CN115725644A - 一种多花黄精的遗传转化方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种多花黄精的遗传转化方法及应用，涉及遗传转化技术领域。本发明以毛状根为媒介的高效遗传转化体系，利用含有工程菌菌液侵染多花黄精外植体，获得了转基因毛状根，侵染过程简单易学，结果高效直观，能够稳定获得多花黄精转基因毛状根。利用本发明所述遗传转化方法，在最优条件下可将诱导率提高至88.8％，可应用于多花黄精的基因功能验证。
Description
技术领域
本发明属于遗传转化技术领域，具体涉及一种多花黄精的遗传转化方法及应用。
背景技术
多花黄精(又名姜形黄精，Polygonatum cyrtonema Hua)，百合科黄精属多年生草本植物，为历版《中国药典》收载的3种基源黄精药材之一。多花黄精种子自然条件下难以萌发，目前尚无影响多花黄精种子萌发的关键基因遗传转化体系。
毛状根(hairy roots)又称发状根，是指利用发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)侵染植物后，其Ri质粒的转移脱氧核糖核酸(T-DNA)整合到植物细胞核基因组，使植物合成冠瘿碱之后产生的许多不定根。发根农杆菌中的Ri质粒经过改造修饰后，其T-DNA片段区可以将目标基因插入宿主植物的基因组中，即可产生转基因毛状根。由于毛状根具有生长迅速、周期短且不需要外源植物激素、合成次生代谢物质能力强且稳定等优点，因此被广泛应用于药用植物的基础研究，为实现药用植物次生代谢产物的工业化生产提供了广阔前景，但是现有的多花黄精的遗传转化方法存在转化效率低的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多花黄精的遗传转化方法及应用，建立多花黄精毛状根高效遗传转化体系，为后续的基因功能研究提供技术支撑。
本发明提供了一种多花黄精的遗传转化方法，包括以下步骤：将目标基因转化至发根农杆菌中，利用含乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基进行重悬，得侵染液；
以多花黄精的小球茎为外植体，对所述外植体进行表面划伤和深层戳伤，而后置于所述侵染液中；
侵染结束后，吸取表面菌液，接种至含乙酰丁香酮的1/2MS固体培养基中进行共培养，将在共培养过程中形成的含菌斑的外植体进行除菌培养；
将除菌培养后诱导出来的毛状根剪下，经筛选后得到转基因毛状根。
优选的，所述发根农杆菌的菌株包括A4、ATCC15834或LBA9402。
优选的，所述1/2MS液体培养基中乙酰丁香酮的浓度为50～150μmol/L。
优选的，所述外植体的制备方法，包括将在4℃沙藏两个月的多花黄精种子，接种在萌发培养基中进行暗培养两个月。
优选的，所述萌发培养基以MS培养基为基础培养基，还包括1mg/L 6-BA和0.5mg/LNAA。
优选的，所述表面划伤和深层戳伤，包括：利用无菌接种刀在外植体表面划出1～2个伤口，然后再用接种针在伤口周围戳出2～5个小伤口。
优选的，所述共培养包括于25～28℃条件下暗培养，所述共培养的时间为0～3d。
优选的，所述除菌培养包括首先将含菌斑的外植体用无菌水清洗2～3遍，再用含抗生素的无菌水清洗2～3遍，最后再用无菌水清洗2～3遍，吸干表面水分后接种在含抗生素的固体培养基中；
所述除菌培养每隔一周进行一次，直至无菌。
优选的，所述筛选包括将剪下的毛状根放在固体培养基(1/2MS+5mg/L潮霉素)中，25～28℃暗培养，筛选出生长速度快、生长较多的毛状根发根系，通过RNA提取，鉴定出转基因不定根根系，之后将鉴定出的转基因不定根根系放在液体培养基(1/2MS+0.1mg/LNAA)中，进行悬浮培养。
