JP2004008227A - 複製欠陥組換えレトロウィルス - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 gag/pol遺伝子、およびenv遺伝子のうち1つを欠失する、複製欠陥組換えレトロウィルスであって、該レトロウィルスに感染した標的細胞における発現のためのプロモーターに作動可能に連結された抗原又はその改変形をコードする遺伝子を含むベクター構造体を有し、該抗原又はその改変形が、動物内の免疫応答を刺激可能であり、ここで該レトロウイルスは、該レトロウイルスにより担持されるgag/pol遺伝子およびenv遺伝子のうちの1つを欠失するパッケージング細胞によって産生される、複製欠陥組換えレトロウィルス。
【選択図】 なし
Description
細菌性疾病は一般的に、抗生物質により容易に治療できるけれども、ほとんど効果的でない処置又は予防が多くのウィルス性、癌性及び他の非細菌性疾病、たとえば遺伝的疾病に対して存在する。これらの疾病を治療するための伝統的な試みは、化学的薬物の使用であった。一般的に、これらの薬物は、特異性を欠いており、高い全体的な毒性を示し、そして従って治療的に無効果であった。
i)パッケージング細胞から高い力価の生成;
ii)パッケージング細胞の使用を含まない手段によるベクター構造体のパッケージング;
iii)前もって選択された細胞系のために標的を決定され得る組換えレトロウィルスの生成;及び
iv)細胞のゲノムにおける前もって選択された部位又は複数の部位中へのプロウィルス構造体の組込み。
外来性病原体を認識し、そして定義する能力は、免疫システムの機能の中心である。免疫認識を通して、このシステムは、「非自己」(外来性)と「自己」とを区別することができ、これは欠陥機構が宿主組織に対するよりもむしろ侵入する実在物に向けられることを確保することが不可欠である。免疫システムの基本特徴は、高い多形性細胞表面認識構造物(受容体)及び侵入する病原体の破壊のためのエフェクター機構(抗体及び細胞溶解性細胞)の存在である。
HIV抗原を発現するベクター
A.Env発現ベクター(第1図を参照のこと):
2.7KbのKpn−XhoIDNAフラグメントを、HIVプロウィルスクローンBH1O−R3(たとえば、Ratnerなど.、Nature 313:277、1985)から分離し、そしてIIIexE7deltaenv(Bal31欠失−nt.5496)からの約400bpのSal−KpnIDNAフラグメントを、プラスミドSK+のSalI部位中に連結した。このクローンから、env発現のために不可欠なrevをまたコードする3.1Kbのenv DNAフラグメント(XhoI−ClaI)を精製し、そしてpAFVXM(Krieglarなど.、Cell 38:483、1984を参照のこと)と呼ばれるレトロウィルスベクター中に連結した。このベクターを変性し、すなわち、BglII部位が、HIV envコードDNAフラグメントのクローニングを促進するためにXhoI部位にリンカーの挿入により変えられた。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を誘導するSV40初期プロモータから成る優性の選択可能なマーカー遺伝子を、感染され、そしてトランスフェクトされた細胞系の単離を促進するためにClaI部位でベクター中に挿入した。
2.5KbのSacI−EcoRV DNAフラグメントをpBH1O−R3(Ratnerなど.、op.cit.を参照のこと)から単離し、そしてpUC31のSacI−SalI部位中に連絡した。pUC31は、ポリリンカーのEcoRI及びKpnI部位の間に挿入される追加のXhoI、BglII、BsstII及びNcoI部位を有するpUC19に由来する。しかしながら、この構造物は、HIVからの主要スプライス供与体(SD)部位を含み、そして従ってウィルスの世代において問題を有する。そのSD部位は、2.1KbのClaI−BamHI DNAフラグメント及び70bpのRsaI−ClaIフラグメントをSK+のHincII−BamHI部位中にサブクローンすることによって除去された。BamHI部位を、リンカー挿入によりClaI部位中に転換した。この構造物を、SK+ gagプロテアーゼSDデルタと命名した。
