CN102559702A - 耐盐基因CcSOS1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程和转基因育种领域，公开了耐盐基因CcSOS1及其应用。耐盐基因CcSOS1，其核苷酸序列为SEQ ID No.1。所述的耐盐基因CcSOS1在提高菊花抗盐性方面的应用。一种提高菊花抗盐性的方法，该方法包括如下步骤：(1)构建CcSOS1基因的植物表达载体；(2)采用农杆菌介导法将含CcSOS1基因的植物表达载体转入到切花菊中，进行培养初步获得抗性植株。本发明从盐生植物大岛野路菊首次克隆了一个新的耐盐基因CcSOS1，通过将该基因整合到菊花基因组中，通过高盐试验分析获得耐高盐的转基因菊花株系。利用本方法可以显著提高菊花的耐盐性。

Description

耐盐基因CcSOS1及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程和转基因育种领域，涉及耐盐基因CcSOS1及其应用。

背景技术

菊花(Chrysanthemum grandiflorum)，菊科多年生草本植物，其中切花菊是世界四大切花之一，菊花原产于我国，因为大自然赋予它丰富的花色、多变的花型以及易于栽培等特点，使其深受广大人民的喜爱。近年来切花菊在切花消费中占有很大的比重，其栽培面积已位居我国切花生产的首位。随着全球土壤盐渍化的不断加重，菊花的生产面临着严重的挑战，传统的物理和化学方法改造土壤不仅耗资巨大，而且随着大量化学物质的加入加重了土壤的次生盐渍化。由于植物耐盐性状本身的复杂性，采用传统的育种方法已经很难获得耐盐优良品种。生物技术不断的发展，导入外源基因提高植物抗盐性已成为现代植物育种的主要手段。

SOS1基因是质膜型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因，除了负责将过多的Na⁺排出细胞之外，还控制Na⁺从根到茎的长距离运输，并且有数据显示转拟南芥AtSOS1基因可显著提高转基因植株的耐盐性(任仲海，等2002；周晓馥，等2002；Shi，等2000)。鉴于质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白在植物耐盐方面的作用，目前许多编码该蛋白的基因已经被克隆，既有从非盐生植物中克隆出来的，如芦苇PhaNHA1(Takahashi等，2006)、水稻OsSOS1(Martínez-Atienza等，2007)、星星草PtSOS1(程玉祥，2008)，也有从耐盐的植物中克隆得到的，如胡杨PeSOS1(Wu等，2007)、小盐芥ThSOS1(Oh等，2007)等。

在植物的遗传转化途径中，农杆菌介导法是应用最为广泛的方法之一，其中有效的植物表达载体至关重要。将耐盐基因CcSOS1构建植物表达载体，用于农杆菌介导的植物遗传转化，可获得具有耐盐特性的新种质。对于优良作物新品种的培育及在生产中的广泛应用，具有重要意义。

参考文献：

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发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种新的耐盐基因CcSOS1。

本发明的另一目的是提供该基因的应用。

本发明的又一目的是提供一种通过转CcSOS1基因提高菊花抗盐性的方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

耐盐基因CcSOS1，其核苷酸序列为SEQ ID No.1。

所述的耐盐基因CcSOS1编码的蛋白质。

含有所述的耐盐基因CcSOS1的植物表达载体。

所述的耐盐基因CcSOS1在提高菊花抗盐性方面的应用。

所述的含耐盐基因CcSOS1的植物表达载体在提高菊花抗盐性方面的应用。

一种提高菊花抗盐性的方法，该方法包括如下步骤：

(1)构建CcSOS1基因的植物表达载体：将所述的CcSOS1基因插入表达载体得到含耐盐基因CcSOS1植物表达载体；

(2)采用农杆菌介导法将含CcSOS1基因的植物表达载体转入到切花菊中，进行培养初步获得抗性植株。

步骤(1)的具体方法优选：以盐生植物大岛野路菊为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板，设计引物进行PCR反应，在CcSOS1基因的上下游分别引入SalI和KpnI酶切位点，上游引物为：CcSOS1-Sal-F：SEQ ID NO.2，下游引物为CcSOS1-Kpn-R：SEQ IDNO.3，将扩增出来的含有CcSOS1完整开放阅读框的PCR产物片段与T载体连接后转化大肠杆菌DH5α感受态，提取阳性质粒，由SalI和KpnI双酶切得到的CcSOS1基因片段，与SalI和KpnI双酶切的线性化的表达载体pCAMBIA1301连接，转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒，酶切电泳检测并测序验证，植物表达载体pCAMBIA1301-CcSOS1构建成功。

