CN108017699B

CN108017699B - 与植物衰老相关的水稻OsNBL1蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN108017699B
Application number: CN201810076445.6A
Authority: CN
Inventors: 赵文生; 赵晓胜; 彭友良; 张天博
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2018-01-26
Filing date: 2018-01-26
Publication date: 2019-01-25
Anticipated expiration: 2038-01-26
Also published as: CN108017699A

Abstract

本发明公开了与植物衰老相关的水稻OsNBL1蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的OsNBL1蛋白是序列2所示的蛋白质，OsNBL1蛋白的编码基因是序列1所示的DNA分子。本发明通过TAIL‑PCR克隆了T‑DNA插入位点，发现该T‑DNA的插入导致OsNBL1基因下调表达；并通过在野生型水稻中超表达OsNBL1基因证实：超表达OsNBL1基因可延迟植物衰老，有利于增加生物量的积累，在提高植物产量上具有应用前景。本发明为利用基因工程手段通过调控OsNBL1基因表达水平来提高作物产量或增强植物耐盐性进行分子育种奠定了基础，具有潜在的应用价值。

Description

与植物衰老相关的水稻OsNBL1蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及与植物衰老相关的水稻OsNBL1蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

植物衰老是指在生长发育过程中，植物机体自身的一种退化行为。在植物的生活史中，衰老可以引起植物细胞及器官的死亡。在正常情况下，叶片的生长发育通常经历三个不同阶段，在早期的生长发育过程中，叶片是贮存光合作用产生能量的主要器官；在抽穗期，由于光合能力达到饱和，叶片成为了植物的主要器官；而在抽穗期之后，叶片进入衰老阶段，在此阶段，大部分营养成分会被有效地再利用和再分配。此外，叶片衰老也是被基因所编码的一个过程，衰老包含着一系列的细胞学以及生物化学方面的改变，伴随着营养从老叶向嫩叶转移的过程，而且这个过程也引起了大分子化合物的降解以及营养物质的再分配。在衰老过程中伴随着一些细胞结构、分子机制以及基因水平等方面上的改变。不同的外界条件(如高温、干旱、营养缺乏、光照不足、黑暗以及病原菌的侵染)也会加速叶片衰老。其中，衰老形成过程中最典型的表现形式是叶尖黄化枯死、叶绿素下降以及蛋白质降解。细胞程序性死亡(PCD)也在叶片黄化形成过程中发挥重要作用。总之，叶片衰老黄化是一个极其复杂的过程，它被诸多因素所调控，衰老可以引起叶片内部的一系列的生理生化代谢的变化。

绿叶中的叶绿体是衰老过程开始时的主要靶标，在衰老过程发生中，叶绿体被破坏，随着叶绿体基粒的堆积和类囊体的扩张，类囊体膜也被破坏。在衰老发生后期，叶绿体的结构完全被破坏，类囊体的结构的改变包括光合系统蛋白质的降解和叶绿素的损失，这些都会导致不平衡的光合电子链传递。叶绿体中基质蛋白质的改变包括Rubisco和C3光合作用路径中的其他组分的改变，谷氨酰胺合成酶II以及硫同化酶的降解。在衰老过程中，叶绿体的破坏可能是为了保持叶片的储存光合作用的能力，与这个相对应的就是叶片的叶绿素含量的下降。叶绿素的含量越低，其光合速率就越低，表明加快了叶片衰老。

活性氧能破坏细胞膜脂质层，改变膜的通透性，进而会导致离子和电解质在膜上的外泄。丙二醛(MDA)是不饱和脂肪酸的降解产物，并且它是检测脂质过氧化作用标记物质。在叶片衰老形成的过程中，MDA的含量也是逐渐地升高。一般情况下，在水稻抽穗期之后，叶片衰老从低节间开始向高节间发展。在植物最后的生长时期，高产量的品种也是与MDA的积累水平呈负相关。有效的抑制叶片衰老，延长植物的最后的生长阶段，在提高产量方面也有重要影响。

通过影响植物组织系统所调控衰老的基因叫做衰老相关基因(Senescence-associated genes，SAGs)。从不同的植物中所分离出来的SAGs包括：与蛋白酶合成相关基因、蛋白酶调控基因、ACC合成基因、核糖核酸酶谷氨酰胺合成酶合成相关基因、金属硫蛋白合成相关基因、叶黄素脱氢酶合成相关基因。在不同的植物中，已经有超过三十多个SAGs被分离、克隆、鉴别出来，如SAG13、SAG21、EDR1、BCB、SAG18和ACS6等。其中，Osl2和Osh69的功能目前基本已经清楚，二者特异在衰老时期的叶片中表达，在茎秆和根里几乎不表达。sgr(t)是水稻中第一个克隆的衰老上升表达基因，其作用是延迟叶绿素的降解。OsDos在叶片衰老和幼穗分化时期表达，不仅调节自然衰老，参与JA(茉莉酸)介导的叶片衰老途径，而且参与花粉发育的调控途径。ygl1也是一个衰老下调基因，是从第一个已被报道的高等植物叶绿体合成酶的突变体中图位克隆得到。持绿相关的基因nyc1定位在第1染色体上，该基因表达的蛋白质产物NYCI可能是叶绿素b还原酶，能有效抑制叶绿素的降解。