レトロウィルスベクターをコードする抗原に対する免疫応答
ネズミの腫瘍細胞系(B/C10ME)(H−2d)を、HIV envをコードするpAF envr SV40 Neoベクター構造物により感染せしめた。次に、1つのクローン化されたHIV−env発現細胞系(B/C10ME−29)を用いて、同系(すなわちMHCと同一の)のBalb/c(H−2d)マウスにおけるHIV−env−特異的CTLを刺激した。マウスを、B/C10ME−29細胞(4×107個の細胞)による腹膜内注射により免疫化し、そして7〜14日目に追加免疫した。応答物の脾臓細胞懸濁液をこれらの免疫化されたマウスから調製し、そしてその細胞を1:50の刺激物:応答物細胞の比で、B/C10ME−29又はB/C10MEマイトシン−C−処理細胞のいづれかの存在下で4日間インビトロで培養した。そのエフェクター細胞をこれらの培養物から収穫し、計数し、そして標準の4〜5時間の51Cr−開放アッセイにおいて、種々のエフェクター:標的(E:T)細胞比で放射性ラベルされた(51Cr)標的細胞(すなわちB/C10MEenv−29又はB/C10ME)と共に混合した。インキュベーションの後、マイクロタイタープレートを遠心分離し、培養上清液100μlを除き、そして溶解された細胞から開放された放射性ラベルの量を、Beckman γ分光計で定量した。標的細胞の溶解率を次のようにして計算した:%標的溶解率= Exp CPM−SP CPM/MR CPM−SR CPM×100、ここで1分当たりの実験的な計数(Exp CPM)はエフェクター+標的を表わし;自発的な開放(SP)CPMは標的のみを表わし;そして最大の開放(MR)CPMは1MのHClの存在下での標的を表わす。
多くの感染性疾病、癌、自己免疫疾患、及び他の疾病は、ウィルス粒子と細胞、細胞と細胞又は細胞と因子との相互作用を包含する。ウィルス感染においては、ウィルスは通常、敏感な細胞の表面上の受容体を通して細胞に侵入する。癌においては、細胞は、他の細胞又は因子からのシグナルに不適切に応答し、又はまったく応答しない。自己免疫疾患においては、「自己」マーカーの不適切な認識が存在する。本発明においては、そのような相互作用は、相互作用におけるいづれかのパートナーの類似体をインビボで生成することによって阻止され得る。
sCD4ベクター
1.pMV7.T4(Maddonなど.、Cell 47:333、1986)からの1.7KbのEcoRI−HindIII DNAフラグメントを、SK+のHincII部位にブラント末端連結した。
上記技法に類似する技法を用いて、病原体又は遺伝子の機能を阻止することができる物質(又は「緩和剤」)の発現を指図するベクター構造物を有する組換えレトロウィルスを生成することができる。本発明において、「機能を阻止することができる」とは、緩和剤が直接的に、病原体の機能を阻止し、又はたとえば病原体の機能を通常、阻止しない物質から阻止する物質に、細胞に存在する物質を転換することによって、間接的にその機能を阻止することを意味する。ウィルス疾病についてのそのような機能の例は、吸着、複製、遺伝子発現、集合及び感染された細胞からウィルスの退去を包含する。癌性疾病についてのそのような機能の例は、細胞、複製、外部シグナルに対する感受性(たとえば接触阻害)及び抗腫瘍遺伝子の生成の欠乏を包含する。
本発明の1つの観点においては、ベクター構造物は、病原性ウィルス、たとえばHIV(又は病原性遺伝子、たとえば腫瘍遺伝子)のRNAに対するアンチセンスRNAの発現を指図し、それによってその複製又は病原を阻害する。そのような発現は、実質的に連続的であり、又は病原性条件に関係する他の物質(「同定物質」)の細胞における存在に応答して連続的であることができる。他方、その発現は、ベクター侵入の標的の決定により又はベクターにおける組織特異的制御配列により組織特異性であることができる。
