CN101810139A - 一种制备石竹高频再生植株的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种制备石竹高频再生植株的方法，所述方法包括：(1)获取石竹的原生质体；(2)将步骤(1)获得的原生质体进行液体浅层培养和增殖培养，使原生质体生成再生细胞，并进而生成愈伤组织；(3)将步骤(2)获得的愈伤组织进行芽分化培养，使愈伤组织上生成芽苗；和(4)将步骤(3)获得的芽苗进行生根培养，使芽苗生长为石竹植株。本发明的方法采用原生质体培育技术，通过培育条件的优化，克服了现有技术中难以从石竹原生质体获得石竹再生植株的技术缺陷。

Description

一种制备石竹高频再生植株的方法

技术领域

本发明属于植物生物学领域，更具体地，本发明涉及一种制备香石竹和中国石竹高频再生植株的方法。

背景技术

石竹科植物为双子叶植物，隶属石竹目(Cayophyllales)。广布于全球，主要分布于北半球温带或暖温带地区。石竹属(Dianthus)是石竹科下的一属，原生于欧洲及亚洲，少部分向南延伸至非洲。

香石竹(Dianthus caryophyllus)是世界四大切花之一，属于石竹科石竹属生物，是多年生根宿草本。株高30-60cm，茎簇生、光滑，微具白粉，茎上有膨大的节。对生叶，线状披针形，全缘，基部抱茎，具白粉而呈灰绿色，有较明显的叶脉3-5条。花多为单生茎顶，少有数朵簇生者，花色有白、粉、红、紫、黄及杂色，具香味，有单瓣重瓣之分。蒴果，种子黑色。香石竹原产南欧及印度，1066年引入英国，1375年有栽培香石竹的记载，1670-1676年开始有人进行香石竹的育种工作。法国、英国育出植株高、花梗挺拔、花朵大的优良切花品种，在世界各国均广为栽培。香石竹主要用于切花。色彩丰富，可制作花篮、花束等，或用作艺术插花的材料。

中国石竹(Dianthus chinensis)为石竹科，石竹属生物，为二年生草本植物。株高15-50cm，茎光滑，直立，较细软，分枝多，丛生性强，节膨大。叶对生，线状披针形，无叶柄，叶脉明显。花单生，或数朵簇生成聚伞花序，花萼圆筒形，花瓣5枚，花红色、粉红色和白色，苞片线状，花期4-5月，蒴果矩圆形，果熟期5-6月。中国石竹原产于甸东北、西北和长江流域，现在中国国内外普遍栽培。生长习性喜光、耐寒。中国石竹为重要的春季花坛、花境材料。

目前石竹属植物的繁殖一般采用无性繁殖的方式，常用的是播种法、扦插法和分株繁殖法。然而，播种繁殖法存在后代花色变差、品种退化的问题，而分株繁殖和扦插法存在培养效率低，单次培育再生植株数量少的问题。

由于石竹植物的观赏性强，被大量地用于景观设计，市场上对于石竹植物的需求非常大。因此，本领域非常需要开发新的高效产生石竹植株的新方法，以克服现有技术存在的问题。目前本领域还没有利用原生质体再生法高频再生石竹植株的方法的报导。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备香石竹和中国石竹高频再生植株的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种制备石竹(Dianthus)再生植株的方法，所述方法包括：

(1)获取石竹的原生质体；

(2)将步骤(1)获得的原生质体进行液体浅层培养和增殖培养，使原生质体生成再生细胞，并进而生成愈伤组织；

(3)将步骤(2)获得的愈伤组织进行芽分化培养，使愈伤组织上生成芽苗；和

(4)将步骤(3)获得的芽苗进行生根培养，使芽苗生长为石竹植株。

在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，获取石竹原生质体的方法是：

(a)取石竹苗顶部叶片(优选取新增殖的顶部三对伸展叶片，优选切成0.5-2mm条状)；

(b)用盐溶液处理所述叶片，使细胞发生细胞质和细胞壁的分离(质壁分离)；

(c)酶解细胞壁，分离出原生质体；和

(d)洗涤纯化该原生质体，获得分离纯化的原生质体。

在本发明的另一个实施方式中，步骤(b)中，所述的盐溶液是：含有0.7±0.2mol/L甘露醇的CPW盐溶液。

在另一优选例中，所述盐溶液pH 5.6±0.2。

在另一优选例中，石竹苗顶部叶片经过短时萎焉处理后再进行盐溶液处理。

在另一优选例中，盐溶液处理的时间是1-2小时；较佳的是1-1.5小时。

在本发明的另一个实施方式中，步骤(c)中，酶解采用的酶解液是CPW盐溶液，其中还含有：2±0.3％纤维素酶，0.5±0.1％离析酶，0.5±0.1mol/L甘露醇。