步骤(2)的具体方法优选：制备感受态的农杆菌，将步骤(1)中构建的含有CcSOS1基因的植物表达载体pCAMBIA1301-CcSOS1转入感受态的农杆菌菌株中；取组培瓶中菊花苗顶端叶盘作为转化受体，在预培养培养基上预培养2～3d，然后进行农杆菌侵染8min，含有CcSOS1基因表达载体的农杆菌菌液OD值为0.5～0.6，侵染后用滤纸吸干叶盘外表的菌液，然后将叶盘放到共生培养基上黑暗培养3d，最后转入筛选培养基上继代培养3～4代，等分化出的抗性芽长至2～3厘米时，将抗性芽转入到生根培养基上培养，初步获得抗性植株；其中所述的预培养培养基：MS+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.5mg/L；共培养培养基：MS+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.5mg/L；所述的筛选培养基：MS+潮霉素10mg/L+羧苄青霉素500mg/L+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.5mg/L；MS+潮霉素8mg/L+羧苄青霉素350mg/L+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.3mg/L；MS+潮霉素8mg/L+羧苄青霉素300mg/L+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.1mg/L；所述的生根培养基：1/2MS+潮霉素8mg/L+萘乙酸0.1mg/L。

所述的提高菊花抗盐性的方法，还包括步骤(3)将转CcSOS1基因初步获得的抗性植株进行PCR检测和荧光定量PCR检测，筛选阳性植株，获得转基因菊花株系；

其中，所述的PCR检测方法为：

取生根筛选得到的抗性植株嫩叶及野生型植株嫩叶，采用CTAB法提取基因组DNA，将hptll基因作为检测目标，根据hptll基因序列合成扩增引物，扩增片段长为980bp，引物序列为：HII-1：SEQ ID NO.4，HII-2：SEQ ID NO.5；分别以潮霉素抗性植株、野生型植株DNA和阳性质粒为模板，以HII-1和HII-2为引物，进行PCR检测，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析；

所述的荧光定量PCR检测方法为：

每个样品重复3次，建立扩增体系，根据数据分析得到各个样品的CT值，以未转化植株的表达为基准值，计算各转基因植株及野生型基因相对表达情况；特异引物片段长为295bp，引物序列为：SOS-JC-F1：SEQ ID NO.6，SOS-JC-R1：SEQ ID NO.7；以扩增的GAPDH基因片段为内标，扩增片段长度为260bp，引物序列为：GAPDH-F：SEQ ID NO.8，GAPDH-R：SEQID NO.9，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析。

所述的农杆菌菌株为EHA105。

有益效果：

本发明从盐生植物大岛野路菊首次克隆了一个新的耐盐基因CcSOS1，通过将CcSOS1基因整合到菊花基因组中，通过高盐试验分析获得耐高盐的转基因菊花株系。结果发现，与野生型株系相比，转CcSOS1的植株耐盐能力得到很大提高，而野生型植株抗性很弱。利用本方法可以显著提高菊花的耐盐性，为利用基因工程技术选育菊花抗盐性品种提供了新颖的方法，将有效推动菊花生物技术育种进程。。

附图说明

图1：植物重组表达质粒pCAMBIA1301-CcSOS1片段图谱

图2：植物表达载体构建酶切验证图

图3：转基因切花菊的转化和再生过程

A，转化叶盘分化出愈伤组织；B，转化叶盘分化出抗性芽；C，生根筛选；D，抗性植株

图4：转CcSOS1基因植株的PCR检测结果

M：Marker；CK+：阳性质粒；CK-：野生型植株；1-14：转基因植株

图5：荧光定量PCR检测CcSOS1基因在转基因和野生型植株的表达

WT：野生型植株；S1-S12：转CcSOS1基因株系

图6：转基因植株和野生型植株盐胁迫处理后恢复生长存活率分析

a：转基因植株与野生型植株盐胁迫处理后恢复生长；b：转基因株系与野生型植株盐处理后恢复生长存活率统计

图7：转基因植株与野生型植株盐水培胁迫处理后生长状态变化

图8：转基因植株与野生型植株盐水培处理后生理指标的检测

a：盐胁迫下单株受害叶面积比率；b：盐胁迫下叶片相对电导率变化；c：盐胁迫下叶绿素(a+b)含量；d：盐胁迫下脯氨酸含量变化；e：盐胁迫下SOD活性变化；f：盐胁迫下POD活性变化

