CN103756920A - 表达绿色荧光蛋白的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株fon-gfp及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种表达绿色荧光蛋白的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株FON-GFP及其制备方法和应用，提供带有绿色荧光蛋白的真菌表达载体，该载体含有潮霉素B抗性基因hph和绿色荧光蛋白基因gfp，采用农杆菌介导法将该载体转化尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株race1，转化子能够表达绿色荧光蛋白，将转化菌株分别侵染嫁接砧木和西瓜的根，通过实时监测荧光菌株来准确分析尖孢镰刀菌西瓜专化型菌在植株根和下胚轴组织中的侵染情况。本发明具有快速简便且可以实时指示尖孢镰刀菌西瓜专化型菌侵染途径的特点，且本发明提供的方法适用于多种丝状真菌，可广泛应用于科研领域。

Description

表达绿色荧光蛋白的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株FON-GFP及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术中的基因工程领域，尤其涉及表达绿色荧光蛋白的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株FON-GFP及其制备方法和应用。

背景技术

西瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxyxporum f.sp. niveum，FON）侵染导致的土传真菌病害，是严重制约西瓜生产的病害之一。根据西瓜品种对病菌表现出的不同的抗感反应，已报道有4种尖孢镰刀菌西瓜专化型的生理小种，分别为0、1、2和3。绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一种广泛应用的报告基因，具有稳定、直观、操作方便等的荧光特性，以其作为报告基因已被成功应用于丝状真菌分子生物学研究中。

西瓜（Citrullus lanatus）是一类重要的瓜果类作物。我国是西瓜生产大国，约占世界蔬菜种植总面积的6%，居世界首位（http://faosta t.fao.org/）。西瓜枯萎病是严重危害西瓜生产的土传真菌病害，砧木嫁接是防治该病害的主要技术手段。枯萎病菌侵染寄主植株是一个复杂的过程，通过荧光电子显微镜观察，将病菌侵染过程分为以下几个步骤：根系识别并附着、菌丝通过不同的根部组织渗透、菌丝在木质部扩散、侵染植株维管系统（Pietro et al., 2003）。目前，已有学者报道了通过实时监测GFP-荧光标记的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌侵染西瓜的过程，如研究发现侵染后12h-1天，病菌主要在根表面生长萌发。接种后第3天，菌丝沿根纵向凹槽平行生长、扩散，然后在某一位点渗透表皮细胞，形成附着胞。接种后第5天，根表面已经全部被菌丝体覆盖，至接种后第7-8天，菌丝穿过皮质层到达根的中央导管，在木质部导管中生长（Lü et al., 2011）。相比之下，关于砧木嫁接提高西瓜抗枯萎病的研究主要集中于嫁接植株的生理生化方面，而未见有关尖孢镰刀菌西瓜专化型菌在嫁接砧木中的侵染特性，尤其是嫁接砧木对病原菌的定植拮抗方面的报道。因此，了解尖孢镰刀菌西瓜专化型菌在嫁接砧木中的侵染特性，并比较其在西瓜中的侵染差异，对于深入了解砧木嫁接抗病机理具有重要的理论意义。

发明内容

解决的技术问题：针对现有技术存在的不足，本发明提供表达绿色荧光蛋白的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株FON-GFP及其制备方法和应用。

技术方案：表达绿色荧光蛋白的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株FON-GFP，其特征在于由以下步骤制备而得：

（1）设计引物trpcp-f和trpcp-r，以pBARGPE1质粒为模板，扩增启动子trpC基因，获得了365bp的trpC条带，即为trpC基因，引物trpcp-f、引物trpcp-r和trpC基因序列分别如SEQ NO1、SEQ NO2、SEQ NO3；

（2）采用Gateway克隆技术，通过BP和LR两步反应，将trpC基因置换到pMDC83载体中，PCR扩增获得一条1436bp的条带，即由启动子trpC启动的绿色荧光蛋白表达盒“trpC+GFP+nos” （如图2B），将含有此表达盒的质粒命名为pWM10，“trpC+GFP+nos” 表达盒的序列如SEQ NO4；

（3）再以pWM10质粒DNA为模板扩增“trpC+GFP+nos”基因，将扩增产物割胶回收后连接到pGEM-T easy载体，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，通过蓝白斑筛选阳性克隆并提取大肠杆菌DH5α质粒；

