CN110184323A - 一种香蕉水通道蛋白基因启动子转录因子的鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种香蕉水通道蛋白基因启动子转录因子的鉴定方法，包括以下步骤，S1，MaPIP1；1启动子的克隆及元件分析，根据现有基因组设计启动子的引物进行扩增，扩增长度至1362bp，通过plant care和PLACE分析其顺式作用元件，结果显示1362bp的启动子序列中会有72个顺式作用元件。本发明通过酵母单杂交的方法识别了MaPIP1；1启动子的核心区域，将启动子核心区域M‑P2作为诱饵区段构建诱饵载体，阐明MaPIP1；1基因在抵御干旱胁迫时的作用机制，首次在植物中直接鉴定出在干旱胁迫条件下，与MaPIP1；1启动子直接结合的转录因子。
Description
技术领域
本发明涉及香蕉耐受性技术领域，尤其涉及一种香蕉水通道蛋白基因启动子转录因子的鉴定方法。
背景技术
香蕉是热带地区的重要经济作物之一，被联合国粮农组织(FAO) 定位为发展中国家仅次于水稻、小麦、玉米之后的第四大粮食作物。香蕉是世界水果贸易量及消费量最大宗的鲜果，香蕉是受干旱胁迫影响最重的水果之一，干旱胁迫严重制约着香蕉的生产，是香蕉产业中急需解决的关键问题。水通道蛋白是一类位于各种细胞膜上24-34Kd 的小分子跨膜蛋白，能够调节水分以及其他小分子物质的运输，在植物生长发育和适应逆境胁迫过程中起着重要的作用。
AQP在植物中参与植物生长发育过程，如种子萌发、果实成熟、细胞伸长等，植物能够通过调节AQP的活性响应多种非生物逆境的胁迫。在植物中过量表达一些AQP家族基因能够提高转基因植物对干旱胁迫的耐受性。转录因子与顺式作用元件互作，诱导特定基因表达是植物响应干旱胁迫的重要方式。
目前在植物中揭示MaPIP1；1介导香蕉对干旱胁迫应答的分子调控机制方面，并未发现有转录因子调控AQP基因表达的相关方法。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种香蕉水通道蛋白基因启动子转录因子的鉴定方法。
本发明提出的一种香蕉水通道蛋白基因启动子转录因子的鉴定方法，包括以下步骤：
S1：MaPIP1；1启动子的克隆及元件分析：根据现有基因组设计启动子的引物进行扩增，扩增长度至1362bp，通过plant care和 PLACE分析其顺式作用元件，结果显示1362bp的启动子序列中会有 72个顺式作用元件；
S2：MaPIP1；1启动子5′端缺失片段表达成转基因拟南芥：鉴定 MaPIP1；1启动子响应干旱胁迫的核心区域，根据启动子序列作用元件，通过5′端缺失技术，将MaPIP1；1启动子分段，经酶切、测序，与MaPIP1；1基因启动子各缺失片段大小相一致，将它们分别替换pCAMBIA-1304载体上的35S启动子并转化拟南芥；
S3：5′端缺失片段转基因拟南芥在干旱胁迫下的表达：进一步研究MaPIP1；1在响应干旱胁迫的调控机制，以转化CaMV35S启动子的转基因拟南芥作为对照，对100mM、200mM、300mM的18％PEG6000处理的15天转基因拟南芥小苗的叶片和根系分别进行启动子GUS活性的检测；
S4：酵母单杂交筛选与MaPIP1；1启动子互作的转录因子：进一步分析MaPIP1；1响应干旱胁迫的分子机制，采用酵母单杂交的方法进行验证，将启动子核心区域M-P2作为诱饵区段构建诱饵载体，筛选酵母干旱处理的香蕉c-DNA单杂交文库，确定与核心区域序列相互作用的蛋白；
S5：荧光定量PCR检测干旱胁迫处理下的结合蛋白：选取五叶一心的香蕉苗进行干旱处理，以其为模版，对筛选出来的多个结合蛋白在干旱胁迫条件下进行荧光定量PCR检测；
S6：双荧光素酶体外互作检测：进一步证明，结合基因在香蕉叶片和根系中的表达模式，挑选了其中一个转录因子进行进一步研究，研究内容为转录因子与MaPIP1；1的启动子区域结合，进行体外互作验证，进行了双荧光素酶的测定。