本发明还提供了利用上述遗传转化方法进行多花黄精基因功能鉴定中的应用。
有益效果：本发明提供了一种多花黄精的遗传转化方法，以毛状根为媒介的高效遗传转化体系，利用含有工程菌菌液侵染多花黄精外植体，获得了转基因毛状根，侵染过程简单易学，结果高效直观，能够稳定获得多花黄精转基因毛状根。本发明所述遗传转化方法，在诱导方式上进行了改动，先大面积进行划伤，再小面积进行戳伤，选择划伤和戳伤两种方式联用的处理，可以提高诱导的效率。本发明在侵染以及共培养过程中，均去除蔗糖，而在之后诱导出毛状根之后，恢复了蔗糖的添加，与诱导过程全程添加蔗糖相比，这种先去除蔗糖又添加蔗糖的方法既能有效减少农杆菌的生长又能促进毛状根的增殖，污染率能够降低20％，增殖率能够增加15％。利用本发明所述遗传转化方法，可通过优化出的毛状根体系获得转基因根，获得的毛状根可应用于多花黄精基因功能的鉴定(包括被转化的基因表达量的检测以及其他目标基因表达量的检测等)，为多花黄精遗传转化体系鉴定了基础。
在本发明实施例中，通过对PcZEP基因进行遗传转化，并筛选得到了适宜多花黄精毛状根诱导的农杆菌类型、预培养、侵染以及共培养时间，发根农杆菌类型为A4，预培养0d，侵染时间2h，共培养2d是较为适宜的多花黄精毛状根诱导条件，在此实验条件下诱导率可达88.8％。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为多花黄精未沙藏的种子；
图2为多花黄精沙藏结束后进行外植体消毒的种子；
图3为多花黄精萌发两个月后的多花黄精外植体材料；
图4为用A4农杆菌侵染2h，共培养3d之后的多花黄精材料；
图5为用A4农杆菌侵染2h，共培养3d之后除菌结束的多花黄精材料；
图6为通过Ri质粒的rolB基因验证毛状根，M：2000bp DNAmarker，1：阴性对照、2-4：转基因毛状根发根系、5：阳性质粒；
图7为转基因工程菌的单克隆示意图；
图8为本发明的转基因毛状根系的GUS染色示意图；
图9为PcZEP的核苷酸序列。
具体实施方式
本发明提供了一种多花黄精的遗传转化方法，包括以下步骤：将目标基因转化至发根农杆菌中，利用含乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基进行重悬，得侵染液；
以多花黄精的小球茎为外植体，对所述外植体进行表面划伤和深层戳伤，而后置于所述侵染液中；
侵染结束后，吸取表面菌液，接种至含乙酰丁香酮的1/2MS固体培养基中进行共培养，将在共培养过程中形成的含菌斑的外植体进行除菌培养；
将除菌培养后诱导出来的毛状根剪下，经筛选后得到转基因毛状根。
本发明将目标基因转化至发根农杆菌中，利用含乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基进行重悬，得侵染液。本发明对所述目标基因并没有特殊限定，可以是多花黄精基因组中的任意基因，实施例中以多花黄精PcZEP基因(图9)为例进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。本发明实施例中优选通过同源重组的方式将多花黄精PcZEP与植物真核表达载体pCAMBIA1301连接，获得含有目的基因的植物表达载体，之后通过冻融法转入发根农杆菌感受态中，获得含有PcZEP的植物表达载体的发根农杆菌工程菌。
本发明在构建得到含有目标基因的发根农杆菌后，优选还包括扩大培养，具体包括将含有目标基因的发根农杆菌在含有相应抗性的LB固体培养基上划线，之后挑取单菌落，放入含有相应抗性的液体培养基中进行扩大培养，扩大培养至OD600为0.6～0.8。本发明所述发根农杆菌的菌种优选包括A4、ATCC15834或LBA9402，其中A4的抗性为K+，LBA9402的抗性为Rif+。本发明在所述扩大培养后，将其利用含50～150μmol/L乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基进行两次重悬，制备成侵染液，所述乙酰丁香酮的浓度优选为100μmol/L。