（4）将大肠杆菌DH5α质粒和pBC-hygro载体质粒同时进行双酶切，利用T₄ DNA连接酶对酶切产物进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，筛选阳性克隆，对阳性克隆分别进行PCR扩增和双酶切验证，然后测序鉴定，构建了表达载体pBC-GFP；

（5）采用农杆菌介导的遗传转化方法，将表达载体pBC-GFP转入尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株基因组中，获得了表达绿色荧光蛋白的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株FON-GFP。

上述所述的表达绿色荧光蛋白的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株FON-GFP的制备方法包括以下步骤：

（1）设计引物trpcp-f和trpcp-r，以pBARGPE1质粒为模板，扩增启动子trpC基因，获得了365bp的trpC条带，即为trpC基因，引物trpcp-f、引物trpcp-r和trpC基因序列分别如SEQ NO1、SEQ NO2、SEQ NO3；

（2）采用Gateway克隆技术，通过BP和LR两步反应，将trpC基因置换到pMDC83载体中，PCR扩增获得一条1436bp的条带，即由启动子trpC启动的绿色荧光蛋白表达盒“trpC+GFP+nos”，将含有此表达盒的质粒命名为pWM10，“trpC+GFP+nos” 表达盒的序列如SEQ NO4；

（3）再以pWM10质粒DNA为模板扩增“trpC+GFP+nos”基因，将扩增产物割胶回收后连接到pGEM-T easy载体，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，通过蓝白斑筛选阳性克隆并提取大肠杆菌DH5α质粒；

（4）将大肠杆菌DH5α质粒和pBC-hygro载体质粒同时进行双酶切，利用T₄ DNA连接酶对酶切产物进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，筛选阳性克隆，对阳性克隆分别进行PCR扩增和双酶切验证，然后测序鉴定，构建了表达载体pBC-GFP；

（5）采用农杆菌介导的遗传转化方法，将表达载体pBC-GFP转入尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株基因组中，获得了表达绿色荧光蛋白的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株FON-GFP。

上述所述的步骤（4）中双酶切位点为XbaI 和HindIII。

上述所述的步骤（4）构建的表达载体pBC-GFP应用于多种丝状真菌的侵染机制研究。

上述所述的表达绿色荧光蛋白的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株FON-GFP应用于嫁接砧木和西瓜根植株侵染过程。

上述所述的表达绿色荧光蛋白的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株FON-GFP在嫁接砧木和西瓜根植株侵染过程中的应用，其步骤如下：

（1）挑取尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株加入马铃薯培养基中，25℃，150rpm摇床上培养5~7天后，过滤，调整孢子液浓度为1x10⁶个/mL；

（2）采用孢子浸根接种法接种，将植株从基质中移出，冲洗植株根上附着的基质，将主根根尖切去1cm，浸根15-30 min，中间摇动2-3次，浸根完成后，将植株再次定植到营养钵中，接种后在26~30℃条件下培养；

（3）于接菌后0、2、4、8、12、24、48、72、96、120、144、168、192、240、336h分别取5~8株西瓜和嫁接砧木的根和茎，将根和茎用去离子水洗涤后放在载玻片上，采用德国Leica TCS SP2激光共聚焦扫描显微镜进行观察，设置GFP和叶绿素的激发波长均为488 nm， GFP发射波长的选择范围为500~515 nm，叶绿素发射波长的选择范围为630~670 nm，记录的图形数据导入Adobe Photoshop7.0进行处理。

有益效果：本发明提供表达绿色荧光蛋白的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株FON-GFP及其制备方法和应用，将转化GFP的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌FON-GFP分别侵染嫁接砧木和西瓜的根，通过实时监测荧光菌株以准确的确定尖孢镰刀菌西瓜专化型菌在植株根和下胚轴中的侵染情况，因此，具有以下优点：

（1）    应用领域广：可应用于多种丝状真菌的侵染机制研究；

（2）    操作简单：仅需摇培孢子液即可进行侵染后观察；

（3）    现象直观：在接种后，可采用荧光显微镜直接观察孢子的萌发及侵染途径，便于掌握尖孢镰刀菌西瓜专化型菌在植株中的侵染动态，有利于明确嫁接砧木对尖孢镰刀菌西瓜专化型菌抗病机制。

