CN103548677A - 一种龙爪柳茎的增殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种龙爪柳茎的增殖方法，通过植物组织培养的方法以龙爪柳茎为外植体对龙爪柳茎进行增殖，在组织培养中所用培养基包括MS、0.01～1mg/L萘乙酸（NAA）、0.05～2mg/L玉米素、30g/L蔗糖和6.5g/L琼脂粉，根据本发明提供的方法，可快速稳定的对龙爪柳茎进行增殖，操作简单易控，增殖率高。

Description

一种龙爪柳茎的增殖方法

技术领域

本发明涉及林木培育领域，特别涉及植物组织培养领域。

背景技术

龙爪柳，又名龙须柳，拉丁名:Salix matsudana var.tortuosa，科名:杨柳科Salicaceae柳属，是生长在东北、华北、西北、华东等地的杨柳科柳属落叶灌木或小乔木，湿地、旱地皆能生长，生长快，其有阳性，耐寒等特点，春季至夏季为适期，其枝条卷曲，姿态别致，在园林中广泛应用栽培，但其数量有限，并且自身繁殖不易，因此在园林应用中受到一定的限制，目前尚无良好的繁殖方法对其进行大规模繁殖。

龙爪柳的繁殖方法有播种法或扦插法繁殖。其中，播种法即是在适宜萌芽的条件下在土壤中播撒龙爪柳种子，等待龙爪柳自然萌芽。由于获取龙爪柳种子受到时间和空间的限制，而且种子自然出芽率低，同时，在野外培养中，土地养料状况、细菌浓度等因素都会对龙爪柳的生长有不可控的影响。此外，播种法育种周期长，种苗变异大，受气候、土壤、水源等自然条件限制严重，植物出芽率、成活率低，选种、播种工作繁重，还需要人工管护、基地、劳动强度大，所需运输等费用大，因此播种法不适合大面积播种和推广。

扦插法是将植物的营养器官：根、茎、叶作为插条进行扦插从而形成独立植株的繁殖方法，该方法培育的植株比播种苗生长快，短时间内可以培育成大苗，避免了种苗的变异问题，然而，传统的扦插方法对插条的需求量大，要求高，而且取材时间固定，同时，植物体的根、茎、叶数量有限，因此会对扦插方法的大规模应用造成限制，此外，该方法存在成活率低，育种周期长，增殖速度慢，管护等费用高的问题。

植物组织培养是在人工培养基中，将离体组织细胞培养成为完整植株的增殖方法。采用植物组织培养方法增殖植物具有占地面积小，增殖周期短，全年都能进行增殖，增殖系数高等特点，同时还可以消除母本植物带来的某些病毒，因此，目前利用植物组织培养来繁殖难以自身繁殖的植物正在大规模推广。如，中国专利CN200610050993.9公开了一种西洋杜鹃组培快速繁殖及试管开花的方法及所用的培养基，其在外植体准备过程中使用含有重金属离子的氯化汞溶液进行消毒，会造成环境污染，其使用的培养基含有Read、MS有机成分物、蔗糖20～30g/L、玉米素1.0～2.5mg/L、萘乙酸0.05～0.1mg/L、琼脂9～11g/L，pH5.0～5.4。该培养基用于常绿灌木西洋杜鹃的组培块快速增殖。

然而，目前尚未有利用植物组织培养的方法对龙爪柳茎进行增殖的报道。

发明内容

为了克服上述问题，本发明经锐意研究，结果发现：龙爪柳茎在包括MS、0.01～1mg/L萘乙酸（NAA）、0.05～2mg/L玉米素、30g/L蔗糖和6.5g/L琼脂粉的培养基可迅速增殖，具有不受自然条件限制、增殖迅速、种苗变异小等优势。其中，加入的萘乙酸和玉米素等激素使龙爪柳茎的增殖效率提升。本发明人经不断探索，确定萘乙酸和玉米素促进龙爪柳茎增殖的最佳浓度分别为0.1mg/L和1mg/L，经多次试验证明，该两种激素在此浓度下能够有效诱导龙爪柳茎增殖。

