MX2013000490A

MX2013000490A - Anticuerpo monoclonal anti-ligando difundible derivado de amiloide beta y usos de los mismos.

Info

Publication number: MX2013000490A
Application number: MX2013000490A
Authority: MX
Inventors: Fubao Wang; Renee C Gaspar; Paul J Shughrue; Weirong Wang; Ningyan Zhang; Wei-Qin Zhao; Alexander Mccampbell; Min Xu
Original assignee: Merck Sharp & Dohme
Priority date: 2010-07-14
Filing date: 2011-07-13
Publication date: 2013-02-21
Also published as: AU2011279221A1; JP2013542914A; DK2593475T3; CA2805414C; EP2593475B1; US20130115227A1; KR101842301B1; CN103140500B; RU2013106270A; ES2573135T3; EP2593475A4; WO2012009442A2; US20150023952A1; US9309309B2; MX338640B; AU2011279221B2; JP5934203B2; CA2805414A1; RU2567808C2; KR20130135831A

Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos que se unen a ligandos difundibles derivados de amiloide ß, también conocidos como ADDLs; los anticuerpos de la invención son selectivos para ADDLs, pueden penetrar en el cerebro y son útiles en métodos de detección de ADDLs y diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer; los presentes anticuerpos también bloquean la unión de ADDLs a neuronas, el ensamblaje de ADDLs y la fosforilación de tau y son útiles en métodos para prevenir y tratar enfermedades asociadas con ADDLs.

Description

ANTICUERPO MONOCLONAL ANTI-LIGANDO DIFUNDIBLE DERIVADO DE AMILOIDE BETA Y USOS DEL MISMO REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama prioridad bajo 35 USC §119 a la Solicitud Provisional de Estados Unidos No. 61/364,210, presentada el 14 de Julio de 201 1.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. La invención también proporciona composiciones que comprenden anticuerpos monoclonales y procedimientos de uso de las composiciones como biomarcadores o para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades asociadas con amiloide beta (?ß) y ligandos difundibles derivados de ?ß (ADDLs).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La enfermedad de Alzheimer (AD) se caracteriza por la pérdida progresiva de la función cognitiva y la acumulación de placas de amiloide beta (?ß) en regiones asociadas con el aprendizaje y la memoria. Aunque antes se pensaba que las placas de ?ß desempeñaban un papel central en la patogénesis de la AD, un conjunto creciente de pruebas sugieren que los ligandos difundibles derivados de ?ß (ADDLs) pueden ser responsables de la disfunción neuronal y del deterioro cognitivo asociados con la enfermedad (Walsh y Selkoe, 2004, Protein Pept. Lett., 1 1 : 213-228). Los ADDL son oligómeros solubles pequeños de ?ß que son abundantes en la AD, pero no en cerebros normales (McLean et al., 1999, Ann. Neurol., 46: 860-866; Gong et al., 2003, Proa Nati. Acad. Sci. USA, 100: 10417-10422). Los estudios in vitro han demostrado que los ADDL, aislados de cerebro con AD o preparaciones sintéticas, se unen a una subpoblación de neuronas corticales e hipocampales (Gong et al., 2003; Klein et al., 2004, Neurobiol. Aqin , 25: 569-580; Lacor et al., 2004, J. Neurosci., 24: 10191-10200; Shughrue et al., 2010, Neurobiol. Aqing, 31 : 189-202), aunque se detectó escasa o ninguna unión con preparaciones de ?ß fibrilar o monomérico (Lacor et al., 2004; Hepler et al., 2006, Biochemistry, 45: 15157-15167). Además, los ADDL que se unen a neuronas pueden atenuarse con anticuerpos tanto policlonales (Gong et al., 2003) como monoclonales (Lee et al., 2006, J. Biol. Chem., 281 : 4292-4299; De Felice et al., 2007, Neurobiol. Aqing 29: 1334-1347; Shughrue et al., 2010) generados contra ADDL.

En modelos de roedor, la administración central de ADDL induce déficits en la potenciación a largo plazo (LTP) y en la formación de memoria en roedores (Walsh et al., 2002, Nature, 416: 535-539; Cleary et al., 2004, Nat. Neurosci., 8: 79-84; Klyubin et al., 2005, Nat. Med.. 1 1 : 556-561 ). El efecto de los oligómeros sobre la LTP se atenuaba cuando los ADDL se coadministraban con un anticuerpo anti-?ß o se administraban a animales que estaban vacunados con el péptido ?ß (Rowan et al, 2004, Exp. Gerontol., 39: 1661-1667). En un modelo transgénico de AD, tal como ratones transgénicos que producen proteina precursora de amiloide humana (hAPP), se han observado déficits cognitivos asociados con la edad con niveles de ADDL elevados (Westerman et al., 2002, J. Neurosci., 22: 1858-1867; Ashe, 2005, Biochem. Soc. Trans., 33: 591-594; Lee et al., 2006; Lesne et al., 2006, Nature, 440: 352-357). Cuando los ratones con hAPP se trataron con un anticuerpo anti-ADDL, se observó una mejora significativa en el rendimiento cognitivo sin una disminución concomitante en la carga de placas de ?ß (Lee et al., 2006). En su conjunto, estos descubrimientos sugieren que los ADDL, y no las placas ?ß, son principalmente responsables de la alteración cognitiva, y que el uso de anticuerpos anti-ADDL puede demostrar eficacia en el tratamiento de la AD. Véanse también los documentos US2006/0228349; US 7.731.962, WO 2007/050359; US2007/0218499, WO 2006/014478; US 7.700.099; US 2008/01758835, WO 2006/055178.