附图说明

图1：pBC-GFP表达载体的PCR检测及酶切鉴定图，其中M：DL 2000 DNA Marker；1：trpC基因的PCR扩增；2-4：“trpC+GFP+nos”表达盒的PCR扩增； 5：“trpC+GFP+nos”表达盒的酶切鉴定。

图2：表达绿色荧光蛋白的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株FON-GFP的荧光观察图，其中灰色的部分表示绿色荧光。

图3：FON-GFP荧光菌株在西瓜自根和嫁接砧木根中的侵染途径（接种后4-72h）；

A, D：孢子在西瓜自根和嫁接砧木根表皮附着（接种后4h）；B, E：菌丝松散的附着在西瓜自根和嫁接砧木根表皮（接种后12h）；C, F：西瓜自根和嫁接砧木根表皮菌丝增加（接种后24h）；G, J：西瓜自根和嫁接砧木根表皮大量菌丝附着并沿表皮生长（接种后48h）；H，I：菌丝向西瓜根皮层入侵（接种后72h，H：纵切；I：横切）；K，L：菌丝在嫁接砧木根表皮附着，未向嫁接砧木根皮层入侵（接种后72h，K：纵切；L：横切）。

图4：FON-GFP荧光菌株在西瓜自根和嫁接砧木根中的侵染途径（接种后96-360h）；

A,D：菌丝体遍布西瓜自根和嫁接砧木根表皮（接种后96h）；B，C：菌丝沿细胞缝隙在西瓜根皮层中扩展（接种后120h，B：纵切；C：横切）；E，F：菌丝在嫁接砧木根表皮附着，仍未向嫁接砧木根皮层入侵（接种后120h，E：纵切；F：横切）；G：菌丝侵入西瓜根木质部导管（接种后144h）；I：砧木根木质部导管中未见菌丝（接种后144h）；H：西瓜根木质部导管中的少量菌丝（接种后168h）；K：砧木根木质部导管中未见菌丝（接种后168h）；I, M：菌丝沿西瓜根导管生长（接种后192h，I：纵切；M：横切）；L, P：砧木根导管中未见菌丝（接种后192h，L：纵切；P：横切）；N：西瓜根下胚轴导管中的菌丝（接种后240h）；Q：砧木根下胚轴导管中未见菌丝（接种后240h）；O：西瓜根上胚轴导管中的菌丝（接种后360h）；R：砧木根上胚轴导管中未见菌丝（接种后360h）。

具体实施方式

本实施方式中的pBARGPE1质粒和pBC-hygro质粒购于长沙赢润生物技术有限公司，Gateway载体构建系统、Gateway克隆技术、pMDC83载体购于Invitrogen公司，pGEM-T easy载体购于Promega公司， T₄ DNA连接酶购于Takara公司，尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株来自于国家蔬菜工程技术研究中心，OLYMPUS DP72荧光显微镜购于日本东京Olympus公司 。

本实施例中的大肠杆菌DH5α感受态制备方法参考《分子克隆实验指南 第三版》，农杆菌介导的遗传转化方法参考（Mullins等，Phytopathology, 2001, 91(2):173-180），马铃薯培养基配制方法参考《分子克隆试验指南 第三版》。

实施例1

1、真菌表达载体pBC-GFP的构建

（1）真菌启动子trpC基因片段的获得

根据pBARGPE1质粒上trpC的基因序列，结合Gateway载体构建系统的特点，设计含有attB位点的trpC基因特异性引物trpcp-f和trpcp-r，以pBARGPE1质粒为模板，扩增启动子trpC基因，获得了365bp的trpC条带（如图1：A），即为trpC基因，引物trpcp-f、引物trpcp-r和trpC基因序列分别如SEQ NO1、SEQ NO2、SEQ NO3；

（2）采用Gateway克隆技术，通过BP和LR两步反应，将trpC基因置换到pMDC83载体中，PCR扩增获得一条1436bp的条带，即由启动子trpC启动的绿色荧光蛋白表达盒“trpC+GFP+nos” （如图1：B），将含有此表达盒的质粒命名为pWM10，“trpC+GFP+nos” 表达盒的序列如SEQ NO4；