因此，本发明以MS、萘乙酸（NAA）、玉米素、蔗糖和琼脂粉制备培养基，并在此培养基中对龙爪柳茎进行增殖，从而完成本发明。

本发明的目的在于提供以下几方面：

第一方面，本发明提供一种龙爪柳茎的增殖方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）外植体的选取，包括以下子步骤：

（1-1）每年4～10月选取龙爪柳当年生嫩茎的形态学上端4～5节，每一节作为一个外植体，冰袋保存；

（1-2）将（1-1）中取得的外植体上叶片的形态学上端剪去，保留叶片的形态学下端0.5～1cm；

（2）外植体灭菌，包括以下子步骤：

（2-1）将（1）处理过的外植体以流动水冲洗；

（2-2）将（2-1）中处理后的外植体移至超净工作台中进行以下操作：

①用75%酒精对外植体进行表面灭菌30～60s，后用灭菌水冲洗酒精灭菌后的外植体；

②在不断摇动的条件下，用0.5～1%次氯酸钠溶液对①处理后的外植体进行灭菌，6～8min；

③用灭菌水冲洗经②处理后的外植体；

（3）接种、培养，包括以下子步骤：

（3-1）将步骤（2）处理后的外植体的形态学下端插入培养基中，每个培养基中接种4个外植体，置于组织培养室中在以下培养条件下培养：温度27℃，光照3000lx，14小时光周期；

（3-2）继代培养：（3-1）中接种的外植体约2周后腋芽开始膨大，3～4周后腋芽抽出新叶，5～6周外植体长至3cm长后，继代至与（3-1）中所用培养基配比相同的培养基中进行继代培养，培养3个月左右，外植体长至10～15cm，得到继代龙爪柳茎；

（3-3）增殖培养：将（3-2）中继代培养得到的继代龙爪柳茎取出，按照其节数，将每节叶片的形态学上端剪去，保留叶片的形态学下端0.5～1cm，移至与（3-1）中所用培养基配比相同的培养基中进行增殖培养；

