CN104878040A - 高通量的多年生黑麦草农杆菌转化体系及其专用试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高通量的多年生黑麦草(Lolium perenne L.)农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)转化体系，包括其专用试剂盒和转化方法。专用试剂盒包括发芽培养基、诱导培养基I、II、分化培养基、保持培养基、侵染液、共培养基、筛选培养基I、II、再生培养基和生根培养基。转化方法包括利用黑麦草丛生芽分生组织诱导的胚性愈伤作为外植体，经过农杆菌转化、筛选、再生和生根培养获得多年生黑麦草的转基因植株，本发明平均转化效率为8.5％，PCR阳性率超过90％。且本发明可持续、稳定、高通量的提供外植体，为黑麦草遗传改良的产业化进行提供了可行途径，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种高通量获得多年生黑麦草农杆菌转化的试剂盒和转化方法。
背景技术
多年生黑麦草(Lolium perenne L.)是世界上最重要的温带牧草之一(Jauhar 1993)，仅新西兰的种植面积就已超过700多万公顷(Siegal et al.1985)。同时多年生黑麦草又是一种异型杂交、风媒和高度自交不亲和的物种(Thorogood et al.2002)。因其高度自交不亲和性使得传统杂交育种在黑麦草优良品种的培育面前显得无计可施。而迅速崛起的生物技术育种度身定造般的弥补了此类空缺。通过高通量的农杆菌介导技术获得多年生黑麦草优良品种，对于改善动物的营养均衡、提高牛奶的产量和品质、增大乳品行业的利益，乃至改良人工草坪、防风固沙、保持水土、改善人类生存环境等都具有举足轻重的作用。
与其他单子叶植物相似，黑麦草属不是农杆菌的天然宿主。而农杆菌介导法比其他物理轰击法能更高效地获得了具备低拷贝、完整引入、稳定表达特性的转基因植株(Luo et al.2003；Han et al.2005)。到目前为止有关农杆菌转化多年生黑麦草的成功案例少之又少(Bettany et al.2003；Wu et al.2005；Bajaj et al.2006；Zhang et al.2012)。随着其他单子叶植物转化体系的突破，筛选组培效应敏感的基因型、优化培养基配方、简化转化流程，以期获得高效、稳定的遗传转化体系，为甄别影响产业性状的目标基因奠定了基础。
发明内容
为解决现有技术中无法用农杆菌对多年生黑麦草进行转化的缺陷，本发明提供一种多年生黑麦草农杆菌转化的试剂盒和转化方法。本发明的第一个目的为提供一种多年生黑麦草农杆菌转化的试剂盒，其具体组成如下：
本发明所述试剂盒依次包括发芽培养基、诱导培养基I、诱导培养基II、分化培养基、保持培养基、侵染液、共培养基、筛选培养基I、筛选培养基II、再生培养基和生根培养基；
所述发芽培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为30g/L的蔗糖和3g/L凝固剂；
所述诱导培养基I为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为22.6μM的2,4-二氯苯氧乙酸、30g/L的蔗糖和3g/L的凝固剂；
所述诱导培养基II为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为9μM的2,4-二氯苯氧乙酸、0.44μM的6-苄氨基腺嘌呤、30g/L蔗糖和3g/L的凝固剂；
所述分化培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为4.4μM的6-苄氨基腺嘌呤、30g/L麦芽糖和3g/L的凝固剂；
所述保持培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为8.8μM的6-苄氨基腺嘌呤、30g/L的蔗糖和3g/L的凝固剂；
所述侵染液为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为10g/L的葡萄糖和50g/L的蔗糖；