Por consiguiente, existe la necesidad de anticuerpos terapéuticos selectivos de ADDL para la prevención y el tratamiento de la AD. La presente invención satisface esta necesidad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un anticuerpo aislado, o un fragmento del mismo, capaz de reconocer de forma diferencial una conformación multidimensional de uno o más ADDL para el tratamiento de enfermedades asociadas con ADDL, tales como la AD. La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden el anticuerpo aislado de la invención, en solitario o en combinación, con uno o más agentes, transportadores o diluyentes terapéuticamente activos.

La presente invención también se refiere a métodos de uso para el anticuerpo aislado, tales como métodos para detectar ADDL en una muestra, para inhibir el ensamblaje de ADDL, para identificar agentes terapéuticos que impidan la unión de ADDL a neuronas, y para atenuar los síntomas de una enfermedad asociada con ADDL, y como biomarcador para su uso en el diagnóstico de una enfermedad asociada con ADDL o para la detección de ADDL en una muestra.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una representación gráfica de la unión en ELISA de un panel de anticuerpos anti-ADLL humanizados (h3B3) y madurados por afinidad (14.2, 7.2, 1 1.4, 9.2, 13.1 , 17.1 y 19.3) y tres anticuerpos de comparación (Comp 1 , 2 y 3) contra ?ß monomérico, ADDL y ?ß fibrilar. El fondo de este ensayo se determinó eliminando el anticuerpo de captura del ELISA (sin mAb). Las barras de error representan el error típico de la media.

La Figura 2 es una representación gráfica de la unión en ELISA del anticuerpo anti-ADDL 19.3 y del anticuerpo 3B3 contra ADDL o ?ß monomérico (?ß1-40) evaluada con una curva de titulación de 1 1 puntos.

La Figura 3 es una representación gráfica de la habilidad del anticuerpo anti-ADDL 19.3 y 3B3 para bloquear la unión de ADDL a células neuronales hipocampales primarias después de la preincubación con una concentración creciente del anticuerpo. La habilidad del anticuerpo anti-ADDL 19.3 para bloquear la unión de ADDL a neuronas se atenuaba después de desnaturalización térmica del anticuerpo. Las barras de error representan el error típico de la media.

Las Figuras 4A-4C son representaciones gráficas de la unión ELISA a ADDLs del anticuerpo anti-ADDL 19.3 (designado como WT en la Figura 4A) y dos anticuerpos anti-ADDL derivados de 19.3 (Figuras 4B y 4C) después de la incubación hasta un mes a temperaturas variables para evaluar la estabilidad del anticuerpo. Los anticuerpos anti-ADDL derivados de 19.3 comprendían una sola sustitución de aminoácido de Asn33 dentro de la cadena ligera CDR1 ya sea a Ser33 (19.3S33) o Thr33 (19.33T33) (SEQ ID NOS: 55 y 56, respectivamente). La sustitución de Asn33 ya sea con S33 (Figura 4B) o T33 (Figura 4C) resultó en una estabilidad de anticuerpo mejorada contra el anticuerpo parental 19.3.

La Figura 5 es una representación gráfica de la unión y disociación de anticuerpos anti-ADDL a FcRn humano inmovilizado cuando se evaluó con Biacore™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ). El sensograma ajustado muestra una unión inicial a pH 6,0 y después la disociación de anticuerpos a pH 7,3 a partir de 180 segundos. Se insertó un punto de aviso (Estabilidad) a los 5 segundos después del final de la unión a pH 6,0 y el "% Unido" Se Calculó COmO UREstabilidad/URunión (%)· La Figura 6A muestra el alineamiento de las regiones variables de cadena pesada y ligera para el anticuerpo anti-ADDL 19.3 con una linea germinal humana, indicándose las regiones determinantes de complementariedad (CDR) en negrita. La Figura 6B es un modelo 3D de regiones variables pesadas y ligeras del anticuerpo 19.3 que muestra la localización de las CDRs.

La Figura 7 es una representación gráfica del perfil farmacocinético (PK) de los anticuerpos anti-ADDL 19.3 y 3B3 evaluado en ratones con FcRn humano 276 heterocigotos (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) después de una sola administración intravenosa (IV) de 10 mg/kg. La concentración de anticuerpo se midió a diversos intervalos de tiempo para determinar la semivida {VA) del anticuerpo libre (19.3: 77 ± 6 horas; 3B3 respectivamente: 29 ± 9 horas).

La Figura 8 es una representación gráfica del PK del anticuerpo anti-ADDL 19.3 (en suero) evaluado en seis monos rhesus después de la administración de una dosis intravenosa (IV) o subcutánea (SC) en embolada de 5 mg/kg. Se determinó una semivida (t /2) de 254 ± 28 (274 ± 9) horas después de la administración IV y de 204 ± 49 (219 ± 52) horas después de la dosificación SC.

La Figura 9 es una representación gráfica del PK del anticuerpo anti-ADDL 19.3 evaluado en líquido cefalorraquídeo (CSF) de primates (tres monos rhesus machos) usando el modelo de mono rhesus con cisterna magna cateterizada después de la administración de una dosis IV en embolada de 5 mg/kg. A aproximadamente 48 horas después de la dosis, el anticuerpo anti-ADDL 19.3 estaba presente en el CSF al 0.1 % de la concentración en suero.