图9：转基因植株与野生型植株盐水培处理后植物体内Na⁺含量的变化

图10：转基因植株与野生型植株盐水处理后植物体内K⁺含量的变化

具体实施方式

下面对发明的具体实施例进行详细的说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件。

实施例1

1、植物表达载体pCAMBIA 1301-CcSOS1的构建

以盐生植物大岛野路菊为材料，提取总RNA，按照M-MLV反转录试剂盒(TaKaRa)取1μg总RNA反转录成cDNA，用RNase消化cDNA产物，以cDNA为模板，设计引物进行PCR反应，在CcSOS1基因的上下游分别引入SalI和KpnI酶切位点，上游引物为：CcSOS1-Sal-F：GGGTCGAC ATG GGA TCG GTG GCA AAC AAC GT(SEQ ID NO.2)，下游引物为CcSOS1-Kpn-R：GGGGTACC TTA GGG AGC TCG GGG GA(SEQ IDNO.3)。50μL反应体系：10×PCR Buffer 5.0μL，CcSOS1-Sal-F、CcSOS1-Kpn-R引物各1.0μL(20μmol·L-1)，dNTP mix 4.0μL(2.5mmol·L-1)，PrimeSTARTM HS DNA Polymerase0.2μL，cDNA模板1μL，ddH₂O 37.8μL；反应程序：95℃预变性4min，然后94℃解链30sec，55℃退火30sec，72℃延伸4min，反应35个循环，72℃延伸10min；PCR产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收纯化，用T4DNA连接酶(TaKaRa)连接到T-载体(TaKaRa)，转化TOP10感受态细胞，进行序列测定，测定序列为SEQ ID NO.1。

提取含有目的片段的T-载体及表达载体pCAMBIA1301质粒DNA并双酶切，酶切体系为：10×Buffer T7.5μL，BSA5μL，SalI 2.0μL，KpnI 2.0μL，质粒DNA 10μL，ddH₂O补齐至50μL，37℃过夜充分酶切。将含有CcSOS1完整开放阅读框的片段和pCAMBIA1301线性化质粒片段分别回收，并将两个片段连接。连接反应体系为：T4 Buffer 2.0μL，T4连接酶1.0μL，载体回收液1.0μL，目的基因回收液4.0μL，dd H₂O补齐至20μL，4℃过夜连接。将连接好的重组质粒pCAMBIA 1301-CcSOS1转化TOP10细胞，提取阳性质粒，酶切电泳检测并测序验证(图1和图2)。

2、农杆菌EHA105介导叶盘法转化菊花

制备感受态的农杆菌，将CcSOS1基因的植物表达载pCAMBIA1301-CcSOS1转入感受态的农杆菌菌株中，详细过程：

从YEB(50μg/mL利福平)平板上挑取EHA105单菌落，接种于50mL含50μg/mL利福平的YEB液体培养基中，200rpm，28℃培养至OD值0.5，然后菌液冰浴30min，将菌液转移到干净的离心管中，4000rpm离心，收集菌体，将菌体悬浮于2mL预冷的100mMCaCl₂(20％甘油)溶液中，200μL/管分装，待用。取5μL pCAMBIA 1301-CcSOS1载体质粒，加入200μL EHA105感受态细胞，搅拌混匀，冰浴30min，液氮冷冻5min，37℃ 5min，加入800μL YEB液体培养基，28℃200rpm预培养4h，菌液涂板于YEB(50μg/mL利福平+50μg/mL卡那霉素)固体培养基上，28℃暗培养2天，挑取单克隆检测，选取阳性克隆摇菌，用于转化菊花。

用YEB(50μg/mL利福平+50μg/mL卡那霉素)液体培养基培养包含CcSOS1基因的植物表达载体的农杆菌EHA105；以切花菊‘神马’叶片为外植体，采用根癌农杆菌介导法将大岛野路菊中克隆得到的CcSOS1基因导入‘神马’：取组培瓶中‘神马’苗顶端叶盘(0.5cm×0.5cm)作为转化受体，在预培养培养基中预培养3d，然后浸入备好的农杆菌菌液(OD为0.5～0.6)中感染8min，用滤纸吸干叶盘表面的菌液后再接种到共培养基上黑暗中培养3d，然后转入筛选培养基上继代培养3～4代，两周继代一次，逐渐降低筛选压，等分化出的抗性芽长至2～3cm时，将抗性芽转入生根培养基上进行筛选，初步获得抗性植株(图3)。

