CN103140500B - 抗addl单克隆抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了能与淀粉样蛋白β-衍生的可扩散配体即ADDL结合的抗体。所述抗体对ADDL具有选择性，能穿透脑部，并可用于检测ADDL和诊断阿尔茨海默病的方法。所述抗体也阻断ADDL与神经元结合、ADDLS聚集和τ磷酸化并可用于预防和治疗ADDL相关疾病的方法。

Description

抗 ADDL 单克隆抗体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请根据35 USC §119，要求于2011年7月14日申请的美国临时申请号61/364,210的优先权。
发明领域
本发明涉及用于治疗阿尔茨海默病(Alzheimer's disease)的单克隆抗体。本发明也提供包含单克隆抗体的组合物以及使用所述组合物作为生物标记或用于诊断和治疗淀粉样蛋白β (Aβ)和Aβ-衍生的可扩散配体(ADDL)相关疾病的方法。
发明背景
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease) (AD)的特征在于认知功能的进行性丧失以及学习和记忆相关区内淀粉样蛋白β (Aβ)斑块的积累。尽管Aβ斑块一度被认为在AD发病机理中起到中心作用，但越来越多的证据表明Aβ-衍生的可扩散配体(ADDL)可能负责疾病相关的神经元功能障碍和认知下降(Walsh和Selkoe, 2004, Protein Pept. Lett., 11: 213-228)。ADDL是小的可溶性Aβ寡聚体，它在AD脑中富含，但正常脑中不含(McLean等, 1999, Ann. Neurol., 46: 860-866；Gong等, 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 10417-10422)。体外研究已经证明，分离自AD脑或合成制备物的ADDL与皮层和海马神经元亚群结合(Gong等, 2003；Klein等, 2004, Neurobiol. Aging, 25: 569-580；Lacor等, 2004, J. Neurosci., 24: 10191-10200；Shughrue等, 2010, Neurobiol. Aging, 31: 189-202)，但纤维状或单体Aβ制备物则未检测到结合或很少结合(Lacor等, 2004；Hepler等, 2006, Biochemistry, 45: 15157-15167)。此外，用针对ADDL而产生的多克隆抗体(Gong等, 2003)和单克隆抗体(Lee等, 2006, J. Biol. Chem., 281: 4292-4299；De Felice等, 2007, Neurobiol. Aging 29: 1334-1347；Shughrue等, 2010)都可减少ADDL与神经元的结合。
在啮齿类模型中，中枢给予(central administration)ADDL诱导啮齿类长期增强作用(LTP)和记忆形成的缺陷(Walsh等, 2002, Nature, 416: 535-539；Cleary等, 2004, Nat. Neurosci., 8: 79-84；Klyubin等, 2005, Nat. Med., 11: 556-561)。当ADDL与抗Aβ抗体联合给予时或当ADDL给予经Aβ肽免疫接种的动物时，寡聚体对LTP的影响被减少(Rowan等, 2004, Exp. Gerontol., 39: 1661-1667)。在AD转基因模型例如产生人淀粉样蛋白前体蛋白(hAPP)的转基因小鼠中，观察到年龄相关的认知缺陷具有升高的ADDL水平(Westerman等, 2002, J. Neurosci., 22: 1858-1867；Ashe, 2005, Biochem. Soc. Trans., 33: 591-594；Lee等, 2006；Lesne等, 2006, Nature, 440: 352-357)。当用抗ADDL抗体治疗hAPP小鼠时，观察到认知表现的显著改善，同时Aβ斑块负荷并未同时降低(Lee等, 2006)。综合这些发现表明，ADDL、而非Aβ斑块，主要负责认知减退，而且使用抗ADDL抗体证明在AD治疗中是有效的。另见US2006/0228349；US 7,731,962, WO 2007/050359；US2007/0218499, WO 2006/014478；US 7,700,099；US 2008/01758835, WO 2006/055178。
因此，需要ADDL选择性的治疗抗体以预防和治疗AD。本发明满足了这种需要。
发明概述
本发明涉及能够差异识别一种或多种淀粉样蛋白-β衍生的可扩散配体(ADDL)的多维构象的分离的抗体或其片段，其用于治疗ADDL相关疾病，例如阿尔茨海默病(AD)。本发明也提供单独包含本发明的分离的抗体或者包含本发明的分离的抗体以及一种或多种治疗活性药物、载体或稀释剂的药物组合物。
本发明也涉及使用所述分离的抗体的方法，例如用于在样品中检测ADDL、用于抑制ADDL的聚集、用于鉴定能阻止ADDL与神经元结合的治疗药、以及用于减少ADDL相关疾病的症状的方法，和作为生物标记用于诊断ADDL相关疾病或用于检测样品中的ADDL的方法。
附图简述
图1是一组人源化(h3B3)和亲和力成熟的抗ADDL (14.2、7.2、11.4、9.2、13.1、17.1和19.3)抗体和3种参比抗体(Comp 1、2和3)与单体Aβ、ADDL和纤维状Aβ的ELISA结合的示意图。通过从ELISA中除去捕获抗体而检测该测定的背景(无mAb)。误差条表示平均值的标准误差。
图2是用11点滴定曲线评价的抗ADDL抗体19.3和抗体3B3与ADDL或单体Aβ (Aβ1-40)的ELISA结合的示意图。
图3是与增加浓度的抗体预孵育之后抗ADDL抗体19.3和3B3阻断ADDL与原代海马神经元细胞结合的能力的示意图。在抗体加热变性之后，抗ADDL抗体19.3阻断ADDL与神经元结合的能力下降。误差条表示平均值的标准误差。
图4A-4C是在不同温度下孵育达1个月之后抗ADDL抗体19.3 (在图4A中称为WT)和2种19.3-衍生的抗ADDL抗体(图4B和4C)的ADDL的ELISA结合示意图，以评价抗体稳定性。19.3-衍生的抗ADDL抗体包括在轻链CDR1内单个氨基酸Asn33取代为Ser33 (19.3S33)或Thr33 (19.3T33) (分别为SEQ ID NOS: 55和56)。用S33 (图4B)或T33 (图4C)取代Asn33导致与亲代19.3抗体相比改进的抗体稳定性。
图5是当用Biacore™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ)评价时，抗ADDL抗体与固定化人FcRn的结合和解离的示意图。经调整的传感图显示在pH 6.0开始结合，然后在pH 7.3从180秒抗体解离。报告点(稳定性)插在pH 6.0结合结束后5秒，“%结合”计算为RU稳定性/RU结合(%)。
图6A显示抗ADDL抗体19.3与人种系的重链可变区和轻链可变区的比对，互补决定区(CDR)用粗体表示。图6B是抗体19.3重链可变区和轻链可变区的三维模型，显示CDR的位置。
图7是在单次10 mg/kg静脉内(IV)给予之后在杂合276人FcRn小鼠(Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)中评价的抗ADDL抗体19.3和3B3的药物动力学(PK)概况的示意图。在不同时间间隔测定抗体浓度以确定游离抗体的半衰期(t½) (分别为：19.3: 77 6小时；3B3: 29 9小时)。
图8是在静脉内(IV)或皮下(SC)推注给予5 mg/kg之后在6只猕猴中评价的抗ADDL抗体19.3 PK示意图(在血清中)。在IV给予之后测得254 28 (274 9)小时的半衰期(t½)，在SC给予后测得204 49 (219 52)小时的半衰期。
图9是使用小脑延髓池端口受控的猕猴模型(cisterna magna ported rhesus model)，在IV推注5 mg/kg之后，在灵长类(3只雄性猕猴)脑脊液(CSF)中评价的抗ADDL抗体19.3 PK示意图。在给药后大约48小时，抗ADDL抗体19.3存在于CSF中，血清浓度为0.1%。
图10A-10D是在过量表达人淀粉样蛋白前体蛋白(hAPP)的转基因小鼠模型中，抗ADDL抗体19.3与2种参比抗体(Comp 1和Comp2)相比，穿越血脑屏障的能力的示意图。小鼠经静脉内(IV)注射125I-标记的抗ADDL抗体19.3或参比抗体，给药后2小时采集血液、CSF和脑样品。在评价放射性分布时，0.02%抗ADDL抗体19.3存在于CSF(图10A)，而在脑中观察到0.19% (图10B)。用2种参比抗体观察到类似水平。免疫细胞化学分析表明抗ADDL抗体19.3的位置(图10C, 箭头)，抗ADDL抗体19.3的浓度显示为斑块(图10D)。抗ADDL抗体19.3能够渗入脑内并与ADDL结合。
图11A-11C是在过量表达hAPP的转基因小鼠模型中，抗ADDL抗体19.3阻断ADDL沉积在生长的斑块的能力的示意图。将生物素化ADDL (bADDL)输注到12月龄小鼠的海马内达4周(每周注射1次) (图11A)标记出已有的斑块(单用溶媒: 图11B；抗体19.3: 图11C, 环)。免疫细胞化学分析用于评价新材料(ADDL)的沉积(图11B和11C)。
发明详述
本发明涉及能与淀粉样蛋白β (Aβ)-衍生的可扩散配体(ADDL)结合的抗体或抗原结合片段，即抗ADDL抗体，并且所述抗体能减弱ADDL与神经元结合。定量的基于细胞的测定所得结果表明抗ADDL抗体优先地结合ADDL，减弱ADDL与海马神经元结合，跨越血脑屏障，并具有改善的药物动力学(PK)性质。
在一个实施方案中，本发明涉及能与淀粉样蛋白β-衍生的可扩散配体(ADDL)结合的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a) 包含以下的轻链可变区，
(i) 具有序列Arg-Ser-Ser-Gln-Ser-Ile-Val-His-Ser-Asn-Gly-Asn-Thr-Tyr-Leu-Glu的CDR1 (SEQ ID NO: 1)，
(ii) 具有序列Lys-Ala-Ser-Asn-Arg-Phe-Ser的CDR2 (SEQ ID NO: 2)，和
(iii) 具有序列Phe-Gln-Gly-Ser-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5的CDR3 (SEQ ID NO: 3)，其中 Xaa1是Arg、Lys或Tyr，Xaa2是Val、Ala或Leu，Xaa3是Pro、His或Gly，Xaa4是Ala、Pro或Val，Xaa5是Ser、Gly或Phe；和
(b) 包含以下的重链可变区，
(i) 具有序列Gly-Phe-Thr-Phe-Ser-Ser-Phe-Gly-Met-His的CDR1 (SEQ ID NO: 4)，
(ii) 具有序列Tyr-Ile-Ser-Arg-Gly-Ser-Ser-Thr-Ile-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Thr-Val-Lys-Gly的CDR2 (SEQ ID NO: 5)，和
(iii) 具有序列Gly-Ile-Thr-Thr-Ala-Leu-Asp-Tyr的CDR3 (SEQ ID NO: 6)。
在另一个实施方案中，本发明涉及能与淀粉样蛋白β-衍生的可扩散配体(ADDL)结合的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a) 包含以下的轻链可变区，
(i) 具有序列Arg-Ser-Ser-Gln-Ser-Ile-Val-His-Ser-Xaa1-Gly-Xaa2-Thr-Tyr-Leu-Glu的CDR1 (SEQ ID NO: 53)，其中 Xaa1是Asn、Ser、Thr、Ala、Asp或Glu，Xaa2是Asn、His、Gln、Ser、Thr、Ala或Asp；
(ii) 具有序列Lys-Ala-Ser-Xaa1-Arg-Phe-Ser的CDR2 (SEQ ID NO: 54)，其中 Xaa1是Asn、Gln、Ser、Thr或Ala，和