AZT及び類似体の抗ウィルス効果を強化するように企画されたベクター
次のレトロウィルスベクターのすべては、「N2」ベクター(Kellerなど.、Nature 318:149〜154、1985を参照のこと)に基づかれている。従って、5’及び3’ EcoRI LTRフラグメント(それぞれ2.8及び1.0Kb)をまず、ポリリンカーを含むプラスミド中にサブクローンし(SK+にサブクローンし、pN2R5〔+/−〕を得;pUC31中にサブクローンし、p31N2R5〔+/−〕及びp31N2R3〔+/−〕を得る)、ベクター構成を促進した。1つの場合、1.2KbのClaI/EcoRI5’LTRフラグメントを、SK+ベクターの同じ部位中にサブクローンし、pN2Cを得た。他の場合、スプライス供与体配列の6bp欠失を含む5’LTRを、1.8KbのEcoRIフラグメントとしてpUC31(p31N25delta〔+〕)中にサブクローンした。HSV−1チミジンキナーゼ遺伝子のコード領域及び転写終結シグナルをプラスミド322TK(pBR322のBamHI中にクローンされたHSVTKの3.5KbのBamHIフラグメント)から1.8KbのBglII/PvuIIフラグメントとして単離し、そしてBglII/SmaIにより消化されたpUC31(pUCTK)中にクローンした。ターミネーターシグナルの欠失を必要とする構造体のために、pUCTKをSmaI及びBamHIにより消化した。残るコード配列及び付着端のBamHIオーバーハングを、次のオリゴマー:5’GAG AGA TGG GGG AGG CTA ACT GAG 3’(配列番号1)及び5’GAT CCT CAG TTA GCC TCC CCC ATC TCT C 3’(配列番号2)から製造された二本鎖オリゴヌクレオチドと共に再構成し、構造体pTKdeltaAを形成した。
(第6図を参照のこと)
1.5KbのXhoI/HindIII 5’LTR及びプラスミド配列を、p31N2R5(+)から単離した。
病原体を阻害するためのもう1つのアプローチは、病原条件を発現する細胞に対して毒性である緩和剤を発現することである。この場合、プロウィルスベクターからの緩和剤の発現は、非病原性細胞の破壊を回避するために病原状態を同定するある細胞内シグナルの存在により制限される。この細胞タイプの特異性はまた、病原条件を有する又はその条件に対して敏感な細胞にベクターを担持する組換えレトロウィルスの標的を決定することによって感染のレベルで付与され得る。
ACV又はその類似体の毒性作用を条件的に強化するためのベクター
ベクターの構成
A.pKTVIHAXの構成(第7図を参照のこと)
1.9.2KbのAsuII/XhoIフラグメントを、ベクターpN2 DNAから単離した。
1.4.5Kbの5’LTR及びベクターを、ベクターp31N25delta(+)からXhoI/BamHIフラグメントとして単離した。
(第9図を参照のこと)
1.中間プラスミドMHM−1の構成:
a)プラスミドpN2CR5を、FoKIにより部分的に消化することにより線状化し、5’オーバーハングをクレノウDNAポリメラーゼを用いてデオキシヌクレオチド三リン酸によりフィルインし、そしてHindIIIリンカーを挿入した。細菌中への形質転換の後、MLV LTR FoKI部位に挿入されたHindIIIリンカーを有するクローンを制限酵素分析により同定した(pN2CR5FH)。
これらのベクターを、tat−依存性HSVTKベクターを試験活性化するために偽−HIVとして使用した。
1.HIV envへのCD4の細胞内結合は、そのタンパク質は膜に結合したまま存続し、そして内因性CD4(これに対して、患者は免疫学的に耐性であるべきである)に構造的に同一であるので、可能性CD4が遊離ウィルスの代役をすることが示されているように、但し系統的なクリアランス及び可能性ある免疫原性の問題を伴わないで、生存性ウィルス粒子の形成を阻害する。
