JP2004535151A - ウイルス性成分の活性および/または特異性の評価に対する新システム - Google Patents
ウイルス性成分の活性および/または特異性の評価に対する新システム Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004535151A JP2004535151A JP2002533910A JP2002533910A JP2004535151A JP 2004535151 A JP2004535151 A JP 2004535151A JP 2002533910 A JP2002533910 A JP 2002533910A JP 2002533910 A JP2002533910 A JP 2002533910A JP 2004535151 A JP2004535151 A JP 2004535151A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- viral
- sequence
- gene
- cells
- transgenic animal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 25
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 title claims abstract description 10
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 title claims description 7
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 196
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 126
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 118
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 107
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 95
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 76
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 74
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims abstract description 39
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 15
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims abstract description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 173
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 95
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 claims description 91
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 82
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 claims description 80
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 59
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 29
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 27
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims description 25
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 21
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 16
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 claims description 15
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims description 15
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 14
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims description 14
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 9
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 8
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 claims description 8
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 claims description 7
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 claims description 7
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 claims description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 5
- 206010010099 Combined immunodeficiency Diseases 0.000 claims description 5
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 claims description 5
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 5
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 claims description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 4
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims description 4
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 claims description 3
- 101000632319 Homo sapiens Septin-7 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100027981 Septin-7 Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 claims description 3
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 claims description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 abstract description 33
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 210
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 43
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 43
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 36
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 28
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 26
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 26
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 25
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 20
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 16
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 13
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 12
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 description 12
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 11
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 11
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 description 4
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 4
- 102100034353 Integrase Human genes 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 108010078428 env Gene Products Proteins 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 102000000412 Annexin Human genes 0.000 description 3
- 108050008874 Annexin Proteins 0.000 description 3
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 3
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000714266 Bovine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 description 2
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 description 2
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 2
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 2
- 108010020076 Cytochrome P-450 CYP2B1 Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000713800 Feline immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 241000714165 Feline leukemia virus Species 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 2
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 235000019013 Viburnum opulus Nutrition 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 230000005101 cell tropism Effects 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 description 1
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 description 1
- 102000003849 Cytochrome P450 Human genes 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000713813 Gibbon ape leukemia virus Species 0.000 description 1
- 102000030595 Glucokinase Human genes 0.000 description 1
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 1
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 description 1
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 description 1
- 241000712899 Lymphocytic choriomeningitis mammarenavirus Species 0.000 description 1
- 241000713821 Mason-Pfizer monkey virus Species 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 1
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000713311 Simian immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108700042075 T-Cell Receptor Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 235000010724 Wisteria floribunda Nutrition 0.000 description 1
- 239000003470 adrenal cortex hormone Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 1
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 108091005948 blue fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229960001714 calcium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- RKHQGWMMUURILY-UHRZLXHJSA-N cortivazol Chemical compound C([C@H]1[C@@H]2C[C@H]([C@]([C@@]2(C)C[C@H](O)[C@@H]1[C@@]1(C)C2)(O)C(=O)COC(C)=O)C)=C(C)C1=CC1=C2C=NN1C1=CC=CC=C1 RKHQGWMMUURILY-UHRZLXHJSA-N 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 210000001771 cumulus cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 108010027225 gag-pol Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 108091008039 hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 1
- 210000004293 human mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 108700041430 link Proteins 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 244000309711 non-enveloped viruses Species 0.000 description 1
- 238000013421 nuclear magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000019263 trisodium citrate Nutrition 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 210000001177 vas deferen Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
- A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0337—Animal models for infectious diseases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
- C12N2740/13041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/13043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/15—Vector systems having a special element relevant for transcription chimeric enhancer/promoter combination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
- C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
- C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
- C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
- C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本発明は、活性および/または調節配列あるいはウイルス性成分の特異性を評価する方法に関するものであり、ウイルス性ベクターは、染色体内に1あるいはそれ以上のウイルス性配列を含む遺伝子組み換え非ヒト動物の細胞に導入される。しかしながら、上記遺伝子組み換え動物は、ウイルスの生成に必要なウイルス性配列を少なくとも1つ欠乏している。このウイルス性配列は、遺伝子組み換え動物の細胞に導入されたウイルス性ベクターを含んでおり、これによって、遺伝子組み換え動物におけるウイルス性粒子が複製する。遺伝子組み換え動物を適切な条件下で維持することで、ウイルス性粒子の生成、ウイルス性粒子が生成する細胞が、それぞれ検出され、評価される。本発明の方法はまた、動物のリガンドに対するレセプターの分布の評価に適用させることができる。本発明ではまた、本発明にかかる方法を用いた遺伝子組み換え非ヒト動物を提供する。
Description
本発明は、活性および/または調節配列またはウイルス性成分の特異性を評価する方法に関するものであって、ウイルス性ベクターは、ゲノム内に1あるいはそれ以上のウイルス性配列を含んでいる遺伝子組み換え非ヒト動物に導入されている。しかしながら、上記遺伝子組み換え動物は、ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を少なくとも1つ欠乏している。このウイルス性配列は、遺伝子組み換え動物の細胞内に導入されたウイルス性ベクターに含まれ、これにより、遺伝子組み換え動物におけるウイルス性粒子が複製される。遺伝子組み換え動物を適切な条件下で維持すると、ウイルス性粒子が生成され、このウイルス性粒子が生成された細胞は、それぞれ、検出され、評価される。本発明にかかる方法はまた、動物のリガンドに対するレセプターの分布の評価に適用することもできる。本発明はまた、本発明にかかる方法において適用可能な遺伝子組み換え動物を提供する。
【0001】
発明の背景
遺伝子治療のためのウイルス性ベクターの使用、特にレトロウイルス性ベクターの使用は、現在、アメリカ合衆国およびヨーロッパの両者における様々な承認議定書の中で、治療的遺伝子を転用した選択方法として注目されている。(Kotani, H. et al. 1994, Human Gene Therapy 5:19−28)。しかしながら、これら議定書の多くが、生体内に生じ、治療的遺伝子を持っているレトロウイルス性ベクターと一体となった標的細胞の感染を必要としている。そして十分に感染された細胞が、影響を受けた個々の細胞に戻される (Rosenberg et al. 1992, Human Gene Therapy 3: 75−90; Anderson, W. F. 1992, Science 256: 808−813)。このような生体外での遺伝子治療手順は、標的細胞固体群(例えばリンパ球)が容易に単離されるといった、医学的条件の下での調整として理想的である。さらに、標的細胞の生体外感染は、使用前に安全性が厳密に調べられることで、濃縮されたウイルスの多量投与を可能にする。
【0002】
残念ながら、容易に単離され、培養され、そして再び導入される標的細胞を含み、遺伝子治療のために応用可能な断片(fraction)はない。さらに、生体外遺伝子治療の複雑な技術およびこれに関連した高いコストが、事実上、生体外遺伝子治療の世界的で広範囲に渡る普及を妨げている。将来、容易で費用効果のある遺伝子治療のために、細胞を生成するレトロウイルス性ベクターの注入あるいは簡単な移植の形で、患者にウイルス性ベクターあるいはウイルス性ベクターを生成する細胞を直接投与するといった生体内での取り組みが必要であろう。
【0003】
この種の生体内での取り組みは、当然、様々な新しい問題をもたらす。まず、そしてとりわけ、安全性に注意を向けなければならない。ウイルスはおそらく、ウイルス生成細胞の移植から生成されるので、生成されたウイルスを事前に点検する機会はないだろう。そのような系の使用に含まれる、限られた危険性の認識およびこの危険性を最小限にする新しい系の構築が重要である。
【0004】
治療的な目的のためのレトロウイルス性ベクター自体は、一般的に、レトロウイルス性タンパク質をコードする遺伝子が、標的細胞に転移されるべき治療的遺伝子およびマーカー遺伝子に置き換わった、修飾されたベクターである。レトロウイルス性タンパク質をコードする遺伝子の置き換えによって、ウイルスは事実上ウイルスを無能にし、このウイルスの複製は不完全となる。このウイルスは、ウイルス性を欠乏しているタンパク質に修飾されたレトロウイルスを提供する成分によって救済されなければならない。この成分は、一様に多量のウイルス性タンパク質を生成する細胞株であるが、複製成分ウイルスを生成する能力を欠乏している。この細胞株は、パッケージング細胞株(packaging cell line)として知られており、パッケージングされる、修飾されたレトロウイルス性ベクターを可能にする遺伝子を持つ第2プラスミドによって形質移入された細胞からなる。
【0005】