所述共培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为9μM的2,4-二氯苯氧乙酸、0.44μM的6-苄氨基腺嘌呤、400μM的乙酰丁香酮、10g/L的葡萄糖、70g/L的蔗糖和3g/L的凝固剂；
所述筛选培养基I为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为9μM的2,4-二氯苯氧乙酸、0.44μM的6-苄氨基腺嘌呤、50mg/L的潮霉素、200mg/L的特美汀、30g/L蔗糖的和3g/L的凝固剂；
所述筛选培养基II为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为9μM的2,4-二氯苯氧乙酸、0.44μM的6-苄氨基腺嘌呤、75mg/L的潮霉素、200mg/L的特美汀、30g/L的蔗糖和3g/L的凝固剂；
所述再生培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为4.4μM的6-苄氨基腺嘌呤、25mg/L的潮霉素、200mg/L的特美汀、30g/L的麦芽糖和3g/L的凝固剂；
所述生根培养基为1/2MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为30g/L的蔗糖和3g/的L凝固剂。
本发明中，所述凝固剂为植物凝胶。
本发明中，所述侵染液和共培养基的pH值为5.2，所述其他各培养基的pH值均为5.8。
本发明中所述的试剂盒可应用于多年生黑麦草农杆菌的转化。
本发明的另一目的为以所述试剂盒为基础，提供一种多年生黑麦草农杆菌的转化方法，其步骤优选如下：
1)“Impact”和“Evening Shade”的品系的遴选：
将多年生黑麦草品种“Impact”和“Evening Shade”的各1000粒种子进行脱壳和表面消毒后置于所述发芽培养基中培养，得到分生组织；将分生组织纵向解剖一分为二置于所述诱导培养基I上，诱导出黄色致密的胚性愈伤组织；将所述黄色致密的愈伤组织移至所述分化培养基上，遴选出再生良好的品系；
2)胚性愈伤组织的诱导：
将所述遴选出的再生性良好的品系的愈伤组织上分化出的绿头移至所述保持培养基上，得到丛生芽；将所述丛生芽的分生组织横向切下，依次接种于所述诱导培养基I和所述诱导培养基II上进行培养，得到胚性愈伤组织；
3)制备侵染用菌液：
先将重组农杆菌悬浮在所述侵染液中得到重悬菌液，再将所述重悬菌液中添加终浓度为400μM的乙酰丁香酮，得到侵染用菌液。
4)转化和筛选
将所述胚性愈伤组织和所述侵染用菌液混匀、连续摇动，将所述胚性愈伤组织取出晾干，得到侵染后的胚性愈伤组织，将所述侵染后的胚性愈伤组织在所述共培养培养基中进行共培养，共培养后依次移至所述筛选培养基I、II上，得筛选后的愈伤组织；将所述筛选后愈伤组织在所述再生培养基进行分化再生，至长出绿苗；
5)生根和壮苗
将所述长出绿苗的愈伤组织转至所述生根培养基上进行生根培养，待生根后进一步称移栽至土壤中壮苗，即得到转基因多年生黑麦草。
本发明步骤1)中所述脱壳和表面消毒的具体操作为：将种子浸泡在体积百分含量20％～100％的硫酸溶液中振摇10～30分钟进行脱壳，将脱壳后的种子用流水洗涤1-5小时，然后在30～60℃培养10～30分钟以杀死内生真菌，最后将种子用有效氯质量百分含量为3％～10％的次氯酸钠溶液表面消毒10～30min，所述次氯酸钠溶液中滴加10微升Tween20；所述脱壳和表面消毒的操作优选为：将种子浸泡在体积百分含量50％的硫酸溶液中振摇20分钟进行脱壳，将脱壳后的种子用流水洗涤3～4小时，然后在56℃培养15分钟以杀死内生真菌，最后将种子用有效氯质量百分含量为5％的次氯酸钠溶液表面消毒20min，所述次氯酸钠溶液中滴加10微升Tween20
本发明步骤1)中，在所述发芽培养中的培养条件为22-25℃黑暗培养5-9天和22-25℃光照培养1-3天；优选为为24℃黑暗培养7天和24℃光下培养2天；
在所述诱导培养基中的培养条件为22-25℃黑暗培养2-7周；优选为为24℃黑暗培养4-5周；
在所述分化培养基中的培养条件为22-25℃光照培养2-7周；优选为24℃光照培养4周；
