CN107318653A - 一种白及胚状体的诱导培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种白及胚状体的诱导培养方法，该方法以白及种子为外植体，先培养出未分化出子叶的原球茎，接着对未分化出子叶的原球茎进行培养，获得分裂能力强、颜色为绿色的胚性组织细胞，最后通过对胚性组织细胞的诱导培养获得白及胚状体，为白及优质种苗的大量培育和快速繁殖提供了一条新途径，可有效地解决当前白及植物资源和种苗资源短缺的问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种白及胚状体的诱导方法，具体涉及一种白及胚状体的诱导培养方法。
背景技术
中国药典规定的中药白及为兰科植物白及Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.的干燥块茎，具有补肺、消肿、生肌、止血、敛疮等功效，用于治疗肺伤咳血、金疮出血、溃疡疼痛、汤火灼伤、手足皲裂等症。
近年来因白及在治疗止血、消肿生肌以及作为化妆品原材料的应用中具有良好的效果而需求量大增。从20世纪80年代以来，白及已成为药用植物中最具代表性和全局影响力的药用植物资源之一。但白及作为中药材历来以采收野生资源提供药用，目前野生白及已遭到过度采挖，数量急剧减少。又由于白及种子非常细小，在自然条件下很难自主萌发生长，因此急需开展人工繁育和栽培。
目前，已有利用组培技术培养白及种子快速成苗的报道，如专利申请号为201110175931.1的“一种快速繁殖白芨苗的方法”，该方法选择白芨成熟种子作为外植体，将种子消毒后接种至萌发培养基中形成原球茎，切割原球茎使原球茎增殖，然后利用原球茎诱导丛生芽，最后切割丛生芽使其大量繁殖。目前还未见有先将白及种子培养出原球茎胚性细胞后，再进一步由原球茎胚性细胞诱导培养出白及胚状体的报道。白及胚状体具有胚的特性，在条件允许的情况下可快速生长为白及植株，能有效解决白及种苗短缺的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种白及胚状体的诱导培养方法，该方法诱导培育出的白及胚状体，在适当的条件下可快速生长为再生植株，从而实现白及植物种苗的快速繁殖。
本发明提供的白及胚状体的诱导培养方法包括如下步骤：
(1)种子的选择及消毒：选取已成熟且果皮已开裂的白及种子，将其进行消毒处理；
(2)原球茎的诱导：将消毒后的白及种子接入半固体培养基1/2MS+6-BA0.1～1.0mg/L+活性炭3.0～5.0g/L+琼脂1.5～3.0g/L中，在培养温度为20～26℃、每天光照10～24小时、光照强度为1500～3000lx的条件下进行原球茎的诱导培养；
(3)原球茎胚性组织细胞培养：选取步骤(2)中未分化出子叶的原球茎，接入固体培养基1/2MS+2iP0.5～2.0mg/L+IAA0.5～1.0mg/L+2,4-D1.0～3.0mg/L中，在培养温度为15～22℃、每天光照6～12小时、光照强度为800～1200lx的条件下进行培养，培养15～25天继代一次，连续进行2次继代培养，获得原球茎胚性组织细胞；
(4)白及胚状体的产生：选取步骤(3)中获得的颜色为绿色的胚性组织细胞，接入固体培养基1/2MS+TDZ1.0～3.0mg/L+NAA0.5～2.0mg/L+酵母提取物100～400mg/L中，在培养温度为22～30℃、每天光照12～24小时、光照强度为2000～3000lx的条件下诱导产生胚状体；
上述所有培养基的蔗糖为20～40g/L、pH值为5.8～6.6；其中固体培养基的琼脂为5.0～6.5g/L。
