113 Betula papyrifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000009109 Betula pendula Nutrition 0.000 description 1
- 235000010928 Betula populifolia Nutrition 0.000 description 1
- 235000002992 Betula pubescens Nutrition 0.000 description 1
- 241000186690 Cupressales Species 0.000 description 1
- 235000001950 Elaeis guineensis Nutrition 0.000 description 1
- 244000127993 Elaeis melanococca Species 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 1
- 235000019687 Lamb Nutrition 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000218378 Magnolia Species 0.000 description 1
- 235000015103 Malus silvestris Nutrition 0.000 description 1
- 240000000249 Morus alba Species 0.000 description 1
- 235000008708 Morus alba Nutrition 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 244000170916 Paeonia officinalis Species 0.000 description 1
- 235000006484 Paeonia officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 240000005809 Prunus persica Species 0.000 description 1
- 235000006040 Prunus persica var persica Nutrition 0.000 description 1
- 241000220324 Pyrus Species 0.000 description 1
- 235000011400 Pyrus pyrifolia Nutrition 0.000 description 1
- 244000079529 Pyrus serotina Species 0.000 description 1
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000124033 Salix Species 0.000 description 1
- 244000234281 Tamarix gallica Species 0.000 description 1
- 235000014265 Tamarix gallica Nutrition 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 244000153888 Tung Species 0.000 description 1
- 240000004922 Vigna radiata Species 0.000 description 1
- 235000010721 Vigna radiata var radiata Nutrition 0.000 description 1
- 235000011469 Vigna radiata var sublobata Nutrition 0.000 description 1
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 1
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 1
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 1
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000021016 apples Nutrition 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000007799 cork Substances 0.000 description 1
- 230000007797 corrosion Effects 0.000 description 1