目前通过转基因技术延缓水稻叶片衰老也有了很大突破，这些基因主要包括PSAG12-IPT、PPF1和ppc等。PSAG12-IPT是衰老自动调节系统，该系统能显著提高内源细胞分裂素水平，有效延缓衰老。该系统目前在籼稻和粳稻中均已得到了应用。PPF1是在短日豌豆花后特异表达、具有延缓衰老作用的基因，将该基因转入水稻中，多数转基因植株的叶绿素含量和光合指标显著高于对照，衰老表现一定程度的延迟。ppc是从玉米中获得的与磷酸烯酮式丙酮酸羧化酶合成有关的基因，将该基因转到水稻中可以显著提高水稻光合速率，特别是逆境条件下的水稻光合速率，在一定程度上延缓了衰老。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何延迟植物衰老和/或提高植物耐逆性。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种与植物衰老相关蛋白。

本发明所提供的与植物衰老相关蛋白的名称为OsNBL1，为如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

其中，序列2由94个氨基酸残基组成。

为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述c)中的蛋白质OsNBL1，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质OsNBL1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质OsNBL1的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

为解决上述技术问题，本发明又提供了与OsNBL1蛋白质相关的生物材料。

本发明提供的与OsNBL1蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码OsNBL1蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1所示的cDNA分子或基因组DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码OsNBL1蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码OsNBL1蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列1由285个核苷酸组成，整个序列1即为所述OsNBL1基因的编码序列(ORF)，编码序列表中序列2所示的蛋白质。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码OsNBL1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的OsNBL1的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码OsNBL1且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，A2)所述的含有编码OsNBL1的核酸分子的表达盒(OsNBL1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达OsNBL1的DNA，该DNA不但可包括启动OsNBL1转录的启动子，还可包括终止OsNBL1转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子。

所述植物重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于微弹轰击的载体等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pCAMBIA1301、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCG1301或其他衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区，即包含多聚腺苷酸信号和任何其他参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述多聚腺苷酸信号可引导多聚腺苷酸加入到MRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子Rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始或邻近区域起始密码子等，但必须与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是人工合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植株进行鉴定和筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可以不加任何选择标记基因，直接以逆境筛选转化植株等。

在本发明中，所述重组表达载体中启动所述编码基因OsNBL1转录的启动子可为ubiquitin启动子、35S启动子或Actin1启动子。在本发明中，启动所述编码基因OsNBL1转录的启动子具体为ubiquitin启动子。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。在本发明中，所述重组载体具体为将ubiquitin启动子和OsNBL1基因插入pCAMBIA1301载体的Sac I和Mlu I酶切位点间后得到的载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。在本发明中，采用的农杆菌具体为EHA105。

上述生物材料中，所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。

为解决上述技术问题，本发明还提供OsNBL1蛋白质或上述生物材料的新用途。

本发明提供了OsNBL1蛋白质或上述生物材料在调控植物衰老中的应用。

本发明还提供了OsNBL1蛋白质或上述生物材料在调控植物耐逆性中的应用。

本发明还提供了OsNBL1蛋白质或上述生物材料在培育衰老延迟的转基因植物中的应用。

本发明还提供了OsNBL1蛋白质或上述生物材料在培育耐逆性提高的转基因植物中的应用。

本发明还提供了OsNBL1蛋白质或上述生物材料在植物育种中的应用。

上述应用中，所述耐逆性为耐盐性。

上述应用中，所述调控植物耐逆性为提高植物耐逆性；所述提高植物耐逆性具体体现在提高植物株高和/或提高植物耐盐相关基因表达量；所述耐盐相关基因具体为基因HAK1和/或HAK5和/或OsLEA3-1和/或OsSNAC1和/或OsSNAC3和/或OsSNAC10。

上述应用中，所述调控植物衰老为使植物早衰或延迟植物衰老；

所述使植物早衰具体体现为如下m1)-m3)中任一种：m1)降低植物叶绿素含量；m2)提高植物早衰标记基因表达量；m3)使植物更易被黑暗诱导衰老；m4)提高植物黑暗诱导相关基因表达量；所述延迟植物衰老具体体现为如下m5)-m7)中任一种：m5)提高植物叶绿素含量；m6)提高植物株高；m7)延缓植物黑暗诱导的衰老。

所述早衰标记基因具体为基因OsNAP和/或OsSGR和/或OsI57和/或OsI85和/或OsRCCR1；所述黑暗诱导相关基因具体为基因OsDIN1和/或OsDIN2和/或OsDIN3和/或OsDIN4和/或OsDIN6和/或OsDIN9。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育衰老延迟的转基因植物的方法。