本发明以多花黄精的小球茎为外植体，对所述外植体进行表面划伤和深层戳伤，而后置于所述侵染液中。本发明所述外植体的制备方法，优选包括选择4℃沙藏两个月并在萌发培养基生长两个月的多花黄精小球茎作为外植体，在进行侵染液的侵染前，优选还可以对所述外植体进行预培养，所述预培养优选包括将所述外植体置于含有100μmol/L乙酰丁香酮的1/2MS固体培养基中，25～28℃暗培养0～3d，更优选的暗培养0d。本发明所述萌发培养基优选包括以MS培养基为基础培养基，还包括1mg/L 6-BA和0.5mg/LNAA。在本发明中，对多花黄精毛状根诱导过程中，包括包括预培养、共培养以及除菌培养时，所用的1/2MS培养基为改良培养基，即在培养基母液中不添加含大量元素的KNO3，不添加肌醇；并且在预培养和共培养时培养基中不添加蔗糖，但在其他培养过程中培养基中均添加蔗糖，且蔗糖的添加量优选为30g/L。
本发明利用所述侵染液对外植体进行侵染，整个侵染过程均在无菌环境中进行，实施例中在超净工作台上进行所述侵染，在进行侵染前，先用无菌接种刀到对外植体划出1～2个伤口，然后再用接种针在伤口周围戳出2～5个小伤口，能够使得侵染液可以与外植体充分接触，从而提高遗传转化成功率。本发明所述侵染的时间优选为2～3h。
本发明在侵染结束后，吸取表面菌液，接种至含乙酰丁香酮的1/2MS固体培养基中进行共培养，将在共培养过程中形成的含菌斑的外植体进行除菌培养。本发明在所述侵染结束之后，优选用无菌滤纸吸干外植体表面残留的菌液，然后接种在含有100μmol/L乙酰丁香酮的1/2MS固体培养基中，25～28℃暗培养条件下共培养0～3d。本发明在所述共培养时，所用的培养基不含蔗糖，去除蔗糖可以有效抑制农杆菌的生长，而不会抑制转化和毛状根的形成，但是无糖会使得培养基上发育的根生长缓慢，因此，在成功诱导出毛状根后，将毛状根转移到添加蔗糖的培养基上。
本发明所述除菌培养由3种不同的除菌方式组成，优选包括将在共培养过程中形成的含菌斑的外植体先用无菌水清洗2～3遍，再用含有抗生素的无菌水清洗2～3遍，最后再用无菌水清洗2～3遍，用无菌滤纸吸干表面水分，接种在含有抗生素的固体培养基中，每隔一周除菌一次，直至无菌。本发明在除菌培养过程中所用的培养基优选为1/2MS+300mg/L特美汀。本发明实施例中，所用的抗生素优选为300mg/L特美汀。本发明所述除菌培养所用的除菌培养基同样不含蔗糖，这个过程需要用大量的无菌水进行清洗，在无菌水中添加300mg/L特美汀，可以减少菌的污染，先用无菌水，后用添加抗生素的无菌水，再用无菌水清洗，能够提高除菌效率。经实施例证实，利用本发明所述方法，与诱导过程全程添加蔗糖相比，本发明先去除蔗糖后又添加蔗糖的方法既能有效减少农杆菌的生长又能促进毛状根的增殖，污染率能够降低20％，增殖率能够增加15％。并且利用本发明所述除菌培养方法，与传统的先用添加抗生素的水，再用无菌水相比，除菌效率能够增加20％左右。
本发明将除菌培养后诱导出来的毛状根剪下，经筛选后得到转基因毛状根。本发明优选待诱导出来的根长到2～3cm时，将毛状根剪下放在固体培养基(1/2MS+5mg/L潮霉素)中，25～28℃暗培养，筛选出生长速度快、生长较多的毛状根发根系，通过RNA提取，鉴定出不定根根系，即为转基因毛状根。本发明在得到转基因毛状根后，优选还包括将所述转基因毛状根放在液体培养基(1/2MS+0.1mg/LNAA)中，进行悬浮培养。本发明所述筛选，优选包括：根据农杆菌及目的基因所含有的抗性进行筛选，待毛状根生长到一定程度时，先对其进行GUS染色，之后提取RNA以此来鉴定出转基因根，之后将其转移到相应的液体培养基中进行扩繁培养。
