TWI355389B

TWI355389B - Antibodies directed against amyloid-beta peptide a

Info

Publication number: TWI355389B
Application number: TW094126072A
Authority: TW
Inventors: Arnon Rosenthal; Jaume Pons; Wei-Hsien Ho; Jan Markus Grimm
Original assignee: Rinat Neuroscience Corp
Priority date: 2004-07-30
Filing date: 2005-08-01
Publication date: 2012-01-01
Also published as: EA016357B1; CA2575663C; US8425905B2; IL180364A0; WO2006036291A3; US20060057702A1; US8268593B2; KR20070040824A; GEP20115195B; TNSN07031A1; EP2298807A3; NZ552480A; AU2010200115B2; US7807165B2; SG190665A1; US7927594B2; NI200700021A; TW200617023A; JP2012197292A; JP5042828B2

Description

1355389 九、發明說明：相關專利之交又參考資料本申請案主張2004年7月30曰申請之美國臨時專利申請案第60/592,494號、2005年2月14日申請之美國臨時專利申請案第60/653,197號及2005年4月29日申請之美國臨時專利申請案第60/676,093號之權利；將其全文以引用的方式併於本文中。【發明所屬之技術領域】本發明係關於抗澱粉狀蛋白胜肽之抗體。本發明更關於此抗體於治療及/或預防疾病（如阿耳滋海默氏症）之用途。【先前技術】阿耳滋海默氏症（AD，Alzheimer's disease)為退化性腦部疾病’臨床上的特徵為逐漸的記憶衰退、混淆、逐漸身體退化及最後死亡》全世界大約有1500萬人罹患阿耳滋海默氏症，且隨壽命增加預期此數字將巨幅增加。組織學上，此疾病的特徵為主要見於聯合皮質區（ass〇eiati〇n cortex)、邊緣系統（iimbic system)及基底核（basal ganglia) 的神經炎斑（neuritic plaques)。此等斑的主要組成份為澱粉狀蛋白-β胜肽（Αβ，amyloid beta peptide)，其為β澱粉狀蛋白刖驅蛋白質（βΑΡΡ或 ΑΡΡ，amyloid precursor protein)之切斷產物。APP為含有一個大的異位N端區塊、一個跨膜區塊、及一個小的細胞質C端尾巴的第I型跨膜醣蛋白。在第21個染色體上單一 APP基因轉錄體之選擇性剪接 I03827.doc 1355389 (alternative spluiiftg)造成胺基酸數目不同的數個亞型 (isoforms) ° Α β似乎在阿耳滋海默氏症的神經病理學中具有重要角色。已將此疾病的遺傳形式關聯至Αρρ及早老素 (Presenilin)基因的突變（Tanzi等人，1996, Neur〇bi〇1 ms 3:159-168; Hardy, 1996, Ann. Med. 28:2 55-258) » 於此等基因中疾病關聯的突變造成在澱粉狀蛋白斑中主要形式之42 個胺基酸形式Αβ製造增加。再者，用人類Αβ接種過度表 • 現疾病關聯的突變形式ΑΡΡ之基因轉殖鼠降低斑負擔及相關的病變（Schenk 等人，1 999，Nature 400:173-177 ;世界專利WO 99/27944)，及體表給予抗Αβ抗體也降低腦中的斑負擔（Bard等人 ’ 2000，Nature Medicine 6(8):916-919 ;世界專利 WO 2004/032868 ; WO 00/72880)。曾有報導說微膠細胞（microglial cell)及/或巨噬細胞之Fc 媒介的吞喔作用對於活體内斑清除之過程為重要。Bard等人 ’ Proc. Natl· Acad. Sci. USA 100，2023-2028(2003)。然 ® 而’也冒報導非Fc媒介的機制涉及由免疫療法之活體内澱粉狀蛋白-β清除。Bacskai等人，J. Neurosci. 22:7873- 7878(2002) ; Das等人，J. Neurosci. 23:8532-8538(2003)。所以抗體療法提供治療及預防阿耳滋海默氏症的一種有希望的方法。然而，用包括Αβ 1-42之疫苗的人類臨床試驗中止因為在病患之子集合中發生腦膜腦炎 (Meningoencephalititis)。Orgogozo等人’ Neruology 61:7-8(2003); Ferrer等人，Brain Pathol. 14:11-20(2004)。曾報 103827.doc 1355389 導用N端專一的抗-Αβ抗體之’被動免疫造成顯著降低主要擴散澱粉狀蛋白’但是引起增加大腦微出血頻率於呈現年齡相關的殿粉狀蛋白斑生長及神經退化以及類似於在人類 AD腦中觀察到的腦澱粉狀蛋白血管病（CAA，cerebral amyloid angiopathy)之基因轉殖鼠中。pfeifer等人， Science 298:1379(2002)。曾建議由抗β-澱粉狀蛋白抗體之被動免疫在ΑΡΡ基因轉殖鼠中腦澱粉狀蛋白血管病（caa， cerebral amyloid angiopathy)相關的微出血之惡化視抗體辨識澱粉狀蛋白β胜肽之沉澱形式而定。Racke等人，j. Neurosei· 25:629-636(2005)。曾建議用抗澱粉狀蛋白沉澱物之胜肽成分的抗體之被動免疫（此抗體缺乏Fc區域）以便降低發炎的危險。世界專利WO 03/0863 10。仍有需要具有改善的功效及安全特性與適用於人類病患之抗抗體及其他免疫療法藥劑。遍及本申請案引用許多文獻（包括專利及專利申請案）。此等文獻之揭示全文以引用的方式併於本文中。【發明内容】第I段本發明於本文十揭示關於結合至Αβ〗·^胜肽（示於表4中的SEQ ID NO: 15)的C端之抗體。於是，一方面，本發明為由具有ATCC登錄號ρΤΑ·6124及ρτΑ_6125(表現載體產生的抗體9TL(可互換地稱為「9TL」將91χ的重鏈及輕鏈可變區域之胺基酸序列示於圖1中。也將抗體9TL的互補決疋區（CDR，compiementarity determining regi〇n)部分（包括 103827.doc 1355389 裘蒂艾（Chotliia)及卡巴（Kabat)CDRs)示於圖1中。當然提及9TL的任何部分或整個區域包含由具有ATCC登錄號 6124及ΡΤΑ-6125之表現載體製造的序列，及/或繪於圖1中的序列。另一方面，本發明也提供具有示於表3中的胺基酸序列之9TL抗體變體。另一方面，本發明為一種抗體，包含示於表3中的抗體 9TL或其變體之片段或區域。於一個實施例中，片段為抗體9TL的輕鏈。於另一個實施例中，片段為抗體9ιχ的重鏈。於再另一個實施例中，片段含有來自抗體9τχ的輕鏈及/或重鏈的一或多個可變區域。於再另一個實施例中，片段含有如圖1中所示來自抗體9TL的輕鏈及/或重鏈的一或多個可變區域。於再另一個實施例中，片段含有來自抗體9TL的輕鏈及/或重鍵的一或多個cdrs。另一方面，本發明提供多胜肽（其可為或可不為抗體），包含下列之任何一或多者：a)示於表3中抗體91χ或其變體之一或多個CDR ; b)來自示於表3中抗體9T]L或其變體之重鏈的CDR H3，c)來自示於表3中抗體9TL或其變體之輕鏈的CDR L3 ; d)來自示於表3中抗體9TL或其變體之輕鏈的二個CDRs ; e)來自示於表3中抗體9TL·或其變體之重鏈的二個CDRs ;f)來自示於表3中抗體9TL或其變體之輕鏈的二個CDRs及重鏈的三個CDRs。本發明更提供多胜肽（其可為或可不為抗體），包含下列之任何一或多者：&)衍生自示於表3中抗體9TL或其變體之一或多（一、二、三、四、 103827.doc Λ 1355389 五、或六）個CDR ; b)衍生自來自抗體9Tl重鏈的CDR Hi 之CDR，及/或衍生自來自抗體91χ輕鏈的CDR L3之cdr。於一些實細例中，CDR為示於圖1中的cdR。於一些實施例中，衍生自示於表3中抗體9TL或其變體之一或多個cdR 為至少約85¼、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約 93%、至少約94。/。、至少約95%、至少約96%、至少約 97%、至少約98%、或至少約99。/。相等於9TL·或其變體之至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、或至少六個CDR。於一些實施例中，CDR為卡巴CDR。於其他實施例中， CDR為裘蒂艾CDR。於其他實施例中，CDR為卡巴及裘蒂艾CDR之組合（也稱為「組合的cdr」或「延伸的 CDR」）。換呂之’對於含有多於一個cdr的任何特定實施例’ CDR可為卡巴、裘蒂艾、及/或其組合。於一些實施例中，本發明的抗體為人類抗體。於其他實施例中，本發明的抗體為人化抗體。於一些實施例中，抗體為單株。於一些實施例中，將抗體（或多胜肽）分離。於一些實施例中，抗體（或多胜肽）大體上為純的。於一些實施例中，抗體包含經改質的固定區域，如為免疫學上惰性（與用詞「具有受損的作用功能」可互換地使用）的固定區域’如不驅動補體媒介的分解、如不刺激抗體相關的細胞調節細胞毒性（ADCC，antibody-dependent cell mediated cytotoxicity)、或不活化微膠細胞。於一些 103827.doc -10· 1355389 實施例中，將固定區域=如Eur. J. Immunol: (1999) 29:2613-2624 ; PCT專利申請案PCT/GB99/01441 ;及/或大英聯合王國專利申請案第9809951.8號中所述改質。於其他實施例中，抗體包含人類重鏈IgG2a固定區域，其含有下列突變：A330P331成為S330S331(胺基酸編號參照野生型igG2a 序歹丨j )。Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624 〇於一些實施例中’抗體包含含有下列突變之IgG4固定區域： E23 3F234L235成為P233V234A235。於再其他實施例中，將固定區域無醣化做N -連結的醣化。於一些實施例中，藉由突變寡醣連接的殘基（如Asn297)及/或於固定區域中為N_ 醣化辨識序列部分的側邊殘基，將固定區域無醣化做N—連結的醣化。於些實施例中，將固定區域無醣化做沁連結的聽化。用酵素或藉由在醣化缺陷的宿主細胞中表現可將固定區域無醣化做N-連結的醣化。另一方面，本發明提供多核苷酸（其可為分離的），其包含編碼表3中所示的抗體9TL或其變體之片段或區域的多核普酸。於一個實施例中，片段為抗體9tl的輕鏈。於另一個實施例中，片段為抗體9TL的重鏈。於再另一個實施例中，片段含有來自抗體9TL的輕鏈及/或重鏈的一或多個可變區域。於再另—個實施例中，片段含有來自抗體9TL的輕鏈及/或重鏈的—或多（即一、二、三、四、五、六）個互補决疋區（CDRS，complementarity代如叫。另一方面，本發明為多核苷酸（其可為分離的），其包含編碼示於表3中的抗體吼或其變體之多核苦酸。於一些實 103827.doc 1355389 施例中’多核苷酸包含示於SEQ m N〇:9及SEQ m NO:10 中的任一或兩者多核苷酸。另一方面’本發明提供編碼本文中所述之任何抗體（包括抗體片段）或多胜肽之多核苷酸。另一方面’本發明提供載體（包括表現及選殖載體）及宿主細胞，其包含本文中揭示之任何多核苷酸。於一些實施例中’載體為具有ATCC編號PTA-6124的pDb.9TL.hFc2a。於其他實施例中，載體為具有ATCC編號ρτΑ_6125的 pEb.9TL.hK。另一方面’本發明為宿主細胞，其包含編碼本文中說明之任何抗體的多核苷酸。另一方面’本發明為由示於表3中的抗體9TL或其變體結合Αβι_40之複合物β 另一方面’本發明為由本文中說明之任何抗體或多胜肽結合Αβι·4〇之複合物。另一方面，本發明為一種醫藥組合物，其包含有效量之本文中說明的任何多胜肽（包括抗體，如包含抗體9Ίχ的一或多個CDRs之抗體）或多核苷酸，及醫藥上可接受的賦形劑。另一方面，本發明為產生抗體9TL的方法，其包含在允許製造抗體9TL的條件下培養宿主細胞或其子代，其中宿主細胞包含編碼抗體9TL的表現載體；及於一些實施例中，純化抗體9TL。於一些實施例中，表現載體包含一或兩者示於SEQ ID N0:9及SEQ ID NChlO中之多核苷酸序 103827.doc -12- 1355389 列。 - 另一方面，本發明提供產生本文中所述的任何抗體或多胜肽的方法，其藉由在適當的細胞中表現一或多個編碼抗體（可將其分開地表現為單一輕或重鏈，或將輕鏈及重鏈兩者由一個載體表現）或多胜肽的多核苷酸，一般接著回收及/或分離所需的抗體或多胜肽。本發明也提供用以預防、治療、抑制、或延遲阿耳滋海默氏症及其他與改變的Αβ或βΑΡΡ表現或Αβ胜肽累積有關的疾病，如蒙古症（Down's syndrome)、帕金森氏症 (Parkinsonis disease)、多發梗塞性痴呆症（Multi-infarct Dementia)、輕度知能障礙（Mild Cognitive Impairment)、及腦澱粉狀蛋白血管病之發展。方法包含給予個體有效劑 i之醫藥組合物’其包含本發明之抗體、多胜肽、或多核苷酸。本發明也提供方法延緩與阿耳滋海默氏症或與胜肽累積有關的其他疾病相關的症狀之發展，其包含給予個體有效劑量之醫藥組合物，其包含本發明之抗體、多胜肽、或多核普酸。本發明也提供抑制個體t澱粉狀蛋白斑形成及/或澱粉狀蛋白累積之方法’其包含給予個體有效劑量之醫藥組合物，其包含本發明之抗體、多胜肤、或多核㈣。於一些實施例中，澱粉狀蛋白斑係於個體的腦（腦組織）中。於一些實施例中’澱粉狀蛋白斑係於大腦血管中。於其他實施例中，澱粉狀蛋白累積是在循環系統中。、 103827.doc -13. m 1355389 本發明也提供降低個體中澱粉狀蛋白斑及/或澱粉狀蛋白累積之方法’其包含給予個體有效劑量之醫藥組合物，其包含本發明之抗體、多胜肽、或多核苷酸。於一些實施例中，澱粉狀蛋白斑係於個體的腦（腦組織）中。於一些實施例中，澱粉狀蛋白斑係於大腦血管中。於其他實施例中’殿粉狀蛋白累積是在循環系統中。本發明也提供移除或清除個體中澱粉狀蛋白斑及/或澱粉狀蛋白累積之方法，其包含給予個體有效劑量之醫藥組合物，其包含本發明之抗體、多胜肽、或多核苷酸。於一些實施例中，澱粉狀蛋白斑係於個體的腦（腦組織）中。於二實知例中，；1又粉狀蛋白斑係於大腦血管中。於其他實施例中，澱粉狀蛋白累積是在循環系統中。此外，本發明提供抑制Αβ胜肽累積在組織中的方法，其包含使組織與本發明的抗體或多胜肽接觸。本發明也提供降低Αβ胜肽（如可溶、寡聚合及沉澱的形式）於個體腦中的方法，其包含給予個體有效量之本發明抗體或多胜肽。於一些實施例中，抑制及/或降低胜肽在腦中的累積。於一些實施例中，將Αβ胜肽的毒性作用抑制及7或降低。因此，可使用本發明的方法來治療Αβ胜肽的累積存在或可能存在之任何疾病，如阿耳滋海默氏症、蒙古症、帕金森氏症、多發梗塞性痴呆症、輕度知能障礙、及腦澱粉狀蛋白血管病。本發明也提供改善知能或倒轉與個體腦中Αβ沉澱有關的疾病（如阿耳滋海默氏症）相關的知能衰退之方法，其包含 103827.doc -14- 1355389 給予個體有效劑量之醫藥組合物，其包含本發明之抗體、多胜肽、或多核苷酸。可使用本文中所述的任何抗體、多胜肽、或多核苷酸於本發明的方法中。於一些實施例中，抗體為抗體9TL。更可將本發明的抗體及多胜肽用於偵測、診斷及監測阿耳滋海默氏症及與改變的Αβ或βΑΡΡ表現有關的其他疾病’如蒙古症。此方法包含使可能具有改變的Αβ或βΑΡΡ 表現的病患之樣本與本發明的抗體接觸及決定是否或 βΑΡΡ的量與控制組或比較樣本不同。於一些實施例中，在給予抗-Αβ抗體之前及之後測量血清Αβ量；及評估血清 Αβ量之任何增加。本發明之任何抗體及多胜肽之給予可為藉由技藝中已知之任何方式’包括.靜脈内、皮下、'經由吸入、動脈内、肌肉内、心臟内、腦室内、非經腸胃、脊髓腔内 (in⑽heCally)、及腹腔内。給予可為全身性，如靜脈内，或為局部的。此也普遍適用於本發明的多胜肽及多核普、另一方面，本發明提供套組及組合物，其含有本文中戶斤述{何或夕種組合物。此等套纽（通常於適當的包事内及具有適當用法說明）有用於、 ^用於本文中所述之任何方第II段本發明提供方法以治療牿抖 ^ ,, 音 …，政為恥中蛋白質沉積的神經學症狀而不導致個體的發炎。干噹々人& ^ 万法包含給予個體有效量之醫樂組合物，其包含專一地結入晋〇主蛋白質或蛋白質沉積物的 103827.doc 1355389 抗體’或編碼此抗體的多核苷酸，其中此抗體具有受損的作用功能。本發明也提供方法以治療或預防與個體中Αβ之澱粉狀蛋白沉積（如沉積於腦組織及大腦血管中）有關的疾病，如阿耳滋海默氏症、蒙古症、多發梗塞性痴呆症、輕度知能障礙、及腦澱粉狀蛋白血管病。此方法包含給予個體有效量之醫藥組合物’其包含專一地結合至β·澱粉狀蛋白胜肽或 β-殿粉狀蛋白胜肽之聚集形式之抗體，或編碼此抗體的多核苷酸，其中此抗體具有受損的作用功能。本發明也提供方法延緩個體中與Αβ之澱粉狀蛋白沉積有關的疾病（如阿耳滋海默氏症）相關的症狀發展，其包含給予個體有效劑量之醫藥組合物，其包含專一地結合至Ρ-澱粉狀蛋白胜肽或β-澱粉狀蛋白胜肽之聚集形式之抗體，或編碼此抗體的多核苷酸，其中此抗體具有受損的作用功能。本發明也提供抑制個體中澱粉狀蛋白斑形成及/或澱粉狀蛋白累積之方法，其包含給予個體有效劑量之醫藥組合物，其包含專一地結合至β_澱粉狀蛋白胜肽或卜澱粉狀蛋白胜肽之聚集形式之抗體，或編碼此抗體的多核苷酸，其中此抗體具有受損的作用功能。於一些實施例中，澱粉狀蛋白斑係於個體的腦（腦組織）中。於一些實施例中，澱粉狀蛋白斑係於大腦血管中。於一些實施例中，澱粉狀累積是在循環系統中。本發明也提供降低個體中澱粉狀蛋白斑及/或澱粉狀蛋 103827.doc 1355389 白累積之方法，其包含給予個體有效劑量之醫藥組合物，其包含專-地結合至β·澱粉狀蛋白胜肽或β•澱粉狀蛋白胜肤之聚集形式之抗體’或編碼此抗體的多核普酸，其中此抗體具有受損的作用功能。於一些實施例中，澱粉狀蛋白斑係於個體的腦（腦組織）中e於一些實施例中，澱粉狀蛋白斑係於大腦血管中。於一些實施例中，澱粉狀蛋白累積是在循環系統中。本發明也提供移除或清除個體中澱粉狀蛋白斑及/或澱粉狀蛋白累積之方法，其包含給予個體有效劑量之醫藥組合物，其包含專一地結合至β_澱粉狀蛋白胜肽或β•澱粉狀蛋白胜肽之聚集形式之抗體，或編碼此抗體的多核苷酸，其中此抗體具有受損的作用功能。於一些實施例中，澱粉狀蛋白斑係於個體的腦（腦組織）中。於一些實施例中，澱粉狀蛋白斑係於大腦血管中。於一些實施例中，澱粉狀蛋白累積是在循環系統中。本發明也提供用以抑制Αβ胜肽累積在組織中的方法，其包含使組織與專一地結合至β_澱粉狀蛋白胜肽或β_澱粉狀蛋白胜肽之聚集形式之抗體接觸’其中此抗體具有受損的作用功能。本發明也提供降低個體中Αβ胜肽（如可溶、寡聚合及沉殿的形式）的方法，其包含給予個體有效量之專一地結合至β-殿粉狀蛋白胜肽或β-澱粉狀蛋白胜肽之聚集形式之抗體’或編碼此抗體的多核苷酸，其中此抗體具有受損的作用功能。於一些實施例中，抑制及/或降低Αβ胜肽在腦中 103827.doc 17 1355389 的累積於一些實施例中，將Ap胜肽的毒性作用抑制友_/ 或降低因此，可使用本發明的方法來治療Αβ胜狀的累積存在或可能存在之任何疾病，如阿耳滋海默氏症、蒙古症、帕金森氏症、及多發梗塞性痴呆症。本發明也提供改善知能或倒轉與個體腦中Αβ沉澱有關的疾病（如阿耳滋海默氏症）相關的知能衰退之方法，其包含給予個體有效劑量之醫藥組合物，其包含專一地結合至卜 • 添粉狀蛋白胜肽或β-澱粉狀蛋白胜肽之聚集形式之抗體，或編碼此抗體的多核苷酸，其中此抗體具有受損的作用功能。本發明也提供治療或預防與Αβ的澱粉狀蛋白沉澱有關的疾病之方法，其包含給予個體有效劑量之醫藥組合物，其 L 3專一地結合至β_澱粉狀蛋白胜肽或卜澱粉狀蛋白胜肽之聚集形式之抗體，其中此抗體包含與天然發生的Fc區域有差異的Fc區域，其中此差異造成受損的作用功能，因而此抗體之給予比不具此差異的抗體之給予引發較少大腦微出贏。也可使用專一地結合至Αβ胜肽或Αβ胜肽之聚集形式且包含具有受損的作用功能之重鏈固定區域的多胜肽於本文中所述的任何方法。於一些實施例中，多胜肽包含衍生自如表3中所示的抗體9TL或其變體之序列（如一或多個 )於一些貫施例中，多胜肽包含衍生自抗體6G之序列（如一或多個CDR)。用於本發明方法之抗體及多胜肽專一地結合至Αβ胜肽或 103827.doc -18 - Αβ胜肽之聚集形式，但具有受損的作用功能。於一-些實施例中，抗體或多胜肽不是F(ab')2片段。於一些實施例中，抗體或多胜肽不是Fab片段。於一些實施例中，抗體或多胜肽不是單鏈抗體scFv。於一些實施例中’抗體或多胜肽包含具有受損的作用功能之重鏈固定區域，其中重鏈固定區域包含Fc區域。於一些實施例中，將Fc區域中的N-醣化去除。於一些實施例中，Fc區域包含突變於N-醣化辨識序列内，因而抗體或多胜肽的Fc區域不受N-醣化。於一些實施例中，將Fc區域聚乙二醇化（PEGylated)。於一些實施例中，抗體或多胜肽的重鏈固定區域為含有下列突變之人類重鏈IgG2a固定區域：A330P331成為S330S331(胺基酸編號參照野生型IgG2a 序列）。於一些實施例中，抗體或多胜肽包含含有下列突變之 IgG4 固定區域：E233F234L235 成為 P233V234A235。於一些實施例中，抗體或多胜肽專一地結合至Αβ胜肽之殘基1-16内的抗原決定區。於一些實施例中，抗體或多胜肽專一地結合至Αβ胜肽之殘基16-28内的抗原決定區。於一些實施例中，抗體專一地結合至Αβ胜肽之C端側上的抗原決定區，如由胺基酸25或之後開始的抗原決定區《抗體可專一地結合至C端截斷的Αβ胜肽（例如Αβ 1_37、1-38、 1-39、1-40、1-41、1-42、1-43)之游離 C端胺基酸。於一些實施例中，抗體或多胜肽專一地結合至Αβ!,胜肽之殘基28-40内的抗原決定區。於一些實施例中，抗體或多胜肽專一地結合至胜肽之殘基28-42内的抗原決定區。 103827.doc -19- 1355389 於一些實施例中，抗體或多胜肽專一地結合至Αβι_43胜肽之殘基28-43内的抗原決定區。於一些實施例中，抗體或多胜肽專一地結合至Αβ胜肽而不結合至全長澱粉狀蛋白前驅蛋白質（APP，amyloid precursor protein)。於一些實施例中’抗體或多胜肽專一地結合至Αβ之聚集形式而不結合至可溶的形式》於一些實施例中’抗體或多胜肽專一地結合至Αβ之可溶的形式而不結合至聚集形式。於一些實施例中，抗體或多胜肽專一地結合至Αβ之聚集形式及可溶的形式兩者。於—些實施例中，抗體或多胜肽專一地結合至之c 端胜肽33-40。於一些實施例中，抗體或多胜肽專一地結合至Αβι-4〇上包括胺基酸35-40的抗原決定區。於一些實施例中’抗體或多胜肽專一地結合至上包括胺基酸36_ 40的抗原決定區。於一些實施例中’抗體或多胜肽專一地結合至上包括胺基酸39及/或40的抗原決定區。於一些實施例中，抗體或多胜肽專一地結合至Αβι·4()但不專一地結合至Api·42及/或Αβ^43。於一些實施例中，抗體包含抗體9TL或本文中所述衍生自9TL的抗體之可變區域。於一些實施例中，抗體或多胜肽競爭性地抑制抗體9tl及/或衍生自9TL的抗體或多胜肽結合至Αβ卜4。。於一些實施例中’抗體或多胜肽以較其結合至APi-42及 Αβι·43更jij的親合力結合至Αβι·4〇。於一些實施例中，抗體或多胜肽專一地結合至Αβ mo上包括胺基酸25_34及4〇的抗原決定區。於一些實施例中，抗體包含抗體或本文中所 103827.doc -20· 1355389 述衍生自6G的抗體之可變區域。於一些實施例中，抗體或多胜肽競爭性地抑制抗體6(}及/或衍生自6G的抗體或多胜月太結合至Α β。專一地結合至Αβ胜肽且具有受損的作用功能的抗體或多胜肤之給予可為藉由技藝中已知之任何方式，包括：靜脈内皮下、經由吸入、動脈内、肌肉内、心臟内、腦室内非經腸月、脊髓腔内（intrathecally)、及腹腔内。給予可為全身性，如靜脈内，或為局部的。此也普遍適用於本發明的多胜肽及多核苷酸。本發明也提供醫藥組合物，其包含有效量之專一地結合至Αβ胜肽或Αβ胜肽之聚集形式且具有受損的作用功能之任何抗體或多胜肽，或編碼此抗體或多胜肽之多核苷酸，及醫藥上可接受的賦形劑。本發明也提供套組及組合物，其包含任何一或多種組合物，其包括有效量之專一地結合至Αβ胜肽或Αβ胜肽之聚集形式且具有受損的作用功能之任何抗體或多胜肽，或編碼此抗體或多胜肽之多核苷酸。此等套組（通常於適常的包裝内及具有適當用法說明）有用於本文中所述之任何方法。【實施方式】本文中揭示的發明提供結合至的C端之抗體及多胜肽。此等抗體及多胜肽係衍生自9TL及其變體（如表3所示）。本發明也提供此等抗體之製造及使用方法。於一些實施例中，本發明提供抗體9TL，及製造與使用此抗體之 I03827.doc -21 - 1355389 方法本發明也提供結合Αβ!·^的9TL多胜肽（包括抗體），及编碼9TL抗體及/或多胜肽之多核苷酸。本文中揭示的發明也提供方法以預防及/或治療個體中 Αβ相關的疾病，如阿耳滋海默氏症、蒙古症、帕金森氏症、多發梗塞性痴呆症、輕度知能障礙、腦澱粉狀蛋白血管病、由Αβ胜肽於血管中之沉澱引發的血管疾病（如令風及HCHWA-D) ’其係藉由給予治療有效量之抗體9TL，或衍生自9TL的抗體或多胜肽。本發明也提供方法以治療或預防個體中與β·澱粉狀蛋白沉積有關的疾病，如個體中的阿耳滋海默氏症、蒙古症、多發梗塞性痴呆症、輕度知能障礙、及腦澱粉狀蛋白血管病’其係藉由給予個體有效量之醫藥組合物，其包含專一地結合至β·澱粉狀蛋白胜肽或Αβ胜肽之聚集形式之抗體或多胜肽，或編碼此抗體或多胜肽的多核苷酸，其中該抗體或多胜肽具有受損的作用功能。一般技術除非另外指明’本發明的實行將利用分子生物學（包括重組技術）、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學之習見技術，其為本技藝之技術範圍内。此等技術係充分於文獻中解釋，如 Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第 2 版（Sambrook 等人，1989)Cold Spring Harbor Press ; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait編著，1984);

Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook(J.E. Cellis編著，1998) 103827.doc -22- 1355389

Aca.demic Press; Animal Cell Culture(R.I.._ Freshney編著， 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather 及 P,E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle，J.B. Griffiths,及 D.G. Newell編著，1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods

in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology(D.M. Weir 及 C,C. Blackwell 編著）；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller 及 M.P. Calos 編著，1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel等人編著，1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction，（Mullis 等人，1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan等人編著， 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley父子， 1999); Immunobiology (C.A. Janeway及Ρ· Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty.編著，IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd及 C. Dean 編著，Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow及 D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti及 J.D. Capra編著，Harwood Academic Publishers， 1995)。定義「抗體」為一種免疫球蛋白分子，其能夠經由位於免疫 103827.doc -23- 1355389 球蛋白分子的可變_區域中的至少一個抗原辨識位置專一結合至目標如碳水化合物、多核普酸、脂質、多胜肤等。如本文t使用，&用詞不僅包含完整多株或單株抗體，也包含其片段（如 Fab、Fab，、F(ab，)2、Fv)、單鏈（ScFv)、其突變體、包括坑體部分之融合蛋白質、及包含抗原辨識位置的免疫球蛋自分子之任何其他改質的結構^抗體包括任何種類抗體’如IgG、IgA、或IgM(或其亞群（sub ciass))，抗體不需要為任何特定㈣卜視其重鏈固定區塊的抗體胺基酸序列而定’可將免疫球蛋白指定為*同類別。免疫球蛋白有五個主要類別：IgA，IgD，IgE，IgG，及_，及此等之數個可再分成「亞群」（同種型（isotypes))，如IgGl、 IgG2 IgG3、IgG4、IgA 1、及lgA2。相當於免疫球蛋白不同類別的重鏈固定區塊分別稱為α、δ、ε、γ、及4。免疫球蛋白不同類別之次單元結構及三度空間組態為已熟知。如本文中使用，「單株抗體」意指來自大體上同源的抗體群體之抗體，即除了可能以少量存在的可能天然發生突變外，包含群體之個別抗體為相同。單株抗體為高度專一性’針對單一抗原位置。再者’相反於通常包括針對不同決定位置（抗原決定區）的不同抗體之多株抗體製品，各單株抗體係針對抗原上的單一決定位置。修飾詞「單株」代表抗體的特性為得自大體上同源的抗體群體，且不應視為品要藉任何特別方法製造抗體。例如，欲根據本發明使用的單株抗體可用首先由Kohler及Milstein，1975，Nature， 256:495所述的融合瘤方法製造，或由如美國專利第 103827.doc •24- 1355389 4,816,567號中所述之重組DNA方法製造。例如，也可將單株抗體自利用說明於McCafferty等人，1990，Nature， 348:5 52-554中的技術所產生的噬菌體庫分離。如本文中使用，「人化」抗體意指非人（如鼠科）抗體之形式，其為含有衍生自非人免疫球蛋白之最少序列之特定嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈、或其片段（如Fv、Fab、 Fab’、F(ab’)2或抗體之其他抗原結合子序列）^對於大部分，人化抗體為人類免疫球蛋白（接受者抗體），其中將來自接受者互補決定區（CDR，complementary determining region)的殘基以來自具有理想專一性、親合力、及能力之非人物種（供給者抗體）如小鼠、大鼠、或兔子的CDR之殘基取代。於一些情況中，將人類免疫球蛋白的Fv骨架區域 (FR，framework region)殘基用相對應的非人殘基取代。再者，人化抗體可包含不見於接受者抗體中及也不見於引進的CDR或骨架序列中的殘基，但被包含以進步幫助及最適化抗體性能。一般而言’人化抗體將大體上包含至少一個（通常為兩個）可變區塊之整體，其中所有或大體上所有 CDR區域相當於非人免疫球蛋白的CDR區域及所有或大體上所有FR區域為人類免疫球蛋白共通序列的FR區域。理想上人化抗體也將包含至少一部份免疫球蛋白固定區域或區塊（Fc)，通常為人類免疫球蛋白的Fc。較佳的是具有如 WO 99/58572中所述改質的Fc區域之抗體。人化抗體之其他形式具有一或多個CDRs (—、二、三、四、五、六個），其係相對於原始抗體改變，其也稱為自原始抗體的一或多 103827.doc • 25· 個CDRs「衍生的」一或多個CDRs。如本文中使用，「人類抗體」意指具有胺基酸序列相當於由人類製造的抗體者之抗體及/或利用技藝中已知或本文中揭示的製造人類抗體的任何技術製造的抗體。此人類抗體之定義包括包含至少一個人類重鏈多胜肽或至少一個人類輕鏈多胜肽之抗體。一個如此之實例為包含鼠科輕鏈及人類重鏈多胜肽之抗體。利用技藝中已知的不同技術可製造人類抗體。於一個實施例中，人類抗體係選自噬菌體庫，其中噬菌體庫表現人類抗體（Vaughan等人，1996,