本发明提供的培育衰老延迟的转基因植物的方法包括提高受体植物中OsNBL1蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的衰老时间迟于所述受体植物。

上述方法中，所述转基因植物的衰老时间迟于所述受体植物体现在所述转基因植物的株高高于所述受体植物和/或所述转基因植物的叶绿素含量高于所述受体植物；

所述提高受体植物中OsNBL1蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体植物中过表达OsNBL1蛋白质；所述过表达的方法为将OsNBL1蛋白质的编码基因导入受体植物；所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。

上述方法中，所述将OsNBL1蛋白质的编码基因导入受体植物为将携带有所述OsNBL1蛋白质的编码基因的重组载体导入所述受体植物，具体可为使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化受体植物组织或细胞，并将转化的植物组织培育成植株。所述重组载体可为将ubiquitin启动子和OsNBL1基因插入pCAMBIA1301载体的Sac I和Mlu I酶切位点间后得到的载体。

为了解决上述技术问题，本发明最后还提供了一种培育耐逆性提高的转基因植物的方法。

本发明提供的培育耐逆性提高的转基因植物的方法包括降低受体植物中OsNBL1蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物。

上述方法中，所述耐逆性为耐盐性；

所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物体现在所述转基因植物的株高高于所述受体植物和/或所述转基因植物的耐盐相关基因的表达量高于所述受体植物；

所述耐盐相关基因为基因OsSNAC1和/或OsHAK5和/或OsHAK1和/或OsLEA3-1和/或OsNAC3和/或OsNAC10。

上述方法中，所述降低受体植物中OsNBL1蛋白质的表达量和/或活性为沉默或抑制受体植物基因组中OsNBL1蛋白质的编码基因的表达和/或活性或敲除OsNBL1蛋白质的编码基因；

所述沉默或抑制受体植物基因组中OsNBL1蛋白质的编码基因的表达和/或活性或敲除OsNBL1蛋白质的编码基因为突变受体植物基因组中OsNBL1蛋白质的编码基因使受体植物基因组中OsNBL1蛋白质的编码基因的表达量降低或使受体植物基因组中OsNBL1蛋白质的编码基因发生缺失突变或发生插入突变；

所述突变的方式可为CRISPR/Cas9或TELLEN技术或T-DNA插入或EMS诱变。在本发明中，所述突变的方式为T-DNA插入；

所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。

上述应用或方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述OsNBL1基因转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

上述应用或方法，所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物可为水稻、玉米、小麦等。在本发明中，所述植物为单子叶植物，所述单子叶植物为水稻，所述水稻品种具体可为爱知旭。

本发明利用一个水稻隐性早熟突变体osnbl1，使用TAIL-PCR技术克隆出OsNBL1基因并进行了功能分析。突变体osnbl1中T-DNA插入在OsNBL1基因的第二个外显子，导致OsNBL1表达下降，表现出早衰表型，与野生型相比增强了对盐的耐受性。进一步，利用Ubiquitin启动子驱动OsNBL1基因在野生型水稻中超表达，与野生型相比超表达植株衰老延迟，暗示超表达OsNBL1基因可增加植物生物量的积累，在提高植物产量上具有应用前景。本发明为利用基因工程手段进行分子育种提高作物产量或增强植物耐盐性提供了基础，具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为突变体osnbl1的表型鉴定。A为野生型与突变体温室表型；WT为野生型，nbl1为突变体osnbl1。B为野生型、突变体和杂合植株(H)田间表型；C为野生型与突变体抽穗期水稻剑叶表型，Bar＝20cm。D为野生型与突变体抽穗期水稻剑叶的叶绿素含量；FW代表叶片鲜重；S代表叶基部；M代表叶中部；T代表叶尖部，白色方框代表野生型，黑色方框代表突变体osnbl1。叶绿素含量的平均数和标准差是由测量的20个数据平均值。数据分析采用t测验。E、F、G、H、J为叶绿素降解相关基因的表达量(SGR和RCCR1)和其他衰老标记基因的表达量。**在0.01水平上差异显著。数据分析采用学生t测验。

图2为突变体osnbl1加速黑暗诱导的衰老。A和B为突变体osnbl1黑暗诱导衰老表型图；D、E、F、G、H、J为利用实时定量PCR检测黑暗诱导的标记基因的表达量。*在0.05水平上差异显著，**在0.01水平上差异显著。数据分析采用学生t测验。

图3为突变体osnbl1的耐盐性增强。A和B为与野生型相比，突变体osnbl1的耐盐性表型增强；D、E、F、G、H、J为利用实时定量PCR检测耐盐标记基因的表达量。*在0.05水平上差异显著，**在0.01水平上差异显著。数据分析采用t测验。