进一步地，步骤(1)中所述消毒处理是指将白及种子按白及种子:升汞溶液＝1:10的体积比放入0.1％的升汞溶液中消毒7～15分钟，再用无菌水清洗8～15分钟。
进一步地，步骤(2)中所述将消毒后的白及种子接入半固体培养基是指将消毒后的白及种子均匀分散地接入至半固定培养基的中下部，其接种密度为2000～3000粒/L。
本发明采用组织培养技术，首先通过选取白及种子和对白及种子的消毒以及原球茎诱导培养基和培养条件的筛选，培育出未分化出子叶的原球茎，接着对未分化出子叶的原球茎进行培养，获得分裂能力强、颜色为绿色的胚性组织细胞，最后通过对胚性组织细胞的诱导培养获得白及胚状体，为白及优质种苗的大量培育和快速繁殖提供了一条新途径，可有效地解决当前白及植物资源和种苗资源短缺的问题。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供的白及胚状体的诱导培养方法包括如下步骤：
(1)种子的选择及消毒：选取已成熟且果皮刚开裂的白及种子，将白及种子及浓度为0.1％的升汞溶液按体积比1:10放入离心管中消毒11分钟，再用无菌水清洗12分钟；
(2)原球茎的诱导：将消毒后的白及种子用药匙接入半固体培养基1/2MS+6-BA0.5mg/L+活性炭4.0g/L+琼脂2.0g/L中，并用药匙沿同一方向搅拌，使白及种子均匀分散在半固体培养基的中下部，其接种密度为2500粒/L，在培养温度为25℃、每天光照16小时、光照强度为2000lx的条件下进行原球茎的诱导培养，培养15天统计，原球茎的染菌率为0％，褐化率为0％，未分化出子叶的原球茎诱导率为100％；
(3)原球茎胚性组织细胞的培养：选取步骤(2)中未分化出子叶的原球茎，直接转接入固体培养基1/2MS+2iP1.0mg/L+IAA0.8mg/L+2,4-D2.0mg/L中,在培养温度为20℃、每天光照8小时、光照强度为1000lx的条件下进行培养，培养20天继代一次，连续进行2次继代培养，可获得原球茎胚性组织细胞，经显微观察统计，原球茎胚性组织细胞的诱导率为96.51％；
(4)白及胚状体的产生：选取步骤(3)中获得的分裂能力强、颜色为绿色的胚性组织细胞，接入固体培养基1/2MS+TDZ2.0mg/L+NAA1.0mg/L+酵母提取物250mg/L中，在培养温度为26℃、每天光照18小时、光照强度为2500lx的条件下培养50天后统计，有94.99％的胚性组织细胞表面产生出胚状体，经显微切片观察，形成的胚状体与母体组织的维管束不连接，有独立的维管束系统；
上述所有培养基的蔗糖为30g/L、pH值为6.0；其中固体培养基的琼脂为5.5g/L。
实施例2
本实施例提供的白及胚状体的诱导培养方法包括如下步骤：
(1)种子的选择及消毒：选取已成熟且果皮刚开裂的白及种子，将白及种子及浓度为0.1％的升汞溶液按照体积比1:10放入离心管中消毒7分钟，再用无菌水清洗8分钟；
(2)原球茎的诱导：将消毒后的白及种子用药匙接入半固体培养基1/2MS+6-BA0.1mg/L+活性炭3.0g/L+琼脂1.5g/L中，并用药匙沿同一方向搅拌，使白及种子均匀分散在半固体培养基的中下部，其接种密度为2000粒/L，在培养温度为20℃、每天光照10小时、光照强度为1500lx的条件下进行原球茎的诱导培养，培养15天统计，原球茎的染菌率为11％，褐化率为0％，未分化出子叶的原球茎诱导率为93％；
(3)原球茎胚性组织细胞的培养：选取步骤(2)中未分化出子叶的原球茎，直接转接入固体培养基1/2MS+2iP0.5mg/L+IAA0.5mg/L+2,4-D1.0mg/L中；在培养温度为15℃、每天光照6小时、光照强度为800lx的条件下进行培养，培养15天继代一次，连续进行2次继代培养，可获得原球茎胚性组织细胞，经显微观察统计，原球茎胚性组织细胞的诱导率为92.56％；