(iii) 具有序列Phe-Gln-Gly-Ser-Arg-Leu-Gly-Pro-Ser的CDR3 (SEQ ID NO: 10)；和
(b) 包含以下的重链可变区，
(i) 具有序列Gly-Phe-Thr-Phe-Ser-Ser-Phe-Gly-Met-His的CDR1 (SEQ ID NO: 4),
(ii) 具有序列Tyr-Ile-Ser-Arg-Gly-Ser-Ser-Thr-Ile-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Thr-Val-Lys-Gly的CDR2 (SEQ ID NO: 5)，和
(iii) 具有序列Gly-Ile-Thr-Thr-Ala-Leu-Asp-Tyr的CDR3 (SEQ ID NO: 6)。
在另一个实施方案中，本发明是与ADDL结合的分离的抗体，即抗ADDL抗体或其抗原结合片段，其具有选自以下的轻链可变区CDR3：17.1，其具有序列Phe-Gln-Gly-Ser-Arg-Val-Pro-Ala-Ser (SEQ ID NO: 7)，14.2，其具有序列Phe-Gln-Gly-Ser-Arg-Val-Pro-Pro-Gly (SEQ ID NO: 8)，13.1，其具有序列Phe-Gln-Gly-Ser-Lys-Ala-His-Pro-Ser(SEQ ID NO: 9)，19.3，其具有序列Phe-Gln-Gly-Ser-Arg-Leu-Gly-Pro-Ser (SEQ ID NO: 10)，7.2，其具有序列Phe-Gln-Gly-Ser-Tyr-Ala-Pro-Pro-Gly (SEQ ID NO: 11)，9.2，其具有序列Phe-Gln-Gly-Ser-Arg-Ala-Pro-Pro-Phe (SEQ ID NO: 12)，和11.4，其具有序列Phe-Gln-Gly-Ser-Arg-Val-Pro-Val-Arg (SEQ ID NO: 13)。在一个亚实施方案中，所述轻链可变区CDR3是SEQ ID NO: 10。
在本发明的再一个实施方案中，所述分离的抗ADDL抗体还包括SEQ ID NO: 15的轻链可变区和SEQ ID NO: 17的重链可变区。
在本发明的还一个实施方案中，所述分离的抗ADDL抗体还包括SEQ ID NO: 21的重链恒定区。
在本发明的另一个实施方案中，所述分离的抗ADDL抗体是单克隆抗体。
本发明的另一个实施方案是包含分离的抗ADDL抗体或其抗原结合片段、以及药学上可接受的载体的药物组合物。
本发明的另一个实施方案是用于减弱ADDL与神经元结合的方法，所述方法包括使神经元与分离的抗ADDL抗体或其抗原结合片段接触，从而减弱Aβ-衍生的可扩散配体与神经元的结合。
本发明的另一个实施方案是抑制ADDL聚集的方法，所述方法包括使含有淀粉样蛋白β1-42肽的样品与分离的抗ADDL抗体或其抗原结合片段接触，从而抑制ADDL聚集。
本发明的另一个实施方案是抑制τ蛋白在Ser202/Thr205位置的磷酸化的方法，所述方法包括使含有τ蛋白的样品与分离的抗ADDL抗体或其抗原结合片段接触，从而抑制τ蛋白在Ser202/Thr205位置的磷酸化。
本发明的另一个实施方案是缓解ADDL相关疾病的症状的方法，所述方法包括给予有需要的患者有效量的包含分离的抗ADDL抗体或其抗原结合片段的药物组合物。
本发明的另一个实施方案是用于鉴定能减弱淀粉样蛋白β-衍生的可扩散配体(ADDL)与神经元结合的推定的治疗药的方法，所述方法包括：
(a) 在药物存在时使包含神经元的组合物与ADDL接触；
(b) 使所述组合物与分离的抗ADDL抗体或其抗原结合片段接触；和
(c) 在所述药物存在时检测抗体或抗原结合片段的结合量，
其中与在所述药物不存在时的抗体结合量相比，在所述药物存在时抗体或抗原结合片段的结合量降低，表明所述药物就是用于减少ADDL与神经元结合的推定的治疗药。
本发明的另一个实施方案是用于检测样品中的ADDL的方法，所述方法包括使样品与分离的抗ADDL抗体或其抗原结合片段接触，并测定包含ADDL和所述抗体或抗原结合片段的复合物的存在。
本发明的另一个实施方案是用于诊断ADDL相关疾病的方法，所述方法包括使样品与分离的抗ADDL抗体或其抗原结合片段接触，并测定包含ADDL和所述分离的抗体或抗原结合片段的复合物的存在，其中所述复合物存在就诊断为ADDL相关疾病。
本发明的再一个实施方案是用于检测ADDL的药盒，所述药盒包含能结合ADDL的分离的抗ADDL抗体或其抗原结合片段。
能差异识别Aβ-衍生的可扩散配体(ADDL)的多维构象的单克隆抗体是本领域已知的(参见美国专利号7,780,963、美国专利号7,731,962和美国专利号7,811,563，其通过引用全部结合在本文中)，并且已经证明在基于细胞的测定中能减少ADDL与神经元结合。抗ADDL抗体能区分阿尔茨海默病(AD)和对照人脑提取物，能鉴定AD脑切片中和海马细胞上的内源寡聚体，并能中和溶液中的内源的和合成的ADDL。抗ADDL抗体特异性结合ADDL的一种或多种多维构象，结合衍生自Aβ42寡聚化的特定ADDL，同时对其它Aβ肽(包括Aβ1-40)具有减少的亲和力。
本发明涉及优先结合ADDL并按其对ADDL的特异性和选择性而表征的抗ADDL抗体，尤其是抗体17.1、14.2、13.1、19.3、19.3T33、19.3S33、7.2、9.2和11.4。重要的是，本发明的这些抗ADDL抗体的特异性和选择性不能根据它们所结合的Aβ线性表位来预测，也不能通过蛋白质印迹检测ADDL的能力而预测该活性，也不能根据它们检测与神经元结合的经免疫染色的ADDL的能力来预测。此外，本发明的抗ADDL抗体中和ADDL和阻断与原代海马神经元结合的差异能力支持了以下观点：抗ADDL抗体通过与更多相关的构象表位结合而起作用，其阻止了ADDL与神经元结合。本发明的一个实施方案中，抗ADDL抗体19.3，不仅阻断ADDL与原代神经元的结合，而且减少ADDL-诱导的海马棘(hippocampal spine)形态学变化，表明ADDL-神经结合的阻抗(impedance)具有显著的生理结果，例如神经元存活、神经元连通性和信号转导。当在体外和体内模型中评价时，与先前已知的抗ADDL抗体3B3相比，抗ADDL抗体19.3也具有改善的药物动力学(PK)性质。另外，当给予过量表达淀粉样蛋白前体蛋白(hAPP)的人形式的转基因小鼠时，抗ADDL抗体19.3显示出穿透血脑屏障并在脑部浓缩。因为ADDL位于脑部并在其中对神经元功能起到不良作用，所以本领域技术人员将会理解和知道，抗体在脑部的穿透和浓缩对于免疫治疗而言是有益的。归纳起来，这些数据表明，选择性抗ADDL抗体例如抗体19.3可阻断ADDL与在学习和记忆中至关重要的海马神经元结合。
抗ADDL抗体在治疗AD中的应用是根据越来越多的证据表明ADDL、而非淀粉样蛋白斑块本身，在该病相关的认知下降中起到基本作用(Walsh和Selkoe, 2004, Protein Pept. Lett., 11: 213-228)。当经中枢给予啮齿类时，ADDL在AD脑中升高并导致行为和电生理终点的缺陷(Walsh等, 2002, Nature, 416: 535-539；Cleary等, 2004, Nat. Neurosci., 8: 79-84；Klyubin等, 2005, Nat. Med., 11: 556-561；Balducci等, 2010, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107: 2295-2300)。在表达hAPP的小鼠模型中也已观察到学习和记忆上的缺陷，并伴随升高的ADDL水平相关的损害发作(Westerman等, 2002, J. Neurosci., 22: 1858-1867；Ashe, 2005, Biochem. Soc. Trans., 33: 591-594；Lee等, 2005, J. Biol. Chem., 281: 4292-4299；Lesne等, 2006, Nature, 440: 352-357)。虽然并未完全了解介导这些对认知的影响的细胞和亚细胞事件，但是很清楚，ADDL与位于海马神经元的树突突起上的突触末端结合(Lacore等, 2004, J. Neurosci., 24: 10191-1022)并改变树突棘(dendritic spine)的形态和数量(Lacor等, 2007, J. Neurosci., 27: 796-807；Shankar等, 2007, J. Neurosci., 27: 2866-2875；Shughrue等, 2010, Neurobiol. Aging, 31: 189-202)。发现ADDL同时与海马中的GABA能神经元和谷氨酸神经元结合(Shughrue等, 2010)，神经元至关重要地涉及学习和记忆，其导致AMPA受体的内在化(Zhao等, 2010, J. Biol. Chem., 285: 7619-7632)进一步支持了以下观点：ADDL直接或间接调节这些神经递质系统(参见例如Venkitaramani等, 2007, J. Neurosci., 27: 11832-11837)。
在本发明中，评价了衍生自抗ADDL抗体3B3的一组抗ADDL抗体(美国专利号7,780,963和美国专利号7,811,563，其通过引用全部结合到本文中)阻断ADDL与原代海马神经元结合的能力。然后所选单克隆抗体经过人源化和亲和力成熟，用于进一步表征。用three-pronged ELISA，在单一浓度下，对于按其与ADDL结合的能力而选择的先导抗体(Lead antibodies)进行进一步评价，以测定抗体与单体Aβ、ADDL和纤维状Aβ的结合。如图1所示，当与单体Aβ和纤维状Aβ相比时，7种亲和力成熟的抗ADDL抗体中有6种(具体是抗体14.2、7.2、11.4、13.1、17.1和19.3)是ADDL优选的。随后，用11点滴定曲线和ELISA来确定抗ADDL抗体与宽范围浓度的ADDL和单体Aβ (Aβ1-40)的结合亲和力。如图2所示，抗ADDL抗体3B3和19.3具有高度ADDL选择性。另外，在基于细胞的结合测定中比较抗体以测定抗体阻断ADDL与神经元结合的能力。如图3所示，将与增加浓度的抗ADDL抗体3B3和19.3预孵育的ADDL加入到原代海马神经元中，再用滴定曲线定量显示抗体阻断ADDL与神经元结合的能力。归纳起来，这些结果表明，在基于细胞的形式中，抗ADDL抗体极大减弱神经元结合。
进行了对氨基酸序列的评价，以鉴定脱酰胺作用的潜在位置。已知治疗性抗体的CDR中存在的天冬酰胺残基和天冬氨酸残基经历脱酰胺作用和异天冬氨酸形成(Valsak和Ionescu, 2008, Curr.Pharm.Biotech., 9:468-481；Aswad等, 2000, J. Pharm.Biomed.Anal., 21:1129-1136)，其形成可改变抗体的结合能力，继而降低了抗体用作治疗药的有效性。因此，本领域技术人员将会知道和理解，在19.3抗体的CDR内天冬酰胺或天冬氨酸的存在并不是想要的。因此，申请人改变轻链CDR1位置33的天冬酰胺残基，以优化抗ADDL抗体19.3的稳定性(表4B)。得到了用丝氨酸(SEQ ID NO: 55)、苏氨酸(SEQ ID NO: 56)或谷氨酸(SEQ ID NO: 67)取代CDR1中位置33的天冬酰胺 (SEQ ID NO: 1)的19.3抗体衍生物。也制备了用天冬氨酸(SEQ ID NO: 68)取代位置33的天冬酰胺，用作对照。这些改变将消除在CDR1中位置33的天冬酰胺的脱酰胺作用的可能性。如实施例3所述产生19.3衍生物并如实施例4所述表征为具有丝氨酸(SEQ ID NO: 55)、苏氨酸(SEQ ID NO: 56)、谷氨酸(SEQ ID NO: 67)和天冬氨酸(SEQ ID NO: 68) 取代的衍生物，以评价新构建体的稳定性。分别如图4B和图4C所示，2种代表性的衍生物19.3S33 (SEQ ID NO: 55)和19.3T33 (SEQ ID NO: 56)，在不同温度下孵育1个月之后，具有增强的结合稳定性。在轻链CDR1中对位置33和35的天冬酰胺 (SEQ ID NO: 53)以及在轻链CDR2中对位置58的天冬酰胺的其它氨基酸取代(SEQ ID NO: 54)在表4B和表4C中给出，用于进一步评价。