优选地，所述S1中顺式作用元件包括有许多TATA框和CAAT框核心元件，核心元件包括ABA响应元件、ABRE、MYB元件、MYC元件、 ERE元件、MeJA响应元件、BOXII、G框、GT1-motif、I框等光响应元件和分生组织响应元件等。
优选地，所述S2中的MaPIP1；1启动子分段为M-P1、M-P2、M-P3 和M-P4四片段，且四片段的克隆长度分别为1362bp、1274bp、813bp 和223bp。
优选地，所述S4中的酵母单杂交筛选中，其中筛选是在添加 25mM、50mM的SD—TLH平板上，MaMaPIP1；1转化子生长都明显受到不同程度的抑制，生长比例比阴性对照的生长比例更少，显示未激活 HIS3报告基因，在50mM 3AT的基础上建立酵母单杂交筛库。
优选地，所述酵母单杂交筛库中的菌落在添加3AT的筛选平板上进行进一步回转验证，结果显示有29个菌落能不同程度地激活HIS3 报告基因，将这29个阳性菌落进行DNA测序和blast比对分析，得到23个不同的与MaPIP1；1互作的蛋白，进一步对这23个不同的蛋白进一步进行回转验证，结果显示23种阳性克隆全部能通过HIS3报告基因。
优选地，所述S6中的转录因子选取为MADS3，且MADS3受到干旱胁迫的诱导表达证明部分转录因子可协同MaPIP1；1基因响应干旱胁迫。
本发明中的有益效果为：
1、本香蕉水通道蛋白基因启动子转录因子的鉴定过程中通过酵母单杂交的方法识别了MaPIP1；1启动子的核心区域，将启动子核心区域M-P2作为诱饵区段构建诱饵载体，阐明MaPIP1；1基因在抵御干旱胁迫时的作用机制，首次在植物中直接鉴定出在干旱胁迫条件下，与MaPIP1；1启动子直接结合的转录因子；
2、本香蕉水通道蛋白基因启动子转录因子的鉴定过程在鉴定过程中，通过荧光定量PCR检测干旱胁迫处理下的结合蛋白，再选取其中某片段的转录因子进行体外互作验证，进行双荧光素酶测定，说明在香蕉中转录因子能够正向调控MaPIP1；1的转录流程。
附图说明
图1为本发明提出的一种香蕉水通道蛋白基因启动子转录因子的鉴定方法的流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
参照图1，一种香蕉水通道蛋白基因启动子转录因子的鉴定方法，包括以下步骤：
S1:MaPIP1；1启动子的克隆及元件分析
根据香蕉A基因组网站设计启动子的引物进行扩增，扩增长度为 1362bp。通过plant care和PLACE分析其顺式作用元件，结果显示了1362bp的启动子序列中共有72个顺式作用元件，包括了许多TATA 框和CAAT框核心元件，包括ABA响应元件ABRE，MYB元件，MYC元件，ERE元件，MeJA响应元件，BOX II，G框，GT1-motif，I框等光响应元件，分生组织响应元件等
S2:MaPIP1；1启动子5′端缺失片段在转基因拟南芥中的表达模式
为了鉴定MaPIP1；1启动子响应干旱胁迫的核心区域，根据启动子序列作用元件，通过5′端缺失技术，将MaPIP1；1启动子分段成 (M-P1，M-P2，M-P3，M-P4)，克隆的长度分别为1362bp，1274bp， 813bp，223bp，经酶切、测序，与MaPIP1；1基因启动子各缺失片段大小相一致，将它们分别替换pCAMBIA-1304载体上的35S启动子并转化拟南芥。
结果显示，M-P1—M-P4的启动子在正常条件下能够启动GUS酶活性均能染出颜色，并且各片段之间也存在着一定的差异。在这些片段中进一步进行GUS酶活检测，M-P1和M-P2的GUS活性较M-P3和 M-P4的GUS活性高。
S3:5′端缺失片段转基因拟南芥在干旱胁迫下的表达