图4为利用TAIL-PCR克隆水稻OsNBL1基因的结果。A为T-DNA在OsNBL1基因的插入位置；B为PCR鉴定T-DNA的插入位点结果；C为利用实时定量PCR检测突变体osnbl1与野生型(WT)中OsNBL1基因的相对表达量结果。**在0.01水平上差异显著。数据分析采用学生t测验。

图5为OsNBL1在烟草叶肉细胞和水稻原生质体中的亚细胞定位结果。

图6为OsNBL1基因超表达转基因株系的获得及表型分析。A为野生型、突变体和超表达植株的温室苗期表型；B为利用实时定量PCR检测野生型和超表达植株中的OsNBL1的基因表达量。*在0.05水平上差异显著，**在0.01水平上差异显著；C为超表达OsNBL1表现延缓衰老表型图；D为超表达OsNBL1抽穗期剑叶叶绿素含量图。FW代表叶片鲜重。叶绿素含量的平均数和标准差是由调查的15个数据所计算获得的，数据分析采用学生t测验。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、水稻OsNBL1蛋白及其编码基因的获得

一、水稻早衰突变体osnbl1的获得及表型鉴定

1、水稻早衰突变体osnbl1的获得及表型鉴定

从T-DNA转化水稻品种爱知旭的后代中筛选获得突变体osnbl1，其表型如图1中A、B和C所示。在温室条件下，突变体osnbl1在苗期表现为植株矮化并带有叶尖枯死的症状；在田间，突变体osnbl1在苗期只表现出植株矮化，叶尖枯死症状并不明显。从分蘖期开始，突变体osnbl1就呈现出叶片早衰现象，主要表现在叶尖等叶的边缘部分变黄，并逐渐地有斑点从叶片边缘扩散到叶片内侧，直至整个叶片枯死。在整个分蘖期，除心叶为正常叶外，其余叶片均有一定的叶片枯死现象发生，而在抽穗期，所有叶片均呈现不同程度的早衰。

2、叶绿素含量检测

叶绿素含量下降是衡量叶片衰老的一个重要指标。为揭示这种叶片早衰的机理，测定了抽穗期后突变体osnbl1及野生型水稻爱知旭的剑叶中的叶绿素含量。叶绿素含量的具体检测步骤参照文献“张宪政.植物叶绿素含量测定——丙酮乙醇混合液法.辽宁农业科学,1986(3):28～30”中的方法进行。结果如图1中D所示，在抽穗期后，与野生型相比，突变体osnbl1剑叶中叶绿素的含量显著降低，其中叶尖部分的叶绿素含量仅为野生型的40％。

3、早衰标记基因的表达量检测

用荧光定量PCR方法分析突变体osnbl1和野生型水稻爱知旭中的2个与叶绿素降解相关基因(CDGs)的表达量以及2个衰老相关基因(SAGs)的表达量。具体步骤如下：取突变体osnbl1和野生型水稻爱知旭相同部位完全展开叶片，采用Trizol试剂法(Invitrogen)提取其总RNA，采用MMLV反转录酶(TaKaRa)并参照相应的使用方法进行反转录，然后利用实时荧光定量PCR技术，根据厂家(TaKaRa)提供的使用方法，在PCR体系中加入SYBR green I荧光染料，在荧光定量PCR仪(ABI 7500，USA)检测叶绿素降解相关基因及衰老相关基因的表达情况，以水稻ACTIN1基因为内参。引物序列如表1所示。实验设三次重复。数据处理采用comparative Ct方法，即Ct值为PCR管中荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，ΔCt＝Ct(待测基因)-Ct(ACTIN1)，以2^-ΔCt值衡量基因转录水平，对突变体osnbl1及野生型水稻中的测定基因进行比较分析。

表1、早衰标记基因引物

基因名称	正向引物5’-3’	反向引物5’-3’
			ACTIN1	TTGGCATCTCTCAGCACATTCCAG	GCGATAACAGCTCCTCTTGGCTTA
OsNBL1	CCTTCCTCATCGTCCTCCTCATC	TGGCGAGCCTGTAGATCCAGTAG
			OsNAP	CAAGAAGCCGAACGGTTC	GTTAGAGTGGAGCAGCAT
OsSGR	AGGGGTGGTACAACAAGCTG	GCTCCTTGCGGAAGATGTAG
			OsI57	GCACGGAGGCGAACGA	CTCCCAGCCTGCAAAGTTCATG
OsI85	GAGCAACGGCGTGGAGA	GCGGCGGTAGAGGAGATG
			OsRCCR1	CGCATTTCCTCATGGAATTT	CTTCTCACGCTGTTTGTCCA