Las Figuras 10A-10D son representaciones de la habilidad del anticuerpo anti-ADDL 19.3, frente a dos anticuerpos de comparación (Comp 1 y Comp 2) para atravesar la barrera hematoencefálica en un modelo de ratón transgénico que sobreexpresa la proteina precursora amiloide humana (hAPP). A los ratones se les inyectó por vía intravenosa (IV) un anticuerpo anti-ADDL 19.3 marcado con 125l, o un anticuerpo de comparación, y las muestras de sangre, CSF y cerebro se recogieron 2 horas después de la dosis. Tras la evaluación de la distribución de la radiactividad, el 0,02% del anticuerpo anti-ADDL 19.3 estaba presente en el CSF (Figura 10A) mientras que se observaba el 0.19% en el cerebro (Figura 10B). Se observaron niveles similares con los dos anticuerpos de comparación. El análisis inmunocitoquímico demostró la localización del anticuerpo anti-ADDL 19.3 (Figura 10C, flechas) y era visible una concentración de anticuerpo anti-ADDL 19.3 con placas (Figura 10D). El anticuerpo anti-ADDL 19.3 fue capaz de penetrar en el cerebro y unirse a ADDLs.

Las Figuras 1 1A-11C son representaciones de la habilidad del anticuerpo anti-ADDL 19.3 para bloquear la deposición de ADDLs en placas en crecimiento en un modelo de ratón transgénico que sobreexpresa hAPP. Los ADDLs biotinilados (bADDLs) infundidos en el hipocampo de ratones de 12 meses de edad durante 4 semanas (una inyección por semana) (Figura 1 1 A) marcaron las placas existentes (transportador solo: Figura 1 1 B; anticuerpo 19.3: Figura 11C, anillo). Se usó un análisis inmunocitoquimico para evaluar la deposición de nuevo material (ADDLs) (Figuras 1 B y 1 1 C).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a anticuerpos, o un fragmento de unión a antígeno, que se unen a ligandos difundibles derivados de amiloide ß (?ß) (ADDLs), es decir, anticuerpos anti-ADDL, y que atenúan la unión de ADDL a neuronas. Los resultados de un ensayo cuantitativo basado en células pusieron de manifiesto que los anticuerpos anti-ADDL unían preferentemente ADDLs, disminuían la unión de ADDLs a neuronas hipocampates, atravesaban la barrera hematoencefálica y tenían un perfil farmacocinético (PK) mejorado.

En una modalidad, la presente invención se refiere a un anticuerpo aislado, o a un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a ligandos difundibles derivados de amiloide ß (ADDLs), que comprende: (a) una región variable de cadena ligera que comprende, (i) una CDR1 que tiene la secuencia Arg-Ser-Ser-GIn-Ser-lle-Val-His-Ser-Asn-Gly-Asn-Thr-Tyr-Leu-Glu (SEQ ID NO: 1), (ii) una CDR2 que tiene la secuencia Lys-Ala-Ser-Asn-Arg-Phe-Ser (SEQ ID NO: 2), y (iii) una CDR3 que tiene la secuencia Phe-Gln-Gly-Ser-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5 (SEQ ID NO: 3), en donde Xaa1 es Arg, Lys o Tyr, Xaa2 es Val, Ala o Leu, Xaa3 es Pro, His o Gly, Xaa4 es Ala, Pro o Val, y Xaa5 es Ser, Gly o Phe; y (b) una región variable de cadena pesada que comprende, (i) una CDR1 que tiene la secuencia Gly-Phe-Thr-Phe-Ser-Ser-Phe-Gly-Met-His (SEQ ID NO: 4), (ii) una CDR2 que tiene la secuencia Tyr-lle-Ser-Arg-Gly-Ser-Ser-Thr-lle-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Thr-Val-Lys-Gly (SEQ ID NO: 5), y (iii) una CDR3 que tiene la secuencia Gly-lle-Thr-Thr-Ala-Leu- Asp-Tyr (SEQ ID NO: 6).

En otra modalidad, la presente invención se refiere a un anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a ligandos difundibles derivados de amiloide ß (ADDLs) que comprende. (a) una región variable de cadena ligera que comprende, (i) una CDR1 que tiene la secuencia Arg-Ser-Ser-GIn-Ser-lle-Val-His-Ser-Xaa1-Gly-Xaa2-Thr-Tyr-Leu-Glu (SEQ ID NO: 53), en donde Xaa1 es Asn, Ser, Thr, Ala, Asp o Glu y Xaa2 es Asn, His, Gln, Ser, Thr, Ala o Asp; (ü) una CDR2 que tiene la secuencia Lys-Ala-Ser-Xaa1-Arg-Phe-Ser (SEQ ID NO: 54), en donde Xaa1 es Asn, Gln, Ser, Thr, o Ala, y (iii) una CDR3 que tiene la secuencia Phe-Gln-Gly-Ser-Arg-Leu-Gly-Pro-Ser (SEQ ID NO: 10); y (b) una región variable de cadena pesada que comprende, (i) una CDR1 que tiene la secuencia Gly-Phe-Thr-Phe-Ser-Ser-Phe-Gly-Met-His (SEQ ID NO: 4), (ii) una CDR2 que tiene la secuencia Tyr-lle-Ser-Arg-Gly-Ser-Ser-Thr-lle-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Thr-Val-Lys-Gly (SEQ ID NO: 5), y (iii) una CDR3 que tiene la secuencia Gly-lle-Thr-Thr-Ala-Leu- Asp-Tyr (SEQ ID NO: 6).