为了测定本发明的亲和力成熟的抗ADDL抗体的药物动力学，进行了一系列体外和体内研究。抗体与FcRn受体在pH 6.0的结合证明可预测抗体在人体内的半衰期(Zalevsky等, 2010, Nat. Biotech., 28(2): 157-159)和在pH 7.3 (USSN 61/307,182)。用无标记相互作用分析(label free interaction analysis)评价本发明的抗ADDL抗体与固定化人FcRn的结合和解离，所述分析例如由Biacore™ Life Sciences, Biacore™ T-100 (GE Healthcare, Piscataway, NJ)所提供。使用经调整的传感图显示在pH 6.0开始结合，然后在pH 7.3从180秒抗体解离。报告点(稳定性)插在pH 6.0结合结束后5秒，“%结合”计算为RU稳定性/RU结合(%)。如图5所示，人源化3B3的解离速率(off-rate)比7种本发明的抗ADDL抗体(包括抗体19.3)和3种参比抗体明显更缓慢。因为缓慢的解离速率被认为代表了不良体内PK，所以在转基因FcRn小鼠(杂合276人FcRn小鼠, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)中进行了额外的体内研究。当转基因FcRn小鼠接受10 mg/kg静脉内(IV)的抗ADDL抗体3B3或19.3时，检测到药物动力学上的显著差异。如图7所示，抗ADDL抗体3B3的半衰期(t½)相当短(29 9小时)，这与来自体外Biacore™数据的预测是一致的，而抗ADDL抗体19.3的半衰期明显更长(77 6小时)。通常，会将不良PK(如抗体3B3所示)排除掉，因为其生物利用度短，所以就不进一步进行抗体用作治疗药的开发。
为了在灵长类中证实所预测的抗ADDL抗体19.3的半衰期，在一组小脑延髓池端口受控的猕猴中对抗体进行灵长类药物动力学研究。动物接受单次静脉内(IV)推注或皮下(SC)注射抗ADDL抗体19.3 (5 mg/kg)，在给予抗体之后收集血液样品。同时按照一定的时间间隔从小脑延髓池端口收集CSF样品，并用抗人IgG ELISA测定来检测抗ADDL抗体19.3在血清和CSF中的浓度。当动物接受单次IV推注注射的抗ADDL抗体19.3时，观察到t1/2为254 28小时(图8)，而皮下给药则观察到t1/2为204 49小时。另外，申请人发现，抗ADDL抗体19.3能够穿透灵长类CSF，在此，所述抗体在头48小时期间其浓度增加，而峰值在大约0.1%所给予的抗体(图9)。
为了确定穿透血脑屏障并进入CSF和脑的抗体数量，将抗ADDL抗体19.3和2种参比抗体(Comp 1和Comp 2)加上125I-标记并给予过量表达hAPP的老龄(12月龄)小鼠，其是啮齿类AD模型。在IV给予后2小时，大约0.02%抗体19.3出现在CSF中(图10A)，而大约0.19%抗体19.3出现在脑中(图10B)。在2种参比抗体中也观察到类似水平(图10A和10B)。当对给药小鼠脑切片进行免疫细胞化学分析并确定抗ADDL抗体19.3的定位时(图10C中的箭头)，观察到Aβ在斑块中沉积的相关的抗体浓度(图10D)。这表明抗ADDL抗体19.3穿透CSF并在脑内浓缩。最近证明当给予过量表达hAPP的小鼠时，外源ADDL沉积在斑块中(Gaspar等, 2010, Exp. Neurol., 223: 394-400)。因此，本文的发现证实局域性的抗ADDL抗体19.3与斑块相关的循环ADDL结合。
为了进一步评价抗ADDL抗体的体内功效，在向12月龄小鼠的海马每周输注生物素化ADDL (bADDL)4次以标记现有斑块后，在hAPP转基因小鼠中评价了抗体19.3阻断ADDLS在生长斑块中沉积的能力(图11A)。动物接受4次每周静脉内输注的抗体19.3 (图11A)。通过免疫细胞化学分析评价新物质(ADDL)向生长的斑块中的沉积。如图11B和图11C所示，与仅用溶媒治疗的小鼠相比(图11B)，抗ADDL抗体19.3显著减少ADDL向现有斑块外围的沉积(图11C)。归纳起来，这些结果表明抗ADDL抗体、尤其是19.3抗体，能够穿透血脑屏障，结合ADDL，并阻断新物质向生长的斑块中沉积。
ADDL结合对神经元也可能具有长期影响。最近的研究证明ADDL与海马神经元的结合可启动信号转导级联，导致τ磷酸化(De Felice等, 2006, Neurobiol. Aging, 29: 394-400)。该信号转导级联的一个成分GSK-3β也已证明在体内和体外受到ADDL结合的调节(Ma等, 2006, J. Neurosci. Res., 83: 374-384)。Ma等(2006)发现用减少ADDL的抗体被动免疫hAPP小鼠也能减少皮质中的GSK-3β水平和τ磷酸化。该发现支持Aβ和磷酸化τ之间的联系并表明ADDL结合可触发导致τ的胞内聚集的事件。此外，数据表明能阻止ADDL与神经元结合和突触棘相关缺损的抗体，例如本发明的抗体，能改善阿尔茨海默病和相关疾病相关的认知和/或病理结果。
差异识别Aβ-衍生的可扩散配体即ADDL的多维构象的单克隆抗体现在已经产生。这些抗体是人源化的，并且在某些实施方案中，是亲和力成熟的。抗体有利地区分阿尔茨海默病和对照人脑提取物，并在阿尔茨海默病脑切片和在培养的海马细胞中鉴定内源寡聚体。此外，本发明的抗体中和溶液中的内源的和合成的ADDL。所谓“合成”ADDL是通过在产生ADDL的条件下将纯化Aβ1-42混合而在体外产生的。参见美国专利号6,218,506。本文所公开的抗体对ADDL表现出高度选择性，同时对单体Aβ种类具有最少检测。此外，这些抗体差异阻断了含DDL的制备物与大鼠海马神经元原代培养物和无限增殖的成神经细胞瘤细胞系的结合能力，并且也阻断了ADDL聚集。该发现表明，这些抗体具有识别ADDLs多维构象的差异能力，尽管具有类似的线性序列识别和亲和性。因为ADDL已知与神经元亚类相关并破坏正常神经元功能，所以本发明的抗体可用于阻止ADDL与神经元结合和ADDL聚集，并且继而可用于治疗ADDL相关疾病，包括阿尔茨海默病。
因此，本发明的一个实施方案是差异识别ADDL的一种或多种多维构象的分离的抗体。本发明的“分离的抗体”是指基本不含其它抗体的抗体。然而，所述分子可包含对抗体基本性质(例如结合特异性、中和活性等)没有有害影响的某些额外试剂或部分。
一种抗体，其能够特异性结合ADDL的一种或多种多维构象，结合从Aβ1-42寡聚化衍生而来的特定ADDL，但不与其它Aβ肽(即Aβ1-12、Aβ1-28、Aβ1-40和Aβ12-28)发生交叉反应，正如本文所公开的蛋白质印迹分析所测定的那样，并且在溶液中优先结合ADDL。两个实体间的特异性结合通常是指亲和力为至少106、107、108、109或1010 M-1。为了达到特异性结合，最好亲和力大于108 M-1。
在具体的实施方案中，能够特异性结合一种或多种ADDL的多维构象的抗体也是针对ADDL的多维构象而引发的(即用其免疫动物)。在其他实施方案中，能够特异性结合一种或多种ADDL的多维构象的抗体是针对低-n聚体形成肽例如Aβ1-42[Nle35-Dpro37]而引发的。
术语“表位”是指抗原上与B细胞和/或T细胞反应的位点，或分子上将针对其而产生抗体的位点，和/或抗体将与其结合的位点。例如，表位可被限定该表位的抗体所识别。
线性的表位是其中氨基酸一级序列包含被识别表位的表位。线性的表位典型地在独特序列中包含至少3个、更通常至少5个、例如大约6至10个氨基酸。
构象表位与线性表位相反，是其中含表位的氨基酸的一级序列不是被识别的表位的唯一界定因素的表位(例如，其中氨基酸的一级序列不一定被限定表位的抗体所识别的表位)。通常，构象表位相对于线性表位来说含有更多数量的氨基酸。在构象表位的识别方面，抗体识别肽或蛋白的三维结构。例如，当蛋白分子折叠形成三维结构时，某些形成构象表位的氨基酸和/或多肽主链变得并列(juxtaposed)，从而使抗体识别表位。确定表位构象的方法包括但不限于例如x-射线晶体照相术、二维核磁共振光谱术和定点旋转标记和电子顺磁共振光谱术。参见例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996) 第66卷, Morris (编辑)。
淀粉样蛋白β-衍生的可扩散配体或ADDL是指Aβ1-42的可溶性寡聚体，理想情况下其含有少于8或9个Aβ1-42肽的聚合体，并发现其与阿尔茨海默病相关。这与高分子量聚合中间体相反，它们形成胶束的链，导致原纤维的形成。这正好与高分子量聚集中间产物相反，其形成胶束，导致原纤维形成。
正如本文所说，本发明的抗体结合或识别ADDL的至少一种多维构象。在具体的实施方案中，所述抗体结合ADDL的至少2、至少3、或至少4种多维构象。ADDL的多维构象包含了二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体、十聚体等，正如通过SDS-PAGE分析所确定的那样。因为三聚体、四聚体等名称可随所用测定方法的不同而异(参见例如Bitan等, 2005, Amyloid, 12:88-95)，本文所用的三聚体、四聚体的定义是按照SDS-PAGE分析。为了说明本文的抗体的差异结合能力，已经发现某些抗体将识别ADDL的一种多维构象，例如ADDL的四聚体(美国专利号7,780,963、鼠抗体2D6和4E2)，而其它抗体识别ADDL的几种多维构象，例如ADDL的三聚体和四聚体(美国专利号7,780,963，鼠抗体2A10、2B4、5F10和20C2和人源化抗体20C2)。因此，本发明的抗体具有寡聚体-特异性的性质。在具体的实施方案中，ADDL的多维构象与特定多肽结构相关，该结构产生了被本发明抗体所识别的构象表位。在其它实施方案中，本发明的抗体与大小范围大约为三聚体或四聚体、分子量>50 kDa的多维构象ADDL特异性结合。
尽管本发明的抗体可具有类似的线性表位，但这样的线性表位并不完全表示这些抗体的结合性质，即阻断ADDL与神经元结合、阻止τ磷酸化和抑制ADDL聚集的能力，因为，技术人员众所周知的是，线性表位仅对应于一部分抗原表位(参见例如Breitling和Dübel, 1999, Recombinant Antibodies, John Wiley & Sons, Inc., NY, pg. 115)。本发明的抗体可以与本领域内其它抗体区分开来，因为它们能差异性地识别多维ADDL，并因此能差异性地阻断ADDL与神经元的结合，差异性地防止τ磷酸化和差异地抑制ADDL的聚集。
本文所用的抗体包括但不限于多克隆抗体或单克隆抗体、以及嵌合抗体、人抗体(例如分离自B细胞的)、人源化抗体、中和抗体、双特异性抗体或其单链抗体。在一个实施方案中，本发明的抗体是单克隆抗体。为了产生抗体，可通过用合成的或天然的ADDL注射来免疫各种宿主，包括山羊、兔、鸡、大鼠、小鼠、人等。产生抗体的方法是本领域众所周知的。参见例如Kohler和Milstein, 1975, Nature, 256:495-497: Harlow和Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988。
根据宿主的种类，可使用不同佐剂以增强免疫反应。用于本发明的佐剂最好能够增强对ADDL的固有反应，而不引起免疫原中的构象变化，从而影响反应的定性形式。特别合适的佐剂包括3-脱氧-酰化单磷酰脂A (MPL™；RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton, MT；参见GB 2220211)和水包油乳剂，例如鲨烯或花生油，任选与免疫刺激剂组合使用，例如单磷酰脂A (参见Stoute等, 1997, N. Engl. J. Med., 336:86-91)、胞壁酰肽(例如，N-乙酰基胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1'-2'二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰基氧)-乙胺(E-PE)、N-乙酰基葡糖胺基-N-乙酰基胞壁酰-L-Al-D-异谷氨酰-L-Ala-二棕榈酰丙胺(DTP-DPP))、或其它细菌细胞壁成分。水包油乳剂的具体实例包括MF59 (WO 90/14837)，含有5%鲨烯、0.5% Tween™ 80和0.5% Span 85 (任选含有不同量的MTP-PE)，使用微量流化器例如Model 110Y流化器(Microfluidics, Newton, MA)制成亚微米级颗粒；SAF，含有10%鲨烯、0.4% Tween™ 80、5% pluronic®-嵌段聚合物L121和thr-MDP，可通过微量流化成亚微米级乳剂，也可振荡以产生较大粒径的乳剂；和Ribi™佐剂系统(RAS) (Ribi ImmunoChem, Hamilton, MT)，含有2%鲨烯、0.2% Tween™ 80和一种或多种细菌细胞壁成分例如单磷酰脂A、二霉酸海藻糖(TDM)和细胞壁骨架(CWS)。