Nature Biotechnology，14:309-314 ; Sheets 等人，1998, PNAS，（USA) 95:6157-6162 ; Hoogenboom及 Winter, 1991， J. Mol. Biol.，227:381 ; Marks等人，1991，J. Mol. Bi〇l.， 222:581)。藉由將人類免疫球蛋白基因座導入基因轉殖動物’如已將内生免疫球蛋白基因部分或完全去活性的小鼠，也可做出人類抗體。此方法係說明於美國專利第 5,545,807 ； 5,545,806 ； 5,569,825 ； 5,625,126 ； 5,633,425 ;及5,661,016號中。或者，藉由使產生抗目標抗原的抗體之人類B淋巴球不朽（此B淋巴球可由個體取得或可於試管内被接種）而可製備人類抗體。見如Cole等人， Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 77 頁（1985) ; Boerner 等人，1991，J. Immunol·，147(1):86-95 ;及美國專利第5,750,373號。

如本文中使用，可互換地使用用詞「9TL」及「抗體 9TL」來意指由具有寄存編號ATCC PTA-6124及ATCC 103827.doc -26- 1355389 PTA-6125之表現載體製造的抗體。將重鏈及輕鏈可變區域的胺基酸序列示於圖1中。將抗體9TL的CDR部分（包括裘蒂乂及卡巴CDRs)概略地繪於圖丨中。將編碼重及輕鏈可變區域的多核苷酸示於SEQ ID N0:9及SEQ ID NO:10中。 9TL的特徵係說明於實例中。本文中可互換地使用用詞「多胜肽」、「寡胜肚」、「胜肽」及「蛋白質」以意指任何長度的胺基酸聚合物。此聚合物可為直線或有分支，其可包含經改質的胺基酸，及可將其插入非胺基酸。此用詞也包含自然或藉由介入而受改質的胺基酸聚合物；例如，雙硫鍵形成、醣化、脂化、乙醯化、磷酸化、或任何其他操作或修飾，如用標記成分連結。同樣包含於此定義的是，例如，含有胺基酸的一或多個類似物（包括’例如’非天然胺基酸等）之多胜肽，以及技藝中已知的其他修飾。當然因為本發明的多胜肽係基於抗體，多胜版可存在為單鏈或結合的鏈。本文中可父互使用的「多核苷酸」或「核酸」意指任何長度之核苷酸聚合物，且包括DNA及RNA。核苷酸可為去氡核畴核苷酿、核酶核苷酸、經改質的核苷酸或鹼基，及 /或其類似物，或可被DNA或RNA聚合酶併入聚合物内的任何受質。多核苷酸可包含經改質的核苷酸，如曱基化核苷酸及其類似物。若存在，可於聚合物組合之前或之後賦予對核苷酸結構的改質。可將核苷酸序列用非核苷酸成分插入。於聚合後可將多核苷酸進一步修飾，如藉由與標記成分連結。其他修飾類型包括，例如，「套冠（caps)」、用 103827.doc 27· 1355389 類似物取代一或多個天然發生的核苷酸、核苷酸間修飾如例如具有未帶電荷的連結（如膦酸曱酯、磷酸三酯、磷醯胺酸、胺基曱酸等）及具有帶電荷的連結（如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等）者、含有侧基（pendant moieties)者，如例如蛋白質（如核酸酶、毒素、抗體、信號胜肽、聚離胺酸等）、具有嵌入劑（如吖啶（aCridine)、補骨脂素（ps〇ralen) 等）者、含有螯合劑（如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等）者、含有烷化劑者、具有經改質的連結（如α異位性 • 核酸荨）者，以及多核苷酸之未經修飾的形式。再者，可將普通存在於糖中的任何經基用例如膦酸殘基、鱗酸殘基取代、用標準保護殘基保護、或活化以製備其他連結至其他核苷酸、或可被結合至固體支撐體。可將5,及3,端0Η磷酸化或用或由1至20個碳原子之有機套冠殘基部分取代。也可將其他羥基衍生化成標準保護殘基。多核苷酸也可含有技藝中已普遍知道的核醣或去氧核醣之類似形式，包括例如2'_0_甲基-’ 2，-〇_烯丙基，2'-氟-或2·-疊氮-核醣、碳環糖類似物' (^異位性糖、差向異構（epimeric)糖如樹膠酸骑（arabinose)、木糖或來蘇糖（丨yx〇ses)、吡喃糖 (pyranose sugars)、呋喃糖（furan〇se sugars)、天庚酮糖 (sedoheptulose)、非環狀類似物及無鹼基核苷類似物如甲基核苦。可將一或多個磷酸二酯連結用其他連結殘基取代。此等其他連結殘基包括（但不限於）其中將磷酸用 P(0)S(「硫代」）、P(s)s(「二硫代」）、（〇)Nr2(「醯胺」）P(〇)R P(〇)〇R·、CO 或 CH2(曱縮链（formacetal)) 103827.doc •28· 取代，其中各R或R'獨立地為Η或視情況含有醚（-〇-)連結的經取代或未經取代的烷基（1-20C)‘、芳基、烯基、環烷基、環烯基或阿拉第基（araldyl)。於多核苷酸中不是所有連接必須為相同。前面的說明適用於本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA及DNA。抗體的「可變區域」意指抗體輕鏈的可變區域或抗體重鏈的可變區域，無論是單獨或組合。重及輕鏈的可變區域各由被也稱為高度可變區域的三個互補決定區（CDRs, complementarity determining regions)連接的四個骨架區域 (FR，framework regions)組成。於各鏈中的CDRs由FRs連結在一起靠攏接近，及與來自另一鏈的CDRs幫助抗體的抗原結合位置之形成。有至少兩個技術決定CDRs : (1)基於跨物種序列變化性之方法（即Kabat等人，Sequences of

Proteins of Immunological Interest,(第 5版，1991，國家衛生研究院’ Bethesda MD));及（2)基於抗原-抗體複合物之結晶學研究之方法（Al-lazikani等人，（1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)。如本文中使用，CDR可意指由任一種方法或由兩種方法組合定義的CDR。抗體的「固定區域」意指抗體輕鏈的固定區域或抗體重鏈的固定區域，無論是單獨或組合。「優先地結合」或「專一地結合」（於本文中可交替使用）至抗體或多胜肽之抗原決定區為技藝中已熟知的用詞’且決定此專一或優先結合之方法也為技藝中已熟知。若分子相較於與其他細胞或物質更經常、更快速、以較長 103827.doc •29· 1355389 期間及/或以更大親合力與特定鈿胞或物質反應或結合，則稱此分子呈現「專一性結合」或「優先性結合」。若抗體相較於其結合至其他物質，以較大親合力、親留力 (avidity)、更容易、及/或以較長期間結合，則抗體「專一地結合」《「優先地結合」至目標。例如，專一地或優先地結合至Αβ!·^抗原決定區之抗體為以比其結合至其他 Αβ!-^抗原決定區或非Αβ!·^抗原決定區更大親合力、親留力、更容易、及/或以較長期間結合此抗原決定區之抗 • 體。由閱讀此定義也知，例如，專一地或優先地結合至第一個目標的抗體（或部分或抗原決定區）可能或可能不專一地或優先地結合至第二個目標。就其本身而論，「專一性結合」或「優先性結合」不一定需要（雖然其可包括）獨佔的結合。一般而言（但非必須），提及結合意指優先的結合0 如本文中使用，「大體上純的」意指為至少50%純（即無污染物），更佳至少90%純，更佳至少95%純，更佳至少 ® 98%純，更佳至少99%純之材料。「宿主細胞」包括可為或曾為用以併入多核苷酸插入體之載體接受者之獨立細胞或細胞培養株。宿主細胞包括單一宿主細胞的子代，且子代可能不一定為完全相同（於形態上或於基因組DNA組）於原始母細胞，因為自然、偶發的、或故意的突變。宿主細胞包括用本發明多核苷酸於活體内轉染的細胞。使用用詞「Fc區域」來定義免疫球蛋白重鏈的c端區 103S27.doc •30· 1355389

域。「Fc區域」可為天然序列Fc區域或變體Fc區域。雖然免疫球蛋白重鏈的Fc區域之邊界可能改變，通常將人類 IgG重鏈Fc區域定義為由在位置Cys226(或由Pro230)至其敌基端的一段。於Fc區域中殘基的編號為如於卡巴中的EU 標號者。Kabat 等人，Sequences of Proteins 〇f Immunological Interest，第5版，公共衛生服務，國家衛生研究院，Bethesda MD·，1991。免疫球蛋白的Fc區域通常包含兩個固定區塊：CH2及CH3。如本文中使用，「Fc受體」及「FcR」說明結合至抗體的 Fc區域之受體。較佳的FcR為天然序列人類FcR。再者，較佳的FcR為結合lgG抗體者（γ受體）及包括FcyRI、 FcyRII、及FcyRIII亞群之受體’包括此等受體之對偶變體及交替接合的形式》FcyRII受體包括FqRIIA(「活化受體」）及FcYRIIB(「抑制受體」）’其具有主要不同於其細胞質區塊之類似胺基酸序列。將FcR回顧於Ravetch及

Kinet，1991, Annu. Rev. Immunol.，9:457-92 ; Capel等人， 1994, Immunomethods，4:25-34 ;及 de Haas 等人，1995, j.

Lab. Clin· Med.，126:330-41。「FcR」也包括新生兒受體 FcRn，其負責轉移母親igG至胎兒（Guyer等人’ 1976，了 Immunol.，U7:587 ;及 Kim 等人，1994, j. Immun〇1， 24:249) ° 「補體相關的細胞毒性」及「CDC」意指在補體存在中分子目標的分解。補體活化途徑受補體系統第一個成分 (Clq)結合至與同源抗原複合的分子（如抗體）而起始。為了 I03827.doc •31 · 1355389 評估補體活化’可進行如說明於Gazzano- Santoro等人，j. JmmwnoL Mei/io心 202:163(1996)之CDC分析法。「有功能的Fc區域」具有天然序列Fc區域之至少一個作用功能。例示「作用功能」包括包括C lq結合；補體相關的細胞毒性（CDC，complement dependent cytotoxicity) ; Fc 受體結合；抗體相關的細胞調節細胞毒性（ADCC， antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity);吞噬作用；細胞表面受體（如B細胞受體（BCR，B cell receptor))之向下調節等。此作用功能通常需要Fc區域與結合區塊（如抗體可變區塊）組合且可利用技藝中用以評估此抗體作用功能之已知許多分析法評估。「天然序列Fc區域」包含自然界中可見的FC區域之胺基酸序列相同的胺基酸序列。「變體Fc區域」包含由於至少一個胺基酸修飾而不同於天然序列F c區域胺基酸序列者，然而仍保留天然序列F c區域之至少一個作用功能。較佳的是，相較於天然序列Fc區域或母多胜肽之Fc區域，變體Fc 區域具有至少一個胺基酸取代，如於天然序列Fc區域或母多胜肽之Fc區域中有由約1個至約10個胺基酸取代，及較佳的是有由約1個至約5個胺基酸取代。本文中的變體f c區域較佳將具有與天然序列Fc區域及/或與母多胜肽之Fc區域至少約80%序列一致性，及最佳與其有至少約9〇%序列一致性，更佳與其有至少約95%序列一致性。如本文中使用，「抗體相關的細胞調節細胞毒性」及「ADCC」意指一種細胞調節反應，其中表現Fc受體 103827.doc -32- ⑧: 1355389 (FcRs)的非專一性細胞毒性細胞（如自然殺手（NK，natural killer)細胞、嗜中性白細胞（Neutrophils)、及巨噬細胞）辨識目標細胞上結合的抗體及隨後造成目標細胞的分解。利用試管内ADCC分析法，如說明於美國專利第5,5〇〇,362或 5,821，337號中者，可評估有興趣的分子之入〇(：(：活性。此分析法的有用作用細胞包括周邊血液單核細胞（PBMC， peripheral blood mononuclear cell)及 NK細胞。或者（或此外）’可將有興趣的分子之ADCC活性於活體内評估，如於動物模型如揭示於Clynes等人，1998, 95:652- 656中者。如本文中使用’「有效劑量」或「有效量」藥物、化合物、或醫藥缸合物為足以產生有利或理想結果的量。對於預防用途有利或理想結果包括如消除或降低危險、減輕嚴重性、或延遲發病，包括疾病的生物化學、組織學及/ 或打為上的症狀、其併發症及在疾病發展期間呈現的中間病理學表型之結果。對於治療用途，有利或理想結果包括臨床結果如抑制、壓制或降低澱粉狀蛋白斑之形成、降低、去除、清除澱粉狀蛋白斑、改善知能、倒轉或或減慢。知能衰退、隔離在生物體液中循環的可溶性Αβ胜肽、減小由疾病造成的一或多種症狀（生物化學、組織學及/或行為上），包括其併發症及在疾病發展期間呈現的中間病理學表型、增進患有疾病者的生活品質、減少治療疾病所需的其他藥物劑量、增強其他藥物的作用、延緩疾病的惡化、及/或延長病患的存活。可將有效劑量以一或多次投藥給 103827.doc •33· ⑧ 1355389 予。為了本發明之目的’藥物、化合物、或醫藥組合物之有效劑量為直接或間接足以達到預防或治療處理之量。如於臨床背景中了解，藥物、化合物、或醫藥組合物之有效劑量可或可不與另一種藥物、化合物、或醫藥組合物結合而達到。因此’可考慮「有效劑量」於給予一或多種治療藥物之文中，及若與一或多種其他藥物結合，可以或已達到理想結果，可將單一藥物視為以有效量給予。

如本文中使用，「治療」或「處理」為用以得到有利或理想結果（包括臨床結果）之方法。為了本發明之目的，有利或理想臨床結果包括（但不限於）下列一或多項：抑制、壓制或降低澱㈣蛋白斑之形成、降低、去除、清除殺粉狀蛋白斑、改善知能、倒轉或或減慢知能衰退、隔離在生物體液中循環的可溶性Αβ胜肽、減少組織（如腦）中^胜肽 (包括可溶性、寡聚合及沉殿的）、抑制、減慢及/或降低 Αβ胜肽於腦中的累積、抑制、減慢及/或降低獅肽於组織（如腦）中之毒性作用、減少自疾病引起的症狀、增進患 :疾病者的生活質、減少治療疾病所需的其他藥物劑置、延緩疾病的惡化、及/或延長病患的存活。如本文中使用，「延緩」阿耳滋海默氏症之發展意指推減慢1定化、及/或延遲疾病之發展。緩可為不同時間長度，親症步 ^ 沒視病史及/或跫治療的個體而定。子‘"、，'"本技藝者而言明顯的是，實際上充八可白人 ^ 貝％上充分或重要的延緩 3預防，其中個體不患此「 *十延緩」阿耳滋海麸氏症之發展的方法為當盥不使用 ^ 田”不使用此方法比較時，在特定時 103827.doc 1355389 間範圍中降低疾病發展的機率及/或在特定時間範圍中降低疾病的程度之方法。此比較通常係基於臨床研究，利用統汁學上有意義的個體數目。阿耳滋海默氏症之「發展」意指在個體内阿耳滋海默氏症之開始及/或惡化。利用如本文中所述的標準臨床技術可偵測到阿耳滋海默氏症發展。然而，發展也意指可為一開始無法偵測到的疾病惡化。為了本發明之目的，惡化意指疾病狀態的生物進程，於此情況中，如由標準神經學檢查、病患面談而決定’或可由更專門的測試而決定。許多此等診斷測試包括（但不限於）神經造影、偵測血清或腦脊髓液中特定蛋白質量之改變（如澱粉狀蛋白胜肽及Tau)、電月6)斷層（CT，computerized tomography)、及磁振造影（MRI， magnetic resonance imaging)。「發展.」包括出現、復發、及開始。如本文中使用阿耳滋海默氏症之r開始」或「出現」包括一開始的發病及/或復發。如本文中使用，「結合」給予包括同時給予及/或於不同時間給予。結合給予也包含以共同配方給予或以分開的組合物給予。如本文中使用，結合給予意指包含任何情況，其中將抗Αβ抗體及另一種藥劑給予至個體，其可同時及/ 或分開地進行。如本文中進一步討論，當然可將抗Αβ抗體及另一種藥劑以不同投藥頻率或間隔給予《例如，可將抗 Αβ抗體每週給予一次，而可將另一種藥劑較不頻繁地給予。當然利用相同給予途徑或不同給予途徑可給予抗Αβ抗體及另一種藥劑。 103827.doc •35- 生物樣本」包含由個體獲得的不同樣本類型及可用於診斷或監測分析中。此定義包含血液及生物來源的其他液體樣本、實體組織樣本如切片樣品或由其產生的組織培養或細胞’及其子代。此定義也包括在其取得後已用任何方式處理的樣本’如由與試藥處理、溶解、或增加某成分 (如蛋白質或多核苦酸）含量、或為切片目的而包埋於半固體或固體基質中。用詞「生物樣本」包含臨床樣本，並且也包括培養的細胞、細胞上層清液、細胞分解物、血清、血漿、生物體液、及組織樣本。「個體」為哺乳類，更佳的是人類。哺乳類包括（但不限於）農場動物（如乳牛）、運動動物、寵物（如貓、狗、馬）、靈長類、小鼠及大鼠。 RNA表現載體、及及某些真核細胞’如生產者細胞。

到要轉錄的核酸序列。如本文中使用，「載體」意指一種構體，其能夠傳遞（及較佳表現）一或多個有興趣的基因或序列於宿主細胞中。載體之實例包括（但不限於）病毒載體、裸dna或rna表現載體、質體、#質體（eGsmid)或嗟菌體载體、與陽離子凝聚丄’·》。的DNA或RNA表現載體、包入微脂粒中的DNA或

當與活性成分合併時，醫藥上可接受的載體」包括任何材料允命成分保持生物活性且其不與 103827.doc • 36 · 1355389 個體的免疫系統反應。實例包括（但不包括）任何標準醫藥載體如磷酸緩衝鹽水溶液、水、乳液如油/水乳液、及許多類型濕潤劑。氣溶膠或非經腸胃給予的較佳稀釋劑為麟酸緩衝鹽水或生理食鹽水（0.9%)。將含有此載體的組合物藉已熟知的習見方法配製（見例如Remingt〇n，s

Pharmaceutical Sciences，第 18版，A. Gennaro編著，Mack Publishing Co.，Easton，PA，*1990 ;及 Remingt〇n，The

Science and Practice of Pharmacy 第 20 版，]y^ack

Publishing, 2000) ° 如本文中使用，用詞「kon」係用來意指抗體結合至抗原的結合速率常數。如本文中使用’用詞「koff」係用來意指抗體自抗體/抗原複合物分解的脫離速率常數。如本文中使用，用詞「KD」係用來意指抗體·抗原交互作用的平衡分解常數。組合物及製造此組合物的方法抗體9TL及9TL衍生的抗體及多胜肽本發明包含組合物（包括醫藥組合物），其包含如表3 所示的抗體9TL及其變體或衍生自如表3中所示的抗體及其變體的多胜肽；及含有編碼9TL抗體及其變體股·故夕胜肽之序列的多核苷酸。如本文中使用，組合物包含結入的C端之一或多種抗體或多胜肽（其可為或抗體）及/或含有編碼結合至的C端之一或多種抗體或夕胜肽之序列的一或多種多核苷酸。此等組合物可、隹— J退一步包 103827.doc -37· 1355389 含適當賦—形劑，如醫藥上可接受的賦形劑（包括其為技藝上已熟知。本發明的抗體及多胜肽之特徵為任何(一或多個徵：⑷結合至Αβι_4。的c端胜肽28，，但不顯著地結人至寺

; (b)結合㈣*端胜肽33·4 個體中澱粉狀蛋白斑之形成；⑷減少個體中的澱粉狀蛋白斑；⑷治療、預防、改善阿耳滋海默氏症之一或狀；⑴改善知能功用。相反於其他報導的抗^抗體本發明之抗體及多胜肽也可呈現理想的安全特性。例如，本發明之組合物可能不會引起明顯或不可接受程度之下列任

緩衝液），何-或多種：腦血管中的出血（大腦出血）；腦膜腦炎（包括改變的磁振掃描）；於大腦脊髓液中升高的白血球數目；中樞神經系統發炎。於是，本發明提供任何下列，或包含任何下列之組合物 (包括醫藥組合物）：（a)示於表3中的抗體9Τχ及其變體； (b)示於表3中的抗體9TL及其變體之片段或區域；（c)示於表3中的抗體9TL及其變體之輕鏈；（d)示於表3中的抗體 9TL及其變體之重鏈；（e)來自示於表3中的抗體9Ίχ及其變體之輕鏈及/或重鏈的一或多個可變區域；示於表3中的抗體9TL及其變體之一或多個c〇Rs(—、二、三 '四、五或六個CDRs) ; (g)來自抗體9TL重鏈的CDR H3 ; (h)來自示於表3中的抗體9TL及其變體之輕鏈的cdr L3 ; (i)來自示於表3中的抗體9TL及其變體之輕鏈的三個CDRs ; (j)來自示於表3中的抗體9TL及其變體之重鏈的三個CDRs ; (k) 103827.doc -38· 1355389 來自示於表3中的抗體9TL及其變體之輕鏈的三個CDRs及來自重鏈的三個CDRs ;及（1)包含（b)至（k)任何一者之抗體。本發明也提供多胜肤，其包含上述任何一或多者。

將抗體9TL之CDR部分（包括裘蒂艾及卡巴CDRs)圖表地繪於圖1中。CDR區域之決定為在本技藝技術範圍内。當然於一些實施例中，CDRs可為卡巴及裘蒂艾CDR的組合 (也稱為「組合的CDRs」或「延伸的CDRs」）。於一些實施例中，CDRs為卡巴CDRs。於其他實施例中，CDRs為裘蒂艾CDRs。換言之，在具有多於一個CDR的實施例中， CDR可為任何卡巴、裘蒂艾、組合CDRs、或其組合。

於一些實施例中，本發明提供多胜肽（其可為或可不為抗體），其包含至少一個CDR、至少兩個、至少三個、或至少四個、至少五個、或所有六個CDRs與示於表3中的抗體9TL及其變體之至少一個CDR、至少兩個、至少三個、或至少四個、至少五個、或所有六個CDRs大體上相同。其他實施例包括具有至少兩個、三個、四個、五個、或六個CDRs與9TL或衍生自9TL的至少兩個、三個、四個、五個、或六個CDRs大體上相同之抗體。於一些實施例中，此至少一個、兩個、三個、四個、五個、或六個CDRs為至少約 85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、96%、 97%、98°/。、或99%相等於示於表3中的抗體9TL及其變體之至少一個、兩個、三個、四個、五個、或六個CDRs。當然，為了本發明的目的，一般將結合專一性及/或整體活性保留，雖然相較於示於表3中的抗體9TL及其變體，活 103827.doc -39- 1355389 性範圍可能改變（可為更大或更小）β 本發明也提供多胜肽（其可為或可不為抗體），其包含具有任何下列之示於表3中的抗體9TL或其變體之胺基酸序列：示於表3中的抗體9TL或其變體之序列的至少5個連續胺基酸、至少8個連續胺基酸、至少約1〇個連續胺基酸、至少約15個連續胺基酸、至少約2〇個連續胺基酸、至少約 25個連續胺基酸、至少約3〇個連續胺基酸，其中至少3個胺基酸係來自亲於表3中的9TL(圖〇或其變體之可變區域。於一個實施例中’可變區域係來自9TL的輕鏈。於另一個實施例t，可變區域係來自9TL的重鏈。例示多胜肽具有來自9TL的重及輕鏈兩者可變區域之連續胺基酸（如上述長度）。於另一個實施例中，5(或更多）個連續胺基酸係來自卞於圖1中的9TL之互補決定區（CDR，complementarity detemining region)。於一些實施例中，連續胺基酸係來自9TL的可變區域。本發明抗體及多胜肽之結合親合力可能不同，且不需要為（但可為）特定範圍值，如下述之例示實施例。本發明抗體及夕胜肽對的結合親合力可為約〇丨〇至約〇 111^'約〇.15至約〇_75 11]\/1、及約〇_18至約〇.72 1114。於一些實施例中，結合親合力為約2 ρΜ、約5 ρΜ、約10 ΡΜ、約 1 5 ρΜ、約2〇 ρΜ、約40 ρΜ、或大於約40 ρΜ。於一個實施例中，結合親合力為約2 ρΜ及22 ρΜ之間。於其他實施例中，結合親合力為小於約1〇 ηΜ、約5 ηΜ、約i ηΜ、約 900 ρΜ、約 ’ ρΜ、約 70G p.M、約 60G ρΜ、約 500 ρΜ、 103827.doc -40. ⑧、 1355389 約 4ΌΌ pM、約 300 pM、約 200 pM、約 150 pM、約 100 pM、約 90 pM、約 80 pM、約 70 pM、約 60 pM、約 50 pM、約40 pM、約30 pM、約10 pM。於一些實施例中，結合親合力為約10 nM。於其他實施例中，結合親合力為小於約10 nM、小於約50 nM、小於約100 nM、小於約150

nM、小於約200 nM、小於約250 nM、小於約500 nM、或小於約1000 nM。於其他實施例中，結合親合力為小於約5 nM。於其他實施例中，結合親合力為小於約1 nM。於其他實施例中，結合親合力為約0.1 nM或約0.07 nM。於其他實施例中，結合親合力為小於約0.1 nM或小於約0.07 nM。於其他實施例中，結合親合力為約1 0 nM、約5 nM、約 1 nM、約 900 pM、約 800 pM、約 700 pM、約 600 pM、約 500 pM、約 400 pM、約 300 pM、約 200 pM、約 150 pM、約 100 pM、約 90 pM、約 80 pM、約 70 pM、約 60 pM、約50 pM、約40 pM、約30 pM、約10 pM之任一者至約 2 pM、約 5 pM .、約 10 pM、約 15 pM、約 20 pM、約 40 pM之任一者。於一些實施例中，結合親合力為約1 0 nM、約 5 nM、約 1 nM、約 900 pM、約 800 pM、約 700 pM、約 600 pM、約 500 pM、約 400 pM、約 300 pM、約 200 pM、約 150 pM、約 100 pM、約 90 pM、約 80 pM、約 70 pM、約 60 pM、約 50 pM、約 40 pM、約 30 pM、約 10 pM之任一者。於再其他實施例中，結合親合力為約2 pM、約5 pM、約10 pM、約15 pM、約20 pM、約40 pM、或大於約40 pM。 103827.doc -41 - 1355389 本發明也提供製造任何此等抗體或多胜肽之方法。藉由技藝中已知的程序可製造本發明之抗體。藉由抗體之蛋白質分解或其他分解法、藉由如上述之重組方法（即單一或融合多胜肽）或藉由化學合成可製造多胜肽。方便地藉由化學合成製造抗體之多胜肽，特別是最多到約5〇個胺基酸的較短多胜肽。化學合成之方法為技藝中已知且為市面上可購得。例如，藉由利用固相方法之自動多胜肽合成器可製造抗體。也見於美國專利第5 807,715 ; 4 816,567 ;及 6,331，415。於另一個替代方法中，利用技藝中已熟知的程序可重組地製造抗體。於一個實施例中，多核苷酸包含示於SEQ m N0:9及SEQ ID NO:1〇中之編碼抗體9TL重鏈及/或輕鏈可變區域之序列。於另一個實施例中，將包含有示於SEq ID N0:9及SEQ ID NO:1〇中核苷酸序列之多核苷酸選殖入一或多個表現或繁殖載體中。可將編碼有興趣的抗體之序列保持於宿主細胞中的載體中及而後使宿主細胞增長及冷凍做進一步使用。將載體（包括表現載體）及宿主細胞於本文中進一步說明。

本發明也包含本發明抗體（如9 TL)之單鍵可變區域片段 (「scFv」）。藉由利用短連結胜肽由連結輕及/或重鏈可變區域製成單鏈可變區域片段。Bird等人，（1988) Science 242:423-426。連結胜肽之實例為（ggggs)3(SEq ID NO:40)，其在一個可變區域之缓基端及另一個可變區域的胺基端之間架橋大約3.5 nm。其他序列之連接體也曾被設 103827.doc -42- 1355389 計及使用。Bird等人（1988)。之後可將連接體修飾做其他功用’如附加藥物或附著至固體支撐體。可將單鏈變體以重組或合成地製造。對於scFv之合成製造，可使用自動合成器。對於scFv之重組製造，可將含有編碼scFv之多核苷酸的適當質體導入適當宿主細胞中’無論是真核細胞如酵母菌、植物、昆蟲或哺乳類細胞，或是原核細胞如大腸桿菌°藉由常規操作如多核苷酸的接合可製造編碼有興趣的 scFv之多核苷酸。利用技藝中已知的標準蛋白質純化技術可將形成的scFv分離。也包含單鏈抗體之其他形式，如微型雙功能抗體 (Diabodies)。微型雙功能抗體為雙價、雙專一性抗體，其中將VH及VL區塊表現於單一多胜肽鏈上，但使用太短而不允許相同鏈上兩區塊間配對之連接體，因而強迫區塊與另一鏈的互補區塊配對及產生兩個抗原結合位置（見如