本发明还提供了利用上述遗传转化方法进行多花黄精基因功能鉴定中的应用。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种多花黄精的遗传转化方法及应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
多花黄精毛状根高效遗传转化体系的建立
(1)外植体材料的获得
将多花黄精种子进行4℃沙藏处理(图1)。两个月之后，将其接种在萌发培养基中暗培养条件下生长两个月(图2)，待长出小球茎后，以此为外植体进行侵染(图3)。
(2)发根农杆菌的筛选
选择A4、ATCC15834和LBA9402作为侵染菌株。
(3)预培养时间、侵染时间及共培养时间的筛选
a.将多花黄精初生根茎转接到1/2MS固体培养基中25～28℃暗培养0～2d。
b.将发根农杆菌LBA9402、ATCC15834和A4分别用接种于YEB固体培养基上，长菌后挑取单菌落至YEB液体培养基中培养，黑暗条件下28℃，180rpm震荡培养，复苏后的菌液OD600＝0.6～0.8时，6000rpm离心10min，弃上清留沉淀，重悬两次，加入等体积的含100μmol/LAS的1/2MS液体培养基，混匀后作为侵染液备用。
c.将预培养结束后的初生根茎先用无菌刀在表面作划伤处理，之后再用无菌接种针做戳伤处理，之后将带伤口的外植体放入到上述侵染液中，超净工作台中侵染2～3h。
d.将侵染后的初生根茎外植体从侵染液中取出，用无菌滤纸吸干表面菌液，随后接种在含有100μmol/LAS的1/2MS固体培养基中，并于25～28℃黑暗培养条件下共培养2～4d。
e.等到共培养结束时(图4)，将在共培养过程中形成的菌斑的外植体先用无菌水清洗2～3遍，再用含有300mg/L特美汀的无菌水清洗2～3遍，最后再用无菌水清洗2～3遍，用无菌滤纸吸干表面水分，接种在含有300mg/L特美汀的1/2MS固体培养基中，每隔一周除菌一次，直至无菌。
f.当诱导出来的根长到2～3cm时，将毛状根剪下放在固体培养基(1/2MS+5mg/L潮霉素)中，25～28℃暗培养，筛选出生长速度快、生长较多的毛状根发根系，通过DNA提取，鉴定出不定根根系(用rolB基因引物进行克隆，毛状根中含有rolB基因，不定根中没有)，之后将其放在液体培养基(1/2MS+0.1mg/LNAA)中，进行悬浮培养。
鉴定不定根根系：
表1RolB克隆引物
体系为10μL，其中上下游引物各0.5μL，PCR MIX为5μL，模板为1μL，无菌水为3μL；
扩增程序为：95℃5min；95℃30s，60.5℃30s，72℃1min，25个循环；72℃10min；4℃2min。
侵染后培养20d统计不同发根农杆菌类型、预培养、侵染以及共培养时间诱导的发根数，根据毛状根的诱导率筛选较佳的条件用于多花黄精的遗传转化。
由表2可知，多花黄精外植体经过预培养、发根农杆菌侵染和共培养，最后在1/2MS除菌培养基上培养14～20d得到多花黄精毛状根。由正交实验结果极差和方差的分析(表3)结果可以得出结论，发根农杆菌类型为A4，预培养0d，侵染时间2h，共培养2d是较为适宜的多花黄精毛状根诱导条件，在此实验条件下诱导率可达88.8％。此外，除发根农杆菌类型外，其他因素均为显著影响条件。
表2正交实验结果与极差分析
表3正交实验结果的方差分析
(4)除菌培养
等到共培养结束时，将在共培养过程中形成的菌斑的外植体先用无菌水清洗2～3遍，再用含有300mg/L特美汀的无菌水清洗2～3遍，最后再用无菌水清洗2～3遍，用无菌滤纸吸干表面水分，接种在含有300mg/L特美汀的1/2MS固体培养基中，每隔一周除菌一次，直至无菌(图5)；