菊花组织培养基以MS培养基为基础，pH5.8，100Kpa、121℃灭菌25分钟。

预培养培养基：MS+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.5mg/L。

共培养培养基：MS+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.5mg/L。

筛选培养基依次分别为：MS+潮霉素10mg/L+羧苄青霉素500mg/L+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.5mg/L；MS+潮霉素8mg/L+羧苄青霉素350mg/L+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.3mg/L；MS+潮霉素8mg/L+羧苄青霉素300mg/L+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.1mg/L。

生根培养基：1/2MS+潮霉素8mg/L+萘乙酸0.1mg/L。

3、转CcSOS1基因抗性植株的分子检测(PCR及荧光定量PCR)

(1)PCR检测

取生根筛选得到的潮霉素抗性植株嫩叶及野生型植株嫩叶，采取CTAB法提取基因组DNA。将hptll基因作为检测目标，根据hptll基因序列合成扩增引物，扩增片段长为980bp，引物序列为：HII-1：CGTCTGTCGAGAAGTTTC(SEQ ID NO.4)，HII-2：TACTTCTACACAGCCATC(SEQ ID NO.5)；分别以潮霉素抗性植株、野生型植株DNA和阳性质粒为模板，以HII-1和HII-2为引物，进行PCR检测。扩增体系为：2.5μL 10×PCR Buffer，1.5μL 2.5mmol·L^-1 MgCl₂，2μLdNTP，HII-1和HII-2各1μL，1μL DNA模板，0.2μL 5U·μL^-1Taq酶，去离子水补足25μL。扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，58℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析(如图4)。图中可以看到，转CcSOS1基因的植株中有9个株系扩增出与阳性对照相同的特异性条带，野生型植株中没有扩增出条带。

(2)荧光定量RT-PCR检测

采用TaKaRa公司生产的RNAiso Reagent试剂盒，提取抗潮霉素植株叶片及未转化株叶片总RNA，反转录成第一链cDNA，用荧光定量qRT-PCR对CcSOS1基因的表达量进行检测。按照荧光定量试剂盒(

Green Realtime PCR Master Mix-Plus-(QPK-212))说明书建立25μL扩增体系；扩增条件为：95℃预变性-1min；95℃变性-15s，60℃退火-15s，72℃延伸-45s，40个循环。每个样品重复3次，试验数据由Roter Gene 6.0和Excel软件分析，采用ΔΔCt法进行基因相对表达分析，以野生型植株的表达为基准值，计算各转基因植株及野生型基因相对表达情况。特异引物片段长为295bp，引物序列为：SOS-JC-F1：CATACCAAGTCTAGGCAGCATC(SEQ ID NO.6)，SOS-JC-R1：

GACTTTCACTTGCTATTTCTCCC(SEQ ID NO.7)以扩增的GAPDH基因片段为内标，扩增片段长度为260bp，引物序列为：GAPDH-F：CTGCTTCTTTCAACATCATTCC(SEQ ID NO.8)，GAPDH-R：CTGCTCATAGGTAGCCTTCTTC(SEQ ID NO.9)。根据荧光定量PCR检测结果(图5)，转基因株系中CcSOS1基因的表达量显著高于野生型植株，其中株系S11、S12表达量相对最高。证实CcSOS1基因已经转入到切花菊基因组DNA中并表达。

4、转基因植株后代的抗性分析

(1)转基因株系及野生型植株盐胁迫处理后恢复生长存活率分析

为检测转基因植株的耐盐性，对转基因株系S11、S12进行了盐胁迫处理。将生长一致的转基因植株及未转基因植株各9株种植于塑料杯中，各株系重复3次，栽培基质为按1∶1比例混合的营养土∶蛭石混合物，种植于温室(23±2℃，12h光周期)中，待转基因及未转化植株展叶8～10片叶时控水处理7d，然后浇灌200mmol/L的NaCl溶液7d，然后将植株根系用去离子水冲洗3遍，并种植于新营养钵中浇足水恢复生长一周，统计植株存活率，存活率采用极限恢复法(张常青等，2005)。

由图6可以看出，盐胁迫处理后，转基因株系S11、S12的大部分植株顶端仍然保持绿色，只有基部叶片皱缩、萎蔫下垂，恢复生长后，存活率为80％～90％；野生型植株只有少部分植株顶端保持绿色，叶片大部分皱缩、萎蔫下垂，恢复生长后，存活率仅为50％。