パッケージベクター(packaged vector)を生成するために、ベクタープラスミドは、パッケージング細胞株内に形質移入される。これらの条件下で、治療遺伝子およびマーカー遺伝子の挿入された修飾レトロウイルス性ゲノムは、ベクタープラスミドから複写され、修飾されたレトロウイルス性粒子(組み換え型ウイルス性粒子)内にパッケージングされる。この組み換え型ウイルスは、それから、標的細胞を感染するために用いられる。この標的細胞内で、ベクター遺伝子および運搬されたマーカー遺伝子あるいは治療的遺伝子は、標的細胞のDNAに組み込まれる。なぜなら、そのような組み換え型ウイルス性粒子によって感染された細胞には、すべてのレトロウイルス性タンパク質が存在しないからである。しかしながら、治療的遺伝子およびマーカー遺伝子を持つベクターのDNAは、DNA細胞内に組み込まれ、感染細胞にて発現する。
【0006】
生体内での遺伝子治療の使用および安全性を実用的な点から考える上で、次に考えなくてはならないのが、レトロウイルス性ベクターのターゲティングである。ベクターによって運搬される治療的遺伝子は、すべての組織および細胞内で分別なく発現されるべきではなく、むしろ必須の標的細胞内でのみ発現されるべきであるということは明らかである。このことは、特に、特定の腫瘍細胞の除去を対象とした、転移される遺伝子が毒性遺伝子あるいは自殺遺伝子である場合に重要である。他の標的とならない細胞の除去は、当然、極めて望ましくない。
【0007】
運搬された治療的遺伝子のターゲティングを行う、多数のレトロウイルス性ベクターシステムが記述されている(Salmons, B. and Guenzburg, W. H. 1993, Human Gene Therapy 4: 129−141)。これら取り組みの多くは、予め定められた細胞型に限った感染、あるいは、より多くは、特定の細胞型に対する非相同的な治療的遺伝子、あるいはマーカー遺伝子に関連した、非相同的な治療的遺伝子を用いるものである。しかしながら、遺伝子の発現の真核生物的調整(eucaryoticregulation)は、未だ完全に解明されていないほど非常に複雑な工程である。遺伝子の発現を制御しているDNA配列は、“調節配列”と呼ばれている。これらの配列は、一般的に、プロモーターからなる。そしてこのプロモーターにおいて、通常の転写因子、ポリメラーゼ集合体および遺伝子がタンパク質を調節する配列が、プロモーターにおける集合過程の速度を制御するために結合する。プロモーターは、一般に、遺伝子の5’末端に即座に見出される。制御タンパク質が結合する配列は、これにより、遺伝子の転写の活性や抑制を行い、さらに、遺伝子の上流に位置し、”エンハンサー”および/または”サプレッサー”と呼ばれる。高等真核生物においては、50000以上のヌクレオチド対に亘る、点在した遺伝子の調節配列を見出すことは例外的である。けれども、このDNAのほとんどが、”スペーサー”とよばれる配列であり、遺伝子制御タンパク質によって認識されない。
【0008】
調節配列がベクター内で遺伝子の発現を引き起こすために用いられるとすれば、レトロウイルス性ベクターの限られた受容のために、核酸配列の短い伸長のものだけがベクター内に導入される。したがって、調節配列の部分だけが、ベクター内のマーカー遺伝子の発現や、治療遺伝子の発現を引き起こすために使用される。レトロウイルス性ベクター、例えば、遺伝子治療に使用可能な調節配列を得るためには、上記調節配列内の領域は、調節配列の通常の機能、特に組織特異性のために必要な領域と同じでなければならない。調節配列の活性および組織特異性を定義する精密な配列のモチーフについての知識によって、特有な応用、例えば、遺伝子治療のための最適なプロモーターの設計が可能になる。
【0009】
しかしながら、制御領域の本質的な領域については、限られた情報しか利用できない。核酸配列に基づく機能的ドメインを予測するコンピューターモデルは利用できるが、それは予測に過ぎない。実際の機能的ドメインは異なっているかもしれなく、あるいは、単にモチーフが未だ知られていないだけかもしれない。他の方法はフットプリント法のようなタンパク質結合解析に基づいており、制御領域内の機能的な配列は、この機能的な配列と結合するタンパク質によって示される。しかしながら、この方法は、これらの配列モチーフが必須、あるいは補助的なエンハンサーやサイレンサーである場合には、この方法によってタンパク質はこれらの配列モチーフの機能と結びつかない。現在のところ利用可能であり、最も有用な調節配列の解析方法は、レポーター遺伝子解析である。この方法によれば、プロモーターの原型あるいは変異体は、レポーター遺伝子の上流で融合している。すなわち、レポーター遺伝子の中を進んだプロモーターにおいて転写を開始させるために、遺伝子は測定可能なタンパク質あるいはタンパク質活性を簡単にコードする。引き続いて、構成は細胞培養系の生細胞内に形質移入され、レポータータンパク質の量および/または活性度が決定される。しかしながら、細胞培養系における細胞は、自然状態の細胞に比べて弱いことが多い。ほとんどの細胞が不死化している、すなわち、制限されない経路の数に亘って培養することができる。しかしながら、どの経路でも細胞の特性は変化し、これら細胞は、これら細胞自身に由来する器官の典型でなくなってしまう。たとえ細胞が器官から単離されて間もない細胞、すなわち、器官の細胞と似た細胞であっても、取り囲む細胞や、自然な細胞外基質といった自然系を欠いているからである。その結果、レポーター遺伝子構成は、自然系内と同じように作用しない。したがって、自然系においてプロモーターが特異的因子の存在下で活性であっても、ある場合には細胞培養系において検査されたレポーター遺伝子構成は、逆に不活性である。したがって、生体内におけるレポーター遺伝子解析の結果は、しばしば、誤って導かれる。
【0010】
結果として、最終的な結果を得るためには、実験動物による生体内での研究が必要である。仮に異なる細胞型でにおけるプロモーターの活性が解析されれば、調節配列に関与する遺伝子組み換え動物が使用される。遺伝子組み換え動物は、例えば、マイクロインジェクション、すなわち1細胞分裂胎芽(1−cell stage)内への異種遺伝子構成の注入、または、移植前胎芽の、レトロウイルス性ベクターDNA(Gordon J. et. al. 1980, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 77: 7380−7384, Jaenisch R. et al. 1983, Cell 32: 209−216)の注入によるものである。結果として、胎芽は、さらに、受容者となる養母の卵管/子宮に移転された後、満期になるまで発育する。結果として成熟した動物のいくらかは、ゲノム内に組み込まれた非相同的なDNAを有している。仮に、遺伝子線細胞(germ line cells)(卵あるいは精子)が修飾されれば、上記遺伝子細胞から発達する、すべての動物は、遺伝子細胞を含んでいる体内のすべての細胞に、異質な核酸配列を含み、そしてこの核酸配列を、その子孫となる細胞に受け渡す。そのような生殖細胞系が修飾された動物は、”遺伝子組み換え”と呼ばれ、遺伝子組み換えされた異質のDNAは、”遺伝子組み換え遺伝子”と呼ばれる。遺伝子組み換え動物は決まってほとんどが特別な実験室で生成され、困難な工程であり、時間や費用がかかり、最初の試みによって単一の遺伝子組み換え動物を生成するのに失敗するため、時には繰り返さなければならない。したがって、遺伝子組み換え動物の生成に基づくプロモーターの解析にはかなりの労力が必要であり、それゆえ、1あるいは非常に限られた数のプロモーターに対してしか実施することができない。
【0011】
プロモーター活性の解析のために、遺伝子組み換え動物の生成を回避するために、他の方法を試した:プロモーターレポーター遺伝子構成を持つレトロウイルス性ベクターで動物を感染した。レトロウイルス性のライフサイクルにしたがって、レトロウイルス性ベクターは細胞に入り、細胞のゲノム内に組み込まれ、そして、その結果、調節配列が活性な、それらの細胞内にレポーター遺伝子が発現した。しかしながら、生体内での形質移入では、実験および治療を目的として使用される、安全なレトロウイルス性ベクターの性能は非常に低かった。それゆえ、散発的な細胞のみが結果として遺伝子組み換えされず、そしてそれゆえレポーター遺伝子を発現せず、多数の細胞に取り囲まれたレポーター遺伝子を発現する単一の細胞に形質移入される。しかしながら、感染された細胞の数が少ないために、レポーター遺伝子活性を検出するのは困難となってしまう。特に関与する調節配列がある組織において全く不活性であり、発現レベルが低く、それゆえ検出されない状態で区別するのが難しい。たとえレポーター遺伝子の発現が高いとしても、感染した細胞は見落とされるであろう。したがって、調節配列は、レトロウイルス性ベクター内にプロモーターレポーター遺伝子構成を導入することによって解析されることはない。
【0012】
予め判っている細胞型に対しての、遺伝子の輸送のターゲティングにおけるさらなる問題は、包囲されたウイルスの感染範囲であろう。包囲されたウイルスの感染範囲は、ウイルス性表面タンパク質遺伝子(”env−遺伝子”)によってコードされたウイルス性表面タンパク質と、レセプターとして作用する宿主細胞膜タンパク質との相互作用によって決定される。ウイルス由来のベクターは、ウイするの感染範囲が修飾されない限り、本来のウイルスが行うように、同じ細胞型内に遺伝子を運搬する。感染のレベルにおいてウイルスの能力を標的の特定の細胞型に結合する方法は、ウイルスの核および遺伝子情報を持つであろう“偽型”のウイルス粒子を生じさせることであり、制限された感染範囲を含む他のウイルスの表面タンパク質を生じさせることである。またウイルス性の表面タンパク質の修飾は、特定の細胞の標的感染となるであろう:ヒトの細胞が、ウイルス性表面タンパク質の結合配列と機能的に相互作用するレセプターを発現しないため、狭宿主性のレトロウイルスは、ヒトの細胞を感染させない。ウイルス性表面タンパク質の結合領域にレセプターリガンド(Kasahara et al. (1994), Science 266, 1373−1376)やその機能的な断片(Valsesia−Wittmann et. al. (1996), J. Virol. 70, 2059−2064)あるいはモノクローナル抗体(Russel et al, (1993), Nucl. Acids Res. 21, 1081−1085) を挿入すると、特定の細胞型に対して対応したレセプターを発現する、修飾されたレトロウイルスの特定の標的となる。
【0013】
安全性の面から、ウイルスを持つベクター(例えば、毒性のある治療遺伝子は、必要な標的細胞だけしか感染させない)を確保するために、ウイルスの感染範囲を予測することが非常に望ましい。さらには、細胞レセプターあるいは細胞リガンドの組織および細胞型分布を決定する系を有することが望ましい。
【0014】
発明の目的
本発明の目的は、組織および/または腫瘍に特異的であり、非相同性の系(例えば、遺伝子的構造)に含まれるとしても、生体内での活性および特異性を維持する、調節配列あるいはウイルス性組成の活性および/または特異性の評価方法を改良することで、不変で費用のかからない方法を提供することにある。調節配列の例として、プロモーターおよびエンハンサーがある。ウイルス性成分は、ウイルス性表面タンパク質であることが好ましい。本発明のさらなる目的は、細胞レセプターあるいは細胞リガンドの組織および細胞型分布を決定する系を提供することにある。上記方法は遺伝子治療における治療的遺伝子およびマーカー遺伝子の発現のためのウイルス性ベクターにおいて使用される、ウイルス性成分の評価に応用される。
【0015】
発明の詳細な説明
前記および他の目的を達成するための方法を本発明では提供する。この方法では、遺伝子組み換え非ヒト動物の細胞、好ましくは哺乳動物、より好ましくはげっし動物の細胞、そして最も好ましくはマウスの細胞に、ウイルス性ベクターが導入される。しかしながら、上記遺伝子組み換え動物は、ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を少なくとも1つ欠乏している。これらのウイルス性配列には、遺伝子組み換え動物の細胞内に導入されたウイルス性ベクターが含まれており、これによって、遺伝子組み換え動物内で、ウイルス性粒子が複製される。遺伝子組み換え動物を適切な条件下で維持した後で、ウイルス性粒子の生成物、ウイルス性粒子が生成された細胞が、それぞれ検出され、評価される。
【0016】
本発明にかかる方法は、調節配列の活性および/または特異性の評価に対して特に有用である。この際、ベクターに含まれる1あるいはそれ以上のウイルス性配列は、解析される調節配列によって制御される。遺伝子組み換え動物の細胞がウイルス性ベクターで形質移入される場合、あるいは、ベクターを含んでいるウイルス性粒子に感染される場合、まず初めに、少数の細胞が、それぞれ形質移入され、感染される。一般的に、遺伝子組み換え動物のすべての細胞は、形質移入可能および/または感染可能であるが、ベクターに含まれる配列および遺伝子それぞれの発現および/または翻訳は、調節配列が活性な細胞内でしか生じない。このように、例えば、細胞型あるいは組織に特異的なプロモーターが使用される場合、プロモーターがこの可能性を完全に満たすのであれば、評価を行うことができる。遺伝子組み換え動物の細胞内での発現、および、ベクター内に含まれ、ウイルス性粒子の発生に必要なウイルス性配列の翻訳のみが生じる。
【0017】
遺伝子組み換え動物の細胞は、さらに、ウイルス性ベクターがコードしないウイルス性タンパク質を提供し、そしてこれにより、遺伝子組み換え動物の細胞はパッケージング細胞株(packing cell line)に似た機能を持つ。遺伝子組み換え動物のゲノム内に含まれるウイルス性配列によってコードされるウイルス性タンパク質は、永久的に生成されるのが好ましい。これらのウイルス性配列は、さらに、遍在性の、恒常的に活性な調節配列によって制御されることが好ましい。最も好ましくは、MLV−プロモーターが使用されることである。しかしながら、遺伝子は、ベクター内に調節配列が含まれ、遺伝子(群)の発現あるいは翻訳を調節する細胞であって、さらにはウイルス性粒子の発生の活性に必要な細胞内のウイルス性粒子にのみ、遺伝子はパッケージングされる。その結果、遺伝子組み換え動物のこれらの細胞だけが、多数の新しいウイルス性粒子を生成し遊離する。ウイルス性粒子は、こうして他の細胞を感染させ、そしてこの工程が繰り返される。ゆえに、このような”雪だるま効果”が開始され、結果として、新しい細胞を感染させる多数のウイルス粒子を生成する。しかしながら、再度ウイルス粒子を遊離するのは、ウイルス性ベクターのプロモーターが活性な細胞のみである。
【0018】
ベクター内に含まれる調節配列は、最も好ましくは、外膜タンパク質をコードする遺伝子の発現および/または翻訳を制御することであり、この外膜タンパク質は、最も好ましくは広宿主性のウイルス性外膜タンパク質であり、最も好ましくは、VSV−gあるいはGALVである。一般的に、”広宿”タンパク質は細胞型で非特異的なタンパク質、すなわち、これらのタンパク質は、異なる細胞型で活性であり、異なる種内でさえも活性である。したがって、広宿主性の外膜タンパク質はウイルス性ベクターに含まれ、遺伝子組み換え動物の特異的な細胞型内でのみ活性な、調節配列によって制御される。このように、これらの細胞型内だけのenv遺伝子が発現され、翻訳され、そしてこれらの細胞型内のみのウイルス性粒子が発生されなければならない。しかしながら、広宿主性外膜タンパク質を含んでいるウイルス性粒子を遊離した後、粒子は数多くの異なる細胞型および異なる組織それぞれを感染させる。それにもかかわらず、調節配列が活性な、新たに感染された細胞のみが、さらにウイルス性粒子等を遊離する。ベクター内に含まれる調節配列の活性なそれらの細胞は、特に、ウイルス性ベクターが付加的に、例えば、緑色蛍光タンパク質(gfp)遺伝子のようなマーカー遺伝子を含んでいるときに、簡単に検出される。したがって、調節配列が完全に細胞型特異的であるか、調節配列が非常に非特異的であるかを簡単に調べることができる。このようにして、調節配列が標的遺伝子治療に適切か否かを決定することができる。遺伝子組み換え動物のほとんどすべての細胞が、評価される調節配列を含んでいるウイルス性ベクターと感染可能であることを確かめるための他の方法として、表面タンパク質を用いる方法がある。これら表面タンパク質は、細胞レセプターに遍在性を与えるための結合サイトを含むように修飾される。好ましい具体例では、遺伝子組み換え動物は、すべての組織に特異的レセプターを発現し、そして、ウイルス性ベクター内の表面タンパク質が、対応するリガンドの結合領域に存在するように設計することである。もう一つの方法として、リガンドを発現するように動物を設計し、そして表面タンパク質を対応するレセプターに含むように、ウイルス性ベクターを設計することである。このもう一つの方法では、残りのリガンドが細胞膜に結合するように、細胞膜局在化信号(cell membrance localization signal)とともに、リガンドを提供する必要がある。
【0019】
この実施形態に従い、本発明では、
a)ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を少なくとも1つ欠乏しているが、ゲノム内に1あるいはそれ以上のウイルス性配列を含んでいる遺伝子組み換え非ヒト動物の細胞に、少なくとも1つのウイルス性配列を含むウイルス性ベクターを導入することによって、遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子を複製する工程であり、この工程において、ウイルス性ベクター内の上記ウイルス性遺伝子の少なくとも1つが評価される調節要素の制御下にある、というという工程と、
b)遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子が生成するように、遺伝子組み換え動物を適切な条件下で維持する工程と、
c)ウイルス性粒子の生成された細胞を検出する工程とを含んでいる。
【0020】
本発明にかかる方法によれば、”調節配列の特異性”が決定される。この文脈において“特異性”という用語は、すべての組織内、あるいは動物の特徴的な発育段階において、調節要素は活性であるか、あるいは、発育段階のある期間の間だけ、あるいは全く活性でないという事実を述べている。したがって、“制御エレメントの特異性の評価”は、制御エレメントが活性化されている細胞型および発育段階の評価を意味している。特定の細胞内でのみ制御エレメントが活性化するのであれば、上記細胞は他の細胞を次々に感染させることができるようなウイルス粒子を生成するであろう。このように、感染された細胞の数が増え(”雪だるま効果”)、最適な条件下において動物細胞の多く(理想的な場合としては、全ての細胞)が感染されるべきである。どの細胞において調節配列が活性であるかを決定する方法は、当業者には知られている。これらの細胞を同定するのに便利な方法は、調節要素の制御下で、少なくとも1つのウイルス性遺伝子を含んでいるウイルス性ベクターが、同じ調節要素の制御下でマーカー遺伝子を含むことである。これは少なくとも一つのウイルス遺伝子およびマーカー遺伝子をそれぞれコードするウイルス性ベクターの、各々の発現カセット(両方のカセットにおいて、遺伝子発現は同じ調節要素を複製することによって制御される)に含むことによって達成される。この型のベクター構成の不利な点は、ベクターゲノム内において、調節配列が2度生じることであり、これにより望ましくない組み換えが生じるかもしれないということである。従って、最も好ましい実施形態は、ただ一つの調節配列が、少なくとも一つのウイルス配列およびマーカー遺伝子の両方の発現を制御するということである。一つの発現カセットによって両方の遺伝子を発現させるためには、少なくとも一つのウイルス配列およびマーカー遺伝子の間に内的リボソーム結合部位(IRES)を含むことである。IRES要素は、当業者には知られている。この文脈おいては、EMCVのようなピコルナウイルスのIRES要素に対する基準を設けた。さらにIRES要素は、以下に開示される。典型的なマーカー遺伝子は、緑色蛍光タンパク質(gfp)をコードした遺伝子、β−ガラクトシダーゼをコードした遺伝子、または特異的な抗体が結合するタンパク質をコードした遺伝子である。マーカー遺伝子の発現を決定する方法は、当業者に知られている。調節要素の“活性”は、マーカー遺伝子の発現の量によって評価できる。
【0021】
さらに、本発明ではウイルス性成分、特に、標的遺伝子治療において安全な媒体としてさらに使用されるべきウイルス性成分の迅速で簡単な解析のための方法を提供する。
【0022】
細胞親和性、すなわち外膜ウイルスの、ウイルス性感染の特異性は、細胞の表面上の対応するレセプターと作用するウイルス性外膜タンパク質によって決定される。仮に対応するレセプターが遍在性であるとすれば、ウイルスは全ての細胞に感染させることができる。仮にレセプターが特定の細胞上にのみ存在しているとすれば、それらの細胞のみが、感染に対して感染性を持つ。非外膜ウイルスの場合には、細胞親和性は、ウイルス性カプシドの表面上の、特定のタンパク質によって定義される。本発明の文脈において、“表面タンパク質”という用語は、ウイルスの表面上にある全てのウイルス性タンパク質のことであり、標的細胞と相互作用し、ウイルスが細胞内に侵入するのに必要なものである。それゆえ、この用語は包膜ウイルスの外膜タンパク質と同様、細胞と接触する非外膜ウイルスのカプシドタンパク質を網羅している。表面タンパク質という用語は、修飾された表面タンパク質など、自然に発生する表面タンパク質を網羅している。”修飾された表面タンパク質”は、ウイルス性表面タンパク質内に自然には生じない細胞レセプターへの結合配列を含むために修飾された表面タンパク質である。ウイルス性表面タンパク質内で自然には生じない結合配列として、例えば、レセプターリガンド((Kasahara et al. (1994), Science 266, 1373−1376)やその機能的な断片(Valsesia−Wittmann et. al. (1996), J. Virol. 70, 2059−2064)、あるいは、モノクローナル抗体(Russel et al, (1993), Nucl. Acids Res. 21, 1081−1085) あるいは他のウイルス性表面タンパク質の結合領域がある。列挙された参考は、そのような結合領域がどのようにしてウイルス表面タンパク質に導入され、標的細胞の感染に行き着くかを明らかにしている。“修飾された表面タンパク質”という用語はまた、ウイルス性の表面タンパク質では自然には生じない、細胞リガンドに対する結合配列を含むために修飾された表面タンパク質も網羅している。”細胞リガンド”という用語は、細胞膜に結合しているリガンドのことをいう。この文脈において、この用語は、細胞リガンドで自然に生じることも網羅している。
【0023】
本発明にかかる方法はまた、表面タンパク質、特にウイルスの外膜タンパク質の特異性を評価するためにも用いられる。すなわち、表面タンパク質、特にウイルスの外膜タンパク質が安全な遺伝子輸送媒体として用いられるならば、腫瘍細胞のような特別の標的細胞の細胞表面にのみ付けることが実際に可能であれば、解析することができる。次に、包膜ウイルスの表面遺伝子、すなわちenv遺伝子について例示する。本発明の概念は、細胞との相互作用に必要なタンパク質をコードした非包膜ウイルスの遺伝子に対する方法にも似た方法で適用することができるということを当業者は理解している。その結果、 “env遺伝子”、および、“envタンパク質”という用語は、より一般的な用語として、“表面遺伝子”、および、“表面タンパク質”それぞれで置き換えることが可能である。先にも触れたように、“表面タンパク質”、は“修飾された表面タンパク質”も、先の定義から網羅している。仮に、特異性が評価される遺伝子がenv遺伝子であれば、すなわち、遺伝子組み換え動物の細胞内、あるいは、非機能的Envタンパク質、あるいは、env遺伝子が完全に欠失されている場合には、Envタンパク質は生成されない。同様に、解析されるべき特別なenv遺伝子はウイルス性ベクターに含まれるが、遍在性の、恒常的に活性な調節配列によって制御されることが好ましい。仮に本発明による方法が動物内のリガンドのためのレセプターの分布を評価するために使用されるなら、同様のことが同じく適用される(以下を参照)。遺伝子組み換え動物の細胞の感染もしくは形質移入の後、外膜タンパク質を構成するさらなるウイルス性粒子は生成されて遊離される。しかしながら、遺伝子組み換え動物のさらなる細胞は唯一ウイルス表面もしくは外膜タンパク質、さらにレセプターとして働く宿主細胞膜タンパク質の間に反応が起こるときに感染される。引き続き、仮にウイルスの外膜がまさに制限された感染範囲を含み、それがすなわち、治療的遺伝子の標的細胞に対する標的転移に適用可能ならば、評価されることが可能だろう。この実施形態によれば、本発明は、