Holliger，P.等人（1993)卩1：〇(；.^11.八。&(1.8(^.1；8入 90:6444-6448 ’ Poljak，R.J.等人（1994) Structure 2:1121-1123)。例如’利用揭示於本文中的抗體可製備雙專一性抗體 (對於至少兩個不同抗原具有結合專一性的單株抗體）^製造雙專一性抗體之方法為技藝中已知（見如Suresh等人， 1986，Methods in Enzymology 121:210)。傳統上，雙專一性抗體之重組製造係基於兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈組與具有不同專一性之兩個重鏈之共同表現（Milhtein及Cuell〇, 1983, Nature 305, 537-539)。根據製造雙專一性抗體的一個方式，將具有理想結合專 103827.doc •43· 1355389 一性-的抗體可變區塊（抗體_抗原結合區域）與免疫球蛋白固定區塊序列融合。此融合較佳為與免疫球蛋白重鏈固定區塊，包含至少部分之樞紐區（hinge)、CH2& CH3區域。較佳使含有輕鏈結合所必須的位置之第一個重鏈固定區域 (CH1)存在於至少一個融合中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合體及視需要免疫球蛋白的DNAs.入分開的表現載體，及共同轉染入適當的宿主生物中。當使用不相等比例之此三種多胜肽鏈於提供最佳產量之構造t，此提供極大彈性於調整實施例中三個多胜肽片段之相互比例。然而，當至少兩個多胜肽鏈之表現以相等比例造成高產量或當比例不特別重要時，能夠插入二或所有三種多胜肽鏈之編碼序列於一個表現載體中。於一個方法中’雙專一性抗體係由具有第一個結合專一性於一臂之雜交免疫球蛋白重鏈及（具有第二個結合專一性）於另一臂中之雜交免疫球蛋白輕鏈對組成。此不對稱結構（具有免疫球蛋白輕鏈於雙專一性分子之單一半中）幫助分離理想雙專一性化合物與不必要的免疫球蛋白鏈組合°此方法係說明於1994年3月3日發表的PCT公告編號 WO 94/04690 中。

包含兩個共價結合的抗體之異體結合抗體也為本發明的範圍内°曾使用此等抗體來使免疫系統細胞攻擊有害的細胞（美國專利第4,676,980號）及用以治療HIV感染（PCT申請公告編號WO 91/00360及WO 92/200373 ;歐洲專利EP 03089)。利用任何方便的交聯方法可製造異體結合抗體。 103827.doc -44 - 1355389 適當的交聯試劑及技術為技藝中已熟知，及揭示於美國專利第 4,676,980號。利用合成蛋白質化學之已知方法，包括包含交聯試劑者’可於試管内製備嵌合或雜交抗體。例如，利用雙硫交換反應或藉由形成硫醚鍵可建造免疫毒素。為此目的之適當试劑之實例包括亞胺基硫氫根（iminothiolate)及甲基-4-疏基丁醯亞胺曱g旨鹽酸鹽（butyrimidate)。利用技藝中已知的任何方法可製造包含抗體9TL之一或多種CDRs或衍生自抗體9TL之一或多種CDRs之人化抗體。例如’可使用四個一般步驟來人化單株抗體。此等為.（1)決定開始抗體輕及重可變區塊的核苷酸及預測的胺基酸序列（2)設計人化抗體，即決定在人化過程期間要使用的抗體骨架區域（3)實際人化方法/技術及（4)轉染及表現人化抗體。例如，見美國專利第4,816,567 ; 5,807,715 ; 5,866,692 ； 6,331,415 ； 5,530,101 ； 5,693,761 ； 5,693,762 ； 5,585,089 ； 6,180,370 ； 5,225,539 ； 6,548,640 號。於重組人化抗體中，可將Fc部分改質以避免與Fey受體及補體免疫系統交互作用。此類型改質係由劍橋大學病理系的Mike Clark博士設計，製備此抗體之技術係說明於 1999年11月18日發表的WO 99/58572中。例如，若抗體用於人類的臨床試驗及治療上，可將固定區域設計成更像人類固定區域以避免免疫反應。見例如美國專利第 5,997,867及5,866,692號。 103827.doc •45· ⑧ 1355389

本發明包含抗體吼的改質，包括不顯著影響功能上相當抗體及具有增強或降低的活性及/或親人力之變體。例如，可將抗體9TL的胺基酸序列突變以得到對 Αβ,4。胜肽具有理想結合親合力之抗體。多胜肽之改質為技藝中的常規工作，不需要於本文中詳述。將多胜肤之改質舉例於實例I經改質的多胜肽之實例包括具有胺基酸序列之保守性置換、不顯著有害地改變功能活性之一或多個胺基酸缺失或加成、或利用化學類似物之多胜肽。胺基酸序列插入包括長度範圍為一個殘基至含有一百個或以上殘基的多胜肽之胺基_及/或羧基端融合，以及單一或多個胺基酸殘基之序列内插入。末端插入之實例包括具有Ν-端甲硫胺醯殘基的抗體或融合至抗原決定區標記物之抗體。抗體分子的其他插入變體包括融合增加抗體的血清半生期之酵素或多胜肽至抗體的^或匕端。置換變體在抗體分子中具有至少一個胺基酸殘基被移除及於其位置插入不同殘基。最有興趣的置換性突變之位置包括高度可變區域，但是也考慮FR改變。將保守性置換示於表1的列標題「保守性置換」下。若此置換造成生物活性的改變’則可能導入更實質的改變（於表1中稱為「例示置換」）’或如下參照胺基酸類別進一步說明，及將產物篩選。 103827.doc -46- 1355389

表1 :胺基酸置換原始殘基保守性置換例示置換 Ala (A) Val Val; Leu; lie Arg ® Lys Lys; Gin; Asn Asn (N) Gin Gin; His; Asp, Lys; Arg Asp (D) Glu Glu; Asn Cys (C) Ser Ser; Ala Gin (Q) Asn Asn; Glu Glu (E) Asp Asp; Gin Gly (G) Ala Ala His (H) Arg Asn; Gin; Lys; Arg Ile(I) Leu Leu; Val; Met; Ala; Phe;正白胺酸（norleucine) Leu(L) lie 正白胺酸；lie; Val; Met; Ala; Phe Lys (K) Arg Arg; Gin; Asn Met (M) Leu Leu; Phe; lie Phe (F) Tyr Leu; Val; lie; Ala; Tyr Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Ser Ser Trp (W) Tyr Tyr; Phe Tyr (Y) Phe Trp; Phe; Thr; Ser Val(V) Leu lie; Leu; Met; Phe; Ala; 正白胺酸藉由選擇顯著改變其於維持（a)多胜肽骨架在置換的區域中的結構，例如，呈片層或螺旋形態、（b)在目標位置的分 103827.doc •47· 子電荷或親油性、或⑷側鏈的體積之作用的置換完成抗體生物性質上的實質改質。基於共同側鏈性質將天然發生的殘基分成群組： ⑴非極性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、lie ; (2) 極性不帶電荷：Cys、Ser、Thr、ASn、Gin ; (3) 酸性（負電荷）：Asp、Glu ; (4) 鹼性（正電荷）：Lys、Arg ; (5) 影響鏈方位之殘基：Giy、pro ;及 (6) 芳香族：τΓρ、Tyr、phe、His。非保守性置換係由交換此等類別其中之一員與另一類別而製成。也可將不涉及維持抗體適當形態的任何半胱胺酸殘基置換（通常與絲胺酸）以改善分子的氧化安定性及避免異常的父聯。相反地，可將半胱胺酸鍵加至抗體以改善其安定 ^ 特別疋當抗體為抗體片段如F v片段時。胺基酸改質反為可為改變或修飾一或多個胺基酸至完全重新設計一區域，如可變區域。可變區域的改變可改變結合親合力及/或專一性。於一些實施例中，在CDR區塊内不做超過一至五個保守性胺基酸置換。於其他實施例中，在CDR區塊内不做超過一至三個保守性胺基酸置換。於再其他實施例中，在CDR區塊為CDRH3及/或CDRL3。改質也包括醣化及無醣化多胜肽，以及具有其他轉譯後修飾之多胜肽，如例如用不同糖之醣化、乙醯化、及磷酸化。將抗體在其固定區域中的保守性位置醣化（Jefferis及 103827.doc •48· 1355389

Lund, 1997，Chem. Immunol· 65:111-128 ; Wright 及 Morrison，1997, TibTECH 15:26-32)。免疫球蛋白的寡醣側鍵影響蛋白質的功能（Boyd等人，1996，Mol. Immunol. 32:1311-1318 ; Wittwe及 Howard, 1990，Biochem. 29:4175-4180)及醣蛋白部分間的分子内交互作用（Hefferis及Lund, 同前；Wyss 及 Wagner, 1996，Current Opin. Biotech. 7:409-416)。寡醣也可作為使特定醣蛋白基於專一辨識結構攻擊某分子。也曾報導抗體的醣化影響抗體相關的細胞毒性 (ADCC, antibody-dependent cellular cytotoxicity)。特別是，曾報導具有四環素調節的β(1,4)-Ν-乙醯胺基葡萄糖轉移酶III(GnTIII)( —種催化等分GlcNAc形成之醣轉移酶）表現之CHO細胞具有改善的ADCC活性（Umana等人，1999, Mature Biotech. 17:176-180) 0

抗體的醣化通常為N-連結或〇-連結。N-連結意指將醣部分連接至天冬醯胺酸殘基的側鏈。三胜肽序列天冬醯胺酸-X-絲胺酸、天冬醯胺酸-X-羥丁胺酸、及天冬醯胺酸_χ_ 半胱胺酸（其中X為除了脯胺酸外之任何胺基酸）為酵素連接醣部分至天冬醯胺酸側鏈之辨識序列。因此，在多胜肽中此等胜肽序列之存在產生可能的醣化位置。〇_連結意指連接糖類Ν-乙醯半乳糖胺、半乳糖、或木糖其中之一者至羥胺基酸，最常見的是絲胺酸或羥丁胺酸，雖然也可使用 5 -經脯胺酸或5 -經離胺酸。藉由改變胺基酸序列使其含有一或多個上述三胜肽序列 (作為Ν-連結膽化位置）方便地完成將醣化位置加入至抗 -49- 103827.doc

1355389 體。藉由加入或用一或多個絲胺酸或經丁胺酸取代至原始抗體的序列（作為〇_連結醣化位置）也可做此改變。也可改變抗體之醣化模式而不改變根本的核苷酸序列。酷化主要視用來表現抗體的宿主細胞而定。因為用於表現作為可能療法的重組醣蛋白（如抗體）的細胞類型罕為天然細胞’可預期抗體之醣化模式的變異（見如Hse等人，1997, J_ Biol. Chem. 272:9062-9070)。

除了宿主細胞之選擇，在抗體的重組製造期間影響醣化的因素包括生長模式、培養基配方、培養密度、氧化作用、pH、純化步驟等。曾建議許多方法來改變於特定宿主生物中達到的醣化模式，其包括導入或過度表現涉及寡醣製造的某些酵素（美國專利第5,047,335 ; 5,51〇,261及 5,278,299號）。可將醣化（或某類型醣化）自醣蛋白酵素式移除，例如，利用内切糖苷酶H(End〇 H，End〇glyc〇sidase H)如實例3中所述的Ν-糖苷酶F、内切糖苷酶fi、内切糖

苷酶F2、内切糖苷酶F3。此外，可將重組宿主細胞遺傳上設計為在處理某類型多騎中有缺陷。此等及類似技術為技藝中已熟知。改質的其他方法包括利用技藝中已知的偶合技術，包括 (但不限於）酵素方式、氧化置換及螯合。例如，可使用改質於連接標記做免疫分析。利用技藝中已建立的程序㈣改質的饥多胜肽及利用技藝中已知的標準分析法可筛選，將其部分於下及實例中說明。於本發明的一些實施例中，抗體包含經改質的固定區 103827.doc ⑧ -50- 域，如為免疫學上惰性或部分惰性之固定區域，如不引發補體媒介的分解、不刺激抗體相關的細胞調節細胞毒性 (ADCC, antibody-dependent cell mediated cytotoxicity) ' 或不活化微膠細胞；或具有降低的活性（相較於未經改質的抗體）於下列任何一或多者：引發補體媒介的分解、刺激抗體相關的細胞調節細胞毒性（ADCC，antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)、或活化微膠細胞。可使用固定區域之不同修飾來達到作用功能之最佳程度及 / 或組合。見例如 Morgan 等人 ’ Immunology 86:319-324 (1995) ; Lund等人 ’ J. Immunology 157:4963-9, 157:4963-4969 (1996) ; Idusogie等人，J. Immunology 164:4178-4184 (2000) ; Tao等人，J· Immunology 143:2595-2601 (1989); 及 Jefferis 等人，Immunological Reviews 163:59-76 (199。於一些實施例中’將固定區域如Eur. J. Immunol. (1999)29:2613-2624 ; PCT 申請案第 PCT/GB99/01441 號；及/或大英聯合王國專利申請案第98099518號中所述改質。於其他實施例中，抗體包含人類重鏈IgG2a固定區域，其含有下列突變·· A330P331成為S330S331(胺基酸編號來照野生型 IgG2a 序列）。Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624。於再其他實施例中’將固定區域無聽化做 N -連結的醣化。於一些實施例中，藉由突變聽化的胺基酸殘基或於固定區域中為N-醣化辨識序列部分的側邊殘基，將固定區域無膽化做N-連結的聽化。於一些實施例中’將固定區威無醣化做N-連結的醣化。例如’可將N-醣化位置 I03827.doc •51 - 1355389 N297突變成a、Q、K、。見Ta〇等人，】。㈣ 143:2595-2601(1989) ； ^ Jefferis # Λ , Immun〇1〇gical

Reviews 163:59-76(1998)。用酵素或藉由在聽化缺陷的宿主細胞中表現可將固定區域無醣化做沁連結的醣化。於一些實施例中，將固定區域無醣化做^^•連結的醣化。可用酵素（如由酵素PNGase移除醣）或藉由表現於醣化缺陷的宿主細胞中，將固定區域無醣化做Ν·連結的畴化。其他抗體改質包括已經修飾如1999年11月18日發表的 • PCT申請案WO 99/58572中所說明。此等抗體除了針對目標分子的結合區塊外還包含一個作用區塊，其具有大體上同源於所有或部分人類免疫球蛋白重鏈的固定區塊之胺基酸序列。此等抗體能夠結合目標分子而不引發顯著補體相關的分解、或細胞調節的目標破壞。於一些實施例中，作用區塊能夠專一地結合FcRn及/或FcyRIIb。此等通常係基於衍生自二或多個人類免疫球蛋白重鏈CH2區塊之嵌合區塊。以此方式改質的抗體特別適用於慢性抗體療法，以避 ^ 免發炎及其他習見抗體療法之不良反應。本發明包括親合力成熟的實施例。例如，藉由技藝上已知的程序可製造親合力成熟的抗體（Marks等人，1992, Bio/Technology，10:779-783 ; Barbas等人，1994，JVoc iVai. Acad. Sci. iASd 91:3809-38 13 ; Schier 等人，1995， 169:147-155 ; Yelton等人，1995，·/· 155:1994- 2004 ; Jackson 等人，1995, «7. 154(7):33 10-9 ；

Hawkins 等人，1992，/. Μσ/. 5ζ·ί>/., 226:889-896 ;及 WO 103827.doc -52-

1355389 2004/058184) 〇可使用下列方法來調整抗體的親合力及了解CDR^了解抗體的CDR及/或改變（如改善）多胜肽（如抗體）的結合親合力的一個方式稱為「資料庫掃描突變法」。一般而言，資料庫掃描突變法運作如下。利用技藝上認可的方法將CDR 中的一或多個胺基酸位置用二或多個（如3、4、5、6、. 7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或 2〇個）胺基酸取代。此產生小的殖株（clone)資料庫（於一些實施例中，對每個分析的胺基酸位置有一個），各具有二或多個成員之複雜度（若在每個位置取代二或多個胺基酸一般而言’資料庫也包括包含自然（未取代的）胺基酸之殖株。將來自各資料庫的小數量殖株，如約2〇·8〇個殖株（視資料庫的複雜度而定）篩選對目標多胜肽（或其他結合目標）的結合親合力，及鑑定具有增加、相同、降低或無結合的候選者。決定結合親合力的方法為技藝中已熟知。利用 BIAcore表面電襞共振（piasm〇n res〇nance)分析可決定結合親合力’其偵測結合親合力約2倍或以上之差異。當開始抗體已以較高親合力結合，例如KD約1 〇 nM或更低時， BIAcore為特別有用。利用BiAcore表面電漿共振之篩選係說明於本文中的實例中。利用動態排除螢光免疫分析法（Kinexa)生物感應器、閃爍接近分析法（Scintillation Proximity Assay)、ELISA、 ORIGEN免疫分析法（IGEN)、螢光淬滅（flu〇rescence quenching)、蟹光轉移、及/或酵母菌呈現（yeast display)可 I03827.doc -53· 1355389 決定結合親合力。利用適當的生物檢定法也可篩選結合親合力。於一些實施例中，將CDR中的每個胺基酸位置利用技藝上認可的突變方法（將其部分揭示於本文中）用所有20個天然胺基酸取代（於一些實施例中，一次一個）。此產生小的殖株資料庫（於一些實施例中，對每個分析的胺基酸位置有一個），各具有20個成員之複雜度（若於每個位置將20個胺基酸置換）。於一些實施例中，要篩選的資料庫包含有在二或多個位置之置換，其可為在相同的CDR中或於二或多個CDR中。因此，資料庫可包含在一個CDR中的二或多個位置之置換。資料庫可包含在二或多個CDR中的二或多個位置之置換。資料庫可包含在3、4、5、或更多個位置中的置換，該位置見於在二、三、四、五、或六個CDR中。利用低重複性（redundancy)密碼子可製備置換。見如Balint等人， (1993) Gene 137(1):109-18 之表 2。 CDR 可為 CDRH3 及 / 或 CDRL3。CDR 可為 CDRL1、 CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2、及/ 或 CDRH3。CDR 可為卡巴CDR、裘蒂艾CDR、或延伸的CDR。可將具有改良結合的候選者定序，因而確認造成改良的親合力之CDR置換突變體（也稱為「改良的」置換）。也可將結合的候選者定序，因而確認保留結合的CDR置換。可進行多重系列之篩選。例如，具有改善的結合之候選者（各包含一個胺基酸置換於一或多個CDR的一或多個位 103827.doc -54- 1355389 置）也有用於設計至少含有原始及經取代的胺基酸於各改良的CDR位置（即於CDR中在置換的突變體顯示改善的結合之胺基酸位置）之第二個資料庫之設計。將此資料庫的製備、及篩選或選擇於下進一步說明。資料庫掃描突變法也提供用以描繪CDR特性的方式，在具有改善的結合之殖株頻率之範圍内，相同結合、降低的結合或無結合也提供關於各胺基酸位置對抗體·抗原複合物安定性的重要性之資訊。例如，若當CDR的一個位置改變至所有20個胺基酸仍保持結合，則將此位置鑑定為不太可能是抗原結合所必須者。相反地，CDR的一個位置若僅於小部份置換保持結合’則將此位置鑑定為對於Cdr功用重要者。因此’資料庫掃描突變法產生關於在Cdr中可改變成許多不同胺基酸（包括所有2〇個胺基酸）的位置及於 CDR中不能改變或僅可改變成一些胺基酸的位置之資訊。可將具有改善的親合力之候選者組合於第二個資料庫中，其包括改善的胺基酸、在該位置的原始胺基酸，及可進一步包括於該位置的其他置換，視希望或利用理想的篩選或選擇方法允許的資料庫之複雜度而定。此外，視需要，可將相鄰胺基酸位置任意排列成至少二或多個胺基酸。任意排列相鄰胺基酸可能允許突變的cdr中之其他形態彈性，其而後可能允許或幫助導入較大量改善的突變。資料庫也可包含置換於在第一次筛選中未顯示改善的親合力之位置。利用技藝令已知的任何方法，包括利用βι“表面電 103827.doc •55- 漿共振分析之篩選’及利用技藝中已知作為選擇的任何方法選擇’包括噬菌體呈現、酵母菌呈現、及核醣體呈現，將第二個資料庫篩選或選擇具有改善的及/或改變的結合親合力之資料庫成員。本發明也包含包括來自本發明之抗體（如9tl)或多胜肽之或夕個片段或區域之融合蛋白質。於一個實施例中，提供一種融合多胜肽，其包含示於SEQ ID N〇:2(圖丨）可變輕鍵區域之至少Μ個連續胺基酸及/或示於SEQ① NO: 1(圖1)可變重鏈區域之至少1〇個胺基酸。於其他實施例中’提供一種融合多胜肽，其包含示於SEQ ID n〇:2(圖 1)可變輕鏈區域之至少約丨〇個、至少約15個、至少約個、至少約25個、或至少約30個連續胺基酸及/或示於SEQ ID NO. 1 (圖1)可變重鏈區域之至少約丨〇個、至少約1 $個、至少約20個、至少約25個、或至少約3〇個連續胺基酸。於另一個實施例中’融合多胜肽包含9TL之輕鏈可變區域及/ 或重鍵可變區域，如圖itSEQ ID ΝΟ··2及SEQ ID ΝΟ··1中所不。於另一個實施例中，融合多胜肽包含91χ之一或多個CDR。於再其他實施例中’融合多胜肽包含抗體”[之 CDR H3及/或CDR L3。為了本發明之目的，9TL融合蛋白質含有一或多個9TL抗體及在天然分子中不連接的另一個胺基酸序列，例如來自另一個區域之異源或同源序列。例不異源序列包括（但不限於）「標籤」如Flag標籤或6His標籤。標籤為技藝中已熟知。藉由技藝中已知的方法，例如合成或重組，可將9TL融 103827.doc 1355389 合多胜肽建立。典型而言，利用本文中說明的重組方法，藉由製備表現編碼它們的多核苷酸，將本發明之9tl融合多胜肽製造’雖然也可將其藉由技藝中已知的其他方法製備’包括例如化學合成法。本發明也提供包含9TL抗體或多胜肽結合（例如連結）至幫助偶合至固體支樓物的試劑（如生物素（bi〇tin)或印白素 (avidin))之組合物。為了簡化，須知一般提及9Ίχ或抗體時，此等方法適用於本文中說明的任何Ap1-4〇結合實施例。結合一般意指連結如本文中說明的此等成分。可將連結（其一般至少為投藥以鄰近結合固定此等成分）以任何方法達到。例如，當各具有能夠與另一者反應的取代基時，減劑及抗體之間的直接反應為可能。例如，在一個上之親核性殘基’如胺基或硫氫基（sulfhy(Jryl gr〇up)可能可以和另一個上具有含羰基（如酐或醯齒）或具有含好的離去殘基之烧基殘基（如_化物）反應。可將本發明之抗體或多胜肽連接至標記試劑（或稱為才己」）如螢光分子、放射線分子或技藝中已知的任何其他標記。標記為技藝中已知，其一般提供（直接或間接）信號。本發明也提供包含抗體9TL的組合物（包括醫藥組合物）及套組’及如本揭示顯示之任何或所有本文中說明的抗體及/或多胜肽。具有受損的作用功能之抗-Αβ胜肽抗體及多胜肽本發明之方法利用專一地結合至澱粉狀蛋白胜肽及具 103827.doc -57· 1355389 有受損的作用功能之抗體或多胜肽（包括含有此抗體或多胜肽之醫藥組合物）。此抗體及多胜肽更具有下列任何（一或多個）特徵：（a)抑制澱粉狀蛋白斑於個體中之形成；降低個體中的殿粉狀蛋白斑：⑷治療、預防、緩解阿耳滋海默氏症的一或多個症狀；（d)改善知能功用。說明於本文中的抗體及多胜肽可能呈現理想的安全特性，例如，本發明之組合物不會引起明顯或不可接受程度或具有降低的程度之下列任何一或多種：腦血管中的出血（大腦出血）；腦 • 膜腦炎（包括改變的磁振掃描）；於大腦脊髓液中升高的白血球數目；中柩神經系統發炎。如時理例4中所示，使於 Fc區域中N-連結的醣化移除的抗_Αβ抗體有效於去除腦中的澱粉狀蛋白斑及改善的知能功用並於阿耳滋海默氏症的動物模型中具有比完整抗體明顯較少微出金。如本文中使用，具有「受損的作用功能」（與「免疫學上惰性」或「部分免疫學上惰性」）的抗體或多胜肽意指不具有任何作用功能或具有降低的活性或作用功能活性之籲抗體或多胜肽（與具有未經改質的或天然發生的固定區域之抗體或多胜肽比較）’如具有無活性或降低的活性於下列之任何一或多者：a)引發補體媒介的分解；b)刺激抗體相關的細胞調節細胞毒性（ADCC，antibody-dependent eell mediated cytotoxicity);及c)活化微膠細胞。可將作用功能降低約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、 90%、95%、99%、及100%之任一者。於一些實施例中，抗體結合至β-澱粉狀蛋白胜肽而不引發顯著的補體相關的 103827.doc •58- 1355389 分解，或目標的細胞調節破壞、例如，可將固定區域上的 Fc受體結合位置改質或突變以去除或降低對某些&受體如 FcyRI、FqRII及/或FcyRIII之結合親合力。為了簡化須知若提及抗體_，實施例也適用於多胜肤。使用eu編號系統（Kabat等人 ’ Sequences of Proteins 〇f Immun〇1〇gical Interest;第 5版 Public Health Service，Nati〇nal Institutes of Healthy，Bethesda，MD” 1991)來指明（如 IgG抗體的）固定區域的何者胺基酸殘基被改變或突變。可使用編號於抗體的特定類型（如IgG 1)或物種（如人類），並且須知可對不同抗體及物種作類似改變。於一些實施例中，專一地結合至Αβ胜肽的抗體包含具有受損的作用功能之重鏈固定區域。重鏈固定區域可具有天然發生的序列或為變體》於一些實施例申，將天然發生的重鏈固定區域之胺基酸序列突變，如藉由胺基酸置換、插入及/或缺失’因而使固定區域的作用功能受損。於一些實施例中’也可將重鏈固定區域之Fc區域的Ν-醣化改變，如可完全或部分移除，因而使固定區域的作用功能受損。於一些實施例中，藉由移除抗Αβ胜肽的Fc區域（如於igG 的CH2區塊中）的N-醣化，使作用功能受損。於一些實施例中，藉由突變醣化的胺基酸殘基或於固定區域中為醣化辨識序列部分的侧邊殘基，將Fc區域的N-醣化移除。三胜肽序列天冬醯胺酸-X-絲胺酸（N-X-S)、天冬醯胺酸-X·羥丁胺酸（N-X-T)及天冬醯胺酸-X-半胱胺酸（N-X-C)(其中X為除了脯胺酸外之任何胺基酸）為酵素連接醣部分至天冬醯胺 103827.doc -59· ⑧· 1355389 酸側鏈做N-醣化之辨識序列。突變在固定區域中的三胜肽中之任何胺基酸產生去酶化IgG。例如，可將人類igGi及 IgG3的N-醣化位置N297突變成A、D、Q、K、或Η。見Tao 等人 ’ J. Immunology 143:2595-2601(1989);及 Jefferis 等人，Immunological Reviews 163:5 9-76(1998) 〇已報導具有用Gin、His、或Lys取代Asn-297之人類igGl及IgG3不結合至人類FcyRI且不活化具有IgGl之Clq結合能力完全喪失及 IgG3之C 1 q结合能力大幅降低之補體。於一些實施例中，將三胜肽序列中之胺基酸N突變成胺基酸A、C、D、E、 F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R'S'T、V、W、Y之任一者。於一些實施例中’將三胜肽序列中之胺基酸N突變成保守性置換。於一些實施例中，將三胜肽序列中之胺基酸X突變成脯胺酸。於一些實施例中，將三胜肽序列中之胺基酸S突變成A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、 N、P、Q、R、V、W、Y。於一些實施例中，將三胜肽序列中之胺基酸T突變成a、d、e、f、g、h、i、k、l、 M、N、P、Q、R、V、W、Y。於一些實施例中，將三胜肽序列中之胺基酸C突變成A、D、E、F、G、H、I、K、 L、M、N、P、Q、R、V、W、Y。於一些實施例中，將三胜肽序列後的胺基酸突變成P。於一些實施例中，將固定區域中的N-醣化以酵素去除（如於實例3中所述之N-糖苷酶 F、内切糖苷酶F1、内切糖苷酶F2、内切糖苷酶F3、及内切糖苷酶H)。藉由在具有N-醣化缺陷的細胞株中製造抗體’也可達到去除N-醣化。Wright等人，J· Immunol. 103827.doc -60- 1355389 160(7):3393-402(1998) 〇於一些實施例中，將與連接至固定區域的N-醣化位置之寡醣交互作用的胺基酸殘基突變以降低對FcyRI結合親合力。例如，可將人類IgG3的F241、V264、D265突變。見 Lund等人，J. Immunology 157:4963-4969(1996) °

於一些實施例中，藉由改質區域如人類IgG之233-236、 297、及/或 327-33 1，如說明於PCT W099/58572 及 Armour 等人，Molecular Immunology 40:585-593(2003) ; Reddy等人，J. Immunology 164:1952-1933(2000)中，使作用功能受損。說明於PCT WO 99/58572及Armour等人中的抗體除了針對目標分子的結合區塊外，還包含一個作用區塊，其具有大體上同源於所有或部分人類免疫球蛋白重鏈的固定區塊之胺基酸序列。此等抗體能夠結合目標分子而不引發顯著補體相關的分解、或細胞調節的目標破壞。於一些實施例中，作用區塊對於FcyRI、FcyRIIcx及FcyRIII具有降低的親合力。於一些實施例中，作用區塊能夠專一地結合 FcRn及/或FcyRIIb。此等通常係基於衍生自二或多個人類免疫球蛋白重鏈CH2區塊之嵌合區塊。以此方式改質的抗體特別適用於慢性抗體療法，以避免發炎及其他習見抗體療法之不良反應。於一些實施例中，抗體之重鏈固定區域為具有下列突變任一者的人類重鏈IgGl : 1)A327A330P331 成為 G327S330S331 ;》)E233L234L235G236成為 P233V234A235 與缺失的 G236 ； 3)E233L234L235 成為 P233V234A235 ； 4)E233L234L235G236A327A330P331 成為 P233V234A235G327S330S331 103827.doc -61 - 1355389 與缺失的 G236 ； 5)E233L234L235A327A330P331 成為 P233V234A235G327S330S331 ; 6)及 N297成為 A297 或除了 N以外的任何其他胺基酸。於一些實施例中，抗體的重鏈固定區域為具有下列突變之人類重鏈IgG2 : A330P331成為 S330S331。於一些實施例中，抗體的重鏈固定區域為具有下列突變任一者之人類重鏈IgG4 : E233F234L235G236成為 P233V234A235 與缺失的 G236 ; E233F234L235 成為 P233V234A235 ；及 S228L235 成為 P228E235。也可將抗體的固定區域改質以削弱補體活化。例如，藉由突變在固定區域中於C1結合基序（如Clq結合基序）的胺基酸殘基可降低補體之C1成分結合後IgG抗體之補體活化。曾報導Ala突變人類IgGl的D270、K322、P329、P331 各顯著地降低抗體結合至Clq及活化補體的能力。對於鼠科IgG2b，Clq結合基序構成殘基E318、K320、K322。 Idusogie 等人，J. Immunology 164:4178-4184(2000); Duncan等人，Nature 322:738-740(1988) 〇吾人相信鼠科IgG2b鑑定的Clq結合基序E318、K320、及K322對於其他抗體同種型為共有的。Duncan等人， Nature 322:73 8-740(1988)。藉由用具有不適當官能基於其側鏈上的殘基取代此等指定的殘基之任一者可徹底破壞 IgG2b的Clq結合活性《不一定僅用Ala取代離子性殘基來破壞Clq結合。也可使用其他經烷基取代的非離子殘基，如Gly、lie、Leu、或Val，或芳香族非極性殘基如Phe ' Tyr、Trp及Pro取代此三個殘基之任一者以便破壞C 1 q結 103827.doc -62·

1355389 合。此外，也能夠利用極性非離子殘基如Ser、Thr、 Cys、及Met取代殘基320及322(但非318)以便破壞Clq結合活性。本發明也提供具有受損的作用功能之抗體，其中抗體具有經改質的樞紐區域。藉由修飾樞紐區域可調節人類IgG 對其Fc區域的結合親合力。Canfield等人，J. Exp. Med. 173:1483-1491(1991); Hezareh等人，J· Virol. 75:12161-12168(2001) ; Redpath等人，111111131111]11111111〇1〇§丫 59:720-727(1998)。可將特定的胺基酸殘基突變或刪除。經改質的植紐區域可包含由來自CH1區塊之不同抗體類別或亞群的抗體衍生的完整樞紐區域。例如，可將IgG抗體類別之固定區塊（CH1)連接至igG4抗體類別之樞紐區域。或者，新的樞紐區域可包含部分天然樞紐或重複單元，其中於重複中的各早元係衍生自天然極紐區域。於一些實施例中，藉由轉變一或多個半胱胺酸殘基成為中性殘基，如丙胺酸，或藉由適當故置的殘基成為半胱胺酸殘基，將天然樞紐區域改變。美國專利第5,677,425。利用技藝上確認的蛋白質化學及較佳的是遺傳工程技術及如本文中所述進行此改變。也可使用專一地結合至Αβ胜肽及融合至具有受損的作用功能之重鏈固定區域之多胜肽於本文中所述的方法中。於一些實施例中，多胜肽包含衍生自示於表3中的抗體9ιχ或其變體的序列。於一些實施例中，多胜肽係衍生自結合至 Αβ胜肽的單一區塊抗體。利用技藝中已知的方法可產生單 103827.doc -63 - 1355389 一區：塊抗體。Omidfar 等人，—Tumour Biol. ’25:296-305(2004) ; Herring等人，Trends in Biotechnology 21:484-489(2003) °

於一些實施例中，抗體或多胜肽不是不是F(ab')2片段。於一些實施例中，抗體或多胜肽不是Fab片段。於一些實施例中，抗體或多胜肽不是單鏈抗體scFv。於一些實施例中，抗體或多胜肽為乙二醇化的F(ab')2片段。於一些實施例中，抗體或多胜肽為乙二醇化的Fab片段。於一些實施例中，抗體或多胜肽是乙二醇化的單鏈抗體scFv。也可使用技藝中已知製造具有受損作用功能的抗體之其他方法。

可於一或多個分析法中測試具有經改質的固定區域之抗體及多胜肽以評估和開始抗體相較生物活性上作用功能降低的量。例如，利用揭示於本文中的分析法以及任何技藝確認的分析法可評估具有改變的Fc區域（或改變的枢紐區域）之抗體或多胜肽結合補體或Fc受體（例如於微膠細胞上的 Fc 受體）之能力。PCT WO 99/58572 ; Armour 等人， Molecular Immunology 40:585-593(2003) ; Reddy等人，J. Immunology 164:1952-1933(2000) ； Song 等人，Infection and Immunity 70:5 177-5 184(2002) o 於一些實施例中，專一地結合至β澱粉狀蛋白胜肽之抗體為多株抗體。於一些實施例中，抗體為單株抗體。於一些實施例中，抗體為人類抗體。於一些實施例中，抗體為嵌合抗體。於一些實施例中，抗體為人化抗體。於一些實 103827.doc -64- 1355389 把例中’抗體為靈長類化抗體。見如Y〇cQlT1等人，_ J.