（4）重复步骤（2）～（3）；

其中，

所述培养基包括：

其中，所述g/L是基于每升培养基所述成分的重量。

第二方面，本发明提供上述龙爪柳茎的增殖方法，其特征在于，所述培养基包括：

其中，所述g/L是基于每升培养基所述成分的重量。

第三方面，本发明提供上述龙爪柳茎的增殖方法，其特征在于，所述培养基包括：

其中，所述g/L是基于每升培养基所述成分的重量。

第四方面，本发明提供上述龙爪柳茎的增殖方法，其特征在于，所述培养基由以下步骤制得：

（1）调节MS培养基pH至5.8～6.0，加入琼脂粉，后于121℃下高温蒸汽灭菌20～30min，冷却至50～60℃待用；

（2）萘乙酸和玉米素灭菌待用；

（3）将（2）中灭菌后的萘乙酸和玉米素加入步骤（1）中制备的琼脂-MS中，凝固制备完成。

第五方面，本发明提供上述龙爪柳茎的增殖方法，其特征在于，所述灭菌方式为通过滤膜过滤灭菌，其中，滤膜孔径为0.22μm。

第六方面，本发明还提供一种用于龙爪柳茎增殖的培养基，其特征在于，包括：

其中，所述g/L是基于每升培养基所述成分的重量。

第七方面，本发明提供上述用于龙爪柳茎增殖的培养基，其特征在于，包括：

其中，所述g/L是基于每升培养基所述成分的重量。

第八方面，本发明提供上述用于龙爪柳茎增殖的培养基，其特征在于，包括：

其中，所述g/L是基于每升培养基所述成分的重量。

第九方面，本发明提供上述用于龙爪柳茎增殖的培养基，其特征在于，通过以下步骤制备得到：

（1）调节MS培养基pH至5.8～6.0，加入琼脂粉，后于121℃下高温蒸汽灭菌20～30min，冷却至50～60℃待用；

（2）萘乙酸和玉米素灭菌待用；

（3）将（2）中灭菌后的萘乙酸和玉米素加入步骤（1）中制备的琼脂-MS中，凝固制备完成。

第十方面，本发明提供上述用于龙爪柳茎增殖的培养基，其特征在于，所述灭菌方式为通过滤膜过滤灭菌，其中，滤膜孔径为0.22μm。

本文中所用术语“年增殖率”是指，一个龙爪柳茎在一年内能够增殖的倍数，如“年增殖率为1:1000”是指，“一个龙爪柳茎在一年内能够增殖1000倍”。

根据本发明提供的一种龙爪柳茎的增殖方法，具有以下有益效果：

（1）本发明提供的龙爪柳茎增殖方法不经过愈伤诱导即可实现龙爪柳茎的增殖，增殖速度快，操作简单，具有较高科研价值；

（2）本发明提供的龙爪柳茎增殖方法能够为龙爪柳转基因工程提供普通方法难以获得的无菌原生质体等物质基础；

（3）本发明提供的龙爪柳茎增殖方法能够在人工可控的环境下获得龙爪柳的茎和叶，且与多年生的树木相比，其所产生的次生代谢物质少，从而简化提取RNA过程；

（4）本发明提供的龙爪柳茎增殖方法，成功率在90%以上，年增殖率为1:1000（即，一个龙爪柳茎在一年内能够增殖1000倍），这为龙爪柳在园林景观、行道树绿化等方面的大规模种植奠定了基础；

（5）本发明提供的方法不受土壤、温度、湿度、光照等自然条件影响，所有操作都在组织培养室中进行，无菌，温度、湿度、光照可控，稳定，重复性强；

（6）本发明提供的方法在组织培养过程中无需更换培养基配方，简化组织培养操作。

附图说明

图1示出实施例1中龙爪柳茎增殖过程中的图片。

附图标号说明

A-灭菌后接入培养基的外植体；

B-继代培养21天时抽出的新叶；

C-培养35天时后接种至新的培养基的未生根组培苗；

D-培养85天时的未生根组培苗。

具体实施方式

以下通过具体实施方式进一步解释或说明本发明内容，但实施例不应被理解为对本发明保护范围的限制。

本发明提供了一种龙爪柳茎的增殖方法，通过对培养基中激素的调节配比，从而诱导龙爪柳茎的增殖，具体地：

包括以下步骤：

（1）外植体的选取，包括以下子步骤：

（1-1）每年4～10月选取龙爪柳当年生嫩茎的形态学上端4～5节，每一节作为一个外植体，冰袋保存；

（1-2）将（1-1）中取得的外植体上叶片的形态学上端剪去，保留叶片的形态学下端0.5～1cm；

（2）外植体灭菌，包括以下子步骤：

（2-1）将（1）处理过的外植体以流动水冲洗；

（2-2）将（2-1）中处理后的外植体移至超净工作台中进行以下操作：

①以75%酒精对外植体进行表面灭菌30～60s，后用灭菌水冲洗酒精灭菌后的外植体；

②在不断摇动的条件下，以0.5～1%次氯酸钠溶液对①处理后的外植体进行灭菌；

③用灭菌水冲洗经②处理后的外植体；

（3）接种、培养，包括以下子步骤：

（3-1）将步骤（2）处理后的外植体的形态学下端插入培养基中，每个培养基中接种4个外植体，置于组织培养室中在以下培养条件下培养；

（3-2）继代培养：（3-1）中接种的外植体约2周后腋芽开始膨大，3～4周后腋芽抽出新叶，5～6周外植体长至3cm长后，继代至与（3-1）中所用培养基配比相同的培养基中进行继代培养，培养3个月左右，外植体长至10～15cm，得到继代龙爪柳茎；