另一类佐剂是皂苷佐剂，例如Stimulon™ (QS-21, Aquila, Framingham, MA)或从其产生的颗粒例如ISCOM (免疫刺激复合物)和ISCOMATRIX® (CSL Ltd., Parkville, Australia)。其它合适佐剂包括完全弗氏佐剂(CFA)、不完全弗氏佐剂(IFA)、矿物凝胶例如氢氧化铝、以及表面活性物质例如溶血卵磷脂、pluronic®多元醇、多聚阴离子、肽、CpG (WO 98/40100)、匙孔血蓝蛋白、二硝基苯酚和细胞因子例如白介素(IL-1、IL-2和IL-12)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和肿瘤坏死因子(TNF)。在用于人的佐剂中，BCG (卡介苗)和小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)特别适合。
针对多维构象ADDL的抗体是通过用ADDL免疫动物而产生的。通常，可经合成或重组片段表达并纯化而产生ADDL。合成ADDL可按照本文所公开的方法或根据美国专利号6,218,506和7,811,563或同时待审的申请U.S. 2007/0218499、U.S. 2010/0143396和U.S. 2010/0240868所公开的方法来制备，所有这些文献都通过引用全部结合到本文中。此外，可将ADDL与其它蛋白例如匙孔血蓝蛋白融合而产生针对嵌合分子的抗体。可在构象上限制ADDL以形成如本文所述的那样有用的表位，此外可将ADDL与某种表面缔合，例如以允许产生能够被本发明抗体识别的构象的方式物理连接或化学键合到某表面。
针对ADDL多维构象的单克隆抗体可使用任何通过在培养物中的连续细胞系提供抗体分子生产的技术来制备。这些技术包括但不限于杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术和EBV-杂交瘤技术(Kohler等,1975, Nature 256:495-497；Kozbor等, 1985, J. Immunol. Methods 81:31-42；Cote等, 1983, Proc.Natl.Acad.Sci. 80:2026-2030；Cole等, 1984, Mol. Cell Biol. 62:109-120)。
在具体的实施方案中，本发明的抗体是人源化抗体。可通过将小鼠抗体基因与人抗体基因剪接而获得具有合适的抗原特异性和生物活性的分子来产生人源化抗体或嵌合抗体(参见Morrison等, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 6851-6855；Neuberger等, 1984, Nature 312:604-608；Takeda等, 1985, Nature 314:452-454；Queen等, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033；WO 90/07861)。例如，将小鼠抗体在噬菌体选择载体中表达为Fv或Fab片段。轻链的基因(以及在平行实验中为重链的基因)与人抗体基因文库交换。然后鉴定仍能结合抗原的噬菌体抗体。该方法通常称为链重排(chain shuffling)，提供的人源化抗体将能与其来源的小鼠抗体结合相同的表位(Jespers等, 1994, Biotechnology NY12:899-903)。作为可选方法，链重排也可在蛋白水平上进行(参见Figini等, 1994, J. Mol. Biol.239:68-78)。
人抗体也可使用噬菌体展示方法而获取。参见例如WO 91/17271和WO 92/01047。在这些方法中，产生噬菌体文库，其中各成员在它们的外表面上展示不同抗体。抗体通常被展示为Fv或Fab片段。通过对ADDL的亲和力富集选择具有所需特异性的噬菌体展示抗体。针对ADDL的人抗体也可以从非人类转基因哺乳动物产生，所述动物具有编码至少一段人免疫球蛋白基因座和失活的内源免疫球蛋白基因座的转基因。参见例如WO 93/12227和WO 91/10741。人抗体可通过竞争性结合实验来选择，或者与特定的小鼠抗体具有相同的表位特异性。这样的抗体通常保留着小鼠抗体的有用的功能性质。人多克隆抗体也可以用经免疫原性试剂免疫的人的血清形式来提供。任选，这样的多克隆抗体可使用ADDL作为亲和试剂通过亲和纯化来浓缩。
如本文所述，人源化抗体也可通过鼠抗体的表面修饰(veneering)或表面重建(resurfacing)来产生。表面修饰包括只用同源人抗体序列表面固定区域的氨基酸替换小鼠重链和轻链可变区中表面固定区域的氨基酸。用同源人序列中同样位置的人残基替代小鼠表面氨基酸，已经证明能降低小鼠抗体的免疫原性，同时保留其配体结合。外部残基的替换对于内部结构域或结构域间的接触一般只有很小影响或没有影响。参见例如美国专利号6,797,492。
人抗体或人源化抗体可被设计为具有IgG、IgD、IgA、IgM或IgE恒定区，以及任何同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在具体的实施方案中，本发明的抗体是IgG或IgM，或其组合。在一个具体的实施方案中，本发明的抗体是IgG2。本领域技术人员将能理解，其它同种型可用于本文。这些同种型的示例性序列在SEQ ID NOS: 43-45中给出。本发明的其它实施方案包括通过将人IgG4序列选择性地整合到标准的人IgG2恒定区中而形成的恒定区。示例性的突变IgG2 Fc是IgG2m4，在本文的SEQ ID NO: 46中给出。抗体可被表达为含有两条轻链和两条重链的四聚体，表达为分离的重链和轻链，或表达为单链抗体，其中重链和轻链可变区通过间隔基连接。产生单链抗体的技术是本领域众所周知的。
通过CDR移植和表面修饰而产生的示例性人源化抗体公开于美国专利号7,780,963、7,731,962和7,811,563。
也考虑了双抗体(diabody)。双抗体是指工程化抗体构建体，其通过以下方式制备：通过将结合抗体的结合结构域(重链和轻链)分离，并提供连接或操作性连接同一多肽链上的重链和轻链的连接部分，从而保留结合功能(参见Holliger等, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444；Poljak, 1994, Structure 2:1121-1123)。这在实质上就形成了极为简化的抗体，只含结合抗原所需的可变区。通过使用非常短的、从而不允许同一条链上的两个结构域间配对的接头，迫使结构域与另一条链上的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。这些二聚体抗体片段或双抗体是二价和双特异性的。技术人员将会理解，产生双抗体的任何方法都可使用。合适的方法描述于Holliger等, 1993, 出处同上；Poljak, 1994, 出处同上；Zhu等, 1996, Biotechnology 14:192-196和美国专利号6,492,123，所述文献都通过引用全部结合到本文中。
本发明分离的抗体的片段也明确地包含在本发明中。片段包括Fab片段、F(ab′)2片段、F(ab′)片段、双特异性scFv片段、Fv片段和Fab表达文库所产生的片段、以及肽适配体(aptamer)。例如，F(ab′)2片段是通过胃蛋白酶消化本发明的抗体分子而产生，而Fab片段则是通过还原F(ab′)2片段的二硫桥而产生。或者，可以构建Fab表达文库以允许快速而容易地鉴定具有所需特异性的单克隆Fab片段(参见Huse等, 1989, Science, 254:1275-1281)。在具体的实施方案中，本发明的抗体片段是保留了中和抗体的可变区结合位点的中和抗体片段，即抗原结合片段。实例是F(ab′)2片段、F(ab′)片段和Fab片段。一般可参见Immunology: Basic Processes, 1985, 第2版, J. Bellanti (Ed.) 第95-97页。
能差异识别ADDL的多维构象的肽适配体可以被合理地设计，或在适配体文库(例如由Aptanomics SA, Lyon, France所提供的文库)中筛选。一般而言，肽适配体是合成的识别分子，其设计基于抗体的结构。肽适配体由可变的肽环构成，其两端与蛋白支架相连。这种双重结构限制极大地增加了肽适配体的结合亲和性，达到了可以与抗体的亲和性相比的水平(纳摩尔范围)。
用于产生本发明抗体和抗体片段的编码重链和轻链可变区的示例性核酸序列在本文中公开在SEQ ID NOS: 14和16。正如技术人员所理解的那样，本文所公开的重链可变区，例如SEQ ID NO: 16所示，可用于与本文所公开的任何一种轻链可变区组合使用，以产生具有修饰的亲和性、解离、表位等的抗体。
本发明的抗体或抗体片段可具有与之连接的额外部分。例如，可将微球体或微粒连接到抗体或抗体片段上，正如美国专利号4,493,825所述，其通过引用全部结合到本文中。
此外，具体实施方案包括这样的抗体或抗体片段：其被突变并筛选以增加抗原亲和性、中和活性(即阻断ADDL与神经元细胞结合的能力或阻断ADDL聚集的能力)、或得到改善的解离常数。大肠杆菌突变株(Low等, 1996, J. Mol. Biol.,260:359-368)、链重排(Figini等, 1994, 出处同上)以及PCR诱变都是已建立的用于突变编码抗体的核酸分子的方法。作为说明，可通过将大量噬菌体抗体与少量生物素化抗原相接触以便抗体竞争结合，来筛选亲和性高的抗体。在这种情况下，抗原分子的数量应当超过噬菌体抗体的数量，但抗原浓度应当稍微低于解离常数。因此，亲和性高的优势突变噬菌体抗体与生物素化抗原结合，而较大部分亲和性较弱的噬菌体抗体保持不结合。然后链霉抗生物素可帮助从混合物中富集具有较高亲和性的突变的噬菌体抗体(Schier等, 1996, J. Mol. Biol.255:28-43)。示例性的亲和力成熟的轻链CDR3 氨基酸序列公开于本文中(参见表4)，其中包括含SEQ ID NO: 3的轻链CDR3氨基酸序列的具体实施方案和SEQ ID NOS: 7-13的具体的实施方案。本发明也包括轻链CDR1 (SEQ ID NO: 53)和CDR2 (SEQ ID NO: 54)的替代变型。
对于某些治疗应用来说，最好能减少抗体从抗原上的解离。为了达到这一点，将噬菌体抗体与生物素化抗原结合并添加过量的未生物素化抗原。过一段时间之后，可用链霉抗生物素来主要收获具有较低解离常数的噬菌体抗体(Hawkins等, 1992, J. Mol. Biol.226:889-96)。
可使用各种免疫测定包括本文所公开的那些进行筛选，以鉴定对ADDL的多维构象具有所需特异性的抗体或其片段。用于竞争结合(例如ELISA)、乳胶凝集测定、免疫放射测定、使用多克隆抗体或单克隆抗体或其片段的动力学(例如BiacoreTM分析)的大量方案是本领域众所周知的。这样的免疫测定通常包括测定特定抗体及其关联抗原(cognate antigen)间的复合物形成。使用能与两个互相无干扰的表位反应的单克隆抗体的双位点的基于单克隆抗体的免疫测定是合适的，但也可使用竞争结合测定。这样的测定也可用于检测样品中ADDL的多维构象。
抗体或抗体片段也可进行其它生物活性测定，例如替代ADDL与神经元或培养的海马细胞结合或者阻断ADDL聚集，以评价中和活性或药理学活性和作为预防药或治疗药的潜在功效。这样的测定描述于本文中并且是本领域众所周知的。
抗体和抗体片段可作为杂交瘤生产和维持，或可在任何已建立的表达系统中重组产生，这些表达系统包括但不限于大肠杆菌、酵母(例如Saccharomyces spp.和Pichia spp.)、杆状病毒、哺乳动物细胞(例如骨髓瘤、CHO、COS)、植物或转基因动物(Breitling和Dübel, 1999, Recombinant Antibodies, John Wiley & Sons, Inc., NY, pp. 119-132)。可使用任何合适方法分离抗体和抗体片段，所述方法包括但不限于亲和色谱、免疫球蛋白结合分子(例如蛋白A、L、G或H)、与抗体或抗体片段操作性连接的标签(例如His标签、FLAG®标签、Strep标签、c-myc标签)等。参见Breitling和Dübel, 1999出处同上。