(5)毛状根的继代培养
当诱导出来的根长到2～3cm时，将毛状根剪下放在不含激素的1/2MS固体培养基中，25～28℃暗培养。
(6)阳性毛状根的筛选及检测
随机挑取几个生长速度较快、分支较多的转基因毛状根作为检测对象，以未侵染多花黄精组培苗DNA作为阴性对照，以发根农杆菌质粒作为阳性对照，设计下列引物。由图6表明，从发根农杆菌转化外植体的总DNA中扩增到rolB，该片段与阳性对照菌株A4的Ri质粒DNA中扩增出的特异性片段大小是一致的，而未转化外植体的总DNA中扩增不到此片段。这说明发根农杆菌中T-DNA已整合到多花黄精毛状根基因组中。
实施例2
一种多花黄精PcZEP毛状根高效遗传转化体系的建立，包括以下步骤：
1、外植体的选择
选择多花黄精小球茎作为外植体材料，先用无菌刀在表面作划伤处理，之后再用无菌接种针做戳伤处理；
2、含目的基因重组载体工程菌液的构建及培养
(1)多花黄精PcZEP的克隆
以转录组测序得到的多花黄精PcZEP的全长序列(图9)为基础，利用PrimerPremier 5设计全长序列特异性引物PcZEP-F、PcZEP-R。以多花黄精小球茎cDNA为模板，进行RT-PCR反应以获得PcZEP的全长序列。
扩增PcZEP全长：
表4 PcZEP全长克隆所需引物
体系为25μL，其中上下游引物各1μL，PCRMIX为12.5μL，模板为1μL，无菌水为9.5μL；
扩增程序为：95℃5min；95℃30s，56.8℃30s，72℃2min，35个循环；72℃10min，4℃2min。
(2)多花黄精真核表达载体的构建
用带有酶切位点的同源重组引物克隆重新克隆目的片段，并将载体进行双酶切，通过同源重组的方法将目的片段与基因进行连接，并将其导入大肠杆菌感受态，涂布于具有相应抗性(pCAMBIA1301为K+抗性)的LB平板上，挑取单菌落进行阳性验证(图7)，并送至上海生工公司进行测序。将测序正确的菌液导入A4农杆菌感受态，利用表5中引物对进行菌液PCR，用阳性菌液进行测序，选取测序正确的农杆菌进行下一步实验。
表5 pCAMBIA1301-PcZEP构建所需引物
菌液PCR：
体系为10μL，其中上下游引物各0.5μL，PCR MIX为5μL，模板为1μL，无菌水为3μL；
菌液PCR扩增程序为：95℃5min；95℃30s，67.2℃30s，72℃2min，25个循环；72℃10min；4℃2min。
3、工程菌侵染外植体
利用步骤2得到的工程菌侵染步骤1得到的外植体2～3h。
4、共培养以及除菌培养
将侵染后的初生根茎外植体从侵染液中取出，用无菌滤纸吸干表面菌液，随后接种在含有100μmol/LAS的1/2MS固体培养基中，并于25～28℃黑暗培养条件下共培养3d。在共培养过程中形成的含菌斑的外植体先用无菌水清洗2～3遍，再用含有抗生素的无菌水清洗2～3遍，最后再用无菌水清洗2～3遍，用无菌滤纸吸干表面水分，接种在含有300mg/L特美汀的1/2MS固体培养基中，每隔一周除菌一次，直至无菌；
5、毛状根的继代增殖培养
当诱导出来的根长到2～3cm时，将毛状根剪下放在不含激素的1/2MS固体培养基中，25～28℃暗培养。
6、GUS及RT-PCR检测
根据pCAMBIA1301载体上具有的GUS基因，对诱导出来的毛状根先后进行GUS染色及分子检测。
检测结果表明，与实验室正常的组培根相比，诱导出来的根能够被GUS染液染成蓝色(图8)，初步说明转基因重组质粒已经整合到多花黄精毛状根中。之后提取转基因根的RNA，反转录成cDNA，利用PCR进行检测。检测结果表明，转基因毛状根能够检测出载体及目的片段上的PCR产物，而非转基因根则没有此片段，说明转PcZEP的重组质粒已经整合到多花黄精的毛状根中。
