CN102487827B - 高效浮萍再生体系的建立 - Google Patents

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Abstract

高效浮萍再生体系的建立。本发明涉及浮萍愈伤组织的快速诱导、继代培养及高效再生方法。以浮萍科浮萍属L.minor为材料，通过适宜比例的激素浓度，建立了浮萍快速愈伤组织诱导和继代体系（图1a,b），在此基础上，进一步以KNO3,MgSO4,H3BO4,L-Ser等为主要成分的新型无激素体系使浮萍愈伤组织得到高效再生。浮萍的再生率在第11天可达到46.15%，14天达到86.67%（图1c），并且最终再生率可高达100%（图1d）。本项发明的成套浮萍组织培养与再生体系不仅高效，而且周期短、成本低，是浮萍生理生化、基因表达、遗传转化等相关理论与应用研究中不可缺少的关键操作。

Description

高效浮萍再生体系的建立
技术领域
本发明涉及植物愈伤组织再生方法，特别是一种用无激素方法对浮萍科浮萍属L.minor快速高效再生的方法。
背景技术
浮萍是单子叶水面漂浮植物，隶属于浮萍科浮萍属，广布于世界各地，其个体小，扩繁快，蛋白含量高，通过光照可控制其无性繁殖等显著优点使其成为理想的高通量外源蛋白表达和基因研究体系。因此，自20世纪80年代以来，浮萍的组织培养和遗传转化方面的研究工作从未间断，国际上所报导的浮萍科浮萍属L.minor愈伤组织诱导不仅需要激素，而且其再生所需时间较长，成为制约浮萍转基因等相关研究发展的重要瓶颈。国内更因缺乏浮萍组培与再生的自主性技术，目前相关研究工作不能有效展开。
发明内容
本发明的目的是解决现有浮萍组培不仅需要激素而且再生所需时间较长的问题，提供一种新型无激素技术进行浮萍科浮萍属L.minor NK1愈伤组织诱导、继代和再生方法及其相关试剂。
本发明提供的浮萍(浮萍科浮萍属L.minor NK1)愈伤组织诱导、继代和再生方法的具体步骤包括：
1)浮萍愈伤组织的诱导和继代：取长势良好的浮萍植株，将其根部切除，并对其叶基部进行横切，将处理好的外植体放入浮萍诱导培养基中，培养条件为光周期16小时/天，光强68μmolm-2s-1，23℃条件下，9-11天后外植体膨大，两周后愈伤开始形成，挑选绿色部分移至浮萍继代培养基上进行继代，21天后长出长势良好的愈伤组织；每两周继代一次愈伤组织；
2)浮萍愈伤组织的再生：将愈伤组织移至浮萍再生培养基中，培养条件同第1)步，11天后浮萍再生即可达到46.15％，14天达到86.67％，并且最终再生率可高达100％。
其中，第1)步所述的浮萍诱导培养基的组成包括：
Figure BDA0000118168290000022
Figure BDA0000118168290000023
Figure BDA0000118168290000024
2.78g/l的FeSO4·7H2O用3.73g/l的Na2-EDTA螯合后作为母液贮存及使用，以上试剂调至pH 6.2并于102.9kPa，121℃20分钟高压灭菌后使用。
第1)步所述的浮萍继代培养基的组成包括：
Figure BDA0000118168290000031
Figure BDA0000118168290000032
Figure BDA0000118168290000033
Figure BDA0000118168290000041
2.78g/l的FeSO4·7H2O用3.73g/l的Na2-EDTA螯合后作为母液贮存及使用，以上试剂调至pH 6.2并于102.9kPa，121℃20分钟高压灭菌后使用。
第2)步所述的浮萍再生培养基的组成包括：
Figure BDA0000118168290000051
2.78g/l的FeSO4·7H2O用3.73g/l的Na2-EDTA螯合后作为母液贮存及使用，以上试剂调至pH 6.2并于102.9kPa，121℃20分钟高压灭菌后使用。
本发明的优点和有益效果：
本发明首创了无激素配方诱导浮萍愈伤组织再生，利用该技术可将再生时间缩短为11天，突破了国际上该品系再生需要4-5周的耗时再生技术瓶颈，并且此技术极大的促进了浮萍愈伤组织再生，实现了100％的再生诱导率。由于浮萍生长周期短、生物量大、蛋白质含量高、可通过光照调控其进行无性繁殖等众多优点使其成为一种高通量外源蛋白表达和转基因研究的理想材料，因此，浮萍转基因技术的相关研究日益受到人们的关注。本发明通过建立无激素高效快速诱导浮萍再生体系，为其转基因技术的发展提供了极其重要的技术平台与支持。
附图说明
图1为浮萍愈伤组织诱导、继代和再生的图片；a为浮萍外植体诱导11天后愈伤组织开始形成；b为浮萍愈伤组织继代培养2-4周后形成绿色的愈伤组织；c为浮萍愈伤组织于再生培养基培养14天后再生率达到86.7％；d为浮萍愈伤组织于再生培养基上培养可达到100％的再生率。e为再生植株移至液体培养基后成活。
图2为在不同丝氨酸浓度下浮萍愈伤组织的再生率统计。
具体实施方式
实施例1：
本发明所述的浮萍愈伤组织诱导、继代和再生方法的具体步骤包括：
1)浮萍愈伤组织的诱导和继代：取长势良好的浮萍植株，将其根部切除，并对其叶基部进行横切，将处理好的外植体放入浮萍诱导培养基中，培养条件为光周期16小时/天，光强68μmolm-2s-1，23℃条件下，9-11天后外植体膨大(图1a)。两周后愈伤开始形成，挑选绿色部分移至浮萍继代培养基上进行继代。21天后长出长势良好的愈伤组织(图1b)。该愈伤组织可用于转基因，提取具有药用价值的浮萍多糖等多种用途。每两周继代一次愈伤组织。
2)浮萍愈伤组织的再生：将愈伤组织移至浮萍再生培养基中，培养条件同第1)步，11天后浮萍再生即可达到46.15％，14天达到86.67％(图1c)，并且最终再生率可高达100％(图1d)。
其中，浮萍科浮萍属L.minor NK1愈伤组织诱导培养基的组成包括：
Figure BDA0000118168290000061
Figure BDA0000118168290000071
Figure BDA0000118168290000072
2.78g/l的FeSO4·7H2O用3.73g/l的Na2-EDTA螯合后作为母液贮存及使用，以上试剂调至pH 6.2并于102.9kPa，121℃20分钟高压灭菌后使用。
所述的浮萍科浮萍属L.minor NK1愈伤组织的继代培养基的组成包括：
Figure BDA0000118168290000073
Figure BDA0000118168290000081
Figure BDA0000118168290000082
Figure BDA0000118168290000083
2.78g/l的FeSO4·7H2O用3.73g/l的Na2-EDTA螯合后作为母液贮存及使用，以上试剂调至pH 6.2并于102.9kPa，121℃20分钟高压灭菌后使用。
所述的浮萍科浮萍属L.minorNK1愈伤组织的再生培养基的组成包括：
Figure BDA0000118168290000091
Figure BDA0000118168290000092
Figure BDA0000118168290000093
2.78g/l的FeSO4·7H2O用3.73g/l的Na2-EDTA螯合后作为母液贮存及使用，以上试剂调至pH 6.2并于102.9kPa，121℃20分钟高压灭菌后使用。