（3）再以pWM10质粒DNA为模板扩增“trpC+GFP+nos”基因，将扩增产物割胶回收后连接pGEM-T easy载体，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，通过蓝白斑筛选阳性克隆并提取大肠杆菌DH5α质粒；

（4）将大肠杆菌DH5α质粒和pBC-hygro质粒同时进行XbaI 和HindIII双酶切，利用T4 DNA连接酶对酶切产物进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，筛选阳性克隆，对阳性克隆分别进行PCR扩增和双酶切验证，然后送上海英骏生物科技有限公司完成测序鉴定，构建了表达载体pBC-GFP。

（2）和（4）中的PCR扩增条件相同，为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，30个循环；最后72 ℃延伸10 min；12 ℃保温。

（4）中的酶切体系和酶切条件如下：

酶切体系

试剂	反应体积/μL
		10xReaction Buffer	2.0
XbaI	1.0
		HindIII	1.0
pBC-hygro DNA	10
		无菌去离子水	补足至总体积20μl

酶切条件：37℃条件下保温1h。

结果表明，酶切产物大小与“trpC+GFP+nos”基因完全一致（如图1：C），证明重组基因在目标载体中结构完整，片段大小没有发生变化，因此，重组基因“trpC+GFP+nos”序列正确，并准确插入了目的载体pBC-hygro，成功构建了表达载体pBC-GFP。

2、表达绿色荧光蛋白的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株FON-GFP的制备

采用农杆菌介导的遗传转化方法将表达载体pBC-GFP转入尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株基因组中，获得表达绿色荧光蛋白的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株FON-GFP。用无菌接种环挑取FON-GFP菌丝制成玻片，采用OLYMPUS DP72荧光显微镜观察转化菌株的荧光，结果发现，荧光显微镜下可清晰地看到绿色荧光表达的菌丝体（如图2：A）和分生孢子（如图2：B）。

3、表达绿色荧光蛋白的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株FON-GFP在嫁接砧木和西瓜根中的侵染途径观察

（1）挑取2~3块0.5cm²的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株加入马铃薯培养基中，25℃，150rpm摇床上培养5~7天后，用灭菌的4层纱布过滤，采用血球计数板计数，调整孢子液浓度为1x10⁶个·mL^-1；

（2）采用孢子浸根接种法接种，将植株从基质中移出，用自来水冲洗根上附着的基质，将主根根尖切去1cm，浸根接种15-30 min，中间摇动2-3次，防止孢子沉降，浸根完成后，将植株再次定植到营养钵中，接种后在26-30℃条件下培养；

（3）于接菌后0、2、4、8、12、24、48、72、96、120、144、168、192、240、336h分别取5~8株西瓜和嫁接砧木的根和茎样品，将材料用去离子水洗涤后放在载玻片上，采用德国Leica TCS SP2激光共聚焦扫描显微镜进行观察。设置GFP和叶绿素的激发波长均为488 nm， GFP发射波长的选择范围为500~515 nm，叶绿素发射波长的选择范围为630~670 nm，记录的图形数据导入Adobe Photoshop7.0进行处理。

结果表明：接种后4h，孢子松散的附着在根表皮（图3：A），12h时，个别孢子萌发产生菌丝（图3：B），24h时，根表皮菌丝量增加（图3：C），到48h时，可见菌丝大量紧密附着于根毛，但没有观察到菌丝向根皮层入侵（图3：G），接种后第3天（72h），可以清楚地看到有单个孢子在入侵点，即表皮细胞的连接处生长，有的孢子已经穿过表皮细胞向皮层组织侵入，此外，也可以观察到萌发的小分生孢子和成熟菌丝向皮层渗透（图3：H、I）。在枯萎病菌接菌4-48h之间，菌丝在嫁接砧木根和西瓜根表皮的附着及生长无差异，接菌72h时，菌丝开始向西瓜根皮层入侵，而在嫁接砧木根中，菌丝仍限于在表皮生长（图3：K：L）。