- 238000005260 corrosion Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- FCRACOPGPMPSHN-UHFFFAOYSA-N desoxyabscisic acid Natural products OC(=O)C=C(C)C=CC1C(C)=CC(=O)CC1(C)C FCRACOPGPMPSHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 231100000722 genetic damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015784 hyperosmotic salinity response Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 235000021017 pears Nutrition 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000004260 plant-type cell wall biogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 230000032361 posttranscriptional gene silencing Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 229910052902 vermiculite Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019354 vermiculite Nutrition 0.000 description 1
- 239000010455 vermiculite Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种借助细胞穿透肽建立杉木外源基因高效瞬时转化体系的方法。所述方法包括以下步骤：1）构建杉木TAC3基因过表达载体；2）制备转染培养液；3）杉木幼苗全株真空侵染；4）侵染后杉木幼苗避光孵育；5）转化植株的转基因鉴定。本发明利用细胞穿透肽的穿膜功能，将外源基因携带至杉木中，进而在杉木中表达转入的基因。该方法为杉木功能基因组学研究奠定了方法基础。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，为快速获得目标基因的表达，旨在建立一种高效的外源基因瞬时表达系统，具体涉及一种借助细胞穿透肽建立杉木外源基因高效瞬时转化体系的方法。
背景技术
近年来，功能基因组学以及基因修饰技术的发展为木本植物的定向培育提供了广阔空间，遗传转化体系是植物基因工程的核心，也是进行植物改良与精确育种的重要途径。稳定的遗传转化对植物自身生长和繁殖特性要求比较严格，且转化时间长，效率低，不能满足当下快速鉴定相关基因功能、了解未知代谢途径以及进行人工调控的需求，而瞬时转化技术作为一种高效便捷的手段，已被越来越多的应用于木本植物相关基因功能研究。现有的瞬时转化技术主要包括以下几种：
1)粒子轰击转化
利用粒子轰击构建的瞬时转化体系在油棕、月季、荔枝、鳄梨等木本植物中都有研究应用。试验结果证明，月季瞬时转化效率受品种、组织类型及生理状态影响，与DNA含量、金粒数量及大小无关，在花瓣中轰击效果较好，而在瞬时转化荔枝胚性组织时，金粉用量、质粒DNA用量等理化参数显著影响GUS瞬时表达。鳄梨胚性愈伤组织瞬时表达水平受DNA量影响但与粒子类型联系不大。除了上述影响因子外，气体压力、轰击距离与次数，以及外植体的状态也与转化效率息息相关，如海枣体细胞胚的转化。虽然粒子轰击法转化植物组织范围较广，并且可以多基因同时转化表达，但此方法不仅需要精确的专用轰击设备，而且对操作手法与技术要求较高，费用昂贵，不适合高通量基因转化研究。
2)PEG介导原生质体转化
聚乙二醇介导原生质体瞬时表达技术已在杨树、甜樱桃、葡萄、油桐、木兰等多种木本植物的遗传转化中得到应用，其影响因素主要包括分离原生质体过程中的酶解溶液、溶液pH和酶解时间，转化过程中原生质体质量、质粒DNA量、PEG浓度、处理时长和制备原生质体所用悬浮细胞的状态等。由于该方法的处理对象是单个细胞，方便对植物细胞内基因的瞬时转化情况进行观察，并且可以直观了解基因产物具体在哪种细胞器中表达。但由于原生质体的获得需要经过质壁分离，细胞在处理过程中脆弱易受伤害，转化率不高。利用原生质体进行转化，不仅很难形成再生植株，而且也无法研究那些与细胞壁合成、细胞间互作、生长发育相关的基因，因此应用范围有限。
3)植物病毒载体介导转化
植物病毒载体介导的瞬时转化技术旨在将携带外源基因的植物病毒载体质粒导入受体细胞，从而进行表达分析。该方法利用病毒进入各种类型细胞且可以大量复制的特点，提高了外源基因在植物细胞中的表达量，并且可以通过提取病毒颗粒表面的外源基因表达产物进行分析，简单直接。另外，RNA病毒能够在植物细胞内形成双链RNA中间体进行RNA干扰，从而抑制相关基因表达来反向证明基因功能。如PaCYP724B1对甜樱桃枝条分枝的调控作用、脱落酸与柑橘矮化的关系、PbrNHX2基因与杜梨耐盐性的联系、枳ERF109调节抗寒性的途径以及牡丹基因功能的鉴定等。此方法在近年来木本植物基因功能的研究中十分流行，但目前可作为转化载体的病毒种类相对来说仍然不多。
4)农杆菌介导转化
农杆菌介导的瞬时转化技术具有快速便捷、可批量转化、成本低、效果佳等优点。其原理是将已插入目的基因的载体转化到农杆菌中，再将利用农杆菌配制的侵染缓冲液通过各种方法导入植物细胞并进行瞬时表达，整个过程只需要几天时间。其具体步骤包括载体构建、农杆菌培养、侵染转化、瞬时表达，其中侵染转化的方法有直接注射法、真空渗透法、菌液浸染法、真空渗透与超声波相互结合辅助转化。除了利用植物叶片、叶柄、花瓣、茎尖、茎段、愈伤组织、上胚轴节段、体细胞胚等作为外植体外，目前木本植物如苹果、柑橘、梨、桃等还可用果肉进行瞬时遗传转化；桑树、新疆野苹果、白桦、杨树、柽柳、软木、柳树、楤木可以浸泡完整植株来进行瞬时转化。虽然农杆菌介导的方法目前是实际的植物转化，但它们仍然有一些关键的限制，包括需要昂贵的设备、基因损伤风险、转化效率低的限制、转基因大小的限制以及适用植物类型(物种和/或组织)的限制。对植物自身生长和繁殖特性要求比较严格，且转化时间长，效率低，不能满足当下快速鉴定相关基因功能、了解未知代谢途径以及进行人工调控的需求。
