CN111011214B

CN111011214B - 一种沙冬青的组织培养方法

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Publication number: CN111011214B
Application number: CN201911400312.0A
Authority: CN
Inventors: 马怀林; 刘思泱; 贾振宇; 高秀梅; 田志来; 崔海鹏; 王媛媛; 张跃华; 潘亮; 荆莹; 高旭
Original assignee: Mengcao Ecological Environment Group Co Ltd
Current assignee: Mengcao Ecological Environment Group Co Ltd
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2019-12-30
Publication date: 2023-09-12
Anticipated expiration: 2039-12-30
Also published as: CN111011214A

Abstract

本发明提供了一种沙冬青的组织培养方法，取用沙冬青种子中的胚作为外植体，经过初代诱导培养、继代培养、生根培养和移栽，系统地研究了沙冬青外植体的选择、最佳培养条件、不同阶段的最佳培养基及栽培基质配比。经过实验，得到了沙冬青的组培中不同阶段的最佳培养基以及培养基组合，最适的培养条件及培养方式，解决了沙冬青组培过程中的褐化问题，提高组培苗成活率，降低生产成本，为实现沙冬青的工厂化生产奠定了可靠的基础。本发明操作简便，成本低廉，具有良好的应用前景。

Description

一种沙冬青的组织培养方法

技术领域

本发明属于组织培养技术领域，具体而言，涉及一种沙冬青的组织培养方法。

背景技术

沙冬青(学名：Ammopiptanthus mongolicus(Maxim.ex Kom.)Cheng f.)，为豆科沙冬青属植物，属于渐危种，主要分布在我国内蒙古、宁夏、甘肃、新疆地区，蒙古国南部、中亚地区也有分布。沙冬青在荒漠地区的生态修复中具有重要的价值，拥有优秀的抗旱、耐寒、抗风、固沙的能力，其根部具有根瘤，结合菌种的施用在改善土壤方面有很好的应用，是荒漠地区防风固沙的优良选择。

但现有沙冬青种子容器育苗技术育苗周期长，出苗率低，一般仅为30～40％，通过组培扩繁技术提高沙冬青育苗成活率是解决沙冬青生态用苗的有效途径。沙冬青的组培扩繁一般包括初代诱导→继代增殖→生根培养三个时期，在沙冬青组培过程中初代诱导和继代增殖时期，褐化现象严重，导致组培苗成活率低，因此寻找每个时期的最佳培养基配方，解决组培过程中的褐化问题，提高组培苗成活率，降低生产成本，对沙冬青生态用苗工厂化、产业化极为重要。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种沙冬青的组织培养方法，解决上述技术问题，本方法过程中系统地研究了沙冬青的外植体的选择、最佳培养条件、不同阶段的最佳培养基及栽培基质配比。

本发明提供了一种沙冬青的组织培养方法，其特征在于由以下步骤组成：

步骤1：外植体取自沙冬青种子的胚；

步骤2：将外植体接种于初代诱导培养基上，诱导分化出丛生芽；

步骤3：将初代诱导的丛生芽在继代培养基上培养；将继代培养基中长势较好的苗转入生根培养基中，诱导生根；

步骤4：将上述诱导生根后的沙冬青生根苗进行移栽。

优选地，所述的初代诱导培养的条件为培养温度26±1℃，昼夜温差7～8℃，湿度50％～60％，光照强度1500Lx，夜间无需补光。

优选地，所述的继代培养条件与初代诱导培养的条件相同。

优选地，所述的生根培养条件为培养温度26±1℃，昼夜温差7～8℃，湿度50％～60％，光照强度2000Lx，夜间无需补光。

优选地，所述步骤1中取沙冬青外植体过程为：将饱满、无病虫害的沙冬青种子流水冲洗，用0.1％的升汞溶液消毒5min，无菌水冲洗3～4次，每次5min，在无菌滤纸上吸干水分，之后在超净工作台挑出沙冬青的种子胚作为再生的外植体，若种子胚较小，可在解剖镜下处理。

优选地，所述步骤3的接种过程中，丛生芽截取带侧芽(或顶芽)的0.2～0.5cm茎段，将生长点插入培养基。

优选地，所述步骤4还包括沙冬青生根后的炼苗移栽阶段，优选地栽培基质为质量比为蛭石10～30％，沙土10～30％，羊粪5～15％，草炭磷酸二铵40～60％，更为优选为蛭石20％，土20％，羊粪10％，草炭磷酸二铵50％。

优选地，所述基本培养基为WH，用3.5g/L的卡拉胶代替琼脂作固化剂，40g/L食用白糖代替蔗糖作为碳源，以自来水代替蒸馏水。

优选地，所述初代诱导培养基为WH(无KI)+NAA 0.1～0.5mg/L+6-BA0.5～1mg/L+GA 0.5mg/L+活性炭1g/L。

优选地，所述继代培养基为WH(无KI)+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.1mg/L+GA 0.5mg/L+活性炭1g/L。