结果如图1中E-J所示，早衰标记基因在突变体osnbl1中的表达量显著升高。说明突变体osnbl1加速了叶片衰老的进程。

4、突变体osnbl1加速黑暗诱导的衰老

(1)黑暗诱导试验

黑暗是诱导叶片衰老的重要外源条件之一。分别对突变体osnbl1和野生型水稻爱知旭进行全黑暗处理的测试。具体步骤如下：1)离体叶片处理：水稻剑叶叶片剪成约3cm大小的小块，放入玻璃皿中并加入15ml水浸泡。在28℃条件下，培养皿置于全黑暗处理5–10天；2)活体稻苗处理：将温室的水稻三叶时期的植株移栽于盆中，并用黑布完全遮住，在28℃条件下继续培养5–10天。

结果如图2中A所示，与野生型相比，活体的突变体osnbl1植株更易被黑暗诱导衰老；图2中B所示黑暗处理后突变体osnbl1离体叶片较野生型更易衰老。

(2)黑暗诱导相关基因的表达量检测

通过qRT-PCR方法测定黑暗处理后突变体osnbl1和野生型水稻爱知旭中6个与黑暗诱导相关基因(dark induced genes，DINs)的表达量，引物序列见表2，以ACTIN1基因为内参，引物序列见表1。试验方法和数据处理同步骤3。

结果如图2中D-J所示：与野生型相比，与黑暗诱导相关基因在突变体osnbl1中的表达量显著升高。综上所述，突变体osnbl1显著地加速了黑暗所诱导的叶片衰老。

表2、黑暗诱导标记基因引物

基因名称	正向引物5’-3’	反向引物5’-3’
			OsDIN1	GCTCTGCTGGTTTTACTGCTGTC	TCACTTGTTGGTTGGGAGTTCATTC
OsDIN2	GCAGTGTTGGAGATTCAGGAAGG	TTGGATTTGGAGCGGGAGAAGG
			OsDIN3	CAAGTGGAGTTACTGGAGGGAAGG	TATGAGGAATGGTAGGAAGGTGTGC
OsDIN4	TCACTACCATTCACAGTCACCAGAG	GGAACTTCTTCAACAGCCAAACGG
			OsDIN6	GGGCTGGGGTCTTGATGGTTC	GGAAGGATATGAATCGCTCGCAATC
OsDIN9	GCTCACTACCACCAGGCGAAC	GGACCAGAGGCAGAGAACTTAACC

5、突变体osnbl1的耐盐性检测

为分析突变体osnbl1对盐的耐受性，将突变体osnbl1和野生型水稻爱知旭分别置于含100mM NaCl的培养液(培养液的溶剂为水，溶质及其在培养液中的浓度分别如下：1.5mM NH₄NO₃，0.3mM NaH₂PO₄，0.5mM K₂SO₄，1.0mM CaCl₂，1.6mM MgSO₄，0.5mM NaSiO₃，20μMFe-EDTA，0.075μM(NH₄)₆Mo₇O₂₄，18.9μM H₃BO₃，9.5μM MnCl₂，0.1μM CuSO₄，0.2μM ZnSO₄，70.8μM citric acid，pH 5.5)中进行盐处理实验，以不含盐的营养液为对照。分别在盐处理第6、12、18天后测量的突变体osnbl1与野生型的株高。

结果如图3中A所示：在不含盐的水培营养液中，野生型的株高一直比突变体osnbl1高。在生长到第6天时，野生型和突变体osnbl1的株高分别为13.6cm、9.6cm，第12天时分别为16.5cm、15.3cm，第18天时，分别为17.9cm、16.3cm。在含100mM NaCl的水培营养液中，突变体osnbl1与野生型的生长都受到抑制。但是，在含有NaCl的水培营养液中，突变体和野生型的株高在第6天时基本上一样高(约为4.5cm)；第12天时，突变体osnbl1平均株高为9.7cm，而野生型为8.6cm，突变体osnbl1的株高已经显著比野生型高；18天时，而野生型仅为8.3cm，且开始衰败，表明野生型可能已经耐受不住盐害所带来的渗透压力，突变体平均株高为11cm，且仍然保持较好的生长状态。这些结果说明，突变体osnbl1比野生型对盐的耐受性更强。

6、与耐盐相关基因的表达量检测

利用qRT-PCR的方法检测4叶1心期的突变体osnbl1和野生型水稻爱知旭中6个与耐盐相关的基因的表达量。耐盐相关基因引物序列见表3，以ACTIN1基因为内参(引物序列见表1)，试验方法和数据处理同步骤3。

表3、qRT-PCR验证耐盐性标记基因引物

基因名称	正向引物5’-3’	反向引物5’-3’
			OsSNAC1	TTGGGATCAAGAAGGCGCTC	GCACCCCAATCATCCAACCT
OsHAK5	CATTGTGGACTATTTGAAAGAA	GGAGAACTACAGAAAAGCCAATC
			OsHAK1	GTTGATGATGCTGATGTTGGAAG	CCAACACTTTCAGCTGAAAC
OsLEA3-1	GGCGAGTGAGCAGGTGAAGAG	GCGGTGGCAGAGGTGTCC
			OsNAC3	GCTGGATGACTGGGTGCTGTG	CCTCCTCCTCCTTCCTGCTCTG
OsNAC10	CCTAATATACACAACACCTCATCCA	GTCATTGCTGCTGCCATC