（3-3）增殖培养：将（3-2）中继代培养得到的继代龙爪柳茎取出，按照其节数，将每节叶片的形态学上端剪去，保留叶片的形态学下端0.5～1cm，移至与（3-1）中所用培养基配比相同的培养基中进行增殖培养；

（4）重复步骤（2）～（3）；

其中，采用本发明所提供的增殖方法而增殖得到的龙爪柳茎也可作为步骤（1-1）中的外植体，用作龙爪柳茎的增殖基础。

植物组织培养即植物无菌培养技术，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官如根、茎、叶、茎尖、花、果实等组织或细胞以及原生质体，在无菌和适宜的人工培养基及光照、温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株的技术，其作为增殖基础的植物体离休器官既可从天然植物体上直接选取，也可以是由组织培养得到的植物离体器官。其中，组培苗是根据植物细胞具有全能性的理论，利用外植体，在无菌和适宜的人工条件下，培育的完整植株。组织培养技术培养条件人工可控，能够有效避免自然环境的不确定因素对植株生长的影响，不受时间环境等因素限制，可周年进行，繁殖率、成活率均高于自然繁育，并且组织培养技术的重复性好。

植物细胞组织培养的成败与两个因素密切相关，一是培养基的组分；二是外植体本身，即由活体植物上切取下来，用以进行离体培养的那部分组织或器官。为了使外植体适于在离体培养条件下生根，有必要对外植体进行选择与处理。

（一）在外植体来源方面：茎尖是较好的外植体，由于茎形态已基本建成，生长速度快，遗传性稳定，也是获得无病毒苗的重要途径，但茎尖往往受到材料来源的限制，因此通常也会选用茎段、叶片等作为培养材料，本发明通过对龙爪柳各部位的诱导及分化能力进行比较，从中筛选出一年生枝条上端4～5个节为合适的、最易再生的最佳外植体；

（二）在外植体大小方面：外植体大小对组织培养成功率有直接的影响，如果外植体过大，则易造成杀菌不彻底，导致污染培养基；如果外植体过小，则会导致在组织培养时难于成活；

（三）在取材季节方面：组织培养的外植体通常选择植物生长的最适时期取材，即在其生长开始的季节采样，若在生长末期或已经进入休眠期取样，则外植体会对诱导反应迟钝或无反应；

（四）在外植体的生理状态和发育年龄方面：越幼嫩，生理年限越短的外植体越具有较高的形态发生能力，组织培养越易成功。

在组织培养中使用的培养基中的营养元素受到浓度和体积的限制，为减少外植体的蒸腾作用和不必要的营养消耗，使培养基中有限的营养元素更为充分的用于促使腋芽发育，同时保证外植体进行必要的光合作用，因此需要将外植体上的叶片进行修剪，当保留叶片的形态学下端大于1cm时，外植体仍会有较强的蒸腾作用并消耗大量营养元素，而对外植体的增殖无明显贡献；当保留叶片的形态学下端小于0.5cm时，外植体的叶片过小，因而无法进行正常的光合作用进而导致外植体增殖困难。因此，本发明选择保留外植体叶片的形态学下端0.5～1cm。

通过以次氯酸钠溶液浓度梯度对外殖体的灭菌效果进行浓度筛选，同时通过以酒精浓度梯度对外殖体的灭菌效果进行浓度筛选，最终确定次氯酸钠溶液和酒精对外植体的最佳灭菌浓度分别为1%和75%。

综合上述各方面因素，本发明选择在每年4～10月取龙爪柳一年生枝条上端4～5个节，以便保证所取外植体在组培增殖过程中的成功率。

本发明中所用培养基包括：

优选的包括：

更优选的包括：

其中，所述g/L是基于每升培养基所述成分的重量。

MS培养基为目前在组织培养中使用最为广泛的一种基本培养基，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要,因而适用范围比较广。它较高的无机盐浓度，能有效保证组织生长所需的矿质营养的供应，同时，由于配方中的离子浓度高，在配制、贮存、消毒等过程中，即使有些成分略有出入，也不致影响离子间的平衡。