a)ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を少なくとも1つ欠乏しているが、ゲノム内に1あるいはそれ以上のウイルス性配列を含んでいる遺伝子組み換え非ヒト動物の細胞に、少なくとも1つのウイルス性配列を含むウイルス性ベクターを導入することによって、遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子を複製する工程と、
b)遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子が生成するように、遺伝子組み換え動物を適切な条件下で維持する工程と、
c)ウイルス性粒子の生成された細胞を検出する工程とを含んでいる。
【0024】
他の実施形態によれば、本発明では、ウイルスの表面タンパク質の特異性を評価する方法を提供する。この方法は、
a)ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を少なくとも1つ欠乏しているが、ゲノム内に少なくとも、ウイルス性表面タンパク質をコードする遺伝子を含んでいるウイルス性配列を含んでいる遺伝子組み換え非ヒト型動物の細胞に、ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を含んでいるウイルス性ベクターを導入することによって、遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子を複製する工程と、
b)遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子が生成するように、遺伝子組み換え動物を適切な条件下で維持する工程と、
c)ウイルス性粒子の生成された細胞を検出する工程とを含んでいる。
【0025】
この別の実施態様が、同じレセプターを使用するウイルスの感染を遮断するために表面タンパク質が細胞表面のレセプターと反応する細胞から合成されるウイルスには働かないことは、当業者には良く知られている。レトロウイルスのenvタンパク質がこの効果を持つかもしれないことは述べられてきた。すなわち、レトロウイルス性env遺伝子を発現する細胞が、ウイルス性表面に対応するenvタンパク質を発現するレトロウイルスにほとんど感染性が無いことが知られている。したがって、この別の実施態様は唯一、生成された表面タンパク質が同じタンパク質をウイルス性表面に持つウイルスの感染を遮断しないウイルスシステムに働くだろう。
【0026】
本発明による方法では、”ウイルス性表面タンパク質の特異性”を決定する。この文脈での”特異性”という用語は、ウイルス性表面タンパク質が、動物発生のいくつかあるいはすべての段階の間、全ての細胞型または特定の細胞型にのみ存在する細胞レセプターと相互作用するであろうという事実を言及している。そのため、”ウイルス性タンパク質の特異性の評価”は、評価される表面タンパク質を表面に有するウイルスに感染されることの可能な細胞の型と発生的段階との評価を意味している。感染細胞内のみおいてウイルス性粒子の生成が生じる。したがって、ウイルス性粒子の生成は、細胞がウイルス性表面に、この細胞に対して特異的なタンパク質を持つウイルスに感染したこと意味する。どの細胞が感染したのかを決定する別の方法は、検出可能な遺伝子生成物を発現するマーカー遺伝子をコードするウイルス性配列を、少なくともウイルス性表面タンパク質を含むウイルスベクターに含むことである。そのようなマーカー遺伝子の例は当業者に良く知られており、そしてとりわけ緑色蛍光タンパク質、またはβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子含む。当業者はこれらの遺伝子の発現の検出、および、定量化の方法を知っている。マーカー遺伝子は、全ての細胞と細胞型の中で活性であることが望ましいプロモーターによって制御されるべきである。ウイルスベクターは、マーカー遺伝子と同じ、もしくは異なるタイプのプロモーターによって制御される、二つの離れた発現カセットに、ウイルス性表面タンパク質をコードするウイルス性配列を含んでいてもよい。望ましくはウイルス性表面タンパク質をコードしている遺伝子とマーカー遺伝子とは、一つのプロモーターからの、一つの発現カセット内に発現している。この場合、IRES要素は両方の遺伝子の間に挿入されなければならない。表面タンパク質の、”活性”は、特定の細胞型または組織によって生成されるウイルス性粒子の定量化、または、マーカー遺伝子の発現の定量化によって評価される。
【0027】
上記で指摘したように、表面タンパク質はまた、上記で定義した修飾表面タンパク質となることが可能である。望ましい実施態様では、修飾表面タンパク質は、結合部位、例えば細胞に結合するように接近している領域に、細胞レセプターに対するリガンドを持つ表面タンパク質であることである。したがって、本発明による方法は、どの細胞に表面タンパク質の結合部位に含まれるリガンドに対するレセプターが発現しているのかを評価するのに使用することができる。ウイルス性表面タンパク質に含まれるリガンドに特異的なレセプターを含むそれらの細胞だけが感染される。望ましい実施態様によると、修飾されていない表面タンパク質は、動物の細胞表面にある、対応するレセプターを持たない表面タンパク質である。修飾されていない表面タンパク質を持つウイルスは、それゆえ、動物の細胞を感染させるべきではない。この型のウイルスの一例は、狭宿主性のレトロウイルスである。あるいは、リガンド配列を細胞レセプターが存在する表面タンパク質に挿入することができる。この場合、表面タンパク質が細胞レセプターと相互作用を生じないように、リガンドを表面タンパク質の結合部位に挿入することが好ましい。修飾されたウイルス性表面タンパク質の、細胞への結合は、そうして、表面タンパク質にあるリガンドと、リガンドの細胞レセプターとの相互作用によるとされるべきである。本発明による方法はまた、仮に修飾された表面タンパク質の表面タンパク質部分が修飾されていない表面タンパク質の細胞レセプターへの残余結合を示すのであれば、適用可能である。この実施態様では、遺伝子組み換え動物を、修飾されていない表面タンパク質を発現しているベクターと感染させることや、その結果を同じ型の遺伝子組み換え動物の修飾された表面タンパク質を発現しているベクターとの感染の後に得られた結果と比較することが必要であろう。
【0028】
本発明の文脈において、”リガンド”という用語は、細胞表面にある特異的な構造、すなわちレセプターに特異的に結合するどのようなペプチドまたはタンパク質も意味する。したがって、リガンドは、例えば成長因子、インスリンなどのホルモン、モノクローナル抗体の結合部位であり得る。”レセプター”は、リガンドと相互作用する細胞表面上の構造として定義される。したがって、レセプターはとりわけ成長因子レセプター、ホルモンレセプター、または修飾されたウイルス性表面タンパク質にある抗原結合部位に特異的な抗原であり得る。”動物でのレセプターの分布”という用語は、細胞の表面上にレセプターが発現して存在している細胞型および組織を意味する。したがって、動物でのレセプターの分布の評価は、実際には細胞の表面上にレセプターを持つ、細胞型と組織との評価である。
【0029】
この実施形態において、本発明は、動物のレセプターの、リガンドの分布を評価する方法を提供する。この方法は、
a)ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を少なくとも1つ欠乏しているが、ゲノム内に1あるいはそれ以上のウイルス性配列を含んでいる遺伝子組み換え非ヒト動物の細胞に、少なくとも1つのウイルス性配列を含むウイルス性ベクターを導入することによって、遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子を複製する工程であって、この工程において、ウイルス性表面タンパク質に対してコードするウイルス性配列は、リガンドに対してコードする配列を持っており、これによりこの配列の発現において、細胞レセプターと相互作用するように接近したタンパク質部分のリガンドの配列を含む修飾されたウイルス性表面タンパク質が生成される、という工程と、
b)遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子が生成するように、遺伝子組み換え動物を適切な条件下で維持する工程と、
c)ウイルス性粒子の生成された細胞を検出する工程とを含んでいる。
【0030】
他の実施形態においては、本発明は、動物のリガンドの、レセプターの分布を評価する方法を提供する。この方法は、
a)ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を少なくとも1つ欠乏しているが、ゲノム内に1あるいはそれ以上のウイルス性配列を含んでいる遺伝子組み換え非ヒト動物の細胞に、ウイルスの生成に必要な欠乏ウイルス性配列を含んでいるウイルス性ベクターを導入することで、遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子を複製する工程であって、この工程において、ウイルス性表面タンパク質に対してコードするウイルス性配列はリガンドに対してコードする配列を含んでおり、これにより配列の発現において、細胞レセプターと相互作用するように接近したタンパク質部分内のリガンドの配列を含む修飾されたウイルス性表面タンパク質が生成される、という工程と、
b)遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子が生成するように、遺伝子組み換え動物を適切な条件下で維持する工程と、
c)ウイルス性粒子の生成された細胞を検出する工程とを含んでいる。
【0031】
この他の実施態様によると、修飾されたウイルス性表面タンパク質の発現は、好ましくは遍在性の、恒常的に活性な制御配列によって制御されるべきであることである。好ましい制御配列は述べられている。最も好ましいのはMLV制御配列である。
【0032】
すでに上記で指摘したように、この他の実施態様は、仮に細胞から生成される修飾された表面タンパク質が、ウイルスを妨害するために同じレセプターを用いて細胞上のレセプターと相互作用するのであれば、ウイルスには作用しないということが当業者には良く知られている。したがって、この他の実施態様は感染されていない細胞から生成される、修飾された表面タンパク質が、同じタンパク質をウイルス性表面に持つ、ウイルスとの感染を妨害しないウイルス系にのみ作用する。
【0033】
一般に、動物のレセプター分布の評価方法における最も好ましい実施態様は、二つの上記で要約された最も望ましいウイルス成分の特異性を評価するための方法の実施態様に関連し、その点で、ウイルス成分は、ウイルス性表面タンパク質である。
【0034】
発明のさらなる実施態様によれば、遺伝子組み換え動物は、パッケージング信号をコードするウイルス性配列を欠乏している。このウイルス性配列は、遺伝子組み換え動物のゲノム内で全く機能しないことが最も好ましい。
【0035】
上記ですでに簡潔に指摘したように、本発明における方法で用いられる、最も望ましい非ヒト遺伝子組み換え動物は、例えば、CD1、FVB、NMRI、C57/Black6、ICR系統のマウスである。動物はおそらく健康的か、あるいは遺伝的に、代謝的に、増殖的に、あるいは他の障害を被っている。遺伝子組み換え動物は、例えば、重症複合免疫不全症(SCID)マウスの場合のように、効果的な免疫システムを欠乏していることが最も好ましい。したがって、動物の免疫機構は、生成された感染性の粒子を攻撃することができない。
【0036】
遺伝子組み換え動物の遺伝子のゲノム内に組み込まれたウイルス性配列、および、ウイルス性粒子を複製するウイルス性配列を含んでいるウイルス性ベクターは、同じウイルス性の系に由来することが好ましく、すなわち、ウイルス性配列も、ウイルス性ベクターも、非レトロウイルスあるいはレトロウイルスに由来することが好ましい。ウイルス配列およびウイルス性ベクターは、どちらもレトロウイルス性起源であることが最も好ましい。
【0037】
レトロウイルス性ベクターは、レトロウイルス性遺伝子に基づいている。単純なレトロウイルスのレトロウイルス性遺伝子は、基本的にはR−U5−gag−env−U3−R構造を含んでいるRNA分子から成る。逆転写工程の間に、U5領域は、生成したDNA分子の右手末端において複製され、一方でU3領域は、生成したDNA分子の左手末端において複製されて配置される。その結果生じたU3−R−U5構造は、LTR(末端反復配列)と呼ばれ、そのため同一であり、そしてDNA構造またはプロウイルスの両方の末端で繰り返される。プロウイルスの左手末端におけるU3領域は、プロモーターを収容する。このプロモーターは、左手U3とR領域との間の境界で開始され、右手RとU5領域との間の境界で終了するRNA転写物の合成を引き起こす。標的細胞の中で、RNA遺伝子は上述したように再び逆転写される。
【0038】
典型的なレトロウイルス性ベクターは、二つの完全なLTRs−a5’およびa3’LTR−、そしてベクターの体内にあるLTRの間にある、関与する配列のための挿入部位から構成される。この場合、調節配列は、上述したレトロウイルスそれぞれの配列・遺伝子と同様の調節配列に調節される、ベクターの体内に挿入される可能性がある。しかしながら、調節配列はLTRの中に挿入されるのが好ましく、LTRのU3領域に挿入されるのがより好ましい。レトロウイルス性ベクターは、プロモーター転換(ProCon)ベクターであることが最も好ましい(PCT/EP95/03445を参照)。
【0039】
プロモーター転換ベクターにおいて、右手のU3領域は改変されるが、しかし、正常な左手のU3構造は保たれる;ベクターは、左手U3領域内に位置する、正常なレトロウイルス性プロモーターを使用するRNA内に転写される。しかしながら、生成されたRNAは、改変された右手のU3構造しか含まない。感染された標的細胞では、逆転写の後、この改変されたU3構造は、レトロウイルス性構造の両端に配置される。
【0040】
改変した領域は、U3領域の代わりにポリリンカーを持っている。そのため、それらの直接的な組織特異的発現を含むどのような調節配列も容易に挿入されることになる。このプロモーターはそのためレトロウイルス性ベクターによって運ばれる連鎖遺伝子の発現のために、標的細胞において排他的に使用される。
【0041】
発明のこの具体的な実施態様によると、調節配列の支配下でのレトロウイルス遺伝子を構成するレトロウイルス性ベクターは、次のようにして生成されることが可能である;ProConベクターにおいて、レトロウイルス性遺伝子をコードするタンパク質、望ましくはenvがベクターの体内に存在する関与する調節配列は、3’−LTRのU3領域に挿入され、その結果生じるベクターは、パッケージング細胞に形質移入される。ProCon原理によると、パッケージング細胞株においては、レトロウイルス性ベクターの発現は、5’−LTRのU3領域に含まれる、正常な、非選択的なレトロウイルス性プロモーターによって制御される。引き続き、ベクターはレトロウイルス性粒子内にパッケージングされる。しかしながら、遺伝子組み換え動物の細胞、(この例では、gagおよびpolを表している)が上記レトロウイルス性粒子に感染される場合には、プロモーター変換が起こり、そしてenvの発現が関与する調節配列によって制御される。本発明によると、レトロウイルス性粒子の生成は、調節配列が活性化している細胞内においてのみ起こる。
【0042】
ProConベクターにおいては、調節配列は、3’LTRのU3領域内に挿入されることが望ましい。さらに好ましくは、U3領域が調節配列によって全体的、もしくは部分的に置き換えられることである。しかしながら、調節配列はまた、3’ LTRのU3およびR領域の間にも挿入される。
【0043】
本発明における、遺伝子組み換え動物の感染もしくは形質移入に用いられるレトロウイルス性ベクターのLTRは、マウス白血病ウイルス(MLV)、マウス乳腺腫瘍ウイルス(MMTV)、マウス肉腫ウイルス(MSV)、サル免疫不全ウイルス(SIV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV)、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)、ネコ白血病ウイルス(FELV)、牛白血病ウイルス(BLV)、サルメイソンファイザーウイルス(MPMV)、およびラウス肉腫ウイルス(RSV)のLTRを構成する群の要素から選ばれるのが好ましい。もっとも好ましくは、両LTRとも、マウス白血病ウイルス(MLV)に由来することである。
【0044】
調節配列によって制御される、評価されるべきenv遺伝子は、VSV−g、LCMV−g(リンパ性脈絡髄膜炎ウイルスの糖タンパク質)、あるいは異なる種の細胞への感染を可能にする、すなわち、幅広い宿主を与えるRD114であってもよい。envはマウス広宿主性env、すなわち、マウス種および非マウス種に由来するenvであることがさらに好ましい。最も好ましくは、MLVの広宿主性4070Aenvが使用されることである。
【0045】
発明の他の好ましい実施態様は、遺伝子組み換え動物にあるレトロウイルス性遺伝子と、レトロウイルス性ベクター内にあるレトロウイルス性遺伝子とが、同じレトロウイルスの型に由来することである。より好ましくは、レトロウイルス性ベクターのLTRもまた、遺伝子と同様に同じ起源に由来することである。最も好ましくは、レトロウイルス性遺伝子およびLTRsがMLVに由来することである。
【0046】
発明の他の実施態様によると、レトロウイルス性ベクターは、レトロウイルス性遺伝子に加えて、非相同性のコード化配列を含んでいる。”非相同性”という用語は、自然状態では本質的に正常ではないDNA配列のどのような組み合わせにおいても用いられる。非相同性コード化配列は、好ましくはマーカー遺伝子、治療的遺伝子、および/または抗腫瘍遺伝子を含む群の要素から選択されることである。上記マーカー遺伝子および治療的遺伝子は、さらに好ましくは、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ネオマイシン遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ヘルペス単一性ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、プロマイシン遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子、チトクロームP450遺伝子、そして緑色蛍光タンパク質(gfp)、青色蛍光タンパク質(bfp)、黄色蛍光タンパク質(yfp)のような蛍光マーカー遺伝子、およびゼオシン耐性遺伝子を含む群の要素から選ばれることである。
【0047】
最も好ましくは、さらなる非相同性遺伝子は、内部リボソーム侵入部位(IRES)に機能的に結合することである。IRESは、リボソームのmRNA配列内のモチーフへの付着を促進し、それによって関連遺伝子が翻訳される。発明の実施形態によると、レトロウイルス性ベクターは、レトロウイルス性遺伝子と、IRESに結合するさらなる非相同性遺伝子を含んでいる。結果的に、レトロウイルス性遺伝子およびさらなる非相同性遺伝子の転写がいずれも同じ調節配列によって制御されるものの、タンパク質内に発現したmRNAのさらなる翻訳は、いずれも独立して、そして分離して行われる。
【0048】
原則として、全ての調節配列は本発明による方法で解析されることが可能である。調節配列は、乳酸化タンパク質(WAP)、マウス乳腺腫瘍ウイルス(MMTV)、β−ラクトグロビン、ラクトアルブミン、そしてカゼイン特異的調節エレメント、および標的ヒト乳腺腫瘍に使用されるであろうプロモーターを含む群の要素を含んでいてもよいが、これらに限定されるものではない。さらに、炭酸脱水酵素プロモーター、グルコキナーゼプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)を含むリンパ球特異的調節エレメントおよびプロモーター、免疫グロブリンとMMTVリンパ球特異的調節領域およびプロモーター、糖質コルチコイドホルモンへの応答性を与える、あるいはヒト乳腺に発現を指示するMMTVP2のようなMMTV特異的調節エレメントおよびプロモーター、T細胞レセプター遺伝子およびCD4レセプタープロモーターのようなT細胞に特異的な調節エレメントおよびプロモーター、免疫グロブリンプロモーターまたは組織因子プロモーターのようなmb1、および腫瘍に特異的なプロモーターのようなT細胞に特異的な調節エレメントおよびプロモーター、癌胎児性胚性抗原(CEA)プロモーター、および血管性内皮成長因子(VEGF)プロモーターのような膵臓に特異的な調節エレメントとプロモーターであってもよい。
【0049】
本発明による方法は、遺伝子治療に使うことを意図したレトロウイルスと関連して非相同性の調節領域を解析するために使われるのが好ましい。この場合、調節配列は、非相同性配列の代わりに、またはさらに遺伝子治療に使用されるレトロウイルス性遺伝子に由来する。レトロウイルス性遺伝子の発現を引き起こす、関与する調節遺伝子は、調節配列がマーカー遺伝子、または治療的遺伝子の発現を引き起こすときには、遺伝子治療のためのレトロウイルス性ベクターの場合と全く同じように機能するのが有利である。したがって、本発明の方法によって、遺伝子治療の間に、例えば、調節配列の活性および組織特異性のレベルを予測することができる。
【0050】
本発明は、本発明による方法によって入手可能な遺伝子組み換え非ヒト動物にも関連し、本発明による方法に適用可能な、遺伝子組み換え非ヒト動物を提供する。後者は、遺伝子に、1あるいはそれ以上のウイルス性配列を含んでいるが、ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を少なくとも1つ欠乏している。したがって、遺伝子組み換え動物の細胞はウイルス性タンパク質を生成するけれども、レトロウイルス性遺伝子は、レトロウイルス性粒子の中に組み入れられない。なぜなら、パッケージング信号および/またはLTR領域のような、複製および/またはパッケージングに必要な配列は、成熟しているかまたは欠落しているからである。ウイルス性粒子の生成に必要な配列の導入は、ウイルス性粒子の複製だけではなく、遺伝子組み換え動物に、上記ウイルス性粒子を拡散する。
【0051】
好ましくは、組み換え遺伝子は、多数の異なる細胞型において発現されることである。最も好ましくは、すべての細胞型において発現されることである。したがって、本発明の好ましい実施態様によれば、ウイルス性配列の発現は、遍在性の、恒常的に活性な調節配列によって引き起こされる。遺伝子組み換え動物の遺伝子に含まれるウイルス性配列がレトロウイルス性起源の場合は、上記レトロウイルス性遺伝子の発現は、SV40エンハンサーおよび/またはプロモーター、β−アクチンプロモーター、ROSA26プロモーター、CDC10プロモーター、あるいはユビキチンプロモーターによって制御されるのが好ましい。そして最も好ましくは、マウス白血病ウイルス(MLV)プロモーターによって制御されることである。
【0052】
好ましくは、動物が、gagおよび/またはpolに対して遺伝子組み換え的であることである。より好ましくは、gagおよび/またはpolがMLVに由来していることであり、最も好ましくは、マウス白血病ウイルス(MLV)プロモーターによって制御されることである。
【0053】
本発明の要点
本発明は特に、以下を単独あるいは組み合わせたものである:
活性および/または調節配列あるいはウイルス性組成の特異性評価は、次の工程を含んでいる。
a)ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を少なくとも1つ欠乏しているが、遺伝子内に1あるいはそれ以上のウイルス性配列を含んでいる遺伝子組み換え非ヒト動物の細胞に、少なくとも1つのウイルス性配列を含むウイルス性ベクターを導入することによって、遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子を複製する工程と、
b)遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子が生成するように、遺伝子組み換え動物を適切な条件下で維持する工程と、
c)ウイルス性粒子の生成された細胞を検出する工程。
【0054】
動物のリガントに対するレセプターの分布を評価する方法は、以下の工程を含んでいる。