本发明步骤2)中，在所述保持培养基中的培养条件为22-25℃光照至长出丛生芽；优选为24℃光照培养至长出丛生芽；
在所述诱导培养I中培养的条件为22～25℃黑暗培养4周，优选为24℃黑暗培养4周；
在所述诱导培养II中的培养条件为22～25℃黑暗培养，并于转化前2-10天继代一次；优选为24℃黑暗培养4周，并于转化前5-7天继代一次；
本发明步骤3)中，所述重悬菌液中菌的浓度为OD600＝0.6-0.8。
本发明步骤4)中，在所述共培养基上的培养条件为22-25℃暗培养2-5天，优选为24℃暗培养4天；
在所述筛选培养I、II上的培养的条件均为22-25℃黑暗培养1-3周，优选为24℃黑暗培养2周。
本发明步骤5)中，在所述生根培养基中的培养条件为22-25℃光照培养2周，所述壮苗的条件为温度22-25℃、光照强度145-155μmol/m2/s、光周期16/8h培养3.5-4.5周，优选为温度24℃、光照强度150μmol/m2/s、光周期16/8h培养4周。
本发明中，所述重组农杆菌为将质粒pCAMBIA1305.1转入根瘤农杆菌EHA101中得到的重组农杆菌。
有益效果：
本发明从黑麦草品种“Impact”和“Evening Shade”的1000个基因型品系中挑选出5个组培效应敏感的基因型，标记为I1、I2、I3和E1、E2。利用I1和E1丛生芽分生组织诱导的胚性愈伤作为外植体，经过农杆菌转化、筛选、再生和生根培养获得了多年生黑麦草的转基因植株，平均转化效率为8.5％，PCR阳性率超过90％。
本发明所述试剂盒和培养方法能够高通量、高效、稳定的获得多年生黑麦草的转基因植株，并通过保持培养基的不断扩繁能够无限获得可用于转化的优质外植体。为后续大批量功能基因导入奠定了基础，为黑麦草的品种改良提供了强有力的助推作用。同时，整套遗传转化体系的摸索过程也为其他不能通过常规育种改良的牧草提供了指导路线。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例涉及一种多年生黑麦草农杆菌转化体系
一、转基因黑麦草的试剂盒制备
用于制备多年生黑麦草农杆菌转化体系的试剂盒包括发芽培养基、诱导培养基I、II、分化培养基、保持培养基、侵染液、共培养基、筛选培养基I、II、再生培养基和生根培养基。
各培养基的组分及制备方法如下：
1)发芽培养基
发芽培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为30g/L的蔗糖和3g/L凝固剂；
上述发芽培养基按照如下方法制备：配制MS基本培养基并在其中中添加最终浓度为30g/L的蔗糖，加水定容至1L，调pH至5.8，添加终浓度为3g/L的植物凝胶，121℃高压灭菌20min，待培养基温度降至55℃左右时添加终浓度为170μM的苯菌灵，倒90×15mm平板，35mL每板，制成固体培养基。
2)诱导培养基I
诱导培养基I为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为22.6μM的2,4-二氯苯氧乙酸、30g/L的蔗糖和3g/L的凝固剂；
上述诱导培养基I按照如下方法制备：配制MS基本培养并在其中添加终浓度为22.6μM的2，4-二氯苯氧乙酸，终浓度为30g/L的蔗糖,加水定容至1L，调pH至5.8，添加终浓度为3g/L的植物凝胶，121℃高压灭菌20min，倒90×15mm平板，35mL每板，制成固体培养基。
3)诱导培养基II
诱导培养基II为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为9μM的2,4-二氯苯氧乙酸、0.44μM的6-苄氨基腺嘌呤、30g/L蔗糖和3g/L的凝固剂；
上述诱导培养基II按照如下方法制备：配制MS基本培养并在其中添加终浓度为9μM的2，4-二氯苯氧乙酸，终浓度为30g/L的蔗糖,加水定容至1L，调pH至5.8，添加终浓度为3g/L的植物凝胶，121℃高压灭菌20min，待培养基温度降至55℃左右时添加终浓度为0.44μM的6-苄氨基腺嘌呤，倒90×15mm平板，35mL每板，制成固体培养基。
4)分化培养基
所述分化培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为4.4μM的6-苄氨基腺嘌呤、30g/L麦芽糖和3g/L的凝固剂；