结果如图3中B所示：与野生型相比，与转运钠离子有关基因HAK1和HAK5的表达量显著上调，基因OsLEA3-1以及其它3个NAC家族中的耐盐相关标记基因在突变体osnbl1中表达量也显著上调。上述结果表明，突变体osnbl1耐盐性的提高可能是通过上调与耐盐相关基因的表达所致。

二、采用TAIL-PCR技术克隆OsNBL1基因

1、OsNBL1基因的获得

对上述步骤一所获得的突变体osnbl1进行遗传分析，结果表明，此突变体的早衰表型与T-DNA插入共分离，为单位点插入的隐性突变体。利用TAIL-PCR技术分离T-DNA侧翼序列。分析发现T-DNA插入位点在第10号染色体上(图4中A所示)。在基因组上设计引物P1(5’-TTCCTCATCGTCCTCCTCATCG-3’)、P2(5’-CGTTGGTTCATGCAGAGTTCAGC-3’)和T-DNA边界引物P3(5’-CTGTTGCCGGTCTTGCGATGAT-3’)组合进行PCR扩增(图4中B所示)，测序分析发现T-DNA插入到一个注释表达蛋白的编码区域内，将此基因命名为OsNBL1基因。如图4中A所示，OsNBL1基因含有3个外显子和2个内含子，插入位点位于第二个外显子上(插入位点位于OsNBL1基因第280位和281位之间)，其开放阅读框(ORF)如序列表中的序列1所示，其编码的蛋白(OsNBL1蛋白)氨基酸序列如序列表中的序列2所示。

与野生型水稻爱知旭相比，本发明的突变体osnbl1为仅在野生型水稻爱知旭基因组中OsNBL1基因第二个外显子上发生T-DNA插入突变，T-DNA插入位点位于OsNBL1基因第280位和281位核苷酸之间。

2、OsNBL1基因表达量检测

利用荧光定量PCR法对突变体osnbl1和野生型水稻爱知旭中的OsNBL1基因表达情况进行分析，以ACTIN1基因为内参，引物序列见表1，检测方法以及数据处理同步骤一。结果如图4中C所示，T-DNA插入导致OsNBL1基因下调表达40倍。

实施例2、OsNBL1蛋白的亚细胞定位

1、利用PCR方法，以GFP-472-F(5’-ATAggtaccATGGGCTCGACGAACAG-3’，下划线部分为Kpn I位点)为正向引物，以GFP-472-R(5’-ATAgtcgacGTGCTTCTTGCTCC-3’，下划线部分为Sal I位点)为反向引物，从水稻品种爱知旭的cDNA中扩增出OsNBL1基因的开放阅读框序列。PCR产物回收后连入pMD-18T载体(TaKaRa)中，经测序正确后，利用Kpn I和Sal I进行双酶切，酶切产物连入植物亚细胞定位表达载体pCG1301(普如汀生物技术(北京)有限公司)，即得到含有OsNBL1基因的重组表达载体pCG1301-OsNBL1-GFP。重组表达载体pCG1301-OsNBL1-GFP的结构描述为：在pCG1301载体的多克隆位点Kpn I和Sal I之间插入序列表中序列1的第1-282位得到的重组质粒。在重组表达载体pCG1301-OsNBL1-GFP中，驱动所述OsNBL1基因表达的为35S启动子。

2、按照文献“Li,X.,2011,Infiltration of Nicotiana benthamiana Protocolfor Transient Expression via Agrobacterium.Bio-protocol Bio101:e95.DOI:10.21769/BioProtoc.95”和文献“Wang,K.,Liu,Y.and Li,S.,2013,BimolecularFluorescence Complementation(BIFC)Protocol for Rice ProtoplastTransformation.Bio-protocol 3(22):e979.DOI:10.21769/BioProtoc.979.”中的方法，将重组表达载体pCG1301-OsNBL1-GFP分别转化烟草叶肉细胞和水稻原生质体，在激光共聚焦显微镜下观察OsNBL1蛋白的定位情况。结果如图5所示，从图中可以看出OsNBL1蛋白在烟草叶肉细胞和水稻原生质体中均定位于细胞膜和细胞内质体上。

实施例3、OsNBL1基因超表达植株的获得及表型鉴定

本实施例中所涉及的基因为实施例1获得的水稻品种爱知旭中的OsNBL1基因，其核苷酸序列为序列表中的序列1，编码序列表中序列2所示的蛋白(OsNBL1)。序列1由285个核苷酸组成，序列2由94个氨基酸组成。