Rheumatol. 25:1257-62(1998) ; Bugelski等人，Human & Experimental Toxicoloy 19:230-243(2000)。於一些實施例中’將抗體藉突變去免疫性使得抗體不活化人類免疫系統。見如 Nanus 等人，J. Urology 170:S84-S89(2003)。如本文中使用，Αβ胜肽包括澱粉狀蛋白前驅蛋白質酵素切斷產物之任何片段。例如，Αβ胜肽包括Αβ^ο、、或Αβ,·。之任何片段；及在Αβ"。、Αβι.42、或ΑβΝ43之Ν端或C端處不同胺基酸數目截斷的胜肽。本文中使用的胺基酸編號係基於為ApuJSEQ ID ΝΟ:17)之編號。於一些實施例中，抗體或多胜肽專一地結合至Αβ胜肽的殘基1-16内的抗原決定區。於一些實施例中，抗體或多胜肽專一地結合至Αβ胜肽的殘基16-28内的抗原決定區。於一些貫加例中’抗體或多胜肽專一地結合至Αβ i_4〇胜肽的殘基28-40内的抗原決定區。於一些實施例中，抗體或多胜肽專一地結合至Αβ,_42胜肽的殘基28-42内的抗原決定區。於一些實施例中，抗體或多胜肽專一地結合至αΡι 43 胜肽的殘基28-43内的抗原決定區。於一些實施例中，抗體或夕胜肽專一地結合至Α β胜肽而不結合至全長澱粉狀蛋白别驅蛋白質（APP，amyloid precursor protein)。於一些實施例中’抗體或多胜肽專一地結合至Αβ之聚集形式而不結合至可溶的形式。於一些實施例中，抗體或多胜肽專—地結合至Αβ之可溶的形式而不結合至聚集形式。於一些實施例中，抗體或多胜肽專一地結合至Αβ之聚集形式及可溶的 103827.doc -65- 1355389 形式兩者。結合至Αβ之不同聚集形式之抗體為技藝中已知，例如，結合至澱粉狀蛋白β衍生的可擴散配體（ADDLs, amyloid beta-derived diffusible ligands);結合至澱粉狀蛋白細纖維及/或沉澱物之抗體。WO 03/104437 ;美國專利申請案第2003/0147887號；美國專利申請案第 2004/0219146號。

於一些實施例中，抗體或多胜肽專一地結合至殘基33-40内的抗原決定區。於一些實施例中，抗體或多胜肽專一地結合至Αβ^ο上包括胺基酸35-40的抗原決定區。於一些實施例中，抗體或多胜肽專一地結合至aPi_4q 上包括胺基酸3 6 - 4 0的抗原決定區。於一些實施例中，抗體或多胜肽專一地結合至Αβ^ο上包括胺基酸39及/或40的抗原決定區。於一些實施例中，抗體或多胜肽專一地結合至Αβ!·4。但不專一地結合至Ap!-42及/或。於一些實施例中’抗體或多胜肽為抗體9TL或本文中所述衍生自9TL 的抗體之抗體或多胜肽。於一些實施例中，抗體或多胜肽競爭性地抑制抗體9TL及/或衍生自9TL的抗體或多胜肽結合至Αβ,-^。於一些實施例中，抗體不是說明於pcT WO 2004/032868 中的抗體 2286 » 本發明之抗體及多胜肽的結合親合力可能不同，且不需要（但可為）一特定值或範圍’如以下說明的例示實施例。本發明之抗體及多胜肽對Αβ^ο、或Αβ^ο的結合親合力可為約〇.1〇至約〇.8〇 ηΜ、約〇_ 15至約0.75 ηΜ及約0.18 至約0.72 ηΜ。於一些實施例中，結合親合力為約2 ρΜ、 103827.doc -66- 1355389 約 5 pm' 約10 pM、約15 pM、約 2〇 pM、約 4〇 _、或大於約40 PM。於一個實施例中，結合親合力為約2 及η PMH其他實施财，結合親合力為小於⑽

約5nM、約lnM、約_pM、約議pM、約7⑽pM、約 6〇〇 PM、約 _ pM、約 _ pM、約则 pM、約細 Μ、約 150PM、約⑽ pM、約 9〇pM、_pM、約 π#、約 6〇 pM、約 50 pM、約 40 pM、約 3〇 pM、約 ι〇 _。於一些實施例中，結合親合力為約10 nM。於其他實施例中，結合親合力為小於約10 nM、小於約5〇 nM、小於約ι〇〇 nM、小於約150 nM、小於約2〇〇 nM、小於約碰、小於約500 nM、或小於約咖nM。於其他實施財結合親合力為小於約5 ηΜβ於其他實施例中，結合親合力為小於約i福。於其他實施例中，結合親合力為約〇」碰或約 0.07福。於其他實施例中，結合親合力為小於約〇 ι nM 或小於約0.07福。於其他實施例中’結合親合力為約ι〇 nM、約5 nM、約i nM、約9⑽pM、約咖_、約· PM、約6G() pM、約则pM、約彻pM、約扇_、約 2〇〇_、約150_、約100_、約9〇_、約8〇_、約 7〇 PM、約 60 PM、約 50 pM、約 4〇 pM、約 3〇 pM、約 ι〇 pM之任一者至約2 pM、約5 pM、約1〇 _、約"pM、約 2〇 PM、或約40 pM之任一者。於一些實施例中，結合親合力為約1〇nM、約5nM、約lnM、約_pM、約咖pM、約 700 PM、約 600 pM、約 500 pM、約 4〇〇 pM、約· PM、約 200 叫、約150_、約1〇〇_、約9〇_、物 103827.doc •67· 1355389 pm、約 70 pM、約 60 μ 1 約 50 PM、約 40 ^ PM、約l〇 pm之任一去。认$ * ΡΜ、約30 任者。於再其他實施例中，結人為約2 ρΜ、約5 、的1 λ X 。親合力約10_、約 15_、約 ΡΜ、或大於約4〇 ρΜ。力40 製造抗體及多胜肽之方法々在為技藝中已知及說明中。％承文

^用競爭性分析法來決^兩個抗體是否藉由辨識相同而一相同抗原決定區或立體上重疊的抗原決定區抗體競等性抑制另—個抗體對抗原的結合。此等技藝上已知。典型而言，將抗原固定於多孔盤上並測量：經標記的抗體阻擋經標記的抗體之結合的能力。此競爭性分析法的一般標記為放射線標記或酵素標記。

可篩選專一地結合至Αβ的抗體及多胜肽之去除澱粉狀蛋白沉殿物的功效及其他有利的作用，如改善知能。例如，可將抗體或多胜肽給予至具有阿耳滋海默氏病變的動物。阿耳滋海默氏症的許多動物模型為技藝中已知。給予後，利用技藝中已知及詳述於實例2中的方法，可測試完整及擴散澱粉狀蛋白之量、知能之行為分析、及微膠細胞活化及微出血。PCT WO 2004/032868 ; Wilcock 等人，J.

Neurosci. 23:3745-3751(2003) ； Wilcock 等人，J.

Neuroinflammation 1:24(2004) ° 多核苷酸、載體及宿主細胞本發明也提供編碼本發明之抗體及多胜肽（包括.包含示於圖1中輕鏈及重鏈可變區域之多胜肽序列之抗體）的分離 103827.doc -68 - 1355389 的多核苦酸’及包含此多核苷酸之載體及宿主細胞。於是’本發明提供多核苷酸（或組合物，包括醫藥組合物），其包含編碼下列任一者之多核苷酸：（a)示於表3中的抗體9TL或其變體；（b)示於表3中的抗體9τχ或其變體之片段或區域，（c)示於表3中的抗體9Τχ或其變體之輕鏈；（d) 不於表3中的抗體9TL或其變體的重鏈；（e)來自示於表3中的抗體9TL或其變體之輕鏈及/或重鏈之一或多個可變區域；⑴示於表3中抗體9TL或其變體之一或多（一、二、二、四、五、或六）個CDR ; 來自抗體9TL重鏈的cdr H3 ; (h)來自示於表3中抗體9Tl或其變體之輕鏈的cDR L3 ;⑴來自示於表3中抗體9Τχ或其變體之輕鏈的三個 CDRs ;⑴來自示於表3中抗體9TL或其變體之重鏈的三個 CDRs ; (k)來自示於表3中抗體9Ίχ或其變體之輕鏈的三個 CDRs及來自重鏈的三個⑶以；及⑴包含⑻至⑻任一者之抗體。於一些實施例中，多核普酸包含示於seq⑴n〇:9 及SEQ ID NO: 10中的任一或兩者多核苷酸。另方面本發明&供編碼本文中所述之任何抗體（包括抗體片段）或多胜肽之多核苦酸，如具有受損的作用功能之抗體或多胜肽。藉由技藝中已知的程序可製造多核苦酸。另方面，本發明提供組合物（如醫藥組合物），其包含本發明之任何多核苷酸。於一些實施例中’組合物包含表現載體’其包含編碼如本文中所述的91χ抗體之多核苦酸。於其他實施例中’組合物包含表現載體，其包含編碼 103827.doc -69- 1355389 如本文中所述的任何抗:體或多胜肽之多核苷酸。於再其他實施例中，組合物包含示於SEq ID N0:9及SEQ ID NO:I〇中的任一或兩者多核苷酸。將表現載體 '及多核苷酸組合物之給予於本文中進一步說明。另一方面，本發明提供製造本文中說明的任何多核苷酸之方法。本發明也包含互補於任何此序列之多核苷酸。多核苷酸可為單股（編碼或反意義）或雙股，及可為dna(基因組、 cDNA或合成的）或rnA分子。RNA分子包括HnRNA分子 (其含有内含子及以一對一的方式相當於Dna分子）及 mRN A为子（其不含有内含子）。其他編碼或非編碼序列可 (仁不而要）存在於本發明的多核苷酸内，及可（但不需要）將多核苷酸連接至其他分子及/或支撐材料。多核苷酸可包含天然序列（即編碼抗體或其部分之内生序列）或可包含此序列之變體。多核苷酸變體含有一或多個置換 '加成、缺失及/或插入使得相對於天然免疫反應眭刀子，編碼的多胜肽之免疫反應性不變小。如本文中所述可一般地評估編碼的多胜肽之免疫反應性作用。變體較佳x、、、扁碼天然抗體或其部分之多核苷酸序列呈現至少約 7 0 °/〇 — Sb ,Μ： > ® /j. 更佳至少約80% —致性及最佳至少約9〇Q/0 — 致性。 ° 下所述對齊做最大符合性’若在兩個序列中的核苦酉欠或胺基酸的序列為相同時，則說兩個多核苷酸或多胜肽序列為「相.. J」°於兩序列間之比較通常由在比較窗上比 103827.doc -70· 1355389 較序列進行以確認及比較序列局部區域之相似性。如本文中使用「比較窗」意指一段至少約20個連續位置，通常30 個至約75個、40個至約50個，其中在將兩序列最適對齊後，可將序列與相同數目連續位置之參考序列比較。

利用生物資訊（bioinformatics)軟體之Lasergene套裝軟體的 Megalign程式（DNASTAR，Inc.，Madison, WI)，利用預設參數，可進行比較序列之最適對齊。此程式包含說明於下列參考資料_的對齊系統：Dayhoff，M.O. (1987)A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detecting distant relationships。於 Dayhoff，M.O.編著，Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation，Washington DC 第 5冊，附錄 3，345-358 頁；Hein J.，1990，Unified Approach to Alignment and Phylogenes，626-645 頁，Methods in Enzymology 第 183 冊，Academic Press, Inc.，San Diego, CA ; Higgins，D.G.及 Sharp, P.M·，1989，CABIOS 5:15 1 153 ; Myers，E·W.及 Muller W·，1988，CABIOS 4:11-17 ; Robinson, E.D.，1971， Comb. Theor. 11:105 ； Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol· Evol. 4:406-425 ; Sneath, P.H.A.及 Sokal，R.R·，1973,

Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA ； Wilbur，W.J.及 Lipman，D.J.，1983，Proc· Natl· Acad. Sci. USA 80:726-730 ° 較佳的是，「序列一致性百分比」係由在至少2 0個位置 103827.doc • 71 - '(δ) 1355389 之比較窗上比較兩個最佳對齊的序列而決定，盆中當比較兩序列之最佳對齊的參考序列（其不含加U缺失），在比較窗中多核普酸或多胜肽序列之部分可包含2〇%或以下，通吊為5至15/。，或1〇至12〇/0之加成或缺失（即空缺）。藉由決定於兩個彳列中纟生相同核酸鹼基或胺基酸殘基的位置之數目而產生相符的位置之數目，將此相符的位置之數目除以參考序列中位置之總數（即窗大小）及將此結果乘以100 而產生序列一致性百分比而計算百分比。變體可能也（或不同地）為大體上同源於天然基因，或其部分或互補。此多核苷酸變體能夠在中等嚴謹的條件下雜父至編瑪天然抗體的天然發生的DNA序列（或互補序列）。適當的「中等嚴謹的條件」包括於5X ssc、〇.5〇/()Sds、

1.0 mM EDTA(pH 8·0)之溶液中預洗；在5〇。〇-65。(：、5X SSC中雜父隔夜；之後於含SDS的2X、0.5X及0.2X SSC於65°C清洗20分鐘各2次。如本文中使用，「高度嚴謹的條件」或「高嚴謹度條件」為：（1)利用低離子強度及高溫做清洗，例如〇.〇 1 5 Μ 氯化鈉/0.0015 Μ檸檬酸鈉/0.1%月桂硫酸鈉於5(TC ; (2)於雜交期間利用變性劑如甲醯胺，例如50%(v/v)甲醯胺與 0.1%牛血清白蛋白/0,1%聚蔗糖（Ficoll)/0.1%聚乙烯吡咯烷酮/50 mM填酸鈉緩衝液於pH 6.5與750 mM氯化鈉、75 mM 檸檬酸鈉於42°C ;或（3)利用50%甲醯胺、5x SSC(0.75 Μ NaCl、0.075 Μ檸檬酸鈉）、50 mM磷酸鈉（pH 6.8)、0.1% 焦磷酸鈉、5x Denhardt's溶液、經超音波震盪的鮭魚精 103827.doc -72- 1355389 DNA(5〇微克/毫升）、（Μ% SDS、及10%硫酸葡聚糖於42 °C ’與在42°C於0.2x SSC(氯化鈉/擰檬酸鈉）中及於55°C的 5 0°/〇甲醯胺中清洗，之後用由含EDTA的O.lx SSC在55。(：組成的高嚴謹度清洗。.熟悉本技藝者將知如何視需要調整溫度、離子強度等以符合如探針長度等的因素。一般熟悉本技藝者將知’由於遺傳密碼的簡併性，有許多核苷酸序列編碼如本文中所述的多胜肽。一些此等多核普酸具有對任何天然基因之核苷酸序列極小的同源性。但是’本發明也特別考慮由於密碼子用法不同而改變的多核普酸。再者’包含有本文中提供的多核苷酸序列的基因之對偶基因為本發明範圍内。對偶基因為由於一或多個突變’如核苷酸之缺失、加入及/或置換造成改變的内生基因。形成的mRNA及蛋白質可能（但不一定要）具有改變的結構或功能。利用標準技術（如雜交、放大及/或資料庫序列比較）可鑑定對偶基因。本發明的多核苷酸可利用化學合成、重組方法、或pCR 得到。化學多核苷酸合成之方法為技藝中已熟知，不窝要於本文中詳細說明。熟悉本技藝者可以使用本文中提供的序列及市售DNA合成儀來產生理想DNA序列。對於利用重組方法製造多核苷酸，可將包含有理想序列之多核苷酸插入適當載體，之後可將載體導入適當宿主細胞做複製及放大，如本文中進一步說明。藉由任何技藝中已知的方式可將多核苷酸插入宿主細胞中。藉由直接攝入 '内呑作用、轉染、F_交配或電穿孔導入外生的多核苷 103827.doc 73· 1355389 酸將細胞轉化。一旦胃導入，可將外生的多核皆酸維持於細胞内呈未結合的載體（如質體）或結合入宿主細胞基因組。藉由技藝中已熟知的方法可將如此放大的DNA自宿主細胞分離。見如Sambrook等人（1989)。或者，PCR允許DNA序列之複製。PCR技術為技藝中已熟知及說明於美國專利第4,683，195、4,800，159、 4,754,065 及 4,683,202 號中，以及 PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis 等人編著，Birkauswer Press， Boston( 1 994)。藉由利用分離的DNA於適當的載體及插入適當的宿主細胞中，可得到RNA。當細胞複製及將DNA轉錄成RNA，之後可將RNA利用熟悉本技藝者已熟知的方法分離，如 Sambrook等人（1989)中所提出。根據標準技術可建立適當的選殖載體，或可由技藝中可得到的大量選殖載體選出。雖然選擇的選殖載體可能根據欲使用的宿主細胞而不同，有用的選殖載體一般有自身複製的能力，可能對特定限制内切核酸酶具有單一目標，及 /或可能攜帶可用於選擇含有此載體之殖株之標記基因。適當的實例包括質體及細菌性病毒，如pUC 1 8、pUC 19、 Bluescript(如 pBS SK+)及其衍生物、mpl8、mpl9、 pBR322、pMB9、ColEl、pCRl、RP4、噬菌體DNA及穿梭載體（shuttle vectors)如pSA3及pAT28。此等及=許多其他選殖載體為可賭自市場供應商如BioRad、Strategene、及 Invitrogen 〇 103827.doc -74- 1355389 表現載體一般為可複製的多核苷酸構體，其含有根據本發明之多核苷酸。此意味表現載體必須在宿主細胞中可複製’無論是呈游離基因（episomes)或呈染色體DNA的整體部分。適當的表現載體包括（但不限於）質體、病毒載體，包括腺病毒、腺相關病毒、反轉錄病毒、黏粒、及揭示於世界專利申請案第W0 87/04462號中的表現載體。載體成分一般可包括（但不限於）下列一或多者：信號序列；複製起點；一或多個標記基因；適當的轉錄控制元件（如啟動子、促進子及終結子）。為了表現（即轉譯），也通常需要一或多個轉譯控制元件，如核醣體結合位置、轉譯起始位置、及停止密碼子。藉由任何許多適當的方法’包括電穿孔、利用氣化飼、氯化敛I、破酸飼、DEAE-葡聚糖、或其他物質之轉染；微彈轟擊法（microprojectile bombardment);脂轉染 (lipofection);及感染（如當載體為有感染性藥劑如牛痘病毒）’可將含有有興趣的多核苷酸之載體導入宿主細胞。導入載體或多核苷酸之選擇常視宿主細胞的特性而定。本發明也提供包含任何本文中所述的多核苷酸之宿主細胞。為了分離編碼有興趣的抗體、多胜肽或蛋白質之基因可使用能夠過度表現異源DNA的任何宿主細胞。哺乳類宿主細胞之非限制性實例包括（但不限於）C〇S、HeLa、及 CHO細胞。也見世界專利申請案第w〇 87/〇4464號。適當的非哺乳類宿主細胞包括原核細胞（如大腸桿菌或枯草芽胞才干囷）及酵母菌（如讓酒酵母（S. cere vis ae)、裂殖酵母（s 103827.doc •75· 1355389 P〇mbe);或乳酸克魯維酵母（κ心化））。較佳的是宿主細胞以約5倍’更佳的是1〇倍，再更佳2〇倍高於宿主細胞中相對應内生的有興趣的抗體或蛋白質之量表現cDna 置。藉由免疫分析法或FACS實行篩選對Αβι·4〇專一性結合之宿主細胞。可鑑定過度表現有興趣的抗體或蛋白質之細胞。具有丈4貝的作用功能之9TL衍生的抗體及抗—j^^抗體之診斷用途可使用結合至端的抗體9TL來鑑定或偵測Αβι·4〇的存在與否。為了簡化，一般提及9TL或抗體時應知此等方法適用於任何本文中說明的APl_4〇結合實施例（如多胜肽）β偵測一般包含使生物樣本與本文中說明結合至APhW 的抗體接觸及於Αβ,-4。及專一地結合至Αβ!·^的抗體（如 9TL)之間形成複合物。此複合物之形成可為試管内或活體内。如本文令使用的用詞「偵測」包括參照或不參照控制組之定性及/或定量偵測（測量程度）。可使用任何許多已知方法於偵測，包括（但不限於）免疫分析法’利用結合至多胜肽的抗體，如藉由酵素連結免疫吸附分析法（ELISA， enzyme-linked immunosorbent assay)、放射免疫分析（RIA，radioimmunoassay)等；編碼的多胜肽之功能分析，如結合活性或酵素分析。於一些實施例中’將抗體可偵測地標記。其他實施例為技藝中已知及說明於本文尹。可使用本發明的抗體及多胜肽於偵測、診斷及監測與改 103827.doc • 76-

1355389 變的或異常Αβ或βΑΡΡ表現有關的疾病、症狀或失調，如阿耳滋海默氏症及蒙古症。因此，於一些實施例中，本發明提供方法，其包含使懷疑具有改變的或異常Αβ表現的個體之標本（樣本）與本發明的抗體或多胜肽接觸及決定是否的量與控制組或比較樣本之量不同。於其他實施例中’本發明提供方法’其包含接觸個體之標本（樣本）及決定Αβ^ο表現量。為了診斷應用，可將抗體用可偵測的部分標記，包括但不限於放射線同位素、螢光標記、及許多酵素受質標記。結合標記至抗體的方法為技藝中已知。於本發明的其他實施例中’不需要將本發明的抗體標記，利用結合至本發明抗體的標記的抗體可偵測其存在。可將本發明的抗體用於任何已知分析法中，如競爭性結合分析法、直接及間接三明治分析法、及免疫沉澱分析法。Zola，Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques， 147-158 頁（CRC Press，Inc. 1987)。也可使用抗體於活體内診斷分析中，如活體内造影。_ 般而言，將抗體用放射線核種（如lllIn、99Tc、、13ll、 12 5 '3 I '或H)標記’以便可使有興趣的細胞或組織利用免疫閃爍攝影定位。也可使用杬體作為病理學上的染色試劑，下列技術為技藝中已熟知。可使用具有受損的作用功能的抗_Αρ抗體於測量腦澱粉狀蛋白量以診斷有高危險性或已診斷出具有AD的個體， 103827.doc •77· 1355389 及評估任何治療及疾病狀態的進展。曾有報導體表給予單株抗Αβ抗體造成快速增加血裂Ap及此增加的大小與海馬迴及皮質中澱粉狀蛋白量有高度相關性。DeMatt〇s等人，

Science 295:2264-2267(2002)。於一些實施例中，將具有文損的作用功能的抗_Αβ抗體給予個體，及測量血漿中的量，因而血漿Αβ之增加代表個體中腦澱粉狀蛋白量之存在及程度。可將此等方法用於監測治療的有效性及疾病階段及用以決定未來投藥及頻率。具有受損的作用功能的抗體可能有較好的安全特性及提供此等診斷用途之優點。利用抗-人$抗體於治療目的之方法可使用說明於本文中的抗體（包括多胜肽）、多核苷酸、及醫藥組合物於治療、預防及抑制特徵為個體腦中蛋白質沉積的神經學症狀發展的方法中。此神經學症狀之實例包括阿耳滋海默氏症、病原素病（pH()n disease)、特徵為路易氏體（Lewy Bodies)之疾病（如帕金森氏症）。方法包含給予個體有效量之專一地結合至蛋白質或蛋白質沉積物的抗體或編碼此抗體之多核苷酸，其中抗體具有受損的作用功能。例如’可將專一地結合至病原素蛋白質或病原素蛋白質之聚集形式且具有受損的作用功能的抗體給予個體做為病原素病之預防及/或治療處理；可將專一地結合至突觸核蛋白（synudein)(如α_突觸核蛋白）或突觸核蛋白之聚集形式且具有受損的作用功能的抗體給予個體做為帕金. 症之預防及/或治療處理。 ’ 可使用說明於本文中的抗體（包括多胜肤）' 多核芽酸、 103827.doc -78- 1355389 及醫藥組合物於治療、預防及抑制阿耳滋海默氏症及其他與改變的Αβ或βΑΡΡ表現、或Αβ胜肽累積或沉澱物有關的疾病（通稱為「Αβ·相關的疾病」），如蒙古症、帕金森氏症、多發梗塞性痴呆症、輕度知能障礙、腦澱粉狀蛋白血官病、於血管中由Αβ胜肽沉澱物引起的血管疾病（如中風及HCHWA-D)之發展。此方法包含給予個體抗體、多胜肤、或多核苷酸、或醫藥組合物。於預防應用中，將醫藥組合物或藥物以足以消除或降低風險、減輕嚴重性、或延遲發病，包括疾病的生物化學、組織學及/或行為症狀、其併發症及在疾病發展期間存在的中間病理學表現型之量給予有可能或有危險得到阿耳滋海默氏症（或其他Αρ_相關的疾病）之病患。於治療應用中，將醫藥組合物或藥物以足以疼癒，或至少部分阻止疾病的症狀（生物化學、組織學及/或行為）’包括其併發症及在疾病發展期間存在的中間病理學表現型之量給予懷疑或已患有此疾病之病患。本發明也提供於個體中延遲與阿耳滋海默氏症（或其他 Αβ-相關的疾病）相關的症狀之發展的方法，其包含給予個體有效劑量之包含本文中所述的抗體、多胜肽、或多核苦酸之醫藥組合物。與阿耳滋海默氏症相關的症狀包含（但不限於）記憶、問題解答、語言、計算、視覺空間感覺、判斷、及行為異常。本發明也提供抑制或降低個體中澱粉狀蛋白斑形成及/ 或Αβ累積之方法，其包含給予個體有效劑量之包含本文中所述的抗體、多胜肽、或多核苷酸之醫藥組合物。於一 4匕 103827.doc -79- 1355389 實施例中’澱粉狀蛋白斑係於個體的腦中。於一些實施例中’殿粉狀蛋白斑係於個體的大腦血管中。於其他實施例中’ Αβ累積是在個體的循環系統中。本發明也提供降低個體中澱粉狀蛋白斑及/或降低或減慢Αβ累積之方法’其包含給予個體有效劑量之包含本文中所述的抗體、多胜肽、或多核苷酸之醫藥組合物。於一些實施例中’澱粉狀蛋白斑係於個體的腦中。於一些實施例中’殿粉狀蛋白斑係於個體的大腦血管中。於其他實施例中’ Αβ累積是在個體的循環系統中。本發明也提供移除或清除個體中澱粉狀蛋白斑及/或Αβ 累積之方法’其包含給予個體有效劑量之包含本文中所述的抗體、多胜肽、或多核苷酸之醫藥組合物。於一些實施例中’澱粉狀蛋白斑係於個體的腦中。於一些實施例中，澱粉狀蛋白斑係於個體的大腦血管中。於其他實施例中， Αβ累積是在個體的循環系統中。本發明也提供降低Αβ胜肽在組織中（如腦）、抑制及/或降低Αβ胜肽累積於組織中（如腦）、及抑制及/或降低Αβ胜肽於個體組織中（如腦）的毒性作用的方法，其包含給予個體有效劑量之包含本文中所述的抗體、多胜肽、或多核苷酸之醫藥組合物。Αβ多胜肽可為以可溶、寡聚合、或沉澱的形式。Αβ之寡聚合形式可由2-50個Αβ多胜肽組成，其可為全長1 -40及1 -42之胜肽的混合物及/或此等胜肽之任何截短的形式》本發明也提供改善知能或倒轉與個體中Αβ之澱粉狀蛋白 103827.do -80· /有關的疾病（如阿耳滋海默氏症）相關的知能衰退之方 'ά3'ό予個體有效劑量之包含本文中所述的抗體、多胜肽'或多核苷酸之醫藥組合物。 ::於*’時間點之單-直接注射或多個時間點至單或夕處可凡成本文中所述的方法（包括預防或治療）。給予也可為幾乎同時至多處。基於達到理想結果，隨治療過程可決定及調整給予之頻率。於一些情況中，本發明之抗體(匕括夕胜肽)、多核苷酸、及醫藥組合物之持續連續釋放配方可能為適11。用以達到持續釋放的不1§1配方及裝置為技藝中已知。病患、對象、或個體包括哺乳類，如人類、牛、馬、狗f田、豬、及轉羊動物。個體較佳為人類，及可或可不受疾㈣磨或目前顯現症狀。在阿耳錢默氏症的情況中，實際上每個人都有罹患阿耳滋海默氏症的危險，只要他或她活㈣久。所以’可將本方法預防性地給予一般大眾而不需任何砰估個體病患的風險。本方法有用於確實具有阿耳滋海默氏症已知遺傳風險的個體。此個體包括具有經歷此症的親戚、纟由分㈣傳或生物化學標記物決定有風險者。對於阿耳滋海默氏症風險之遺傳標記物包括在 APP基因中的突變，特別是在位置717及位置670及671的突變，分別稱為哈地（Hardy)及瑞典人（s wedish)突變（見 Hardy(1997)TrendS Ne⑽sci. 2〇:154·9)。其它風險標記物為在早老素基因（PS1及PS2)及ApoE4的突變、AD、高膽固醇A症或動脈硬化之家族史。目前患有阿耳滋海默氏症的 103827.doc 個體可由特殊癡呆以及上述風險因子的存在而辨識。此外可得到許多診斷測試來鑑定具有AD的個體。此等包括測量CSF tau及Αβ42量。升高的tau及降低的Αβ42量意味AD的存在。也可由阿耳滋海默氏症及相關疾病協會 (ADRDA, Alzheimer's Disease and Related Disorders Ass〇clatlon)標準診斷患有阿耳滋海默氏症的個體。在無症狀的病患中，治療可於任何年齡（如1〇、2〇、3〇歲）開始。然而，一般直到病患達到40、5〇、6〇或7〇歲才需要開始治療。藉著技藝中已知的不同方式可隨時間監測治療。在可月匕的豕古症患者的情況中，在產前藉由給予母親治療藥劑或出生後不久可開始治療。可用於上述方法中的醫藥組合物包括本文中所述的任何抗體夕胜肤、及/或多核苦酸。於一些實施例中，抗體為不於表3中的抗體9JL或其變體。於一些實施例中，抗體為專地、纟α合至Α β胜肽之抗體及包含具有受損的作用功能之固定區域。給予及劑量較佳將抗體於載體中給予至哺乳類；較佳的是醫藥上可接受的載體。適當的載體及其配方係說明於Remingt()n,s