在另一优选例中，酶解条件是：24±3℃，黑暗，静置。更佳地，酶解时间是10-20小时，较佳的是12-14小时。

在另一优选例中，酶解后，酶解液用200目尼龙网过滤，去除未酶解的组织残渣，获得含有原生质体的过滤液。

在另一优选例中，将含有原生质体的过滤液离心(优选500rpm/min离心2-3min)，去除酶解液；洗液洗涤原生质体，离心(优选500rpm/min离心2-3min)分离洗涤后的原生质体，用洗液重悬该原生质体，获得悬浮液；将悬浮液加入(优选缓缓加入)到含有0.5±0.1mol/L蔗糖的CPW盐溶液，以1000±200rpm/min的速度离心(优选离心5±2分钟)，离心后静置以形成两个液体相，吸取处于两个液体相中间的液面上的原生质体。较佳地，将获得的原生质体再用洗液洗涤一次。

在另一优选例中，所述的洗液是含有0.5±0.1mol/L甘露醇的CPW盐溶液；更佳地，洗液的pH 5.6±0.2。

在另一优选例中，石竹的原生质体的产量为6×10⁶/g FW以上。

在本发明的另一个实施方式中，步骤(2)中，进行液体浅层培养的方法是：

(i)将原生质体置于液体培养液(如2ml体积)中，进行暗培养，每隔10±5天加入0.1-0.3倍(优选0.15-0.25倍)体积的新鲜液体培养液，获得8-32个细胞的小细胞团；其中，所述的液体培养液是含有0.5±0.1mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)和0.5±0.1mg/L萘乙酸(NAA)的KM8p基本培养基；

(ii)向培养液中加入降低渗透压的液体培养基，继续暗培养，从而形成小愈伤组织；其中，所述降低渗透压的液体培养基是含有1±0.2％(重量)葡萄糖、2±0.4％(重量)蔗糖、1±0.2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、0.2±0.04萘乙酸(NAA)的MS培养液。

在另一优选例中，培养10天时石竹原生质体的再生细胞分裂频率高于20％。

在本发明的另一个实施方式中，步骤(2)中，进行增殖培养的方法是：

将步骤(ii)获得的小愈伤组织转移到含有0.5±0.1mg/L 6-苄基嘌呤(BA)和0.2±0.05mg/L萘乙酸(NAA)的固化的MS增殖培养基(优选Gelrite固化的MS增殖培养基)上，光照培养3-8周(优选5-6周)，获得直径2-5mm(优选3-4mm)愈伤组织。

在本发明的另一个实施方式中，步骤(i)中，原生质体在液体培养基中的密度是(1.5-4)×10⁶个/ml(较佳地(2-3)×10⁶个/ml，更佳地2.5×10⁶个/ml)。

在本发明的另一个实施方式中，步骤(3)中，进行芽分化培养的方法是：

将愈伤组织置于芽分化培养基上，获得芽苗；其中所述的芽分化培养基是含有1±0.2mg/L玉米素(ZT)和0.1±0.02mg/L萘乙酸(NAA)的MS培养基。

在另一优选例中，石竹的芽分化频率高于55％。

在本发明的另一个实施方式中，步骤(4)中，进行生根培养的方法是：

将芽苗置于生根培养基上，诱导生根(优选培养15±2天)；其中所述的生根培养基是含有0.8±0.2mg/L吲哚3-丁酸(IBA)的1/2MS培养基。

在另一优选例中，所述方法还包括：将生根的植株移栽到泥炭、蛭石和珍珠岩(v/v/v＝7∶2∶1)的混合物中培养。

在本发明的另一个实施方式中，所述的石竹选自：香石竹(Dianthuscaryophyllus)或中国石竹(Dianthus chinensis)。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1：香石竹照片组：