优选地，所述生根培养基为1/2MS+IAA 0.1mg/L+B9 1mg/L。

优选地，所述MS基本培养基中，用3.5g/L的卡拉胶代替琼脂作固化剂，20g/L食用白糖代替蔗糖作为碳源，以自来水代替蒸馏水。

本发明提供了一种沙冬青的组织培养方法，操作简便，成本低廉，具有良好的应用前景。本发明系统地研究了沙冬青的外植体的选择、最佳培养条件、不同阶段的最佳培养基及栽培基质配比。，解决了沙冬青组织培养的褐化问题，提高组培苗成活率，降低成本，为实现沙冬青的工厂化生产奠定了可靠的基础。

具体实施方式

为了更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，下面对本发明进一步详细说明。但下述的实施例仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明保护范围以权利要求书为准。

一、沙冬青外植体的材料

实验用的沙冬青种子采自内蒙古蒙草生态环境(集团)股份有限公司抗旱植物研究院实验基地的试验苗圃。将饱满、无病虫害的沙冬青种子流水冲洗，用0.1％的升汞溶液消毒5min，无菌水冲洗3次，每次5min，在无菌滤纸上吸干水分，之后在超净工作台挑出沙冬青的种子胚作为再生的外植体，若种子胚较小，可在解剖镜下处理。将种子胚接种于初代诱导培养基上，建立试管苗无性繁殖系。选取10～20天的丛生芽，丛生芽剪去基部，截取带侧芽(或顶芽)的0.2～0.5cm茎段，作为再生的外植体。

二、筛选统计方法

初代芽诱导率＝(诱导出的丛生芽数/接种的外植体总数)×100％

继代增殖倍数＝(诱导出的丛生芽数/接入单株芽的总数)×100％

生根率＝(分化根的外植体数/接种的外植体总数)×100％

三、沙冬青组织培养各个阶段最佳培养基的筛选

WH培养基较MS培养基相比，无机盐含量低，有益于组培苗的生长。故选择以WH为基本培养基，用3.5g/L的卡拉胶代替琼脂作固化剂，40g/L食用白糖代替蔗糖作为碳源，以自来水代替蒸馏水，分别添加不同配比的细胞分裂素和生长素进行培养基的筛选。

1、初代诱导培养基的选择

将WH设为有KI微量元素和无KI微量元素，NAA的浓度设0.1mg/L、0.3mg/L、0.5mg/L、1mg/L四个浓度梯度，6-BA的浓度设0.3mg/L、0.5mg/L、0.7mg/L、1mg/L四个浓度梯度，进行不同组配，每组三个重复，每组培养基均含有GA 0.5mg/L和活性炭1g/L。接种时每瓶接3个胚，观察生长点在不同培养基上不定芽的发生情况。

初代诱导培养的条件为温度26±1℃，昼夜温差范围7～8℃，湿度50～60％光照强度1500Lx，除白天自然光照外，夜间不用补光。

从表1可见，各个激素组合的分化率不同，18号、19号、20号、22号、23号、24号、26号、27号和28号是沙冬青种子胚的培养基较佳的诱导培养基，即WH(无KI)+NAA 0.1～0.5mg/L+6-BA 0.5～1mg/L+GA 0.5mg/L+活性炭1g/L，不但诱导率高，而且每个外植体新增芽数多，分化率最高，其分化率可达233.33～266.67％。对比WH基础培养基有KI微量元素和无KI微量元素的区别，可以发现，当WH基础培养基存在KI微量元素时，培养基褐化现象严重，而WH基础培养基无KI微量元素时，有效减缓甚至消除培养基褐化现象。

表1：不同培养基和激素浓度对沙冬青生长点丛生芽诱导率的影响

2、继代增殖培养基的选择

将上述诱导分化出的不定芽分别接种到继代增殖培养基上，标记好初代培养基编号，NAA设0.1mg/L、0.5mg/L两个浓度梯度，6-BA设0.1mg/L、0.5mg/L两个浓度梯度，共四种培养基，每组重复3次，每瓶接5个单株，观察记录再生不定芽的分化生长情况，15天后统计不同激素组合条件下芽的增殖倍数。

继代培养条件与初代培养条件相同。经诱导培养后，将在诱导培养基中产生的0.2-0.5cm的沙冬青丛生芽生长点，分别移入继代增殖培养基中(见表2)，2-3天后部分材料的芽基部出现芽丛时开始观察记录，15天后统计试验结果，部分数据见表2(其他特征不明显或效果不明显的数据未记入)。

表2：激素浓度及其组合对沙冬青不定芽增殖的影响

试验表明，沙冬青在WH(无KI)+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.1mg/L+GA 0.5mg/L+活性炭1g/L的继代培养中，对丛生芽的生长有促进作用，相比其他组合更为理想，增值倍数最高可达16.43倍，丛生芽数量多，幼苗较大，移植出苗率效果最佳。但通过对比不同初代培基不定芽的继代增殖倍数，可以发现初代培养基的激素环境会对不定的芽后期增殖阶段的适应性带来影响，综合结果表明：初代培养基WH(无KI)+NAA 0.1～0.5mg/L+6-BA 0.5～1mg/L+GA0.5mg/L+活性炭1g/L，和继代培养基WH(无KI)+NAA 0.1mg/L+6—BA