上述分化培养基按照如下方法制备：配制MS基本培养基，并在其中添加终浓度为30g/L的麦芽糖，加水定容至1L，调pH至5.8，添加终浓度为3g/L的植物凝胶，121℃高压灭菌20min，待培养基温度降至55℃左右时添加终浓度为4.4μM的6-苄氨基腺嘌呤，倒90×15mm平板，35mL每板，制成固体培养基。
5)保持培养基
持培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为8.8μM的6-苄氨基腺嘌呤，30g/L的蔗糖和3g/L的凝固剂；
上述保持培养基按照如下方法制备：配制MS基本培养基，并在其中添加终浓度为30g/L的蔗糖，加水定容至1L，调pH至5.8，添加终浓度为3g/L的植物凝胶，121℃高压灭菌20min，待培养基温度降至55℃左右时添加终浓度为8.8μM的6-苄氨基腺嘌呤，倒90×15mm平板，35mL每板，制成固体培养基。
6)侵染液
侵染液由MS基本培养基、葡萄糖、蔗糖和水组成，葡萄糖在侵染液中的终浓度为10g/L，蔗糖在侵染液中的终浓度为50g/L；
上述侵染液按照如下方法制备：配制MS基本培养基，并在其中添加终浓度为10g/L的葡萄糖，终浓度为50g/L的蔗糖,加水定容至1L，调pH至5.2，过滤灭菌后保存在-4℃。
7)共培养基
共培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为9μM的2,4-二氯苯氧乙酸、0.44μM的6-苄氨基腺嘌呤、400μM的乙酰丁香酮、10g/L的葡萄糖、70g/L的蔗糖和3g/L的凝固剂；
上述共培养基按照如下方法制备：配制MS基本培养基并在其中中添加终浓度为9μM的2，4-二氯苯氧乙酸，终浓度10g/L的葡萄糖，终浓度为70g/L的蔗糖,加水定容，调pH至5.2，添加终浓度为3g/L的植物凝胶，121℃高压灭菌20min，待培养基温度降至55℃左右时添加终浓度为0.44μM的6-苄氨基腺嘌呤，终浓度为400μM的乙酰丁香酮，倒90×15mm平板，35mL每板，制成固体培养基。
8)筛选培养基I
筛选培养基I为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为9μM的2,4-二氯苯氧乙酸、0.44μM的6-苄氨基腺嘌呤、50mg/L的潮霉素、200mg/L的特美汀、30g/L蔗糖的和3g/L的凝固剂；
上述筛选培养基I按照如下方法制备：配制MS基本培养基，并在其中添加终浓度为9μM的2,4-二氯苯氧乙酸，终浓度为30g/L的蔗糖，加水定容至1L，调pH至5.8，添加终浓度为3g/L的植物凝胶，121℃高压灭菌20min，待培养基温度降至55℃左右时添加终浓度为0.44μM的6-苄氨基腺嘌呤，终浓度为50mg/L的潮霉素，终浓度为200mg/L的特美汀，倒90×15mm平板，35mL每板，制成固体培养基。
9)筛选培养基II
筛选培养基II为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为9μM的2,4-二氯苯氧乙酸、0.44μM的6-苄氨基腺嘌呤、75mg/L的潮霉素、200mg/L的特美汀、30g/L的蔗糖和3g/L的凝固剂；
上述筛选培养基II按照如下方法制备：在MS基本培养基中添加终浓度为9μM的2,4-二氯苯氧乙酸，终浓度为30g/L的蔗糖，加水定容至1L，调pH至5.8，添加终浓度为3g/L的植物凝胶，121℃高压灭菌20min，待培养基温度降至55℃左右时添加终浓度为0.44μM的6-苄氨基腺嘌呤，终浓度为75mg/L的潮霉素，终浓度为200mg/L的特美汀，倒90×15mm平板，35mL每板，制成固体培养基。
10)再生培养基
再生培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为4.4μM的6-苄氨基腺嘌呤、25mg/L的潮霉素、200mg/L的特美汀、30g/L的麦芽糖和3g/L的凝固剂；
