CN113430226A - 神经递质谷氨酸探针浮萍的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种神经递质谷氨酸探针浮萍的制备方法，包括以下步骤：获得原代实验材料；获得大量传代浮萍；获得浮萍愈伤组织；获得携带谷氨酸探针基因用于侵染的农杆菌；大量扩增用于侵染的农杆菌；裂解农杆菌使得质粒被释放出来，与愈伤组织结合；使质粒与愈伤组织充分结合；给质粒提供侵染的环境并给愈伤组织提供恢复状态的环境；洗去黏附在愈伤组织上未被完全裂解的农杆菌；使愈伤组织再生成浮萍。本发明获得的浮萍中携带谷氨酸探针基因，谷氨酸探针可以与谷氨酸结合产生荧光，由此可验证浮萍内积蓄谷氨酸的情况。
Description
技术领域
本发明涉及水环境技术领域，特别是涉及一种神经递质谷氨酸探针浮萍的制备方法。
背景技术
浮萍是单子叶水面漂浮植物，隶属于浮萍科浮萍属，广布于世界各地，其个体小，扩繁快，对环境的适应能力强，对盐碱水环境有一定的抗性，对重金属镉离子有富集能力。但是，对于浮萍富集重金属的生理机制和分子机制尚未阐明。常规野生浮萍无法直接应用于机制研究中，重金属污染水境的生态学修复和植物抗重金属应用的研究难以开展，一种可用于机制研究的浮萍有待于进一步研究和开发。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的浮萍富集重金属的生理机制和分子机制研究难以开展的问题，而提供一种神经递质谷氨酸探针浮萍的制备方法。
为实现本发明的目的所采用的技术方案是：
一种神经递质谷氨酸探针浮萍的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，采集浮萍；
步骤2，对步骤1采集的浮萍置于浮萍液体培养基内进行继代培养；
步骤3，夹取步骤2得到的浮萍植株，放置在诱导培养基上进行诱导培养，以获得浮萍愈伤组织；
步骤4，构建携带谷氨酸探针基因用于侵染的农杆菌-iGluSnFR农杆菌；
步骤5，活化iGluSnFR农杆菌；
步骤6，裂解iGluSnFR农杆菌使得质粒被释放出来，与愈伤组织结合：利用共生培养液溶解iGluSnFR农杆菌，得到共培养菌液，将步骤3得到的浮萍愈伤组织移至所述共培养菌液中，常温抽真空；
步骤7，避光缓慢振荡缓慢共培养，使质粒与愈伤组织充分结合；
步骤8，将共培养菌液吸出，将愈伤组织置于滤纸上待共培养菌液彻底被吸干后，将愈伤组织转移至固体共培养基上避光培养，提供愈伤组织恢复环境；
步骤9，用含头孢霉素的无菌水清洗步骤8得到的愈伤组织3-5次以洗去黏附在愈伤组织上未被完全裂解的农杆菌，将其放在滤纸上使愈伤组织中的水吸干，并烘干，移至筛选培养基上培养5-6天；
步骤10，将愈伤组织移至再生培养基上培养20-30天，使愈伤组织再生成浮萍，即可得到神经递质谷氨酸探针浮萍。
在上述技术方案中，所述步骤2中，浮萍液体培养基包括0.4-0.5mM的MgSO4·7H2O、1.4-1.6mM的Ca(NO3)2·4H2O、1.0-1.2mM的KNO3、0.4-0.5mM的KH2PO4、0.4-0.5mM的Mg(NO3)2·6H2O、45-55μM的CaCl2·2H2O、45-55μM的KCl、6.1-6.3μM的Na2MoO4·2H2O、69-71μM的H2BO3、28-32μM的K2H2EDTA·2H2O、56.7-58.7μM的FeNH4-EDTA、13.8-14.8μM的MnCl2·4H2O、2.8-3.8μM的ZnNa2EDTA·4H2O、4.8-5.8μM的CoSO4·7H2O、18.6-19.6μM的Na2-EDTA·2H2O，调节pH为5.6-5.8后，高压灭菌，优选的高压灭菌压力为102.9-104.9kPa、温度为120-122℃、时间为20-30分钟；所述步骤2中的继代培养温度为23-24℃，光周期为16-18小时/天，光强为90-100μmol m-2s-1，每周继代一次。