前期的实验证明了MaPIP1；1转基因拟南芥能够响应干旱胁迫，然而元件分析该1362bp启动子元件中并未发现已知的干旱或者盐胁迫诱导的顺式作用元件。为了进一步研究MaPIP1；1在响应干旱胁迫的调控机制，以转化CaMV35S启动子的转基因拟南芥作为对照，对 100mM，200mM，300mM 18％PEG 6000处理的15天转基因拟南芥小苗的叶片和根系分别进行启动子GUS活性的检测。从表型上看，GUS染色中，除了CaMV35S对照植株，各片段的启动子转基因植株叶片均未染色或染色很浅(提示是否启动子中含有根系特异表达元件)。而转基因根系中，在根尖部位着色较深，其中-1274to-1区段(M-P2) 的转基因拟南芥染色最深，而在-813to-1(M-P3)区段，颜色变浅，其余片段染色接近。为了更加准确地确定干旱胁迫下各片段叶片和根系GUS表达的差异，测定了GUS酶活性，结果显示，M-P2(-1274至 -1)在胁迫处理下显示出更高的酶活性。当浓度为300mM时，酶活性为89，是对照的1.48倍。该结果表明，与干旱渗透胁迫相关的功能元件可能包含在M-P2和M-P3之间。在干旱胁迫处理时，CaMV35S转基因拟南芥的酶活性是稳定的。当干旱胁迫浓度为300mM时，M-P2 片段的GUS活性是CaMV35S的0.77倍，高于正常条件下M-P2和 CaMV35S的比例，这意味着M-P2(-1274—-1)可以实现高水平的基因表达和盐度或渗透胁迫诱导。结果表明M-P2(-1274—-1)为该启动子的核心区域，该区域包含了许多核心区域元件CAAT框and TATA框。
S4:酵母单杂交筛选与MaPIP1；1启动子互作的转录因子
为了进一步分析MaPIP1；1响应干旱胁迫的分子机制，采用酵母单杂交的方法进行验证，将启动子核心区域M-P2作为诱饵区段构建诱饵载体，筛选酵母干旱处理的香蕉cDNA单杂交文库，确定与核心区域序列相互作用的蛋白。
3AT是酵母HIS3蛋白合成的竞争性抑制剂，用于抑制His3基因的泄漏表达。由自激活检测结果看出，在添加25mM、50mM的SD-TLH 平板上，MaMaPIP1；1转化子生长都明显受到不同程度的抑制，生长比例比阴性对照的生长比例更少，显示未激活HIS3报告基因，因此在50mM 3AT的基础上进行酵母单杂交筛库。
用含有正确pHIS2-MaPIP1；1诱饵质粒的Y187酵母转化子作为受体菌制备感受态，将文库质粒转入其中，涂SD-Trp-Leu-His+50mM 3AT平板，记录转化效率为：Total numberof transformants＝(1376/20+172/2+25/0.2)×1/3×8000＝7.46×105，根据效率平板的转化子数量，计算筛库效率为：Transformation efficiency＝7.46×105/25ug＝2.98×10/4ug。
阳性克隆His报告基因的检测结果，将SD-TL缺陷型平板上长出的33个初始阳性克隆转化子分别用无菌水稀释后点板至SD-TL 和SD-TLH+150mM 3AT缺陷平板，可以看到，阳性对照在不添加3AT 和添加3AT的筛选平板上都能正常生长，而阴性对照由于不会激活HIS3报告基因，因此在缺少histidine并添加3AT的筛选平板上不能生长或生长不良。因此，在33个初始阳性克隆中，能在添加 3AT的筛选平板上生长旺盛的是激活了HIS3报告基因。
将菌落在添加3AT的筛选平板上进行进一步回转验证，结果显示有29个菌落能不同程度地激活HIS3报告基因，将这29个阳性菌落进行DNA测序和blast比对分析，得到23个不同的与MaPIP1；1互作的蛋白，进一步对这23个不同的蛋白进一步进行回转验证，结果显示23种阳性克隆全部能通过HIS3报告基因。这些功能蛋白包括 beta-amylase(BMY)gene，acidic chitinase gene， pectatelyase2(PL2)，neutral ceramidase，glucan endo-1,3-beta-glucosidase，V-type proton ATPase subunit d2， germin-like protein，KHdomain-containing protein，heat shock cognate 70kDa protein，3'-N-debenzoyl-2'-deoxytaxol N-benzoyltransferase，tubulin alpha-3chain，alpha-1,4glucanphosphorylase L isozyme，pyrrolidone-carboxylate peptidase， ADP-ribosylationfactor，pyruvate kinase，levodione reductase， MADS box protein(MADS3)等。