(2)转基因株系及野生型植株盐胁迫后各项生理指标的检测

采集转基因株系和野生型植株生长一致的扦插苗，当叶片长至8～10片叶时，用200mmol/LNaCl进行水培处理，放置于23±2℃，12h光周期环境中，然后分别在0d、2d、4d、6d、8d进行取样(植物叶片)，测量盐胁迫下单株受害叶面积比率、叶片相对电导率、叶片叶绿素(a+b)含量、脯氨酸含量以及SOD和POD活性变化。

单株受害叶面积比率采用管志勇等的方法(2010)，叶片相对电导率、叶绿素含量的测定采用李合生等的方法(2000)，游离脯氨酸含量采用磺基水杨酸方法测定(李合生等，2000)，可溶性蛋白采用考马斯亮蓝G-250染色法，SOD采用氮蓝四唑(NBT)法，POD活性采用愈创木酚法。数据分析采用SPSS(SPSSRelease10.0.1)软件；作图用EXCEL系统。

由图7可以看出，对转基因株系S11、S12以及野生型植株进行盐胁迫处理。随着盐处理时间的延长，与WT植株相比，S11、S12转基因株系萎蔫进程较慢，WT植株只有少部分植株顶端保持绿色，叶片大部分皱缩、萎蔫下垂，而转基因株系大部分仍保持绿色。

由图8中a可以看出，盐胁迫下，S11、S12转基因株系的单株受害叶面积比率明显低于野生型植株，盐处理第4d时，野生型植株的受害叶面积比率已经达到了50％，是转基因植株的2.5倍。当盐处理到第8d时，野生型植株受害叶面积比率已经接近于100％。

由图8中b可以看出，盐处理下转基因植株与野生型植株相对电导率表现出显著性差异，尤其在盐处理第8d时，对照比转基因株系高1.5倍。表明S11、S12转基因株系的耐盐性明显高于野生型植株。

由图8中c可以看出，所有植株的叶绿素含量都随着盐处理时间的延长而逐步下降，但是野生型植株叶绿素含量的下降幅度显著大于S11、S12转基因株系，当盐处理进行第8天时，转基因植株的叶绿素含量是对照的3倍，差异显著。

由图8中d可以看出，S11、S12转基因株系及野生型植株中脯氨酸含量水平随时间呈缓慢升高状态，盐处理的前4天中，野生型植株中的脯氨酸含量水平略高于S11、S12植株。4d后，S11、S12植株中脯氨酸含量继续升高，而野生型植株的脯氨酸含量上升趋于缓慢，总体上含量低于转基因株系。

由图8中e可以看出，转基因株系及野生型植株中SOD活性水平均呈现缓慢升高状态，但S11、S12转基因株系的SOD活性水平变化幅度较大，明显高于野生型植株。

由图8中f可以看出，转基因株系及野生型植株中POD活性变化趋势稍有不同，野生型植株中POD活性呈缓慢升高的状态，而S11、S12转基因株系在处理第二天时，POD活性水平迅速升高，第4d时达到最低水平，随后继续呈现较快的升高状态，POD活性水平明显高于野生型植株，转基因株系及野生型植株盐胁迫后离子含量检测。

(3)转基因株系及野生型植株盐胁迫后离子含量检测

采集转基因植株和野生型植株生长一致的扦插苗，用200mmol/LNaCl进行水培处理，分别在0d、2d、4d、6d、8d对植株4个部位进行取样，取样部位分别为：上位叶、中位叶、茎和根，然后检测不同时间点植株各部分Na⁺、K⁺含量变化。Na⁺、K⁺的提取参照王宝山和赵可夫(1995)的方法略加改动，Na⁺、K⁺含量用Optimal 2100DV电感耦合等离子体发射光谱仪(Perkin Elmer)进行测定。

由图9、10可以看出，盐胁迫下转基因植株和野生型植株体内的Na⁺主要分布在中位叶中，其次是上位叶、茎和根中，而且随着盐处理时间的延续，不同部位的Na⁺含量呈逐步上升的趋势，但是，相比较野生型植株，转基因植株各个部位的Na⁺含量均明显低于野生型植株。盐胁迫下，K⁺在植物体的分布主要集中在根、茎，然后是中位叶和上位叶，与Na⁺的分布正好相反，而且随着盐处理时间的延续，K⁺在不同部位的变化趋势与Na⁺的变化趋势也不同，随着时间的变化，K⁺在转基因植株及野生型植株的上位叶上呈现逐步下降趋势，而在中位叶、茎和根中，K⁺都表现出先升高再降低的趋势，但总体上，转基因植株不同部位的K⁺含量明显高于野生型植株。

Claims (10)