图1A：由香石竹原生质体来的愈伤组织；

图1B：由香石竹愈伤组织来的丛芽；

图1C：伸长的香石竹芽苗。

图2：中国石竹照片组。

图2A：由中国石竹原生质体来的愈伤组织；

图2B：由中国石竹愈伤组织来的丛芽；

图2C：伸长的中国石竹芽苗。

具体实施方式

本发明人经过长期而深入的研究，找到了一种高频产生石竹(Dianthus)(如香石竹或中国石竹)再生植株的方法，即以石竹的原生质体再生成植株。本发明的方法通过培育条件的优化，克服了现有技术中难以从石竹原生质体获得石竹再生植株的技术缺陷。

如本文所用，所述的“石竹”是指石竹科的植物，更特别地是指石竹科石竹属的植物，例如所述的石竹选自：香石竹(Dianthus caryophyllus)或中国石竹(Dianthus chinensis)。

如本文所用，所述的“原生质体(Protoplast)”指除去细胞壁的细胞。

如本文所用，所述的“再生植株”是指将石竹的原生质体经过再生细胞壁、形成细胞团、形成愈伤组织、诱导芽分化、诱导生根等过程再生成植株的方法或利用所述方法获得的植株。

原生质体的分离

本发明人研究中发现，从石竹的不同组织(包括茎、叶、根等)获得的原生质体再生成植株的能力是有差异的，并且，利用石竹的原生质体再生成植株对再生的步骤和操作存在较高的要求。经过深入研究，本发明人优化了石竹植物的原生质体的分离技术，并且首次开发了利用石竹原生质体高频获得再生植株的方法。

作为本发明的优选方式，获取香石竹原生质体的方法是：(a)取石竹苗顶部叶片；(b)用盐溶液处理所述叶片，使细胞发生细胞质和细胞壁的分离(质壁分离)；(c)酶解细胞壁，分离出原生质体；和(d)洗涤纯化该原生质体，获得分离纯化的原生质体。优选地将叶片切成0.5-2mm的条状；更佳地切成1-1.5的mm的条状，这样有利于获得良好的质壁分离以及酶解效果。较佳地在对叶片切成条状之前，对香石竹苗顶部叶片进行短时萎焉处理，这对于获得良好的质壁分离和酶解效果也是有利的。

质壁分离采用调节细胞渗透压的培养基，通过改变细胞渗透压使得细胞质从细胞壁上分离开来。较佳地，所述的调节细胞渗透压的培养基是含有0.7±0.2mol/L甘露醇的CPW盐溶液；更佳地所述盐溶液pH 5.6±0.2。盐溶液处理的时间是1-2小时；较佳的是1.5小时。CPW盐溶液是本领域已知的用于细胞渗透压调节的基础培养基，本发明人优化了其中加入的甘露醇的用量。

合适的酶的选择有利于较好地去除细胞壁且保留完整的、状态良好的香石竹原生质体，因此本发明人对酶解选用的酶、其用量及酶解条件进行了优化。作为本发明的优选方式，采用含有纤维素酶、离析酶、甘露醇的CPW盐溶液来酶解香石竹的细胞壁。较佳地，酶解液含有：2±0.3％纤维素酶，0.5±0.1％离析酶，0.5±0.1mol/L甘露醇。作为本发明的优选方式，酶解条件是：24±3℃，黑暗，静置；酶解时间是10-20小时，较佳的是12-14小时。

酶解完成后，酶解液过滤去除未酶解的组织残渣，获得含有原生质体的过滤液。原生质体的纯化是较为关键的，关系到最终获得的原生质体的质量，而试剂使用不当或操作(如离心操作)不当都将造成原生质体被破坏，因此本发明人优化了原生质体的纯化过程，找到了一种温和地纯化香石竹原生质体的方法。

因此，作为本发明的优选方式，将含有原生质体的过滤液进行温和地离心，优选500rpm/min离心2-3min，去除酶解液；洗液洗涤原生质体，再温和地离心分离洗涤后的原生质体，用洗液重悬该原生质体，获得悬浮液；将悬浮液加入(优选缓缓加入)到含有0.5±0.1mol/L蔗糖的CPW盐溶液，以1000±200rpm/min的速度离心(优选离心5±2分钟)，离心后静置以形成两个液体相，吸取处于两个液体相中间的液面上的原生质体。较佳地，将获得的原生质体再用洗液洗涤一次。较佳地，所述的洗液是含有0.5±0.2mol/L甘露醇的CPW盐溶液。