Pharmaceutical Sciences，第 18版，A. Gennaro編著，Mack Publishing Co，Easton PA，1990 ;及 Remington, The Science and Practice of pharmacy 第 20 版，Mack

Publishing, 2000。典型而言，將適當量之醫藥上可接受的鹽用於配方中使得配方為等張性。載體之實例包括鹽水、 103827.doc 1355389 林袼氏液（Ringer’s solution)及葡萄輔 .v?龙 .衡甸糖，合液。溶液的pH較佳馮約5至約8，更佳為約7至約7 5。制 J )異匕載體包括持續釋放氣品如含有抗體之固體親油性聚合物之半渗透基質，此基質為以成某形狀物件，如膜、微脂粒或微顆粒之形式。對於熟悉本技藝者將知某政載體可能# _ 一料腥』牝马更佳，視例如給予途經及給予的抗體濃度而定。

藉由注射（如全身性、靜脈内、腹腔内、皮下、肌肉内、肝門内）、或藉由其它方法’如灌流，其確保其以有效形式傳遞至血流，可將抗體給予哺乳類。藉由分離的灌注技術，如分離的組織灌注，也可將抗體給予以發揮局部治療作用。靜脈内注射為較佳。給予抗體的有效劑量及時間表可由經驗決定，做此決定為本技藝的技術範圍内。熟悉本技藝者將知必須給予的抗體劑量將視例如接受抗體的哺乳類、給予的途徑、使用的抗體之特定種類及給予此哺乳類之其它藥物而定。選擇適當抗體劑量之指導可見於抗體之治療用途的文獻中，如 Handbook of Monoclonal Antibodies，Ferrone等人編著， Noges Publication，Park Ridge，N. J.，1985 第 22 章及 303-357 頁，Smith 等人，Antibodies in Human Diagnosis and

Therapy, Haber等人編著，Raven press，New York，1977, 3 65-3 89頁《單獨使用抗體之典型每曰劑量可能範圍為每天約1微克/公斤至高達100毫克/公斤體重或以上，視上述因素而定。一般而言，可使用下列任何劑量：給予劑量為至少約50毫克/公斤體重；至-少約1〇毫克/公斤體重；至少 103827.doc -83 - 1355389 約3毫克/公斤體重；至少約1毫克/公斤體重；至少約750微克/公斤體重；至少約500微克/公斤體重；至少約250微克/ 公斤體重；至少約100微克/公斤體重；至少約50微克/公斤體重；至少約10微克/公斤體重；至少約1微克/公斤體重，或以上。在開始治療時可將抗體以較低劑量或較少頻率給予以避免可能的副作用，如暫時腦澱粉狀蛋白血管病 (CAA, cerebral amyloid angiopathy) °

於一些實施例中，可存在多於一種抗體。此組合物可含有至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種不同本發明抗體（包括多胜肢）。也可將抗體與有效量之一或多種其它治療藥劑組合給予哺乳類。可將抗體與一或多種其它治療藥劑相繼或同時給予。抗體及治療藥劑的量視例如使用的藥物類型、治療的病理症狀、及給予的時間表及途徑，但一般比其獨立地使用較少量。

給予哺乳類抗體後，可以熟悉本技藝者已熟知的不同方式監測哺乳類的生理狀況。上述給予及劑量的原理可適用於本文中所述的多胜肽。也可使用編碼本文中所述的抗體或多胜肽之多核苦酸於傳遞及表現抗體或多胜肽於理想細胞中。當然可使用表現載體來主導抗體之表現。可將表現載體全身性、腹腔内、靜脈内、肌肉内、皮下、脊髓腔内、腦室内、口服、腸内、非經腸胃、鼻内、皮膚、或經由吸入給予。例如，表現載體之給予包括局部或全身給予，包括注射、口給 103827.doc 予、顆粒搶或導管給予、及局部給予。熟悉本技藝者熟知表現載體之給予以在活體内得到外生蛋白質之表現β見如美國專利第 6,436,908 ; 6,413,942 ;及 6,376,471 號。也可使用包含編碼本發明抗體之多核苷酸的治療組合物之目標傳遞。受體媒介的DNA傳遞技術係說明於例如 Findeis等人，Trends Biotechnol. (1993) 11:202; Chiou等人，Gene Therapeutics: Methods And Applications Of

Direct Gene Transfer (J.A. Wolff編著）（1994) ; Wu等人，】· Biol. Chem. (1988) 263:621 ; Wu等人，J. Biol. Chem. (1994) 269:542 ; Zenker 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)(1990) 87:3655 ; Wu等人，J. Biol. Chem. (1991) 266:338。將含有多核苷酸的治療組合物於基因療法步驟之局部給予中以約100 ng至約200毫克DNA之範圍給予。於基因療法步驟期間也可使用約500 ng至約50 mg、約1微克至約2毫克、約5微克至約500微克、及約20微克至約1 〇〇微克DNA之濃度範圍。利用基因傳遞媒介可傳遞本發明的治療多核苷酸及多胜肽。基因傳遞媒介可為病毒或非病毒來源（一般見 Jolly，Cancer Gene Therapy(1994) 1:51 ; Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845 ； Connelly,

Human Gene Therapy (1995) 1:185 ;及 Kaplitt，Nature Gneetics (1994)6:148)。利用内生的哺乳類或異源啟動子可引發此編碼序列之表現。編碼序列之表現可為持續性或受調控者。用以傳遞理想多核苷酸及在理想細胞中表現之以病毒為 103827.doc • 85- 1355389 基礎的載體為技藝中已熟知。例示以病毒為基礎的媒介包括（但不限於）重組反轉錄病毒（見如世界專利申請案第wo 90/07936 ； WO 94/03622 ； WO 93/25698 ； WO 93/25234 ； WO 93/1 1230 ; WO 93/10218 ; WO 91/02805號；美國專利第 5,219,740 ; 4,777，127號；德國專利地 2,200,651 號；及歐洲專利0 345 242)、（X病毒為基本的載體（如辛德比斯 /

(Sindbis)病毒載體、聖利基森林（Semliki Forest)病毒 (ATCC VR-67 ; ATCC VR-1247)、羅斯河（Ross River)病毒 (ATCC VR-373 ； ATCC VR-1246)及委内瑞拉馬腦炎 Venezuelan equine encephalitis)病毒（ATCC VR-923 ; ATCC VR-1250 ; ATCC VR 1249 ; ATCC VR-532))、及腺相關病毒（AAV, adeno-associated virus)載體（見如世界專利申請案第 WO 94/12649，WO 93/03769 ; WO 93/19191 ; WO 94/28938 ; WO 95/11984及 WO 95/00655號）》也可使用如說明於Curiel，Hum. Gene Ther. (1992) 3:147之DNA連接至殺死的腺病毒之給予。

也可使用非病毒傳遞媒介及方法，包括但不限於聚陽離子縮合的DNA連接或未連接至殺死的單獨腺病毒（見如 Curiel，Hum. Gene Ther. (1992) 3:147);酉己體連接的 DNA(見如 Wu，J. Biol. Chem. (1989) 264:16985);真核細胞傳遞媒介細胞（見如美國專利第5,814,482號；世界專利申請案第 WO 95/07994 ; WO 96/17072 ; WO 95/30763 ;及 WO 97/42338號）及核電荷中和或與細胞膜融合。也可使用裸DNA。例示裸DNA導入方法係說明於世界專利申請案第 103827.doc -86- (1) 1355389 WO 90/11092號及美國專利第5 58〇 859號中。可作用為基因傳遞媒介的微脂粒係說明於美國專利第5/22,120號；世界寻利申請案第 WO 95/13796 ; WO 94/23697 ; WO 91/14445號，及歐洲專利0 524 968中。其他方式係說明於 Philip，Mol. Cel】 Bi〇l_ (1994) 14:2411，及於 Woffendin， Proc· Natl· Acad· Sci. (1994) 91:1581 中。套组本發明也提供製造的物件及含有有用於治療本文中所述的病理症狀如阿耳滋海默氏症或其他Αβ_相關的疾病（如蒙古症、帕金森氏症、多發梗塞性痴呆症、輕度知能障礙、腦澱粉狀蛋白血管病、於蠱管中由Αβ胜肽沉澱物引起的血管疾病（如中風及HCHWA-D))，或偵測或純化Αβ或βΑρρ之物質的套組。製造的物件包含具有標籤的容器。適當的容器包括例如瓶子、小瓶、及試管。容器可由許多材質如玻璃或塑膠形成。谷器谷納具有活性藥劑之組合物，其有效於治療病理症狀或有效於偵測或純化Αβ或βΑρι^於組合物中的活性藥劑為抗體，較佳的是，包含對或有專一性的單株抗體。於一些實施例中，活性藥劑包含抗體 9TL或衍生自抗體9TL之任何抗體或多胜肽。於一些實施例中，活性藥劑包含具有受損的作用功能之抗抗體或多胜肽。於一些實施例中，抗-Αβ抗體或多胜肽包含重鏈固定區域，其中固定區域具有受損的作用功能。在容器上的標籤指出組合物係用於治療病理症狀如阿耳滋海默氏症或债測或純化Α β或β A Ρ Ρ ’及也可指出於活體内或市管内 103827.doc -87· 1355389 使用之用法說明，如上述者。本發明也提供包含本文中所述的任何抗體（如9tl)、多胜肽、多核苷酸之套組。於一些實施例中，本發明之套組包含上述的容器。於其他實施例中，本發明之套組包含上述的容器及包含緩衝劑的第二個容器。其可更包括由商業及使用者觀點喜歡的其它材料，包括其它緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針頭、針筒、及用以實施任何本文中說明的方法（如/0療阿耳滋海默氏症的方法，及用以抑制或降低 • Αβ胜肽於腦中的累積）之用法說明的包裝内頁。在用於偵測或純化Αβ或βΑΡΡ的套組中，通常將抗體用可偵測的標記物標記’如例如放射線同位素、螢光化合物、生物發光化合物、化學發光化合物、金屬螯合劑或酵素。於一些實施例中，本發明提供用於本文中所述的任何方法中之組合物（本文中所述），無論是作為藥劑使用及/或用於藥劑之製造的文中。提供下列實例以作為說明（但非限制）本發明。 ^ 實例實例1抗體9TL及其變體之結合親合力測定 Α. —般方法於此實例中使用下列一般方法。用於殖株鑑定的表現載體抗體Fab片段之表現是在IPTG可誘發的lacZ啟動子的控制下’類似於說明於 Barbas (2001 )Phage display: a laboratory manual, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring 103827.doc -88· 1355389

Harbor Haboratory Press pg 2.10。載體pc〇rnb3X)然而，修飾包括加入及表現下列其它區塊：人類κ輕鏈固定區塊及 IgG2a人類免疫球蛋白的CHI固定區塊，igy_2鏈c區域，蛋白質登錄號P01859;免疫球蛋白κ輕鏈（智人），蛋白質登錄號 CAA09181。小規模Fab製備

如下進行小規模表現Fab於96孔盤中。開始由用Fab資料庫轉化的大腸桿菌’將菌落挑至接種於主盤（洋菜膝LB +氨比西林（Ampicillin)(50微克/毫升）+2°/0葡萄糖）及工作盤（2 毫升/孔’ 96孔/盤含1.5毫升LB+氨比西林（5〇微克/毫升）+2%葡萄糖）兩者。將兩盤皆培養於小時。將主盤儲存於4 °C ’將取自工作盤的細胞以5〇〇〇 rpm沉殿及用1毫升LB +氨比西林（50微克/毫升）+i mM IPTG重新懸浮以誘發Fab表現。在30。〇及5小時表現時間後藉離心將細胞收集’而後重新懸浮於500微升HBS-P緩衝液（1〇 mM HEPES緩衝液 pH 7.4，150 mM NaCl，0.005% P20)。藉由冷凍（-80 C )而後於3 7°C解凍之一次循環達到hbS-P重新懸浮的細胞之分解。將細胞分解物以5000 rpm離心3〇分鐘以分離細胞殘骸與含Fab的上層清液。而後將上層清液注入 BIAcore電漿共振裝置以得到各Fab的親合力資訊。將表現

Fab的殖株自主盤救回以定序DNA及如下述為大規模Fab製造及詳細定性。大規模Fab製備為了得到詳細的動力學參數，自大的培養將Fab表現及 103827.doc • 89 - ⑧ 1355389 純化、將含有200毫升LB +氨比西林（50微克/毫升）+2%葡萄糖的錐形瓶用來自選擇的Fab表現的大腸桿菌殖株的5毫升隔夜培養液接種。將殖株於30°C培養直到達到〇〇550_為 1.0及而後由取代培養基成為200毫升LB +氨比西林（50微克 /毫升）+1 mM IPTG誘發。在30°C及5小時表現時間後藉離心將細胞沉澱，而後重新懸浮於10毫升PBS(pH 8)。藉由冷凍/解凍（分別於-80°C及37°C )之兩次循環達到細胞分解。將細胞分解物的上層清液裝入用PBS(pH 8)平衡的Ni-NTA 超流量填脂糖凝膠（superflow sepharose)(Qiagen, Valencia. CA)管柱，而後用5倍管柱體積的PBS(pH 8)清洗。各別Fab用PBS(pH 8)+300 mM Imidazol沖提於不同分液中。將含有Fab的分液集合及於PBS中透析，而後在親合力定性前用EILSA定量。完整抗趙製備為了表現完整抗體，將重及輕鏈可變區域選殖入哺乳類表現載體及利用陽離子脂質體（lipofectamine)轉染入HEK 293細胞做暫時表現。利用標準方法利用蛋白質a將抗體純化。載體pDb_9TL.hFc2a為包含9TL抗體重鏈之表現載體，及為適於做重鏈的暫時或穩定表現。載體pDb.9TL.hFc2a具有相對應於下列區域之核苷酸序列：鼠巨細胞病毒 (cytomegalovirus)啟動子區域（核苷酸κυ);合成的内含子（核苷酸619-1507) ; DHFR編碼區域（核：y：酸707-1267); 人類生長荷爾蒙信號胜肽（核苷酸1525-1602) ; 9TL的重鏈 103827.doc -90· 0' 1355389 可變區域（核苷酸1603-1951);含有卞列突變之人類種鏈 IgG2a固定區域：A330P331成為S330S331(胺基酸編號參照野生塑 IgG2a序列；見 Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624) ; SV40晚期聚腺苷酸化信號（P〇lyadenylation 81吕1131)(核苦酸2960-3203) ; SV40促進子區域（核音酸3204-3449);噬菌體fl區域（核苷酸3537-4992)及β内醯胺酶 (Lactamase)(AmpR)編碼區域（核苦酸 4429-5286)。載體 pDb.9TL.hFc2a係於2004年7月20日寄存於ATCC ’並被指定 ATCC 登錄號 PTA-6124。載體pEb.9TL.hK為包含9TL抗體輕鏈之表現載體，及為適於做輕鏈的暫時表現。載輝pEb.9TL.hK具有相對應於下列區域之核苷酸序列：鼠巨細胞病毒啟動子區域（核苷酸1 -612);人類EF-1内含子（核苷酸619-1142);人類生長荷爾蒙信號胜肽（核苷酸1173-1150);抗體9TL輕鏈可變區域（核苷酸1251-1593);人類κ鏈固定區域（核苷酸1594-1914); SV40晚期聚腺苷酸化信號（核苷酸1932-2175) ; SV40促進子區域（核苷酸2176-2421);噬菌體Π區域（核苷酸2509-2964)及β内醯胺酶（AmpR)編碼區域（核苷酸3401-4258)。載體pEb.9TL.hK係於2004年7月20曰寄存於ATCC，並被指定 ATCC 登錄號 PTA-6125。

Biacore分析法利用 BIAcore3000TM表面電渡共振（SPR，surface plasmon resonance)系統（BIAcore，INC, Piscaway NJ)決定 9TL單株抗體的親合力。決定親合力的一個方式為固定9TL於CM5 103827.doc -91 - 1355389

晶片上及測量胜肽對抗體的結合動力學。根據供應商的使用說明將CM5晶片用Ν-乙基-Ν·-(3-二甲基胺基丙基）-碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC, N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride)及 N-經基琥珀硫亞胺（NHS，N-hydroxysuccinimide)活化。將抗體 9TL或其變體稀釋入1〇 mM醋酸鈉pH 4.0或5.0及以0.005毫克/毫升之濃度注入活化的晶片上。利用可變的流動時間通過個別晶片通道，達到一定範圍之抗體密度：1000-2000 或 2000-3000 反應單元（RU，response units)。將晶片用乙酵胺阻斷。再生的研究顯示含2倍體積PIERCE沖提緩衝液及1倍體積4M NaCl之溶液有效地去除結合的Αβ^ο胜肽同時在超過200次注射後仍保持晶片上9TL活性。於所有 Biacore分析法中使用HBS-EP緩衝液（0.01Μ HEPES，pH 7.4，0.15 M NaCl，3 mM EDTA，0.005% 界面活性劑 P20)作為運轉緩衝液。將純化的合成胜肽樣品之連續稀釋 (O.l-ΙΟχ估計的KD)以100微升/分鐘注入1分鐘及允許10分鐘分解時間《利用BIA評估程式藉由套用數據至1: 1蘭格默爾（Langmuir)結合模型（Karlsson，R. Roos，H. Fagerstam， L. Petersson，B.(1994). Methods Enzymology 6. 99-110)同時得到動力學結合速率（Ιη)及分解速率（kw)。將平衡分解常數（KD)值計算為1„/]ίοη。或者，藉由固定Αβ^ο胜肽於SA晶片上及測量9TL Fab 及9TL變體的Fab對固定的Αβ^ο胜肽之結合動力學，決定親合力。9TL Fab片段及其變體Fab片段之親合力係由表 103827.doc -92· 1355389

面電漿共振（SPR， surface plasmon resonance)系統 (BIAcore3000TM，BIAcore，INC, Piscaway NJ)決定。根據供應商的使用說明使用SA晶片（鏈親合素）。將生物素化的 Αβ胜肽 1-40稀釋入HBS-EP(10 mM HEPES，pH 7.4, 150 mM NaCl，3 mM EDTA，0.005% P20)及 0.005 毫克 / 毫升之濃度注入活化的晶片上。利用可變的流動時間通過個別晶片通道，達到兩個範圍之抗原密度：10-200反應單元（RU， response units)用於詳細動力學研究及500-600 RU作為濃度研究及篩選。再生的研究顯示100 mM磷酸（也可接筆用含2倍體積50 mM NaOH及1倍體積70%乙醇）有效地去除結合的Fab同時在超過200次注射後仍保持晶片上Αβ胜肽活性。於所有BIAcore分析法中使用HBS-EP緩衝液作為運轉緩衝液。將純化的Fab樣品之連續稀釋（0.1-lOx估計的KD) 以100微升/分鐘注入2分鐘及允許10分鐘分解時間。Fab蛋白質的濃度係由ELISA及/或SDS-PAGE電泳利用已知濃度 (由胺基酸分析決定）之標準Fab而決定。利用BIA評估程式藉由套用數據至1: 1蘭格默爾結合模型（Karlsson，R. Roos， H. Fagerstam, L. Petersson, B.(1994). Methods Enzymology 6. 99-110)同時得到動力學結合速率（kQn)及分解速率 (koff)。將平衡分解常數（KD)值計算為koff/kw。 B.抗體9TL及其變體對Ah，之結合親合力將抗體9TL的重鏈及輕鏈可變區域之胺基酸序列適於圖1 中。將利用上述兩個Biacore方法決定的抗體9TL對Αβ!-*。之結合親合力示於下表2中。 103827.doc -93- ⑧’ 1355389 表2 .抗體9TL及Fab片段之結合親合力 k〇„(l/Ms) k〇ff(l/s) KD( nM) 9TLmAb於CM5晶片上， Αβυο流動到其上 4.25 X 105 3.89 X 10'4 0.9 Αβ^ο於SA晶片上，9TL Fab流動到其上 3.18 X 105 3.59 X ΙΟ"4 1.13 將9TL變體之胺基酸序列示於下表3中。示於表3中的變體之所有胺基酸置換係相對於9TL的序列說明。9TL變體的Fab片段之結合親合力也示於表3中。KD及其他動力學參數係由上述BIAcore分析用固定於SA晶片上而決定。表3.抗體9TL變體之胺基酸序列及動力學數據殖株 HI ⑴ H2 H3 LI L2 L3 MMs'1) (2) kofKs'1) KD( nM ) (3) 9TL 3.18 x 105 3.59 x 10'4 1.13 22-T/I LI 021 3.18 x 105 4.60 x 10'4 1.45 C6 new L102T 3.56 x 105 9.20 x 10_4 2.58 W1 Y31A, A34S L102T 3.18 x 105 9.00 x 1 O'3 28.30 W8 Y31H, A34S, K35A L102T 3.18 x 105 3.80 x 10'3 11.95 W5 Y31H, K35A L102T 3.18 x 105 4.00 x 10° 12.58 Ml L94M 3.18 x 105 8.60 x 10'4 2.70 M2 L94N 3.18 x 105 1.10 x 10·3 3.46 M3 L94C 3.18 x 105 1.30 x 10'3 4.09 103827.doc -94- ⑧ 1355389 Μ4 - L94F 3.18 x 105 9.95x1 O'4 3.13 Μ5 L94V 3.18 x 105 1.65 x 10° 5.19 Μ6 L94K 3.18 x 105 4.10 x 10'3 12.89 Μ7 L94S 3.18 x 105 6.00 x 1 O'3 18.87 Μ8 L94Q 3.18 xlO5 6.80 x 10·3 21.38 Μ9 L94G 3.18 xlO5 7.80x1 O'3 24.53 Μ10 L94S 3.18 xlO5 8.30 x 1(T3 26.10 Mil G96S 3.18 x 105 2.00 x ΙΟ'3 6.29 M12 G96T 3.18x 105 3.30 x 10'3 10.38 M13 T97S 3.18 x 105 3.90 x 10'4 1.23 M14 H98L 3.18 x 105 1.60 x 1 O'3 5.03 M15 Y99P 3.18x 105 6.70 x 1 O'4 2.11 M16 Y99A 3.18 x 105 7.00 x 10_4 2.20 M17 Y99W 3.18 x 105 1.00 x nr3 3.14 M18 Y99Q 3.18 x 105 1.50 x ΙΟ'3 4.72 M19 Y99M 3.18 x 105 1.70 x 10'3 5.35 M20 Y99S 3.18x 105 2.00 x 10_3 6.29 M21 Y99E 3.18 x 105 5.00 x 10'3 15.72 M22 V101L 3.18 x 105 4.00 x ΙΟ'3 12.58 M23 V101K 3.18x 105 5.00 x ΙΟ'3 15.72 M24 V101H 3.18 x 105 6.00 x ΙΟ'3 18.87 M25 V101T 3.18x 105 8.00 x 1 O'3 25.16 M26 V101A 3.18 x 105 9.00 xlO'3 28.30 M27 V101E 3.18x 10s 1.20 x 1 O'2 37.74 M28 V101M 3.18 x 105 1.40 x 1 O'2 44.03 103827.doc -95- Φ 1355389

M29 L102S 3.18 x 105 7.60 x lO·4 2.39 M30 LI 02 V 3.18 x 105 6.80 x ΙΟ"4 2.14 M31 L99V 3.18 x 105 1.00 x 1 O'2 31.45 M32 L99I 3.18 x 105 2.00 x 1 O'2 62.89 M33 Y100W • 3.18 xlO5 6.30 x 10*4 1.98 M34 S101T 3.18 x 105 8.00 x 10'4 2.52 M35 S101G 3.18 xlO5 9.00 x 1 O'3 28.30 M36 L102R 3.18 x 105 9.00 x 1 O'4 2.83 M37 L102A 3.18 x 105 9.20 xlO'4 2.89 M38 LI 02 V 3.18 x 105 1.50 x 10° 4.72 M39 L102S 3.18 x 105 2.30 x 10'3 7.23 M40 L102T 3.18 x 105 4.50 xlO'3 14.15 M41 L102Q 3.18 x 105 1.00 x i〇·2 31.45 M42 L102E 3.18 x 105 1.50 x 1 O'2 47.17 M43 VI041 3.18 x 105 3.00 x 10'4 0.94 M44 V104T 3.18 x 105 3.00 x 1 O'3 9.43 M45 V104P 3.18 x 105 1.50 x 10'2 47.17 M46 V104C 3.18 x 105 2.00 x 10-2 62.89 M47 V104Q 3.18 x 105 2.00 x ΙΟ'2 62.89 M48 V104S 3.18 x 105 2.60 x 10'2 81.76 M49 V104N 3.18 x 105 2.60 x 10·2 81.76 M50 V104F 3.18 x 105 2.70 x 1 O'2 84.91 M51 Y105H 3.18 x 105 8.60 x 10'4 2.70 M52 Y105F 3.18 x10s 1.30 x 10'3 4.09 M53 Y105W 3.18 x 105 1.30 x 10'3 4.09 103827.doc -96- 1355389 Μ54 Y105S 3.18 x10s 2.40 χ 10'3 7.55 Μ55 Υ105Ι 3.18 xlO5 3.00 χ 1〇*3 9.43 Μ56 Y105V 3.18 x10s 3.50 χ 10'3 11.01 Μ57 Υ105Α 3.18 xlO5 3.90 χ ΙΟ'3 12.26 1 =所有CDR為包括卡巴及裘蒂艾CDR兩者之延伸的CDR。將胺基酸殘基依序編號。 2 =下標線的kon係由實驗決定。其它的為估計與9TL同。 3=將 KD值計算為 Kc^keff/kon。實例2 :於胜肽上抗體9TL結合的抗原決定區之定性為了決定Αβ多胜肽上被抗體9TL辨識的抗原決定區，使用表面電漿共振（SPR，surface plasmon resonance, BIAcore 3000)結合分析。將偶合至生物素的多胜肽（Global Peptide Services，CO)固定於鏈親合素塗佈的晶片（SA晶片）上。Αβ抗體Fab片段（以50 nM)對固定的Αβ^ο之結合在Αβ 胜月太之不同可溶性片段（以10 μΜ，來自American Peptide Company Inc·，CA)存在或不存在下。將Αβ卜40、Αβυ；?、及 Αβ 之胺基酸序列示於下表4中。取代抗體9TL Fab片段對Αβ^ο之結合的Αβ胜肽分別為Αβ28_40、Αβ,.”、Αβ33.40、及Αβ17.4〇(圖因此，抗體9TL結合至Αβ^。的C端胜肽 (33-40)。如圖 2 中所不，Αβι_28、Αβ28·42、Αβ22-35、Αβι· 16、Apus、及Αβ,-38胜肽不抑制抗體9TL Fab片段的結合，暗示抗體9TL結合至Αβ^ο胜肽的C端。此外’ A 028-42及Α β丨-43胜肤不抑制抗體9TL至Αβ卜40的結合，雖然其可立即抑制結合至控制組抗體（抗體 103827.doc -97- 1355389 2289，此抗體係說明於美國專利申請案第2004/01465 12及世界專利WO 04/032868)，其結合至Αβ^ο的16-28。此等結果顯示抗體9TL較優先結合至Αβ!.^，但不結合至及。表4.β澱粉狀蛋白胜肽之胺基酸序列 1-40 (WT) DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL MVGGVV (SEQ ID NO: 15) 1-42(WT) DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL MVGGVVIA (SEQ ID NO: 16) 1-43 (WT) DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL MVGGVVIAT (SEQ ID NO: 17) 實例3.單株抗體2Η6及去醣化2Η6之產生 Α.單株抗體2Η6之產生及定性以約16週連續間隔用25-100微克連結至KLH的胜肽（Αβ^ο 的胺基酸28-40)於佐劑中將小鼠接種（每腳掌50微升，每隻共 100 微升），如 Geerligs HJ 等人，1989，J. Immunol. Methods 124:95-102 ; Kenney JS 等人，1989 * J. Immunol. Methods 121:157-166 ;及 Wicher K等人，1989，Int. Arch. Allergy Appl_ Immunol. 89:128-135 中所述。首先將小鼠用 50微克胜肽於完全弗氏佐劑（CFA, complete Freud's adjuvant)中接種。21天後，將小鼠用25微克胜肽於不完全弗氏佐劑（IFA, incomplete Freud’s adjuvant)中第二次接種。第二次接種後23天，用25微克胜肽於IFA中進行第三次接種。10天後，利用ELISA測試抗體力價（titer)。第三次接種後34天，用25微克胜肽於IFA中進行第四次接種。 103827.doc •98· 第四次接種後32天’用100微克可溶性胜肽進行最後追加。自接種的小鼠取得脾細胞及以10 : 1之比例用聚乙二醇 1500和NSO骨髓癌細胞融合。將融合細胞植入含20%馬血清及2-草醋酸（oxaloacetate)/丙酮酸/胰島素（Sigma)之 DMEM中的96孔盤内.，及開始次黃嘌呤（hypoxanthine)/胺甲蝶吟（aminopterin)/胸腺喷咬核苷（thymidine)選擇。在第 8天，將1〇〇微升含有20%馬血清的DMEM佳至所有孔中。藉由利用抗體捕獲免疫分析法篩選融合細胞的上層清液。用類別專一的二級抗體完成抗體類別的決定。選擇一組製造單株抗體的細胞株做定性。選擇的一個細胞株產生記為2H6之抗體。抗體被測定為具有IgG2b重鏈。決定抗體2H6對Αβ!-^的親合力。利用蛋白質a親合力層析法將單株抗體2H6自融合瘤培養之上層清液純化。將上層清液平衡至PH 8 °而後將上層清液裝載至用PBS平衡至 pH 8 的蛋白質 A 管柱 MabSelect(Amersham Biosciences # 17-5199-02)。將管柱用5倍管柱體積pBS(pH 8)清洗。將抗體用50 mM檸檬酸-磷酸緩衝液（pH 3)沖提。將沖提出的抗體用1M磷酸緩衝液（PH 8)中和。將純化的抗體用PBS透析《利用鼠科mAb標準曲線藉SDS-PAGE決定抗體濃度。藉由利用免疫純（丨11111^1：1〇?1^6)?&13套組（口丨61>〇6# 44885)之木瓜酵素蛋白質水解2H6完整抗體及遵照製造商的使用說明藉流經蛋白質A層析法純化而製備2H6 Fab »藉SDS-PAGE及利用1〇D = 0·6毫克/毫升之A280決定濃度。 103827.doc -99- 利用 BIAcore3000TM—表—面電聚共振（SPR，surface plasmon resonance)系統（BIAcore，INC, Piscaway NJ)決定 2H6單株抗體的親合力。決定親合力的一個方式為固定2H6抗體於 CM5晶片上及測量Αβ^ο胜肽對抗體的結合動力學。根據供應商的使用說明將CM5晶片用Ν-乙基-Ν'-(3-二曱基胺基丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC, N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride)及 N-經基號拍硫亞胺（NHS，N-hydroxysuccinimide)活化。將2H6 單株抗體稀釋入10 mM醋酸鈉pH 4.0或5.0及以0.005毫克/ 毫升之濃度泛入活化的晶片上。利用可變的流動時間通過個別晶片通道，達到一定範圍之抗體密度：1000-2000或 2000-3000反應單元（RU，response units)。將晶片用乙醇胺阻斷。再生的研究顯示Pierce沖提緩衝液（產品編號21004, Pierce Biotechnology, Rockford, IL)及 4M NaCl(2 : 1)之混合物有效地去除結合的APi，胜肽同時在超過200次注射後仍保持晶片上2H6抗體之活性。於所有Biacore分析法中使用 HBS-EP 缓衝液（0.01M HEPES，pH 7.4，0.15 M NaCl, 3 mM EDTA，0.005%界面活性劑P20)作為運轉缓衝液。將純化的Αβι.4〇合成胜肤樣品之連續稀釋（〇· 1_ 1〇Χ估計的Kd)以 100微升/分鐘注入1分鐘及允許10分鐘分解時間。利用BIA 評估程式藉由套用數據至1 : 1籣格默爾結合模型 (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B.(1994). ]\461:11〇(15£1127111〇1〇笆7 6.99-110)同時得到動力學結合速率 d)及分解速率（kw)。將平衡分解常數（KD)值計算為 103827.doc •100· 1355389 k0ff/k0n。