たとえば慢性肝炎又は異種組織、たとえば骨髄の移植における不適切な又は所望しない免疫応答の特異的ダウン−レギュレーションは、抗−MHCクラスI遺伝子、たとえば免疫抑制ウィルス遺伝子を用いて構成され得る。グループCのアデノウィルスAd2及びAd5は、ウィルスのE3領域にコードされる19Kdの糖タンパク質(gp19)を有する。このgp19分子は、細胞の小胞体におけるクラスIMHC分子に結合し、そして細胞表面へのクラスIMHCの末端グリコシル化及び翻訳を妨害する。たとえば、骨髄移植の前、供与体骨髄細胞は、gp19の発現に基づいて、MHCクラスI移植抗原の表面発現を阻害するgp19−コードベクター構造体により感染され得る。これらの供与体細胞は、移植片拒絶の低い危険性を伴って移植され得、そして移植患者のために最少の免疫抑制法を要する。これは、許容できる供与体−受容体キメラ状態のより少ない複雑性を伴っての存在を可能にすることができる。類似する処置を使用して、いわゆる自己免疫疾患、たとえばエリテマトーデス、多発性硬化症、リウマチ様関節炎又は慢性B型肝炎の範囲を処理することができる。
ある同定物質に応答して、細胞中に緩和剤を発現する上記技法はまた、同定タンパク質を発現する細胞中の特定の遺伝子(たとえば特定のウィルスにより担持される遺伝子)の検出を可能にし、そして従って、そのウィルスを担持する細胞の検出を可能にするように変性され得る。さらに、この技法は、ウィルスに関連する同定タンパク質を担持する細胞の臨床サンプルにおけるウィルス(たとえばHIV)の検出を可能にする。
HIV−特異的マーカーシステム又はアッセイ
A.構造体
HIV発現システムの制御下でのレポーター構造体は、第12図(組換えレトロウィルスベクター)及び第13図(トランスフェクションにより使用される単純なプラスミド)に示される。これらの好ましいベクター及びレポータープラスミドの断片は次の通りにして得られた:
レトロウィルス主鎖は、構造体pAFVXM(Kriegerなど.、Cell 38:384、1984)に由来し、これはXhoI及びClaIを用いて線状化されている。SV2neoを、1.8KbのClaIフラグメントの単離により、プラスミドpKoneo(Hanahen、未公開)から得た。
B.指示細胞及びレトロウィルスベクター
ヒトT細胞(H−9、CEM及びSupI)及び単球(U−937)細胞系を、ATCCから得、そして10%のウシ胎児血清及び1%ぺニシリン/ストレプトマイシンにより補足されたRPMI 1640培地に維持した。
安定細胞系をHIV(HTLVIIIB)により感染せしめ、そしてその細胞(β−gal)又は培地(アルカリホスファターゼ)を、感染の後、6日間、毎日アッセイした。
感染された細胞を、次のいづれかによりアッセイした:
(i)MacGregorなど.(Somatic Cell and Mol.Genetics 13:253、1987)により記載されるような現場組織化学的染色;又は(ii)基質としてONPGを含む溶液酵素アッセイにおける細胞抽出物を用いて(Norton及びCoffin、Mol.Cel.Biol. 5:281、1985)。
培地を感染された細胞から除き、10秒間、マイクロ遠心分離し、そして次に68℃に10分間加熱し、内因性ホスファターゼを破壊した。次に、その培地を2分間マイクロ遠心分離し、そしてアリコート(10〜50μl)をアッセイのために除去した。緩衝液(1Mのジエタノールアミン、pH9.8;0.5mMのMgCl2;10mHのL−ホモアルギニン)100μlを添加し、そして次に120mMのp−ニトロフェニルホスフェート(緩衝液中)20μlを添加した。その反応混合物のA405を、自動プレート読取機を用いてモニターした。
本発明のこの観点は、パッケージング細胞から低い組換えウィルス力価の主要原因及びこれらの原因を修正するための技法の発見に一部基づかれる。基本的には、少なくとも5種の要因が、低い組換えウィルス力価のための原因として仮定される:
1.ウィルスパッケージングタンパク質の制限された利用性;
2.レトロウィルスベクターDNAゲノムの制限された利用性;
3.組換えレトロウィルスの発芽のための細胞膜の制限された利用性;
4.レトロウィルスベクターゲノムの制限された本質的なパッケージング効力;及び
5.与えられたレトロウィルスのエンベロープに対して特異的な受容体の密度。
高レベルのパッケージングタンパク質を製造するように企画されたプラスミド(第7図)
1.アンフォトロープ性envセグメントを含むpAMA(Millerなど.、Mol.Cell.Biol. 5:431、1985)からの2.7KbのXbaIフラグメントを、XbaI部位でpUC18中にクローン化し、次にHindIII及びSmaIにより除去した。このフラグメントを、HindII及びPvuIIにより切断されたベクターpRSV neo(Gormanなど.、Mol.Cell.Biol. 2:1044、1982;Southernなど.、J.Mol.Appl.Genet. 1:327、1982)中にクローンし、pRSV envを得た。フィルインされたBstEII末端を有するプラスミドpUT507(Mulsantなど.、Somat.Cell.Mol.Genet. 14:243、1988)からの0.7KbのBamHI〜BstEIIフラグメントは、phleo耐性コード配列を担持する。4.2KbのBamHI〜XhoIフラグメント、RSVenvからの隣接する1.6KbのXhoI〜XbaI(フィルインされたXbaI)及びphleoフラグメントを連結し、pRSVenv−phleoを得た。
エンベロープ置換
gag、pol及びenv機能を別々に発現する能力は、これらの機能の独立した操作を可能にする。十分な量のgag polを発現する細胞系が、envに関する力価の問題を提供するために使用され得る。低い力価をもたらす1つの要因は、標的細胞又は組織上での適切な受容体分子の密度である。env発現が別の単位から付与される場合、種々の源からの種々のエンベロープ遺伝子(異なった受容体タンパク質を必要とする)、たとえばキセノトロープ性、ポリトロープ性又はアンフォトロープ性envが、特定の標的組織に対する最高の力価について試験され得る。さらに、非ネズミレトロウィルス源からのエンベロープが、ベクターを偽型にするために使用され得る。さらに、ハイブリッドエンベロープ(下記に説明される)が、レトロウィルスベクターの同性を合せ(そして力価を効果的に高める)るために、このシステムにおいて同様に使用され得る。逆に、十分な量の与えられたエンベロープ遺伝子を発現する細胞系が、gag及びpolに関する力価の問題を提供するために使用され得る。
2種の追加の他のシステムがベクター構造体を担持する組換えレトロウィルスを生成するために使用され得る。これらのシステムのそれぞれは、昆虫ウィルス、バキュロウィルス及び哺乳類ウィルス、ワクシニア及びアデノウィルスが多量のいづれか一定のタンパク質を製造するために最近適合された(このためにはその遺伝子がクローンされている)事実を利用する。たとえば、Smrithなど.(Mol.Cell.Biol. 3:12、1983);Picciniなど.(Meth.Enzmology,153:545、1987);及びMansourなど.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:1359、1985)を参照のこと。
1.Smrithなど.(前記)により記載されたのと類似する態様でバキュロウィルスシステムにおいて製造されたgag/pol及びenvタンパク質(又は他のタンパク質生成システム、たとえば酵母又はE.コリにおいて);
2.既知のT7又はSP6又は他のインビトロでのRNA生成システムにおいて製造されたウィルスベクターRNA(たとえばFlamant及びSorge, J.Virol.62:1827、1988を参照のこと);
3.(2)におけるようにして製造され又は酵母又は哺乳類組織培養細胞から精製されたtRNA;