一、OsNBL1基因超表达植株的获得

1、重组表达载体pCAMBIA1301-Ubi-OsNBL1的构建

(1)利用PCR方法，采用引物5’-atagagctcGTGCAGCGTGACCCGGT-3’(下划线部分为Sac I位点)和5’-ataggatccAAGTAACACCAAACAACAGGGT-3’(下划线部分为Bam HI位点)，以双元载体pUbiGUSPlus(普如汀生物技术(北京)有限公司)为模板，扩增ubiquitin启动子区域。将扩增产物回收后连接pMD18-T simple(TaKaRa)载体并测序验证。将测序验证正确的质粒用Sac I和Bam HI双酶切，酶切产物回收后连入pCAMBIA1301载体(普如汀生物技术(北京)有限公司)的Sac I和Bam HI双酶切位点，得到pCAMBIA1301-Ubi。

(2)利用PCR方法，采用引物OE-NBL1-F(5’-ATAggatccGGCTCGACGAACAGC-3’，下划线部分为Bam HI位点)和OE-NBL1-R(5’-TATacgtgcCTAGTGCTTCTTGCTC-3’，下划线部分为Mlu I位点)，从水稻品种爱知旭的cDNA中扩增出OsNBL1基因的开放阅读框序列。PCR产物回收后连入pMD-18T载体(TaKaRa)中，经测序正确后，利用Bam HI和Mlu I进行双酶切，酶切产物连入步骤(1)中的植物表达载体pCAMBIA1301-Ubi，即得到含有OsNBL1基因的重组表达载体pCAMBIA1301-Ubi-OsNBL1。

所述重组表达载体pCAMBIA1301-Ubi-OsNBL1为将ubiquitin启动子和OsNBL1基因插入pCAMBIA1301载体的Sac I和Mlu I酶切位点间后得到的载体。在重组表达载体pCAMBIA1301-Ubi-OsNBL1中，驱动所述OsNBL1基因表达的为ubiquitin启动子。

在重组表达载体pCAMBIA1301-Ubi-OsNBL1的构建过程中，也可以人工合成的序列表中序列所示的OsNBL1基因为模板。

2、OsNBL1基因超表达水稻的获得

将上述步骤1所构建的重组表达载体pCAMBIA1301-Ubi-OsNBL1，通过农杆菌EHA105(普如汀生物技术(北京)有限公司)导入到水稻品种爱知旭(Oryza sativaL.cv.Aichi asahi)的胚性愈伤组织中。具体转化方法参见文献“易自力、曹守云、王力、储成才、李祥、何锶洁、唐祚舜、周朴华、田文忠，提高农杆菌转化水稻频率的研究，遗传学报，2001，28(4)：352-358”一文。

3、OsNBL1基因超表达水稻的鉴定

(1)PCR初步鉴定

从步骤2中所获得的T0代转入pCAMBIA1301-Ubi-OsNBL1的转基因水稻中提取基因组DNA，利用引物5’-GCTGCGCCGATGGTTTCTACAA-3’和5’-CACGGCCTCCAGAAGAAGATGTTG-3’检测转基因水稻中的新霉素磷酸转移酶基因(HPTII)片段，PCR扩增产物为514bp的片段的即为转基因阳性植株。经上述PCR鉴定，将其中5个转入pCAMBIA1301-Ubi-OsNBL1的转基因水稻株系分别记做T0代转OsNBL1水稻株系OE-4、OE-6、OE-9、OE-12和OE-15。

(2)转录水平分析(RNA表达量)

以上述获得的T0代转OsNBL1水稻株系OE-4、OE-6、OE-9、OE-12、OE-15和野生型水稻爱知旭为材料进行荧光定量PCR分析，以ACTIN1基因为内参，扩增引物见表1。检测方法以及数据处理同实施例1步骤一中的3。

各试验材料中OsNBL1基因的实时荧光定量PCR结果如图6中B所示。从图中可以看出：与未转基因的野生型水稻爱知旭相比，T0代转OsNBL1水稻株系OE-4、OE-6、OE-9、OE-12和OE-15中OsNBL1基因的转录水平均显著提高，其表达量分别是野生型的30到150倍。

二、OsNBL1基因超表达水稻抗衰老性状检测

1、短日照条件下OsNBL1基因超表达水稻株高检测

以上述获得的T0代转OsNBL1水稻株系OE-9、OE-12和野生型水稻爱知旭为材料，按常规方法在温室种植，在短日照条件下(日照时间8小时)观察各材料四叶一心期的表型。