上述再生培养基按照如下方法制备：配制MS基本培养基，并在其中添加终浓度为30g/L的麦芽糖，加水定容至1L，调pH至5.8，添加终浓度为3g/L的植物凝胶，121℃高压灭菌20min，待培养基温度降至55℃左右时添加终浓度为4.4μM的6-苄氨基腺嘌呤，终浓度为25mg/L的潮霉素，终浓度为200mg/L的特美汀，倒90×15mm平板，35mL每板，制成固体培养基。
11)生根培养基
生根培养基为1/2MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为30g/L的蔗糖和3g/的L凝固剂。
上述生根培养基按照如下方法制备：配制1/2MS基本培养基，并在其中添加终浓度为30g/L的蔗糖，加水定容至1L，调pH至5.8，添加终浓度为3g/L的植物凝胶，121℃高压灭菌20min，倒90×15mm平板，35mL每板，制成固体培养基。
二、转基因多年生黑麦草的获得
具体方法如下：
1、“Impact”和“Evening Shade”的品系的遴选
将各1000粒多年生黑麦草“Impact”和“Evening Shade”不同品系的种子浸泡在体积百分含量50％的硫酸溶液中振摇20分钟脱壳。脱壳种子用流水洗涤3-4小时后在56℃培养15分钟以杀死内生真菌Neotyphodium lolii(＝Acremonium)。然后将种子用有效氯质量百分含量为5％的次氯酸钠溶液(滴加10微升Tween20)表面消毒20min。消毒后，用无菌水洗涤6次并用3M的无菌滤纸吸干种子表面的水分。
将种子移至发芽培养基上，24℃黑暗培养7天。将发芽的幼苗暴露于光下培养2天，在超净工作台中用解剖刀将大约1cm的分生组织切下，然后纵向解剖一分为二。移至诱导培养基I上，切口端朝下，24℃黑暗培养4-5周(每两周继代一次)后，见到黄色致密的胚性愈伤组织。将得到愈伤组织移至分化培养基上，24℃光照培养4周，每两周继代一次。挑选出5个分化较好的愈伤组织，其本体基因型标记为I1、I2、I3和E1、E2(分化频率如表2)。
分化频率＝(分化出绿苗的愈伤数/总愈伤数)×100％
统计结果如表1所示：
表1：分化频率
由表1可以看出，编号为I1和E1的品种分化效果最好，选择它作为组培效果良好的品系，进行后续的实验。
2、胚性愈伤组织的诱导
取分化效果最好的I1和E1愈伤组织上的分化出的绿苗上的绿头移至保持培养基上，24℃光照培养至长出丛生芽。在超净工作台中用解剖刀将丛生芽的分生组织横向切下，并于24℃黑暗条件下散布在诱导培养基I上，每两周继代一次。4周后继代至诱导培养基II上，在诱导培养II上24℃黑暗培养4周，至长出胚性愈伤组织，每两周继代一次，于转化之前5-7天继代一次。
3、重组农杆菌的获得
将质粒pCAMBIA1305.1转入根瘤农杆菌EHA101中，将转入后的根瘤农杆菌在50mg/L卡那霉素和50mg/L潮霉素LB抗性平板上生长，即得重组农杆菌EHA101(pCAMBIA1305.1)。
挑取重组农杆菌EHA101(pCAMBIA1305.1)的单克隆菌落，接种于10mL含有50mg/L卡那霉素和50mg/L潮霉素的LB液体培养基中，于28℃ 200rpm悬浮培养24h，待生长至OD600＝1.0左右时与等体积的30％甘油溶液混匀，并分装至1.5ml离心管中(约400-600μL每管)，于-80℃冷冻保存。
4、侵染用菌液的获得
1)活化
将上述1保存的重组农杆菌EHA101(pCAMBIA1305.1)与5mL相应抗生素50mg/L卡那霉素和50mg/L潮霉素的LB液体培养基混合，28℃ 200rpm悬浮培养9h进行菌体活化，吸取500μL活化菌液均匀涂布在含有相应抗生素的LB固体培养基上，按照28℃ 2d+23℃1d的方式进行培养，得到活化的重组农杆菌EHA101(pCAMBIA1305.1)。
2)侵染用菌液的获得
将活化的重组农杆菌EHA101(pCAMBIA1305.1)于转化当天重悬至侵染液中，使菌的浓度保持在OD600＝0.6-0.8，得到重悬菌液，再向重悬菌液中添加终浓度为400μM的乙酰丁香酮得到侵染用菌液。
5、转化和筛选
将步骤2中得到的胚性愈伤组织置于盛有3.0mL侵染用菌液的10mL离心管中，在100rpm的摇床上连续摇动30min。30min后，吸除多余的菌液。于三层Whatman NO.1定性滤纸上晾干后，将处理后的胚性愈伤组织移至共培养基上，24℃黑暗培养4天。4天后将其移至筛选培养基I上，24℃黑暗培养2周，而后继代至筛选培养基II上。2周后，将其置于再生培养基上，每两周继代一次，直至长出绿苗。