a)ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を少なくとも1つ欠乏しているが、ゲノム内に1あるいはそれ以上のウイルス性配列を含んでいる遺伝子組み換え非ヒト動物の細胞に、ウイルスの生成に必要な欠乏ウイルス性配列を含んでいるウイルス性ベクターを導入することで、遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子を複製する工程であって、この工程において、ウイルス性表面タンパク質に対してコードするウイルス性配列はリガンドに対してコードする配列を含んでおり、これにより配列の発現において、細胞レセプターと相互作用するように接近したタンパク質部分内のリガンドの配列を含む修飾されたウイルス性表面タンパク質が生成される、という工程と、
b)遺伝子組み換え動物の細胞にウイルス性粒子が生成するように、遺伝子組み換え動物を適切な条件下で維持する工程と、
c)ウイルス性粒子の生成された細胞を検出する工程。
【0055】
上記方法において、ウイルス性組成はウイルス性表面タンパク質である。
【0056】
上述した方法において、遺伝子組み換え非ヒト動物は哺乳類、好ましくはげっし動物、最も好ましくはマウスである。
【0057】
上記方法において、遺伝子組み換え非ヒト動物は、重症複合型免疫不全(SCID)マウスである。
【0058】
上記方法において、遺伝子組み換え動物は、パッケージング信号に対するウイルス性配列コードを不完全にしている。
【0059】
上記方法において、パッケージング信号に対するウイルス性配列コードは欠失されている。
【0060】
上記方法において、遺伝子組み換え動物のゲノム内に含まれるウイルス性配列の発現および/または翻訳は、遍在性の、恒常的に活性な調節配列によって制御される。
【0061】
上記活性および/または調節配列の特異性を評価する方法において、ベクターに含まれる少なくとも1つのウイルス性配列の発現および/または翻訳が、解析される調節配列によって制御される。
【0062】
上記方法において、遺伝子をコードするenvの発現および/または翻訳が解析される調節配列によって制御される。
【0063】
上記方法において、envをコードする遺伝子の発現および/または翻訳は、解析されるべき調節配列によって制御される。
【0064】
上記方法において、envコードをコードする遺伝子は、広宿主性のenvに対するものである。
【0065】
上記方法において、解析されるべき調節配列は、遺伝子治療に適している。
【0066】
上記ウイルスの外膜タンパク質の特異性を評価する方法において、遺伝子組み換え動物は、envをコードするウイルス性配列を不完全にしている。
【0067】
上記方法において、envをコードするウイルス性配列は、欠失される。
【0068】
上記方法において、ウイルス性ベクターに含まれるenv遺伝子の発現および/または翻訳は、遍在性の、恒常的に活性な調節配列によって制御される。
【0069】
上記方法において、外膜タンパク質は、標的遺伝子治療に適している。
【0070】
上記方法において、ウイルス性配列およびウイルス性ベクターは、レトロウイルス性起源である。
【0071】
上記方法において、遺伝子組み換え動物は、レトロウイルス性ベクターで形質移入される、および/または、上記レトロウイルス性ベクターを含むレトロウイルス性粒子に感染されている。
【0072】
上記方法において、遺伝子組み換え動物のゲノム内に含まれているレトロウイルス性ベクターおよびレトロウイルス性配列は、レトロウイルスの同じ型に由来している。
【0073】
上記方法において、レトロウイルス性配列は、マウス白血病ウイルス(MLV)に由来している。
【0074】
上記活性および/または調節配列の特異性の評価において、調節配列は、レトロウイルス性ベクターの末端反復配列(LTR)に挿入されている。
【0075】
上記方法において、調節配列は、LTRのU3−領域に挿入されている。
【0076】
上記方法において、レトロウイルス性ベクターが、プロモーター転換ベクターに基づいている。
【0077】
上記方法において、レトロウイルス性ベクターが、レトロウイルス性配列に加えて、非相同性遺伝子を含んでいる。
【0078】
上記方法において、非相同遺伝子が、治療的遺伝子、抗腫瘍遺伝子および/またはマーカー遺伝子である。
【0079】
上記方法において、マーカー遺伝子が、緑色蛍光タンパク質(gfp)遺伝子および/またはゼオシン耐性遺伝子である。
【0080】
上記方法において、非相同遺伝子が、内部リボゾーム侵入部位に効率よく結合している。
【0081】
上記方法によって得られる遺伝子組み換え非ヒト型動物。
【0082】
ゲノム体内に1あるいはそれ以上のウイルス性配列を含んでいるが、ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を少なくとも1つ欠乏しており、遺伝子組み換え動物の細胞へ少なくとも1つのウイルス性配列が導入されることによってウイルス性粒子を生成し、遺伝子組み換え動物において上記ウイルス性粒子を拡散する遺伝子組み換え動物。
【0083】
上記遺伝子組み換え非動物において、遺伝子非ヒト動物が哺乳類、好ましくはげっし動物、最も好ましくはマウスである。
【0084】
上記遺伝子組み換え動物において、マウスは、重症複合免疫不全症(SCID)マウスである。
【0085】
上記遺伝子組み換え動物が、ウイルス性配列コード化envを欠乏している。
【0086】
上記遺伝子組み換え動物において、遺伝子組み換え動物のゲノム内に含まれるウイルス性配列の発現および/または翻訳が、遍在性の、恒常的に活性な調節配列によって制御される。
【0087】
上記遺伝子組み換え動物において、ウイルス性配列はウイルス性起源である。
【0088】
上記遺伝子組み換え動物において、調節配列は、調節配列が、SV40エンハンサーおよび/またはプロモーター、β−アクチンプロモーター、ROSA26プロモーター、CDC10プロモーター、ユビキチンプロモーターおよび/またはMLVプロモーターを含む群の要素から選ばれる。
【0089】
上記遺伝子組み換え動物において、レトロウイルス性配列は、マウス白血病ウイルス(MLV)起源である。
【0090】
図:
図1は、中間クローニングプラスミドおよび半複製的なレトロウイルスベクターを概略的に示す。略語:CMV:ヒトサイトメガロウイルス中間初期プロモーター;env:ウイルス性被覆遺伝子;eGFP:増強緑色蛍光タンパク質遺伝子;IRES;Encephalo myocarditisウイルス内部リボソーム侵入部位;SV40−neo(SV−40プロモーター/エンハンサー制御下におけるネオマイシン耐性遺伝子);gfp/zeo:ゼオシン耐性遺伝子と緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子の融合;cyp/zeo:(チトクロームp450 2B1−ゼオシン耐性融合遺伝子)の融合;LTR:末端反復配列;ψ、レトロウイルスパッケージング信号 MMTV;マウス乳腺腫瘍ウイルス
実施例
以下の例で、本発明をさらに説明する。提供する実施例は、当業者によってよく理解されるだろう。しかしながら、本発明の技術の応用性は、この実施例に限定されるものではない。
【0091】
1.MLVに基づいた半複製的レトロウイルス性ベクターpLEIGZ、pLEIGZM、pLEICZおよびpLEICZMの合成
半複製的レトロウイルス性ベクター(図1)は、多くの異なるクローニングベクターと中間ベクターに由来する(図1)。
【0092】
最初の中間生成物を得るために、基本となるクローニングベクターpIRES(Invitrogen)(これはEMCV(Encephalo myocarditisウイルス)からの内部リボソーム侵入部位を持っている)を、M1uIで直線化し、プラスミドpALFの消化によって得られた2118bpのenv遺伝子断片に結合した(Cosset, F. K., Takeuchi, Y., Battini, J. −L, Weiss, R. A., Collins, Mm K. L. 1995; Jounal of Virology 69, 7430−7436)。この最初の中間生成物を、長さ8214bpのpCEIと名づけた。次に、pCEIGZおよびpCEICZベクターを作成するために、前駆体プラスミドpCEIが、gfp/zeoカセットまたはcyp/zeoカセットを挿入するために、それぞれXbalで直線化した。gfp/zeo融合遺伝子カセットは、酵素RsrII/BseRIによる発現ベクターpTracerSV40(Invitrogen)の消化、および、1148bp断片の単離によって得た。同時に、ヌクレオチド15〜377(Genbankアクセスナンバーは、X90639)由来のStreptoallteichus hindustanusブレオマイシン遺伝子に融合した、ヌクレオチド25〜1458(GenbankアクセスナンバーM37134)由来のラットチトクロームP450 2B1遺伝子を含んでいるcyp/zeo融合遺伝子を生成した。直線化されたプラスミドpCEI内への、gfp/zeoカセットの挿入は、結果としてベクターpCEIGZとなり、直線化されたプラスミドpCEIへのcyp/zeoカセットの挿入は、結果としてベクターpCEICZとなった。
【0093】
プラスミドpPEIGZ、pCEIGZを作成ために、pCEIGZをPstl/Notlで消化した。その結果、他の中から、env−IRES−gfp/zeoカセットを含む4185bpの断片が生じた。同時に、レトロウイルス性ベクターpLXSNeGFP(Klein, D., Indraccolo, S., von Rombs, K., Amarodi, A., Salmons, B., Guenzburg W. H. 1997; Gene Thereapy 4, 1256−1260)をRsrll/EcoRIで消化し、得られた4808bpの断片を製造者の説明書にしたがってT4DNAポリメラーゼ(Life Technologies)で平滑末端化し、4185bpの断片に結合した。
【0094】
プラスミドpLEIGZの合成と同時に、ProConに基づいた版(Saller, R. M., Oezbuerk, F., Salmons, B. Guenzburg, W. H. 1998; Jounal of Virology 72, 1699−1703)を合成した。pLEIGXMと呼ばれるこのプラスミドはpLEIGZに非常に良く似ているが、3’−LTRにおけるMLV−U3領域の代わりに、非相同性MMTVプロモーター領域を持っている。そのため、レトロウイルス性ベクター内の遺伝子の発現は、pLEIGZM形質移入細胞内のMLVプロモーター領域によって引き起こされるが、LEIGZM形質移入細胞内のMMTVプロモーターによって引き起こされる。プラスミドpLEIGZMは、プラスミドpLESN1aMのRsrII/EcoRI制限消化物由来の5283bp断片との結合反応において、pCEIGZの4185bpのPstl/Notl断片を用いて合成した。このプラスミドは、プライマーBi01(5’GCCTCGGCCTCTGAGCTATT−3’)およびBi02(5’−ATATCCGCGGGCTAGCTTGCCAAACCT−3’)を用いたpLXSNEGFP断片を含む1025bpのネオマイシン遺伝子PCR増幅によって得た。この断片をSacIIとHindIIIで切り取り、pLXPCMTVeGFPの5787bpのSacII/HindII断片に結合した。このプラスミドはeGFP遺伝子を含むpEGFP−1(Clontech)の862bpのSmaI/HpaI断片を、HpaIで直線化されたプラスミドPLXPCMTVの中に挿入することで得た。プラスミドpLXPCMTVはSacIIでプラスミドpLX125を部分的に消化し、直線化されたベクターをT4ポリメラーゼで処理、再結合して得た。そのため、5’LTRの5’末端にあるSacII部位は破壊され、そして3’LTRの5’末端にあるSacII部位が一つになった。プラスミドpLXSNの3534bpのBamHI/AFlIII断片を結合して、プラスミドpLX125を作成した(Saller, R. M. 1994, Doctoral Thesis, Ludwig−Maximilian University, Munich, Germany)。
【0095】
ベクターpLEICZとpLEICZMを含むチトクロームP450 2B1遺伝子を作るために、プラスミドpCEICZを制限酵素NheIおよびNotIで消化し、4663bp断片を結果として得た。この断片は、env−IRES−cyp/zeoカセットを含んでいるが、プラスミドpLXSNNEGFPにある4808bpのRsrII/EcoRI断片に結合され、結果としてベクターpLEICZを得た。env−IRES−cyp/neoカセットの、プラスミドpLESN1aMのRsrII/EcoRI制限消化物由来の5283bp断片に対する結合は、結果としてベクターpLEICZMを得た。
【0096】
全ての制限消化物、平滑末端化終末化と結合反応は、Life Technologiesの酵素を用いて、製造者の説明書に従って行った。遺伝子組み換えは、同じLife Techinologiesから得たE. coli ME DH5αバクテリアを用いて行った。
【0097】
全ての合成物はin vitroで、可動化アッセイによるenv−gene発現で解析した:5×105 293gagpol半パッケージング細胞、これは293細胞(ATCC CRL 1573)をpGagPolGPTで形質移入することで得た(Markowitz, D., Goff, S., Bank, A. 1988; Journal of Virology 62, 1120−1124)のだが、テストのため3μgのベクターで、そして3μgのpLXSNeGFPで形質移入した。形質移入は、供給者(American Pharmacia)の説明書にしたがってカルシウム−フォスファテート形質移入方法を用いて行った。env遺伝子が発現した場合、ベクターPLXSNeGFPベクターを保持するウイルス粒子が得られるはずである。24時間後、形質移入細胞をリン酸塩バッファー生理食塩水で二回洗い、新鮮な3mlの培養液(DMEM+5%FCS)を加えた。形質移入して48時間後、1mlの培地上澄みを4×105 NIH/3T3標的細胞(ATCC CRL−1658)を感染するために用いた。感染細胞の数をFACS(表1)で48時間後に解析した。
【0098】
表1は、異なるFACS解析による、一時的な形質移入よび感染の後の、効果的な形質移入および感染の結果を示している。
【0099】
【表1】
【0100】
(表1の説明:293gp9T半パッケージング細胞を上記のプラスミドで形質移入した。形質移入した細胞の上澄みを含むウイルスを用いてNIH細胞を感染させたときに、これらの細胞をFACS解析(FACS1)の対象とした。感染された細胞のFACS解析(FACS 2)を、48時間後に行った。数字は緑の割合を示す(gfp陽性細胞)。
【0101】
IRESエレメントおよびgfp/zeo−融合カセットの機能を、zeocin耐性の群体の選択によって評価した。少なくとも100群体の集団が確立され、これらをFACS解析の対象とした。興味深いことに、63%のzeo耐性細胞が、gfp遺伝子を発現する。
【0102】
2. レトロウイルス粒子の産生
5μgのプラスミドDNAを293gag/pol半パッケージング細胞に形質移入することで、組み換えレトロウイルス性粒子の生成を行った。293gag/pol半パッケージング細胞を、293の細胞(ATCC CRL 1573)をpGagPolGPT、または、PA317(Miller, A. D., Buttimore, C. 1986, Molecular and Cellular Biology 6: 2985−2902)のような通常のパッケージング細胞で形質移入することで得た。その目的のため、形質移入の24時間前に、5×105個のパッケージング細胞を、3cmのシャーレに播いた。形質移入は製造業者(CellPhect形質移入キット; Amersham Phamacia)から提供された説明書に従って行った。18時間後、培養液を除去し、細胞をPBSで二回洗うことで新鮮な培養液を得た。形質移入の48時間後、細胞をトリプシンで処理し、クローンを得るため、および/または、組み換えレトロウイルス粒子を安定に生成するという選択のために希釈した。
【0103】
感染実験として、感染させる48時間前に、1/106のプロデューサー細胞を3cmのシャーレに播いた。24時間後、培培養液を除去し、1mlの新鮮な培養液を加えた。さらに、この時点で、2/105のレシピエント細胞を3cmシャーレに置いた。45umフィルターを通じてろ過された、1mlのウイルス含有培養液を用いて標的細胞の感染を行った。最終濃度8um/mlの培養液に、ポリブレンを加えた。感染の6時間後、3mlの新鮮な培養液をそれぞれのシャーレに加えた。感染して72時間後に、FACS解析でeGFPプロモーターの発現を測定した。
【0104】
3. gap/pol発現を合成するpTopoGagPolの合成
プラスミドpGagPolGPTの長鋳型PCR由来のMLV gag/pl発現カセットおよび複製ベクターpCR−XL−TOPO(Invitrogen)の結合によって、ベクターpTOPOgagpolの発現を作成した。プラスミドpGagPolGTP(Markowits, D., Goff, S., Bank, A. 1988, Jounal of Virology 62: 1120−1124)のgag/polコード領域の発現は、MLV LTRプロモーター領域をラットリポコルチンエンハンサー/プロモーターに相同的な、412bp配列に5’融合したものによって制御される。この発現カセットは長鋳型PCRで、リポコルチンのエンハンサー/プロモーターの最初に特異的なプライマーGPTransHin(5’CTGTGATAAACTACCGCATTA−3’)と、ポリアデニル化信号の終わりに特異的なGPTransRuecck2(5’ GTTATTGCAGCTTATAATGG−3’)プライマーのプライマーで単離した。PCRは結果的に6731bpの断片となった。断片を0.8%アガロースゲル上で動作して精製し、DNAバンドを切り出し、そしてDNAをQiaquickプロトコル(Qiagen)で抽出した。40ngのPCR断片と10ngのクローニングベクターpCR−XL−TOPOとを混合し、室温で五分間保温した。1μlの6倍TOPOクローニング停止溶液を加えることによって結合を停止した。”One Shot”コンピテントバクテリア(Invitrogen)を選択されたクローニング混合物とカナマイシン耐性群体とで遺伝子組み換えした。プラスミドDNAは準備された制限酵素EcoRI, XhoI, XbaI, SpeIでそれぞれ消化した。最終的に、正確なプラスミドは、pTOPOGagPOLに設計された。
【0105】
このプラスミドの機能性を評価するため、NIH細胞およびHeLa細胞を、5μgのプラスミドpTOPOGagPol、MLV遺伝子発現カセットを構成するpALF(Cosset, F. −L., Takeuchi, Y., Battini, J. −l., Weiss, R. A., Collins M. K. L 1995, Jounal of Virology 69: 7430−7436)、GFP発現レトロウイルス性ベクターを構成するpLXSNeGFP(Klein, D., Indraccolo, S., von Rombs, K., Amadori, A., Salmons, B., Guenzburg, W. H. 1997, Gene Therapy 4; 12560−1260)で形質移入した。48時間後、4×105個のNIH細胞およびHeLa細胞を、形質移入された細胞培養液上澄みで感染させた。72時間後に、eGFPを解析するFACSでウイルス力価を測定した。プラスミドPOTPOgalpolを使う実験は、コントロールとして、プラスミドpGagPolGPTを用いる実験と同じ力価値を生じ、ベクターpTOPOGagPol内に、gag/pol発現カセットの完全な機能を示す。
【0106】
4. gag/pol遺伝子組み換えマウスの生成
gag/pol遺伝子組み換えマウスの確立として、上記gag/pol発現カセットを得るために、プラスミドpTOPOGagPolをNsiIで消化した。0.8%アガロースゲル上で消化混合物を生成し、6845bpの断片で切り取り、QiaExllゲル抽出キット(Qiagen)でDNAを抽出した。引き続き、12%のPEG6000、1.5M NaClでDNAを沈殿させ、ddH2Oで再び懸濁し、−20℃で保存した。
【0107】
8−10週齢のオスのB6CBAF−1ハイブリッドマウスの精管を切除し、二週間後、それぞれのマウスを、5−8週齢のメスCD−1マウスと、ホルモン処理をすることなく雑種配合した。偽妊娠レシピエントマウスをDNA注入接合体に用いた。
【0108】
過排卵ドナーを提供するために、150μlのNaCl溶液内の7.5I. E. PMSG(妊娠雌馬血清ゴナドトロピン、eCG)を、4−5週齢メスCD−1マウスに腹腔内注入した。48時間後、5 I. E. hCGで排卵を誘起し、ドナーのメスをCD−1マウスと雑種配合した。hCG(ヒト絨毛性ゴナドトロピン)処理の16時間後、雑種配合したメスを安楽死させた。受精した接合体は、37℃で三分間、PBS/10% FCSの1mg/mlヒアルロニダーゼを用いて、引き続き未受精卵からキュムラス細胞を分離し、用意した。パラフィン油でカバーしたPBS/2% FCSの滴下の下で、接合体を37℃で保存した。
【0109】
ガラスキャピラリーを用いてそれぞれの接合体の核に、1〜2plの微小注入溶液(1000−2000 DNAコピー)を注入した。それぞれのドナーマウスの卵管内に、12〜15個の微小注入した接合体を移した。マウス子孫の遺伝子組み合え具合を、次に説明するようにして解析した。
【0110】
陽性のファウンダーマウスをCD1の野生種動物と雑種配合することによって、遺伝子組み換え系統を確立した。
【0111】
マウスゲノムDNA由来のリポコルチン−LTR−gag配列のPCR増幅によって、推定上の遺伝子組み換えマウスのスクリーニングを行った。マウスの尾部末端を切り取り、そしてミラーら(Miller, S. A., Dykes, D. D., Poleky, H. H. 1988, Nucleic Acids Research 16,, 215)による塩析法で、ゲノムDNAを調整した。最終的に、DNAを300μlの無菌水で溶解した。プライマーgagpol−screen(5’−TGCGCTGCTGAGAAGCCAGT−3’)およびgagpol−screen2(5’−TTGTGAGCGATCCGCTCGAC−3’)を用いて、1μlをPCRの対象とした。陽性サンプルは、アガロース電気泳動で特異的な1115bpの信号を生じた。
【0112】
さらに、選択したサンプルをサザンブロット解析の対象とした。20μgのDNAをSspI/NotIで消化し、アガロース電気泳動で分離し、ナイロン膜(Zeta Probe, Biorad)に移した。続いて、移送効率を見積もるために、ブロットしたゲルをエチジウムブロマイドで染色した。2×SSC(3M NaCl, 0.3M Tri−sodium−citrate x 2H2O, pH 7.5−8.0)で10分間、3回膜を洗い、空気で乾かした。DNAを紫外線交差結合により、膜に固定した。68℃で2時間プレハイブリダイゼーション(6x SSC; 5x Denhardta’s; 0.5% SDS; 50μγ/ml サケ精子DNA)行った後、導入遺伝子に特異的なプローブで、膜を68℃で一晩ハイブリダイズした。続いて、2x SSC, 0.1% SDSで68℃で20分間、膜を二回洗い、0.1% SSC, 0.1%SDSで15分間、68℃で一回洗った。最後に、膜をホスホイメージャープレート(Fuji)に暴露した。
【0113】
導入遺伝子に特異的なプローブを得るために、リポコルチンプロモーター断片の一部、MLVプロモーター、そしてgagコーディング領域の一部を持つ2088bp断片を生成するSspIおよびNotIで、プラスミドpTOPOgag/polを消化した。アガロース電気泳動で断片を精製し、そして製造業者の説明書に従って、ランダムプライマーDNAラベリングシステムキット(Life technologies)を用いた初回抗原刺激を用いて、alpha−32P−dCTPで、50μgの断片を標識した。標識されたプローブを、製造業者の説明書に従って、BioSpin−30カラム(BioRad)で精製した。ハイブリダイゼーション後に十分な信号を得るために、最小限の4×108 cpm/μg DNAの特異的な活性を、ハイブリダイゼーション反応に用いた。