En otra modalidad, la presente invención es un anticuerpo aislado que une ADDLs, es decir, un anticuerpo anti-ADDL, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene una región variable de cadena ligera CDR3 que se selecciona del grupo que consiste en 17.1 , que tiene la secuencia Phe-GIn-Gly-Ser-Arg-Val-Pro-Ala-Ser (SEQ ID NO: 7), 14.2, que tiene la secuencia Phe-GIn-Gly-Ser-Arg-Val-Pro-Pro-Gly (SEQ ID NO: 8), 13.1 , que tiene la secuencia Phe-GIn-Gly-Ser-Lys-Ala-His-Pro-Ser (SEQ ID NO: 9), 19.3, que tiene la secuencia Phe-GIn-Gly-Ser-Arg-Leu-Gly-Pro-Ser (SEQ ID NO: 10), 7.2, que tiene la secuencia Phe-Gln-Gly-Ser-Tyr-Ala-Pro-Pro-Gly (SEQ ID NO: 11), 9.2, que tiene la secuencia Phe-Gln-Gly-Ser-Arg-Ala-Pro-Pro-Phe (SEQ ID NO: 12) y 11.4, que tiene la secuencia Phe-Gln-Gly-Ser-Arg-Val-Pro-Val-Arg (SEQ ID NO: 13). En una submodalidad la región variable de cadena ligera CDR3 es la SEQ ID NO: 10.

En otra modalidad más de la presente invención, el anticuerpo anti-ADDL aislado comprende además una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 15 y una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 17.

En otra modalidad más de la presente invención, el anticuerpo anti-ADDL aislado comprende además una región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 21.

En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo anti-ADDL aislado es un anticuerpo monoclonal.

Otra modalidad de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-ADDL aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en una mezcla con un transportador farmacéuticamente aceptable.

Otra modalidad de la presente invención es un método para atenuar la unión de ADDLs a una neurona, que comprende poner en contacto la neurona con un anticuerpo anti-ADDL aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, de modo que se atenúe la unión de ligandos difundibles derivados de ?ß a la neurona.

Otra modalidad de la presente invención es un método para inhibir el ensamblaje de ADDLs que comprende poner en contacto una muestra que contiene péptidos de amiloide ß 1-42 con un anticuerpo anti-ADDL aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, inhibiendo de este modo el ensamblaje de ADDLs.

Otra modalidad de la presente invención es un método para inhibir la fosforilación de proteína tau en Ser202/Thr205, que comprende poner en contacto una muestra que contiene una proteína tau con un anticuerpo anti-ADDL aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, inhibiendo de este modo la fosforilación de la proteína tau en Ser202/Thr205.

Otra modalidad de la presente invención es un método para atenuar los síntomas de una enfermedad asociada con ADDLs que comprende administrar una cantidad eficaz a un paciente que lo necesite de la composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-ADDL aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

Otra modalidad de la presente invención es un método para identificar un agente terapéutico putativo que atenúe la unión de lígandos difundibles derivados de amiloide ß (ADDLs) a neuronas, que comprende: (a) poner en contacto una composición que comprende una neurona con ADDLs en presencia de un agente; (b) poner en contacto la composición con el anticuerpo anti-ADDL aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo; y (c) detectar la cantidad de anticuerpo o fragmento de unión a antígeno unido en presencia del agente, en donde una disminución en la cantidad de anticuerpo o fragmento de unión a antígeno unido en presencia del agente en comparación con la cantidad de anticuerpo unido en ausencia del agente indica que el agente es un agente terapéutico putativo para atenuar la unión de ADDLs a neuronas.

Otra modalidad de la presente invención es un método para detectar ADDLs en una muestra que comprende poner en contacto una muestra con un anticuerpo anti-ADDL aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y determinar la presencia de un complejo que comprende los ADDLs y dicho anticuerpo o fragmento de unión a antigeno.

Otra modalidad de la presente invención es un método para diagnosticar una enfermedad asociada con ADDLs, que comprende poner en contacto una muestra con un anticuerpo anti-ADDL aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y determinar la presencia de un complejo que comprende los ADDLs y dicho anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno, en donde la presencia de dicho complejo es diagnóstica de una enfermedad asociada con ADDLs.

Otra modalidad más de la presente invención es un kit para detectar ADDLs que comprende un anticuerpo anti-ADDL aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a ADDLs.

Se conocen en la técnica anticuerpos monoclonales que reconocen de forma diferencial conformaciones multidimensionales de ligandos difundióles derivados de ?ß (ADDLs) (véase la Patente de ESTADOS UNIDOS No. 7,780,963, la Patente de ESTADOS UNIDOS No. 7,731 ,962, y la Patente de ESTADOS UNIDOS No. 7,8 1 ,563, las cuales están incorporadas aquí en su totalidad como referencia) y se ha demostrado que reducen la unión de ADDL a neuronas en ensayos basados en células. Los anticuerpos anti-ADDL pueden distinguir entre enfermedad de Alzheimer (AD) y extractos de cerebro humano de control, pueden identificar oligómeros endógenos en cortes de cerebro con AD y en células hipocampales, y pueden neutralizar ADDLs endógenos y sintéticos en solución. Los anticuerpos anti-ADDL se unen específicamente a una o más conformaciones multidimensionales de los ADDLs, se unen a ADDLs particulares derivados de oligomerización de ?ß42, al tiempo que tienen una afinidad reducida por otros péptidos de ?ß, incluyendo ?ß1-40.