本发明的抗体和抗体片段具有各种用途，包括诊断ADDL积累相关的疾病，阻断或抑制ADDL与神经元细胞的结合，阻断ADDL聚集，预防性或治疗性治疗ADDL相关疾病，鉴定能阻止ADDL与神经元结合以及阻止τ蛋白在Ser202/Thr205位置的磷酸化的治疗药。
本发明的抗体和抗体片段可用于阻断或抑制ADDL与神经元细胞结合的方法。本发明的这一方法的执行是通过在体外或体内使神经元与本发明的抗体或抗体片段接触，从而阻断ADDL与神经元的结合。在具体的实施方案中，本发明的抗体或抗体片段使ADDL的结合与不存在抗体或抗体片段的情况下ADDL的结合相比减少了至少15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或97%。抗体阻断ADDL与神经元结合的程度可按照本文所公开的方法来测定，即免疫细胞化学或基于细胞的碱性磷酸酶测定或任何其它合适的测定。降低ADDL与神经元细胞结合的特别有用的抗体包括美国专利号7,731,962、7,780,963和7,811,563所示的示例性抗ADDL抗体、及其衍生物和其片段。
本发明的抗体和抗体片段还可用于阻断或抑制ADDL聚集的方法。该方法包括使含有淀粉样蛋白β 1-42肽的样品与本发明的抗体或抗体片段接触以便ADDL的聚集被抑制。抗体阻断ADDL聚集的程度可按照本文所公开的方法测定，即FRET或荧光偏振或任何其它合适的测定。阻断ADDL聚集的特别有用的抗体包括具有SEQ ID NO: 10所示的CDR3氨基酸序列的抗ADDL抗体、及其衍生物和其片段。
本文所公开的抗体还可用于阻止τ蛋白在Ser202/Thr205位置的磷酸化的方法。该方法包括使含有τ蛋白的样品与本发明的抗体或抗体片段接触，以便ADDL与神经元的结合被阻断，从而阻止τ蛋白磷酸化。抗体阻止τ蛋白在Ser202/Thr205位置的磷酸化的程度可根据本文所公开的方法或其它任何合适的测定来确定。
阻断或降低ADDL与神经元的结合，抑制ADDL的聚集，和阻止τ蛋白在Ser202/Thr205位置的磷酸化，都可在预防性或治疗性治疗ADDL积累相关疾病的方法中找到用途。因此，本发明也包括使用本文的抗体或抗体片段以预防或治疗ADDL积累相关的疾病(例如阿尔茨海默病或类似的记忆相关障碍)。本领域的证据表明Aβ水平升高、但不一定是斑块聚集，可引起阿尔茨海默病相关的痴呆和随后的τ异常。Aβ-衍生的可扩散配体与阿尔茨海默病相关的神经毒性直接相关。本领域指出在转基因小鼠和阿尔茨海默病患者中ADDL升高并且在动物模型中调节记忆过程相关的功能活性。因此，去除这种形式的Aβ可缓解阿尔茨海默病相关的神经毒性。因此，用能降低中枢神经系统ADDL负荷的本发明抗体进行治疗，在阿尔茨海默病的治疗中证明是有效的。可以治疗的患者包括有疾病风险但未表现出症状的个体，以及目前已经表现出症状的患者。就阿尔茨海默病而言，事实上任何人都有患阿尔茨海默病的风险，只要他或她活得足够长。因此，本发明的抗体或抗体片段可无需对受试患者进行任何风险评价就预防性地给予普通人群。本方法对于已知具有阿尔茨海默病遗传风险的个体来说特别有用。这些个体包括其亲属已经被诊断患有该病，以及其风险已经通过遗传标记或生物化学标记确定了的个体。阿尔茨海默病风险的遗传标记包括APP基因中的突变，尤其是在位置717以及位置670和671分别被称为Hardy和Swedish的突变。其它风险标记是早老蛋白基因PS1和PS2以及ApoE4中的突变、阿尔茨海默病家族史、高胆固醇血症或动脉粥样硬化。目前患有阿尔茨海默病的个体可根据特征性的痴呆以及上述风险因子的存在来识别。另外，有多种诊断测试可用于鉴定患有阿尔茨海默病的个体。这包括测定CSF τ和Aβ1-42水平。患有阿尔茨海默病的个体也可通过ADRDA标准或本文所公开的方法来诊断。
在无症状的患者中，治疗可以在任何年龄(例如10、20、30岁)开始。但是，通常来说在患者达到40、50、60或70岁前不一定开始治疗。治疗通常需要在一段时间内使用多个剂量。可通过测定ADDL随时间的存在而监测治疗。
在治疗应用中，将含有本发明抗体或抗体片段的药物组合物或药物给予疑似或已经患有ADDL积累相关疾病的患者，其用量足以治愈或至少部分阻止疾病的症状(生物化学、组织学和/或行为学的症状)，包括其在疾病发展过程中的并发症和中间病理表现型。在预防性应用中，将含有本发明抗体或抗体片段的药物组合物或药物给予疑似患有ADDL积累相关疾病或具有这样的疾病风险的患者，其用量足以在患者中实现被动免疫，从而消除或减少风险，降低严重程度，或延迟疾病的发作，包括疾病的生物化学、组织学和/或行为学的症状，其在疾病发展过程中的并发症和中间病理表现型。在某些方法中，在尚未发展出特征性阿尔茨海默病病理学的患者中给药能降低或消除肌认知减退(myocognitive impairment)。在具体的实施方案中，本发明抗体或抗体片段的有效量是在患者中能够使ADDL与神经元的结合与未经治疗时ADDL的结合相比减少至少15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或97%。因此，降低了长期增强作用(potentiation)/记忆形成的损伤。
用于治疗上述病症的本发明组合物的有效剂量随许多不同因素的变化而变，包括给药方式、患者的生理状态、患者是人还是动物、所给予的其它药物、以及治疗是预防性的还是治疗性的。通常，患者是人，但也可治疗非人类哺乳动物，例如狗或转基因哺乳动物。
通常滴定(titrate)治疗剂量以优化安全性和功效。对于使用抗体或抗体片段的被动免疫来说，从大约0.0001至100 mg/kg、更通常0.01至5 mg/kg宿主体重的剂量范围是合适的。例如，剂量可以是1 mg/kg体重或10 mg/kg体重或在1-10 mg/kg范围内。在某些方法中，同时给予具有不同结合特异性的两种或更多种本发明抗体，在这种情况下所给予的每种抗体的剂量都落入指定范围内。通常多次给予抗体，其中每剂间的间隔可以是周、月或年。示例性的治疗方案需要皮下给予，两周一次或每月一次。间隔也可以不规则，按照测定患者中针对ADDL的抗体的血液水平所指定。在某些方法中，调整剂量以获得血浆抗体浓度1-1000 µg/mL，在某些方法中25-300 µg/mL。或者，可以持续释放制剂给予抗体或抗体片段，在这种情况下需要较低频率的给予。剂量和频率根据抗体在患者中的半衰期不同而异。一般而言，人抗体和人源化抗体比嵌合抗体和非人抗体的半衰期更长。如上所述，给药的剂量和频率可根据治疗是预防性还是治疗性的而变化。在预防性应用中，在长时间周期内以相对不频繁的间隔给予相对低的剂量。某些患者在他们的余生中持续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要在相对短的间隔中使用相对高的剂量，直到疾病的发展被减缓或终止，优选直到患者显示出疾病症状的部分或完全改善。之后，可按预防性方案给予患者。
本发明的抗体和抗体片段可作为药物组合物或药物的成分而给予。药物组合物或药物通常含有活性治疗药和各种其它药学上可接受的成分。参见Remington: The Science 和 Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro主编, 第20版. Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2000。优选的形式取决于所需给药方式和治疗性应用。药物组合物可根据所需制剂而含有药学上可接受的无毒载体或稀释剂，它们被定义为常用于配制动物用或人用药物组合物的赋形剂/溶媒(vehicle)。选择稀释剂，使其不影响组合的生物活性。这类稀释剂的实例是蒸馏水、生理磷酸缓冲盐水、林格液、葡萄糖溶液和Hank's溶液。
药物组合物也可含有大的、代谢缓慢的大分子例如蛋白、多糖例如脱乙酰壳多糖、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚物(例如乳胶功能化的sepharose™、琼脂糖、纤维素等)、多聚氨基酸、氨基酸共聚物和脂质聚集物(例如油滴或脂质体)。
本发明药物组合物或药物的给予可通过各种途径进行，包括但不限于口服、局部、肺部、直肠、皮下、皮内、鼻内、颅内、肌内、眼内或鞘内或关节内注射等。最典型的给药途径是静脉内，其次是皮下，尽管其它途径也同样有效。也可在手臂和腿部肌肉内进行肌内注射。在某些方法中，将药物直接注射到沉积物积累的特定组织中，例如颅内注射或鞘内注射。在某些实施方案中，将抗体或抗体片段直接注射到颅骨或CSF。在其它实施方案中，抗体或抗体片段作为持续释放组合物或装置例如Medipad™装置而给予。
对于胃肠外给药，本发明的抗体或抗体片段可作为物质在含有药物载体生理上可接受的稀释剂中的溶液剂或混悬剂的可注射剂型来给予，所述载体可以是无菌液体，例如水、油、盐水、甘油或乙醇。另外，辅料，例如润湿剂或乳化剂、表面活性剂、pH缓冲物质等可存在于组合物中。药物组合物的其它成分是石油来源、动物来源、植物来源或合成来源的组分，例如花生油、大豆油和矿物油。一般而言，二醇类例如丙二醇或聚乙二醇是合适的液体载体，尤其用于注射用溶液剂。抗体可以以长效注射或植入制剂的形式来给予，所述制剂以允许活性成分持续释放的方式配制。
示例性的组合物含有本发明分离的抗体或其抗体片段，其在等渗缓冲盐水(10mM组氨酸、150 mM氯化钠、0.01% (w/v)聚山梨酯 80, pH 6.0)中配制为无菌澄清液体，浓度至少10 mg/ml。示例性的抗体制剂以单剂量填充，0.6 ml玻璃管中每管填充3.3 ml溶液。各管用Teflon-包被的塞子塞住并用铝帽密封。
通常，将组合物制备成可注射的，或者是液体溶液剂或者是混悬剂；也可制备固体形式，所述形式适于在注射前在液体溶媒中配制成溶液剂或混悬剂。也可将制剂乳化或包入脂质体或微粒例如聚丙交酯、聚乙交酯或共聚物以增强递送。
对于栓剂，粘合剂和载体包括例如聚亚烷基二醇或甘油三酯；可从含有范围在0.5%至10%、或更好1%-2%的活性成分的混合物来制成这样的栓剂。
口服制剂包含赋形剂，例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素和碳酸镁。这些组合物采取溶液剂、混悬剂、片剂、丸剂、胶囊剂、持续释放制剂或粉剂的形式并含有10%-95%活性成分、或更适宜为25%-70%。
局部应用可导致透皮或皮内递送。可通过与霍乱毒素或其脱毒衍生物或其亚基或其它类似的细菌毒素共同给药而促进局部给药(参见Glenn等(1998) Nature 391:851)。可通过使用作为混合物或作为连接分子(通过化学交联或表达为融合蛋白而获得)的成分来实现共同给药。
或者，可使用皮肤途径或使用转染体(transferosome)达到透皮递送(Paul等, 1995, Eur. J. Immunol. 25:3521-3524；Cevc等, 1998, Biochem. Biophys. Acta 1368:201-215)。
本发明的抗体或抗体片段任选可与在淀粉样蛋白源性疾病的治疗中至少部分有效的其它药物联合给予。例如，本发明的抗体可与现有阿尔茨海默病姑息治疗(palliative treatment)一起给予，所述治疗例如乙酰基胆碱酯酶抑制剂例如ARICEPT™、EXELON™和REMINYL™，以及NMDA拮抗剂NAMENDA™。除了这些已批准的治疗之外，本发明抗体还可用于对目前正在开发的用于治疗阿尔茨海默病的若干方法中的任一种提供协同/加和的益处，所述方法包括但不限于Aβ产生和聚集的抑制剂。
本发明的抗体和抗体片段也在鉴定能阻止ADDL与神经元(例如海马细胞)结合、从而阻止ADDL引起的下游事件的治疗药中找到用途。通过在药物存在时使神经元与ADDL接触并使用本发明的抗体或抗体片段来确定在药物存在时ADDL与神经元的结合，而进行这样的测定。正如技术人员将会理解的那样，与未接触药物的神经元相比，阻断ADDL与神经元结合的药物将减少与神经元结合的ADDL的量；这个量可在免疫测定中使用本发明的抗体或抗体片段来检测。检测神经元结合的ADDL的合适免疫测定公开于本文。
可使用本文所提供的方法来筛选的药剂包括大量的化学类别，然而通常它们是有机分子，优选分子量大于100而小于大约2,500道尔顿的小的有机化合物。药剂包含与蛋白发生结构相互作用、尤其是氢键键合所需的官能团，并且通常至少包括胺、羰基、羟基或羧基，优选至少有2个化学官能团。所述药剂通常含有环状碳或杂环结构和/或芳香或多芳香结构，其被一个或多个上述官能团取代。也可在包括以下在内的生物分子中发现药剂：肽、抗体、糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、结构类似物或其组合。药剂可得自广泛来源，包括天然的或合成的化合物文库。