4.リポソーム(固定されたenvタンパク質を有する);
5.envプロセッシング及びいづれか又は他の必要な細胞由来機能を提供する細胞抽出物又は精製された必要な成分(固定される場合)(典型的にはマウス細胞から)。
レトロウィルスの宿主細胞範囲特異性を、env遺伝子生成物により一部決定する。たとえば、Coffin.J.(RNA Tumor Viruses 2:25〜27、Cold Spring Harbor、1985)は、ネズミ白血病ウィルス(MLV)及びRous Sarcomaウィルス(RSV)からのタンパク質の細胞外成分が特定の受容体結合を担当することを示す。他方、エンベロープタンパク質の細胞質ドメインは、ビリオン形成の役割を演ずることが理解されている。偽型化(すなわち他の種のウィルスタンパク質による1つの種からのウィルスRNAのカプシド化)が、低い頻度で生じる場合、エンベロープタンパク質は、与えられたレトロウィルスのビリオン形成のためにある特異性を有する。本発明は、ハイブリッドenv遺伝子生成物(すなわち、特に、天然において同じタンパク質分子に存在しない細胞質領域及び外因性結合領域を有するenvタンパク質)を創造することによって、宿主範囲の特異性は、細胞質機能かち独立的に変更され得ることを示す。従って、前もって選択された標的細胞に特異的に結合するであろう組換えレトロウィルスが生成され得る。
ハイブリッドHIV−MLVエンベロープ
ハイブリットエンベロープ遺伝子を、連結の適切な点に新しい制限部位を導入するためにインビトロ突然変異誘発(Kunkel, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488〜492、1985)を用いて調製する。他方、2種のエンベロープ配列が同じプラスミド上に存在する場合、それらは、インビトロ突然変異誘発を用いていづれか所望する点に直接連結され得る。いづれの場合でも、最終結果物は、HIV gp160の5’末端及びMLB p15Eの3’末端を含むハイブリッド遺伝子である。その得られた組換え遺伝子により発現されるハイブリッドタンパク質は第18図に示され、そしてHIV gp41の細胞外部分(gp120結合領域及び融合領域)、HIV gp120(CD4受容体結合タンパク質)及びMLV p15Eの細胞質部分並びに宿主膜内のいくつかの点のいづれかで存在する連結部を含む。第18図に示される新規のEcoRI部位での融合により製造されるハイブリッド遺伝子は、ヒトSupTI細胞におけるCMVIE遺伝子の制御下で発現され、そして真のHIV env遺伝子によくあることであるが、シンシチアを導く。従って、そのハイブリッドは、細胞表面に正しく運ばれ、そしてそこで表示される。
染色体上の予定された位置へのレトロウィルスベクターの目標決定は、遺伝子送出しシステムの利益を高める。高い安定性が染色体上の「安全な」スポットヘの直接的な組込みにより得られ、すなわちベクターの挿入から有害な結果を有さないことが証明された。もう1つの可能性ある利益は、染色体の「開放」領域に遺伝子を向ける能力であり、ここでその発現は最大にされる。特定の部位にレトロウィルスを組込むための2種の技法が下記に示される。
標的細胞のDNAにおける特定の部位中に組換えレトロウィルスのベクター構造体の外因性遺伝子を組込むための1つの技法は、相同性組換え法を使用する。ゲノム配列に相同である約300bp以上のDNA配列を含むプラスミドは、そのような相同性の不在下での特定の相互反応にわたって103倍以上の割合で、それらのゲノム配列と相互作用(置換又は挿入により)することが示された(Thomas及びCapecchi, Cell 51:503〜12、1987;及びDoetschemanなど.、Nature 330:576〜78、1987を参照のこと)。挿入又は置換は、ベクターの特定の企画により操作され得ることが示された。
標的細胞のゲノムの前もって選択された特定の部位にベクター構造体を組込むためのもう1つの技法は、インテグラーゼ変性を包含する。