5)基于肽的基因递送系统
基于肽的基因递送系统已经被研究并作为动物细胞潜在的新基因载体受到了广泛关注。然而，对于植物细胞来说，这项新技术仍处于早期阶段，有几项研究报道了使用细胞穿透肽(CPPs)将质粒DNA(pDNA)递送到透化的小麦胚、绿豆和大豆根中，以及其他使用双链RNA在烟草悬浮细胞中诱导转录后基因沉默的研究。基于肽的基因递送系统的潜在优势在于，与农杆菌介导的递送不同，它不受待转化植物类型或转基因大小的限制。但另一方面，基于肽的基因载体穿过细胞壁的渗透性和转染效率还没有被充分量化。
随着当今木本植物全基因组及转录组测序研究地不断深入，越来越多的与表型相关的候选基因被克隆出来，但是受遗传转化效率低的限制，这些基因的功能分析受到了很大阻碍。瞬时转化技术具有简单、稳定、通量高的优点，特别适合应用于植物自身或异源基因功能以及代谢途径的大规模遗传研究，并且使得利用同源系统植物的瞬时表达进行基因功能分析成为可能，而不是仅仅用草本模式植物进行各种木本植物基因功能的鉴定。木本植物具有杂合度高、育种时间长、转化效率低等特点，不能快速获得大量转基因植株，且仍有相当大一部分木本植物再生过程艰难，遗传改良受到限制。
杉木[Cunninghamia Lanceolata(Lamb)]又名沙木，属柏目，杉科乔木，属喜光树种，生长速度快且生产量大，对干旱贫瘠的环境适应能力强，在福建省主要分布在海拔800m以下的山地丘陵，杉木生长快、产量高、材质好、用途广。其木材纹理通直且含有“杉脑”，有香气且可以抗虫耐腐，加工容易，品质优良，装饰用材，也是优质的纸浆用材和器具加工行业的首选材料,是我国最重要的商品材树种之一。《本草纲目》中介绍了杉木的材、皮、叶、子都可入药。杉木不仅提高了人们的生活水平，还可促进我国经济的发展,调节当地的气候。
原生质体作为细胞组成的一个形态结构单位，是没有细胞壁包被的裸露细胞，由于没有细胞壁，可以作为遗传转化的理想材料，原生质体转化的原理是通过改变细胞膜的通透性来导入外源基因，从而实现瞬时表达或进行长期表达得到转基因细胞团或转基因植株。在一些木本植物中，已可以成功的分离纯化得到原生质体，但是绝大部分的木本植物原生质体的分离纯化体系还尚未成熟，即使在已有相关报道中转化效率较好的杨树也才达到30％的转化效率。杉木作为主要的木本植物，同样也是典型的裸子植物，建立杉木的瞬时转化体系是高效进行杉木基因功能研究所必需的。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种借助细胞穿透肽建立杉木外源基因高效瞬时转化体系的方法。
为实现上述目的，本发明主要采取如下的技术方案：
一种借助细胞穿透肽建立杉木外源基因高效瞬时转化体系的方法，其包括以下步骤：
1)构建杉木TAC3基因过表达载体；
2)制备转染培养液；
3)杉木幼苗全株真空侵染；
4)侵染后杉木幼苗避光孵育；
5)转化植株的转基因鉴定。
步骤1)中，所述杉木TAC3基因过表达载体为35S::GFP-TAC3，其是将杉木TAC3基因连接至带有GFP报告基因的pFGFP植物表达载体得到；所述杉木TAC3基因的全长序列如SEQID NO.1所示，CDS序列如SEQ ID NO.2所示。
步骤2)中，所述转染培养液的制备为：将1×PBS缓冲液与细胞穿透肽溶液、杉木TAC3基因过表达载体溶液混合，于37℃放置30min，而后用超纯水补齐至5mL，得到转染培养液。
步骤2)中，所述转染培养液中细胞穿透肽：杉木TAC3基因过表达载体的质量比为1：1。
步骤2)中，所述细胞穿透肽的氨基酸序列为RRRRRRRRRKKLFKKILKYL-NH2。
步骤3)中，所述真空侵染为在真空泵内外压强差为0.1Mpa条件下侵染5min，然后放气2min。
步骤4)中，所述避光孵育为在25℃、黑暗条件中避光孵育2天以上。
步骤5)中，所述转基因鉴定为进行Western blot分析，检测转化植株中TAC3基因的表达。
本发明的显著优点在于：
本发明提供了一种借助细胞穿透肽建立杉木外源基因高效瞬时转化体系的方法。瞬时转化技术作为一种高效便捷的手段，操作简单、快速便捷、可批量转化、成本低、效果佳已被越来越多的应用于木本植物相关基因功能研究。本发明不需要将外源基因与目标受体进行染色体整合，只要将目的基因导入靶细胞内快速表达以分析基因功能，是细胞水平的表达分析，不涉及再生过程，可在转化之后直接进行表型鉴定，周期短且转化效率高。通过此方法将重组质粒导入杉木并进行瞬时表达，建立外源基因瞬时转化体系，实现对在杉木中外源基因的高效表达，可为裸子植物的分子生物学研究和遗传转化提供技术支持。转化产物容易分离进行后续基因以及蛋白质水平上的分析；用完整植株进行转化，不仅能够提高转化效率，还有利于分析植物胁迫下外源基因的表达模式，为木本植物基因工程育种和种质创新提供参考。
附图说明
图1为本发明所述一种借助细胞穿透肽建立杉木外源基因高效瞬时转化体系的方法的模式图。
图2为10天龄杉木幼苗的示意图。
图3为浸没在转染培养液中的杉木幼苗的示意图。
图4为真空环境作业下的杉木幼苗的示意图。
图5为用锡纸包裹的杉木幼苗的示意图。
图6为Western blot检测结果。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
以下实施例中所用到的试验材料如下：
杉木材料：杉木种子，由漳平五一国有林场提供；
过表达载体：35S::GFP-TAC3，其具体构建步骤在实施例中简要介绍；
细胞穿透肽：其序列为RRRRRRRRRKKLFKKILKYL-NH2，由生物公司合成提供。
实施例1