接种后96h（第4天），GFP观察显示其主根已经被菌丝体完全包裹，且菌丝在表皮细胞的入侵点也清晰可见（图4：A）。接种后120h（第4天），可见根皮层组织已经遍布菌丝，菌丝沿皮层细胞间隙生长（图4：B、C），此时，菌丝尚未入侵到木质部导管，接种后144h（第5天），个别菌丝已生长到木质部导管，可以清楚的看到菌丝向木质部导管入侵（图4：G）。接种后168h（第7天），植株表型仍然很健康，而此时整个植株的主根和根冠区已经被完全侵染，菌丝已经进入到木质部导管（图4：H）。接种后192h（第8天），菌丝沿木质部导管向上扩散（图4：I、M），有些植株开始显症。接种后240h（第10天），植株出现明显病害症状，如基部变褐缢缩、发病植株猝倒等。此时，可见根和下胚轴木质部导管中遍布菌丝（图4：N）。所有植株上胚轴均未被侵染。接种后360h（第15天），侵染植株已全部死亡，此时，植株上胚轴均已被侵染（图4：O）。

通过对受侵染组织横切和纵切的大量观察，可以发现菌丝进入根维管系统后，其以后的生长和扩散均在木质部导管中进行，有时菌丝可以穿过木质部导管向薄壁细胞侵染。而在茎中，菌丝的生长仅限于木质部导管。同样，我们观察到菌丝仅在西瓜根中侵染，而在嫁接砧木根及下胚轴中无菌丝侵入（图4：D、E、F、J、K、L、P、Q、R）。

                        序列表

 

<110>  江苏省农业科学院

 

<120>  表达绿色荧光蛋白的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株FON-GFP及其制备方法和应

       用

 

<130> 

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

gtcgacagaa gatgatattg                                                 20

 

 

<210>  2

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

tgcttgggta gaataggtaa gtc                                             23

 

 

<210>  3

<211>  365

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

gtcgacagaa gatgatattg aaggagcact ttttgggctt ggctggagct agtggaggtc     60

 

aacaatgaat gcctattttg gtttagtcgt ccaggcggtg agcacaaaat ttgtgtcgtt    120

 

tgacaagatg gttcatttag gcaactggtc agatcagccc cacttgtagc agtagcggcg    180

 

gcgctcgaag tgtgactctt attagcagac aggaacgagg acattattat catctgctgc    240

 

ttggtgcacg ataacttggt gcgtttgtca agcaaggtaa gtgaacgacc cggtcatacc    300

 

ttcttaagtt cgcccttcct ccctttattt cagattcaat ctgacttacc tattctaccc    360

 

aagca                                                                365

 

 

<210>  4

<211>  1436

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

gtcgacagaa gatgatattg aaggagcact ttttgggctt ggctggagct agtggaggtc     60

 

aacaatgaat gcctattttg gtttagtcgt ccaggcggtg agcacaaaat ttgtgtcgtt    120

 

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ttccatggcc aaccctggtc accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc tcccgttacc    660

 

ctgatcatat gaagcggcac gacttcttca agagcgccat gcctgaggga tacgtgcagg    720

 

agaggaccat cttcttcaag gacgacggga actacaagac acgtgctgaa gtcaagtttg    780

 

agggagacac cctcgtcaac aggatcgagc ttaagggaat cgatttcaag gaggacggaa    840

 

acatcctcgg ccacaagttg gaatacaact acaactccca caacgtatac atcatggccg    900

 

acaagcaaaa gaacggcatc aaagccaact tcaagacccg ccacaacatc gaagacggcg    960

 

gcgtgcaact cgctgatcat tatcaacaaa atactccaat tggcgatggc cctgtccttt   1020

 

taccagacaa ccattacctg tccacacaat ctgccctttc gaaagatccc aacgaaaaga   1080

 

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aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat gttact       1436

Claims (6)

1.表达绿色荧光蛋白的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株FON-GFP，其特征在于由以下步骤制备而得：

（1）设计引物trpcp-f和trpcp-r，以pBARGPE1质粒为模板，扩增启动子trpC基因，获得了365bp的trpC条带，即为trpC基因，引物trpcp-f、引物trpcp-r和trpC基因序列分别如SEQ NO1、SEQ NO2、SEQ NO3；