作为本发明的优选方式，最终获得的香石竹的原生质体置于含有0.5±0.1mg/L 2，4-D和0.5±0.1mg/L NAA的KM8p基本培养基中培养。

植株的再生

在获得了石竹的原生质体后，需要继续培养该原生质体，以获得再生植株。作为本发明的优选方式，再生植株的方法主要包括以下步骤：用培养液浅层培养原生质体，使之生成愈伤组织团块；用增殖培养基培养愈伤组织团块使之生成较大的愈伤组织；用芽分化培养基培养愈伤组织使之生成芽苗；对芽苗进行生根培养以获得完整的再生植株。

作为本发明的优选方式，进行液体浅层培养的方法是：(i)将原生质体置于液体培养液(如2ml体积)中，进行暗培养，每隔10±5天加入0.1-0.3倍(优选0.15-0.25倍)体积的新鲜液体培养液，获得8-32个细胞的小细胞团；其中，所述的液体培养液是含有0.5±0.1mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)和0.5±0.1mg/L萘乙酸(NAA)的KM8p基本培养基；(ii)向培养液中加入降低渗透压的液体培养基(优选加入原培养液的？-？倍体积)，继续暗培养，从而形成小愈伤组织；其中，所述降低渗透压的液体培养基是含有1±0.2％(重量)葡萄糖、2±0.4％(重量)蔗糖、1±0.2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、0.2±0.04萘乙酸(NAA)的MS培养液。

在浅层培养时，培养基中调节适当的原生质体密度有利于获得良好的细胞再生效果。本发明人反复研究后发现，步骤(i)中，在初始培养时，原生质体在液体培养基中的密度为(1.5-4)×10⁶个/ml，较佳地(2-3)×10⁶个/ml，更佳地2.5×10⁶个/ml时，培养效果较为理想。

在浅层培养过程中，细胞的渗透压的调节是较为重要的。因此，在浅层培养的过程中，每隔10±5天加入新鲜的培养基，并维持一定的渗透压，使细胞处于持续分裂状态；当细胞长到形成8-32个细胞的小细胞团时，立即加入降低渗透压的液体培养基。并且加入2，4-D和NAA的量也进行了良好地控制，在培养初期，2，4-D和NAA的加入量维持在可启动细胞分裂即可，而加入过多反而会抑制细胞的分裂；在培养至8-32个细胞的小细胞团时，2，4-D的量适当增加，NAA的量适当降低。采用本发明的方法，培养10天时石竹原生质体的再生细胞分裂频率高于20％。

作为本发明的优选方式，进行增殖培养的方法是：将步骤(ii)获得的小愈伤组织转移到含有0.5±0.1mg/L 6-苄基嘌呤(BA)和0.2±0.05mg/L萘乙酸(NAA)的固化的MS增殖培养基(优选Gelrite固化的MS增殖培养基)上，光照培养3-8周(优选5-6周)，获得直径2-5mm(优选3-4mm)愈伤组织。该阶段为光照培养，并且培养基为固态，其中不加入2，4-D，这种条件下有利于小愈伤组织的增殖，形成较大的(直径约3-4mm)的愈伤组织。

作为本发明的优选方式，进行芽分化培养的方法是：将愈伤组织置于芽分化培养基上，获得芽苗；其中所述的芽分化培养基是含有1±0.2mg/L玉米素(ZT)和0.1±0.02mg/L萘乙酸(NAA)的MS培养基。采用本发明的方法，石竹的芽分化频率高于55％。

作为本发明的优选方式，进行生根培养的方法是：将芽苗置于生根培养基上，诱导生根(优选培养15±2天)；其中所述的生根培养基是含有0.8±0.2mg/L吲哚3-丁酸(IBA)的1/2MS培养基。采用本发明的方法，可顺利地使得芽苗生成根系并成活。

本发明中，除非另外说明，所用的CPW盐溶液，MS培养基或1/2MS培养基，KM8p培养基均是本领域已知的培养基。例如，常规的CPW盐溶液的配方可参见Power，J.B and R.Davay，1980：Laboratory Mannual：Plant Protoplasts.Univ.of Nottingham，England；常规的MS培养基的配方可参见Murashige，T and F.Skoog，1962：A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue-culture.Physiol.Plant.15：473-497；常规的KM8p培养基的配方可参见Kao，K.N.，1977：Chromosomal behaviour in somatic hybrids of Soybean-Nicotiana glauca.Mol.Gen.Genet.，150：225-230。1/2MS培养基则是无机盐为MS培养基的一半的MS培养基。然而，为了获得良好的再生效果，本发明人在这些基础培养基的基础上进行了优化或调节，例如视条件的不同，在CPW盐溶液中加入了适当浓度的甘露醇、纤维素酶、或离析酶等；在KM8p培养基中加入了适当浓度的2，4-D或NAA等；在MS培养基中加入了适当浓度的ZT或NAA等。