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1は、中間クローニングプラスミドおよび半複製的なレトロウイルスベクターを概略的に示す図である。
【0001】
発明の背景
遺伝子治療のためのウイルス性ベクターの使用、特にレトロウイルス性ベクターの使用は、現在、アメリカ合衆国およびヨーロッパの両者における様々な承認議定書の中で、治療的遺伝子を転用した選択方法として注目されている。(Kotani, H. et al. 1994, Human Gene Therapy 5:19−28)。しかしながら、これら議定書の多くが、生体内に生じ、治療的遺伝子を持っているレトロウイルス性ベクターと一体となった標的細胞の感染を必要としている。そして十分に感染された細胞が、影響を受けた個々の細胞に戻される (Rosenberg et al. 1992, Human Gene Therapy 3: 75−90; Anderson, W. F. 1992, Science 256: 808−813)。このような生体外での遺伝子治療手順は、標的細胞固体群(例えばリンパ球)が容易に単離されるといった、医学的条件の下での調整として理想的である。さらに、標的細胞の生体外感染は、使用前に安全性が厳密に調べられることで、濃縮されたウイルスの多量投与を可能にする。
【0002】
残念ながら、容易に単離され、培養され、そして再び導入される標的細胞を含み、遺伝子治療のために応用可能な断片(fraction)はない。さらに、生体外遺伝子治療の複雑な技術およびこれに関連した高いコストが、事実上、生体外遺伝子治療の世界的で広範囲に渡る普及を妨げている。将来、容易で費用効果のある遺伝子治療のために、細胞を生成するレトロウイルス性ベクターの注入あるいは簡単な移植の形で、患者にウイルス性ベクターあるいはウイルス性ベクターを生成する細胞を直接投与するといった生体内での取り組みが必要であろう。
【0003】
この種の生体内での取り組みは、当然、様々な新しい問題をもたらす。まず、そしてとりわけ、安全性に注意を向けなければならない。ウイルスはおそらく、ウイルス生成細胞の移植から生成されるので、生成されたウイルスを事前に点検する機会はないだろう。そのような系の使用に含まれる、限られた危険性の認識およびこの危険性を最小限にする新しい系の構築が重要である。
【0004】
治療的な目的のためのレトロウイルス性ベクター自体は、一般的に、レトロウイルス性タンパク質をコードする遺伝子が、標的細胞に転移されるべき治療的遺伝子およびマーカー遺伝子に置き換わった、修飾されたベクターである。レトロウイルス性タンパク質をコードする遺伝子の置き換えによって、ウイルスは事実上ウイルスを無能にし、このウイルスの複製は不完全となる。このウイルスは、ウイルス性を欠乏しているタンパク質に修飾されたレトロウイルスを提供する成分によって救済されなければならない。この成分は、一様に多量のウイルス性タンパク質を生成する細胞株であるが、複製成分ウイルスを生成する能力を欠乏している。この細胞株は、パッケージング細胞株(packaging cell line)として知られており、パッケージングされる、修飾されたレトロウイルス性ベクターを可能にする遺伝子を持つ第2プラスミドによって形質移入された細胞からなる。
【0005】
パッケージベクター(packaged vector)を生成するために、ベクタープラスミドは、パッケージング細胞株内に形質移入される。これらの条件下で、治療遺伝子およびマーカー遺伝子の挿入された修飾レトロウイルス性ゲノムは、ベクタープラスミドから複写され、修飾されたレトロウイルス性粒子(組み換え型ウイルス性粒子)内にパッケージングされる。この組み換え型ウイルスは、それから、標的細胞を感染するために用いられる。この標的細胞内で、ベクター遺伝子および運搬されたマーカー遺伝子あるいは治療的遺伝子は、標的細胞のDNAに組み込まれる。なぜなら、そのような組み換え型ウイルス性粒子によって感染された細胞には、すべてのレトロウイルス性タンパク質が存在しないからである。しかしながら、治療的遺伝子およびマーカー遺伝子を持つベクターのDNAは、DNA細胞内に組み込まれ、感染細胞にて発現する。
【0006】
生体内での遺伝子治療の使用および安全性を実用的な点から考える上で、次に考えなくてはならないのが、レトロウイルス性ベクターのターゲティングである。ベクターによって運搬される治療的遺伝子は、すべての組織および細胞内で分別なく発現されるべきではなく、むしろ必須の標的細胞内でのみ発現されるべきであるということは明らかである。このことは、特に、特定の腫瘍細胞の除去を対象とした、転移される遺伝子が毒性遺伝子あるいは自殺遺伝子である場合に重要である。他の標的とならない細胞の除去は、当然、極めて望ましくない。
【0007】
運搬された治療的遺伝子のターゲティングを行う、多数のレトロウイルス性ベクターシステムが記述されている(Salmons, B. and Guenzburg, W. H. 1993, Human Gene Therapy 4: 129−141)。これら取り組みの多くは、予め定められた細胞型に限った感染、あるいは、より多くは、特定の細胞型に対する非相同的な治療的遺伝子、あるいはマーカー遺伝子に関連した、非相同的な治療的遺伝子を用いるものである。しかしながら、遺伝子の発現の真核生物的調整(eucaryoticregulation)は、未だ完全に解明されていないほど非常に複雑な工程である。遺伝子の発現を制御しているDNA配列は、“調節配列”と呼ばれている。これらの配列は、一般的に、プロモーターからなる。そしてこのプロモーターにおいて、通常の転写因子、ポリメラーゼ集合体および遺伝子がタンパク質を調節する配列が、プロモーターにおける集合過程の速度を制御するために結合する。プロモーターは、一般に、遺伝子の5’末端に即座に見出される。制御タンパク質が結合する配列は、これにより、遺伝子の転写の活性や抑制を行い、さらに、遺伝子の上流に位置し、”エンハンサー”および/または”サプレッサー”と呼ばれる。高等真核生物においては、50000以上のヌクレオチド対に亘る、点在した遺伝子の調節配列を見出すことは例外的である。けれども、このDNAのほとんどが、”スペーサー”とよばれる配列であり、遺伝子制御タンパク質によって認識されない。
【0008】
調節配列がベクター内で遺伝子の発現を引き起こすために用いられるとすれば、レトロウイルス性ベクターの限られた受容のために、核酸配列の短い伸長のものだけがベクター内に導入される。したがって、調節配列の部分だけが、ベクター内のマーカー遺伝子の発現や、治療遺伝子の発現を引き起こすために使用される。レトロウイルス性ベクター、例えば、遺伝子治療に使用可能な調節配列を得るためには、上記調節配列内の領域は、調節配列の通常の機能、特に組織特異性のために必要な領域と同じでなければならない。調節配列の活性および組織特異性を定義する精密な配列のモチーフについての知識によって、特有な応用、例えば、遺伝子治療のための最適なプロモーターの設計が可能になる。
【0009】
しかしながら、制御領域の本質的な領域については、限られた情報しか利用できない。核酸配列に基づく機能的ドメインを予測するコンピューターモデルは利用できるが、それは予測に過ぎない。実際の機能的ドメインは異なっているかもしれなく、あるいは、単にモチーフが未だ知られていないだけかもしれない。他の方法はフットプリント法のようなタンパク質結合解析に基づいており、制御領域内の機能的な配列は、この機能的な配列と結合するタンパク質によって示される。しかしながら、この方法は、これらの配列モチーフが必須、あるいは補助的なエンハンサーやサイレンサーである場合には、この方法によってタンパク質はこれらの配列モチーフの機能と結びつかない。現在のところ利用可能であり、最も有用な調節配列の解析方法は、レポーター遺伝子解析である。この方法によれば、プロモーターの原型あるいは変異体は、レポーター遺伝子の上流で融合している。すなわち、レポーター遺伝子の中を進んだプロモーターにおいて転写を開始させるために、遺伝子は測定可能なタンパク質あるいはタンパク質活性を簡単にコードする。引き続いて、構成は細胞培養系の生細胞内に形質移入され、レポータータンパク質の量および/または活性度が決定される。しかしながら、細胞培養系における細胞は、自然状態の細胞に比べて弱いことが多い。ほとんどの細胞が不死化している、すなわち、制限されない経路の数に亘って培養することができる。しかしながら、どの経路でも細胞の特性は変化し、これら細胞は、これら細胞自身に由来する器官の典型でなくなってしまう。たとえ細胞が器官から単離されて間もない細胞、すなわち、器官の細胞と似た細胞であっても、取り囲む細胞や、自然な細胞外基質といった自然系を欠いているからである。その結果、レポーター遺伝子構成は、自然系内と同じように作用しない。したがって、自然系においてプロモーターが特異的因子の存在下で活性であっても、ある場合には細胞培養系において検査されたレポーター遺伝子構成は、逆に不活性である。したがって、生体内におけるレポーター遺伝子解析の結果は、しばしば、誤って導かれる。
【0010】
結果として、最終的な結果を得るためには、実験動物による生体内での研究が必要である。仮に異なる細胞型でにおけるプロモーターの活性が解析されれば、調節配列に関与する遺伝子組み換え動物が使用される。遺伝子組み換え動物は、例えば、マイクロインジェクション、すなわち1細胞分裂胎芽(1−cell stage)内への異種遺伝子構成の注入、または、移植前胎芽の、レトロウイルス性ベクターDNA(Gordon J. et. al. 1980, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 77: 7380−7384, Jaenisch R. et al. 1983, Cell 32: 209−216)の注入によるものである。結果として、胎芽は、さらに、受容者となる養母の卵管/子宮に移転された後、満期になるまで発育する。結果として成熟した動物のいくらかは、ゲノム内に組み込まれた非相同的なDNAを有している。仮に、遺伝子線細胞(germ line cells)(卵あるいは精子)が修飾されれば、上記遺伝子細胞から発達する、すべての動物は、遺伝子細胞を含んでいる体内のすべての細胞に、異質な核酸配列を含み、そしてこの核酸配列を、その子孫となる細胞に受け渡す。そのような生殖細胞系が修飾された動物は、”遺伝子組み換え”と呼ばれ、遺伝子組み換えされた異質のDNAは、”遺伝子組み換え遺伝子”と呼ばれる。遺伝子組み換え動物は決まってほとんどが特別な実験室で生成され、困難な工程であり、時間や費用がかかり、最初の試みによって単一の遺伝子組み換え動物を生成するのに失敗するため、時には繰り返さなければならない。したがって、遺伝子組み換え動物の生成に基づくプロモーターの解析にはかなりの労力が必要であり、それゆえ、1あるいは非常に限られた数のプロモーターに対してしか実施することができない。
【0011】
プロモーター活性の解析のために、遺伝子組み換え動物の生成を回避するために、他の方法を試した:プロモーターレポーター遺伝子構成を持つレトロウイルス性ベクターで動物を感染した。レトロウイルス性のライフサイクルにしたがって、レトロウイルス性ベクターは細胞に入り、細胞のゲノム内に組み込まれ、そして、その結果、調節配列が活性な、それらの細胞内にレポーター遺伝子が発現した。しかしながら、生体内での形質移入では、実験および治療を目的として使用される、安全なレトロウイルス性ベクターの性能は非常に低かった。それゆえ、散発的な細胞のみが結果として遺伝子組み換えされず、そしてそれゆえレポーター遺伝子を発現せず、多数の細胞に取り囲まれたレポーター遺伝子を発現する単一の細胞に形質移入される。しかしながら、感染された細胞の数が少ないために、レポーター遺伝子活性を検出するのは困難となってしまう。特に関与する調節配列がある組織において全く不活性であり、発現レベルが低く、それゆえ検出されない状態で区別するのが難しい。たとえレポーター遺伝子の発現が高いとしても、感染した細胞は見落とされるであろう。したがって、調節配列は、レトロウイルス性ベクター内にプロモーターレポーター遺伝子構成を導入することによって解析されることはない。
【0012】
予め判っている細胞型に対しての、遺伝子の輸送のターゲティングにおけるさらなる問題は、包囲されたウイルスの感染範囲であろう。包囲されたウイルスの感染範囲は、ウイルス性表面タンパク質遺伝子(”env−遺伝子”)によってコードされたウイルス性表面タンパク質と、レセプターとして作用する宿主細胞膜タンパク質との相互作用によって決定される。ウイルス由来のベクターは、ウイするの感染範囲が修飾されない限り、本来のウイルスが行うように、同じ細胞型内に遺伝子を運搬する。感染のレベルにおいてウイルスの能力を標的の特定の細胞型に結合する方法は、ウイルスの核および遺伝子情報を持つであろう“偽型”のウイルス粒子を生じさせることであり、制限された感染範囲を含む他のウイルスの表面タンパク質を生じさせることである。またウイルス性の表面タンパク質の修飾は、特定の細胞の標的感染となるであろう:ヒトの細胞が、ウイルス性表面タンパク質の結合配列と機能的に相互作用するレセプターを発現しないため、狭宿主性のレトロウイルスは、ヒトの細胞を感染させない。ウイルス性表面タンパク質の結合領域にレセプターリガンド(Kasahara et al. (1994), Science 266, 1373−1376)やその機能的な断片(Valsesia−Wittmann et. al. (1996), J. Virol. 70, 2059−2064)あるいはモノクローナル抗体(Russel et al, (1993), Nucl. Acids Res. 21, 1081−1085) を挿入すると、特定の細胞型に対して対応したレセプターを発現する、修飾されたレトロウイルスの特定の標的となる。
【0013】
安全性の面から、ウイルスを持つベクター(例えば、毒性のある治療遺伝子は、必要な標的細胞だけしか感染させない)を確保するために、ウイルスの感染範囲を予測することが非常に望ましい。さらには、細胞レセプターあるいは細胞リガンドの組織および細胞型分布を決定する系を有することが望ましい。
【0014】
発明の目的
本発明の目的は、組織および/または腫瘍に特異的であり、非相同性の系(例えば、遺伝子的構造)に含まれるとしても、生体内での活性および特異性を維持する、調節配列あるいはウイルス性組成の活性および/または特異性の評価方法を改良することで、不変で費用のかからない方法を提供することにある。調節配列の例として、プロモーターおよびエンハンサーがある。ウイルス性成分は、ウイルス性表面タンパク質であることが好ましい。本発明のさらなる目的は、細胞レセプターあるいは細胞リガンドの組織および細胞型分布を決定する系を提供することにある。上記方法は遺伝子治療における治療的遺伝子およびマーカー遺伝子の発現のためのウイルス性ベクターにおいて使用される、ウイルス性成分の評価に応用される。
【0015】
発明の詳細な説明
前記および他の目的を達成するための方法を本発明では提供する。この方法では、遺伝子組み換え非ヒト動物の細胞、好ましくは哺乳動物、より好ましくはげっし動物の細胞、そして最も好ましくはマウスの細胞に、ウイルス性ベクターが導入される。しかしながら、上記遺伝子組み換え動物は、ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を少なくとも1つ欠乏している。これらのウイルス性配列には、遺伝子組み換え動物の細胞内に導入されたウイルス性ベクターが含まれており、これによって、遺伝子組み換え動物内で、ウイルス性粒子が複製される。遺伝子組み換え動物を適切な条件下で維持した後で、ウイルス性粒子の生成物、ウイルス性粒子が生成された細胞が、それぞれ検出され、評価される。
【0016】
本発明にかかる方法は、調節配列の活性および/または特異性の評価に対して特に有用である。この際、ベクターに含まれる1あるいはそれ以上のウイルス性配列は、解析される調節配列によって制御される。遺伝子組み換え動物の細胞がウイルス性ベクターで形質移入される場合、あるいは、ベクターを含んでいるウイルス性粒子に感染される場合、まず初めに、少数の細胞が、それぞれ形質移入され、感染される。一般的に、遺伝子組み換え動物のすべての細胞は、形質移入可能および/または感染可能であるが、ベクターに含まれる配列および遺伝子それぞれの発現および/または翻訳は、調節配列が活性な細胞内でしか生じない。このように、例えば、細胞型あるいは組織に特異的なプロモーターが使用される場合、プロモーターがこの可能性を完全に満たすのであれば、評価を行うことができる。遺伝子組み換え動物の細胞内での発現、および、ベクター内に含まれ、ウイルス性粒子の発生に必要なウイルス性配列の翻訳のみが生じる。
【0017】
遺伝子組み換え動物の細胞は、さらに、ウイルス性ベクターがコードしないウイルス性タンパク質を提供し、そしてこれにより、遺伝子組み換え動物の細胞はパッケージング細胞株(packing cell line)に似た機能を持つ。遺伝子組み換え動物のゲノム内に含まれるウイルス性配列によってコードされるウイルス性タンパク質は、永久的に生成されるのが好ましい。これらのウイルス性配列は、さらに、遍在性の、恒常的に活性な調節配列によって制御されることが好ましい。最も好ましくは、MLV−プロモーターが使用されることである。しかしながら、遺伝子は、ベクター内に調節配列が含まれ、遺伝子(群)の発現あるいは翻訳を調節する細胞であって、さらにはウイルス性粒子の発生の活性に必要な細胞内のウイルス性粒子にのみ、遺伝子はパッケージングされる。その結果、遺伝子組み換え動物のこれらの細胞だけが、多数の新しいウイルス性粒子を生成し遊離する。ウイルス性粒子は、こうして他の細胞を感染させ、そしてこの工程が繰り返される。ゆえに、このような”雪だるま効果”が開始され、結果として、新しい細胞を感染させる多数のウイルス粒子を生成する。しかしながら、再度ウイルス粒子を遊離するのは、ウイルス性ベクターのプロモーターが活性な細胞のみである。
【0018】
ベクター内に含まれる調節配列は、最も好ましくは、外膜タンパク質をコードする遺伝子の発現および/または翻訳を制御することであり、この外膜タンパク質は、最も好ましくは広宿主性のウイルス性外膜タンパク質であり、最も好ましくは、VSV−gあるいはGALVである。一般的に、”広宿”タンパク質は細胞型で非特異的なタンパク質、すなわち、これらのタンパク質は、異なる細胞型で活性であり、異なる種内でさえも活性である。したがって、広宿主性の外膜タンパク質はウイルス性ベクターに含まれ、遺伝子組み換え動物の特異的な細胞型内でのみ活性な、調節配列によって制御される。このように、これらの細胞型内だけのenv遺伝子が発現され、翻訳され、そしてこれらの細胞型内のみのウイルス性粒子が発生されなければならない。しかしながら、広宿主性外膜タンパク質を含んでいるウイルス性粒子を遊離した後、粒子は数多くの異なる細胞型および異なる組織それぞれを感染させる。それにもかかわらず、調節配列が活性な、新たに感染された細胞のみが、さらにウイルス性粒子等を遊離する。ベクター内に含まれる調節配列の活性なそれらの細胞は、特に、ウイルス性ベクターが付加的に、例えば、緑色蛍光タンパク質(gfp)遺伝子のようなマーカー遺伝子を含んでいるときに、簡単に検出される。したがって、調節配列が完全に細胞型特異的であるか、調節配列が非常に非特異的であるかを簡単に調べることができる。このようにして、調節配列が標的遺伝子治療に適切か否かを決定することができる。遺伝子組み換え動物のほとんどすべての細胞が、評価される調節配列を含んでいるウイルス性ベクターと感染可能であることを確かめるための他の方法として、表面タンパク質を用いる方法がある。これら表面タンパク質は、細胞レセプターに遍在性を与えるための結合サイトを含むように修飾される。好ましい具体例では、遺伝子組み換え動物は、すべての組織に特異的レセプターを発現し、そして、ウイルス性ベクター内の表面タンパク質が、対応するリガンドの結合領域に存在するように設計することである。もう一つの方法として、リガンドを発現するように動物を設計し、そして表面タンパク質を対応するレセプターに含むように、ウイルス性ベクターを設計することである。このもう一つの方法では、残りのリガンドが細胞膜に結合するように、細胞膜局在化信号(cell membrance localization signal)とともに、リガンドを提供する必要がある。
【0019】
この実施形態に従い、本発明では、
a)ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を少なくとも1つ欠乏しているが、ゲノム内に1あるいはそれ以上のウイルス性配列を含んでいる遺伝子組み換え非ヒト動物の細胞に、少なくとも1つのウイルス性配列を含むウイルス性ベクターを導入することによって、遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子を複製する工程であり、この工程において、ウイルス性ベクター内の上記ウイルス性遺伝子の少なくとも1つが評価される調節要素の制御下にある、というという工程と、
b)遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子が生成するように、遺伝子組み換え動物を適切な条件下で維持する工程と、
c)ウイルス性粒子の生成された細胞を検出する工程とを含んでいる。
【0020】
本発明にかかる方法によれば、”調節配列の特異性”が決定される。この文脈において“特異性”という用語は、すべての組織内、あるいは動物の特徴的な発育段階において、調節要素は活性であるか、あるいは、発育段階のある期間の間だけ、あるいは全く活性でないという事実を述べている。したがって、“制御エレメントの特異性の評価”は、制御エレメントが活性化されている細胞型および発育段階の評価を意味している。特定の細胞内でのみ制御エレメントが活性化するのであれば、上記細胞は他の細胞を次々に感染させることができるようなウイルス粒子を生成するであろう。このように、感染された細胞の数が増え(”雪だるま効果”)、最適な条件下において動物細胞の多く(理想的な場合としては、全ての細胞)が感染されるべきである。どの細胞において調節配列が活性であるかを決定する方法は、当業者には知られている。これらの細胞を同定するのに便利な方法は、調節要素の制御下で、少なくとも1つのウイルス性遺伝子を含んでいるウイルス性ベクターが、同じ調節要素の制御下でマーカー遺伝子を含むことである。これは少なくとも一つのウイルス遺伝子およびマーカー遺伝子をそれぞれコードするウイルス性ベクターの、各々の発現カセット(両方のカセットにおいて、遺伝子発現は同じ調節要素を複製することによって制御される)に含むことによって達成される。この型のベクター構成の不利な点は、ベクターゲノム内において、調節配列が2度生じることであり、これにより望ましくない組み換えが生じるかもしれないということである。従って、最も好ましい実施形態は、ただ一つの調節配列が、少なくとも一つのウイルス配列およびマーカー遺伝子の両方の発現を制御するということである。一つの発現カセットによって両方の遺伝子を発現させるためには、少なくとも一つのウイルス配列およびマーカー遺伝子の間に内的リボソーム結合部位(IRES)を含むことである。IRES要素は、当業者には知られている。この文脈おいては、EMCVのようなピコルナウイルスのIRES要素に対する基準を設けた。さらにIRES要素は、以下に開示される。典型的なマーカー遺伝子は、緑色蛍光タンパク質(gfp)をコードした遺伝子、β−ガラクトシダーゼをコードした遺伝子、または特異的な抗体が結合するタンパク質をコードした遺伝子である。マーカー遺伝子の発現を決定する方法は、当業者に知られている。調節要素の“活性”は、マーカー遺伝子の発現の量によって評価できる。
【0021】
さらに、本発明ではウイルス性成分、特に、標的遺伝子治療において安全な媒体としてさらに使用されるべきウイルス性成分の迅速で簡単な解析のための方法を提供する。
【0022】