S5:qRT-PCR检测干旱胁迫处理下的结合蛋白
五叶一心的香蕉苗进行干旱处理，以其为模版，对筛选出来的 23个结合蛋白在干旱胁迫条件下进行qRT-PCR检测，结果显示，在不同程度的干旱胁迫条件下，23个基因在香蕉叶片和根系中的表达模式大致如下，在叶片中呈先升后降表达模式的基因有10个，呈上升表达模式的基因有7个，呈下降表达模式的基因有4个，呈先降后升表达模式的基因有2个。在根系中呈先升后降表达模式的基因有9 个，呈上升表达模式的基因有5个，呈下降表达模式的基因有4个，呈先降后升表达模式的基因有2个，升降表达趋势不明显的基因有3个。根据研究目的，结合基因在香蕉叶片和根系中的表达模式，我们挑选了其中一个转录因子MADS3进行进一步的研究。MADS3受到干旱胁迫的诱导表达，在叶片中，当干旱胁迫土壤水分为45％时，MADS3 基因在香蕉叶片表达量最大。而在根系中，MADS3基因在干旱胁迫下的表达趋势与在叶片中相似。这个结果进一步证明了MADS3转录因子能够协同MaPIP1；1基因响应干旱胁迫。
S6:双荧光素酶体外互作检测
为了进一步证明MADS3与MaPIP1；1的启动子区域结合，进行体外互作验证，进行了双荧光素酶的测定。将MaPIP1；1启动子M-P2 片段构建到reporter vector p Green II0800载体命名为pMaPIP1； 1::LUC，将转录因子MADS3全长ORF构建到effector vectorpCambia-1301载体上命名为35S::MADS3，转化到GV3101农杆菌中并在烟草叶片中表达。结果显示pMaPIP1；1:LUC的相对荧光素活性比 35S::MADS3-pMaPIP1；1::LUC低，说明在香蕉中MADS3能够与MaPIP1； 1启动子结合正向调控MaPIP1；1的转录。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种香蕉水通道蛋白基因启动子转录因子的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：MaPIP1；1启动子的克隆及元件分析：根据现有基因组设计启动子的引物进行扩增，扩增长度至1362bp，通过plant care和PLACE分析其顺式作用元件，结果显示1362bp的启动子序列中会有72个顺式作用元件；
S2：MaPIP1；1启动子5′端缺失片段表达成转基因拟南芥：鉴定MaPIP1；1启动子响应干旱胁迫的核心区域，根据启动子序列作用元件，通过5′端缺失技术，将MaPIP1；1启动子分段，经酶切、测序，与MaPIP1；1基因启动子各缺失片段大小相一致，将它们分别替换pCAMBIA-1304载体上的35S启动子并转化拟南芥；
S3：5′端缺失片段转基因拟南芥在干旱胁迫下的表达：进一步研究MaPIP1；1在响应干旱胁迫的调控机制，以转化CaMV35S启动子的转基因拟南芥作为对照，对100mM、200mM、300mM的18％PEG6000处理的15天转基因拟南芥小苗的叶片和根系分别进行启动子GUS活性的检测；
S4：酵母单杂交筛选与MaPIP1；1启动子互作的转录因子：进一步分析MaPIP1；1响应干旱胁迫的分子机制，采用酵母单杂交的方法进行验证，将启动子核心区域M-P2作为诱饵区段构建诱饵载体，筛选酵母干旱处理的香蕉c-DNA单杂交文库，确定与核心区域序列相互作用的蛋白；
S5：荧光定量PCR检测干旱胁迫处理下的结合蛋白：选取五叶一心的香蕉苗进行干旱处理，以其为模版，对筛选出来的多个结合蛋白在干旱胁迫条件下进行荧光定量PCR检测；