レトロウィルスベクターのヘルパー系生成に関してこれまで記載された2つの問題は:(a)多量のベクターの生成の困難性;及び(b)ベクターを製造するために一次細胞の代わりに永久的な細胞を使用する現在の必要性である。これらの問題は、トランスジニック動物に生成される生産体又はパッケージング系により克服され得る。これらの動物は、パッケージングゲノム及びレトロウィルスベクターゲノムを担持する。現在の技法は、一次細胞でのパッケージング細胞系及び所望するベクター産生系の生成をそれらの制限された寿命期間のために可能としない。現在の技法は、一次細胞の使用を排除する広範な特徴づけが必要である。しかしながら、トランスジニック動物の個々の細胞系は、パッケージング機能、たとえばgag、pol又はenvを生成する本明細書に提供される方法により生成され得る。次にこれらの動物の細胞系は、パッケージング機能を転写するハウスキーピング又は組織特異性プロモーターの選択的な使用を通して完全な動物又は標的を定められた組織のいづれかにおける発現のために特徴づけられる。送出されるべきベクターもまた、組織特異的プロモーター又はハウスキーピングプロモーターを有するトランスジニック動物系に挿入される。上記で論じたように、ベクターは、5’LTRのU3領域を置換するそのようなプロモーターを排除され得る(第19図)。このトランス遺伝子は、その発現において誘発性であり、又は遍在性である。しかしながら、このベクターはパッケージされない。次にこれらの動物系は、gag/pol/env動物と交配され、そして続く子孫がパッケージされたベクターを生成する。実質的に同一であるそれらの子孫が特徴づけられ、そして一次産生細胞の無限な源を提供する。他方、gag/pol及びenvを製造し、そしてトランスジニック動物に由来する一次細胞は、一次細胞産生系を製造するためにレトロウィルスベクターにより多量、感染され又はトランスフェクトされ得る。多くの異なったトランスジニック動物又は昆虫、たとえばマウス、ラット、鶏、豚、ウサギ、牛、羊、魚及びハエは、それらのベクターを産生することができる。そのベクター及びパッケージングゲノムは、組織特異性プロモーター及び種々のエンベロープタンパク質の使用により、種感染特異性及び組織特異性発現のために適合される。そのような方法の例は、第20図に示される。
トランスジニック動物における遍在性発現のためにハウスキーピングプロモーターを用いてのGag−Polタンパク質の産生
十分に特徴づけられたハウスキーピングプロモーターの例は、HPRTプロモーターである。HPRTは、すべての組織において発現するプリンサルベージ酵素である(Patelなど.、Mol.Cell Biol. 6:4〜403、1986及びMeltonなど.、Proc.Natl.Acad.Sci. 81:2147〜2151、1984を参照のこと)。このプロモーターは、組換えDNA技法(Maniatisなど.、Molecular Cloning:A Laborator Manual, Cold Spring Harbor、1982を参照のこと)を用いて、Bluescriptプラスミド(Strategene, Inc.)でクローンされる種々のgag/polフラグメント(たとえばBalI/ScaI;AatII/ScaI;MoMLVのPstI/ScaI;RNA Tumor Viruses 2、1985 Cold Spring Harbor Laboratory、1985を参照のこと)の前に挿入される。その得られたプラスミドを精製し(Maniatisなど.、op.cit.)、そして適切な遺伝子情報をGeneclean(Bio 101)又はエレクトロエルーシヨン(Hoganなど.(出版社)Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual. Cold Spring Habor、1986を参照のこと)を用いて分離する。
トランスジニック動物における遍在性発現のためにハウスキーピングプロモーターを用いてのenvタンパク質/ハイブリッドエンベロープタンパク質の産生