或者，藉由固定Αβ,-40胜肽於SA晶片上及測量2H6 Fab 對固定的Αβ^ο胜肽之結合動力學，決定親合力。2H6 Fab 片段之親合力係由表面電漿共振（SPR，surface plasmon resonance)系統（BIAcore3000TM，BIAcore，INC, Piscaway NJ)決定。根據供應商的使用說明使用SA晶片（鏈親合素）。將生物素化的Αβ胜肽1-40(SEQ ID NO:15)稀釋入 HBS-EP(10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA，0.005% P20)及以0.005毫克/毫升之濃度注入活化的晶片上。利用可變的流動時間通過個別晶片通道，達到兩個範圍之抗原密度：10-200反應單元（RU，response units) 用於詳細動力學研究及500-600 RU作為濃度研究。再生的研究顯示Pierce沖提緩衝液及4M NaCl(2: 1)之混合物有效地去除結合的Fab同時在超過200次注射後仍保持晶片上Αβ 胜肽活性。於所有Biacore分析法中使用HBS-EP緩衝液作為運轉緩衝液。將純化的Fab樣品之連續稀釋（0.1-lOx估計的KD)以100微升/分鐘注入2分鐘及允許10分鐘分解時間。 Fab蛋白質的濃度係由ELISA及/或SDS-PAGE電泳利用已知濃度（由胺基酸分析決定）之標準Fab而決定。利用BIA評估程式藉由套用數據至1 : 1蘭格默爾結合模型（Karlsson，R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B.(1994). Methods Enzymology 6. 99-110)同時得到動力學結合速率（k〇n)及分解速率（kQff)。將平衡分解常數（KD)值計算為k^f/k^。將利用上述兩種方法決定的2H6抗體親合力示於下表5中。 103827.doc -101 - ®； 1355389 將結合至Αβ^ο的胺基酸28-40之胜肽的抗體2286如上述測試。抗體2286係說明於美國專利申請案第10/683,815號及 PCT/US03/32080 t。表5.抗體2H6及2286之結合親合力 k〇„(l/Ms) k〇ff(l/s) KD( nM) 2Η6 mAb於CM5晶片上，Αβ!.4G流動到其上 4.67 X 105 3.9 χ10'3 9 Αβυο於SA晶片上，2Η6 F ab流動到其上 6.3 X 105 3.0 χ10_3 4.7 2286 mAb 於 CM5 晶片上，流動到其上 1.56 X 105 0.0419 269 Αβι.4〇於SA晶片上， 22 8 6 Fab流動到其上 1.8 X 105 0.044 245 為了決定Αβ多胜肽上被抗體2H6辨識的抗原決定區，使用表面電聚共振（SPR，surface plasmon resonance, BIAcore 3000)結合分析《將偶合至生物素的Αβ^。多胜肽（SEQ ID NO:15)(Global Peptide Services，CO)固定於鏈親合素塗佈的晶片（SA晶片）上。Αβ抗體（以100 nM)對固定的Αβ丨.40之結合在Αβ胜肽之不同可溶性片段（以16 μΜ，來自American

Peptide Company Inc.，CA)存在或不存在下。取代抗體2H6 對Αβ丨-40之結合的Αβ胜肽分別為Αβ17_4〇、Αβ33_4()、及Αβ丨.40 (圖3)。因此’抗體2Η6結合至ΑβΜο的C端胜肽（33-40)。然而，在測試的濃度下Αβ!·4。的C端胜肽（33-40)不取代抗體 2286對Αβ!，之結合。如圖3中所示，胜肽不抑制抗體2H6或抗體2286對的結合，暗示類似於抗體2286， 103827.doc -102- ㊣ 1355389 抗體2H6結合的抗原決定區包括八行^❹胜·肽的_胺基酸μ及-, 或40(圖3)。此外’ Αβ!·42及Αβι·43胜妝不抑制抗體2H6至Αβ^ο的結合，雖然其可立即抑制結合至控制組抗體（抗體 2289 ’此抗體係說明於美國專利申請案第1〇/683 8 15及 PCT/US03/32080)，其結合至ApN40 的 16-28(圖 3)。此等結果顯示抗體2H6較優先結合至，但不結合至Αβ142及 Αβΐ-43。

為了進一步評估抗體2Η6結合的β-澱粉狀蛋白胜肽之分離胺基酸殘基的關聯’藉由定點突變法產生不同變體’其中將最後6個胺基酸（Αβ^^胺基酸殘基35-40)各用丙胺酸個別取代（丙胺酸掃描突變法）^將此等Αβ,^ο變體（序列示於表6中）表現於大腸桿菌中成為麩胱苷肽-S-轉移酶 (GST，Glutathione-S-Transferase)融合蛋白質（Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ USA)隨後於麵胱苦肽-瓊脂醣珠（Sigma-Aldrich Corp.，St_ Louis，MO, USA)上親合力純化。作為控制組，將野生型（WT, Wild-typeMP^o 以及Αβ丨-4丨、Αβ丨-42、及Αβυί»也表現為GST融合蛋白質。而後將 Αβ 丨.40、Αβι_41、Αβ 1-42、Αβι_39以及六個不同變體 (示於表 6 中的 M35A(l-40)、V36A(l-40)、G37A(l-40)、 G38A(l-40)、V39A(l-40)、或 V40A(l-40))固定（每孔 100 微升之0.025微克/微升GST-胜肽）於ELISA分析盤上及用mAb 2286、2289、及2H6任一者以自0.3 nM往下連續稀釋培養 (將利用0.3 nM mAb之數據示於圖4中）。在1〇次連續清洗 103827.doc •103- © 1355389 後，…將=分析盤用每孔100微升之0.03微克/毫升生物素連結的羊-抗-小鼠（H+L)抗體（\^(^〇1>1^1)〇犷&1〇1^8，乂6(^〇1>#8八-9200，Burllingame CA，USA)培養，隨後每孔100微升之 0.025微克/毫升HRP-連結的鏈親合素（Amersham Biosciences Corp.，#RPN4401V，NJ，USA)。於 450 nm 讀取盤的吸收度。表6. β-澱粉狀蛋白胜肽及變體之胺基酸序列

1-40 (WT) DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL MVGGVV (SEQ ID NO: 15) 1-42(WT) DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL MVGGVVIA (SEQ ID NO: 16) 1-43 (WT) DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL MVGGVVIAT (SEQ ID NO: 17) 1-41 (WT) DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL MVGGVVI (SEQ ID NO: 18) 1-39(WT) DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL MVGGV (SEQ ID NO: 19) M35A(1- 40) DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL AVGGVV (SEQ ID NO: 20) V36A(1- 40) DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL MAGGVV (SEQ ID NO: 21) G37A(1- 40) DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL MVAGVV (SEQ ID NO: 22) G38A(1- 40) DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL MVGAVV (SEQ ID NO: 23) V39A(1- 40) DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL MVGGAV (SEQ ID NO: 24) V40A(1- 40) DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL MVGGVA (SEQ ID NO: 25) 如圖4中所示，針對Αβ的16至28胺基酸的Mab 2289以相 103827.doc -104· ⑧， 1355389

同強度辨識所有變體及作為盤上蛋白質濃度及蛋白質完整性的内部正控制組。抗體2H6不辨識、Αβ!_39、或 Αβ丨.42，如圖 4 中所示。Αβυο變體 V40A、V39A、G38A、 G37A、V36A、及Μ35Α顯示對抗體2Η6降低的結合，證實抗體2Η6抗原決定區延伸於端的至少6個胺基酸。V 及G突變至A為非常保守，不可能產生蛋白質重大的形態改變，所以，此等突變對抗體2H6結合之大影響可能是由於抗體區別Αβ内容中上述胺基酸之間的能力，此等資料顯示此抗體之非常高度專一性。

為了決定是否2Η6及9TL競爭對Αβ!-"之結合，利用 Biacore分析法進行競爭實驗。將抗體2Η6、9TL及2289固定於CM5晶片的不同通道上。根據供應商的使用說明將 CΜ5晶片通道用N-乙基-Ν^-(3-二甲基胺基丙基）-碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC, N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride)及 N-經基號 ίέ 硫亞胺（NHS, N-hydroxysuccinimide)活化。將抗體2H6、9TL及 2289稀釋入 10 mM醋酸鈉pH 4.0及以0.005毫克/毫升之濃度注入活化的晶片上。抗體密度為2H6有1625反應單元（RU, response units) ; 9TL 為 4000 RU ;及 2289 為 2200 RU。將各通道用乙醇胺阻斷。將Αβ!,胜肽（15 0 uM)流至晶片上2分鐘。而後將抗體2H6(欲測試結合競爭者）以0.6 uM至晶片上1分鐘。於所有Biacore分析法中使用HBS-EP緩衝液（0.01 Μ HEPES, pH 7.4, 0.15 M NaCl，3 mM EDTA, 0.005%界面活性劑P20)作為運轉缓衝液。在測量Αβ的結合後，藉由 103827.doc -105 - 用 Pierce沖提緩衝液（產品編號 21004，Pierce Biotechnology, Rockford, IL)及4M NaCl(2 : 1)之混合物清洗6秒2次再生晶片的所有通道。而後對抗體9TL進行競爭結合，及而後抗體2289。觀察到9TL及2H6對結合之競爭，但未觀察到9TL及2289之間或2Η6及2289之間的競爭。觀察固定的抗體及流至晶片上相同的抗體之間的競爭作為正控制組。 Β·抗體2Η6不結合至ΑΡΡ 為了決定2Η6是否結合至澱粉狀蛋白前驅蛋白質（ΑΡΡ， amyloid precursor protein)決定2Η6對用野生型ΑΡΡ轉染的細胞之結合。將293細胞用編碼野生型人類澱粉狀蛋白前驅蛋白質的cDNA轉染。轉染後48小時，將細胞於冰上與單株抗體抗-Αβ^^、抗-Αβ16·28、或2H6(5微克/毫升於具有 10% FCS的DMEM)培養45分鐘。而後將細胞於PBS中5分鐘清洗3次，用4% PFA固定。將細胞再次於PBS中清洗3 次，用來自Jackson Immunoresearch之二級Cy3-結合的羊抗-小鼠抗體（1 : 500稀釋）在螢光顯微鏡下偵測抗體結合。辨認Αβ中的N端或中間抗原決定區的抗-ΑβΝ16及抗-Αβ16_28抗體皆對表現於細胞上的ΑΡΡ前驅蛋白質顯示顯著結合。相反地’ 2Η6不結合至ΑΡΡ表現細胞。 C.去醣化抗體2Η6之產生為了產生去醣化抗體2Η6，將純化的抗體2Η6與胜肽-Ν-糖苷酶F(Prozyme，每毫克抗體0.05U)於20 mM Tris-HCl pH 8.0在37°C培養7天。由MALDI-TOF-MS及蛋白質膠體電泳證實完全去醣化。將去醣化的抗體用蛋白質A層析法 103827.doc -106- 1355389 純化及將内毒素藉Q-瓊脂糖凝膠去除。利用上述Biacor6分析法測試去醣化的2H6對的結合親合力，及發現2H6 對的結合親合力相同於完整抗體2Η6。實例4·於阿耳滋海默氏症的動物模型中藉給予去醣化的 2Η6逆轉知能衰退$组織學的症狀且具有較少微出血 Α.實驗步驟衣:邀之銓浐.·使用過度表現「瑞典人」突變澱粉狀蛋白前驅蛋白質（具有Κ670Ν/Μ671之APP Tg2576 ; Hsiao等人，Science 274:99-102(1996))的基因轉殖小鼠於此實驗。存在於此等小鼠中的類似阿耳滋海默氏症表現型已被詳細了解。Holcomb 等人 ’ Nat. Med_ 4:97-100(1998); Holcomb 等人，Behav. Gen. 29:177-185(1999);及 McGowan E，Neurobiol. Dis· 6:231-244(2999)。為了 16週處理研究，將APP-基因轉殖的小鼠（2〇週大）分成四群。第一群每週腹膜内接受抗-Αβ抗體2H6(小鼠單株抗-人類Ap284〇 IgG2b，如實例3中所述）注射16週期間（n=4)e第二群每週腹膜内接受去醣化抗-Αβ抗體2H6(如實例3中所述製造）注射16週期間（n=5)。第三群每週腹臈内接受抗·AMN抗體 2H6(2906 ;小鼠單株抗·果蠅遺忘症蛋白質IgG1)注射16週期間（n=6)。同窩出生非基因轉殖鼠用抗_AMN抗體（n=4)或 2H6(n=2)處理 16 週。疗4分#.·抗體處理16週後，使來自研究的小鼠經過兩天放射狀水迷宮模式，如前所述》wilcock等人，J Neuroinflammation 1:24(2〇〇4)。裝置為如前述之 6 桿迷 103827.doc •107· 1355389 宮。G〇id〇n等人，Neurobi〇1 览一茶 yc κ ^ ^ g g 22:377-385(2001)。在第天，15次忒驗以5次一組分三在連續對各組做測試(即4隻小氣各做進订。使-群4隻小鼠的小鼠做第二次測試等卜在仏./―次測試’而後相同 - jt- & _人測試的組合後，使第二群】鼠進订，在小乳接受第_ 自睥Η 組5次測試前允許延長的休心間。對於一群中的各鼠 .„ , 琛杯為不同，以使氣味線索減至取小。各試驗的起始桿為，、 .θ . ^ ^ μμ J 而對一特定個體目標知在兩天皆保持固;^對於前u次試及而後隱藏（最後4次試驗隱藏）。父〆 -天-模-樣的方式進行，除二第二天，使小鼠以和第，、了 + α於所有試驗中皆為隱藏。於一分鐘範圍中測量失數目（進入不正確桿）。將20 秒中無法做桿選擇的小鼠記為-次失誤，但於此研究中盈小鼠必須以此方式記為失誤。由於於此研究中小鼠的數目’測試者不知道^的處理族群身分。因為在放射狀水迷宮測試中評估的内容為^量，非評估性，將測試者的偏見之可能性降低。為了使個別試驗變化性的影響減至最小，每天將各小鼠3次連續試驗的失誤平均產生5個數據點將其利用 StatVlew(SAS Institute lnc” 叫藉 AN〇VA統計分析。愈硪學分# :在犧牲之日，將小鼠秤重，過量給予ι〇〇毫克 / 公斤寧必妥（Nembutal)(Abbott laboratories，North Chicago, IL)，及而後用25毫升〇·9%氯化鈉心臟内灌注。快速地取出腦，將腦的左半部浸沒固定24小時於新鮮製備的 4%二聚甲路[Paraformaldehyde]於 100 mM ΚΡ〇4(ρη 7.2) 103827.doc 1355389 做組織病理學。而後將半腦依序培養於1〇%、20%友蔬糖24小時做冰凍保護。利用滑走切片機收集25微米厚的水平切片並於具有疊氮化鈉的Dulbecc〇，s磷酸緩衝的鹽水 (pH 7.2)中4°C儲存以避免微生物生長β將一系列8個等間

隔600微米之組織切片隨機選擇遍及整個腦部及利用自由漂淨免疫組織化學對總Αβ(兔多株抗_Αβ ; Biosource， Camarillo，CA，1:1〇,〇〇〇)染色，如先前所述。G〇rd〇n 等人，EXp. Neurol. 173:183-195(2002) ; Wilcock等人，J·

Neurosci. 24:6144-6151(2004)。將第二個系列之間隔 6〇〇微米之組織切片利用0.2〇/〇剛果紅於Naa飽和的8〇%乙醇染色。也同樣裝設另一組切片及利用2%亞鐵氰化鉀於2%鹽酸染色血鐵質（Hem〇Siderin)15分鐘，而後於1%中性紅溶液 ίο刀I里做對比染色。利用Image_Pr〇

Cybernetics，SiWer Spring’ MD)進行剛果紅染色及免疫組織化學的定量以分析由正染色佔據的面積百分比。分析刖葉皮質的一個區域及海馬迴的三個區域（以確保在海馬迴質中無區域的偏差）。進行剛果紅的起始分析以產生總值。在手動地編輯出所有實質澱粉狀蛋白沉澱後進行第二個分析而產生限制於血管剛果紅染色的面積百分比。為了估計剛果紅的實質面積，將血管澱粉狀蛋白值自總百分比減去。對g鐵質染色，在所有切片上計算f魯士藍:性位置的數目及計算每個切片的平均位置數目。以低倍率於切片上觀察到動物間性質上的差異。檢視八個等間二刀片並決定陽性數目及平均成每個切片的值。^ 了評估可能的 103827.doc 1355389 處理相關的差異，將各處理族群的值用單向ANOVA分析，接著用Fishery LSD中數比較。利用EILSA測量胜肽血清濃度·.辂氮I 一夂給予氟觀後一天收集的血清稀釋及培養於96孔微量滴定盤中 (MaxiSorp ; Nunc，Rosklide，Denmark)，將其用 5微克/毫升於PBS緩衝液（PH 7.4)之抗體6E10(抗-β澱粉狀蛋白抗體，其結合至Αβ!•丨7 ; Signet，Dedham，ΜΑ)預先塗佈。二級抗體為以1 : 5000稀釋之生物素化的4G8(抗-β澱粉狀蛋白抗體’其結合至Αβ17·24 ; Signet)。利用鏈親合素-辣根過氧化物酶連結體（Amersham Biosciences)，接著TMB受質 (KPL，Gaithersburg, MD)進行偵測。使用 6-400 pM範圍之 APwJAmerican Peptide)作為標準曲線。 B.結果藉給予去醣化的抗體逆轉知能衰退：散殆氣4兔言儀氧偵測基因轉殖小鼠模型中之空間學習與記憶衰退。G〇rd〇n 等人 ’ Neurobiol. Aging. 22:377-385(2001) ; Morgan 等人 ’ Nature 408:982-985(2000)。將用抗體 2H6、去醣化 2H6、或抗- AMN處理16週的動物於放射狀水迷宮之兩天版中測試空間行進學習。將未基因轉殖的正常小鼠（包括用 2H6抗體處理的兩隻小鼠及用抗_AMN抗體處理的4隻小鼠，將此兩個族群合併，因為未觀察到行為差異）也於放射狀扒迷呂之兩天版中測试。如圖5中所示，用控制組抗體（抗-AMN)處理的App_基因轉殖小鼠在兩天測試中無法學習平台位置且相較於未基因轉殖的小鼠顯著能力較差， 103827.doc •110· 1355389 先月〗所述。Wilcock 等人，j Neur〇inf丨ammati〇n 1.24(2004)。，然而’給予抗·Αρ抗體2H6及去_化⑽的土因轉殖小鼠顯現顯者逆轉在控制組處理的Αρρ·基因轉殖小鼠中觀察到的損傷，以每次試驗接近i次失誤之平均表現結束第二天（圖5)。控制組處理的App_*因轉殖小鼠在第二天結束時具有每次試驗接近3次失誤之平均表現（圖5)。示於圖5中的數據指出去醣化的抗體作用如同完整抗體可逆轉在APP_基因轉殖小鼠中的知能衰退。減少Αβ沉澱而無增加微出血·•如下表7所示，相較於控制組抗體處理的族群（抗_ΑΜΝ)，用抗體2Η6(約56%降低， ρ=ο.οοοι)及去醣化2Η6(約58%降低，ρ<〇〇〇〇1)免疫治療16 週後於海馬迴中的總Αβ免疫染色顯著降低。如下表8中所示，相較於控制組抗體處理的族群（抗_ΑΜΝ)，用抗體 2Η6(約50%降低，pco.oooi)及去醣化2η6(約51%降低， ρ<0.0001)免疫治療16週後於前葉皮質中的總Αβ免疫染色顯著降低。表7 ·抗體處理1 6週後海馬迴的總Α β量。顯示由對Α β正免疫組織化學染色佔據的平均百分比面積、及海馬迴的標準偏差及平均數的標準誤差。給予的抗體被分析的動物數目平均數標準偏差 --— 標準誤差抗-ΑΜΝ 6 27.127 4.602 一 — 1.879 2Η6 4 12.011 5.057 --—— 2.529 去醣化的2Η6 5 11.344 4.765 ------—. 2.131 103827.doc -111 - 1355389 表8.抗體處理16週後前葉皮質的總Αβ量。顯示由對Αβ正免疫組織化學染色佔據的平均百分比面積、及前葉皮質的標準偏差及平均數的標準誤差。給予的抗體被分析的動物數目平均數標準偏差標準誤差抗-ΑΜΝ 6 47.060 4.667 1.905 2Η6 4 23.708 6.355 3.178 去醣化的2Η6 5 22.834 1.970 0.881

如下表9所示，相較於控制組抗體處理的族群（抗-ΑΜΝ)，用抗體2Η6(約77%降低，ρ<0·0001)及去醣化 2Η6(約53%降低，ρ<0.0001)免疫治療16週後於海馬迴中的總剛果紅染色顯著降低。如下表1 0中所示，相較於控制組抗體處理的族群（抗-AMN)，用抗體2H6(約79%降低， p<0.0001)及去醣化2H6(約68%降低，p<0.0001)免疫治療16 週後於前葉皮質中的總剛果紅染色也顯著降低。

表9.抗體處理1 6週後海馬迴的總剛果紅染色。顯示由對Αβ 正剛果紅染色佔據的平均百分比面積、及海馬迴的標準偏差及平均數的標準誤差。給予的抗體被分析的動物數目平均數標準偏差標準誤差抗-ΑΜΝ 6 1.210 0.081 0.033 2Η6 4 0.281 0.021 0.010 去醣化的2Η6 5 0.573 0.101 0.045 103827.doc -112- 1355389 表10_抗體處理16週後前葉皮質的總剛果紅染色。顯示由對Αβ正剛果紅染色佔據的平均百分比面積、及前葉皮質的標準偏差及平均數的標準誤差。給予的抗體被分析的動物數目平均數標準偏差標準誤差抗-ΑΜΝ 6 2.507 0.691 0.282 2Η6 4 0.520 0.047 0.023 去醣化的2Η6 5 0.807 0.104 0.046 分別對前葉皮質及海馬迴兩者分析實質（表u&12;及圖6)及血管（表13及14 ;圖7)剛果红染色。如表u及圖6八所示，相較於控制組抗體處理的族群（抗_AMN)，用抗體 2H6(約98%降低，ρ<〇·〇〇〇ι)及去醣化2H6(約77%降低， p<0.0001)免疫治療16週後於前葉皮質中的實質剛果紅染色顯著降低。如表12及圖6B中所示，相較於控制組抗體處理的族群（抗-AMN)，用抗體2H6(約96%降低，ρ<〇.〇〇〇ι)及去醣化2H6(約63%降低，p<〇.〇〇01)免疫治療16週後於海馬迴中的實質剛果紅染色也顯著降低。去醣化的2H6比完整 2H6抗體在降低前葉皮質及海馬迴中的剛果紅染色較不有效。表11·抗體處理16週後前葉皮質的實質剛果紅染色。顯示由對Αβ正剛果紅染色佔據的平均百分比面積、及前葉皮質的標準偏差及平均數的標準誤差。 103827.doc •113· 1355389 給予的抗體被分析的動物數目平均數標準偏差標準誤差抗-ΑΜΝ 6 2.360 0.676 0.276 2Η6 4 0.059 0.047 0.024 去醣化的2Η6 5 0.537 0.144 0.064 表12.抗體處理16週後海馬迴的實質剛果紅染色。顯示由對Αβ正剛果紅染色佔據的平均百分比面積、及海馬迴的標準偏差及平均數的標準誤差。給予的抗體被分析的動物數目平均數標準偏差標準誤差抗-ΑΜΝ 6 1.117 0.104 0.043 2Η6 4 0.040 0.029 0.015 去醣化的2Η6 5 0.416 0.078 0.035

如表13及圖7 Α所示，相較於控制組抗體處理的族群（抗-AMN)，用抗體2H6(約2.7倍，p<0.0001)及去醣化2H6(約 1.7倍，p = 0.0185)免疫治療16週後於海馬迴中的血管剛果紅染色顯著增加。如表14及圖7B中所示，相較於控制組抗體處理的族群（抗-AMN)，用抗體2H6(約3_5倍，p<0.0001) 及去醣化2H6(約1.8倍，ρ = 0·0048)免疫治療16週後於前葉皮質中的血管剛果紅染色也顯著增加。在海馬迴 (ρ = 0·0025)及前葉皮質（ρ<0.0001)兩者中，去醣化的2Η6處理之族群中血管剛果紅染色增加顯著少於完整2Η6抗體處理的族群。. 表13抗體處理16週後海馬迴的血管剛果紅染色。顯示由對 103827.doc -114- 1355389 Αβ正剛果紅染色佔據的平均百分比面積、及海馬迴的樣準偏差及平均數的標準誤差。給予的抗體被分析的動物數目平均數標準偏差標準誤差抗-ΑΜΝ 6 0.093 0.036 0.015 2Η6 4 0.253 0.053 0.027 去醣化的2Η6 5 0.157 0.030 0.013 表14.抗體處理16週後前葉皮質的血管剛果紅染色。顯示由對Αβ正剛果紅染色佔據的平均百分比面積、及前葉皮質的標準偏差及平均數的標準誤差。給予的抗體被分析的動物數目平均數標準偏差標準誤差抗-ΑΜΝ 6 0.147 0.055 0.023 2Η6 4 0.511 0.084 0.042 去醣化的2Η6 5 0.269 0.043 0.019 使用普魯士藍組織學染色來標記血鐵質（血紅素分解中產生的氧化鐵物質）。於腦中靜脈外血液導致微膠細胞的紅血球吞噬作用及於其内分解血紅素。因此，含氧化鐵的微膠細胞為昔日出血的標記物。計算抗體處理的動物中普魯士藍陽性數目。如表1 5及圖8中所示，相較於控制組抗體處理的族群（抗-ΑΜΝ)，用抗體2Η6處理顯著（ρ<0·0001) 增加普魯士藍染色約5.5倍。相較於控制組抗體處理的族群，用去醣化的2Η6處理僅增加普魯士藍染色約1.8倍 103827.doc -115- 1355389 (p = 0.0364)。表15.抗體處理16週後整個切片的普魯士藍染色。顯示由正普魯士藍染色佔據的平均百分比面積、及整個切片的標準偏差及平均數的標準誤差。給予的抗體被分析的動物數目平均數標準偏差標準誤差抗-ΑΜΝ 7 0.589 0.295 0.112 2Η6 4 3.250 0.445 0.222 去醣化的2Η6 5 1.050 0.143 0.064 給予去醣化2H6抗體後的血清濃度·.如嵐9今忭示、給予APP Tg2576小鼠抗體2H6及去醣化2H6兩者顯著地增加β-澱粉狀蛋白胜肽之血清濃度。然而，在給予抗-AMN 抗體於APP Tg2576小鼠中或在給予抗-ΑΜΝ抗體或抗體 2H6於野生型小鼠中β-澱粉狀蛋白胜肽之血清濃度無顯著增加。此指出可使用β-澱粉狀蛋白胜肽之血清濃度增加來幫助診斷AD及監測AD療法（如免疫治療）的反應。 C ·結論上述資料證實1)去醣化抗體2Η6與完整抗體2Η6—樣有效於倒轉APP Tg2576小鼠中的學習及記憶衰退；2)去醣化抗體2H6比完整抗體2H6有些許減少效能於減少海馬迴及前葉皮質中的Α β沉殿物，如由剛果紅染色測量，但一樣有效於減少海馬迴及前葉皮質中的Αβ量，如Αβ免疫染色測量；3)由去醣化抗體2Η6增加的海馬迴及前葉皮質血管中 103827.doc -116- ⑧ 1355389 的Αβ沉澱物（如由剛果紅染色測量）比完整2H6抗少許多；及4)如由普魯士藍染色測量的微出血在用去醣化2Η6抗體處理的APP Tg2576小鼠中比用完整2Η6抗體處理的小鼠低許多。此等資料建議去醣化的抗體為一樣有效於改善阿耳滋海默氏症適應症且APP Tg2576小鼠中具有較低微出血風險。實例5.不同抗體Fc區域對鼠及人類Fey受體及補體之結合親合力利用上述BIAcore測量抗體Fc區域對Fey受體或補體之結合親合力。簡而言之，藉由胺化學，將純化的人類或鼠類 Fey受體（來自R&D Systems)及人類Clq(來自Quidel)固定於 BIAcore CM5晶片上。將單株抗體之連續稀釋（範圍為2nM 至如表16及17中指示的最高濃度）注入。HBS-EP(0.01M HEPES，pH 7.4, 0.15 M NaCl，3 mM EDTA，0.005%界面活性劑P20)作為運轉及樣品緩衝液。利用1 : 1蘭格默爾交互作用模型於高親合力交互做用，或穩定狀態親合力模型於低親合力交互作用分析結合數據。下表16顯示抗-β-澱粉狀蛋白抗體對鼠FcyRI、FcyRIIb、 FcyRIII、及人類Clq(hClq)之結合親合力，如由KD( nM)測量。去醣化的抗體具有去除的N-醣化之固定區域。 9TL(hIgGl)及9TL(hIgG2Aa)具有相同可變區域（示於SEQ ID ΝΟ:1及SEQ ID NO:2)，但不同的固定區域。 9TL(hIgGl)具有人類IgGl固定區域；及9TL(hIgG2M)具有八330?331成為83308331(卡巴胺基酸編號參照野生型：^〇23 103827.doc •117- 序列）之突變的人類hIgG2。如表16中所示，相較於無去除的N-醣化之各相對應抗體，去醣化的2H6、2294、及2286 對所有受測的鼠類Fey受體具有降低的親合力。相較於 2H6，去醣化的2H6也對人類補體有降低的親合力。 9TL(hIgGl)對 mFcyRIIb 或 mFcyRIII 無顯著結合；及 9TL(hIgG2Aa)對鼠類 FcyRI、FcyRIIb、FcyRIII或 hClq任一者皆無顯著結合.。下表17顯示抗-β-澱粉狀蛋白抗體對人類FcyRI、 FcyRIIb/c、FcyRIIIb、及hClq之結合親合力，如由 KD( nM)測量。如表17中所示，9TL(hIgG2Aa)對人類FcyRI 或hClq無顯著結合；及相較於具有人類IgGl固定區域的抗體對人類FcyRIIb/c及FcyRIIIb之親合力，9TL(hIgG2Aa)對此等分子具有顯著較低的親合力。表16·抗體對鼠類Fey受體及人類補體之結合親合力，如由 KD( nM)測量抗體 FcyRI FcyRIIb FcyRIII hClq 同種型結合至Fey受體測試的最大抗體濃度(nM) 2H6 1,800 76,000 133,000 5,000 鼠類IgG2b 49,000 去醣化2H6 5,600 NB NB 30,000 去醣化鼠類IgG2b 17,000 2294 1,200 13,000 19,000 鼠類IgG2b 18,000 去醣化2294 8,600 NB NB 去醣化鼠類IgG2b 22,000 2286 93 5,000 10,000 鼠類IgGl 12,000 103827.doc -118- 去醣化2286 2,700 NB NB 去醣化鼠類IgGl 9,3〇〇 9TL(hIgGl) 800 NB NB 34 人類IgGl 30,000 9TL(hIgG2Aa) NB NB NB NB 人類IgG2Aa 30,000 NB :當以測試的最大濃度使用抗體時無顯著結合。為結合至hClq測試的最大抗體濃度為30,000 nM。表17.抗體對人類FcY受體及人類補體之結合親合力，如由 KD( nM)測量