La presente invención se refiere a anticuerpos anti-ADDL, en concreto a los anticuerpos 17.1, 14.2, 13.1 , 19.3, 19.3T33, 19.3S33, 7.2, 9.2 y 11.4, que se unen preferentemente a ADDLs y que se han caracterizado en lo que se refiere a su especificidad y selectividad por ADDLs. De forma importante, la especificidad y selectividad de estos anticuerpos anti-ADDL de la presente invención no era predecible a partir del epítopo lineal de ?ß con el que se unen, ni esta actividad era predecible a partir de su habilidad para detectar ADDLs por transferencia de Western, o a partir de su habilidad para detectar ADDLs inmunoteñidos unidos a neuronas. Además, la habilidad diferencial de los anticuerpos anti-ADDL de la presente invención para neutralizar ADDLs y bloquear la unión a neuronas hipocampales primarias confirma la creencia de que los anticuerpos anti-ADDL actúan a través de la unión a un epítopo conformacional más relevante, que impide la unión de ADDL a neuronas. Una modalidad de la presente invención, el anticuerpo anti- ADDL 19.3, no sólo bloqueaba la unión de ADDLs a neuronas primarias sino que también disminuía los cambios inducidos por ADDL en la morfología de la espina hipocampal, un indicio de que la impedancia de la unión neuronal a ADDL tiene ramificaciones fisiológicas significativas, por ejemplo, supervivencia neuronal, conectividad neuronal y transducción de señales. El anticuerpo anti-ADDL 19.3 también tenia un perfil farmacocinético (PK) mejorado en comparación con un anticuerpo anti-ADDL conocido previamente, 3B3, cuando se evaluaba en modelos tanto in vitro como in vivo. Además, cuando se administraba a ratones transgénicos que sobreexpresan una forma humana de proteína precursora de amiloide (hAPP), se demostró que el anticuerpo anti-ADDL 19.3 atravesaba la barrera hematoencefálica y se concentraba en el cerebro. Puesto que los ADDLs se localizan en el cerebro y actúan ahí para afectar de forma perjudicial a la función neuronal, un experto en la técnica apreciará y reconocerá que la penetración y la concentración de anticuerpo en el cerebro serían beneficiosas para la inmunoterapia. En su conjunto, estos datos demuestran que los anticuerpos anti-ADDL selectivos, tales como el anticuerpo 19.3, pueden bloquear la unión de ADDLs a neuronas hipocampales, que están críticamente implicadas en el aprendizaje y la memoria.

La utilidad de anticuerpos anti-ADDL para el tratamiento de la AD se basa en un conjunto creciente de pruebas que sugieren que los ADDLs, y no las placas amiloides de por sí, desempeñen un papel fundamental en el deterioro cognitivo asociado con esta enfermedad (Walsh y Selkoe, 2004, Protein Pept. Lett., 1 1 : 213-228). Los ADDLs están elevados en el cerebro con AD e inducen déficits en criterios de valoración conductuales y electrofisiológicos cuando se administran por vía central a roedores (Walsh et al., 2002, Nature, 416: 535-539; Cleary et al., 2004, Nat. Neurosci., 8: 79-84; Klyubin et al., 2005, Nat. Med., 1 1 : 556-561 ; Balducci et al., 2010, Proa Nati. Acad. Sci. USA, 107. 2295-2300). También se han observado déficits en el aprendizaje y la memoria en un modelo de ratón que expresa hAPP, asociándose el comienzo de la alteración con niveles de ADDL elevados (Westerman et al., 2002, J. Neurosci., 22: 1858-1867; Ashe, 2005, Biochem. Soc. Trans.. 33: 591-594; Lee et al., 2005, J. Biol. Chem., 281 : 4292-4299; Lesne et al., 2006, Nature. 440: 352-357). Aunque los acontecimientos celulares y subcelulares que median estos efectos sobre el conocimiento no se entienden en su totalidad, está claro que los ADDLs se unen a las terminales sinápticas localizadas en los procesos dendríticos de las neuronas hipocampales (Lacore et al., 2004, J. Neurosci., 24: 10191-1022) y alteran la morfología y el número de espinas dendríticas (Lacor et al., 2007, J. Neurosci., 27: 796-807; Shankar et al., 2007, J. Neurosci., 27: 2866-2875; Shughrue et al., 2010, Neurobiol. Aqinq, 31 : 189-202). El descubrimiento de que los ADDLs se unen tanto a neuronas GABAérgicas como de glutamato en el hipocampo (Shughrue et al., 2010), neuronas implicadas críticamente en el aprendizaje y la memoria, lo que da como resultado la internalización de receptores de AMPA (Zhao et al., 2010, J. Biol. Chem., 285: 7619-7632), confirma adicionalmente la creencia de que los ADDLs modulan directa o indirectamente estos sistemas de neurotransmisores (véase, por ejemplo, Venkitaramani et al., 2007, J. Neurosci., 27: 1 1832-1 1837).