本发明的主要优点在于：

采用本发明的上述方法，采用极少的起始材料、单次培育即可获得大量的石竹植株(多于50株)，因此本发明的方法是一种高频再生方法，特别适合于石竹植物的培育。

采用本发明的上述方法获得的植株的表型一致性高，并且可以以获得的原生质体作为受体转入其它基因以制备出既能保持亲本的遗传表型，又具有所转入的外源目的基因的性状的植株。

可以以本发明的方法获得的原生质体作为体细胞杂交的亲本之一，进行细胞杂交，可创造不同于原亲本的新种质，供进一步的花卉品种的遗传改良。

本发明的方法再现性高，用本发明的方法经三批离体培养实验，均能获得香石竹和中国石竹的叶肉原生质体经培养获得高频再生植株。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

除非另外注明，文中涉及的KM8p培养基、MS培养基、1/2MS培养基、CPW盐溶液等均与Power，J.B and R.Davay，1980：Laboratory Mannual：Plant Protoplasts.Univ.of Nottingham，England；或Murashige，T and F.Skoog，1962：A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue-culture.Physiol.Plant.15：473-497；或Kao，K.N.，1977：Chromosomal behaviour in somatic hybrids of Soybean-Nicotiana glauca.Mol.Gen.Genet.，150：225-230中提到的配方一样。

实施例1.获取香石竹及中国石竹的原生质体

以香石竹(Dianthus caryophyllus，种为Tuareg，红色花)及中国石竹(Dianthus chinensis，种为兴安石竹D.Versicolor Fish ex Link，亦称变色石竹)经扩增繁殖的试管苗为起始材料，取新增殖的顶部三对伸展叶片，经短时萎蔫，用镊子轻轻撕下下表皮或用解剖刀切成宽约1-1.5mm左右的细条，置于附加0.7mol/L甘露醇的CPW盐溶液(pH 5.6)中质壁分离1-1.5h，随后换入过滤灭菌的酶解液【酶液组成为2％纤维素酶(Cellulase Onozuka R-10)，0.5％离析酶(Macerozyme R-10)，0.5mol/L甘露醇溶于CPW盐溶液中】。放入24℃培养箱中黑暗静置酶解12-14h。

酶解后，将酶解液用无菌的200目的尼龙网过滤，去除未酶解的组织残渣。将含原生质体的过滤液离心(500r/min，2.5min)，吸去酶解液，在含原生质体的离心管中加入新鲜的无菌洗液(其组成为附加0.5mol/L甘露醇的CPW盐溶液，pH 5.6)，使原生质体重新悬浮后再次离心(500r/min，2.5min)。吸去溶液后，再加入2ml新鲜的无菌洗液悬浮原生质体后，将此原生质体悬浮液缓缓加入到含8ml的附加0.5mol/L蔗糖的CPW盐溶液的液面上，以1000r/min的速度离心5min后，吸取界面上纯化的原生质体注入离心管中，再加入新鲜的无菌洗液再离心洗涤一次后，加入少量培养基(培养基为改良的KM8p+0.5mg/L 2，4-D+0.5mg/L NAA)。

在血球计数板上计数，分别估算香石竹和中国石竹的原生质体的产量，计数结果表明香石竹的叶肉原生质体的产量为6.8×10⁶/g FW，中国石竹的叶肉原生质体的产量为6.5×10⁶/g FW。

实施例2.原生质体培养再生细胞

将适量的原生质体分别放置入6个6cm直径的无菌玻璃培养皿中，每个培养皿注入2ml的液体培养液，使得原生质体密度2.5×10⁵个/ml；用胶带(Parafilm)封口，进行液体浅层暗培养(24℃)，培养基为改良的KM8p(KM8p+0.5mg/L 2，4-D+0.5mg/L NAA)，培养4-5天后部分原生质体开始长壁，细胞绝大部分呈椭圆形，培养7天时可见到再生细胞呈现第一次分裂。