萘乙酸（NAA），是一类生长调节类激素，其主要作用是促进细胞分裂与扩大，促进生根，其作用效果与之使用浓度密切相关，本发明人以萘乙酸浓度对龙爪柳茎增殖效果进行浓度梯度实验，筛选出促进龙爪柳茎增殖的最佳萘乙酸浓度为0.01～1mg/L，更优选的为0.05～0.8mg/L，更为优选的为0.06～0.09mg/L。

玉米素是从玉米嫩籽中分离出的第一种存在于高等植物中的天然细胞分裂素，其与生长素配合使用时，能够促进愈伤组织发芽。由于当玉米素浓度达到0.05mg/L时，对龙爪柳茎的增殖起到明显的促进作用，随着玉米素浓度的增加，其促进作用显著增强，而当玉米素浓度达到2mg/L时，其促进作用达到顶峰，综合玉米素的成本及其作用效果，本发明选择玉米素的浓度为0.05～2mg/L，优选为0.1～1.8mg/L，更优选为1.1～1.6mg/L。

此外，由于萘乙酸与玉米素均属激素，高温蒸汽灭菌会导致其失活，因此通常采用过滤的方式对其进行除菌，本发明所选用的滤膜孔径为0.22μm。

蔗糖，为培养基中为植物细胞提供能量的碳源，选用它作为碳源主要有以下几个方面的原因：

（1）与葡萄糖相比，蔗糖能更好地调节培养基内的渗透压。配制相同质量分数的培养基，蔗糖形成的渗透压要明显低于葡萄糖，因此若采用葡萄糖作为碳源，易使植物细胞脱水而导致生长不良。同时，植物细胞吸收蔗糖的速率要明显慢于吸收葡萄糖的速率，所以蔗糖形成的渗透压可相对长期的保持稳定。

（2）植物组织培养过程中，需要时刻注意防止培养基受到微生物的污染，而微生物生长所需的碳源最常用的是葡萄糖，一般很少利用蔗糖，因此，采用蔗糖作为培养基的碳源，可以在一定程度上减少或防止微生物的污染。

蔗糖作为组培植物的碳源，当蔗糖浓度不为30g/L时，龙爪柳茎的增殖率低，因此本发明优选蔗糖浓度为30g/L。

琼脂是培养基中常用的固体剂，其最主要的作用是使液体培养基凝固，为外植生长提供固相生根环境。

结合龙爪柳的生长特性，选择组织培养的培养条件为：温度27℃，光照3000lx，14小时光周期。

本发明中所述培养基由以下步骤制得：

（1）调节MS培养基pH至5.8～6.0，加入琼脂粉，后于121℃下高温蒸汽灭菌20～30min，冷却至50～60℃待用；

（2）萘乙酸和玉米素灭菌待用；

（3）将（2）中灭菌后的萘乙酸和玉米素加入步骤（1）中制备的琼脂-MS中，凝固制备完成。

本发明提供的龙爪柳茎的增殖方法具有以下优点：

第一，本发明提供的龙爪柳茎的增殖方法不经过愈伤诱导即可实现龙爪柳茎的增殖，增殖速度快，操作简单，具有较大的科研价值；

第二，本发明提供的龙爪柳茎的增殖方法能够为龙爪柳转基因工程提供普通方法难以获得的无菌原生质体等物质基础；

第三，本发明提供的龙爪柳茎的增殖方法能够在人工可控的环境下获得龙爪柳的茎和叶，且与多年生的树木相比，其所产生的次生代谢物质少，从而简化提取RNA过程；

第四，本发明提供的龙爪茎的增殖方法，成功率在90%以上，年增殖率为1:1000（即，一个龙爪柳茎在一年内能够增殖1000倍），这为龙爪柳在园林景观、行道树绿化等方面的大规模种植奠定了基础；