本实施例主要介绍过表达载体35S::GFP-TAC3的构建，其具体步骤如下：
S1：杉木TAC3基因全长序列如SEQ ID NO.1所示，CDS序列如SEQ ID NO.2所示。根据杉木TAC3基因序列设计TAC3(CDS)-BamH I-F和TAC3(CDS)-BamH I-R，序列如下：
正向引物TAC3(CDS)-BamH I-F：
5’-TCCAGCTCCAGGATCCAAAACGCGGCCGC-3’，
反向引物TAC3(CDS)-BamH I-R：
5’-GAGAAAGCTTGGATCCAATAGTTTCCAGTTCCCATGACG-3’。
S2：以杉木DNA为模板，以TAC3(CDS)-BamH I-F和TAC3(CDS)-BamH I-R为引物扩增带有BamH I位点的杉木TAC3基因。PCR反应体系总体积50μL：DNA模板1μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，2×GoldPfu PCR SuperMix25μL，RNase free ddH2O22μL。PCR反应程序为：94℃2min；94℃20s，50-60℃20s，72℃2-4kb/min，运行35个循环；72℃5min。
S3：将扩增的杉木TAC3基因在BamH I限制性内切酶识别位点进行单酶切，并将带有GFP报告基因的植物表达载体pFGFP在BamH I限制性内切酶识别位点进行单酶切。
S4：将杉木TAC3基因酶切产物与带有GFP报告基因的pFGFP载体酶切产物使用T4连接酶进行连接、转化、涂板、挑取单克隆提取质粒测序，得到的过表达载体命名为35S::GFP-TAC3。
实施例2
本实施例主要提供一种借助细胞穿透肽建立杉木外源基因高效瞬时转化体系的方法(图1)，其具体步骤如下：
S1：制备转染培养液：
将200μl 1×PBS缓冲液(pH＝7.2)、5μL过表达载体35S::GFP-TAC3溶液(2mg/μL，过表达载体35S::GFP-TAC3溶解于pH＝7.2的1×PBS缓冲液中)、5μL细胞穿透肽溶液(2mg/μL，细胞穿透肽溶解于pH＝7.2的1×PBS缓冲液中)混合均匀，将混合溶液在37℃放置30min，而后用超纯水补齐体积至5ml，得到转染培养液，备用。
S2：培养杉木幼苗：
将杉木种子播种于由质量比为2：1的营养土和蛭石混合配制而成的基质中，置于25℃、黑暗的条件下使其萌发。
S3：杉木幼苗的预处理：
取萌发10天的杉木幼苗，用无菌水清洗3～5次，再用无菌滤纸吸干表面水分。
S4：真空侵染：
将预处理后的杉木幼苗全株浸没于装有转染培养液的试管中，移至真空干燥器中，于室温用真空泵使内外压强差为0.1Mpa下侵染5min，然后放气2min。
S5：真空侵染后的孵育：
真空侵染后，将装有杉木幼苗的试管用锡纸包裹避光，于室温(25℃)、黑暗条件下避光孵育。
S6：Western-blot检测：
分别于避光孵育1、2、4、6天后，取杉木幼嫩叶片，提取总蛋白质，分别用anti-GFP抗体和anti-HSP90抗体，通过Western-blot进一步在蛋白质水平检测杉木TAC3基因的表达。
实施例3
本实施例主要提供一种借助细胞穿透肽建立杉木外源基因高效瞬时转化体系的方法，其操作步骤与实施例2基本相同，不同之处在于：转染培养液的制备方法为：将200μl1×PBS缓冲液(pH＝7.2)、5μL过表达载体35S::GFP-TAC3溶液(2mg/μL)、2.5μL细胞穿透肽溶液(4mg/μL)混合均匀，将混合溶液在37℃放置30min，而后用超纯水补齐体积至5ml，得到转染培养液，备用。
实施例4
本实施例主要提供一种借助细胞穿透肽建立杉木外源基因高效瞬时转化体系的方法，其操作步骤与实施例2基本相同，不同之处在于：转染培养液的制备方法为：将200μl1×PBS缓冲液(pH＝7.2)、5μL过表达载体35S::GFP-TAC3溶液(2mg/μL)、50μL细胞穿透肽溶液(0.2mg/μL)混合均匀，将混合溶液在37℃放置30min，而后用超纯水补齐体积至5ml，得到转染培养液，备用。
Western blot检测结果见图6。实施例2～4中所有阳性株系均有特异条带，这个结果不但表明这些株系确实是转基因株系，而且还表明转化的目的基因在植物中得到了表达，没有发生基因沉默现象。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (8)
1.一种借助细胞穿透肽建立杉木外源基因高效瞬时转化体系的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）构建杉木TAC3基因过表达载体；
2）制备转染培养液；
3）杉木幼苗全株真空侵染；
4）侵染后杉木幼苗避光孵育；
5）转化植株的转基因鉴定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述杉木TAC3基因过表达载体为将杉木TAC3基因连接至带有GFP报告基因的pFGFP植物表达载体得到；所述杉木TAC3基因的全长序列如SEQ ID NO.1所示，CDS序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述转染培养液的制备为：将1×PBS缓冲液与细胞穿透肽溶液、杉木TAC3基因过表达载体溶液混合，于37℃放置30min，而后用超纯水补齐至5mL，得到转染培养液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述真空侵染为在真空泵内外压强差为0.1Mpa条件下侵染5min，然后放气2min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述避光孵育为在25℃、黑暗条件中避光孵育2天以上。