En la presente invención, un panel de anticuerpos anti-ADDL derivados del anticuerpo anti-ADDL, 3B3 (Patente de Estados Unidos No. 7,780,963 y Patente de Estados Unidos No 7,81 1 ,563, las cuales se incorporan aquí en su totalidad como referencia), se evaluaron para determinar su habilidad para bloquear la unión de ADDL a neuronas hipocampales primarias. Los anticuerpos monoclonales seleccionados se humanizaron después y se maduraron por afinidad para una caracterización adicional. Los anticuerpos candidato, seleccionados por su habilidad para unirse a ADDLs, se evaluaron adicionalmente a una sola concentración usando un ELISA de 3 frentes para determinar la unión de anticuerpo a ?ß monomérico, ADDLs y ?ß fibrilar. Como se muestra en la Figura 1 , seis de los siete anticuerpos anti-ADDL madurados por afinidad, en concreto los anticuerpos 14.2, 7.2, 1 1.4, 13.1 , 17.1 y 19.3, preferían ADDL, en comparación con ?ß monomérico y ?ß fibrilar. Posteriormente, se usó una curva de titulación de once puntos y ELISA para determinar la afinidad de unión de anticuerpos anti-ADDL a ADDLs y ?ß monomérico (?ß?-40) a lo largo de un amplio intervalo de concentraciones. Como se muestra en la Figura 2, los anticuerpos anti-ADDL 3B3 y 19.3 eran altamente selectivos de ADDL. Además, los anticuerpos se compararon en un ensayo de unión basado en células para determinar la habilidad de anticuerpos para bloquear la unión de ADDL a neuronas. Como se muestra en la Figura 3, se añadieron ADDLs, preincubados con concentraciones crecientes de los anticuerpos anti-ADDL 3B3 y 19.3, a neuronas hipocampales primarias, y se usó una curva de titulación para demostrar cuantitativamente la habilidad del anticuerpo para bloquear la unión de ADDL a neuronas. En su conjunto, estos resultados muestran que los anticuerpos anti-ADDL atenúan profundamente la unión neuronal en un formato basado en células.

Se condujo una evaluación de la secuencia de aminoácidos para identificar sitios potenciales de desamidacion. Los residuos de ácido aspártico y asparangina presentes en los CDRs de anticuerpos terapéuticos son conocidas por experimentar desamidacion y formación de isoaspartato (Valsak y lonescu, 2008, Curr.Pharm.Biotech., 9:468-481 ; Aswad et al., 2000, J. Pharm.Biomed.Anal., 21 :1129-1 136), la formación del cual puede alterar la potencia de unión de un anticuerpo y, a su vez, reducir la efectividad del anticuerpo para su uso como un terapéutico. Así, aquellos con habilidad en la técnica reconocerían y apreciarían que la presencia de una asparangina o de un ácido aspártico dentro de los CDRs para el anticuerpo 19.3 no serían deseables. En consecuencia, los Solicitantes alteraron el residuo de asparangina en la posición 33 de la cadena ligera de CDR1 para optimizar la estabilidad del anticuerpo anti-ADDL 19.3 (Cuadro 4B). Los derivados del anticuerpo 19.3 fueron producidos con la sustitución de serina (SEQ ID NO: 55), treonina (SEQ ID NO: 56), o ácido glutámico (SEQ ID NO: 67) por la asparangina en la posición 33 (SEQ ID NO: 1) en CDR1 . La sustitución del ácido aspártico (SEQ ID NO: 68) por la asparangina en la posición 33 también fue generada como un control. Estos cambios retirarán la posibilidad de desamidación de la asparangina en la posición 33 en CDR1. Los derivados de 19.3 fueron generados como se describe en el Ejemplo 3 y caracterizados y descritos en el Ejemplo 4 en cuanto a derivados con las sustituciones de serina (SEQ ID NO: 55), treonina (SEQ ID NO: 56) , ácido glutámico (SEQ ID NO: 67), y ácido aspártico (SEQ ID NO: 68), para evaluar la estabilidad de las nuevas construcciones. Como se muestra en las Figuras 4B y 4C, respectivamente, dos derivados representativos, 19.3S33 (SEQ ID NO: 55) y 19.3T33 (SEQ ID NO: 56), habían mejorado la estabilidad de unión después de un mes de incubación a temperaturas variables. Otras sustituciones de aminoácidos en la cadena ligera de CDR1 por la asparangina en las posiciones 33 y 35 (SEQ ID NO: 53) y en la cadena ligera CDR2 por la asparangina en la posición 58 (SEQ ID NO: 54) son propuestas en los Cuadros 4B y 4C para evaluación posterior.