结果如图6中A所示，在四叶一心期时T0代转OsNBL1水稻株系的株高比野生型显著增高。

2、黑暗处理后衰老表型检测

分别对T0代转OsNBL1水稻株系OE-9、OE-12和野生型水稻爱知旭离体叶片进行黑暗处理，具体处理方法同实施例1步骤一中的4。

结果如图6中C所示，与野生型爱之旭相比，黑暗处理后的T0代转OsNBL1水稻株系OE-9、OE-12的水稻叶片明显表现出延缓衰老。

3、叶绿素含量检测

分别测定抽穗期的T0代转OsNBL1水稻株系OE-9、OE-12和野生型水稻爱知旭的水稻叶片中的叶绿素含量，具体测定方法同实施例1步骤一中的2。

结果如图6中D所示，与野生型爱知旭相比，T0代转OsNBL1水稻株系OE-9、OE-12的水稻叶片中的叶绿素含量显著升高。

以上结果证明OsNBL1基因可负向调控衰老，超表达OsNBL1可以延缓植物衰老。

序列表

<110>中国农业大学

<120>与植物衰老相关的水稻OsNBL1蛋白及其编码基因与应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>285

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

atgggctcga cgaacagccc ggtggtggtg gtggtgccgg accccgtggt ggtgggggtg 60

gggctccacc acccgcaccc ggccgccgcg ctgatctccc gccgcgtcgc catggcgcgg 120

gactacgccg ccgccgccgc cgtcctccgc ccgccgtggc tcctcgacct cctccccttc 180

ctcatcgtcc tcctcatcgc cgcccacgtc ctcgccctcg gctactggat ctacaggctc 240

gccaccgacg gctcaaggca gcccgcgcgg agcaagaagc actag 285

<210>2

<211>94

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

Met Gly Ser Thr Asn Ser Pro Val Val Val Val Val Pro Asp Pro Val

1 5 10 15

Val Val Gly Val Gly Leu His His Pro His Pro Ala Ala Ala Leu Ile

20 25 30

Ser Arg Arg Val Ala Met Ala Arg Asp Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Val

35 40 45

Leu Arg Pro Pro Trp Leu Leu Asp Leu Leu Pro Phe Leu Ile Val Leu

50 55 60

Leu Ile Ala Ala His Val Leu Ala Leu Gly Tyr Trp Ile Tyr Arg Leu

65 70 75 80

Ala Thr Asp Gly Ser Arg Gln Pro Ala Arg Ser Lys Lys His

85 90

Claims

1.一种蛋白质在植物育种中的应用；

所述蛋白质的氨基酸序列如序列表中序列2所示；

所述育种的目标为获得衰老延迟的植物。

2.一种蛋白质的相关生物材料在植物育种的应用；

所述蛋白质的氨基酸序列如序列表中序列2所示；

所述育种的目标为获得衰老延迟的植物；

所述相关生物材料为下述A1）至A12）中的任一种：

A1）编码所述蛋白质的核酸分子；

A2）含有A1）所述核酸分子的表达盒；

A3）含有A1）所述核酸分子的重组载体；

A4）含有A2）所述表达盒的重组载体；

A5）含有A1）所述核酸分子的重组微生物；

A6）含有A2）所述表达盒的重组微生物；

A7）含有A3）所述重组载体的重组微生物；

A8）含有A4）所述重组载体的重组微生物；

A9）含有A1）所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10）含有A2）所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11）含有A3）所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12）含有A4）所述重组载体的转基因植物细胞系。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：A1）所述核酸分子为序列表中序列1所示的cDNA分子或基因组DNA分子。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

5.一种培育衰老延迟的转基因植物的方法，包括提高受体植物中氨基酸序列如序列2所示的蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的衰老时间迟于所述受体植物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述转基因植物的衰老时间迟于所述受体植物体现在所述转基因植物的株高高于所述受体植物和/或所述转基因植物的叶绿素含量高于所述受体植物。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述提高受体植物中氨基酸序列如序列2所示的蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体植物中过表达氨基酸序列如序列2所示的蛋白质。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述过表达的方法为将所述的蛋白质的编码基因导入受体植物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列如序列1所示。

10.权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物。

11.一种培育耐逆性提高的转基因植物的方法，包括降低受体植物中氨基酸序列如序列2所示的蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物；

所述耐逆性为耐盐性。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物体现在所述转基因植物的株高高于所述受体植物和/或所述转基因植物的耐盐相关基因的表达量高于所述受体植物。

13.根据权利要求11或12所述的方法，其特征在于：所述降低受体植物中氨基酸序列如序列2所示的蛋白质的表达量和/或活性为沉默或抑制受体植物基因组中氨基酸序列如序列2所示的蛋白质的编码基因的表达和/或活性或敲除氨基酸序列如序列2所示的蛋白质的编码基因。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述沉默或抑制受体植物基因组中氨基酸序列如序列2所示的蛋白质的编码基因的表达和/或活性或敲除氨基酸序列如序列2所示的蛋白质的编码基因为突变受体植物基因组所述的蛋白质的编码基因使受体植物基因组所述的蛋白质的编码基因的表达量降低或使受体植物基因组中所述的蛋白质的编码基因发生缺失突变或发生插入突变。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于：所述突变的方式为CRISPR/Cas9或TELLEN技术或T-DNA插入或EMS诱变。

16.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列如序列1所示。

17.权利要求11或12所述的方法，其特征在于：所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物。