各种其它药剂例如盐和中性蛋白也可包括在筛选测定中。另外，可使用能够提高测定效率的药剂，例如蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、抗微生物剂等。可按任何顺序加入各成分的混合物以提供所需的结合。
通过本发明筛选测定而鉴定的药剂将有益于淀粉样蛋白源性疾病和/或τ蛋白病(tauopathy)的治疗。另外，考虑了用于说明这些概念的实验系统代表了用于评价、鉴定和筛选τ磷酸化的淀粉样蛋白β诱导相关的新药物靶标的研究工具。
本发明也提供使用本文的抗体或抗体片段来检测ADDL和诊断ADDL积累相关疾病的方法。ADDL积累相关疾病包括ADDL积累导致长期增强作用/记忆形成的生理性缺损的任何疾病。该类疾病包括但不限于阿尔茨海默病和类似的记忆相关障碍。
按照这些方法，将患者样品与本发明的抗体或抗体片段接触，抗体或抗体片段与样品的结合表明样品中存在ADDL。当用于本发明中时，样品是指适合于使用免疫测定来分析的任何体液或组织。可按本发明的方法来分析的合适样品包括但不限于来自患者(例如哺乳动物，例如人)脑的活检样品和液体样品。对于体外目的而言(例如在监测寡聚体形成的测定中)，样品可以是神经元细胞系或组织样品。对于诊断目的而言，考虑到样品可来自疑似患有ADDL积累相关疾病的个体或来自处于ADDL积累相关疾病的风险中的个体，例如具有使个体易患ADDL积累相关疾病的家族史的个体。
可使用任何标准免疫测定(例如本文所公开的)对抗体或抗体片段与样品中的ADDL结合情况进行检测，或者当抗体片段为例如肽适配体时，可通过例如与适配体融合的可检测标记蛋白(例如β-半乳糖苷酶、GFP或萤光素酶)来直接检测结合。其后，ADDL-抗体复合物的存在或不存在分别与样品中ADDL的存在或不存在相关联，因此分别与ADDL积累相关疾病的存在或不存在相关联。考虑到本发明的一种或多种抗体或抗体片段可与现有的非侵入性的基于免疫的成像技术联合使用，以极大地增强对ADDL积累相关疾病的检测和早期诊断。
为了便于诊断，本发明还涉及含有本文的抗体或抗体片段的药盒。所述药盒包括装有能识别ADDL多维构象的一种或多种抗体或抗体片段的容器，以及使用所述抗体的说明书，其目的是使ADDL与所述抗体结合以形成抗体-抗原复合物，并检测抗体-抗原复合物的形成以便将抗体-抗原复合物的存在与否与样品中ADDL的存在与否相关联。容器的实例包括允许在多个样品中同时检测ADDL的多孔板。
本文所引用的所有参考文献都通过引用全部结合到本文中。
通过以下非限制性实施例，更详细地描述本发明。
实施例
以下缩略语用于本文：Ab:抗体；Aβ: 淀粉样β蛋白；AD: 阿尔茨海默病；ADDL: 淀粉样蛋白-β (Aβ)-衍生的可扩散配体；Ag:抗原；APP: 淀粉样蛋白前体蛋白；bADDL: 生物素化 ADDL；CSF: 脑脊液；DMSO: 二甲亚砜；hAPP: 人淀粉样蛋白前体蛋白；HAT培养基:次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷培养基；HFIP: 六氟-2-丙醇；IV: 静脉内；LB琼脂: 溶原性肉汤琼脂；SC: 皮下；PBS: 磷酸缓冲盐水；TEA: 三乙胺。
实施例 1
通用材料与方法
A. ADDL单克隆抗体的产生
将可溶性Aβ寡聚体(在本文中称为“合成”ADDL)与完全弗氏佐剂(第一和第二次接种)或不完全弗氏佐剂(所有后续接种)以1:1混合，然后经皮下(前两次接种)或腹膜内注射到3只小鼠中，总体积为1 mL/只。每次注射由相当于194 ± 25 µg总蛋白的纯化ADDL组成。小鼠大约每3周注射一次。6次注射之后，1只小鼠死亡，将其脾脏冷冻。然后在聚乙二醇存在时将具有最高血清滴度的小鼠的脾脏与SP2/0骨髓瘤细胞融合并铺在6个96孔板中。细胞在200 μl次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)选择培养基中于37℃ 5% CO2中培养10天，所述培养基由加富合成培养基例如Iscove's Modified Dulbecco's培养基(IMDM)、(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)组成，其中补充了10%胎牛血清(FBS), 1 µg/mL Hybri-max® (重氮丝氨酸-次黄嘌呤；Sigma-Aldrich, MO)和30%的收集自SP2/0细胞培养的条件培养基。培养物在第10天时用补充有10% FBS的IMDM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)补料一次，在第14天时取出培养上清液，用于在ELISA中筛选阳性孔。阳性培养物通过在概率为每孔0.3个细胞的有限稀释而进一步克隆。阳性克隆在ELISA中证实并进一步扩增。然后产生并纯化单克隆抗体备用(QED Bioscience, San Diego, CA)。
B. ADDL和bADDL的制备
使用前述方法制备ADDL (Hepler等, 2006, Biochemistry, 45: 15157-15167；Shughrue等, 2010, Neurobiol. Aging, 31: 189-202)。简而言之，将合成的Aβ1-42肽 (AmericanPeptide, Sunnyvale, CA)溶于六氟-2-丙醇 (HFIP)，浓度为10 mg/ml，然后在室温下 (RT)孵育1小时。将该肽溶液分成50 µl等分试样装入聚丙烯 1.5 ml微量离心管中。用SpeedVac® (Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA)除去HFIP，所得肽薄膜干燥贮存在-70℃备用。将0.5 mg干燥HFIP膜溶于22 µl无水二甲亚砜 (DMSO)并在涡旋混合器上搅拌10 分钟。然后将1 ml冷的无酚红的Ham’s F12培养基(United Biosource, San Francisco, CA)快速加入到DMSO/肽混合物中。盖上该管，上下颠转以确保完全混合并在4℃孵育过夜。次日早晨将样品在2-8℃操作的Beckman微量离心机(Beckman Coulter, Brea, CA)中以12,000 x g离心10分钟。收集上清液并通过ym 50 (50,000 kDa分子量截留) Centricon®离心过滤器(Millipore, Billerica, MA)过滤，以富集寡聚类型。用同样方法制备生物素化 ADDL (bADDL)，但自N-端生物素化 Aβ1-42肽(American Peptide, Sunnyvale, CA)开始。
C. 单体和原纤维的制备
为了产生单体制备物，以每mg肽2 mL 25 mM硼酸缓冲液(pH 8.5)将RT Aβ1-40或Aβ1-42肽薄膜溶解，分为等分试样，并在-70℃冷冻备用。通过加入2 mL 10 mM盐酸/mg Aβ1-42肽薄膜来制备原纤维制备物。将溶液在涡旋混合器上以可能的最低速度混合5-10分钟，将所得制备物在使用前在37℃贮存18-24小时。
D. 原代神经元
从购自BrainBits (Springfield, IL)的大鼠海马和/或皮层组织制备原代神经元培养物。解离之后，将细胞以35,000 细胞/孔接种在预先包被层粘连蛋白和聚-D-赖氨酸的96孔板(Corning Life Sciences, Lowell, MA)中。将细胞在培养基(补充有2% B27, 1% L-谷氨酰胺和1% pen/strep的Neurobasal ；Invitrogen, Carlsbad, CA)中在37℃
5% CO2维持2-3周，然后用于结合研究。
E. 基于细胞的ADDL结合测定
为了测定抗ADDL抗体对阻断ADDL结合上的效果，将抗ADDL抗体与500nM bADDL混合，终抗体浓度范围为1.8nM至450nM。作为对照，将相同浓度的热变性抗体(98ºC 30 分钟)与bADDL混合。将抗体-bADDL混合物在硅化微量离心管(Fischer Scientific, Pittsburgh, PA)中在37℃孵育1小时，并以低速、稳定的端-对-端旋转。然后将混合物施用于原代海马和/或皮层培养物并在37℃孵育1小时。移出培养基，终止孵育。如上所述地对细胞进行固定并在固定后处理。然后将细胞与缀合了碱性磷酸酶(AP)的链霉抗生物素在4℃孵育过夜，用PBS洗涤5次并与Tropix® CDP®-Star化学发光底物(Life Technologies™, Carlsbad, CA) 在室温下反应30 分钟。用EnVision® 微量板读板器(PerkinElmer, Waltham, MA)测定并记录bADDL结合强度。
F. ELISA
将生物素化 ADDL (bADDL)或单体Aβ1-40或Aβ1-42加入到高容量链霉抗生物素-包被的板(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)，所述板包含100 μL/孔的含1 μM包被试剂的PBS，并在室温下孵育2小时。在含有0.05%吐温的PBS中洗涤各板(6次)和然后单独用PBS洗涤(3次)，然后在5%脱脂奶粉的PBS中在室温下1小时封闭各孔。再洗涤各孔并将系列稀释的抗体样品加入各板并在室温下允许结合2小时。孵育和洗涤之后，用与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗人IgG-Fc第二抗体检测抗体结合(1:1,000；在室温下1小时)。HRP标记用四甲基对二氨基联苯(Virolabs, Chantilly, VA)作为底物来显色并在450 nm处在微量板读板器上读数。
实施例 2
抗 ADDL 抗体的选择
A. 淘选人源化抗体文库
构建人源化抗ADDL抗体h3B3的亲和力成熟文库(参见U.S. 2006/0228349和U.S. 2008/0175835)，其中轻链CDR3 氨基酸序列部分经历随机诱变。为了覆盖整个CDR3区，构建2个亚文库。一个文库由亲代重链可变区和在轻链CDR3左半侧的突变氨基酸和在轻链CDR3右半侧的其它突变氨基酸组成。类似策略用于3个亚文库的重链CDR随机诱变。
使用本领域已知方法，对人源化 3B3 (h3B3)进行亲和力成熟。将h3B3 可变区克隆到Fab展示载体(pFab3D)。在该载体中，将重链和轻链的可变区符合读框地插入，以分别匹配恒定区CH1结构域和kappa 恒定区。在Fab3D中，myc 表位和6个连续组氨酸氨基酸接在CH1序列之后，其再与噬菌体pIII蛋白连接，用于展示。使用在PCR 引物中构建的简并寡核苷酸序列，将重链和轻链CDR3中的所有位置都随机诱变。为了适应物理大小，构建亚文库，各自集中在5-6 氨基酸。使用突变PCR引物，人3B3 (H3B3)的载体DNA用作模板DNA以扩增重链和轻链(表1)。PCR扩增之后，合成的DNA片段在1.3% 琼脂糖凝胶上跑胶，除去引物，可变区片段用限制酶消化：BsiWI和XbaI克隆位点用于轻链可变区克隆，XhoI和ApaI用于重链可变区克隆。
表1
为了在pFab3D噬菌体展示载体中构建亲和力成熟文库，pFab3D-3B3 DNA用同样一对限制酶消化，纯化，重链可变区或轻链可变区的PCR片段用 T4连接酶(Invitrogen)在16℃连接过夜。再用连接产物转染大肠杆菌TG1电穿孔-感受态细胞(Stratagene, Agilent Technologies, Santa Clara, CA)并将等分试样的细菌培养物接种在LB琼脂-羧苄西林(50 μg/mL)板，以滴定(titer)文库大小。剩余培养物或者接种在含羧苄西林的大板上并在30℃孵育过夜用于大肠杆菌文库储备，或者用辅助噬菌体M13K07 (Invitrogen, Carlsbad, CA, 1011 pfu/mL)通过在室温下孵育和在37℃孵育10分钟而感染。然后加入含羧苄西林 (50 μg/mL)的2YT培养基并在37℃孵育1小时，同时振荡。再加入卡那霉素(70 μg/ml)并将培养物在30℃振荡培养过夜。滴定(tittered)噬菌体培养物上清液并用20% (v/v) PEG (聚乙二醇)/NaCl沉淀而浓缩，重悬于PBS，用0.22 µm滤器除菌，制备等分试样，用于噬菌体文库淘选。
然后进行噬菌体文库淘选，概述于下表2。
表2