抗體 FcyRI FcyRIIb/c FcyRIIIb hClq 9TL(hIgGl) 2.2 7,000 33,000 34 9TL(hIgG2Aa) NB 61,000 >100,000 NB NB :當以30 μΜ濃度使用抗體時無顯著結合。為結合測試的最大抗體濃度為30,000 nM。實例6.顱内給予後去醣化2H6抗體對微膠細胞活化、Fey受體結合、及澱粉狀蛋白清除之作用手游衮序！犮禮之虡巧給^ :將19.5個月大的Tg2576基因轉殖小鼠分成三個族群，所有族群接受顱内注射進入前葉皮質及海馬迴。第一個族群在各區域接受濃度2微克/微升之抗Αβ抗體2H6。第二個族群在各區域接受濃度2微克/ 微升之去醣化2Η6抗體。第三個族群接受針對果蠅遺忘症蛋白質之IgG作為完整IgG注射之非專一性控制組。手術後所有小鼠存活72小時。手術當天，將小鼠（Tg2576基因轉殖小鼠）秤重，用異氟烧（Isoflurane)麻醉及置於立體定位儀（stereotaxic 103827.doc -119- 1355389 appai*atus)(516〇3雙操控器實驗室標準，Stoelting，Wood Dale’ IL)中。做正中矢狀切口（midsagiUal incisi〇n)以露出頭盡骨及利用牙科鑽頭在右前葉皮質及海馬迴上方以下列座標鑽兩個顱骨鑽孔：皮質：AP+1.5 mm，L -2.0 mm,海馬迴AP-2_7 mm，L -2.5 mm，所有皆取自前囪。將連接至丨〇微升Hamilt〇n(Reno, Nv)針筒的26號針頭降低腹侧朝向前自3 mm及在2分鐘期間注射2微升。用鹽水清潔切口及用手術釘缝合。愈.鐵·#潜：在犧牲當天’將小鼠秤重、過量給予1 〇〇毫克/公斤戊巴比妥（Pentobarbital)(寧必妥鈉鹽溶液，Abbott laboratories，North Chicago，IL)及用 25毫升 0.9%氯化鈉心臟内灌注’接著50毫升新鮮製備的4%三聚甲链（pH 7.4)。快速地取出腦及浸沒固定24小時於新鮮製備的4%三聚甲酸中。而後將腦依序培養於1 〇、20及3 0%蔗糖24小時以冰凍保護之。而後利用滑走切片機收集25微米厚的水平切片並於具有疊氮化鈉的DPBS緩衝液中4。(：儲存以避免微生物生長。將6至8個間隔大約1 〇〇微米之切片選擇遍及注射位置及利用自由漂浮免疫組織化學法對總Αβ(與Αβ,·^及Αβ!·^反應的兔抗血清；使用的稀釋1:1〇,〇〇〇)、抗_CD45抗體（目錄編號 MCA1031G，Serotec，Raleigh NC ;使用的稀釋 1:5000)、及抗FcY受體（CD16/CD32)抗體（目錄編號553141，來自BD Bioscience ;使用為1:1，〇0〇稀釋）染色。對於抗_Αβ 抗體染色，使用以1 : 3,000稀釋的生物素化羊_抗兔作為二 103827.doc 120. 1355389 級抗=體。對於抗-CD45及Fq受體抗體染色，使用以1 : 3，000稀釋的生物素化羊_抗大鼠作為二級抗體。為了免疫染色，將一些切片省略一級抗體以評估非專一性免疫組織化學反應。將相鄰切片置於載玻片上及利用4%硫黄素 (thioflavine)-S(Sigma-Aldrich，St· Louis M0)染色 1〇分鐘。應注意包含注射體積的切片為有限數量。教#分舞：利用錄影量測卜丨(^〇11^14(：)\^150影像分析系統（Oncor，San Diego, CA)在皮質及海馬迴的注射區域中及 • 腦的對側上相對應的區域測量所有染色的切片上免疫組織化學反應產物。將數據呈現為Αβ染色、硫黃素_S染色、 CD45染色、及FcY受體染色之注射的一邊比未注射的—邊之比例。將各注射位置以相對應的對侧位置平均化減少動物間變化性的影響及允許用少量小鼠對藥物作用有可靠的量别。為了評估可能的處理相關的差異，將各處理族群的比例值利用 StatView軟體 5_0.1 版（S AS Institute Inc.，NC)藉 ANOVA分析’接著用Fisher's LSD中數比較。 ® 結果如圖10中所示，在顱内給予去醣化2H6抗體後在前葉皮質及海馬迴中CD45染色與控制組抗體大約相同。相反地，在顱内給予2H6抗體後比控制組抗體在前葉皮質中 CD45染色為顯著較高（Ρ<〇.〇1)及在海馬迴中CD45染色普遍較高。此指出’不像抗體2H6，給予去醣化2H6在給予後 72小時不活化前葉皮質及海馬迴中的微膠細胞。如圖11中所示，在顱内給予去醣化2H6抗體後在前葉皮 103827.doc -121 · 1355389 質及海馬迴中FcYII及FcYIII受體染色與控制組抗體大約相同。相反地，在顱内給予2H6抗體後比控制組抗體在前葉皮質及海馬迴中Fey受體染色為顯著較高（p<0.01)。此指出，不像抗體2H6，給予去醣化2H6在給予後72小時不活化前葉皮質及海馬迴中的微膠細胞。如圖12中所示，相較於控制組抗體，在顱内給予2H6抗體或去醣化2H6抗體後72小時在前葉皮質及海馬迴中Αβ染色為較低。如圖13中所示，相較於控制組抗體，在顧内給予2Η6抗體或去醣化2Η6抗體後72小時在前葉皮質及海馬迴中硫黄素-S染色的緊密斑也為較低。此等數據指出去醣化2Η6抗體能夠降低前葉皮質及海馬迴中的Αβ及緊密斑而不引發微膠細胞活化及發炎反應。實例7. Αβ胜肽上抗體2294結合的抗原決定區之定性抗體2294為用Αβ^ο接種小鼠產生的鼠類抗體。此抗體係說明於美國專利US 2004/0146512及世界專利WO 04/032868 ° 利用如上述的Biacore測量抗體2294對Αβ^ο、Αβ!.42、或之結合親合力。下表18顯示抗體2294 Fab片段對不同Αβ胜肽之親合力。表18.抗體2294 Fab片段之結合親合力 kon(l/Ms) koff(l/s) KD( nM) 生物素化的Αβ140固定於鏈親合素晶片上，2294 Fab流動到其上 6.6 X 104 3.95 X 10'4 6 生物素化的Αβ142固定於鏈親合素 1.1 X 104 4.87 X 10° 400 103827.doc -122 -

晶片上，2294 Fab流動生物素化的Αβά-37固定於鏈親合素晶片上’ 2294 Fab流動到其上 5x 103 0.049 10,000 藉由ELISA分析法進行抗體2294的抗原決定區製圖。將生物素化的不同Αβ胜肽之15_員或1〇_員（此等胜肽具有甘胺酸加至C-端末端）固定於鏈親合素塗佈的盤上。將nunc 11^乂丨5〇卬盤於4°(：用6微克/毫升鏈親合素（？41^6，21122)於 PBS pH 7.4塗佈超過M、時。將盤用1% BSA於PBS緩衝液 pH 7·4阻斷。清洗後，將生物素化的A|3胜肽於PBS pH7.4 中於室溫培養1小時《將一級抗體（來自細胞上層清液、含抗-Αβ抗體之血清、或以理想稀釋之純化的全抗體或Fab) 與固定的Αβ胜肽於室溫培養1小時。清洗後，將盤與以1 : 5000稀釋之二級抗體（HRP·連結的羊抗-人κ鏈抗體（ΜΡ Biomedicals，5 523 3))培養。清洗後，藉由加入ΤΜΒ受質 (KPL，5 0-76-02, 50-65-02)測量結合的二級抗體。藉由加入 1Μ磷酸停止HRP反應及測量在45〇 nm吸收度。如圖14中所示，抗體2294結合至具有胺基酸2〇·34、21-35、22-36、 23-3 7、24-38、25-39、26-40 ' 及 25-34 與甘胺酸於 C端的 Αβ胜肽；但不結合至具有胺基酸19-33、27-41、24-33、及27-35與甘胺酸於此等胜肽的c端之Αβ胜肽。此建議抗體 2294結合之抗原決定區包括由26至34之胺基酸。

為了進一步決定Αβ胜肽上由抗體2294辨認的抗原決定區’使用ELISA結合分析。將不同的Αβ胜肽（Globa.1 Peptide Services，CO)固定於 ELISA 盤上。如上述藉 EILSA 103827.doc •123- 1355389 決定2294完整抗體（以20 nM)結合至固定的Αβ。抗體2294 結合至 Αβ 胜肽 17-40、17-42、28-40、1-38、1-40、1-42、及1-43 »抗體2294不結合至Αβ胜肽1-16、1-28、28-42、 22-35、及33-40。因此，抗體2294結合至不同截短的Αβ胜肽的 C端’例如 1-38、1-40、1-42、及 1-43。下表19顯示由Biacore分析法測量的2294至Αβ^ο與其他 Αβ胜肽之結合比較。與其他胜肽比較，抗體2294(完整抗體）對Αβι-4〇具有最強結合，顯著較低結合至截短的Αβΐ 4〇 •(如卜36、1.37、卜38、及 1-39)、Αβ,.ΜΑβΜ。此指出 Αβ的胺基酸40(纈胺酸（Valine))之側鏈或骨架涉及2294對 Αβ!_4〇的結合；及在此胺基酸不存在時結合顯著降低。表19

Αβ胜肽片段結合 1-28 - 1-43 - 22-35 1-36 + 1-37 + 1-38 + + 1-39 ++ 17-42 +++ 1-42 +++ 17-40 ++++ 1-40 + + + + 103827.doc -124- ⑧ 1355389 「-」代表無結合；「+」代表非常低結合；「++」代表中等結合；「+++」代表強結合；及「++++」代表非常強結合0 基於上述數據，抗體2294結合的抗原決定區似乎包括胺基酸26-34及40。抗體2294結合至非常類似於美國臨時專利申請案第60/676,093號中所述之抗體6G的抗原決定區（將此抗體的胺基酸及核酸序列示於SEQ ID NO:36-39 ;編碼 6G的載體係於2005年6月15日寄存於ATCC，其登錄號為 PTA-6786及PTA-6787)。抗體2294及6G之抗原決定區比較也示於圖14中。然而，抗體6G以11 nM之KD結合至Αβ22.37 ; 但2294以10 μΜ之KD結合至Αβ22.37。如實例3所述利用Biacore分析法進行2294、6G、2Η6、及2289之間的抗體競爭實驗。利用Biacore分析法進行競爭實驗。將抗體2294、6G、2H6、及2289固定於CM5晶片的不同通道上。根據供應商的使用說明將CM5晶片通道用N-乙基-N、（3-二甲基胺基丙基）-碳化二亞胺鹽酸鹽（丑0(：，\-ethyl-N'-(3 - dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride)及 N-經基號 ίό 硫亞胺（NHS， Ν-hydroxysuccinimide)活化。將抗體 2294、6G、2Η6、及 22 89各稀釋入10 mM醋酸鈉pH 4· 0及以0.0〇5毫克/毫升之濃度注入活化的晶片上。將各通道用乙醇胺阻斷。將Αβ丨_40 胜肽（150 μΜ)流至晶片上2分鐘。而後將抗體2294(欲測試結合競爭者）以0.6 uM至晶片上1分鐘。於所有Biacore分析法中使用 HBS-EP 緩衝液（0.01M HEPES，pH 7.4，0.15 Μ 103827.doc • 125· 1355389

NaCl，3 mM EDTA，0.005°/〇界面活性劑P20)作為蓮轉緩衝液。在測量Αβ^4〇的結合後，藉由用Pierce沖提缓衝液（產品編號 21004, Pierce Biotechnology, Rockford, IL)及 4M NaCl(2 ·· 1)之混合物清洗6秒2次再生晶片的所有通道。而後對抗體6G、2H6、及而後抗體2289進行競爭結合。觀察到2294及6G之間及2294及2H6之間對Αβ丨_4〇結合之競爭，但未觀察到2294及2289之間或6G及2289之間的競爭。觀察固定的抗體及流至晶片上相同的抗體之間的競爭作為正控制組。資料指出抗體2294與2Η6及6G競爭結合至Αβ,,。實例8.於阿耳滋海默氏症的動物模型中去醣化的抗體2294 降低Αβ沉澱物及知能之作用藉由於37 °C將純化的抗體2294與胜肽-Ν-糖苷酶 F(Prozyme,每毫克抗體 0.05U)於 20 mM Tris-HCl pH 8.0 培養7天而製備去醣化的抗體2294。由MALDI-TOF-MS及蛋白質膠體電泳證實完全去醣化。將去醣化的抗體用蛋白質A層析法純化及將内毒素藉Q-瓊脂糖凝膠去除。利用上述Biacore分析法測試去醣化的2294對Αβ!,的結合親合力，及發現2294對Αβ!,的結合親合力相同於完整抗體 2294 ° 為了測試去醣化抗體2294對逆轉知能衰退、組織學的症狀、及微出血的作用，如實例4中所述於基因轉殖小鼠ΑΡΡ Tg2567中測試抗體2294及去醣化2294。為了 16週處理研究，將APP-基因轉殖的小鼠（20週大）分成四群。第一群每週腹膜内接受抗-Αβ抗體2294注射16週期間（n=4)。第二群 103827.doc -126- 每週腹膜内接受去醣化抗-Αβ抗體2294注射16適期間 (η=5)。第三群每週腹膜内接受抗-ΑΜΝ抗體2Η6(2906;小鼠單株抗-果蠅遺忘症蛋白質IgGl)注射16週期間（η=6)。同窩出生非基因轉殖鼠用抗-ΑΜΝ抗體（η=4)或2294(η=2)處理 1 6週。如實例4中所述進行組織學分析。應知本文中所說明的實例及實施例僅為舉例的目的，熟悉本技藝者將建議按照其作許多修改或變化，其將包括於本申請案的精神及權限範圍内。將所有本文中引用的文獻、專利及專利申請案為所有目的以參考資料併於本文中，該引用的程度就如同以特定地及個別地將各個獨立的文獻、專利或專利申請案以引用的方式併入一般。生物材料之寄存下列材料已寄存於美國菌種中心（ATCC，American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, USA)：材料抗體編號 ATCC登錄號寄存曰期 pDb.9TL.hFc2a 9TL重鏈 PTA-6124 2004年7月20曰 pEb.9TL.hK 9TL輕鏈 PTA-6125 2〇〇4年7月20日 pDb.6G.hFc2a 6G重鍵 PTA-6786 2005年6月15日 pEb.6G.hK 6G輕键 PTA-6787 2005年6月15曰載體pEb.9TL.hK為編碼9TL輕鏈可變區域及輕鏈κ固定區域的多核苷酸；及載體pDb.9TL.hFc2a為編碼9TL重鏈可 103827.doc -127- 1355389 變區域及含有下列突變A330P331成為S330S331(胺基酸編號參照野生型IgG2a序列；見Eur. J. Immunol. (1999) 29:26 1 3-2624)之重鏈IgG2a固定區域的多核苷酸。載體pEb.6G.hK為編碼6G輕鏈可變區域及輕鏈κ固定區域的多核苷酸；及載體pDb.6G.hFc2a為編碼6G重鏈可變區域及含有下列突變A330P331成為S330S331(胺基酸編號參照野生型 IgG2a序列；見 Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624)之重鏈IgG2a固定區域的多核苷酸。此等寄存係基於微生物有機體保存專利程序之國際認可布達佩斯協定（Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and the Regulations thereunder (Budapest Treaty))之規定。此保證自寄存之日始30年維持寄存可存活的培養物。在布達佩斯協定條款下可由ATCC 辦理寄存，及受到Rinat Neuroscience公司及ATCC之間的協議之管制，其保證在相關美國專利發佈時或在向大眾公開任何美國或外國專利申請案（無論哪個先）時，大眾永久及無限制可取得寄存培養的子代，及保證由美國專利及商標委員決定根據35 USC第122條及根據其的委員規定（包括 37 CFR第1.14條，其中特別參照886 OG 63 8)命名者之子代的可得性。本專利申請案的受讓人已同意當在適當的條件下培養若寄存的材料之培養物應死亡或失去或被摧毁，將在通知時立即將材料用相同的另一者替換。不應將寄存的材料之可 103827.doc -128- 1355389 得性視為違反任何政府根據其專利法的職權下承認的權力而實行本發明的許可。抗體序列 9TL重鏈可變區域胺基酸序列（SEQ ID ΝΟ:1)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYYTEAYYIHWVRQAPGQ

GLEWMGRIDPATGNTKYAPRLQDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRS

EDTAVYYCASLYSLPVYWGQGTTVTVSS 9TL輕鏈可變區域胺基酸序列（SEQ ID NO:2)

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDAKTYLNWFQQRP

GQSPRRLIYQISRLDPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVY

YCLQGTHYPVLFGQGTRLEIKRT 9TL CDR Hl(延伸的 CDR)(SEQ ID NO:3)

GYYTEAYYIH

9TL CDR H2(延伸的 CDR)(SEQ ID NO:4) RIDPATGNTKYAPRLQD 9TL CDR H3(延伸的 CDR)(SEQ ID NO:5)

LYSLPVY 9TL CDR Ll(延伸的 CDR)(SEQ ID NO:6)

KSSQSLLYSDAKTYLN 9TL CDR L2(延伸的 CDR)(SEQ ID N0:7)

QISRLDP 9TL CDR L3(延伸的 CDR)(SEQ ID NO:8)

LQGTHYPVL 9TL重鏈可變區域核苷酸序列（SEQ ID NO :9) 103827.doc •129· 1355389

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGTGCTGAGGTGAAGAAGCCTG

GCGCTTCCGTGAAGGTTTCCTGCAAAGCATCTGGTTACTATACG

GAGGCTTACTATATCCACTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGTCAAGG

CCTGGAGTGGATGGGCAGGATTGATCCTGCGACTGGTAATACTA

AATATGCCCCGAGGTTACAGGACCGGGTGACCATGACTCGCGAT

ACCTCCACCAGCACTGTCTACATGGAACTGAGCTCTCTGCGCTC

TGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCCTCCCTTTATAGTCTCCC

TGTCTACTGGGGCCAGGGTACCACTGTTACCGTGTCCTCT

9TL輕鏈可變區域核苷酸序列（SEQ ID NO:10)

GATGTTGTGATGACCCAGTCCCCACTGTCTTTGCCAGTTACCCT

GGGACAACCAGCCTCCATATCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCT

TATATAGTGATGCCAAGACATATTTGAATTGGTTCCAACAGAGGC

CTGGCCAGTCTCCACGCCGCCTAATCTATCAGATTTCCCGGCTG

GACCCTGGCGTGCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCA

CAGATTTTACACTTAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGTG

GGAGTTTATTACTGCTTACAAGGTACACATTATCCGGTGCTCTTC

GGTCAAGGGACCCGCCTGGAGATCAAACGCACT 9TL重鏈完整抗體胺基酸序列（包括如本文中所述經改質的

IgG2a)(SEQ ID ΝΟ:11)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYYTEAYYIHWVRQAPGQ

GLEWMGRIDPATGNTKYAPRLQDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRS

EDTAVYYCASLYSLPVYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRST

SESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS

LSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPC 103827.doc • 130- 1355389

PAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFN

WYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEY

KCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL

TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLT

VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 9TL輕鏈完整抗體胺基酸序列（SEQ ID NO:12)

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDAKTYLNWFQQRP

GQSPRRLIYQISRLDPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVY

YCLQGTHYPVLFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV

VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS

STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 9TL重鏈完整抗體核苷酸序列（包括如本文中所述經改質的

IgG2a)(SEQ ID NO:13)

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGTGCTGAGGTGAAGAAGCCTG

GCGCTTCCGTGAAGGTTTCCTGCAAAGCATCTGGTTACTATACG

GAGGCTTACTATATCCACTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGTCAAGG

CCTGGAGTGGATGGGCAGGATTGATCCTGCGACTGGTAATACTA

AATATGCCCCGAGGTTACAGGACCGGGTGACCATGACTCGCGAT

ACCTCCACCAGCACTGTCTACATGGAACTGAGCTCTCTGCGCTC

TGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCCTCCCTTTATAGTCTCCC

TGTCTACTGGGGCCAGGGTACCACTGTTACCGTGTCCTCTGCCT

CCACCAAGGGCCCATCTGTCTTCCCACTGGCCCCATGCTCCCGC

AGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGG

ACTACTTCCCAGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCT 103827.doc -131 - ⑧ 1355389

CTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCCTC

AGGTCTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCATCCAGCA

ACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCC

AAGCAACACCAAGGTCGACAAGACCGTGGAGAGAAAGTGTTG

TGTGGAGTGTCCACCTTGTCCAGCCCCTCCAGTGGCCGGACCAT

CCGTGTTCCTGTTCCCTCCAAAGCCAAAGGACACCCTGATGATC

TCCAGAACCCCAGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCC

ACGAGGACCCAGAGGTGCAGTTCAACTGGTATGTGGACGGAGT

GGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCAAGAGAGGAGCAGTT

CAACTCCACCTTCAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGGTGCAC

CAGGACTGGCTGAACGGAAAGGAGTATAAGTGTAAGGTGTCCA

ACAAGGGACTGCCATCCAGCATCGAGAAGACCATCTCCAAGAC

CAAGGGACAGCCAAGAGAGCCACAGGTGTATACCCTGCCCCCA

TCCAGAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTC

TGGTGAAGGGATTCTATCCATCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAG

TCCAACGGACAGCCAGAGAACAACTATAAGACCACCCCTCCAA

TGCTGGACTCCGACGGATCCTTCTTCCTGTATTCCAAGCTGACC

GTGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGAAACGTGTTCTCTTGTT

CCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTATACCCAGAAGAG

CCTGTCCCTGTCTCCAGGAAAGTAATTCTAGA 9TL輕鏈完整抗體核苷酸序列（SEQ ID N0:14)

GATGTTGTGATGACCCAGTCCCCACTGTCTTTGCCAGTTACCCT

GGGACAACCAGCCTCCATATCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCT

TATATAGTGATGCCAAGACATATTTGAATTGGTTCCAACAGAGGC 103827.doc -132- 1355389

CTGGCCAGTCTCCACGCCGCCTAATCTATCAGATTTCCCGGCTG

GACCCTGGCGTGCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCA

CAGATTTTACACTTAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGTG

GGAGTTTATTACTGCTTACAAGGTACACATTATCCGGTGCTCTTC

GGTCAAGGGACCCGCCTGGAGATCAAACGCACTGTGGCTGCAC

CATCTGTCTTCATCTTCCCTCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCCG

GAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCACGC

GAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCG

GTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACA

GCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCAGA

CTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAG

GGCCTGAGTTCTCCAGTCACAAAGAGCTTCAACCGCGGTGAGT

GCTAATTCTAG 6G重鏈可變區域胺基酸序列（SEQ ID NO:26)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYAIHWVRQAPGQG

LEWMGFTSPYSGVSNYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRS

EDTAVYYCARFDNYDRGYVRDYWGQGTLVTVS 6G輕鏈可變區域胺基酸序列（SEQ ID NO:27)

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNDRISFLNWYQQKPGQ

PPKLLIYAATKQGTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC

QQSKEFPWSFGGGTKVEIKRTV 6G CDR Hl(延伸的 CDR)(SEQ ID NO:28)

GYTFTTYAIH 6G CDR H2(延伸的 CDR)(SEQ ID NO:29) 103827.doc -133 -

1355389

FTSPYSGVSNYNQKFKG 6G CDR H3(延伸的 CDR)(SEQ ID NO:30)

FDNYDRGYVRDY 6G CDR Ll(延伸的 CDR)(SEQ ID NO:31)

RASESVDNDRISFLN 6G CDR L2(延伸的 CDR)(SEQ ID NO:32)

AATKQGT 6G CDR L3(延伸的 CDR)(SEQ ID NO:33>

QQSKEFPWS 6G重鏈可變區域核苷酸序列（SEQ ID NO:34)

CAGGTGCAACTGGTGCAATCCGGTGCCGAGGTGAAAAAGCCAG

GCGCCTCCGTGAAAGTGTCCTGCAAAGCCTCCGGTTACACCTTT

ACCACCTATGCCATCCATTGGGTGCGCCAGGCCCCAGGCCAGGG

TCTGGAGTGGATGGGCTTTACTTCCCCCTACTCCGGGGTGTCGA

ATTACAATCAGAAGTTCAAAGGCCGCGTCACCATGACCCGCGA

CACCTCCACCTCCACAGTGTATATGGAGCTGTCCTCTCTGCGCT

CCGAAGACACCGCCGTGTATTACTGTGCCCGCTTCGACAATTAC

GATCGCGGCTATGTGCGTGACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGT

CACCGTCTCC 6G輕鏈可變區域核苷酸序列（SEQ ID NO:35)

GACATCGTGATGACCCAGTCCCCAGACTCCCTGGCCGTGTCCCT

GGGCGAGCGCGCCACCATCAACTGCCGCGCCAGCGAATCCGTG

GATAACGATCGTATTTCCTTTCTGAACTGGTACCAGCAGAAACC

AGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACGCCGCCACCAAACAGG 103827.doc -134- ⑧· 1355389

GTACCGGCGTGCCTGACCGCTTCTCCGGCAGCGGTTCCGGCAC

CGATTTCACTCTGACCATCTCCTCCCTGCAGGCCGAAGATGTGG

CAGTGTATTACTGTCAGCAGTCCAAAGAGTTTCCCTGGTCCTTT

GGCGGTGGCACCAAGGTGGAGATCAAACGCACTGTG 6G重鏈完整抗體胺基酸序列（包括如本文中所述經改質的

IgG2a)(SEQ ID NO:36)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYAIHWVRQAPGQG

LEWMGFTSPYSGVSNYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRS

EDTAVYYCARFDNYDRGYVRDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPL

APCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL

QSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKC

CVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE

DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQD

WLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREE

MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDG

SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

6G輕鏈完整抗體胺基酸序列（SEQ ID NO:37)

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNDRISFLNWYQQKPGQ

PPKLLIYAATKQGTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC

QQSKEFPWSFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVC

LLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL

TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 6G重鏈完整抗體核苷酸序列（包括如本文中所述經改質的

IgG2a)(SEQ ID NO:38) 103827.doc 135- @ 1355389

CAGGTGCAACTGGTGCAATCCGGTGCCGAGGTGAAAAAGCCAG

GCGCCTCCGTGAAAGTGTCCTGCAAAGCCTCCGGTTACACCTTT

ACCACCTATGCCATCCATTGGGTGCGCCAGGCCCCAGGCCAGGG

TCTGGAGTGGATGGGCTTTACTTCCCCCTACTCCGGGGTGTCGA

ATTACAATCAGAAGTTCAAAGGCCGCGTCACCATGACCCGCGA

CACCTCCACCTCCACAGTGTATATGGAGCTGTCCTCTCTGCGCT

CCGAAGACACCGCCGTGTATTACTGTGCCCGCTTCGACAATTAC

GATCGCGGCTATGTGCGTGACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGT

CACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCTGTCTTCCCAC

TGGCCCCATGCTCCCGCAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCT

GGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCAGAACCTGTGACCGTG

TCCTGGAACTCTGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCC

AGCTGTCCTGCAGTCCTCAGGTCTCTACTCCCTCAGCAGCGTGG

TGACCGTGCCATCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGC

AACGTAGATCACAAGCCAAGCAACACCAAGGTCGACAAGACCG

TGGAGAGAAAGTGTTGTGTGGAGTGTCCACCTTGTCCAGCCCC

TCCAGTGGCCGGACCATCCGTGTTCCTGTTCCCTCCAAAGCCAA

AGGACACCCTGATGATCTCCAGAACCCCAGAGGTGACCTGTGT

GGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGCAGTTCAAC

TGGTATGTGGACGGAGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGC

CAAGAGAGGAGCAGTTCAACTCCACCTTCAGAGTGGTGAGCGT

GCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGAAAGGAGTAT

AAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGACTGCCATCCAGCATCGAGA

AGACCATCTCCAAGACCAAGGGACAGCCAAGAGAGCCACAGG 103827.doc -136· 1355389 tgtataccctgcccccatccagagaggagatgaccaagaacca

GGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGATTCTATCCATCCGACA

TCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGACAGCCAGAGAACAACTA

TAAGACCACCCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGATCCTTCTTCC

TGTATTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGG

AAACGTGTTCTCTTGTTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACC

ACTATACCCAGAAGAGCCTGTCCCTGTCTCCAGGAAAG 6G輕鏈完整抗體核苷酸序列（SEQ ID NO:39)

GACATCGTGATGACCCAGTCCCCAGACTCCCTGGCCGTGTCCCT

GGGCGAGCGCGCCACCATCAACTGCCGCGCCAGCGAATCCGTG

GATAACGATCGTATTTCCTTTCTGAACTGGTACCAGCAGAAACC

AGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACGCCGCCACCAAACAGG

GTACCGGCGTGCCTGACCGCTTCTCCGGCAGCGGTTCCGGCAC

CGATTTCACTCTGACCATCTCCTCCCTGCAGGCCGAAGATGTGG

CAGTGTATTACTGTCAGCAGTCCAAAGAGTTTCCCTGGTCCTTT

GGCGGTGGCACCAAGGTGGAGATCAAACGCACTGTGGCTGCAC

CATCTGTCTTCATCTTCCCTCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCCG

GAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCACGC

GAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCG

GTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACA

GCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCAGA

CTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAG

GGCCTGAGTTCTCCAGTCACAAAGAGCTTCAACCGCGGTGAGT

GC 103827.doc -137- 1355389 【圖式簡單說明】圖1顯示9TL抗體之重鏈可變區域（SEQ ID N0:1)及輕鏈可變區域（SEQ ID N0:2)之胺基酸序列。卡巴CDRs為粗體字，而裘蒂艾CDRs為下底線。將重鏈及輕鏈可變區域之胺基酸殘基依序編號。

圖2顯示由胜肽競爭之抗體9TL抗原決定區圖譜分析。將 Αβ^ο胜肽固定在SA晶片上。單株抗體2289及9TL Fab片段 (各5 0 nM)，將其各與10 μΜ不同胜肽（Αβ的胺基酸28-40、 1-40 、 1-28 、 28-42 、 22-35 、 1-16 、 1-43 、 33-40 、 1-38 、或17-40)或無胜肽預先培養1小時，及而後流至晶片上。測量結合至固定的Αβ!,胜肽之抗體Fab片段。