この例は、エンベロープ又はハイブリッドエンベロープタンパク質のいづれかの発現のためにHPRTプロモーターを使用する。このエンベロープタンパク質は、MLLの場合において、適切なgag−polを補うことができるいづれかのレトロウィルスからである。例は、エコトロピックMLV、アンフォトロピックMLV、キセノトロピックMLV、ポリトロピックMLV又はハイブリッドエンベロープである。上記のように、エンベロープ遺伝子は、組換えDNA技法(Maniatisなど.、op.cit.を参照のこと)を用いて、HPRTプロモーターの後ろにクローンされる。得られた「小遺伝子(minigene)」は単離され(Hoganなど.、op.cit.を参照のこと)、そしてエンベロープタンパク質の発現が決定される(Harlowなど.、op.cit.)。トランスジニックエンベロープ動物を、十分に特徴づけられたエンベロープ動物を得るために、ホモ接合度に繁殖せしめる。
トランスジニック動物における遍在性発現のためにハウスキーピングプロモーターを用いてのgag−pol−env動物の産生
これは、十分に特徴づけられたgag−pol動物及び永久的なgag−pol/エンベロープ動物系の確立のための動物を使用する。これは、ホモ接合度への繁殖及び十分に特徴づけられた系統の確立を包含する。次に、これらの系統は、組織培養においてパッケージングベクターのために使用され得る一次マウス胚系を得るために使用される。さらに、レトロウィルスベクターを含む動物は、この系統中に繁殖される。
トランスジニック動物におけるgag−pol−env又はハイブリッドエンベロープの組織特異性発現の産生
この例は、特定の組織、たとえばT細胞へのgag pol、エンベロープ又はハイブリッドエンベロープの組織発現を指図することである。これは、位置及びコピー数を付与されているCD2配列(Langなど.、EMBO J. 7:1675〜1682、1988を参照のこと)の使用を包含する。CD2遺伝子からの1.5KbのBamHI/HindIIIフラグメントを、組換えDNA技法を用いてgag−pol、エンベロープ又はハイブリッドエンベロープフラグメントの前に挿入する。これらの遺伝子を、マイクロインジェクションにより受精されたマウスの卵子中に注入する。トランスジニック動物を前のようにして特徴づける。T細胞の発現を確立する。動物をホモ接合度に繁殖し、トランスジニック動物の十分に特徴づけられた系統を確立する。Gag−pol動物とエンベロープ動物とを接合し、T細胞のみを発現するgag−pol−env動物を得る。次に、これらの動物のT細胞は、レトロウィルスベクターをパッケージングできるT細胞のための源である。再び、ベクター動物とこれらのgag−pol−env動物とを交配し、ベクターを発現するT細胞を得る。
トランスジニック動物におけるハウスキーピング又は組織特異性レトロウィルスベクターのいづれかの産生
トランスジニック動物の生殖系中へのレトロウィルス又はレトロウィルスベクターの挿入は、ほとんど又はまったく発現をもたらさない。Jaenisch(Jahnerなど.、Nature 298:623〜628、1982を参照のこと)により記載されるこの結果は、5’レトロウィルスLTR配列のメチル化によるものである。
Claims (1)
- gag/pol遺伝子、およびenv遺伝子のうち1つを欠失する、複製欠陥組換えレトロウィルスであって、該レトロウィルスに感染した標的細胞における発現のためのプロモーターに作動可能に連結された抗原又はその改変形をコードする遺伝子を含むベクター構造体を有し、該抗原又はその改変形が、動物内の免疫応答を刺激可能であり、ここで該レトロウイルスは、該レトロウイルスにより担持されるgag/pol遺伝子およびenv遺伝子のうちの1つを欠失するパッケージング細胞によって産生される、複製欠陥組換えレトロウィルス。
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