細胞親和性、すなわち外膜ウイルスの、ウイルス性感染の特異性は、細胞の表面上の対応するレセプターと作用するウイルス性外膜タンパク質によって決定される。仮に対応するレセプターが遍在性であるとすれば、ウイルスは全ての細胞に感染させることができる。仮にレセプターが特定の細胞上にのみ存在しているとすれば、それらの細胞のみが、感染に対して感染性を持つ。非外膜ウイルスの場合には、細胞親和性は、ウイルス性カプシドの表面上の、特定のタンパク質によって定義される。本発明の文脈において、“表面タンパク質”という用語は、ウイルスの表面上にある全てのウイルス性タンパク質のことであり、標的細胞と相互作用し、ウイルスが細胞内に侵入するのに必要なものである。それゆえ、この用語は包膜ウイルスの外膜タンパク質と同様、細胞と接触する非外膜ウイルスのカプシドタンパク質を網羅している。表面タンパク質という用語は、修飾された表面タンパク質など、自然に発生する表面タンパク質を網羅している。”修飾された表面タンパク質”は、ウイルス性表面タンパク質内に自然には生じない細胞レセプターへの結合配列を含むために修飾された表面タンパク質である。ウイルス性表面タンパク質内で自然には生じない結合配列として、例えば、レセプターリガンド((Kasahara et al. (1994), Science 266, 1373−1376)やその機能的な断片(Valsesia−Wittmann et. al. (1996), J. Virol. 70, 2059−2064)、あるいは、モノクローナル抗体(Russel et al, (1993), Nucl. Acids Res. 21, 1081−1085) あるいは他のウイルス性表面タンパク質の結合領域がある。列挙された参考は、そのような結合領域がどのようにしてウイルス表面タンパク質に導入され、標的細胞の感染に行き着くかを明らかにしている。“修飾された表面タンパク質”という用語はまた、ウイルス性の表面タンパク質では自然には生じない、細胞リガンドに対する結合配列を含むために修飾された表面タンパク質も網羅している。”細胞リガンド”という用語は、細胞膜に結合しているリガンドのことをいう。この文脈において、この用語は、細胞リガンドで自然に生じることも網羅している。
【0023】
本発明にかかる方法はまた、表面タンパク質、特にウイルスの外膜タンパク質の特異性を評価するためにも用いられる。すなわち、表面タンパク質、特にウイルスの外膜タンパク質が安全な遺伝子輸送媒体として用いられるならば、腫瘍細胞のような特別の標的細胞の細胞表面にのみ付けることが実際に可能であれば、解析することができる。次に、包膜ウイルスの表面遺伝子、すなわちenv遺伝子について例示する。本発明の概念は、細胞との相互作用に必要なタンパク質をコードした非包膜ウイルスの遺伝子に対する方法にも似た方法で適用することができるということを当業者は理解している。その結果、 “env遺伝子”、および、“envタンパク質”という用語は、より一般的な用語として、“表面遺伝子”、および、“表面タンパク質”それぞれで置き換えることが可能である。先にも触れたように、“表面タンパク質”、は“修飾された表面タンパク質”も、先の定義から網羅している。仮に、特異性が評価される遺伝子がenv遺伝子であれば、すなわち、遺伝子組み換え動物の細胞内、あるいは、非機能的Envタンパク質、あるいは、env遺伝子が完全に欠失されている場合には、Envタンパク質は生成されない。同様に、解析されるべき特別なenv遺伝子はウイルス性ベクターに含まれるが、遍在性の、恒常的に活性な調節配列によって制御されることが好ましい。仮に本発明による方法が動物内のリガンドのためのレセプターの分布を評価するために使用されるなら、同様のことが同じく適用される(以下を参照)。遺伝子組み換え動物の細胞の感染もしくは形質移入の後、外膜タンパク質を構成するさらなるウイルス性粒子は生成されて遊離される。しかしながら、遺伝子組み換え動物のさらなる細胞は唯一ウイルス表面もしくは外膜タンパク質、さらにレセプターとして働く宿主細胞膜タンパク質の間に反応が起こるときに感染される。引き続き、仮にウイルスの外膜がまさに制限された感染範囲を含み、それがすなわち、治療的遺伝子の標的細胞に対する標的転移に適用可能ならば、評価されることが可能だろう。この実施形態によれば、本発明は、
a)ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を少なくとも1つ欠乏しているが、ゲノム内に1あるいはそれ以上のウイルス性配列を含んでいる遺伝子組み換え非ヒト動物の細胞に、少なくとも1つのウイルス性配列を含むウイルス性ベクターを導入することによって、遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子を複製する工程と、
b)遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子が生成するように、遺伝子組み換え動物を適切な条件下で維持する工程と、
c)ウイルス性粒子の生成された細胞を検出する工程とを含んでいる。
【0024】
他の実施形態によれば、本発明では、ウイルスの表面タンパク質の特異性を評価する方法を提供する。この方法は、
a)ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を少なくとも1つ欠乏しているが、ゲノム内に少なくとも、ウイルス性表面タンパク質をコードする遺伝子を含んでいるウイルス性配列を含んでいる遺伝子組み換え非ヒト型動物の細胞に、ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を含んでいるウイルス性ベクターを導入することによって、遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子を複製する工程と、
b)遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子が生成するように、遺伝子組み換え動物を適切な条件下で維持する工程と、
c)ウイルス性粒子の生成された細胞を検出する工程とを含んでいる。
【0025】
この別の実施態様が、同じレセプターを使用するウイルスの感染を遮断するために表面タンパク質が細胞表面のレセプターと反応する細胞から合成されるウイルスには働かないことは、当業者には良く知られている。レトロウイルスのenvタンパク質がこの効果を持つかもしれないことは述べられてきた。すなわち、レトロウイルス性env遺伝子を発現する細胞が、ウイルス性表面に対応するenvタンパク質を発現するレトロウイルスにほとんど感染性が無いことが知られている。したがって、この別の実施態様は唯一、生成された表面タンパク質が同じタンパク質をウイルス性表面に持つウイルスの感染を遮断しないウイルスシステムに働くだろう。
【0026】
本発明による方法では、”ウイルス性表面タンパク質の特異性”を決定する。この文脈での”特異性”という用語は、ウイルス性表面タンパク質が、動物発生のいくつかあるいはすべての段階の間、全ての細胞型または特定の細胞型にのみ存在する細胞レセプターと相互作用するであろうという事実を言及している。そのため、”ウイルス性タンパク質の特異性の評価”は、評価される表面タンパク質を表面に有するウイルスに感染されることの可能な細胞の型と発生的段階との評価を意味している。感染細胞内のみおいてウイルス性粒子の生成が生じる。したがって、ウイルス性粒子の生成は、細胞がウイルス性表面に、この細胞に対して特異的なタンパク質を持つウイルスに感染したこと意味する。どの細胞が感染したのかを決定する別の方法は、検出可能な遺伝子生成物を発現するマーカー遺伝子をコードするウイルス性配列を、少なくともウイルス性表面タンパク質を含むウイルスベクターに含むことである。そのようなマーカー遺伝子の例は当業者に良く知られており、そしてとりわけ緑色蛍光タンパク質、またはβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子含む。当業者はこれらの遺伝子の発現の検出、および、定量化の方法を知っている。マーカー遺伝子は、全ての細胞と細胞型の中で活性であることが望ましいプロモーターによって制御されるべきである。ウイルスベクターは、マーカー遺伝子と同じ、もしくは異なるタイプのプロモーターによって制御される、二つの離れた発現カセットに、ウイルス性表面タンパク質をコードするウイルス性配列を含んでいてもよい。望ましくはウイルス性表面タンパク質をコードしている遺伝子とマーカー遺伝子とは、一つのプロモーターからの、一つの発現カセット内に発現している。この場合、IRES要素は両方の遺伝子の間に挿入されなければならない。表面タンパク質の、”活性”は、特定の細胞型または組織によって生成されるウイルス性粒子の定量化、または、マーカー遺伝子の発現の定量化によって評価される。
【0027】
上記で指摘したように、表面タンパク質はまた、上記で定義した修飾表面タンパク質となることが可能である。望ましい実施態様では、修飾表面タンパク質は、結合部位、例えば細胞に結合するように接近している領域に、細胞レセプターに対するリガンドを持つ表面タンパク質であることである。したがって、本発明による方法は、どの細胞に表面タンパク質の結合部位に含まれるリガンドに対するレセプターが発現しているのかを評価するのに使用することができる。ウイルス性表面タンパク質に含まれるリガンドに特異的なレセプターを含むそれらの細胞だけが感染される。望ましい実施態様によると、修飾されていない表面タンパク質は、動物の細胞表面にある、対応するレセプターを持たない表面タンパク質である。修飾されていない表面タンパク質を持つウイルスは、それゆえ、動物の細胞を感染させるべきではない。この型のウイルスの一例は、狭宿主性のレトロウイルスである。あるいは、リガンド配列を細胞レセプターが存在する表面タンパク質に挿入することができる。この場合、表面タンパク質が細胞レセプターと相互作用を生じないように、リガンドを表面タンパク質の結合部位に挿入することが好ましい。修飾されたウイルス性表面タンパク質の、細胞への結合は、そうして、表面タンパク質にあるリガンドと、リガンドの細胞レセプターとの相互作用によるとされるべきである。本発明による方法はまた、仮に修飾された表面タンパク質の表面タンパク質部分が修飾されていない表面タンパク質の細胞レセプターへの残余結合を示すのであれば、適用可能である。この実施態様では、遺伝子組み換え動物を、修飾されていない表面タンパク質を発現しているベクターと感染させることや、その結果を同じ型の遺伝子組み換え動物の修飾された表面タンパク質を発現しているベクターとの感染の後に得られた結果と比較することが必要であろう。
【0028】
本発明の文脈において、”リガンド”という用語は、細胞表面にある特異的な構造、すなわちレセプターに特異的に結合するどのようなペプチドまたはタンパク質も意味する。したがって、リガンドは、例えば成長因子、インスリンなどのホルモン、モノクローナル抗体の結合部位であり得る。”レセプター”は、リガンドと相互作用する細胞表面上の構造として定義される。したがって、レセプターはとりわけ成長因子レセプター、ホルモンレセプター、または修飾されたウイルス性表面タンパク質にある抗原結合部位に特異的な抗原であり得る。”動物でのレセプターの分布”という用語は、細胞の表面上にレセプターが発現して存在している細胞型および組織を意味する。したがって、動物でのレセプターの分布の評価は、実際には細胞の表面上にレセプターを持つ、細胞型と組織との評価である。
【0029】
この実施形態において、本発明は、動物のレセプターの、リガンドの分布を評価する方法を提供する。この方法は、
a)ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を少なくとも1つ欠乏しているが、ゲノム内に1あるいはそれ以上のウイルス性配列を含んでいる遺伝子組み換え非ヒト動物の細胞に、少なくとも1つのウイルス性配列を含むウイルス性ベクターを導入することによって、遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子を複製する工程であって、この工程において、ウイルス性表面タンパク質に対してコードするウイルス性配列は、リガンドに対してコードする配列を持っており、これによりこの配列の発現において、細胞レセプターと相互作用するように接近したタンパク質部分のリガンドの配列を含む修飾されたウイルス性表面タンパク質が生成される、という工程と、
b)遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子が生成するように、遺伝子組み換え動物を適切な条件下で維持する工程と、
c)ウイルス性粒子の生成された細胞を検出する工程とを含んでいる。
【0030】
他の実施形態においては、本発明は、動物のリガンドの、レセプターの分布を評価する方法を提供する。この方法は、
a)ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を少なくとも1つ欠乏しているが、ゲノム内に1あるいはそれ以上のウイルス性配列を含んでいる遺伝子組み換え非ヒト動物の細胞に、ウイルスの生成に必要な欠乏ウイルス性配列を含んでいるウイルス性ベクターを導入することで、遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子を複製する工程であって、この工程において、ウイルス性表面タンパク質に対してコードするウイルス性配列はリガンドに対してコードする配列を含んでおり、これにより配列の発現において、細胞レセプターと相互作用するように接近したタンパク質部分内のリガンドの配列を含む修飾されたウイルス性表面タンパク質が生成される、という工程と、
b)遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子が生成するように、遺伝子組み換え動物を適切な条件下で維持する工程と、
c)ウイルス性粒子の生成された細胞を検出する工程とを含んでいる。
【0031】
この他の実施態様によると、修飾されたウイルス性表面タンパク質の発現は、好ましくは遍在性の、恒常的に活性な制御配列によって制御されるべきであることである。好ましい制御配列は述べられている。最も好ましいのはMLV制御配列である。
【0032】
すでに上記で指摘したように、この他の実施態様は、仮に細胞から生成される修飾された表面タンパク質が、ウイルスを妨害するために同じレセプターを用いて細胞上のレセプターと相互作用するのであれば、ウイルスには作用しないということが当業者には良く知られている。したがって、この他の実施態様は感染されていない細胞から生成される、修飾された表面タンパク質が、同じタンパク質をウイルス性表面に持つ、ウイルスとの感染を妨害しないウイルス系にのみ作用する。
【0033】
一般に、動物のレセプター分布の評価方法における最も好ましい実施態様は、二つの上記で要約された最も望ましいウイルス成分の特異性を評価するための方法の実施態様に関連し、その点で、ウイルス成分は、ウイルス性表面タンパク質である。
【0034】
発明のさらなる実施態様によれば、遺伝子組み換え動物は、パッケージング信号をコードするウイルス性配列を欠乏している。このウイルス性配列は、遺伝子組み換え動物のゲノム内で全く機能しないことが最も好ましい。
【0035】
上記ですでに簡潔に指摘したように、本発明における方法で用いられる、最も望ましい非ヒト遺伝子組み換え動物は、例えば、CD1、FVB、NMRI、C57/Black6、ICR系統のマウスである。動物はおそらく健康的か、あるいは遺伝的に、代謝的に、増殖的に、あるいは他の障害を被っている。遺伝子組み換え動物は、例えば、重症複合免疫不全症(SCID)マウスの場合のように、効果的な免疫システムを欠乏していることが最も好ましい。したがって、動物の免疫機構は、生成された感染性の粒子を攻撃することができない。
【0036】
遺伝子組み換え動物の遺伝子のゲノム内に組み込まれたウイルス性配列、および、ウイルス性粒子を複製するウイルス性配列を含んでいるウイルス性ベクターは、同じウイルス性の系に由来することが好ましく、すなわち、ウイルス性配列も、ウイルス性ベクターも、非レトロウイルスあるいはレトロウイルスに由来することが好ましい。ウイルス配列およびウイルス性ベクターは、どちらもレトロウイルス性起源であることが最も好ましい。
【0037】
レトロウイルス性ベクターは、レトロウイルス性遺伝子に基づいている。単純なレトロウイルスのレトロウイルス性遺伝子は、基本的にはR−U5−gag−env−U3−R構造を含んでいるRNA分子から成る。逆転写工程の間に、U5領域は、生成したDNA分子の右手末端において複製され、一方でU3領域は、生成したDNA分子の左手末端において複製されて配置される。その結果生じたU3−R−U5構造は、LTR(末端反復配列)と呼ばれ、そのため同一であり、そしてDNA構造またはプロウイルスの両方の末端で繰り返される。プロウイルスの左手末端におけるU3領域は、プロモーターを収容する。このプロモーターは、左手U3とR領域との間の境界で開始され、右手RとU5領域との間の境界で終了するRNA転写物の合成を引き起こす。標的細胞の中で、RNA遺伝子は上述したように再び逆転写される。
【0038】
典型的なレトロウイルス性ベクターは、二つの完全なLTRs−a5’およびa3’LTR−、そしてベクターの体内にあるLTRの間にある、関与する配列のための挿入部位から構成される。この場合、調節配列は、上述したレトロウイルスそれぞれの配列・遺伝子と同様の調節配列に調節される、ベクターの体内に挿入される可能性がある。しかしながら、調節配列はLTRの中に挿入されるのが好ましく、LTRのU3領域に挿入されるのがより好ましい。レトロウイルス性ベクターは、プロモーター転換(ProCon)ベクターであることが最も好ましい(PCT/EP95/03445を参照)。
【0039】
プロモーター転換ベクターにおいて、右手のU3領域は改変されるが、しかし、正常な左手のU3構造は保たれる;ベクターは、左手U3領域内に位置する、正常なレトロウイルス性プロモーターを使用するRNA内に転写される。しかしながら、生成されたRNAは、改変された右手のU3構造しか含まない。感染された標的細胞では、逆転写の後、この改変されたU3構造は、レトロウイルス性構造の両端に配置される。
【0040】
改変した領域は、U3領域の代わりにポリリンカーを持っている。そのため、それらの直接的な組織特異的発現を含むどのような調節配列も容易に挿入されることになる。このプロモーターはそのためレトロウイルス性ベクターによって運ばれる連鎖遺伝子の発現のために、標的細胞において排他的に使用される。
【0041】
発明のこの具体的な実施態様によると、調節配列の支配下でのレトロウイルス遺伝子を構成するレトロウイルス性ベクターは、次のようにして生成されることが可能である;ProConベクターにおいて、レトロウイルス性遺伝子をコードするタンパク質、望ましくはenvがベクターの体内に存在する関与する調節配列は、3’−LTRのU3領域に挿入され、その結果生じるベクターは、パッケージング細胞に形質移入される。ProCon原理によると、パッケージング細胞株においては、レトロウイルス性ベクターの発現は、5’−LTRのU3領域に含まれる、正常な、非選択的なレトロウイルス性プロモーターによって制御される。引き続き、ベクターはレトロウイルス性粒子内にパッケージングされる。しかしながら、遺伝子組み換え動物の細胞、(この例では、gagおよびpolを表している)が上記レトロウイルス性粒子に感染される場合には、プロモーター変換が起こり、そしてenvの発現が関与する調節配列によって制御される。本発明によると、レトロウイルス性粒子の生成は、調節配列が活性化している細胞内においてのみ起こる。
【0042】
ProConベクターにおいては、調節配列は、3’LTRのU3領域内に挿入されることが望ましい。さらに好ましくは、U3領域が調節配列によって全体的、もしくは部分的に置き換えられることである。しかしながら、調節配列はまた、3’ LTRのU3およびR領域の間にも挿入される。
【0043】
本発明における、遺伝子組み換え動物の感染もしくは形質移入に用いられるレトロウイルス性ベクターのLTRは、マウス白血病ウイルス(MLV)、マウス乳腺腫瘍ウイルス(MMTV)、マウス肉腫ウイルス(MSV)、サル免疫不全ウイルス(SIV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV)、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)、ネコ白血病ウイルス(FELV)、牛白血病ウイルス(BLV)、サルメイソンファイザーウイルス(MPMV)、およびラウス肉腫ウイルス(RSV)のLTRを構成する群の要素から選ばれるのが好ましい。もっとも好ましくは、両LTRとも、マウス白血病ウイルス(MLV)に由来することである。
【0044】
調節配列によって制御される、評価されるべきenv遺伝子は、VSV−g、LCMV−g(リンパ性脈絡髄膜炎ウイルスの糖タンパク質)、あるいは異なる種の細胞への感染を可能にする、すなわち、幅広い宿主を与えるRD114であってもよい。envはマウス広宿主性env、すなわち、マウス種および非マウス種に由来するenvであることがさらに好ましい。最も好ましくは、MLVの広宿主性4070Aenvが使用されることである。
【0045】
発明の他の好ましい実施態様は、遺伝子組み換え動物にあるレトロウイルス性遺伝子と、レトロウイルス性ベクター内にあるレトロウイルス性遺伝子とが、同じレトロウイルスの型に由来することである。より好ましくは、レトロウイルス性ベクターのLTRもまた、遺伝子と同様に同じ起源に由来することである。最も好ましくは、レトロウイルス性遺伝子およびLTRsがMLVに由来することである。
【0046】
発明の他の実施態様によると、レトロウイルス性ベクターは、レトロウイルス性遺伝子に加えて、非相同性のコード化配列を含んでいる。”非相同性”という用語は、自然状態では本質的に正常ではないDNA配列のどのような組み合わせにおいても用いられる。非相同性コード化配列は、好ましくはマーカー遺伝子、治療的遺伝子、および/または抗腫瘍遺伝子を含む群の要素から選択されることである。上記マーカー遺伝子および治療的遺伝子は、さらに好ましくは、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ネオマイシン遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ヘルペス単一性ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、プロマイシン遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子、チトクロームP450遺伝子、そして緑色蛍光タンパク質(gfp)、青色蛍光タンパク質(bfp)、黄色蛍光タンパク質(yfp)のような蛍光マーカー遺伝子、およびゼオシン耐性遺伝子を含む群の要素から選ばれることである。
【0047】
最も好ましくは、さらなる非相同性遺伝子は、内部リボソーム侵入部位(IRES)に機能的に結合することである。IRESは、リボソームのmRNA配列内のモチーフへの付着を促進し、それによって関連遺伝子が翻訳される。発明の実施形態によると、レトロウイルス性ベクターは、レトロウイルス性遺伝子と、IRESに結合するさらなる非相同性遺伝子を含んでいる。結果的に、レトロウイルス性遺伝子およびさらなる非相同性遺伝子の転写がいずれも同じ調節配列によって制御されるものの、タンパク質内に発現したmRNAのさらなる翻訳は、いずれも独立して、そして分離して行われる。
【0048】
原則として、全ての調節配列は本発明による方法で解析されることが可能である。調節配列は、乳酸化タンパク質(WAP)、マウス乳腺腫瘍ウイルス(MMTV)、β−ラクトグロビン、ラクトアルブミン、そしてカゼイン特異的調節エレメント、および標的ヒト乳腺腫瘍に使用されるであろうプロモーターを含む群の要素を含んでいてもよいが、これらに限定されるものではない。さらに、炭酸脱水酵素プロモーター、グルコキナーゼプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)を含むリンパ球特異的調節エレメントおよびプロモーター、免疫グロブリンとMMTVリンパ球特異的調節領域およびプロモーター、糖質コルチコイドホルモンへの応答性を与える、あるいはヒト乳腺に発現を指示するMMTVP2のようなMMTV特異的調節エレメントおよびプロモーター、T細胞レセプター遺伝子およびCD4レセプタープロモーターのようなT細胞に特異的な調節エレメントおよびプロモーター、免疫グロブリンプロモーターまたは組織因子プロモーターのようなmb1、および腫瘍に特異的なプロモーターのようなT細胞に特異的な調節エレメントおよびプロモーター、癌胎児性胚性抗原(CEA)プロモーター、および血管性内皮成長因子(VEGF)プロモーターのような膵臓に特異的な調節エレメントとプロモーターであってもよい。
【0049】