Claims (1)

1.一种浮萍愈伤组织诱导、继代和再生的方法，其特征在于该方法的具体步骤包括： 
1）浮萍愈伤组织的诱导和继代：取长势良好的浮萍植株，将其根部切除，并对其叶基部进行横切，将处理好的外植体放入浮萍诱导培养基中，培养条件为光周期16小时/天，光强68μmolm-2s-1，23℃条件下，9-11天后外植体膨大，两周后愈伤开始形成，挑选绿色部分移至浮萍继代培养基上进行继代，21天后长出长势良好的愈伤组织；每两周继代一次愈伤组织； 
所述的浮萍诱导培养基的组成包括： 
Figure FDA00002695308100011
Figure FDA00002695308100021
Figure FDA00002695308100022
2.78g/l的FeSO4·7H2O用3.73g/l的Na2-EDTA螯合后作为母液贮存及使用，以上试剂调至pH6.2并于102.9kPa，121℃20分钟高压灭菌后使用； 
所述的浮萍继代培养基的组成包括： 
Figure FDA00002695308100023
Figure FDA00002695308100031
Figure FDA00002695308100032
Figure FDA00002695308100033
2.78g/l的FeSO4·7H2O用3.73g/l的Na2-EDTA螯合后作为母液贮存及使用，以上试剂调pH6.2并于102.9kPa，121℃20分钟高压灭菌后使用； 
2）浮萍愈伤组织的再生：将愈伤组织移至浮萍再生培养基中，培养条件同第1）步，11天后浮萍再生达到46.15%，14天达到86.67%，并且最终再生率高达100%； 
所述的浮萍再生培养基的组成包括： 
Figure FDA00002695308100041
Figure FDA00002695308100042
Figure FDA00002695308100043
2.78g/l的FeSO4·7H2O用3.73g/l的Na2-EDTA螯合后作为母液贮存及使用，以上试剂调至pH6.2并于102.9kPa，121℃20分钟高压灭菌后使用。 
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