1.耐盐基因CcSOS1，其特征在于核苷酸序列为SEQ ID No.1。

2.权利要求1所述的耐盐基因CcSOS1编码的蛋白质。

3.含有权利要求1所述的耐盐基因CcSOS1的植物表达载体。

4.权利要求1所述的耐盐基因CcSOS1在提高菊花抗盐性方面的应用。

5.权利要求3所述的含耐盐基因CcSOS1的植物表达载体在提高菊花抗盐性方面的应用。

6.一种提高菊花抗盐性的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

(1)构建CcSOS1基因的植物表达载体：将所述的CcSOS1基因插入表达载体得到含耐盐基因CcSOS1植物表达载体；

(2)采用农杆菌介导法将含CcSOS1基因的植物表达载体转入到切花菊中，进行培养初步获得抗性植株。

7.根据权利要求6所述的提高菊花抗盐性的方法，其特征在于步骤(1)的具体方法为：以盐生植物大岛野路菊为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板，设计引物进行PCR反应，在CcSOS1基因的上下游分别引入SalI和KpnI酶切位点，上游引物为：CcSOS1-Sal-F：SEQ ID NO.2，下游引物为CcSOS1-Kpn-R：SEQ ID NO.3，将扩增出来的含有CcSOS1完整开放阅读框的PCR产物片段与T载体连接后转化大肠杆菌DH5α感受态，提取阳性质粒，由SalI和KpnI双酶切得到的CcSOS1基因片段，与SalI和KpnI双酶切的线性化的表达载体pCAMBIA1301连接，转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒，酶切电泳检测并测序验证，植物表达载体pCAMBIA1301-CcSOS1构建成功。

8.根据权利要求7所述的提高菊花抗盐性的方法，其特征在于步骤(2)的具体方法为：制备感受态的农杆菌，将步骤(1)中构建的含有CcSOS1基因的植物表达载体pCAMBIA1301-CcSOS1转入感受态的农杆菌菌株中；取组培瓶中菊花苗顶端叶盘作为转化受体，在预培养培养基上预培养2～3d，然后进行农杆菌侵染8min，含有CcSOS1基因表达载体的农杆菌菌液OD值为0.5～0.6，侵染后用滤纸吸干叶盘外表的菌液，然后将叶盘放到共生培养基上黑暗培养3d，最后转入筛选培养基上继代培养3～4代，两周继代一次，继代过程中逐渐降低筛选压，等分化出的抗性芽长至2～3厘米时，将抗性芽转入到生根培养基上培养，初步获得抗性植株；其中所述的预培养培养基：MS+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.5mg/L；共培养培养基：MS+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.5mg/L；所述的筛选培养基依次为：MS+潮霉素10mg/L+羧苄青霉素500mg/L+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.5mg/L；MS+潮霉素8mg/L+羧苄青霉素350mg/L+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.3mg/L；MS+潮霉素8mg/L+羧苄青霉素300mg/L+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.1mg/L；所述的生根培养基：1/2MS+潮霉素8mg/L+萘乙酸0.1mg/L。

9.根据权利要求6～8中任一项所述的提高菊花抗盐性的方法，其特征在于还包括步骤(3)将转CcSOS1基因初步获得的抗性植株进行PCR检测和荧光定量PCR检测，筛选阳性植株，获得转基因菊花株系；

其中，所述的PCR检测方法为：

取生根筛选得到的抗性植株嫩叶及野生型植株嫩叶，采用CTAB法提取基因组DNA，将hptll基因作为检测目标，根据hptll基因序列合成扩增引物，扩增片段长为980bp，引物序列为：HII-1：SEQ ID NO.4，HII-2：SEQ ID NO.5；分别以潮霉素抗性植株、野生型植株DNA和阳性质粒为模板，以HII-1和HII-2为引物，进行PCR检测，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析；

所述的荧光定量PCR检测方法为：

每个样品重复3次，建立扩增体系，根据数据分析得到各个样品的C_T值，以未转化植株的表达为基准值，计算各转基因植株及野生型基因相对表达情况；特异引物片段长为295bp，引物序列为：SOS-JC-F1：SEQ ID NO.6，SOS-JC-R1：SEQ ID NO.7；以扩增的GAPDH基因片段为内标，扩增片段长度为260bp，引物序列为：GAPDH-F：SEQ ID NO.8，GAPDH-R：SEQID NO.9，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析。

10.根据权利要求6～8中任一项所述的提高菊花抗盐性的方法，其特征在于所用的农杆菌菌株为EHA105。

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