本発明による方法は、遺伝子治療に使うことを意図したレトロウイルスと関連して非相同性の調節領域を解析するために使われるのが好ましい。この場合、調節配列は、非相同性配列の代わりに、またはさらに遺伝子治療に使用されるレトロウイルス性遺伝子に由来する。レトロウイルス性遺伝子の発現を引き起こす、関与する調節遺伝子は、調節配列がマーカー遺伝子、または治療的遺伝子の発現を引き起こすときには、遺伝子治療のためのレトロウイルス性ベクターの場合と全く同じように機能するのが有利である。したがって、本発明の方法によって、遺伝子治療の間に、例えば、調節配列の活性および組織特異性のレベルを予測することができる。
【0050】
本発明は、本発明による方法によって入手可能な遺伝子組み換え非ヒト動物にも関連し、本発明による方法に適用可能な、遺伝子組み換え非ヒト動物を提供する。後者は、遺伝子に、1あるいはそれ以上のウイルス性配列を含んでいるが、ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を少なくとも1つ欠乏している。したがって、遺伝子組み換え動物の細胞はウイルス性タンパク質を生成するけれども、レトロウイルス性遺伝子は、レトロウイルス性粒子の中に組み入れられない。なぜなら、パッケージング信号および/またはLTR領域のような、複製および/またはパッケージングに必要な配列は、成熟しているかまたは欠落しているからである。ウイルス性粒子の生成に必要な配列の導入は、ウイルス性粒子の複製だけではなく、遺伝子組み換え動物に、上記ウイルス性粒子を拡散する。
【0051】
好ましくは、組み換え遺伝子は、多数の異なる細胞型において発現されることである。最も好ましくは、すべての細胞型において発現されることである。したがって、本発明の好ましい実施態様によれば、ウイルス性配列の発現は、遍在性の、恒常的に活性な調節配列によって引き起こされる。遺伝子組み換え動物の遺伝子に含まれるウイルス性配列がレトロウイルス性起源の場合は、上記レトロウイルス性遺伝子の発現は、SV40エンハンサーおよび/またはプロモーター、β−アクチンプロモーター、ROSA26プロモーター、CDC10プロモーター、あるいはユビキチンプロモーターによって制御されるのが好ましい。そして最も好ましくは、マウス白血病ウイルス(MLV)プロモーターによって制御されることである。
【0052】
好ましくは、動物が、gagおよび/またはpolに対して遺伝子組み換え的であることである。より好ましくは、gagおよび/またはpolがMLVに由来していることであり、最も好ましくは、マウス白血病ウイルス(MLV)プロモーターによって制御されることである。
【0053】
本発明の要点
本発明は特に、以下を単独あるいは組み合わせたものである:
活性および/または調節配列あるいはウイルス性組成の特異性評価は、次の工程を含んでいる。
a)ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を少なくとも1つ欠乏しているが、遺伝子内に1あるいはそれ以上のウイルス性配列を含んでいる遺伝子組み換え非ヒト動物の細胞に、少なくとも1つのウイルス性配列を含むウイルス性ベクターを導入することによって、遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子を複製する工程と、
b)遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子が生成するように、遺伝子組み換え動物を適切な条件下で維持する工程と、
c)ウイルス性粒子の生成された細胞を検出する工程。
【0054】
動物のリガントに対するレセプターの分布を評価する方法は、以下の工程を含んでいる。
a)ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を少なくとも1つ欠乏しているが、ゲノム内に1あるいはそれ以上のウイルス性配列を含んでいる遺伝子組み換え非ヒト動物の細胞に、ウイルスの生成に必要な欠乏ウイルス性配列を含んでいるウイルス性ベクターを導入することで、遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子を複製する工程であって、この工程において、ウイルス性表面タンパク質に対してコードするウイルス性配列はリガンドに対してコードする配列を含んでおり、これにより配列の発現において、細胞レセプターと相互作用するように接近したタンパク質部分内のリガンドの配列を含む修飾されたウイルス性表面タンパク質が生成される、という工程と、
b)遺伝子組み換え動物の細胞にウイルス性粒子が生成するように、遺伝子組み換え動物を適切な条件下で維持する工程と、
c)ウイルス性粒子の生成された細胞を検出する工程。
【0055】
上記方法において、ウイルス性組成はウイルス性表面タンパク質である。
【0056】
上述した方法において、遺伝子組み換え非ヒト動物は哺乳類、好ましくはげっし動物、最も好ましくはマウスである。
【0057】
上記方法において、遺伝子組み換え非ヒト動物は、重症複合型免疫不全(SCID)マウスである。
【0058】
上記方法において、遺伝子組み換え動物は、パッケージング信号に対するウイルス性配列コードを不完全にしている。
【0059】
上記方法において、パッケージング信号に対するウイルス性配列コードは欠失されている。
【0060】
上記方法において、遺伝子組み換え動物のゲノム内に含まれるウイルス性配列の発現および/または翻訳は、遍在性の、恒常的に活性な調節配列によって制御される。
【0061】
上記活性および/または調節配列の特異性を評価する方法において、ベクターに含まれる少なくとも1つのウイルス性配列の発現および/または翻訳が、解析される調節配列によって制御される。
【0062】
上記方法において、遺伝子をコードするenvの発現および/または翻訳が解析される調節配列によって制御される。
【0063】
上記方法において、envをコードする遺伝子の発現および/または翻訳は、解析されるべき調節配列によって制御される。
【0064】
上記方法において、envコードをコードする遺伝子は、広宿主性のenvに対するものである。
【0065】
上記方法において、解析されるべき調節配列は、遺伝子治療に適している。
【0066】
上記ウイルスの外膜タンパク質の特異性を評価する方法において、遺伝子組み換え動物は、envをコードするウイルス性配列を不完全にしている。
【0067】
上記方法において、envをコードするウイルス性配列は、欠失される。
【0068】
上記方法において、ウイルス性ベクターに含まれるenv遺伝子の発現および/または翻訳は、遍在性の、恒常的に活性な調節配列によって制御される。
【0069】
上記方法において、外膜タンパク質は、標的遺伝子治療に適している。
【0070】
上記方法において、ウイルス性配列およびウイルス性ベクターは、レトロウイルス性起源である。
【0071】
上記方法において、遺伝子組み換え動物は、レトロウイルス性ベクターで形質移入される、および/または、上記レトロウイルス性ベクターを含むレトロウイルス性粒子に感染されている。
【0072】
上記方法において、遺伝子組み換え動物のゲノム内に含まれているレトロウイルス性ベクターおよびレトロウイルス性配列は、レトロウイルスの同じ型に由来している。
【0073】
上記方法において、レトロウイルス性配列は、マウス白血病ウイルス(MLV)に由来している。
【0074】
上記活性および/または調節配列の特異性の評価において、調節配列は、レトロウイルス性ベクターの末端反復配列(LTR)に挿入されている。
【0075】
上記方法において、調節配列は、LTRのU3−領域に挿入されている。
【0076】
上記方法において、レトロウイルス性ベクターが、プロモーター転換ベクターに基づいている。
【0077】
上記方法において、レトロウイルス性ベクターが、レトロウイルス性配列に加えて、非相同性遺伝子を含んでいる。
【0078】
上記方法において、非相同遺伝子が、治療的遺伝子、抗腫瘍遺伝子および/またはマーカー遺伝子である。
【0079】
上記方法において、マーカー遺伝子が、緑色蛍光タンパク質(gfp)遺伝子および/またはゼオシン耐性遺伝子である。
【0080】
上記方法において、非相同遺伝子が、内部リボゾーム侵入部位に効率よく結合している。
【0081】
上記方法によって得られる遺伝子組み換え非ヒト型動物。
【0082】
ゲノム体内に1あるいはそれ以上のウイルス性配列を含んでいるが、ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を少なくとも1つ欠乏しており、遺伝子組み換え動物の細胞へ少なくとも1つのウイルス性配列が導入されることによってウイルス性粒子を生成し、遺伝子組み換え動物において上記ウイルス性粒子を拡散する遺伝子組み換え動物。
【0083】
上記遺伝子組み換え非動物において、遺伝子非ヒト動物が哺乳類、好ましくはげっし動物、最も好ましくはマウスである。
【0084】
上記遺伝子組み換え動物において、マウスは、重症複合免疫不全症(SCID)マウスである。
【0085】
上記遺伝子組み換え動物が、ウイルス性配列コード化envを欠乏している。
【0086】
上記遺伝子組み換え動物において、遺伝子組み換え動物のゲノム内に含まれるウイルス性配列の発現および/または翻訳が、遍在性の、恒常的に活性な調節配列によって制御される。
【0087】
上記遺伝子組み換え動物において、ウイルス性配列はウイルス性起源である。
【0088】
上記遺伝子組み換え動物において、調節配列は、調節配列が、SV40エンハンサーおよび/またはプロモーター、β−アクチンプロモーター、ROSA26プロモーター、CDC10プロモーター、ユビキチンプロモーターおよび/またはMLVプロモーターを含む群の要素から選ばれる。
【0089】
上記遺伝子組み換え動物において、レトロウイルス性配列は、マウス白血病ウイルス(MLV)起源である。
【0090】
図:
図1は、中間クローニングプラスミドおよび半複製的なレトロウイルスベクターを概略的に示す。略語:CMV:ヒトサイトメガロウイルス中間初期プロモーター;env:ウイルス性被覆遺伝子;eGFP:増強緑色蛍光タンパク質遺伝子;IRES;Encephalo myocarditisウイルス内部リボソーム侵入部位;SV40−neo(SV−40プロモーター/エンハンサー制御下におけるネオマイシン耐性遺伝子);gfp/zeo:ゼオシン耐性遺伝子と緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子の融合;cyp/zeo:(チトクロームp450 2B1−ゼオシン耐性融合遺伝子)の融合;LTR:末端反復配列;ψ、レトロウイルスパッケージング信号 MMTV;マウス乳腺腫瘍ウイルス
実施例
以下の例で、本発明をさらに説明する。提供する実施例は、当業者によってよく理解されるだろう。しかしながら、本発明の技術の応用性は、この実施例に限定されるものではない。
【0091】
1.MLVに基づいた半複製的レトロウイルス性ベクターpLEIGZ、pLEIGZM、pLEICZおよびpLEICZMの合成
半複製的レトロウイルス性ベクター(図1)は、多くの異なるクローニングベクターと中間ベクターに由来する(図1)。
【0092】
最初の中間生成物を得るために、基本となるクローニングベクターpIRES(Invitrogen)(これはEMCV(Encephalo myocarditisウイルス)からの内部リボソーム侵入部位を持っている)を、M1uIで直線化し、プラスミドpALFの消化によって得られた2118bpのenv遺伝子断片に結合した(Cosset, F. K., Takeuchi, Y., Battini, J. −L, Weiss, R. A., Collins, Mm K. L. 1995; Jounal of Virology 69, 7430−7436)。この最初の中間生成物を、長さ8214bpのpCEIと名づけた。次に、pCEIGZおよびpCEICZベクターを作成するために、前駆体プラスミドpCEIが、gfp/zeoカセットまたはcyp/zeoカセットを挿入するために、それぞれXbalで直線化した。gfp/zeo融合遺伝子カセットは、酵素RsrII/BseRIによる発現ベクターpTracerSV40(Invitrogen)の消化、および、1148bp断片の単離によって得た。同時に、ヌクレオチド15〜377(Genbankアクセスナンバーは、X90639)由来のStreptoallteichus hindustanusブレオマイシン遺伝子に融合した、ヌクレオチド25〜1458(GenbankアクセスナンバーM37134)由来のラットチトクロームP450 2B1遺伝子を含んでいるcyp/zeo融合遺伝子を生成した。直線化されたプラスミドpCEI内への、gfp/zeoカセットの挿入は、結果としてベクターpCEIGZとなり、直線化されたプラスミドpCEIへのcyp/zeoカセットの挿入は、結果としてベクターpCEICZとなった。
【0093】
プラスミドpPEIGZ、pCEIGZを作成ために、pCEIGZをPstl/Notlで消化した。その結果、他の中から、env−IRES−gfp/zeoカセットを含む4185bpの断片が生じた。同時に、レトロウイルス性ベクターpLXSNeGFP(Klein, D., Indraccolo, S., von Rombs, K., Amarodi, A., Salmons, B., Guenzburg W. H. 1997; Gene Thereapy 4, 1256−1260)をRsrll/EcoRIで消化し、得られた4808bpの断片を製造者の説明書にしたがってT4DNAポリメラーゼ(Life Technologies)で平滑末端化し、4185bpの断片に結合した。
【0094】
プラスミドpLEIGZの合成と同時に、ProConに基づいた版(Saller, R. M., Oezbuerk, F., Salmons, B. Guenzburg, W. H. 1998; Jounal of Virology 72, 1699−1703)を合成した。pLEIGXMと呼ばれるこのプラスミドはpLEIGZに非常に良く似ているが、3’−LTRにおけるMLV−U3領域の代わりに、非相同性MMTVプロモーター領域を持っている。そのため、レトロウイルス性ベクター内の遺伝子の発現は、pLEIGZM形質移入細胞内のMLVプロモーター領域によって引き起こされるが、LEIGZM形質移入細胞内のMMTVプロモーターによって引き起こされる。プラスミドpLEIGZMは、プラスミドpLESN1aMのRsrII/EcoRI制限消化物由来の5283bp断片との結合反応において、pCEIGZの4185bpのPstl/Notl断片を用いて合成した。このプラスミドは、プライマーBi01(5’GCCTCGGCCTCTGAGCTATT−3’)およびBi02(5’−ATATCCGCGGGCTAGCTTGCCAAACCT−3’)を用いたpLXSNEGFP断片を含む1025bpのネオマイシン遺伝子PCR増幅によって得た。この断片をSacIIとHindIIIで切り取り、pLXPCMTVeGFPの5787bpのSacII/HindII断片に結合した。このプラスミドはeGFP遺伝子を含むpEGFP−1(Clontech)の862bpのSmaI/HpaI断片を、HpaIで直線化されたプラスミドPLXPCMTVの中に挿入することで得た。プラスミドpLXPCMTVはSacIIでプラスミドpLX125を部分的に消化し、直線化されたベクターをT4ポリメラーゼで処理、再結合して得た。そのため、5’LTRの5’末端にあるSacII部位は破壊され、そして3’LTRの5’末端にあるSacII部位が一つになった。プラスミドpLXSNの3534bpのBamHI/AFlIII断片を結合して、プラスミドpLX125を作成した(Saller, R. M. 1994, Doctoral Thesis, Ludwig−Maximilian University, Munich, Germany)。
【0095】
ベクターpLEICZとpLEICZMを含むチトクロームP450 2B1遺伝子を作るために、プラスミドpCEICZを制限酵素NheIおよびNotIで消化し、4663bp断片を結果として得た。この断片は、env−IRES−cyp/zeoカセットを含んでいるが、プラスミドpLXSNNEGFPにある4808bpのRsrII/EcoRI断片に結合され、結果としてベクターpLEICZを得た。env−IRES−cyp/neoカセットの、プラスミドpLESN1aMのRsrII/EcoRI制限消化物由来の5283bp断片に対する結合は、結果としてベクターpLEICZMを得た。
【0096】
全ての制限消化物、平滑末端化終末化と結合反応は、Life Technologiesの酵素を用いて、製造者の説明書に従って行った。遺伝子組み換えは、同じLife Techinologiesから得たE. coli ME DH5αバクテリアを用いて行った。
【0097】
全ての合成物はin vitroで、可動化アッセイによるenv−gene発現で解析した:5×105 293gagpol半パッケージング細胞、これは293細胞(ATCC CRL 1573)をpGagPolGPTで形質移入することで得た(Markowitz, D., Goff, S., Bank, A. 1988; Journal of Virology 62, 1120−1124)のだが、テストのため3μgのベクターで、そして3μgのpLXSNeGFPで形質移入した。形質移入は、供給者(American Pharmacia)の説明書にしたがってカルシウム−フォスファテート形質移入方法を用いて行った。env遺伝子が発現した場合、ベクターPLXSNeGFPベクターを保持するウイルス粒子が得られるはずである。24時間後、形質移入細胞をリン酸塩バッファー生理食塩水で二回洗い、新鮮な3mlの培養液(DMEM+5%FCS)を加えた。形質移入して48時間後、1mlの培地上澄みを4×105 NIH/3T3標的細胞(ATCC CRL−1658)を感染するために用いた。感染細胞の数をFACS(表1)で48時間後に解析した。
【0098】
表1は、異なるFACS解析による、一時的な形質移入よび感染の後の、効果的な形質移入および感染の結果を示している。
【0099】
【表1】
【0100】
(表1の説明:293gp9T半パッケージング細胞を上記のプラスミドで形質移入した。形質移入した細胞の上澄みを含むウイルスを用いてNIH細胞を感染させたときに、これらの細胞をFACS解析(FACS1)の対象とした。感染された細胞のFACS解析(FACS 2)を、48時間後に行った。数字は緑の割合を示す(gfp陽性細胞)。
【0101】
IRESエレメントおよびgfp/zeo−融合カセットの機能を、zeocin耐性の群体の選択によって評価した。少なくとも100群体の集団が確立され、これらをFACS解析の対象とした。興味深いことに、63%のzeo耐性細胞が、gfp遺伝子を発現する。
【0102】
2. レトロウイルス粒子の産生
5μgのプラスミドDNAを293gag/pol半パッケージング細胞に形質移入することで、組み換えレトロウイルス性粒子の生成を行った。293gag/pol半パッケージング細胞を、293の細胞(ATCC CRL 1573)をpGagPolGPT、または、PA317(Miller, A. D., Buttimore, C. 1986, Molecular and Cellular Biology 6: 2985−2902)のような通常のパッケージング細胞で形質移入することで得た。その目的のため、形質移入の24時間前に、5×105個のパッケージング細胞を、3cmのシャーレに播いた。形質移入は製造業者(CellPhect形質移入キット; Amersham Phamacia)から提供された説明書に従って行った。18時間後、培養液を除去し、細胞をPBSで二回洗うことで新鮮な培養液を得た。形質移入の48時間後、細胞をトリプシンで処理し、クローンを得るため、および/または、組み換えレトロウイルス粒子を安定に生成するという選択のために希釈した。
【0103】
感染実験として、感染させる48時間前に、1/106のプロデューサー細胞を3cmのシャーレに播いた。24時間後、培培養液を除去し、1mlの新鮮な培養液を加えた。さらに、この時点で、2/105のレシピエント細胞を3cmシャーレに置いた。45umフィルターを通じてろ過された、1mlのウイルス含有培養液を用いて標的細胞の感染を行った。最終濃度8um/mlの培養液に、ポリブレンを加えた。感染の6時間後、3mlの新鮮な培養液をそれぞれのシャーレに加えた。感染して72時間後に、FACS解析でeGFPプロモーターの発現を測定した。
【0104】
3. gap/pol発現を合成するpTopoGagPolの合成
プラスミドpGagPolGPTの長鋳型PCR由来のMLV gag/pl発現カセットおよび複製ベクターpCR−XL−TOPO(Invitrogen)の結合によって、ベクターpTOPOgagpolの発現を作成した。プラスミドpGagPolGTP(Markowits, D., Goff, S., Bank, A. 1988, Jounal of Virology 62: 1120−1124)のgag/polコード領域の発現は、MLV LTRプロモーター領域をラットリポコルチンエンハンサー/プロモーターに相同的な、412bp配列に5’融合したものによって制御される。この発現カセットは長鋳型PCRで、リポコルチンのエンハンサー/プロモーターの最初に特異的なプライマーGPTransHin(5’CTGTGATAAACTACCGCATTA−3’)と、ポリアデニル化信号の終わりに特異的なGPTransRuecck2(5’ GTTATTGCAGCTTATAATGG−3’)プライマーのプライマーで単離した。PCRは結果的に6731bpの断片となった。断片を0.8%アガロースゲル上で動作して精製し、DNAバンドを切り出し、そしてDNAをQiaquickプロトコル(Qiagen)で抽出した。40ngのPCR断片と10ngのクローニングベクターpCR−XL−TOPOとを混合し、室温で五分間保温した。1μlの6倍TOPOクローニング停止溶液を加えることによって結合を停止した。”One Shot”コンピテントバクテリア(Invitrogen)を選択されたクローニング混合物とカナマイシン耐性群体とで遺伝子組み換えした。プラスミドDNAは準備された制限酵素EcoRI, XhoI, XbaI, SpeIでそれぞれ消化した。最終的に、正確なプラスミドは、pTOPOGagPOLに設計された。
【0105】
このプラスミドの機能性を評価するため、NIH細胞およびHeLa細胞を、5μgのプラスミドpTOPOGagPol、MLV遺伝子発現カセットを構成するpALF(Cosset, F. −L., Takeuchi, Y., Battini, J. −l., Weiss, R. A., Collins M. K. L 1995, Jounal of Virology 69: 7430−7436)、GFP発現レトロウイルス性ベクターを構成するpLXSNeGFP(Klein, D., Indraccolo, S., von Rombs, K., Amadori, A., Salmons, B., Guenzburg, W. H. 1997, Gene Therapy 4; 12560−1260)で形質移入した。48時間後、4×105個のNIH細胞およびHeLa細胞を、形質移入された細胞培養液上澄みで感染させた。72時間後に、eGFPを解析するFACSでウイルス力価を測定した。プラスミドPOTPOgalpolを使う実験は、コントロールとして、プラスミドpGagPolGPTを用いる実験と同じ力価値を生じ、ベクターpTOPOGagPol内に、gag/pol発現カセットの完全な機能を示す。
【0106】
4. gag/pol遺伝子組み換えマウスの生成
gag/pol遺伝子組み換えマウスの確立として、上記gag/pol発現カセットを得るために、プラスミドpTOPOGagPolをNsiIで消化した。0.8%アガロースゲル上で消化混合物を生成し、6845bpの断片で切り取り、QiaExllゲル抽出キット(Qiagen)でDNAを抽出した。引き続き、12%のPEG6000、1.5M NaClでDNAを沈殿させ、ddH2Oで再び懸濁し、−20℃で保存した。
【0107】
8−10週齢のオスのB6CBAF−1ハイブリッドマウスの精管を切除し、二週間後、それぞれのマウスを、5−8週齢のメスCD−1マウスと、ホルモン処理をすることなく雑種配合した。偽妊娠レシピエントマウスをDNA注入接合体に用いた。
【0108】