第五，本发明提供的龙爪茎的增殖方法不受土壤、温度、湿度、光照等自然条件影响，所有操作都在组织培养室中进行，无菌，温度、湿度、光照可控，稳定，重复性强；

第六，本发明提供的龙爪茎的增殖方法在组织培养过程中无需更换培养基配方，简化组织培养操作。

实施例

实验部分：

MS培养基、萘乙酸和玉米素均购自Sigma公司。

以下每例实施例及对比例中，分别对10株龙爪柳茎进行增殖。

实施例1

1.培养基的制备

（1）将MS培养基用NaOH调节pH至5.8，加入琼脂粉6.5g，后于121℃下高温蒸汽灭菌20min，冷却至50℃待用；

（2）萘乙酸和玉米素用孔径为0.22μm的滤膜过滤灭菌，待用；

（3）将（2）中灭菌后的萘乙酸0.08mg、玉米素1.2mg加入步骤（1）中制备的琼脂-MS中，定容至1L，凝固制备完成。

2.龙爪柳茎增殖

（1）外植体的选取，包括以下子步骤：

（1-1）4月时选取龙爪柳当年生嫩茎或采用本发明提供的方法增殖得到的龙爪柳茎的形态学上端4节，每一节作为一个外植体，冰袋保存；

（1-2）将（1-1）中取得的外植体上的叶片的形态学上端剪去，使叶片的形态学下端保留0.5cm；

（2）外植体灭菌，包括以下子步骤：

（2-1）将（1）处理过的外植体以流动的自来水冲洗；

（2-2）将（2-1）中处理后的外植体移至超净工作台中进行以下操作：

①用75%酒精对外植体进行表面灭菌30s，用灭菌水冲洗酒精灭菌后的外植体；

②在不断摇动的条件下，用1%次氯酸钠溶液对外植体进行灭菌；

③用无菌的蒸馏水冲洗次氯酸钠灭菌后的外植体；

（3）接种、培养，包括以下子步骤：

（3-1）将步骤（2）处理后的外植体的形态学下端插入培养基中，每个培养基中接种4个外植体，置于组织培养室中在温度为27℃，光照3000lx，14小时光周期的培养条件下培养；

（3-2）继代培养：（3-1）中接种的外植体约2周后腋芽开始膨大，3周后腋芽抽出新叶，5周外植体长至3cm长后，继代至与（3-1）中所用培养基配比相同的培养基中进行继代培养，培养3个月左右，外植体长至10～15cm，得到继代龙爪柳茎；

（3-3）增殖培养：将（3-2）中继代培养得到的继代龙爪柳茎取出，按照其节数，将每节叶片的形态学上端剪去，保留叶片的形态学下端0.5～1cm，移至与（3-1）中所用培养基配比相同的培养基中进行增殖培养；

（4）重复步骤（2）～（3）。

3.龙爪柳茎增殖结果

如图1所示，作为外植体的龙爪柳茎在继代培养15天后腋芽开始膨大，21天后腋芽抽出新叶，35天长至3cm，85天后长至15cm，即为龙爪柳未生根组培苗；其年增殖率约为1:1000。

实施例2

1.培养基的制备和龙爪柳茎增殖过程与实施例1相同，区别仅在于制备培养基时加入萘乙酸和玉米素的重量：

萘乙酸0.05mg，玉米素1.0mg。

2.龙爪柳茎增殖结果

作为外植体的龙爪柳茎在继代培养17天后腋芽开始膨大，25天后腋芽抽出新叶，38天长至3cm，90天后长至15cm，即为龙爪柳未生根组培苗；其年增殖率约为1:1000。

实施例3

1.培养基的制备和龙爪柳茎增殖过程与实施例1相同，区别仅在于制备培养基是时加入萘乙酸和玉米素的重量：

萘乙酸0.6mg，玉米素1.7mg。

2.龙爪柳茎增殖结果

作为外植体的龙爪柳茎在继代培养18天后腋芽开始膨大，27天后腋芽抽出新叶，38天长至3cm，88天后长至15cm，即为龙爪柳未生根组培苗；其年增殖率约为1:1000。