（2）采用Gateway克隆技术，通过BP和LR两步反应，将trpC基因置换到pMDC83载体中，PCR扩增获得一条1436bp的条带，即由启动子trpC启动的绿色荧光蛋白表达盒“trpC+GFP+nos”，将含有此表达盒的质粒命名为pWM10，“trpC+GFP+nos” 表达盒的序列如SEQ NO4；

（3）再以pWM10质粒DNA为模板扩增“trpC+GFP+nos”基因，将扩增产物割胶回收后连接到pGEM-T easy载体，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，通过蓝白斑筛选阳性克隆并提取大肠杆菌DH5α质粒；

（4）将大肠杆菌DH5α质粒和pBC-hygro载体质粒同时进行双酶切，利用T₄ DNA连接酶对酶切产物进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，筛选阳性克隆，对阳性克隆分别进行PCR扩增和双酶切验证，然后测序鉴定，构建了表达载体pBC-GFP；

（5）采用农杆菌介导的遗传转化方法，将表达载体pBC-GFP转入尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株基因组中，获得了表达绿色荧光蛋白的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株FON-GFP。

2.如权利要求1所述的表达绿色荧光蛋白的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株FON-GFP的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）设计引物trpcp-f和trpcp-r，以pBARGPE1质粒为模板，扩增启动子trpC基因，获得了365bp的trpC条带，即为trpC基因，引物trpcp-f、引物trpcp-r和trpC基因序列分别如SEQ NO1、SEQ NO2、SEQ NO3；

（2）采用Gateway克隆技术，通过BP和LR两步反应，将trpC基因置换到pMDC83载体中，PCR扩增获得一条1436bp的条带，获得了由真菌启动子trpC启动的绿色荧光蛋白表达盒“trpC+ GFP+nos”，将含有此表达盒的质粒命名为pWM10，“trpC+GFP+nos” 表达盒的序列如SEQ NO4；

（3）再以pWM10质粒DNA为模板扩增trpC+GFP+nos基因，将扩增产物割胶回收后连接到pGEM-T easy载体，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，通过蓝白斑筛选阳性克隆并提取大肠杆菌DH5α质粒；

（4）将大肠杆菌DH5α质粒和pBC-hygro载体质粒同时进行双酶切，利用T₄ DNA连接酶对酶切产物进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，筛选阳性克隆，对阳性克隆分别进行PCR扩增和双酶切验证，然后测序鉴定，构建了表达载体pBC-GFP；

（5）采用农杆菌介导的遗传转化方法，将表达载体pBC-GFP转入尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株基因组中，获得了表达绿色荧光蛋白的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株FON-GFP。

3.根据权利要求2所述的表达绿色荧光蛋白的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株FON-GFP的制备方法，其特征在于所述步骤（4）中双酶切位点为XbaI 和HindIII。

4.根据权利要求2所述的表达绿色荧光蛋白的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株FON-GFP的制备方法，其特征在于所述步骤（4）构建的表达载体pBC-GFP应用于多种丝状真菌的侵染机制研究。

5.表达绿色荧光蛋白的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株FON-GFP在嫁接砧木和西瓜根植株侵染过程中的应用。

6.根据权利要求5所述的表达绿色荧光蛋白的尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株FON-GFP在嫁接砧木和西瓜根植株侵染过程中的应用，其特征在于步骤如下：

（1）挑取尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株加入马铃薯培养基中，25℃，150rpm摇床上培养5~7天后，过滤，调整孢子液浓度为1x10⁶个/mL；

（2）采用孢子浸根接种法接种，将植株从基质中移出，冲洗植株根上附着的基质，将主根根尖切去1cm，浸根15-30 min，中间摇动2-3次，浸根完成后，将植株再次定植到营养钵中，接种后在26~30℃条件下培养；

（3）于接菌后0、2、4、8、12、24、48、72、96、120、144、168、192、240、336h分别取5~8株西瓜和嫁接砧木的根和茎，将根和茎用去离子水洗涤后放在载玻片上，采用德国Leica TCS SP2激光共聚焦扫描显微镜进行观察，设置GFP和叶绿素的激发波长均为488 nm， GFP发射波长的选择范围为500~515 nm，叶绿素发射波长的选择范围为630~670 nm，记录的图形数据导入Adobe Photoshop7.0进行处理。

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