在上述技术方案中，所述步骤3中，诱导培养基中包括3.164g/L的B5粉，15mg/L的麦草畏，1mg/ml的2.4-D，2mg/L的6-BA，15g/L的蔗糖，6.3g/L的琼脂，调至pH为6.2–6.4后高压灭菌，优选的，灭菌压力为102.9-104.9kPa、温度为120-122℃、时间为20-30分钟，所述诱导培养的温度为23℃，光周期为16小时/天，光强为95μmol m-2s-1，每两周继代一次。
在上述技术方案中，所述步骤4中，构建iGluSnFR农杆菌的方法为：构建pCAMBIA-1301-35SN-iGluSnFR表达载体并转化至大肠杆菌中扩增12-16h，提取表达载体并转化至农杆菌中。
在上述技术方案中，所述步骤5中，iGluSnFR农杆菌的活化的方法为：从甘油冻存管中平板活化农杆菌2-3次，用接种环挑取步骤4得到的单菌落在LB培养液中小体积活化农杆菌24-30h，其次吸取小体积活化的菌液加入LB培养液中大体积活化农杆菌3-4h，最后常温离心后弃去上清，优选的，所述大体积活化用LB培养液的体积是小体积活化用LB培养液体积的3-4倍，所述LB培养液中包括45-55mg/mL的链霉素Str，20-30mg/mL的利福平，45-55mg/mL的卡那霉素。
在上述技术方案中，所述步骤6中，所述共生培养液中包括3-4g/L的B5粉、10-12g/L的蔗糖，每mg菌体利用20ml共生培养液溶解，常温抽真空空3次，每次55-65s。
在上述技术方案中，所述步骤7中，共培养温度为27-29℃，时间为30-40min，振荡强度为100-120rpm。
在上述技术方案中，所述步骤8中，固体共培养基上进行避光培养时，培养温度为28℃，培养时间为1-3天，所述固体共培养基中包括3-4g/L的B5粉，14-16g/L的蔗糖和6-7g/L的琼脂，调至pH为6.2–6.4后高压灭菌，优选的，灭菌压力为102.9-104.9kPa、温度为120-122℃、时间为20-30分钟。
在上述技术方案中，所述步骤9中，烘干时，将吸干水的愈伤组织在酒精灯附近烘烤30-40min，筛选培养基上培养温度为23-24℃，光周期为16-18小时/天，光强为90-100μmol m-2s-1；所述筛选培养基中包括3-4g/L的B5粉、14-16g/L的蔗糖、2-2.5mg/L的2iP、10-10.5mg/L的CPA、6-7g/L的琼脂、1-1.5mg/L的潮霉素、155-165mg/L的头孢霉素。
在上述技术方案中，所述步骤10中，再生培养基上培养条件为：23-24℃温度下，光周期16-18小时/天，光强90-100μmol m-2s-1，每两周更换培养基一次，所述再生培养基中包括3-4g/L的B5粉、14-16g/L的蔗糖、6-7g/L的琼脂、1-1.5mg/L的潮霉素、155-165mg/L的头孢霉素、0.1-0.15M丝氨酸，调至pH为6.2–6.4后高压灭菌，优选的，灭菌压力为102.9-104.9kPa、温度为120-122℃、时间为20-30分钟。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明首创了神经递质谷氨酸探针浮萍制备方法，利用该技术可获得一种能荧光显示谷氨酸含量的浮萍，应用于浮萍细胞水平研究，填补了浮萍谷氨酸实时观测的空白。
2.本发明通过阐明神经递质谷氨酸探针浮萍制备方法，为其细胞水平研究提供了新思路。
3.本发明有效验证了镉胁迫诱发了浮萍瞬间谷氨酸响应，推动了浮萍富集重金属的生理机制和分子机制的研究。
附图说明
图1是pCAMBIA-1301-35SN-iGluSnFR构建报告。
图2是野生型浮萍在488nm激发光下的荧光照片。
图3是实施例2中第一次验证谷氨酸探针浮萍在488nm激发光下的荧光照片。
图4是iGluSnFR农杆菌质粒电泳图。
图5是实施例2中第二次验证谷氨酸探针浮萍在488nm激发光下的荧光照片。
图6是实施例2中第三次验证谷氨酸探针浮萍在488nm激发光下的荧光照片。
图7是实施例3中滴加氯化镉第0分钟谷氨酸探针浮萍在488nm激发光下的荧光照片。
图8是实施例3中滴加氯化镉第20分钟谷氨酸探针浮萍在488nm激发光下的荧光照片。
图9是实施例3中滴加氯化镉第30分钟谷氨酸探针浮萍在488nm激发光下的荧光照片。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：
本发明的实验思路分为十步，具体如下：
步骤1：获得原代实验材料；
步骤2：获得大量传代浮萍；
步骤3：获得浮萍愈伤组织；
步骤4：获得携带谷氨酸探针基因用于侵染的农杆菌；
步骤5：大量扩增用于侵染的农杆菌；
步骤6：裂解农杆菌使得质粒被释放出来，与愈伤组织结合；
步骤7：使质粒与愈伤组织充分结合；
步骤8：给质粒提供侵染的环境并给愈伤组织提供恢复状态的环境；
步骤9：洗去黏附在愈伤组织上未被完全裂解的农杆菌；
步骤10：使愈伤组织再生成浮萍。
步骤10获得的浮萍中携带谷氨酸探针基因，谷氨酸探针可以与谷氨酸结合产生荧光，由此可验证浮萍内积蓄谷氨酸的情况。
实施例2
为实现实施例1的实验思路，本实施例中所述的神经递质谷氨酸探针浮萍制备方法的具体步骤包括：
步骤1，浮萍的采集：浮萍采集自天津市西青区湖水中，本实施例中所用浮萍为浮萍科浮萍属L.minor NK 1。
步骤2，浮萍的培养：将浮萍培养于液体培养基上，培养条件为23℃温度下，光周期16小时/天，光强95μmol m-2s-1，每周继代一次。
所需浮萍液体培养基组成包括：
大量元素：
微量元素：
以上试剂调至pH 5.7并于102.9kPa，121℃20分钟高压灭菌后使用。
步骤3，浮萍愈伤组织的诱导：夹取浮萍植株，放置在诱导培养基上，培养条件为23℃温度下，光周期16小时/天，光强95μmol m-2s-1，每两周继代一次。
所述的诱导培养基的组成包括：
以上试剂调至pH 6.2–6.4并于102.9kPa，121℃20分钟高压灭菌后使用。
步骤4，iGluSnFR农杆菌构建：构建pCAMBIA-1301-35SN-iGluSnFR表达载体并转化至大肠杆菌中扩增12h，提取表达载体并转化至农杆菌中。
步骤5，iGluSnFR农杆菌的活化：从甘油冻存管中平板活化农杆菌3次，用接种环挑取单菌落在5ml LB培养液中小体积活化农杆菌30h，其次吸取1ml菌液加入19mlLB培养液中大体积活化农杆菌4h，最后常温5,000rpm离心10min，弃上清。
所述的液体LB抗生素的组成包括：
所述的LB培养液的组成包括：
链霉素Str(避光) 50mg/mL
利福平Rif 25mg/mL
卡那霉素Kana 50mg/mL
步骤6，用20ml共生培养液溶解菌体，并将愈伤组织移至共培养菌液中，常温抽真空3次，每次1min(0.05-0.06MPa时开始计时)
所述的共生培养液的组成包括：
B5粉 3.164g/L
蔗糖 10g/L
以上试剂调至pH 5.8并于102.9kPa，121℃20分钟高压灭菌后使用。
步骤7，28℃避光缓慢振荡缓慢共培养30min。
步骤8，将共培养液体吸出，将愈伤组织置于滤纸上待菌液彻底被吸干后，将愈伤组织转移至固体共培养基上28℃避光培养3天。
所述的共生培养液的组成包括：
B5粉 3.164g/L
蔗糖 15g/L
琼脂 6.3g/L
以上试剂调至pH 6.2–6.4并于102.9kPa，121℃20分钟高压灭菌后使用。
步骤9，用无菌水(含100mg/L头孢霉素)清洗愈伤组织6次，将其放在滤纸上使愈伤组织中的水吸干，然后将其在酒精灯附近烘烤30min，移至筛选培养基上培养5天，培养条件为23℃温度下，光周期16小时/天，光强95μmol m-2s-1。所述的筛选培养基的组成包括：
以上试剂调至pH 6.3并于102.9kPa，121℃20分钟高压灭菌后使用
步骤10，将愈伤组织移至再生培养基上培养30天，培养条件为：23℃温度下，光周期16小时/天，光强95μmol m-2s-1，每两周更换培养基一次。