实施例4

1.培养基的制备和龙爪柳茎增殖过程与实施例1相同，区别仅在于制备培养基是时加入萘乙酸和玉米素的重量：

萘乙酸0.9mg，玉米素0.06mg。

2.龙爪柳茎增殖结果

龙爪柳茎在继代培养22天后便开始增殖；年增殖率约为1:1000；且增殖培养出的龙爪柳茎生长迅速，27天后，其高度可达10cm，即为龙爪柳未生根组培苗，增殖周期为3个月。

作为外植体的龙爪柳茎在继代培养22天后腋芽开始膨大，30天后腋芽抽出新叶，40天长至3cm，90天后长至15cm，即为龙爪柳未生根组培苗；其年增殖率约为1:1000。

实施例5

1.培养基的制备和龙爪柳茎增殖过程与实施例1相同，区别仅在于制备培养基是时加入萘乙酸和玉米素的重量：

萘乙酸0.03mg，玉米素1.9mg。

2.龙爪柳茎增殖结果

作为外植体的龙爪柳茎在继代培养23天后腋芽开始膨大，27天后腋芽抽出新叶，40天长至3cm，93天后长至15cm，即为龙爪柳未生根组培苗；其年增殖率约为1:1000。

对比例

对比例1

1.培养基的制备和龙爪柳茎增殖过程与实施例1采用相同的组织培养方式，区别仅在于制备培养基时加入萘乙酸的重量为：2mg。

2.龙爪柳茎增殖养结果

作为外植体的龙爪柳茎在继代培养16天后腋芽开始膨大，22天后腋芽抽出新叶，35天长至3cm，90天后长至15cm，即为龙爪柳未生根组培苗；其年增殖率约为1:1000。

由对比例1可知，增加萘乙酸浓度，并未对龙爪柳茎的增殖起到明显的促进作用。

对比例2

1.培养基的制备和龙爪柳茎增殖过程与实施例1采用相同的组织培养方式，区别仅在于制备培养基时加入玉米素的重量为：3mg。

2.龙爪柳茎增殖结果

龙爪柳茎在继代培养16天后便开始增殖；年增殖率约为1:1000；且增殖培养出的龙爪柳茎生长迅速，22天后，其高度可达10cm，即为龙爪柳未生根组培苗，增殖周期为2个月。

作为外植体的龙爪柳茎在继代培养16天后腋芽开始膨大，25天后腋芽抽出新叶，35天长至3cm，90天后长至15cm，即为龙爪柳未生根组培苗；其年增殖率约为1:1000。

由对比例2可知，增加玉米素浓度，并未对龙爪柳茎的增殖起到明显的促进作用。

对比例3

1.培养基的制备和龙爪柳茎增殖过程与实施例1采用相同的组织培养方式，区别仅在于制备培养基时加入萘乙酸的重量为：0.005mg。

2.龙爪柳茎增殖结果

龙爪柳茎不增殖。

由对比例3可知，当萘乙酸浓度过低时，龙爪柳茎的不进行增殖。

对比例4

1.培养基的制备和龙爪柳茎增殖过程与实施例1采用相同的组织培养方式，区别仅在于制备培养基时加入玉米素的重量为：0.02mg。

2.龙爪柳茎增殖结果

作为外植体的龙爪柳茎在继代培养21天后腋芽开始膨大，35天后腋芽抽出新叶，45天长至3cm，95天后长至15cm，即为龙爪柳未生根组培苗；其年增殖率约为1:1000。

由对比例4可知，降低玉米素浓度，会明显降低龙爪柳茎的增殖速度。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种龙爪柳茎的增殖方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）外植体的选取，包括以下子步骤：

（1-1）每年4～10月选取龙爪柳当年生嫩茎的形态学上端4～5节，每一节作为一个外植体，冰袋保存；

（1-2）将（1-1）中取得的外植体上叶片的形态学上端剪去，保留叶片的形态学下端0.5～1cm；

（2）外植体灭菌，包括以下子步骤：

（2-1）将（1）处理过的外植体以流动水冲洗；

（2-2）将（2-1）中处理后的外植体移至超净工作台中进行以下操作：

①用75%酒精对外植体进行表面灭菌30～60s，后用灭菌水冲洗酒精灭菌后的外植体；

②在不断摇动的条件下，用0.5～1%次氯酸钠溶液对①处理后的外植体进行灭菌，6～8min；

③用灭菌水冲洗经②处理后的外植体；

（3）接种、培养，包括以下子步骤：

（3-1）将步骤（2）处理后的外植体的形态学下端插入培养基中，每个培养基中接种4个外植体，置于组织培养室中在以下培养条件下培养：温度27℃，光照3000lx，14小时光周期；

（3-2）继代培养：（3-1）中接种的外植体约2周后腋芽开始膨大，3～4周后腋芽抽出新叶，5～6周外植体长至3cm长后，继代至与（3-1）中所用培养基配比相同的培养基中进行继代培养，培养3个月左右，外植体长至10～15cm，得到继代龙爪柳茎；

（3-3）增殖培养：将（3-2）中继代培养得到的继代龙爪柳茎取出，按照其节数，将每节叶片的形态学上端剪去，保留叶片的形态学下端0.5～1cm，移至与（3-1）中所用培养基配比相同的培养基中进行增殖培养；

（4）重复步骤（2）～（3）；

其中，

所述培养基包括：

其中，所述g/L是基于每升培养基所述成分的重量。

2.根据权利要求1所述的一种龙爪柳茎的增殖方法，其特征在于，所述培养基包括：

其中，所述g/L是基于每升培养基所述成分的重量。

3.根据权利要求1所述的一种龙爪柳茎的增殖方法，其特征在于，所述培养基包括：

其中，所述g/L是基于每升培养基所述成分的重量。

4.根据权利要求1所述的一种龙爪柳茎的增殖方法，其特征在于，所述培养基由以下步骤制得：

（1）调节MS培养基pH至5.8～6.0，加入琼脂粉，后于121℃下高温蒸汽灭菌20～30min，冷却至50～60℃待用；

（2）萘乙酸和玉米素灭菌待用；

（3）将（2）中灭菌后的萘乙酸和玉米素加入步骤（1）中制备的琼脂-MS中，凝固制备完成。

5.根据权利要求1所述的一种龙爪柳茎的增殖方法，其特征在于，所述灭菌方式为通过滤膜过滤灭菌，其中，滤膜孔径为0.22μm。

6.一种用于龙爪柳茎增殖的培养基，其特征在于，包括：

其中，所述g/L是基于每升培养基所述成分的重量。

7.根据权利要求6所述的用于龙爪柳茎增殖的培养基，其特征在于，包括：

其中，所述g/L是基于每升培养基所述成分的重量。

8.根据权利要求6所述的用于龙爪柳茎增殖的培养基，其特征在于，包括：

其中，所述g/L是基于每升培养基所述成分的重量。

9.根据权利要求6所述的用于龙爪柳茎增殖的培养基，其特征在于，通过以下步骤制备得到：

（1）调节MS培养基pH至5.8～6.0，加入琼脂粉，后于121℃下高温蒸汽灭菌20～30min，冷却至50～60℃待用；

（2）萘乙酸和玉米素灭菌待用；

（3）将（2）中灭菌后的萘乙酸和玉米素加入步骤（1）中制备的琼脂-MS中，凝固制备完成。

10.根据权利要求6所述的用于龙爪柳茎增殖的培养基，其特征在于，所述灭菌方式为通过滤膜过滤灭菌，其中，滤膜孔径为0.22μm。

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