此时，香石竹的再生细胞分裂频率为6.7％，中国石竹的再生细胞分裂频率为5.8％。培养10天时香石竹的再生细胞分裂频率达到24.6％，中国石竹的再生细胞分裂频率达到21.4％。

实施例3.培养再生植株

在培养过程中，每隔10天应加入新鲜的无菌培养液0.3-0.5ml以维持正常的渗透压，使分裂细胞持续分裂，当形成8-32个细胞的小细胞团时，应及时添加0.5ml降低渗透压的液体培养基(含1％(重量比)葡萄糖和2％(重量比)蔗糖的MS培养液+1mg/L2，4-D+0.2mg/L NAA)1-2次，此后原生质体的再生细胞能向着形成胚性细胞的方向发育。

培养至95-100天时，即可见到大量肉眼可见的乳白色、结构致密的小愈伤组织，用玻璃吸管将其一起吸到附加0.5mg/L BA和0.2mg/L NAA，0.2％Gelrite固化的MS增殖培养基上，经5-6周培养，愈伤组织长到直径约3-4mm大小时，就可将此种大小的愈伤组织块转到不同的芽分化培养基上，培养20-25天。其中在MS+1mg/L ZT+0.1mg/L NAA的芽分化培养基上，香石竹的芽分化频率可达68.6％，中国石竹的芽分化频率可达56.4％(参见图1和图2)。

切取分化出的香石竹和中国石竹的叶肉原生质体培养再生出的芽苗，经诱导生根培养试验的结果表明，1/2MS+0.8mg/L IBA是最适宜的生根培养基，经15天生根培养后，均能形成完整的香石竹和中国石竹植株。

试验累计获得香石竹叶肉原生质体培养再生植株87株，中国石竹叶肉原生质体培养再生植株53株。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种制备石竹Dianthus再生植株的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)获取石竹的原生质体；

(2)将步骤(1)获得的原生质体进行液体浅层培养和增殖培养，使原生质体生成再生细胞，并进而生成愈伤组织；

(3)将步骤(2)获得的愈伤组织进行芽分化培养，使愈伤组织上生成芽苗；和

(4)将步骤(3)获得的芽苗进行生根培养，使芽苗生长为石竹植株。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，获取石竹原生质体的方法是：

(a)取石竹苗顶部叶片；

(b)用盐溶液处理所述叶片，使细胞发生细胞质和细胞壁的分离；

(c)酶解细胞壁，分离出原生质体；和

(d)洗涤纯化该原生质体，获得分离纯化的原生质体。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述的盐溶液是：含有0.7±0.2mol/L甘露醇的CPW盐溶液。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(c)中，酶解采用的酶解液是CPW盐溶液，其中还含有：2±0.3％纤维素酶，0.5±0.1％离析酶，0.5±0.1mol/L甘露醇。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，进行液体浅层培养的方法是：

(i)将原生质体置于液体培养液中，进行暗培养，每隔10±5天加入0.1-0.3倍体积的新鲜液体培养液，获得8-32个细胞的小细胞团；其中，所述的液体培养液是含有0.5±0.1mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.5±0.1mg/L萘乙酸的KM8p基本培养基；

(ii)向培养液中加入降低渗透压的液体培养基，继续暗培养，从而形成小愈伤组织；其中，所述降低渗透压的液体培养基是含有1±0.2重量％葡萄糖、2±0.4重量％蔗糖、1±0.2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、0.2±0.04萘乙酸的MS培养液。

6.如权利要求1或5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，进行增殖培养的方法是：

将步骤(ii)获得的小愈伤组织转移到含有0.5±0.1mg/L 6-苄基嘌呤和0.2±0.05mg/L萘乙酸的固化的MS增殖培养基上，光照培养3-8周，获得直径2-5mm愈伤组织。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(i)中，原生质体在液体培养基中的密度是(1.5-4)×10⁶个/ml。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，进行芽分化培养的方法是：

将愈伤组织置于芽分化培养基上，获得芽苗；其中所述的芽分化培养基是含有1±0.2mg/L玉米素和0.1±0.02mg/L萘乙酸的MS培养基。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，进行生根培养的方法是：

将芽苗置于生根培养基上，诱导生根；其中所述的生根培养基是含有0.8±0.2mg/L吲哚3-丁酸的1/2MS培养基。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的石竹选自：香石竹Dianthus caryophyllus或中国石竹Dianthus chinensis。

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