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述转基因鉴定为进行Western blot分析，检测转化植株中TAC3基因的表达。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述转染培养液中细胞穿透肽：杉木TAC3基因过表达载体的质量比为1：1。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述细胞穿透肽的氨基酸序列为RRRRRRRRRKKLFKKILKYL-NH2。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311340157.4A CN117402906A (zh) | 2023-10-17 | 2023-10-17 | 一种借助细胞穿透肽建立杉木外源基因高效瞬时转化体系的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311340157.4A CN117402906A (zh) | 2023-10-17 | 2023-10-17 | 一种借助细胞穿透肽建立杉木外源基因高效瞬时转化体系的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117402906A true CN117402906A (zh) | 2024-01-16 |
Family
ID=89497380
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311340157.4A Pending CN117402906A (zh) | 2023-10-17 | 2023-10-17 | 一种借助细胞穿透肽建立杉木外源基因高效瞬时转化体系的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117402906A (zh) |
-
2023
- 2023-10-17 CN CN202311340157.4A patent/CN117402906A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107435047B (zh) | 一种植物磷信号网络中耐低磷关键基因GmPHR25及其与应用 | |
| CN109750048B (zh) | 苹果果实糖转运蛋白基因MdERDL6及其应用 | |
| CN104357456A (zh) | 葡萄特异抗白粉病基因VpR8H-1cDNA序列及其应用 | |
| CN115637269A (zh) | 一种多顺反子间隔区元件及其在植物育种中的应用 | |
| CN107739738A (zh) | 一种鹅掌楸纤维素合酶基因LcCESA1及其表达蛋白和应用 | |
| CN105907733B (zh) | 一种苦豆子肌醇甲基转移酶及其编码基因及应用 | |
| CN106399326A (zh) | 大豆bHLH转录因子基因GmFER及其编码蛋白和应用 | |
| CN109609514A (zh) | 梨转录因子PbrMYB169及其应用 | |
| CN107400671A (zh) | 梨果实糖转运蛋白基因PbTMT4及其应用 | |
| CN108588098A (zh) | 尾叶桉cad基因及其应用 | |
| JP3538428B2 (ja) | 植物プロモーターおよび該プロモーターを用いた遺伝子発現方法 | |
| CN116891871A (zh) | 一种采用葫芦二烯醇合酶合成葫芦二烯醇的方法及其应用 | |
| CN102146377B (zh) | 一种通过胚性细胞组织制备蛋白质的方法 | |
| CN114703198B (zh) | 一种番茄转运蛋白SlZIF1的克隆及其应用 | |
| CN117402906A (zh) | 一种借助细胞穿透肽建立杉木外源基因高效瞬时转化体系的方法 | |
| CN116083445A (zh) | 一种CrBZR1基因及其应用 | |
| Li et al. | Development of a Simple and Efficient Method for Agrobacterium-Mediated Transformation in Sorghum. | |
| CN107760708B (zh) | 通过过表达JcARF19基因来提高小桐子果实产量的方法 | |
| CN108004267A (zh) | 一种利用基因工程技术延长番茄果实货架期的新方法 | |
| CN104805093B (zh) | 水稻基因OsLOL3在延缓植物叶片衰老和提高植物耐旱性中的应用 | |
| US20100146672A1 (en) | Compositions and methods for increasing cellulose production | |
| CN108998454B (zh) | 一种与菊花脑抗蚜性相关的miRNA160a及其应用 | |
| CN105906695A (zh) | 一种苦豆子水通道蛋白及其编码基因及应用 | |
| JP2016214218A (ja) | 転写抑制因子を利用した植物の二次細胞壁の量的形質を改変する方法 | |
| CN104805100A (zh) | 水稻基因OsSμBP-2在延缓植物叶片衰老中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |