KR920001196B1 - 페트리디쉬를 사용한 새로운 배양기법에 의한 무병, 우량 인공씨감자(기내소괴경, Potato microtuber)의 급속대량 생산방법 - Google Patents

페트리디쉬를 사용한 새로운 배양기법에 의한 무병, 우량 인공씨감자(기내소괴경, Potato microtuber)의 급속대량 생산방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

페트리디쉬를 사용한 새로운 배양기법에 의한 무병, 우량 인공씨감자(기내소괴경, Potato microtuber)의 급속대량 생산방법
제1도는 페트리디쉬(Petridish)내의 인공배양액 위에서 급속증식 되고 있는 ‘수미(Superior)’품종의 인공씨감자 형성용 경정(Microtubergenic shoot)사진.
제2도는 페트리디쉬(Petridish)내의 인공배양액 위에서 급속대량 형성된 ‘수미(Superior)’품종의 인공씨감자 사진.
제3도는 수확후 페트리디쉬(Petridish)내에서 무균 상태로 보관, 장기저온 저장되고 있는 ‘수미(Superior)’품종의 인공씨감자 사진.
제4도는 수미(Superior)품종의 인공씨감자를 심어서 재배한 수확직전의 감자 사진.
제5도는 수미(Superior)품종의 인공씨감자 한알을 심어서 이로부터 수확된 감자(평균치) 사진.
본 발명은 식물조직배양기술을 사용하여 바이러스에 감염되지 않은 무병주 감자식물의 경정을 대량으로 배양, 이로부터 인공씨감자(기내소괴경, Microtuber, 이하 인공씨감자라 지칭)를 급속, 대량 생산하고 생산된 인공씨감자를 막바로 관행의 씨감자를 대체해서 사용하거나 혹은 관행의 씨감자를 생산하기 위한 직전 단계의 씨감자로 사용하는 새롭고 획기적으로 진보된 차원의 인공씨감자 급속대량 생산방법 및 그 이용법에 관한 것이다.
감자는 가지과에 속하는 식물로서 괴경에 의한 영향 번식을 주로하는 식물이다. 대다수의 영양번식 작물에서 공통적으로 가장 심각한 문제점 중의 하나가 바로 바이러스 감염에 의한 수확량의 감소인데 감자의 경우 특히 그 피해의 정도가 심각한 것으로 나타나 있다.(Manzer, F.E., D.C.Merriam and P.R.Hepler. 1978. Effects of potato virus S and two strains of potato virus X on yields of Russet Burbank, Kennebec and Katahdin cultivars in Maine. Am. Potato Jour. 55 : 610-609. Korea´s seed potato program : organational Potato Center. pp 19-24), 따라서 바이러스에 감염되지 않은 무병 우량종서를 매년 확보하는 것은 감자농사의 승패를 좌우하는 중요한 일로서 이를 위해 종래에는 바이러스 매개충인 진딧물의 번식율이 낮은 고령지 산간지방에서 종서를 생산하는 방법을 사용하였다. 그러나 최근 발달된 조직 배양기술 중 생장점 배양 기술과 고온의(38℃) 열처리 기술은 병행하여 바이러스에 감염되지 않은 무병주 감자식물을 기내에서 대량증식할 수 있는 방법이 이미 개발된바 있다. 하지만 위와 같은 방법에 의해 경정(Shoot)을 기내에서 대량으로 생산한다 할지라도 실제 필요한 종서를 생산하기 위해서는 이들을 마지막 단계에서 토양을 이식해야 하는데 기내에서 자란 식물을 토양에 이식하는 것 자체가 매우 어려울 뿐만 아니라 이러한 과정중에서 실제 많은 수의 식물이 고사하여 성공적으로 토양에 활착하는 비율이 매우 낮은 단점이 있다.
따라서 이러한 문제점을 해결할 수 있는 방안으로서 인공씨감자(기내소괴경)를 생산하여 이것을 직접 씨감자로 파종하여 이용하는 방법을 들수가 있겠는데 여기서 말하는 인공씨감자라는 것은 감자의 줄기를 인공배지상에서 배양하면서 적절한 배양환경 조건을 부여하여 인공적으로 형성시킨, 실제감자의 괴경과 모양 및 기능은 꼭 같으면서도 단지 크기만 극도로 축소된 콩알만한 크기의 괴경을(직경이 0.5∼1.0cm, 무게는 약 200∼500mg정도) 말한다. 감자의 줄기를 조직배양할 경우 기내소괴경이 형성되는 현상에 관해서는 일찍부터 많은 보고가 있었으며(Garcia-Torres, L. and C. Gomez-Campo. 1973. In vitro tuberization of potato sprouts as affected by ethrel and gibberellic acid. Potato Res. 16 : 73∼79. Abbott, A.J. and A.R.Belcher. 1986. Potato tuber formation in vitro. In Plant Tissue Culture and its Agricultural applications. Butterworths, pp. 113-122) 이것들을 사용하여 감자의 무병우량종서를 대량으로 생산하고자 한 시도도 있었다.(Wang P.J. and C.Y.Hu. 1982. In vitro mass tuberization and virus-free seed potato production in Taiwan. Amer. Potato Jour. 59 : 33∼39). 그러나 감자의 경우 워낙 방대한 양의 씨감자가 매년 필요하기 때문에 설령 이 인공씨감자를 씨감자로서 사용할 수 있다고 하더라도 엄청난 갯수의 인공씨감자를 적은 면적에서 급속대량으로 생산하여 저렴한 가격으로 농민에게 공급할 수 있는 방법을 개발하지 않고서는 그 실용적인 의미는 거의 없다고 할 수 있다.
그러므로 본 발명에서는 감자에 있어서 씨감자로 막바로 사용이 가능한 인공씨감자를 종래의 방법보다 최소한 30배 이상 더 효율적으로 급속대량 생산하여 천연씨감자의 가격보다도 더 저렴하게 농민에게 공급할 수 있는 방법을 개발하고 이 방법에 의해 대량으로 생산된 인공씨감자를 씨감자로서 실제 사용할 수 있음을 보여주고자 한다. 다음의 실시예는 무수히 많은 감자 품종중 현재 한국에서 가장 많이 재배되고 있는 수미(Superior) 한품종만을 예를 들어 보여주고 있으나 본 발명에서 개발된 방법은 괴경형성을 특징으로 하는 감자의 모든 품종에 적용이 가능한 방법으로서 본 발명의 범위가 어느 특정한 품종의 감자나 본 명세서의 실시예에만 국한되는 것은 아니다.
[실시예 1]
[무병우량(Virus-free)감자의 경정배양(Shoot tip culture)확립과 인공씨감자 형성용 경정의 유기 및 이의 급속 대량 중식 방법]
농촌진흥청 원예 시험장에서 획득한 무병의 ‘수미(Superior)’ ‘세포디(Shepody)’, ‘남작(Irish cobbler)’, ‘대지마(Daejuma)’ 및 ‘러셋 버뱅크(Russet Burbank)’등의 다섯품종의 괴경을 사용하였으며 이 괴경들을 흐르는 수도물에 깨끗이 씻은 다음 70% 에릴알콜에 3분간 침지하고 20% 클로락스(상업용 유한락스)로 10분간 최종 표면소독을 한 후 멸균된 상토가(버미클라이트 : 펄라이트=1 : 1)들어있는 직사각형 화분에 파종하였다. 낮의 길이가 16시간 밤의 길이가 8시간이며 온도는 밤낮의 구별없이 25℃로 고정된 배양기에서 약 1주후부터 괴경의 발아가 일어나기 시작했으며 2주후에 싹의 길이가 평균 5∼10cm 정도에 이르렀을때 신초의 선단부위를(길이 1∼2cm) 절단하여 경정배양의 기초 재료로 사용하였다.
위와 같이하여 절단된 신초를 멸균 증류수로 3번 세척한 뒤 70% 에틸알콜에 30초간 침지하고 10% 클로락스(상업용 유한락스)로 10분간 최종 표면소독을 거친후 특수한 조성을 지닌 액체 혹은 고체의 인공씨감자 형성용 경정 발생 및 증식배지에 치사하였다. 배양실의 환경 조건은 앞서의 괴경발아시와 동일하였으며 이러한 배양환경 조건하에서 치상후 약 1주일 후부터 곁가지가(axillary shoot) 발생하기 시작하였으며 대개의 경우 3∼4주가 경과한 후에는 계대배양을 해주어야할 정도로 왕성한 생장을 보였다. 이때 곁가지의 발생을 최대한 촉진시키기 위해서 기재휘묻이(In vitro layering) 방법을 사용하였는데 플라스크나 시험관으로 배양할 경우 이러한 작업이 매우 어려울 뿐만 아니라 시간이 많이 거리는 단점이 있기 때문에 본 실험에서는 납작한 모양의 페트리디쉬(Petri dish, 직경 10cm, 높이 1.5cm)에서 경정을 배양, 자동적으로 기내휘묻이가 되도록하여 곁가지의 발생을 대폭적으로 증가시킬 수 있었다.(표 1참조). 경정 배양시 일반적으로 액체배양이 고체배양에 비해 경정(shoot)의 생장번식속도는 훨씬 빨랐으나 액체배양을 장기간 계속해서 시행할 경우 수분의 과다 흡수에 의한 경정의 퇴화내지는 비정상화 현상(shoot vitrification)이 빈번히 발생하여 정상적인 증식배양이 이루어지지 않았다. 따라서 배양초기에만 액체배지를 사용하였고 그 이후에는 주로 고체배지를 사용하는 방법을 택하였다.
여기서 한가지 특기할 사실은 배양액상에서 증식된 경정들이 다음 단계의 인공씨감자 형성조건에 옮겨졌을때 모두 인공씨감자를 형성하는 능력을 가지는 것이 아니라 특정한 모양, 즉 다시 말해서 잎과 줄기가 정상적으로 균형하게 전개되어 있고 곁가지 및 뿌리의 발달이 매우 왕성한 경정(제1도)들만이 인공씨감자를 대량으로 생산해내는 능력을 가진다는 점이다(표 2참조). 따라서 우리는 이러한 특이한 모양과 능력을 지닌 경정을 ‘인공씨감자 형성용 경정(Micro tubergenic shoot)’이라고 명하고 ‘수미(특허세포주 수탁번호, KCTC 8445p)’, ‘남작(특허세포주 수탁번호, KCTC 8442p)’, ‘대지마(특허세포주 수탁번호, KCTC 8446p)’, ‘Shepody(특허세포주 수탁번호, KCTC 8444p)’ 및 ‘Russet Burbank(특허세포주 수탁번호, KCTC 8443p)’등의 다섯품종에서 인공씨감자 형성용 경정을 유기하여 Korean Type Culture Collection에 특허세포주로 등록, 기탁하였다. 이러한 인공씨감자 형성용 경정들은 특수한 조성이 인공씨감자 형성용 경정 발생배지에서 주로 발생하였으며 한번 발생된 인공씨감자 형성용 경정은 적어도 24번(1년)동안의 계대배양후에도 그 특성을 그대로 유지하였다.
[표 1]
Figure kpo00001
Figure kpo00002
[표 2]
Figure kpo00003
[실시예 2]
[인공씨감자의 급속 대량 형성방법]
실시예 1의 경정의 급속증식단계, 즉 다시말해서 페트리디쉬에서 왕성하게 증식한 인공씨감자 형성용 경정들을 먼저 30℃의 고온배양기(기타 배양조건은 위의 인공씨감자 형성용 경정증식 배지와 동일함)에 옮겨서 1주일간 배양한 다음 이어서 이들을 완전 암흑의 10℃ 저온 배양기에서 또 다시 1주일간 저온 전처리를 하였다. 저온에 의한 전처리가 끝난 인공씨감자 형성용 경정들을 채취하여 인공씨감자 형성 촉진용배지에 치상한 뒤 3겹의 파라핀 필름으로 밀봉하여 낮의 온도가 20℃, 밤의 온도가 12℃, 낮의 길이가 6시간, 밤의 길이가 18시간, 광도가 500룩스인(lux) 배양기에 약 10개 단위로 페트리디쉬를 포개어서 배양하였다. 거의 대부분의 경우에 있어서는 위와 같은 인공씨감자 형성조건에 옮겨진 뒤 약 10일경부터 인공씨감자가 형성되기 시작하며 평균 40일내지는 50일정도 경과하게 되면 장차 씨감자로서 사용할 수 있는 콩알만한 인공씨감자가 페트리디쉬 한개당 평균 10여개 이상 형성되었다(제2도 참조). 인공씨감자 형성촉재용 배지의 조성중에서 Chloro Choline Chloride(CCC) 대신에 이와 비슷한 생리화학적 효능을 가지고 있는 Phosphon D, Amo-1618, B-905(N-dimethyl-amino succinamic acid)등의 생장억제제를 CCC와 동일한 농도로(100ppm) 배양액에 첨가하였을때도 인공씨감자 형성에 CCC만큼 탁월한 효과가 있었다.
‘수미(Superior)’품종에 있어서 인공씨감자 형성용 경정이 아닌 보통경정을 사용하여 관행의 액체배양법으로 인공씨감자를 생산했을때의 효율과 본 발명에서 새로이 개발한 고체배지를 사용한 페트리디쉬 배양법(인공씨감자 형성률을 높이기 위해 사용된 기타의 모든 처리 포함)으로 인공씨감자 형성용 경정을 배양하여 인공씨감자를 생산하였을때의 1인에 의한 단위 배양면적당 생산효율을 실예에 의해서 비교한 결과는 표 3 및 표 4와 같다.
[표 3]
Figure kpo00004
[표 4]
Figure kpo00005
[실시예 3]
[인공씨감자의 장기저장방법과 저장중 발아억제 및 저장후 발아 촉진방법]
배양기에서 대량으로 생산된 ‘수미’품종의 인공씨감자의 무균 상태로 수확, 멸균증류수에 일단 담구어서 3 내지 4번정도 충분히 세척하여 표면에 남아있는 배양액을 깨끗이 씻어내었다. 그리고나서 인공씨감자들을 멸균된 빈 페트리디쉬에 담아서 넓고 고르게 편뒤 클린벤취내에서 표면의 물기가 완전히 마를때까지 건조시킨 다음 뚜껑을 닫고 3겹의 파라필름으로 단단히 밀봉하여 4℃ 저온 냉장고에 포개어서 보관하였다(제3도 참조). 이렇게하여 저온저장고에 보관된 인공씨감자들은 약 두달뒤부터는 휴면이 타파되어 필요시에는 실온에 2주일 정도 방치하면 쉽게 발아가 되었으며(표 8참조) 발아를 억제하면서 장시간 보관하고자 할때에는 수확후 멸균수로 세척한 다음 5mg/ℓ의 앱사이식 산(Abscisic acid)용액에 3시간동안 침지한 후 표면의 물기를 완전히 말린뒤 0-4℃ 저온 저장고에 보관하였다. 이와 같은 방법으로 인공씨감자를 1년 이상 건전하게 보관할 수 있었으며 발아력이 조금도 상실되지 않았음을 확인하였다(표 6참조). 그리고 경우에 따라 수확후 조기에 발아시킬 필요가 있을때에는 지베릴릭산 처리를 하거나 지베릴릭 산 처리전에 38℃ 온욕처리를 병행해서 실시하게 되면 휴면타파촉진에 의한 조기발아가 가능하였으며(표 5참조) 이미 휴면이 타파된 인공씨감자의 경우에는 발아하는데 걸리는 기간을 대폭 단축시킬 수가 있었다(표 7참조).
[표 5]
Figure kpo00006
[표 6]
Figure kpo00007
[표 7]
Figure kpo00008
[실시예 4]
[인공씨감자의 파종, 재비에 의한 수확량 검정]
실시예 3에서와 같이 저온저장하던 ‘수미’품종의 인공씨감자를 2주일간 실온처리하여 일단 페트리디쉬내에서 눈을 2∼3mm 정도의 길이로 발아시킨 다음 이들을 포장에 막바로 직파하여 종래의 천연씨감자와 수확량 비교 검정을 진행하였다. 생육초기에는 인공씨감자의 생육이 천연씨감자의 생육에 비해 매우 불량하였으나 중기 이후에는 매우 왕성한 생육을 보여 파종후 3달이 되는 수확 시점에서는 인공씨감자의 지상부 생육이 천연씨감자의 생육에 약 삼분의 이 정도에 달하였으며 최종수확량도 지상부 생육정도와 정비례한 경향을 보여서 인공씨감자는 주당 약 507그람, 천연씨감자는 주당 약 812그람 정도의 수확량을 나타내었다.(표 8 및 제4,5도 참조). 따라서 인공씨감자를 천연씨감자 재식방법과 똑같이 심을 경우 천연씨감자에 비해 약 60∼70%의 수확을 올릴수 있음을 확인하였다. 그러나 인공씨감자의 경우 워낙 씨감자 자체의 크기가 작고 이로부터 생기는 식물체 자체의 크기도 상당히 왜소해지기 때문에 천연의 씨감자를 심는 재식 밀도보다 2배 내지는 3배까지도 밀식할 수가 있어서 이러한 재배방법을 채택할 경우 단위 면적당 수확량은 종래의 천연씨감자를 심었을때보다 오히려 더 증가할 수도 있을 것이다.
[표 8]

Claims (8)

  1. 감자 ‘수미(Superior)’품종의 괴경으로부터 특수한 조성의 배양액과 페트리디쉬형태의 배양용기를 사용하여 1단계 배양에서 특이한 성질(계대배양중 경정의 세력이 전혀 퇴화되지 않고 곁가지의 발생이 왕성하며 수평으로 잘 자라는 성질을 지닐뿐만 아니라 2단계 배양으로 인공씨감자를 많이 생성하는 성질)을 지닌 ‘인공씨감자 형성용 경정계’(KCTC.NO. 8445P)를 유기해내고 이들을 페트리디쉬와 유사한 형태의 납작한 배양용기에서 단시간내 대량 증식시킨 후 다음 단계인 2단계 배양용기를 포개에서 배양하는 방법으로 이들 ‘인공씨감자 형성용 경정’들을 배양하므로써 배양 실내의 전공간을 사용하여 무병, 우량 인공씨감자를 급속, 대량생산하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, ‘수미’품종의 ‘인공씨감자 형성용 경정계’의 유기 및 증식에 사용된 1단계 배양액으로서 Ammonium nitrate 2,000mg/liter, potassium nitrate 2,500mg/liter, Calcium chloride 。2H2O 440mg/liter, Magnesium sulfate 。7H2O 370mg/liter, Potassium Phosphate 170mg/liter, Disodium EDTA 37.25mg/liter, Ferrous sulfate 。7H2O 27.85mg/liter, Managanese sulfate 。H2O 16.9mg/liter, Boric acid 6.2mg/liter, Zinc sulfate 。7H2O 8.6mg/liter, Potassium iodide 0.83mg/liter, Sodium molybdate 。2H2O 0.25mg/liter, Copper sulfate 。5H2O 0.025mg/liter, Cobalt chloride 。6H2O 0.025mg/liter. Myo-inositol 100mg/liter, Ascorbic acid 50mg/liter, Gibberellic acid(GA) 0.1mg/liter, Zeatin reboside 0.1mg/liter, Sucrose 20,000mg/liter, Agar Riboflavin 0.5mg/liter, Biotin 1.0mg/liter, Choline chloride 1.0mg/liter, Calcium pantothenate 1.0mg/liter, Thiamine HCI 1.0mg/liter, Nicotinamide 2.0mg/liter, Pyridoxine HCI 2.0mg/liter, Para-aminobenzoic acid 0.5mg/liter를 함유하고 배양액의 pH를 5.7로 조정한 특수조성의 배양액을 사용하는 방법.
  3. 제1항에 있어서 인공씨감자 대량생산에 사용된 2단계 배양액으로서 Ammonium nitrate 1,000mg/liter, Potassium nitrate 1,500mg/liter, Calcium chloride 。2H2O 440mg/liter, Magnesium sulfate 。7H2O 370mg/liter, potassium phosphate 550mg/liter, Disodium EDTA 37.25mg/liter, Ferrous sulfate 。7H2O 27.85mg/liter, Managanese sulfate 。H2O 16.9mg/liter, Boric acid 6.2mg/liter, Zinc sulfate 。7H2O 8.6mg/liter, Potassium iodide 0.83mg/liter, Sodium molybdate 。2H2O 0.25mg/liter, Copper sulfate 。5H2O 0.025mg/liter, Cabalt Chloride 。6H2O 0.025mg/liter. Myo-inositol 100mg/liter, Ascorbic acid 50mg/liter, Chloro Choline chloride(CCC) 100mg/liter, Zeatin reboside 0.1mg/liter, Sucrose 90,000mg/liter, Agar 10,000mg/liter, Cyanocobalmin 1.5mg/liter, Folicacid 0.5mg/liter, Riboflavin 0.5mg/liter, Biotin 1.0mg/liter, Choline choride 1.0mg/liter, Calcium pantothenate 1.0mg/liter, Thiamine HCI 1.0mg/liter, nicotinamide 2.0mg/liter, Pyridoxine HIC 2.0mg/liter, Para-aminobenzoic acid 0.5mg/liter를 함유하고 배양액의 pH를 5.7로 조정한 특수조정의 배양액을 사용하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, Chloro choline Chloride 이외에도 이와 비슷한 생리화학적 효능을 가지고 있는 Phosphon D, Amo-1618, B-905(N-dimethyl-amino succinamic acid)의 생장억제제를 100ppm 이하의 농도로 2단계 인공씨감자 대량생산 배지에 첨가하여 사용하는 방법.
  5. 제1항 또는 제3항에 있어서 인공씨감자 형성을 촉진시키기 위하여 1단계 배양에서 증식된 인공씨감자 형성용 경정을 2단계 배양 직전에 18시간 광주기 및 3000록스(lux)의 광도와 30℃의 고온 조건에서 1주일 배양한 임흑 및 10℃의 저온 조건에서 또다시 1주일씩 각각 전처리한 뒤 이어서 주간 6시간 동안 20℃, 야간 18시간 12℃의 배양조건으로 7주일 동안 변온처리하여 2단계 배양이 끝날때까지 배양하는 방법.
  6. 제1항에 있어서 수확된 인공씨감자를 무균상태에서 장기 저장함에 있어서 앱사이식산(Abscisic acid)을 10ppm 농도로 3시간 침지처리하여 발아억제 시키므로써 장기 저장하는 방법.
  7. 제1항에 있어서 주어진 배양실의 면적 및 특히 공간이용 효율을 극대화하기 위하여 페트리디쉬와 유사한 납작한 형태의 배양기를 배양에 사용하고 특히 2단계 배양에서 납작한 형태의 배양기를 포개어 배양하는 기법으로 배양선반의 공간을 최대한 사용하는 방법.
  8. 제1항에 있어서 생산된 인공씨감자를 4℃ 저온에 저장하여서 휴면을 자발적으로 타파하는 방법과 5ppm 농도의 지베릴릭산(Gibberellic acid) 처리와 38℃ 온탕처리를 병행하여 인위적으로 휴면을 타파하고 발아를 촉진시키는 방법.
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