Para determinar la farmacocinética de los anticuerpos anti-ADDL madurados por afinidad de la presente invención, se realizaron una serie de estudios in vitro e in vivo. La unión de anticuerpos al receptor FcRn a pH 6,0 ha demostrado ser predictiva de la semivida del anticuerpo en seres humanos (Zalevsky et al., 2010, Nat. Biotech., 28(2): 157-159) y a pH 7,3 (USSN 61/307,182). La unión y la disociación de los anticuerpos anti-ADDL de la presente invención a FcRn humano inmovilizado se evaluó con un análisis de interacción sin marcador, tal como el ofrecido por Biacore™ Life Sciences, Biacore™ T-100 (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Se usó un sensograma ajustado para mostrar la unión inicial a pH 6,0 y después la disociación de anticuerpos a pH 7,3 a partir de 180 segundos. Se insertó un punto de aviso (Estabilidad) a los 5 segundos después del final de la unión a pH 6,0 y el "% unido" se calculó como UREstabiiidad/URuni0n (%)· Como se muestra en la Figura 5, la velocidad de disociación para el 3B3 humanizado era notablemente más lenta que la de los siete anticuerpos anti-ADDL de la presente invención, que incluían el anticuerpo 19.3 y tres anticuerpos de comparación. En el sentido de que se cree que la velocidad de disociación lenta es un indicador de mala PK in vivo, se realizó un estudio in vivo adicional en ratones transgénicos con FcRn (ratones con FcRn humano 276 heterocigotos, Jackson Laboratorios, Bar Harbor, ME). Cuando a los ratones transgénicos con FcRn se les administró por vía intravenosa (IV) 10 mg/kg de anticuerpo 3B3 o anticuerpo 19.3, se determinó una diferencia significativa en la farmacocinética. Como se muestra en la Figura 7, la semivida (VA) del anticuerpo anti-ADDL 3B3 era relativamente corta (29 ± 9 horas), lo que concuerda con la predicción de los datos del Biacore™ in vitro, aunque la semivida para el anticuerpo anti-ADDL 19.3 era significativamente más prolongada (77 ± 6 horas). En general, un mal PK, como se observa con el anticuerpo 3B3, excluiría un desarrollo adicional de un anticuerpo para su uso como agente terapéutico debido a su corta biodisponibilidad.

Para confirmar la semivida predicha del anticuerpo anti-ADDL 19.3 en primates, se condujo un estudio farmacocinética primate para el anticuerpo en un cohorte de monos rhesus de cisterna magna cateterizada. Los animales fueron dosificados con una sola inyección embolada intravenosa (IV) o subcutánea (SC) de anticuerpo anti-ADDL 19.3 (5 mg/kg) y se recolectaron muestras de sangre después de la administración del anticuerpo. Al mismo tiempo, se recolectaron muestras de CSF del catéter de cisterna magna a intervalos cronometrados y se determinó la concentración de anticuerpo anti— ADDL 19.3 en suero y CSF con un ensayo ELISA IgG antihumano. Cuando a los animales se les administró el anticuerpo anti-ADDL 19.3 por una sola inyección embolada IV se observó una ti/2 de 254 ± 28 horas (Figura 8), mientras que se observó una ti/2 de 204 + 49 horas para la administración subcutánea. Adicionalmente. Los Solicitantes encontraron que el anticuerpo anti-ADDL 19.3 fue capaz de cruzar en el CSF de primate, en donde incrementó la concentración durante las primeras 48 horas y alcanzó un pico a aproximadamente 0.1 % del anticuerpo dosificado (Figura 9).

En un intento por determinar la cantidad de anticuerpo que atraviesa la barrera hematoencefálica y entra en el CSF y el cerebro, el anticuerpo anti-ADDL 19.3 y dos anticuerpos de comparación (Comp 1 y Comp 2) se marcaron con 125l y se administraron a ratones de edad avanzada (doce meses de edad) que sobreexpresan hAPP, un modelo de roedor para la AD. Dos horas después de la dosificación IV se observa aproximadamente el 0.02% del anticuerpo 19.3 en el CSF (Figura 10A), mientras que se observa aproximadamente el 0.19% del anticuerpo 19.3 en el cerebro (Figura 10B). Se observaron niveles similares para los dos anticuerpos de comparación (Figuras 10A y 10B). Cuando el análisis inmunocitoquímico se llevó a cabo en secciones de cerebro de los ratones dosificados y se determinó la localización del anticuerpo anti-ADDL 19.3 (flecha en la Figura 10C), se observó una concentración de anticuerpo asociada con la deposición de ?ß en las placas (Figura 10D). Esto demuestra que el anticuerpo anti-ADDL 19.3 penetraba en el CSF y se concentraba en el cerebro. Recientemente se demostró que los ADDLs exógenos se depositaban en placas cuando se administraban a ratones que sobreexpresan hAPP (Gaspar et al., 2010, Exp. Neurol., 223: 394-400). Así, estos descubrimientos demuestran que el anticuerpo anti-ADDL 19.3 localizado unido a ADDLs circulantes se asociaba con las placas.

Para evaluar adicionalmente la eficacia in vivo de anticuerpos anti-ADDL, se evaluó la habilidad del anticuerpo 19.3 para bloquear la deposición de ADDLs en placas en crecimiento en ratones transgénicos con hAPP después de cuatro infusiones semanales de ADDLs biotinilados (bADDLs) en el hipocampo de ratones de 12 meses de edad para marcar las placas existentes (Figura 1 1A), los animales recibieron entonces cuatro infusiones intravenosas semanales de anticuerpo 19.3 (Figura 1 1A). La deposición de nuevo material (ADDLs) en placas en crecimiento se evaluó por análisis inmunocitoquímico. Como se observa en las Figuras 1 1 B y 1 1 C, el anticuerpo anti-ADDL 19.3 reducía significativamente la deposición de ADDLs en la periferia de placas existentes (Figura 11 C) en comparación con los ratones tratados con transportador solamente (Figura 1 1 B). En su conjunto, estos resultados demuestran que un anticuerpo anti-ADDL, en concreto, el anticuerpo 19.3, era capaz de atravesar la barrera hematoencefálica, unirse a ADDLs y bloquear la deposición de nuevo material en placas en crecimiento.