用900 µL封闭液(3%脱脂奶粉的PBS)封闭来自Fab展示噬菌体文库的输入噬菌体(100 µl, 大约1011-12 pfu)，以减少对噬菌体表面的非特异性结合。通过在磁力分类器中收集200 µL珠的悬液并除去上清液，制备链霉抗生物素-包被的珠。然后将珠子悬浮于1 mL封闭液中并放在旋转混合器上过30 分钟。为了除去非特异性链霉抗生物素结合的噬菌体，将封闭的噬菌体文库与封闭的链霉抗生物素-包被的珠子混合并放在旋转混合器上过30分钟。将来自de-selection过程的噬菌体悬液移至新管，然后加入200 µL抗原、10% bADDL并孵育2小时，让抗体和抗原结合。孵育之后，将混合物加入到封闭的链霉抗生物素-包被的珠子中并在旋转混合器上孵育1小时，以捕获在链霉抗生物素珠子上的Ab/Ag复合物。将具有捕获的10% bADDL/噬菌体复合物的珠子用PBS/0.05%吐温20洗涤5次，再单用PBS洗涤2次。用200 µL 100mM TEA (Sigma Aldrich, St. Louis, MO)将结合的噬菌体从bADDL上洗脱下来并孵育20分钟。再将洗脱下来的噬菌体移至50 mL管，用100 µL 1M Tris-HCl (pH7.5)中和并加入到10 mL OD 600 nm介于0.6-0.8的大肠杆菌TG1细胞中。在37℃振荡孵育1小时之后，将培养物等分试样接种在LB琼脂-羧苄西林(50 µg/mL)板上，以滴定输出噬菌体数量，并将剩余细菌离心并悬浮于500 µl 2xYT培养基 (Teknova, Hollister, CA)， 接种在含有100 µg/ml氨苄青霉素和1% 葡萄糖的生物测定YT琼脂板(Teknova, Hollister, CA)上。生物测定板在30℃生长过夜。
每轮淘选之后，随机挑取单菌落，以在96孔板中产生噬菌体。在96孔板制备噬菌体的方法类似于以上所述，除了未使用噬菌体沉淀步骤之外。将生长在120 µL含100 µg/ml 氨苄青霉素和0.1% 葡萄糖的2xTY培养基中的菌落的培养板在HiGro®振荡器(基因组Solutions, Ann Arbor, MI)中在450 rpm振荡中在30℃孵育过夜。噬菌体上清液(大约100 μL)直接用于在上述ADDL结合ELISA中进行分析。一个差异是用缀合HRP的抗M13-抗体(Amersham Bioscience, GE Healthcare, Waukesha, WI)检测噬菌体与ADDL的结合。
实施例 3
抗 ADDL 抗体的鉴定
根据轻链亲和力成熟的成果，在噬菌体/Fab ELISA中，与h3B3相比，一组7个克隆显示出对ADDL的强结合活性 (数据未显示)。选择这7个克隆用于转化为IgG并产生和纯化单克隆抗体，用于进一步表征。
A. 抗ADDL抗体选择
按照实施例2所述进行文库淘选和筛选之后，选择7个先导Fab克隆(表3-5)进行针对IgG转化的选择。表3显示从轻链亲和力成熟文库中选择的克隆的氨基酸与亲代抗体h3B3相比的相似性。表4A概述了所选克隆的轻链CDR3与亲代抗体h3B3的轻链CDR3中的氨基酸差异数。表4B概述了所选克隆的轻链CDR1与亲代抗体19.3轻链的CDR3中的氨基酸差异数。表4C概述了所选克隆的轻链CDR2与亲代抗体19.3轻链中的CDR3的氨基酸差异数。表5是关于所选克隆与亲代抗体h3B3的轻链可变区的一部分(位置21-117)的比对。各克隆的CDR3用粗体表示。
表3
表4A
表4B
表4C
表5
B. IgG转化
使用基于质粒的载体可表达转化的IgG。构建表达载体，使它们含有所有除可变区之外的必需成分。在基本载体中，轻链和重链的表达都由人CMV 启动子和牛生长激素 聚腺苷酸化信号驱动。对于选择用于IgG转化的7个克隆，将重链可变区在读框内与人IgG2 重链恒定区(SEQ ID NOS: 20和21)融合，而将轻链可变区在读框内与kappa轻链恒定区(SEQ ID NOS: 18和19)融合。还相应地将介导抗体向培养基中分泌的重链(SEQ ID NOS: 29和30)和轻链(SEQ ID NOS: 31和32)的先导序列符合读框地与可变区融合。对于重链表达载体，恒定区可从不同亚类同种型例如IgG1或IgG2中选择。在先导序列和恒定区之间，基因间序列含有克隆序列，用于将引入的可变区在其5'-端与先导序列和在其3'-端与恒定区的无缝读框内融合(使用In-Fusion克隆策略)(Clontech, Mountain View, CA)。用In-Fusion™ Dry-Down PCR克隆试剂盒(Clontech, Mountain View, CA)对可变区进行PCR扩增。Dry-Down克隆试剂盒含有用于PCR反应的所有必需成分。加入PCR 引物和模板DNA。表达载体携带来自EBV病毒基因组的oriP。oriP/EBNA1对常用于在转染细胞中延长表达载体的存在并广泛用于延长表达持续时间(Lindner等, 2007, Plasmid 58:1-12)，用于延长在293EBNA细胞中的表达、卡那霉素选择标记的细菌序列、以及大肠杆菌的复制起点。当插入可变区时，IgG在哺乳动物细胞中直接表达。本文的所有重链可变区都克隆到IgG1 表达载体(pV1JNSA-BF-HCG1)，轻链可变区都克隆到匹配的kappa或lambda 表达载体(pV1JNSA-GS-FB-LCK)。
C. 抗体克隆
所得抗体表达载体的克隆过程如下。可变区经PCR扩增，其中在25 µL体积中进行PCR反应，所述体积含有高保真PCR主要混合物，模板体积1 µL和正向引物和反向引物: 各1 µL。PCR条件：1次循环94℃, 2 分钟；25次循环94℃, 1.5 分钟；60℃, 1.5 分钟；72℃, 1.5 分钟和72℃, 7 分钟；4℃直到移出。然后PCR产物用DpnI消化并用QIAquick平板试剂盒(Qiagen, Venlo, The Netherlands)纯化。用In-Fusion反应将100 ng相应的先前线状化的重链或轻链载体退火到10 ng PCR片段(IN-Fusion Dry-Down Cloning Kit, Clontech, Mountain View, CA)。将反应混合物转化到XL2 Blue MRF'感受态细胞并在含有50 μg/mL卡那霉素的琼脂板上接种过夜。轻链构建体用HindIII + NotI消化，重链构建体用AspI + HindIII消化，以通过限制性分析来检查结构。所有克隆的DNA序列都通过测序来证实。
D. 在哺乳动物细胞中的抗体表达和纯化
测序证实轻链和重链DNA的构建体被转染到293 Freestyle细胞(Invitrogen, Carlsbad, CA)。使用293 Transfectin (Invitrogen, Carlsbad, CA)来转染293 Freestyle细胞。使用基于PEI的转染试剂来转染EBNA单层细胞。将转染的细胞在无Opti-MEM 血清的培养基 (Invitrogen, Carlsbad, CA)中在37℃/5% CO2中孵育7天。收集培养基，离心，通过0.22 um过滤系统(Millipore, Billerica, MA)过滤，然后通过Centricon®离心过滤器(Millipore, Billerica, MA)浓缩。将浓缩培养基以 1:1的比例与结合缓冲液(Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)混合，然后上样到预先平衡的蛋白A/G 柱 (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL )或HI trap rProtein A FF (来自GE Healthcare, Waukesha, WI)。已上样的柱子用结合缓冲液洗涤并用洗脱缓冲液(Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)洗脱。将洗脱下来的抗体立即中和并针对缓冲PBS透析过夜。经透析的抗体用Amicon离心滤器(Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)浓缩和通过OD280nm检测蛋白浓度，消光系数1.34 mg/mL。纯化的抗体用SDS-PAGE (Invitrogen, Carlsbad, CA)、或蛋白labchip (Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA)来分析。在非还原条件下进行SDS-PAGE。
使用QuikChange II XL定点诱变试剂盒(Agilent Technologies, La Jolla, CA)，通过从WT表达载体pV1JASN-GS-19.3-LCK定点诱变，将抗体19.3轻链CDR1的位置33天冬酰胺(N33)诱变为N33S (SEQ ID NO: 55), N33T (SEQ ID NO: 56), N33E (SEQ ID NO: 67)或N33D (SEQ ID NO: 68)。在19.3S33 (SEQ ID NO: 55)中代表N的密码子AAT突变为代表S的AGT，在19.3T33 (SEQ ID NO: 56)中突变为代表T的ACT，在19.3E33 (SEQ ID NO: 67)中突变为代表E的GAA ，或在19.3D33 (SEQ ID NO: 68)中突变为代表D的GAT，以及位置经DNA测序证实的新密码子。为了产生这些突变体的全长IgG抗体，将相应的轻链质粒与关联重链质粒pV1JNSA-19.3-HCG2配对，用于在293 FreeStyle细胞(Invitrogen, Carlsbad, CA)中瞬时转染。在本实施例中表达方法和纯化方法如上描述。在不同条件下，在4ºC, 25ºC或40ºC，将纯化的突变抗体以及19.3 亲代抗体(SEQ ID NO: 1)的等分试样孵育1个月，然后进行ELISA分析，见图4A-4C所示。
实施例 4
抗 ADDL 抗体的表征
所选抗ADDL抗体，即源自亲代抗体h3B3的那些，在three-pronged Aβ ELISA中首次被测定，以评价抗体与单体Aβ、ADDL和纤维状Aβ的结合。如图1所示，除了抗体9.2以外，所有抗ADDL抗体都显示出对ADDL的优先结合(相对于h3B3、选择性(Comp 1和3: 仅结合ADDL)参比物、非选择性(Comp 2: 结合所评价的所有形式的Aβ)参比物和对照(无抗体))。抗体9.2对所有形式的Aβ都显示出低结合，表明其结合亲和性在IgG转化和/或抗体产生期间受到不利影响。对每种抗体和h3B3都创建完整滴定曲线(图2)，以测定它们与ADDL的结合亲和力(与单体Aβ相比)。尽管7种亲和力成熟的抗体中有6种显示出对ADDL的优先结合，但申请人先前已经证明，对ADDL具有优先结合的某些抗ADDL抗体不能阻止 ADDL与原代海马神经元结合(Shughrue等, 2010, Neurobiol. Aging, 31: 189-202, 图1)。
因为单与ADDL优先结合可能并非有效性的准确预测者，所以最好鉴定也能阻断 ADDL与神经元结合的抗ADDL抗体，其可在基于细胞的结合测定中评价如下。将抗体与ADDL预孵育，然后加入到原代海马培养物中，以评价它们对ADDL结合的阻断。该研究结果表明本文的抗ADDL抗体尤其是抗体19.3，极大地降低了ADDL与神经元的结合 (图3)。然而，当抗体经热变性时，在该测定中观察到抗体活性的明显降低(图3)。
EC50的测定。在4℃将高蛋白结合板(Costar, Corning, Lowell, MA)用含靶配体的PBS包被过夜。对于Aβ40 (American Peptide, Sunnyvale, CA)，包被蛋白浓度为100 pmol/孔，而对于ADDL为50 pmol/孔。按照实施例1B所述产生ADDL。次日，各板用PBS + 0.05%吐温-20 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO)洗涤5次并用酪蛋白封闭缓冲液(ThermoScientific, Waltham, MA)和0.05%吐温-20封闭过夜。在15 µg/ml至0 µg/ml在12点3倍稀释系列中测试如实施例3所述产生的3种代表性的抗体，19.3 (图A)、19.3S33 (图4B)和19.3T33 (图4C)。 在室温下孵育2小时之后，洗涤各板并加入0.08 µg/ml碱性磷酸酶缀合的抗人IgG (ThermoScientific, Waltham, MA)。在室温下孵育45 分钟之后，洗涤各板并加入Tropix® CDP®-Star化学发光底物(Life Technologies™, Carlsbad, CA)。30 分钟之后在EnVision® 微量板读板器(PerkinElmer, Waltham, MA)上测定发光。用GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA)软件完成曲线拟合。