過排卵ドナーを提供するために、150μlのNaCl溶液内の7.5I. E. PMSG(妊娠雌馬血清ゴナドトロピン、eCG)を、4−5週齢メスCD−1マウスに腹腔内注入した。48時間後、5 I. E. hCGで排卵を誘起し、ドナーのメスをCD−1マウスと雑種配合した。hCG(ヒト絨毛性ゴナドトロピン)処理の16時間後、雑種配合したメスを安楽死させた。受精した接合体は、37℃で三分間、PBS/10% FCSの1mg/mlヒアルロニダーゼを用いて、引き続き未受精卵からキュムラス細胞を分離し、用意した。パラフィン油でカバーしたPBS/2% FCSの滴下の下で、接合体を37℃で保存した。
【0109】
ガラスキャピラリーを用いてそれぞれの接合体の核に、1〜2plの微小注入溶液(1000−2000 DNAコピー)を注入した。それぞれのドナーマウスの卵管内に、12〜15個の微小注入した接合体を移した。マウス子孫の遺伝子組み合え具合を、次に説明するようにして解析した。
【0110】
陽性のファウンダーマウスをCD1の野生種動物と雑種配合することによって、遺伝子組み換え系統を確立した。
【0111】
マウスゲノムDNA由来のリポコルチン−LTR−gag配列のPCR増幅によって、推定上の遺伝子組み換えマウスのスクリーニングを行った。マウスの尾部末端を切り取り、そしてミラーら(Miller, S. A., Dykes, D. D., Poleky, H. H. 1988, Nucleic Acids Research 16,, 215)による塩析法で、ゲノムDNAを調整した。最終的に、DNAを300μlの無菌水で溶解した。プライマーgagpol−screen(5’−TGCGCTGCTGAGAAGCCAGT−3’)およびgagpol−screen2(5’−TTGTGAGCGATCCGCTCGAC−3’)を用いて、1μlをPCRの対象とした。陽性サンプルは、アガロース電気泳動で特異的な1115bpの信号を生じた。
【0112】
さらに、選択したサンプルをサザンブロット解析の対象とした。20μgのDNAをSspI/NotIで消化し、アガロース電気泳動で分離し、ナイロン膜(Zeta Probe, Biorad)に移した。続いて、移送効率を見積もるために、ブロットしたゲルをエチジウムブロマイドで染色した。2×SSC(3M NaCl, 0.3M Tri−sodium−citrate x 2H2O, pH 7.5−8.0)で10分間、3回膜を洗い、空気で乾かした。DNAを紫外線交差結合により、膜に固定した。68℃で2時間プレハイブリダイゼーション(6x SSC; 5x Denhardta’s; 0.5% SDS; 50μγ/ml サケ精子DNA)行った後、導入遺伝子に特異的なプローブで、膜を68℃で一晩ハイブリダイズした。続いて、2x SSC, 0.1% SDSで68℃で20分間、膜を二回洗い、0.1% SSC, 0.1%SDSで15分間、68℃で一回洗った。最後に、膜をホスホイメージャープレート(Fuji)に暴露した。
【0113】
導入遺伝子に特異的なプローブを得るために、リポコルチンプロモーター断片の一部、MLVプロモーター、そしてgagコーディング領域の一部を持つ2088bp断片を生成するSspIおよびNotIで、プラスミドpTOPOgag/polを消化した。アガロース電気泳動で断片を精製し、そして製造業者の説明書に従って、ランダムプライマーDNAラベリングシステムキット(Life technologies)を用いた初回抗原刺激を用いて、alpha−32P−dCTPで、50μgの断片を標識した。標識されたプローブを、製造業者の説明書に従って、BioSpin−30カラム(BioRad)で精製した。ハイブリダイゼーション後に十分な信号を得るために、最小限の4×108 cpm/μg DNAの特異的な活性を、ハイブリダイゼーション反応に用いた。
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1は、中間クローニングプラスミドおよび半複製的なレトロウイルスベクターを概略的に示す図である。
Claims (37)
- 活性および/または、調節配列あるいはウイルス性成分の特異性を評価する方法であって、
a)ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を少なくとも1つ欠乏しているが、ゲノム内に1あるいはそれ以上のウイルス性配列を含んでいる遺伝子組み換え非ヒト動物の細胞に、少なくとも1つのウイルス性配列を含むウイルス性ベクターを導入することによって、遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子を複製する工程と、
b)遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子が生成するように、遺伝子組み換え動物を適切な条件下で維持する工程と、
c)ウイルス性粒子が生成した細胞を検出する工程とを含んでいることを特徴とする方法。 - ウイルス性成分が、ウイルス性表面タンパク質であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- a)ウイルスの生成に必要なウイルス性表面タンパク質をコードする遺伝子を含むウイルス性配列を少なくとも欠乏しているが、ゲノム内に1あるいはそれ以上のウイルス性配列を含んでいる遺伝子組み換え非ヒト動物に、少なくともウイルス性配列を含んでいるウイルス性ベクターを導入することによって、遺伝子組み換え動物の細胞におけるウイルス性粒子を複製する工程であって、この際ウイルス性表面タンパク質をコードするウイルス性配列コードはこの配列の発現の際に細胞レセプターと相互作用するよう近接したタンパク質の部分の配列を含む修飾されたウイルス性表面タンパク質が生成されるようにコード化配列を含んでいる、という工程と、
b)遺伝子組み換え動物の細胞内にウイルス性粒子が生成するように、遺伝子組み換え動物を適切な条件下で維持する工程と、
c)ウイルス性粒子の生成された細胞を検出する工程とを含んでいることを特徴とする方法。 - 遺伝子組み換え非ヒト動物が、哺乳動物、好ましくはげっし動物、特に好ましくはマウスであることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 遺伝子組み換え非ヒト動物が、重症複合型免疫不全(SCID)マウスであることを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 遺伝子組み換え動物が、パッケージング信号に対するウイルス性配列コードを不完全にしていることを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- パッケージング信号に対するウイルス性配列コードが欠失されていることを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 遺伝子組み換え非ヒト動物のゲノム内に含まれるウイルス性配列の発現および/または翻訳が、遍在性の、恒常的に活性な調節配列によって制御されることを特徴とすることを特徴とする請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 活性および/または調節配列の特異性を評価する方法であって、ベクターに含まれる少なくとも1つのウイルス性配列の発現および/または翻訳が、解析される調節配列によって制御されることを特徴とする請求項1、2および4〜8のいずれかに記載の方法。
- 表面遺伝子の発現および/または翻訳が、解析される調節配列によって制御されることを特徴とする請求項9に記載の方法。
- 表面遺伝子がenvをコードする遺伝子であり、特に、広宿主性のenvに対してコードする遺伝子であることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 解析される調節配列が、標的遺伝子治療に適していることを特徴とする請求項9〜11のいずれかに記載の方法。
- ウイルスの表面タンパク質の特異性の評価あるいは動物のレセプターの分布の評価において、遺伝子組み換え動物がウイルス性表面タンパク質をコードするウイルス性配列を不完全にしていることを特徴とする請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- ウイルス性表面タンパク質をコードするウイルス性配列が欠失されていることを特徴とする請求項13に記載の方法。
- ウイルス性ベクターに含まれるウイルス性表面遺伝子の発現および/または翻訳が、遍在性の、恒常的に活性な調節配列によって制御されることを特徴とする請求項13または14に記載の方法。
- 表面タンパク質が、標的遺伝子治療に適しているものであることを特徴とする請求項13〜15のいずれかに記載の方法。
- ウイルス性配列およびウイルス性ベクターが、レトロウイルス性に由来することを特徴とする請求項1〜16のいずれかに記載の方法。
- 遺伝子組み換え動物が、レトロウイルスベクターで形質移入されている、および/または、上記レトロウイルス性ベクターを含むレトロウイルス性粒子に感染されていることを特徴とする請求項17に記載の方法。
- 遺伝子組み換え動物のゲノム内に含まれているレトロウイルス性ベクターおよびレトロウイルス性配列が、レトロウイルスの同じ型に由来していることを特徴とする請求項17または18に記載の方法。
- レトロウイルス性配列が、マウス白血病ウイルス(MLV)に由来していることを特徴とする請求項19に記載の方法。
- 活性および/または調節配列の特異性の評価において、調節配列がレトロウイルス性ベクターの末端反復配列(LTR)に挿入されていることを特徴とする請求項17〜20のいずれかに記載の方法。
- 調節配列がLTRのU3領域に挿入されていることを特徴とする請求項21に記載の方法。
- レトロウイルス性ベクターが、プロモーター転換ベクターに基づいていることを特徴とする請求項17〜22のいずれかに記載の方法。
- レトロウイルス性ベクターが、レトロウイルス性配列に加えて、非相同性遺伝子を含んでいることを特徴とする請求項17〜23のいずれかに記載の方法。
- 非相同性遺伝子が、治療的遺伝子、抗腫瘍遺伝子および/またはマーカー遺伝子であることを特徴とする請求項24に記載の方法。
- マーカー遺伝子が、緑色蛍光タンパク質(gfp)遺伝子および/またはゼオシン耐性遺伝子であることを特徴とする請求項25に記載の方法。
- 非相同性遺伝子が、内部リボゾーム侵入部位に効率よく結合していることを特徴とする請求項24〜26のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜27のいずれかに記載の方法によって得られる遺伝子組み換え非ヒト動物。
- ゲノム体内に1あるいはそれ以上のウイルス性配列を含んでいるが、ウイルスの発生に必要なウイルス性配列を少なくとも1つ欠乏しており、遺伝子組み換え動物の細胞へ少なくとも1つのウイルス性配列が導入されることによってウイルス性粒子を生成し、遺伝子組み換え動物において上記ウイルス性粒子を拡散することを特徴とする遺伝子組み換え非ヒト動物。
- 遺伝子組み換え非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項29に記載の遺伝子組み換え動物。
- マウスが、重症複合型免疫不全(SCID)マウスであることを特徴とする請求項30に記載の遺伝子組み換え動物。
- 遺伝子組み換え動物が、表面タンパク質をコードするウイルス性配列を不完全にしていることを特徴とする請求項29〜31のいずれかに記載の遺伝子組み換え動物。
- 遺伝子組み換え動物の遺伝子に含まれているウイルス性配列の発現および/または翻訳が、遍在性の、恒常的に活性な調節配列によって制御されることを特徴とする請求項29〜32のいずれかに記載の遺伝子組み換え動物。
- ウイルス性配列が、レトロウイルス性に由来していることを特徴とする請求項29〜33のいずれかに記載の遺伝子組み換え動物。
- 調節配列が、SV40エンハンサーおよび/またはプロモーター、β−アクチンプロモーター、ROSA26プロモーター、CDC10プロモーター、ユビキチンプロモーターおよび/またはMLVプロモーターを含む群の要素から選ばれることを特徴とする請求項33および34に記載の遺伝子組み換え動物。
- レトロウイルス性配列が、マウス白血病ウイルス(MLV)に由来していることを特徴とする請求項34または35に記載の遺伝子組み換え動物。
- 請求項1〜27のいずれかに記載の方法における、請求項29〜39のいずれかに記載の遺伝子組み換え動物の使用。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DKPA200001519 | 2000-10-10 | ||
DKPA200001519 | 2000-10-10 | ||
PCT/EP2001/011626 WO2002030471A2 (en) | 2000-10-10 | 2001-10-08 | A novel system for the evaluation of the activity and/or specificity of a viral component |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004535151A true JP2004535151A (ja) | 2004-11-25 |
JP2004535151A5 JP2004535151A5 (ja) | 2005-03-17 |
JP2004535151A6 JP2004535151A6 (ja) | 2005-04-14 |
Family
ID=8159785
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002533910A Pending JP2004535151A (ja) | 2000-10-10 | 2001-10-08 | ウイルス性成分の活性および/または特異性の評価に対する新システム |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20030229903A1 (ja) |
EP (1) | EP1341558A2 (ja) |
JP (1) | JP2004535151A (ja) |
AU (1) | AU2002218218A1 (ja) |
CA (1) | CA2425293A1 (ja) |
WO (1) | WO2002030471A2 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013159571A1 (zh) | 2012-04-26 | 2013-10-31 | 中国石油化工股份有限公司 | 一种润滑油组合物及其制造方法 |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5591624A (en) * | 1988-03-21 | 1997-01-07 | Chiron Viagene, Inc. | Retroviral packaging cell lines |
US5662896A (en) * | 1988-03-21 | 1997-09-02 | Chiron Viagene, Inc. | Compositions and methods for cancer immunotherapy |
US5716826A (en) * | 1988-03-21 | 1998-02-10 | Chiron Viagene, Inc. | Recombinant retroviruses |
US6133029A (en) * | 1988-03-21 | 2000-10-17 | Chiron Corporation | Replication defective viral vectors for infecting human cells |
US5997859A (en) * | 1988-03-21 | 1999-12-07 | Chiron Corporation | Method for treating a metastatic carcinoma using a conditionally lethal gene |
EP1001032A3 (en) * | 1989-08-18 | 2005-02-23 | Chiron Corporation | Recombinant retroviruses delivering vector constructs to target cells |
US5264372A (en) * | 1991-03-15 | 1993-11-23 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Receptor-based screening methods for amylin agonists and antagonists |
AU7192394A (en) * | 1993-07-19 | 1995-02-20 | Cantab Pharmaceuticals Research Limited | Production method for preparation of disabled viruses |
FR2716459B1 (fr) * | 1994-02-22 | 1996-05-10 | Univ Paris Curie | Système hôte-vecteur utilisable en thérapie génique. |
FR2747046B1 (fr) * | 1996-04-05 | 1998-06-19 | Univ Paris Curie | Nouveaux vaccins issus de plasmovirus |
WO1998044788A2 (en) * | 1997-04-09 | 1998-10-15 | Chang Lung Ji | Animal model for evaluation of vaccines |
US6248721B1 (en) * | 1997-04-09 | 2001-06-19 | Lung-Ji Chang | Method of using mouse model for evaluation of HIV vaccines |
US6207455B1 (en) * | 1997-05-01 | 2001-03-27 | Lung-Ji Chang | Lentiviral vectors |
EP1025208A2 (en) * | 1997-10-20 | 2000-08-09 | Universita' Degli Studi Di Padova | A packaging cell line producing siv-pseudotyped mlv |
WO1999035280A1 (en) * | 1998-01-06 | 1999-07-15 | Bavarian Nordic Research Institute A/S | Reconstituting retroviral vector (recon vector) for targeted gene expression |
-
2001
- 2001-10-08 AU AU2002218218A patent/AU2002218218A1/en not_active Abandoned
- 2001-10-08 WO PCT/EP2001/011626 patent/WO2002030471A2/en not_active Application Discontinuation
- 2001-10-08 EP EP01986610A patent/EP1341558A2/en not_active Withdrawn
- 2001-10-08 CA CA002425293A patent/CA2425293A1/en not_active Abandoned
- 2001-10-08 JP JP2002533910A patent/JP2004535151A/ja active Pending
-
2003
- 2003-04-09 US US10/410,469 patent/US20030229903A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2425293A1 (en) | 2002-04-18 |
EP1341558A2 (en) | 2003-09-10 |
US20030229903A1 (en) | 2003-12-11 |
WO2002030471A3 (en) | 2003-02-27 |
WO2002030471A2 (en) | 2002-04-18 |
AU2002218218A1 (en) | 2002-04-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU665176B2 (en) | Packaging cells | |
EP0702084B1 (en) | Recombinant retroviruses | |
US6485965B1 (en) | Replicating or semi-replicating viral constructs, preparation and uses for gene delivery | |
US5716832A (en) | Packaging cells | |
EP0960116B1 (en) | Inducible expression system useful in the generation of packaging cell lines for pseudotyped retroviral vectors | |
US7070994B2 (en) | Packaging cells | |
US5817491A (en) | VSV G pseusdotyped retroviral vectors | |
US6027722A (en) | Vectors for gene transfer | |
WO1998005754A9 (en) | Packaging cell lines containing expression constructs producing pseudotyped retroviral vectors | |
US20040234504A1 (en) | Methods of inhibiting gene expression by RNA interference | |
CA2157931A1 (en) | Improved vectors for gene therapy | |
JPH08511156A (ja) | テナガザル白血球ウイルスベースのレトロウイルスベクター | |
JP2004305227A (ja) | 条件致死遺伝子を利用する組成物及び方法 | |
US7056730B2 (en) | Expression of heterologous genes from an IRES translational cassette in retroviral vectors | |
US20070042494A1 (en) | Heterologous retroviral packaging system | |
JP2004535151A (ja) | ウイルス性成分の活性および/または特異性の評価に対する新システム | |
JP2004535151A6 (ja) | ウイルス性成分の活性および/または特異性の評価に対する新システム | |
EP1059356B1 (en) | Replicating retroviral constructs, preparation and uses for gene delivery | |
WO2002064805A2 (en) | Replication competent non-mammalian retroviral vectors | |
US20030051259A1 (en) | Packaging cells | |
WO2002072017A9 (en) | Method of drug target validation | |
MXPA98010665A (en) | Vectors and methods for synthesis specific to protein tissue ingengos de gallinas transgeni |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040915 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070904 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20080219 |