圖3為顯示由胜肽競爭之抗體2H6抗原決定區圖譜分析之圖表。將Αβ!,胜肽固定在SA晶片上。單株抗體2289、 22 86、及2Η6片段（各100 nM)，將其各與16 μΜ不同胜肽 (Αβ的胺基酸1-16、1-28、1-38、1-40、1-42、1-43、17-40、17-42、22-35、25-35、或 33-40)或無胜肽預先培養 1 小時，將其流至晶片上。測量結合至固定的Αβ!，胜肽之抗體。圖4為顯示抗體2Η6、2286、及2289結合至不同Αβ胜肽C 端變體的圖表。將GST-Αβ變體（Μ35Α、V36A、G37A、 G38A、V39A、或 V40A)、或 GST-Αβ 胜肽 1-39、1-41、1-40、1-42固定於ELISA盤上。將單株抗體2286、2Η6、或 22 89(各mAb 0.3 nM)與各固定的胜肽培養，及藉由與生物素抗-小鼠IgG(H+L)及隨後鏈親合素（Streptavidin)-HRP培 103827.doc -138- 1355389 養偵測其結合。圖5為顯示在用2H6及去醣化2H6抗體治療16週後倒轉 APP-基因轉殖鼠中空間學習缺陷之圖表。將小鼠於放射狀水迷宮之兩天版中測試。Y軸代表在2天試驗期間做錯的平均數。方塊數目1 -5代表第1天中的測試；而方塊數目6-10 代表第2天中的測試。「*」代表當與抗-AMN抗體處理的小鼠（A-AMN)比較，對2H6(A-2H6)及去醣化的2H6(A-De-2H6)兩者處理的小鼠p<0.05。「**」代表當與抗-AMN抗體處理的小鼠（A-AMN)比較，對2H6(A-2H6)及去醣化的 2H6(A-De-2H6)兩者處理的小鼠p<0.01。圖6A及6B為圖表，顯示在用2H6、抗-AMN(稱為 AMN)、及去醣化2H6(稱為D-2H6)抗體之16週抗體處理後在海馬迴（hippocampus)(圖 6B)及前葉皮質（frontal cortex) (圖6A)中實質剛果紅染色的澱粉狀蛋白-β胜肽之減少。於圖6 Α及6 Β中的Υ軸代表對剛果紅染色陽性的面積百分比之平均。於圖6A及6B中的X轴代表給予的抗體類型。圖7A及7B為圖表，顯示在用2H6、抗-AMN(稱為 AMN)、及去醣化2H6(稱為D-2H6)抗體之16週抗體處理後在海馬迴（圖7A)及前葉皮質（圖7B)中血管剛果紅染色的澱粉狀蛋白-β胜肽之增加。於圖7A及7B中的Y軸代表對剛果紅染色陽性的面積百分比之平均。於圖7Α及7Β中的X軸代表給予的抗體類型。圖8為圖表，顯示在用2Η6、抗-ΑΜΝ(稱為ΑΜΝ)、及去醣化2Η6(稱為D-2H6)抗體之16週抗體處理後普魯士藍陽性 103827.doc -139- 外觀的數目。Y軸代表每個切片之陽性外觀。X軸代表給予的抗體類型。圖9為圖表，顯示在給予APP Tg2576小鼠抗-ΑΜΝ抗體 (稱為AMN)、抗體2H6(稱為2H6)、去醣化2H6(稱為2H6-D) 後，及給予野生型（WT)小鼠抗-AMN抗體及抗體2H6後， Αβ胜肽之血清含量。圖10顯示頭蓋骨内給予2Η6抗體（Α)或去醣化2Η6抗體（Β) 後於小鼠海馬迴中CD45之免疫染色。下圖顯示在頭蓋骨内給予控制組抗體、2Η6抗體、或去醣化2Η6抗體後於前葉皮質及海馬迴中被注射的一邊比未注射的一邊之受 CD45陽性染色佔據的平均面積之比例。「**」代表當相較於控制組抗體Ρ<0.01。圖11顯示頭蓋骨内給予2Η6抗體（Α)或去醣化2Η6抗體（Β) 後於小鼠海馬迴中Fey受體之免疫染色。下圖顯示在頭蓋骨内給予控制組抗體、2H6抗體、或去醣化2H6抗體後於前葉皮質及海馬迴中被注射的一邊比未注射的一邊之受 Fey受體陽性染色佔據的平均面積之比例。「**」代表當相較於控制組抗體P<0.01。圖12顯示頭蓋骨内給予2H6抗體（A)或去醣化2H6抗體（B) 後於小鼠海馬迴中Αβ胜肽之免疫染色。下圖顯示在頭蓋骨内給予控制組抗體、2Η6抗體、或去醣化2Η6抗體後於前葉皮質及海馬迴中被注射的一邊比未注射的一邊之受Αβ陽性染色佔據的平均面積之比例。「* *」代表當相較於控制組抗體Ρ<0.01。「*」代表當相較於控制組抗體Ρ<0.05。 103827.doc -140- 1355389 圖13顯示頭蓋骨内給予2H6抗體（A)或去醣化2H6抗體（B) 後於小鼠海馬迴中的硫黃素-S(thioflavine-S)。下圖顯示在頭蓋骨内給予控制組抗體、2H6抗體、或去醣化2H6抗體後於前葉皮質及海馬迴中被注射的一邊比未注射的一邊之受硫黃素-S陽性染色佔據的平均面積之比例。「* *」代表當相較於控制組抗體P<0.05。

圖14為顯示藉ELISA抗原決定區圖譜分析抗體2294及6G 的圖表。將不同的Αβ胜肽固定於ELISA盤上。將抗體與此不同的固定胜肽培養1小時。利用山羊抗人類KHRP連結的二級抗體測量結合至固定的Αβ胜肽之抗體6G。利用結合至重及輕鏈兩者及為HRP連結的二級抗體之山羊抗小鼠測量結合至固定的Αβ胜肽之抗體2294。「ΝΒ」意指未偵測到結合。在「2294」及「6G」下的縱列中數字代表於450 nm 的吸收。

103827.doc -141 - 1355389 序列表 <110>美商雷那特神經科學股份有限公司 <120>抗澱粉狀蛋白-β胜肽之抗體及其使用方法 <130〉 514712002341 <140〉 094126072 <141> 2005-08-01 <150> US 60/676,093 <151> 2005-04-29 <150> US 60/653,197 <151〉 2005-02-14 <150> US 60/592,494 φ <151> 2004-07-30 <160> 53 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210〉 1 <211〉 116 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223>合成構築體 <400〉 1

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Tyr Thr Glu Ala Tyr 20 25 30

Tyr lie His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Arg lie Asp Pro Ala Thr Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Pro Arg Leu 50 55 60

Gin Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Ser Leu Tyr Ser Leu Pro Val Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val 100 105 110

Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 114 <212> PRT <213>人工序列 103827-序列.doc 1355389 <22G> 一 <223>合成構築體 <400> 2

Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15

Gin Pro Ala Ser He Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30

Asp Ala Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Arg Arg Leu lie Tyr Gin lie Ser Arg Leu Asp Pro Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gin Gly 85 90 95

Thr His Tyr Pro Val Leu Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu lie Lys 100 105 110

Arg Thr

<210〉 3 <211> 10 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223>合成構築體 <400〉 3

Gly Tyr Tyr Thr Glu Ala Tyr Tyr lie His 1 5 10

<210> 4 <211> 17 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 4

Arg He Asp Pro Ala Thr Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Pro Arg Leu Gin 15 10 15

Asp <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223>合成構築體 103827-序列.doc 1355389 <400〉 5

Leu Tyr Ser Leu Pro Val Tyr 1 ^ <210〉 6 <211> 16 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400〉 6

Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser Asp Ala Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15

<210〉 7 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 7

Gin lie Ser Arg Leu Asp Pro 1 S <210〉 8 <211〉 9 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成構築體 ^ <400> 8

Leu Gin Gly Thr His Tyr Pro Val Leu 1 S <210〉 9 <211> 348 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223>合成構築體 <400〉 9 caggtgcagc tggtgcagtc tcctgcaaag catctggtta cctggtcaag gcctggagtg gccccgaggt tacaggaccg atggaactga gctctctgcg tggtgctgag gteaagaagc ctggcgcttc cgtgaaggtt 60 ctatacggag gcttactata tccactgggt gcgccaagcc 120 gatgggcagg attgatcctg cgactggtaa tactaaatat 180 ggtgaccatg actcgcgata cctccaccag cactgtctac 240 ctctgaggac actgctgtgt attactgtgc ctccctttat 300

103827-序列.doc 1355389 agtetccctg tetactgggg ccagggtacc actgttaccg tgtcctct 348 <210> 10 .<211> 342 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>合成構築體 <400〉 10 gatgttgtga tgacccagtc cccactgtct ttgccagtta ccctgggaca accagcctcc 60 atatcttgca agtcaagtca gagcctctta tatagtgatg ccaagacata tttgaattgg 120 ttccaacaga ggcctggcca gtctccacgc cgcctaatct atcagatttc ccggctggac 180 cctggcgtgc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac acttaaaatc 240 agcagagtgg aggctgaaga tgtgggagtt tattactgct tacaaggtac acattatccg 300 gtgctcttcg gtcaagggac ccgcctggag atcaaacgca ct 342 <210〉 11 •<211> 442 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223>合成構築體

<400> 11 Gin Val Gin Leu Val Gin 1 5 Ser Val Lys Val Ser Cys 20 Tyr He His Trp Val Arg 35 Gly Arg lie Asp Pro Ala 50 Gin Asp Arg Val Thr Met 65 70 Met Glu Leu Ser Ser Leu 85 Ala Ser Leu Tyr Ser Leu 100 Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 Pro Cys Ser Arg Ser Thr 130 Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 Gly Thr Gin Thr Tyr Thr 195 Lys Val Asp Lys Thr Val 210 Cys Pro Ala Pro Pro Val 225 230 Lys Pro Lys Asp Thr Leu

Lys Cys Pro Ser Met He Ser Arg

Val Lys Lys Pro Tyr Tyr Gin Gly

Ser Gly

Lys Ala

Gin Ala 40

Thr Gly 55

Thr Arg

Arg Ser

Pro Val

Thr Lys 120 Ser Glu 135

Glu Pro His Thr Ser Val

Cys Asn 200 Glu Arg 215

Ala Gly

Ala Glu 10

Ser Gly 25

Pro Gly

Asn Thr

Asp Thr

Glu Asp 90

Tyr Trp 105

Gly Pro

Ser Thr

Val Thr

Phe Pro 170 Val Thr 185

Val Asp

Lys Tyr 60

Ser Thr 75

Thr Ala

Gly Gin

Ser Val

Ala Ala 140 Val Ser 155

Ala Val

Val Pro

His Lys

Cys Val 220 Val Phe 235

Thr Pro

Thr Glu 30

Leu Glu 45

Ala Pro

Ser Thr

Val Tyr

Gly Thr 110 Phe Pro 125

Leu Gly

Trp Asn

Leu Gin

Ser Ser 190 Pro Ser 205

Glu Cys Leu Phe Glu Val

Gly Ala 15

Ala Tyr

Trp Met

Arg Leu

Val Tyr 80

Tyr Cys 95

Thr Val

Leu Ala

Cys Leu

Ser Gly 160 Ser Ser 175

Asn Phe

Asn Thr

Pro Pro

Pro Pro 240 Thr Cys 103 827-序列.doc 1355389 245 250 255

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp 260 265 270

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285

Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val 290 295 300

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 305 310 315 320

Lys Gly Leu Pro Ser Ser lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly 325 330 335

Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 340 345 350

Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 355 360 365

Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 370 375 380

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 405 410 415

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430

Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210〉 12 <211> 219 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>合成構築體 <400> 12

Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15

Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30

Asp Ala Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Arg Arg Leu lie Tyr Gin lie Ser Arg Leu Asp Pro Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gin Gly 85 90 95

Thr His Tyr Pro Val Leu Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu lie Lys 100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125

Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 103827·序列.doc 1355389

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 . <210> 13 <211〉 1336 <212〉 DNA <213>人工序列 <220〉 <223>合成構築體 <400〉 13 caggtgcagc tggtgcagtc tggtgctgag gtgaagaagc ctggcgcttc cgtgaaggtt 60 tcctgcaaag catctggtta ctatacggag. gettactata tccactgggt gcgccaagcc 120 •cctggtcaag gcctggagtg gatgggcagg attgatcctg cgactggtaa tactaaatat 180 gccccgaggt tacaggaccg ggtgaccatg actcgcgata cctccaccag cactgtctac 240 atggaactga gctctctgcg ctctgaggac actgctgtgt attactgtgc ctccctttat 300 agtctccctg tctactgggg ccagggtacc actgttaccg tgtcctctgc ctccaccaag 360 ggcccatctg tcttcccact ggccccatgc tcccgcagca cctccgagag cacagccgcc 420 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttccca gaacctgtga ccgtgtcctg gaactctggc 480 gctctgacca geggegtgea caccttccca gctgtcctgc agtcctcagg tctctactcc 540 ctcagcagcg tggtgaccgt gccatccagc aaetteggea cccagaccta cacctgcaac 600 gtagatcaca agccaagcaa caccaaggtc gacaagaccg tggagagaaa gtgttgtgtg 660 gagtgtccac cttgtccagc ccctccagtg gccggaccat ccgtgttcct gttccctcca 720 aagccaaagg acaccctgat gatctccaga accccagagg tgacctgtgt ggtggtggac 780 gtgtcccacg aggacccaga ggtgcagttc aactggtatg tggacggagt ggaggtgcac 840 aacgccaaga ccaagccaag agaggageag ttcaactcca ccttcagagt ggtgagcgtg 900 ctgaccgtgg tgcaccagga ctggctgaac ggaaaggagt ataagtgtaa ggtgtccaac 960 aagggactgc catccagcat cgagaagacc atctccaaga ccaagggaca gccaagagag 1020 ccacaggtgt ataccctgcc cccatccaga gaggagatga ccaagaacca ggtgtccctg 1080 acctgtctgg tgaagggatt ctatccatcc gacatcgccg tggagtggga gtccaacgga 1140 cagccagaga acaactataa gaccacccct ccaatgctgg actccgacgg atccttcttc 1200 ctgtattcca agctgaccgt ggacaagtcc agatggeage agggaaacgt gttctcttgt 1260 ^ tccgtgatgc acgaggccct gcacaaccac tatacccaga agagcctgtc cctgtctcca 1320 ^ ggaaagtaat tetaga 1336 <210> 14 <211> 666 <212〉 DNA <213>人工序列 <220〉 <223>合成構築體 <400〉 14 gatgttgtga tgacccagtc cccactgtct ttgccagtta ccctgggaca accagcctcc 60 atatettgea agtcaagtca gagcctctta tatagtgatg ccaagacata tttgaattgg 120 ttccaacaga ggcctggcca gtctccacgc cgcctaatct atcagatttc ccggctggac 180 cctggcgtgc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac acttaaaatc 240 agcagagtgg aggetgaaga tgtgggagtt tattactgct tacaaggtac acattatccg 300 gtgetetteg gtcaagggac ccgcctggag atcaaacgca ctgtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc ctccatctga tgagcagttg aaatccggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatccacg cgaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 103827·序列.doc -6- 1355389 tccggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgaccctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ttctccagtc acaaagagct tcaaccgcgg tgagtgctaa 660 ttctag 666 <210> 15 <211> 40 <212> PRT <213>智人 <400> 15

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys 15 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie 20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val 35 40 <210> 16 •<211> 42 <212〉 PRT <213>智人 <400〉 16

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys 15 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie 20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val lie Ala 35 40 <210> 17 <211〉 43 <212> PRT <213>智人 <400> 17

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys 15 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie 20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val lie Ala Thr 35 40 <210> 18 <211> 41 <212〉 PRT <213>智人 <400> 18

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys 15 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie 20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val He 35 40 103827-序列.doc 1355389 <210> 19 <211> 39 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 19

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys 15 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie 20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val 35

<210〉 20 <211〉 40 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223〉合成構築體 <400> 20

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys 15 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie He 20 25 30

Gly Leu Ala Val Gly Gly Val Val 35 40 <210> 21 <211> 40 <212> PRT <213〉人工序列赢 <220〉 φ <223>合成構築體 <400> 21

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys 15 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie 20 25 30

Gly Leu Met Ala Gly Gly Val Val 35 40 <210〉 22 <211〉 40 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223>合成構築體 103827-序列.doc 1355389 <400> 22

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys 15 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie 20 25 30

Gly Leu Met Val Ala Gly Val Val 35 40 <210> 23 <211> 40 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>合成構築體 <400〉 23

Asp/Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys 15 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie 20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Ala Val Val 35 40 <210〉 24 <211> 40 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 24

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys 15 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie •20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Ala Val 35 40 <210> 25 <211> 40 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400〉 25

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys 15 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie He 20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Ala 35 40 103827-序列.doc 1355389 <210〉 26 <211〉 120 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223>合成構築體 <400〉 26

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30

Ala He His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Phe Thr Ser Pro Tyr Ser Gly Val Ser Asn Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Phe Asp Asn Tyr Asp Arg Gly Tyr Val Arg Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 <210> 27 <211> 114 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223>合成構築體 <400> 27

Asp He Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Asp 20 25 30

Arg lie Ser Phe Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 45

Lys Leu Leu lie Tyr Ala Ala Thr Lys Gin Gly Thr Gly Val Pro Asp 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 65 70 75 80

Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Lys 85 90 95

Glu Phe Pro Trp Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg 100 105 110

Thr Val <210> 28 ' 103 827-序列.doc - 10- 1355389 <211> 10 <212〉 PRT <213>智人 <400> 28

Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Ala lie His 1 5 10 <210> 29 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400〉 29

Phe Thr Ser Pro Tyr Ser Gly Val Ser Asn Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 15 10 15

Gly <210> 30 <211> 12 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>合成構築體 <400〉 30

Phe Asp Asn Tyr Asp Arg Gly Tyr Val Arg Asp Tyr 1 5 10 <210> 31 <211> 15 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>合成構築體 <400> 31

Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Asp Arg lie Ser Phe Leu Asn 15 10 15 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 103827-序列.doc -11 - 1355389 <400> 32

Ala Ala Thr Lys Gin Gly Thr 1 5

<210〉 33 <211〉 9 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223>合成構築體 <400〉 33

Gin Gin Ser Lys Glu Phe Pro Trp Ser 1 s

<210〉 34 <211> 360 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223>合成構築體 cgtgaaagtg 60 gcgccaggcc 120 gtcgaattac 180 cacagtgtat 240 ccgcttcgac 300 caccgtctcc 360 <400> 34 caggtgcaac tcctgcaaag ccaggccagg aatcagaagt atggagctgt aattacgatc tggtgcaatc cctccggtta gtctggagtg tcaaaggccg cctctctgcg gcggctatgt cggtgccgag cacctttacc gatgggcttt cgtcaccatg ctccgaagac gcgtgactat gtgaaaaagc acctatgcca acttccccct acccgcgaca accgccgtgt tggggccagg caggcgcctc tccattgggt actccggggt cctccacctc attactgtgc gcaccctggt

<210> 35 <211> 342 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223>合成構築體 gcgcgccacc 60 gaactggtac 120 acagggtacc 180 gaccatctcc 240 gtttccctgg 300 342 <400〉 35 gacatcgtga atcaactgcc cagcagaaac ggcgtgcctg tccctgcagg tcctttggcg tgacccagtc gcgccagcga caggccagcc accgcttctc ccgaagatgt gtggcaccaa cccagactcc atccgtggat tcctaagctg cggcagcggt ggcagtgtat ggtggagatc ctggccgtgt aacgatcgta ctcatttacg tccggcaccg tactgtcagc aaacgcactg ccctgggcga tttcct ttct ccgccaccaa atttcactct agtccaaaga tg

<210〉 36 <211> 447 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 103 827-序列.doc 12- 1355389 <400> 36

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30

Ala lie His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Phe Thr Ser Pro Tyr Ser Gly Val Ser Asn Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Phe Asp Asn Tyr Asp Arg Gly Tyr Val Arg Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175

Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190

Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys 210 215 220

Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr 245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270

Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser 290 295 300

Val Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser He Glu Lys Thr lie 325 330 335

Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380

Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser 385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415

Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 103827-序列.doc -13- 1355389 <210〉 37 <211> 218 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <2?3>合成構築體 <400〉 37

Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Asp 20 25 30

Arg He Ser Phe Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 45

Lys Leu Leu lie Tyr Ala Ala Thr Lys Gin Gly Thr Gly Val Pro Asp 50 55 60 • Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 65 70 75 80

Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Lys 85 90 95

Glu Phe Pro Trp Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser 145 150 155 160

Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 38 <211> 1341 <212〉 DNA <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 <400〉 38 caggtgcaac tggtgcaatc cggtgccgag gtgaaaaagc caggcgcctc cgtgaaagtg 60 tcctgcaaag cctccggtta cacctttacc acctatgcca tccattgggt gcgccaggcc 120 ccaggccagg gtctggagtg gatgggcttt acttccccct actccggggt gtcgaattac 180 aatcagaagt tcaaaggccg cgtcaccatg acccgcgaca cctccacctc cacagtgtat 240 atggagctgt cctctctgcg ctccgaagac accgccgtgt attactgtgc ccgcttcgac 300 aattacgatc gcggctatgt gcgtgactat tggggccagg gcaccctggt caccgtctcc 360 tcagcctcca ccaagggccc atctgtcttc ccactggccc catgctcccg cagcacctcc 420 gagagcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tcccagaacc tgtgaccgtg 480 103827-序列.doc -14- \ 1355389 tcctggaact ctggcgctct gaccagcggc gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtcc 540 tcaggtctct actccctcag cagcgtggtg accgtgccat ccagcaactt cggcacccag 600 acctacacct gcaacgtaga tcacaagcca agcaacacca aggtcgacaa gaccgtggag 660 agaaagtgtt gtgtggagtg tccaccttgt ccagcccctc cagtggccgg accatccgtg 720 ttcctgttcc ctccaaagcc aaaggacacc ctgatgatct ccagaacccc agaggtgacc 780 tgtgtggtgg tggacgtgtc ccacgaggac ccagaggtgc agttcaactg gtatgtggac 840 ggagtggagg tgcacaacgc caagaccaag ccaagagagg agcagttcaa ctccaccttc 900 agagtggtga gcgtgctgac cgtggtgcac caggactggc tgaacggaaa ggagtataag 960 tgtaaggtgt ccaacaaggg actgccatcc agcatcgaga agaccatctc caagaccaag 1020 ggacagccaa gagagccaca ggtgtatacc ctgcccccat ccagagagga gatgaccaag 1080 aaccaggtgt ccctgacctg tctggtgaag ggattctatc catccgacat cgccgtggag 1140 tgggagtcca acggacagcc agagaacaac tataagacca cccctccaat gctggactcc 1200 gacggatcct tcttcctgta ttccaagctg accgtggaca agtccagatg gcagcaggga 1260 aacgtgttct cttgttccgt gatgcacgag gccctgcaca accactatac ccagaagagc 1320 ctgtccctgt ctccaggaaa g 1341

<210〉 39 <211> 654 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223>合成構築體 <400> 39 gacatcgtga atcaactgcc cagcagaaac ggcgtgcctg tccctgcagg tcctttggcg atcttccctc aataacttct ggtaactccc agcaccctga acccatcagg tgacccagtc cccagactcc ctggccgtgt ccctgggcga gcgcgccacc 60 gcgccagcga atccgtggat aacgatcgta tttcctttct gaactggtac 120 caggccagcc tcctaagctg ctcatttacg ccgccaccaa acagggtacc 180 accgcttctc cggcagcggt tccggcaccg atttcactct gaccatctcc 240 ccgaagatgt ggcagtgtat tactgtcagc agtccaaaga gtttccctgg 300 gtggcaccaa ggtggagatc aaacgcactg tggctgcacc atctgtcttc 360 catctgatga gcagttgaaa tccggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420 atccacgcga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcc 480 aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540 ccctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600 gcctgagttc tccagtcaca aagagcttca accgcggtga gtgc 654 <210> 40 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>合成構築體 <400> 40

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 41 <211> 16 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 103 827-序列.doc ⑧’ 1355389 <400> 41

Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie Gly Gly 15 10 15 <210> 42 <211> 16 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223>合成構築體 <400〉 42

Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie Gly Leu Gly 15 10 15 <210〉 43 <211> 16 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223>合成構築體 <400> 43

Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala He He Gly Leu Met Gly 15 10 15 <210〉 44 <211> 16 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223>合成構築體 φ <4〇〇> 44

Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie He Gly Leu Met Val Gly 15 10 15 <210> 45 <211> 16 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223>合成構築體 <400〉 45

Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie He Gly Leu Met Val Gly Gly 1 5 10 15 <210> 46 103 827-序列.doc 16- 1355389 <211> 16 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223>合成構築體 <400〉 46

Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie Gly Leu Met Val Gly Gly Gly 15 10 15 <210> 47 <211> 16 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223>合成構築體 # <400> 47

Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie Gly Leu Met Val Gly Gly Val Gly 15 10 15 <210〉 48 <211> 16 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223>合成構築體 <400> 48

Ser Asn Lys Gly Ala lie lie Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Gly 15 10 15 <210> 49 <211> 16 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223>合成構築體 <400〉 49

Asn Lys Gly Ala He He Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val He Gly 15 10 15 <210> 50 <211> 16 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成構築體 103827-序列.doc -17- 1355389 <400> 50

Lys Gly Ala lie lie Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val lie Ala Gly 15 10 15 <210> 51 <211> 11 <212> PRT <2ί3>人工序列 <220〉 <223>合成構築體 <400> 51

Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie Gly Gly 1 5 10 <210〉 52 <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>合成構築體 <400> 52

Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie He Gly Leu Gly 1 5 10 <210> 53 <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 <220>

<223>合成構築體 <400> 53

Ser Asn Lys Gly Ala lie He Gly Leu Met Gly 1 5 10 103 827-序列.doc -18 -

Claims

第094126j)p號專利申請案十、申請專利範圍：

申讀專範〇午 grn I1 覆替換本(100—年8月) 户修(幻正本| 1. 一種專一地結合至β-澱粉狀蛋白（Αβ)胜肽或Αβ胜肽聚集形式的抗體之用途，其係用於製造用以治療個體中與 Αβ-澱粉狀蛋白沉澱有關的疾病之藥物，其中抗體包含具有受損作用功能的Fc區域，且其中該抗體包含：重鏈可變區域，其包含： (a) 示於SEQ ID NO:3中的CDR1區域； (b) 示於SEQ ID NO:4中的CDR2區域；及 (c) 示於SEQ ID NO:5中的CDR3區域，其中第一個L可視需要被V或I取代；其中第二個Y可視需要被W取代；其中第三個S可視需要被T或G取代；其中第四個L可視需要被R、A、V、S、T、Q或E取代；其中第六個V可視需要被I、T、P、C、Q、S、N或F 取代；及其中第七個Y可視需要被H、F、W、S、 I、V或A取代；及輕鏈可變區域，其包含： (d) 示於SEQ ID NO:6中的CDR1區域，其中第八個Y可視需要被A或Η取代；其中第十一個A可視需要被S 取代；及其中第十二個K可視需要被A取代； (e) 示於SEQIDNO:7中的CDR2區域；及 (f) 示於SEQ ID NO:8中的CDR3區域，其中第一個L可視需要被Μ、N、C、F、V、K、S、Q、G或S取代；其中第三個G可視需要被S或T取代；其中第四個T可視需要被S取代；其中第五個Η可視需要被L 103827-1000819.doc 1355389 取代；其中第六個Y可視需要被p、A、w、Q、 Μ、s或E取代；其中第八個v可視需要被l、K、 Η、Τ、A、Ε或Μ取代；及其中第九個^可視需要被I、Τ、S或V取代。 2. 如請求項1之用途，其中該個體為人類。 3. 如請求項1之用途’其中該疾病為阿耳滋海默氏症。 4. 如請求項1之用途，其中該抗體為單株抗體。 5. 如清求項丨之用途，其中該抗體為人化抗體。 6. 如睛求項1之用途’其中該抗體為人類抗體。 7. 如請求項1之用途’其中該抗體以約2 ηΜ或以下的kd結 *" .... - ...... ·. .... 合至Αβ胜肽。 8. 如請求項1之用途，其中該抗體專一地結合至Αβΐ4〇的殘基28-403内的抗原決定區。 9. 如請求項1之用途，其中該抗體專一地結合至Api4〇tC_ 端。 10. 如請求項1之用途，其中該抗體專一地結合至Αβΐ4〇上包括胺基酸39及/或40之抗原決定區。 11_如請求項1〇之用途’其中該抗體包含包含如SEq ID NO: 1所示的胺基酸序列之重鏈可變區域，及包含如SEq ID NO:2所示的胺基酸序列之輕鍵可變區域。 12. 如請求項1之用途，其中該抗體以比結合至八^^或43 更高的親合力結合至ApU4()。 13. 如請求項1之用途，其中該抗體結合至ΑβΝ4〇上包括胺基酸25-34及40之抗原決定區。 103827-1000819.doc 14. 如請求項1之用途，其中該抗體包含：重鍵可變區域，其包含： (a) 示於SEQ ID NO:3中的CDR1區域； (b) 示於SEQ ID N0:4中的CDR2區域；及 (c) 示於SEQIDN0:5中的CDR3區域及輕鏈可變區域，其包含： (d) 示於SEQ ID NO:6中的CDR1區域； (e) 示於SEQ ID NO:7中的CDR2區域；及 (f) 示於SEQIDNO:8中的CDR3區域。 15. 16. 17. 如請求項1之用途，其中該抗體的以區域包含於N-醣化辨識序列内之突變，因而FC區域為非N-醣化。如請求項1之用途，其中該抗體的Fc區域為包含在位置 330由丙胺酸成為絲胺酸及在位置331由脯胺酸成為絲胺酸之胺基睃突變的人類重鏈IgG2a之Fc區域，其中胺基酸位置係基於參照人類野生型IgG2序列之卡巴編號。一種抗體，其包含：重鏈可變區域，其包含： (a) 示於SEQ ID NO:3中的CDR1區域； (b) 示於SEQ ID NO:4中的CDR2區域；及 (c) 示於SEQ ID NO:5中的CDR3區域，其中第一個L可視需要被V或I取代；其甲第二個γ可視需要被w取代；其中第三個S可視需要被T或G取代；其中第四個L可視需要被R、a、V、S、T、Q或E取代；其中第六個V可視需要被I、T、P、C、Q、S、N或F 103827-1000819.doc !355389 取代；及其中第七個Y可視需要被H、F、W、S、 I、V或A取代；及輕鏈可變區域，其包含： (d) 示於SEQ ID N0:6中的CDR1區域，其中第八個γ可視需要被A或Η取代；其中第十一個A可視需要被S 取代；及其中第十二個K可視需要被A取代； (e) 示於SEQIDN0:7中的CDR2區域；及 (f) 示於SEQ ID N0:8中的CDR3區域，其中第一個L可視需要被Μ、N、C、F、V、K、S、Q、G或S取代；其中第三個G可視需要被S或T取代；其中第四個T可視需要被S取代；其中第五個Η可視需要被L 取代；其中第六個Υ可視需要被P、A、W、Q、 Μ、S或E取代；其中第八個V可視需要被L、K、 Η、T、A、Ε或Μ取代；及其中第九個L可視需要被I、Τ、S或V取代，其中該抗體專一地結合至Αβ胜肽。 18. 如請求項17之抗體，其中該抗體包含：重鏈可變區域，其包含： (a) 示於SEQIDN0:3中的CDR1區域； (b) 示於SEQIDN0:4中的CDR2區域；及 (c) 示於SEQIDN0:5中的CDR3區域及輕鏈可變區域，其包含： (d) 示於SEQIDN0:6中的CDR1區域； (e) 示於SEQIDN0:7中的CDR2區域；及 103827-10008l9.doc 1^55389 (f)示於SEQIDNO:8中的CDR3區域。 19. 如請求項18之抗體，其中該重鏈可變區域包含示於SEQ IDNO:l中的胺基酸序列。 20. 如請求項18之抗體，其中該輕鏈可變區域包含示於SEq ID NO:2中的胺基酸序列。 21，如請求項20之抗體’其中該重鏈可變區域包含示於SEq IDNO:l中的胺基酸序列。傷 22.如請求項18之抗體’其中該重鏈包含示mSEq ID N〇:n 中的胺基酸序列；及該輕鏈包含示於SEQ ID N〇:12*的胺基酸序列。

103827-1000819.doc