6、生根和壮苗
将长出绿苗的愈伤组织移至生根培养基上进行生根培养，2周后得到生根的转基因黑麦草。生根的转基因黑麦草地上部分长至10cm左右且诱导出2条以上强壮根系时，移栽至12×12cm的花盆中，于光照强度500μmol/m2/s、光周期16/8h、昼夜温度为20/15℃的生长室中壮苗扩繁，即为T0代黑麦草抗性植株。
三、转基因黑麦草的鉴定
使用TIANGEN快速型植物基因组DNA提取系统试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，产品目录编号为L0814)鉴定T0代黑麦草抗性植株的基因组DNA，以各自基因组DNA为模板，hpt基因为靶基因，用特异引物5′-AATACGAGGTCGCCAACATCT-3′和5′-AGGAACCCTAATTCCCTTATCTG-3′进行PCR扩增，hpt基因扩增片段大小为441bp；以未转基因的黑麦草植株基因组DNA为阴性对照，以质粒pCAMBIA1305.1为阳性对照，记录PCR检测呈阳性的植株。
结果如下：PCR产物大小约为441bp为阳性。
四、转化效率统计
转化频率为(阳性的T0代转基因黑麦草/转化的外植体数)×100％
统计结果如表2所示：
表2：转化效率
由以上实验数据可知，运用本发明所述的试剂盒和方法，可成功实现将重组农标菌导入多年生黑麦草中，这为后续黑麦草基因和性状的改良提供了基础。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种用于多年生黑麦草农杆菌转化的专用试剂盒，其特征在于，包括发芽培养基、诱导培养基I、诱导培养基II、分化培养基、保持培养基、侵染液、共培养基、筛选培养基I、筛选培养基II、再生培养基和生根培养基；
所述发芽培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为30g/L的蔗糖和3g/L凝固剂；
所述诱导培养基I为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为22.6μM的2,4-二氯苯氧乙酸、30g/L的蔗糖和3g/L的凝固剂；
所述诱导培养基II为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为9μM的2,4-二氯苯氧乙酸、0.44μM的6-苄氨基腺嘌呤、30g/L蔗糖和3g/L的凝固剂；
所述分化培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为4.4μM的6-苄氨基腺嘌呤、30g/L麦芽糖和3g/L的凝固剂；
所述保持培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为8.8μM的6-苄氨基腺嘌呤、30g/L的蔗糖和3g/L的凝固剂；
所述侵染液为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为10g/L的葡萄糖和50g/L的蔗糖；
所述共培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为9μM的2,4-二氯苯氧乙酸、0.44μM的6-苄氨基腺嘌呤、400μM的乙酰丁香酮、10g/L的葡萄糖、70g/L的蔗糖和3g/L的凝固剂；
所述筛选培养基I为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为9μM的2,4-二氯苯氧乙酸、0.44μM的6-苄氨基腺嘌呤、50mg/L的潮霉素、200mg/L的特美汀、30g/L蔗糖的和3g/L的凝固剂；
所述筛选培养基II为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为9μM的2,4-二氯苯氧乙酸、0.44μM的6-苄氨基腺嘌呤、75mg/L的潮霉素、200mg/L的特美汀、30g/L的蔗糖和3g/L的凝固剂；