S6：双荧光素酶体外互作检测：进一步证明，结合基因在香蕉叶片和根系中的表达模式，挑选了其中一个转录因子进行进一步研究，研究内容为转录因子与MaPIP1；1的启动子区域结合，进行体外互作验证，进行了双荧光素酶的测定。
2.根据权利要求1所述的一种香蕉水通道蛋白基因启动子转录因子的鉴定方法，其特征在于，所述S1中顺式作用元件包括有许多TATA框和CAAT框核心元件，核心元件包括ABA响应元件、ABRE、MYB元件、MYC元件、ERE元件、MeJA响应元件、BOXII、G框、GT1-motif、I框等光响应元件和分生组织响应元件等。
3.根据权利要求1所述的一种香蕉水通道蛋白基因启动子转录因子的鉴定方法，其特征在于，所述S2中的MaPIP1；1启动子分段为M-P1、M-P2、M-P3和M-P4四片段，且四片段的克隆长度分别为1362bp、1274bp、813bp和223bp。
4.根据权利要求1所述的一种香蕉水通道蛋白基因启动子转录因子的鉴定方法，其特征在于，所述S4中的酵母单杂交筛选中，其中筛选是在添加25mM、50mM的SD—TLH平板上，MaMaPIP1；1转化子生长都明显受到不同程度的抑制，生长比例比阴性对照的生长比例更少，显示未激活HIS3报告基因，在50mM3AT的基础上建立酵母单杂交筛库。
5.根据权利要求4所述的一种香蕉水通道蛋白基因启动子转录因子的鉴定方法，其特征在于，所述酵母单杂交筛库中的菌落在添加3AT的筛选平板上进行进一步回转验证，结果显示有29个菌落能不同程度地激活HIS3报告基因，将这29个阳性菌落进行DNA测序和blast比对分析，得到23个不同的与MaPIP1；1互作的蛋白，进一步对这23个不同的蛋白进一步进行回转验证，结果显示23种阳性克隆全部能通过HIS3报告基因。
6.根据权利要求1所述的一种香蕉水通道蛋白基因启动子转录因子的鉴定方法，其特征在于，所述S6中的转录因子选取为MADS3，且MADS3受到干旱胁迫的诱导表达证明部分转录因子可协同MaPIP1；1基因响应干旱胁迫。
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104313026A (zh) * | 2014-09-23 | 2015-01-28 | 中国热带农业科学院海口实验站 | 香蕉水通道蛋白基因启动子及其应用 |
| CN106191076A (zh) * | 2016-07-26 | 2016-12-07 | 江苏省农业科学院 | 植物pip1；10基因及其应用 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| YI XU等: "A banana aquaporin gene, MaPIP1;1, is involved in tolerance to drought and salt stresses" * |
| 吴宪: "拟南芥干旱诱导型启动子的克隆及功能分析" * |
| 宋顺;黄东梅;徐碧玉;金志强;孙威;许桂莺;李敬阳;许奕;: "非生物胁迫对水通道蛋白启动子活性的调节作用" * |
| 谢学立等: "香蕉水通道蛋白基因的克隆与表达分析" * |
| 钟曦等: "与AtGA20ox1启动子结合的转录因子筛选分析" * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113480625A (zh) * | 2021-08-19 | 2021-10-08 | 中国热带农业科学院海口实验站 | 香蕉bZIP转录因子在调控果实发育过程中品质形成的应用及其表达载体构建 |
| CN113480625B (zh) * | 2021-08-19 | 2023-03-14 | 中国热带农业科学院海口实验站 | 香蕉bZIP转录因子在调控果实发育过程中品质形成的应用及其表达载体构建 |
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