0.1mg/L+GA 0.5mg/L+活性炭1g/L的组合效果最佳。

3、生根培养基的选择

将继代培养基中长势较好的苗，分成单株转入生根培养基中，B9分为0mg/L、0.5mg/L、1mg/L、1.5mg/L三个浓度梯度，共四种培养基，每组重复3次，每瓶接入4株，观察记录不同培养基上苗的生根情况，10天后统计生根率。

生根培养条件为温度26±1℃，昼夜温差范围7～8℃，湿度50～60％光照强度2000Lx，除白天自然光照外，夜间不用补光。

B9为农药丁酰肼，添加目的是控制有害物质分泌，阻止过快生长，提高组培苗的成活率。

其中MS基本培养基中，用3.5g/L的卡拉胶代替琼脂作固化剂，20g/L食用白糖代替蔗糖作为碳源，以自来水代替蒸馏水。

从生根培养10天的试验结果来看(表3)，两个培养基对根的形成均有诱导作用，其中3号生根培养基生根和移栽效果较好，生根率达75％、移栽成活率达55.56％。生根基部可新增带根的丛生芽，平均可达3-4个。因此，适宜生根的培养基是1/2MS+IAA 0.1mg/L+B91mg/L。

表3：不同丁酰肼浓度对幼苗生根和移栽的影响

处理编	培养基成分	生根率	根系生长状	移栽成活率
					1	1/2MS+IAA 0.5mg/L+B9 0	33.33	粗短，数量	16.67
2	1/2MS+IAA 0.5mg/L+B9	50.00	粗短，数量	38.89
					3	1/2MS+IAA 0.5mg/L+B9	75.00	长，数量多	55.56

生根培养后，为了提高沙冬青幼苗对移栽环境的适应性，可以对其进行炼苗，优选地栽培基质为质量比为蛭石10～30％，沙土10～30％，羊粪5～15％，草炭磷酸二铵40～60％，更为优选为蛭石20％，土20％，羊粪10％，草炭磷酸二铵50％，组培苗成活率达80～90％。

以上实施例目的是为具体说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

Claims

1.一种沙冬青的组织培养方法，其特征在于由以下步骤组成：

步骤1：外植体取自沙冬青种子的胚；

步骤2:将外植体接种于初代诱导培养基上，诱导分化出丛生芽；初代诱导培养基为WH（无KI）+NAA 0.1~0.5mg/L+6-BA 0.5~1mg/L+GA 0.5 mg/L+活性炭 1g/L；

步骤4：将上述诱导生根后的沙冬青生根苗进行移栽；

所述WH（无KI）为不添加微量元素KI的WH基本培养基。

2.根据权利要求1所述的沙冬青的组织培养方法，其特征在于：所述的初代诱导培养的条件为培养温度26±1℃，昼夜温差7~8℃，湿度50%~60%，光照强度1500Lx，夜间无需补光；所述的继代培养条件与初代诱导培养的条件相同。

3.根据权利要求1所述的沙冬青的组织培养方法，其特征在于：所述的生根培养条件为培养温度26±1℃，昼夜温差7~8℃，湿度50%~60%，光照强度2000Lx，夜间无需补光。

4.根据权利要求1所述的沙冬青的组织培养方法，其特征在于：所述步骤1中沙冬青取外植体过程为：将饱满、无病虫害的沙冬青种子流水冲洗，用0.1%的升汞溶液消毒5min，无菌水冲洗3~4次，每次5min，在无菌滤纸上吸干水分，之后在超净工作台挑出沙冬青的种子胚作为再生的外植体，若种子胚较小，可在解剖镜下处理。

5.根据权利要求1所述的沙冬青的组织培养方法，其特征在于：步骤4移栽后的栽培基质为蛭石20%，土20%，羊粪10%，草炭磷酸二铵50%。

6.根据权利要求1所述的沙冬青的组织培养方法，其特征在于：所述继代培养基为WH（无 KI）+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.1mg/L+GA 0.5 mg/L+活性炭 1g/L；所述WH（无KI）为不添加微量元素KI的WH基本培养基。

7.根据权利要求1所述的沙冬青的组织培养方法，其特征在于：所述生根培养基为1/2MS+IAA 0.1mg/L+B9 1mg/L。

8.根据权利要求1或权利要求6任一所述的沙冬青的组织培养方法，其特征在于：所述WH基本培养基，用3.5g/L的卡拉胶代替琼脂作固化剂，40g/L食用白糖代替蔗糖作为碳源，以自来水代替蒸馏水。

9.根据权利要求7所述的沙冬青的组织培养方法，其特征在于：所述MS基本培养基，用3.5g/L的卡拉胶代替琼脂作固化剂，20g/L食用白糖代替蔗糖作为碳源，以自来水代替蒸馏水。