第10)步所述的再生培养基的组成包括：
以上试剂调至pH 6.3并于102.9kPa，121℃20分钟高压灭菌后使用。
本实验过程中共构建9个iGluSnFR农杆菌转化子，iGluSnFR质粒导入农杆菌之后，得到转化子，然后扩增转化子，再把质粒提取出来做的鉴定，鉴定得到的iGluSnFR农杆菌质粒电泳图如图4所示，选取质粒电泳条带最明显的转化子用于侵染浮萍，即图4中的7号转化子，因为条带都很单一，且位置相同证明是同一个基因，所以选择最亮的7号转化子，获得神经递质谷氨酸探针浮萍，并进行三次验证实验，验证实验时用胶头滴管对谷氨酸探针浮萍的根部滴加2滴100mM CdCl2，然后在488nm激发光照射15分钟，三次验证实验结果分别为图3、图5和图6所示。
实施例3
谷氨酸是重要的信号分子，已有文献证明在植物受到机械损伤或者被吞噬的时候产生谷氨酸响应，进而引发钙信号，推测谷氨酸在植物中响应了逆境胁迫。在我们的实验结果中，表明镉胁迫诱发了浮萍瞬间谷氨酸响应。
图2中在室温下随机选取野生型浮萍用胶头滴管对其根部滴加2滴100mM CdCl2后在488nm激发光照射40分钟内均无绿色荧光信号，图3中在室温下随机选取谷氨酸探针浮萍用胶头滴管对其根部滴加2滴100mM CdCl2后在488nm激发光照射15分钟时开始有显著的绿色荧光信号并随时间延长而不断加强。
滴加氯化镉后，浮萍根部谷氨酸含量逐渐升高，随时间的不断延长荧光逐渐加强。从滴加氯化镉第0分钟至滴加氯化镉第30分钟，荧光强度如图7-图9所示，逐渐加强。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种神经递质谷氨酸探针浮萍的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，采集浮萍；
步骤2，对步骤1采集的浮萍置于浮萍液体培养基内进行继代培养；
步骤3，夹取步骤2得到的浮萍植株，放置在诱导培养基上进行诱导培养，以获得浮萍愈伤组织；
步骤4，构建携带谷氨酸探针基因用于侵染的农杆菌-iGluSnFR农杆菌；
步骤5，活化iGluSnFR农杆菌；
步骤6，裂解iGluSnFR农杆菌使得质粒被释放出来，与愈伤组织结合：利用共生培养液溶解iGluSnFR农杆菌，得到共培养菌液，将步骤3得到的浮萍愈伤组织移至所述共培养菌液中，常温抽真空；
步骤7，避光缓慢振荡缓慢共培养，使质粒与愈伤组织充分结合；
步骤8，将共培养菌液吸出，将愈伤组织置于滤纸上待共培养菌液彻底被吸干后，将愈伤组织转移至固体共培养基上避光培养，提供愈伤组织恢复环境；
步骤9，用含头孢霉素的无菌水清洗步骤8得到的愈伤组织3-5次以洗去黏附在愈伤组织上未被完全裂解的农杆菌，将其放在滤纸上使愈伤组织中的水吸干，并烘干，移至筛选培养基上培养5-6天；
步骤10，将愈伤组织移至再生培养基上培养20-30天，使愈伤组织再生成浮萍，即可得到神经递质谷氨酸探针浮萍。
2.如权利要求1所述的神经递质谷氨酸探针浮萍的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，浮萍液体培养基包括0.4-0.5mM的MgSO4·7H2O、1.4-1.6mM的Ca(NO3)2·4H2O、1.0-1.2mM的KNO3、0.4-0.5mM的KH2PO4、0.4-0.5mM的Mg(NO3)2·6H2O、45-55μM的CaCl2·2H2O、45-55μM的KCl、6.1-6.3μM的Na2MoO4·2H2O、69-71μM的H2BO3、28-32μM的K2H2EDTA·2H2O、56.7-58.7μM的FeNH4-EDTA、13.8-14.8μM的MnCl2·4H2O、2.8-3.8μM的ZnNa2EDTA·4H2O、4.8-5.8μM的CoSO4·7H2O、18.6-19.6μM的Na2-EDTA·2H2O，调节pH为5.6-5.8后，高压灭菌，优选的高压灭菌压力为102.9-104.9kPa、温度为120-122℃、时间为20-30分钟；所述步骤2中的继代培养温度为23-24℃，光周期为16-18小时/天，光强为90-100μmolm-2s-1，每周继代一次。