PCR检测引物：
1301+ZEPH-F(SEQ ID NO.7):TGATCAATACGCTTCCTGAAGCTCC
1301+ZEPH-R(SEQ ID NO.8):GAGTCCCCCGTGTTCTCTCCAAATG
体系(10μL)：上下游引物各0.5μL，PCR MIX为5μL，模板为1μL，无菌水为3μL；
扩增程序为：95℃5min；95℃30s，64℃30s，72℃2min，25个循环；72℃10min；4℃2min。
综上所述，本发明提供了多花黄精PcZEP毛状根高效遗传转化体系的建立，通过所述的方法，能够简单、快速、高效的获得多花黄精转基因毛状根。所述的方法通过正交实验得到了适宜的农杆菌类型、预培养、侵染以及共培养时间，之后通过适宜的方法进行含目的基因毛状根的诱导，并通过GUS及RT-PCR进行检测等，为构建简单高效的多花黄精PcZEP毛状根高效遗传转化体系奠定了基础。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种多花黄精的遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：将目标基因转化至发根农杆菌中，利用含乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基进行重悬，得侵染液；
以多花黄精的小球茎为外植体，对所述外植体进行表面划伤和深层戳伤，而后置于所述侵染液中；
侵染结束后，吸取表面菌液，接种至含乙酰丁香酮的1/2MS固体培养基中进行共培养，将在共培养过程中形成的含菌斑的外植体进行除菌培养；
将除菌培养后诱导出来的毛状根剪下，经筛选后得到转基因毛状根。
2.根据权利要求1所述遗传转化方法，其特征在于，所述发根农杆菌的菌株包括A4、ATCC15834或LBA9402。
3.根据权利要求1所述遗传转化方法，其特征在于，所述1/2MS液体培养基中乙酰丁香酮的浓度为50～150μmol/L。
4.根据权利要求1所述遗传转化方法，其特征在于，所述外植体的制备方法，包括将在4℃沙藏两个月的多花黄精种子，接种在萌发培养基中进行暗培养两个月。
5.根据权利要求4所述遗传转化方法，其特征在于，所述萌发培养基以MS培养基为基础培养基，还包括1mg/L 6-BA和0.5mg/LNAA。
6.根据权利要求1所述遗传转化方法，其特征在于，所述表面划伤和深层戳伤，包括：利用无菌接种刀在外植体表面划出1～2个伤口，然后再用接种针在伤口周围戳出2～5个小伤口。
7.根据权利要求1所述遗传转化方法，其特征在于，所述共培养包括于25～28℃条件下暗培养，所述共培养的时间为0～3d。
8.根据权利要求1所述遗传转化方法，其特征在于，所述除菌培养包括首先将含菌斑的外植体用无菌水清洗2～3遍，再用含抗生素的无菌水清洗2～3遍，最后再用无菌水清洗2～3遍，吸干表面水分后接种在含抗生素的固体培养基中；
所述除菌培养每隔一周进行一次，直至无菌。
9.根据权利要求1所述遗传转化方法，其特征在于，所述筛选包括将剪下的毛状根放在固体培养基中，25～28℃暗培养，筛选出生长速度快、生长较多的毛状根发根系，通过RNA提取，鉴定出转基因不定根根系，之后将鉴定出的转基因不定根根系放在液体培养基中，进行悬浮培养；
所述固体培养基以1/2MS为基础培养基，还包括5mg/L潮霉素；
所述液体培养基以1/2MS为基础培养基，还包括0.1mg/LNAA。
10.利用权利要求1～9任一项所述遗传转化方法进行多花黄精基因功能鉴定中的应用。
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