(4)白及胚状体的产生：选取步骤(3)中获得的分裂能力强、颜色为绿色的胚性组织，接入固体培养基1/2MS+TDZ1.0mg/L+NAA0.5mg/L+酵母提取物100mg/L中，在培养温度为22℃、每天光照12小时、光照强度为2000lx的条件下培养50天后统计，有90.23％的胚性组织细胞表面产生胚状体，经显微切片观察，形成的胚状体与母体组织的维管束不连接，有独立的维管束系统；
上述所有培养基中蔗糖为20g/L、pH值为5.8；其中固体培养基中的琼脂为5.0g/L。
实施例3
本实施例提供的白及胚状体的诱导培养方法包括如下步骤：
(1)种子的选择及消毒：选取已成熟且果皮刚开裂的白及种子，将白及种子及浓度为0.1％的升汞溶液按照体积比1:10放入离心管中消毒15分钟，再用无菌水清洗15分钟；
(2)原球茎的诱导：将消毒后的白及种子用药匙接入半固体培养基1/2MS+6-BA1.0mg/L+活性炭5.0g/L+琼脂3.0g/L中，并用药匙沿同一方向搅拌，使白及种子均匀分散在半固体培养基的中下部，其接种密度为3000粒/L，在培养温度为26℃、每天光照24小时、光照强度为3000lx的条件下进行原球茎的诱导培养，培养15天统计，原球茎的染菌率为0％，褐化率为25％，未分化出子叶的原球茎诱导率为89％；
(3)原球茎胚性组织细胞培养：选取步骤(2)中未分化出子叶的原球茎，直接转接入固体培养基1/2MS+2iP2.0mg/L+IAA1.0mg/L+2,4-D3.0mg/L中；在培养温度为22℃、每天光照12小时、光照强度为1200lx的条件下进行培养，培养25天继代一次，连续进行2次继代培养，可获得原球茎胚性细胞，经显微观察统计，原球茎胚性组织细胞的诱导率为90.65％；
(4)白及胚状体的产生：选取步骤(3)中产生的分裂能力强、颜色为绿色的胚性组织细胞，接入固体培养基1/2MS+TDZ3.0mg/L+NAA2.0mg/L+酵母提取物400mg/L中，在培养温度为30℃、每天光照24小时、光照强度为3000lx的条件下培养50天后统计，有90.28％的胚性组织表面产生胚状体，经显微切片观察，形成的胚状体与母体组织的维管束不连接，有独立的维管束系统；
上述所有培养基的蔗糖为40g/L、pH值为6.6；其中固体培养基的琼脂为6.5g/L。
实施例4
将实施例1步骤(1)中白及种子的消毒时间改为7分钟，其它步骤同实施例1，培养15天统计，染菌率为12％，原球茎的褐化率为0％，未分化出子叶的原球茎诱导率为95％。
实施例5
将实施例1步骤(1)中白及种子的消毒时间改为15分钟，其它步骤同实施例1，培养15天统计，染菌率为0％，原球茎的褐化率为28％，未分化出子叶的原球茎诱导率为89％。
实施例6
将实施例1步骤(3)中的固体培养基改为1/2MS+2iP0.5mg/L+IAA0.5mg/L+2,4-D1.0mg/L，其它步骤同实施例1，经显微观察统计，原球茎胚性组织细胞的诱导率为93.41％。
实施例7
将实施例1步骤(4)中的固体培养基改为1/2MS+TDZ1.0mg/L+NAA0.5mg/L+酵母提取物100mg/L，其它步骤同实施例1，培养50天后统计，有88.23％的胚性组织表面产生浅绿色类圆形的胚状体。
比较实施例1
将实施例1步骤(1)中白及种子的消毒时间改为4分钟，其它步骤同实施例1，培养15天统计，原球茎的染菌率为61.38％，褐化率为0％，未分化出子叶的原球茎诱导率为72％。
比较实施例2
将实施例1步骤(1)中白及种子的消毒时间改为20分钟，其它步骤同实施例1，培养15天统计，染菌率为0％，原球茎的褐化率为68％，未分化出子叶的原球茎的诱导率为38％。
比较实施例3