3.如权利要求1所述的神经递质谷氨酸探针浮萍的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，诱导培养基中包括3.164g/L的B5粉，15mg/L的麦草畏，1mg/ml的2.4-D，2mg/L的6-BA，15g/L的蔗糖，6.3g/L的琼脂，调至pH为6.2–6.4后高压灭菌，优选的，灭菌压力为102.9-104.9kPa、温度为120-122℃、时间为20-30分钟，所述诱导培养的温度为23℃，光周期为16小时/天，光强为95μmolm-2s-1，每两周继代一次。
4.如权利要求1所述的神经递质谷氨酸探针浮萍的制备方法，其特征在于，所述步骤4中，构建iGluSnFR农杆菌的方法为：构建pCAMBIA-1301-35SN-iGluSnFR表达载体并转化至大肠杆菌中扩增12-16h，提取表达载体并转化至农杆菌中。
5.如权利要求1所述的神经递质谷氨酸探针浮萍的制备方法，其特征在于，所述步骤5中，iGluSnFR农杆菌的活化的方法为：从甘油冻存管中平板活化农杆菌2-3次，用接种环挑取步骤4得到的单菌落在LB培养液中小体积活化农杆菌24-30h，其次吸取小体积活化的菌液加入LB培养液中大体积活化农杆菌3-4h，最后常温离心后弃去上清，优选的，所述大体积活化用LB培养液的体积是小体积活化用LB培养液体积的3-4倍，所述LB培养液中包括45-55mg/mL的链霉素Str，20-30mg/mL的利福平，45-55mg/mL的卡那霉素。
6.如权利要求1所述的神经递质谷氨酸探针浮萍的制备方法，其特征在于，所述步骤6中，所述共生培养液中包括3-4g/L的B5粉、10-12g/L的蔗糖，每mg菌体利用20ml共生培养液溶解，常温抽真空空3次，每次55-65s。
7.如权利要求1所述的神经递质谷氨酸探针浮萍的制备方法，其特征在于，所述步骤7中，共培养温度为27-29℃，时间为30-40min，振荡强度为100-120rpm。
8.如权利要求1所述的神经递质谷氨酸探针浮萍的制备方法，其特征在于，所述步骤8中，固体共培养基上进行避光培养时，培养温度为28℃，培养时间为1-3天，所述固体共培养基中包括3-4g/L的B5粉，14-16g/L的蔗糖和6-7g/L的琼脂，调至pH为6.2–6.4后高压灭菌，优选的，灭菌压力为102.9-104.9kPa、温度为120-122℃、时间为20-30分钟。
9.如权利要求1所述的神经递质谷氨酸探针浮萍的制备方法，其特征在于，所述步骤9中，烘干时，将吸干水的愈伤组织在酒精灯附近烘烤30-40min，筛选培养基上培养温度为23-24℃，光周期为16-18小时/天，光强为90-100μmol m-2s-1；所述筛选培养基中包括3-4g/L的B5粉、14-16g/L的蔗糖、2-2.5mg/L的2iP、10-10.5mg/L的CPA、6-7g/L的琼脂、1-1.5mg/L的潮霉素、155-165mg/L的头孢霉素。
10.如权利要求1所述的神经递质谷氨酸探针浮萍的制备方法，其特征在于，所述步骤10中，再生培养基上培养条件为：23-24℃温度下，光周期16-18小时/天，光强90-100μmolm-2s-1，每两周更换培养基一次，所述再生培养基中包括3-4g/L的B5粉、14-16g/L的蔗糖、6-7g/L的琼脂、1-1.5mg/L的潮霉素、155-165mg/L的头孢霉素、0.1-0.15M丝氨酸，调至pH为6.2–6.4后高压灭菌，优选的，灭菌压力为102.9-104.9kPa、温度为120-122℃、时间为20-30分钟。
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