实施例 5
抗 ADDL 抗体的体外 FcRn 结合
为了表征抗ADDL抗体与固定化人FcRn结合和解离的能力，在Biacore FcRn结合测定中评价本文的7种抗ADDL抗体，所述测定是用于在非人类灵长类中评价抗体PK和预测抗体的终末半衰期(t1/2)的替代系统。
简而言之，将纯化的人FcRn蛋白固定在Biacore CM5生物传感器芯片上并用PBSP (50 mM NaPO4, 150 mM NaCl和0.05% (v/v) Surfactant 20) pH 7.3作为运行缓冲液。将mAb用PBSP pH 6.0稀释至100 nM，允许与FcRn结合3分钟以达到平衡，然后在pH 7.3运行缓冲液中解离。报告点(稳定性)在mAb结合结束后5秒插入，并且“%结合”计算为RU稳定性/RU结合(%)。申请人发现具有相同Fc序列但不同Fab结构域的单克隆抗体(mAb)能以相当大的差异与FcRn结合和从中解离(数据未显示)。此外，观察到在中性pH时解离与体内 药物动力学之间的明显相关性，其中具有缓慢解离分数(即更高“%结合”)的mAb在体内倾向于表现出更短的t½。该性质用作用于抗体药物动力学体外筛选工具。
在FcRn结合测定中，对本文的7种抗ADDL抗体、以及h3B3、2种ADDL优选的抗体(Comp 1和3)和非选择性 (Comp 2: 结合所评价的所有Aβ形式)参比物进行比较。创建传感图 (图5)，显示在pH 6.0开始结合，然后在pH 7.3从180秒抗体解离。如图5所示，在h3B3和所评价的其他抗体之间有明显差异。尽管h3B3对FcRn具有高百分率的结合，但本发明的7种抗ADDL抗体、以及2种参比抗体都表现出相对低的结合。
实施例 6
抗 ADDL 抗体 19.3 的表征
选择亲和力成熟的抗体19.3，进行进一步表征。测定模板DNA序列和推导的轻链可变区的氨基酸序列，分别为SEQ ID NOS: 14和15。重链(SEQ ID NO: 17)和轻链(SEQ ID NO: 15)的可变区的比对见图6A，连同最近的种系序列(SEQ ID NO: 47)。重链可变区和轻链可变区的3D模型和6个互补决定区(CDR)的位置见图6B。
进行Biacore™ (GE Healthcare, Waukesha, WI)和KinExA (Sapidyne, Boise, ID)分析，以确定抗ADDL抗体19.3对ADDL的结合亲和力并测定19.3对ADDL相对于单体Aβ的选择性。基于Biacore™和KinExA的技术广泛用于测定大分子之间(例如抗体和蛋白靶之间)的结合亲和性。在Biacore™所根据的表面等离子共振(SPR) 技术中，一个或多个分子间结合相互作用的定量测定取决于靶分子在传感器芯片表面的固定化。当它们通过芯片时，可捕获针对靶的结合配偶体。表面等离子共振(SPR)通过测定折射率的变化而测定接近传感器芯片表面的水层的质量变化。当测试液中的分子与靶分子结合时，质量增加(ka)，当它们解离时，质量下降(kd)。这一简单原理构成传感图的基础 – 对相互作用的分子的缔合和解离的持续的实时监测。传感图提供关于结合特异性、样品中分子的活性浓度、动力学和亲和性的实时的定量信息。
KinExA技术(来自Sapidyne Instruments, Boise, Idaho)测定结合常数，以表征溶液相中的生物分子结合事件，而非溶液相和固相之间的结合事件。在溶液中，结合配偶体在充分孵育之后达到平衡。未结合分子经滴定而定量，其反映出与配偶体结合的分子部分。KinExA 方法不需要修饰所研究的分子。使用KinExA，所测定的反应发生在溶液中的未修饰的分子之间。因此，消除了对修饰怎样改变“天然”结合反应的考虑。KinExA方法允许更广泛范围的结合常数，精确到10-13 M。KinExA软件进行数据分析，其是基于经典结合方程的准确解(kd 数学)，而不是假的一级近似值。KinExA不需要任意数据操作或范围选择。
如表6所示，在Biacore™测定中，抗体19.3对ADDL具有4.8 nM亲和力，相比之下对单体Aβ具有150 nM亲和力。抗体19.3对ADDL比对Aβ单体具有30倍选择性，明显好于用亲代抗体h3B3所观察到的，后者对ADDL比对Aβ单体仅有10倍的优先。
表6
同样，在基于KinExA的平衡常数测定中评价抗体19.3。如表7所示，抗体19.3的平衡常数为2.7 nM，其表示在相同测定中，对ADDL 寡聚体比对Aβ40单体的结合有超过6倍的优先。
表7
实施例 7
抗 ADDL 抗体 19.3 的生物物理表征
进行评价抗体聚集体形成的潜力的生物物理表征，结果显示本文的抗ADDL抗体在胁迫条件下是稳定的并且适合用作治疗药。将抗ADDL抗体19.3浓缩至>50 mg/mL并放入pH 范围为5.0-8.0的多种制剂中。将两组样品在37℃和45℃孵育1周。将第3组样品放在-70℃，开始一系列的5次冷冻/融化循环。大小排阻层析分析表明抗体制备物主要(>95%)呈单体状态，有少量二聚体，这对于单克隆抗体制剂而言是典型的。在温度胁迫之后在所有缓冲液中二聚体和更高分子量寡聚体的数量并未增加，未观察到片段化。如表8所概述，近紫外浊度分析也表明没有聚集。经冻/融胁迫的样品在浊度上显示出缓冲液依赖性增加，这与其它单克隆抗体相当。在50 mg/mL的粘度低于2厘泊，表明可接受的注射粘度，因为20厘泊水平通常被认为是皮下注射的实施极限。示差扫描量热法也揭示出可接受的热稳定性，其中Fab在大约72℃解折叠，而最不稳定的CH2结构域在超过65℃时解折叠。归纳起来，抗体19.3显示出非常好的结构稳定性，其生物物理性质适于皮下递送。
表8
实施例 8
19.3的药物动力学分析和在AD模型中的功效
A. 在人FcRn小鼠中的药物动力学研究
最近，人FcRn小鼠 (杂合Tg276) (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)已证明是用于评价单克隆抗体药物动力学的有价值的替代系统。为了在人FcRn小鼠中表征抗ADDL抗体19.3的药物动力学，3只动物通过尾静脉接受单次静脉内注射10 mg/kg抗体19.3。在IV给予抗体19.3或h3B3之后的0, 25, 50, 75, 100, 150, 250和350小时的时间点采集一系列10 μL血液样品，经证实的抗人IgG 免疫测定用于测定抗体的血液浓度。如图7所示，抗体19.3的血液水平以双相方式下降，表观t1/2 77 6小时，这比亲代抗体h3B3的大约29 9小时的半衰期显著更长。这些半衰期与通过体外 FcRn结合测定所预测的差异是一致的(图5)。用无房室模型 (WinNonlin®, Pharsight, Sunnyvale, CA)测定消除期终末半衰期，数据点介于给药后第3至第5天之间。
B. 在非人类灵长类中的药物动力学研究
为了在灵长类中证实所预测的19.3的t1/2，在一组小脑延髓池端口受控的猕猴中对抗ADDL抗体19.3进行灵长类药物动力学研究。6只动物(3雄/3雌)接受单次静脉内推注或皮下注射抗体19.3 (5 mg/kg)，在给予抗体之后收集血液样品。同时在0, 2, 4, 8, 12, 24, 30, 48, 54和72小时从小脑延髓池端口采集CSF 样品，并用抗人IgG ELISA测定来检测抗体19.3在血清和CSF中的浓度。当动物接受单次IV推注注射的抗体19.3时，观察到t1/2为254 28小时，而皮下给药后则观察到t1/2为204 49小时(图8)。另外，申请人发现，抗体19.3能够穿透灵长类CSF，在此，所述抗体在头48小时期间其浓度增加，而峰值在大约0.1%所给予的抗体(图9)。
C. 125I-标记的抗ADDL抗体19.3在小鼠脑内的分布
为了测定到达脑内的抗体浓度，给12月龄的雄性Tg2576小鼠 (品系B6；SJL-TgN APPSWE)注射(尾静脉) 200 μg 125I-标记的19.3抗体(约8 mg/kg)、或两种参比抗体中的一种，并在2小时之后采集血液和CSF。通过心脏输注PBS而将残余放射性从脑血管中清除掉，然后取出大脑。然后将血液、CSF和全脑的样品放入γ计数器，测定各样品中存在的放射性标记的抗体的量。计数之后，将脑在4%多聚甲醛中固定48小时，然后处理，用于自由漂浮(free-floating)免疫细胞化学测定。用抗人第二抗体和标准ABC测定方法测定抗体19.3在小鼠脑中的定位。然后将该免疫反应性与硫代黄素S染色(检测斑块的染料)结合，以确定小鼠脑中的抗体与斑块的共同定位。
如图10A和图10B所示，放射性标记的抗体19.3能穿透血脑屏障进入CSF和脑。此外，当与在CSF中所见的水平相比(0.02%)，数据表明抗体19.3在脑(0.19%)中富集。为了测定在脑中的该浓度是否是因为抗体19.3与Aβ缔合，对脑进行固定和处理，用于免疫细胞化学测定。对老年Tg2576小鼠脑中的抗体分布的分析表明抗体19.3在脑中与硫代黄素S阳性的淀粉样蛋白斑块缔合(图10C和10D)。这些数据提供了抗体19.3能穿透转基因小鼠脑并与目标Aβ种类结合的第一证据。
实施例 9
斑块沉积模型
为了进一步评价抗ADDL抗体19.3减少 ADDL在脑中的淀粉样蛋白斑块中沉积的能力，每周给12月龄雄性Tg2576小鼠 (Taconic, NY)的单侧插入导管并每周将bADDL (50 pmol/μL)输注到海马内，共4周(图11A)。在最后一次bADDL 治疗之后1周，半数小鼠 (n=5/治疗)每周接受(尾静脉) PBS，共4周，而其余动物则每周接受200 μg抗ADDL抗体(大约8 mg/kg)。末次治疗之后1周对所有动物实施安乐死并处理其脑，用于免疫细胞化学分析。对于bADDL和斑块的检测，将脑切片与链霉抗生物素Alexa Fluor® 594 (Invitrogen, Carlsbad, CA)一起孵育，涂抹在玻片上并用硫代黄素S对斑块染色。然后用UltraVIEW ERS软件用PerkinElmer Rapid Confocal Imager捕捉斑块的荧光图像并定量分析斑块生长的差异。该模型的详情近期已公布(Gaspar et. al., 2010, Exp. Neurol., 223: 394-400)。治疗后1个月，当与仅用溶媒治疗的动物相比(图11B)，在经抗体19.3治疗的动物中观察到新ADDL向现有斑块的沉积明显减少(图11C)。

Claims (10)

1.与淀粉样蛋白β-衍生的可扩散配体结合的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或片段包含：
(a) 包含以下的轻链可变区，
(i) SEQ ID NO: 1的CDR1，
(ii) SEQ ID NO: 2的CDR2，和
(iii) SEQ ID NO: 10的CDR3；和
(b) 包含以下的重链可变区，
(i) SEQ ID NO: 4的CDR1，
(ii) SEQ ID NO: 5的CDR2，和
(iii) SEQ ID NO: 6的CDR3。
2.权利要求1的分离的抗体，其中所述抗体的轻链可变区包含SEQ ID NO: 15，所述抗体的重链可变区包含SEQ ID NO: 17。
3.权利要求1的分离的抗体，所述抗体还包含SEQ ID NO: 21的重链恒定区。
4.权利要求1的分离的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
5.包含权利要求1的抗体或抗原结合片段与药学上可接受的载体的混合物的药物组合物。
6.权利要求1的抗体或抗原结合片段在制备用于减弱淀粉样蛋白β-衍生的可扩散配体与神经元结合的药物中的用途。
7.权利要求1的抗体或抗原结合片段在制备用于抑制淀粉样蛋白β-衍生的可扩散配体的装配的药物中的用途。
8.权利要求1的抗体或抗原结合片段在制备用于抑制τ蛋白在Ser202/Thr205的磷酸化的药物中的用途。
9.权利要求5的药物组合物在制备用于减弱淀粉样蛋白β-衍生的可扩散配体相关疾病的症状的药物中的用途。
10.用于检测淀粉样蛋白β-衍生的可扩散配体的药盒，所述药盒包含权利要求1的抗体或抗原结合片段。
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