将实施例1步骤(2)中所述白及种子改接入固体培养基1/2MS+6-BA0.5mg/L+活性炭0.4％+琼脂5.5g/L的表面，其它步骤同实施例1，培养15天统计，未分化子叶的原球茎的诱导率仅为6.52％。
比较实施例4
将实施例1步骤(2)中白及种子的接种密度改为5000粒/L，其它步骤同实施例1，培养15天统计，染菌率为27％，原球茎褐化率为43.54％，未分化出子叶的原球茎诱导率仅为61.52％。
比较实施例5
在实施例1步骤(3)中，改选分化出子叶的原球茎接入固体培养基中，其它步骤同实施例1，继代培养后获得原球茎胚性细胞，经显微观察统计，原球茎胚性组织细胞的诱导率仅为8.31％。
比较实施例6
将实施例1步骤(3)中所述固体培养基改为MS+6-BA1.0mg/L+IAA1.0mg/L+2,4-D2.0mg/L，其它步骤同实施例1，继代培养后获得原球茎胚性组织细胞，经显微观察，原球茎胚性组织细胞的诱导率仅为19.26％。
比较实施例7
将实施例1步骤(3)中所述继代培养改为只进行1次继代培养，其它步骤同实施例1，继代培养后获得原球茎胚性组织细胞，经显微观察，原球茎胚性组织细胞的诱导率仅为29.76％。
比较实施例8
在实施例1步骤(4)中，改选颜色为黄白色的胚性组织细胞，其它步骤同实施例1，培养50天后统计，仅有29.96％的胚性组织细胞表面产生胚状体。
比较实施例9
将实施例2步骤(4)所述固体培养基改为1/2MS+NAA1mg/L+酵母提取物250mg/L，其它步骤同实施例1，培养50天后统计，仅有28.48％的胚性组织细胞表面产生胚状体。
Claims (3)
1.一种白及胚状体的诱导培养方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)种子的选择及消毒：选取已成熟且果皮已开裂的白及种子，将其进行消毒处理；
(2)原球茎的诱导：将消毒后的白及种子接入半固体培养基1/2MS+6-BA0.1～1.0mg/L+活性炭3.0～5.0g/L+琼脂1.5～3.0g/L中，在培养温度为20～26℃、每天光照10～24小时、光照强度为1500～3000lx的条件下进行原球茎的诱导培养；
(3)原球茎胚性组织细胞的培养：选取步骤(2)中未分化出子叶的原球茎，接入固体培养基1/2MS+2iP0.5～2.0mg/L+IAA0.5～1.0mg/L+2,4-D1.0～3.0mg/L中，在培养温度为15～22℃、每天光照6～12小时、光照强度为800～1200lx的条件下进行培养，培养15～25天继代一次，连续进行2次继代培养，获得原球茎胚性组织细胞；
(4)白及胚状体的产生：选取步骤(3)中获得的颜色为绿色的胚性组织细胞，接入固体培养基1/2MS+TDZ1.0～3.0mg/L+NAA0.5～2.0mg/L+酵母提取物100～400mg/L中，在培养温度为22～30℃、每天光照12～24小时、光照强度为2000～3000lx的条件下诱导产生胚状体；
上述所有培养基的蔗糖为20～40g/L、pH值为5.8～6.6；其中固体培养基的琼脂为5.0～6.5g/L。
2.根据权利要求1所述的白及胚状体的诱导培养方法，其特征在于：步骤(1)中所述消毒处理是指将白及种子按白及种子:升汞溶液＝1:10的体积比放入0.1％的升汞溶液中消毒7～15分钟，再用无菌水清洗8～15分钟。
3.根据权利要求1所述的白及胚状体的诱导培养方法，其特征在于：步骤(2)中所述将消毒后的白及种子接入半固体培养基是指将消毒后的白及种子均匀分散地接入至半固定培养基的中下部，其接种密度为2000～3000粒/L。
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