所述再生培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为4.4μM的6-苄氨基腺嘌呤、25mg/L的潮霉素、200mg/L的特美汀、30g/L的麦芽糖和3g/L的凝固剂；
所述生根培养基为1/2MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为30g/L的蔗糖和3g/的L凝固剂。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述侵染液和共培养基的pH值为5.2，所述其他各培养基的pH值均为5.8。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述凝固剂为植物凝胶。
4.一种权利要求1～3任一项所述的试剂盒用于多年生黑麦草农杆菌的转化的方法。
5.根据权利要求4所述的转化方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)黑麦草“Impact”和“Evening Shade”的品系的遴选：
将多年生黑麦草品种“Impact”和“Evening Shade”种子进行脱壳和表面消毒后置于所述发芽培养基中培养，得到分生组织；将分生组织纵向解剖一分为二置于所述诱导培养基I上，诱导出黄色致密的胚性愈伤组织；将所述黄色致密的愈伤组织移至所述分化培养基上，遴选出再生性良好的品系；
2)胚性愈伤组织的诱导：
将所述遴选出的再生性良好的品系的愈伤组织上分化出的绿头移至所述保持培养基上，得到丛生芽；将所述丛生芽的分生组织横向切下，依次接种于所述诱导培养基I和所述诱导培养基II上进行培养，得到胚性愈伤组织；
3)制备侵染用菌液：
先将重组农杆菌悬浮在所述侵染液中得到重悬菌液，再将所述重悬菌液中添加终浓度为400μM的乙酰丁香酮，得到侵染用菌液；
4)转化和筛选
将所述胚性愈伤组织和所述侵染用菌液混匀、连续摇动，将所述胚性愈伤组织取出晾干，得到侵染后的胚性愈伤组织，将所述侵染后的胚性愈伤组织在所述共培养培养基中进行共培养，共培养后依次移至所述筛选培养基I、II上，得筛选后的愈伤组织；将所述筛选后愈伤组织在所述再生培养基进行分化再生，至长出绿苗；
5)生根和壮苗
将所述长出绿苗的愈伤组织转至所述生根培养基上进行生根培养，待生根后进一步移栽至土壤中壮苗，即得到转基因多年生黑麦草。
6.根据权利要求5所述的转化方法，其特征在于，在所述步骤1)中，在所述发芽培养中的培养条件为22-25℃黑暗培养5-9天和22-25℃光照培养1-3天；优选为为24℃黑暗培养7天和24℃光下培养2天；
在所述诱导培养基中的培养条件为22-25℃黑暗培养2-7周；优选为为24℃黑暗培养4-5周；
在所述分化培养基中的培养条件为22-25℃光照培养2-7周；优选为24℃光照培养4周。
7.根据权利要求5或6所述的转化方法，其特征在于，所述步骤2)中，在所述保持培养基中的培养条件为22-25℃光照至长出丛生芽；优选为24℃光照培养至长出丛生芽；
在所述诱导培养I中培养的条件为22～25℃黑暗培养4周，优选为24℃黑暗培养4周；
在所述诱导培养II中的培养条件为22～25℃黑暗培养，并于转化前2-10天继代一次；优选为24℃黑暗培养4周，并于转化前5-7天继代一次。
8.根据权利要求5或7所述的转化方法，其特征在于，在所述步骤4)中，在所述共培养基上的培养条件为22-25℃暗培养2-5天，优选为24℃暗培养4天；
在所述筛选培养I、II上的培养的条件均为22-25℃黑暗培养1-3周，优选为24℃黑暗培养2周。
9.根据权利要求5或8所述的转化方法，其特征在于，所述步骤5)中，在所述生根培养基中的培养条件为22-25℃光照培养2周，所述壮苗的条件为温度22-25℃、光照强度145-155μmol/m2/s、光周期16/8h培养3.5-4.5周，优选为温度24℃、光照强度150μmol/m2/s、光周期16/8h培养4周。
10.根据权利要求4-9中任一项所述的转化方法，其特征在于：所述重组农杆菌为将质粒pCAMBIA1305.1转入根瘤农杆菌EHA101中得到的重组农杆菌。
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