La unión de ADDL también puede tener efectos a largo plazo sobre neuronas. Estudios recientes han demostrado que la unión de ADDL a neuronas hipocampales puede iniciar una cascada de señalización que de como resultado la fosforilación de tau (De Felice et al., 2006, Neurobiol. Aqinq, 29: 394-400). También se ha demostrado que un componente de esta cascada de señalización, GSK-3p, está modulado por la unión de ADDL in vivo e in vitro (Ma et al., 2006, J. Neurosci. Res., 83: 374-384). Ma, et al., 2006, descubrieron que la inmunización pasiva de ratones con hAPP con un anticuerpo que reducía los ADDLs también reducía los niveles de GSK-3p y la fosforilación de tau en la corteza. Este descubrimiento confirma un vínculo entre ?ß y tau fosforilada, y sugiere que la unión de ADDL puede desencadenar acontecimientos que conducen a la agregación intracelular de tau. Además, los datos sugieren que los anticuerpos que impiden la unión de ADDLs a neuronas y la pérdida asociada de espinas sinápticas, tales como los anticuerpos de la presente invención, podrían mejorar las consecuencias cognitivas y/o patológicas asociadas con la enfermedad de Alzheímer y enfermedades relacionadas.

Ahora se han generado anticuerpos monoclonales que reconocen de forma diferencial conformaciones multidimensionales de ligandos difundibles derivados de ?ß, es decir, ADDLs). Estos anticuerpos están humanizados y, en algunas modalidades, madurados por afinidad. Los anticuerpos distinguen ventajosamente entre enfermedad de Alzheimer y extractos de cerebro humano de control, e identifican oligómeros endógenos en cortes de cerebro con enfermedad de Alzheimer y en células hipocampales cultivadas. Además, los anticuerpos de la presente invención neutralizan los ADDLs endógenos y sintéticos en solución. Los denominados ADDLs "sintéticos" se producen in vitro mezclando ?ß1-42 purificado en condiciones que generan ADDLs. Véase la Patente de Estados Unidos No. 6,218,506. Los anticuerpos descritos en la presente memoria presentan un alto grado de selectividad por ADDLs, con una detección mínima de especies de ?ß monomérico. Además, estos anticuerpos bloquean de forma diferencial la habilidad de las preparaciones que contienen ADDL para unirse a cultivos primarios de neuronas hipocampales de rata y líneas celulares de neuroblastoma inmortalizadas, y también bloquean el ensamblaje de ADDL. Este descubrimiento demuestra que estos anticuerpos poseen una habilidad diferencial para reconocer una conformación multidimensional de ADDLs a pesar de un reconocimiento de secuencia lineal y afinidades similares. Puesto que se sabe que los ADDLs se asocian con un subconjunto de neuronas y alteran la función neuronal normal, los anticuerpos de la presente invención encuentran utilidad en la prevención de la unión de ADDL a neuronas y el ensamblaje de ADDLs, y, a su vez, se pueden usar en el tratamiento de enfermedades relacionadas con ADDL, incluyendo la enfermedad de Alzheimer.

Por consiguiente, una modalidad de la presente invención es un anticuerpo aislado que reconoce de forma diferencial una o más conformaciones multidimensionales de ADDLs. Un anticuerpo "aislado" de la presente invención se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos. Sin embargo, la molécula puede incluir algunos agentes o restos adicionales que no afecten perjudicialmente a las características básicas del anticuerpo (por ejemplo, especificidad de unión, actividad neutralizante, etc.).

Un anticuerpo que es capaz de unirse específicamente a una o más conformaciones multidimensionales de ADDLs, se une a ADDLs particulares derivados de la oligomerización de ?ß1-42, pero no reacciona de forma cruzada con otros péptidos de ?ß, en concreto ?ß1-12, ?ß1-28, ?ß1-40 y ?ß 12-28, según se determina por análisis de transferencia de western como se describe en la presente memoria; y se une preferentemente a ADDLs en solución. La unión específica entre dos entidades generalmente se refiere a una afinidad de al menos 06, 107, 108, 109 ó 1010 M"1. Se desean afinidades superiores a 108 M"1 para conseguir una unión específica.

En modalidades particulares, un anticuerpo que es capaz de unirse específicamente a una conformación multidimensional de uno p más ADDLs es también formulado en contra, es decir, un animal se inmuniza con conformaciones multidimensionales de ADDLs. En otras modalidades, un anticuerpo que es capaz de unirse específicamente a una conformación multidimensional de uno o más ADDLs es formulado en contra de un péptido que forma oligómeros de bajo n, tal como Ap -42[Nle35-Dpro37].

El término "epítopo" se refiere a un sitio en un antigeno contra el que responden células T y/o B o un sitio en una molécula contra el que se producirá un anticuerpo y/o al que se unirá un anticuerpo. Por ejemplo, un epítopo puede ser reconocido por un anticuerpo que defina el epitopo.

Un epítopo lineal es un epítopo en el que una secuencia primaria de aminoácidos comprende el epítopo reconocido. Un epítopo lineal incluye típicamente al menos 3 y, más habitualmente, al menos 5, por ejemplo, de aproximadamente 6 a aproximadamente 10 aminoácidos en una secuencia única.

Un epítopo conformacional, al contrario que un epítopo lineal, es un epítopo en donde la secuencia primaria de los aminoácidos que comprenden el epítopo no es el único componente que define al epítopo reconocido (por ejemplo, un epítopo en el que la secuencia primaria de aminoácidos no es necesariamente reconocida por el anticuerpo que define el epítopo). Típicamente, un epítopo conformacional incluye un número aumentado de aminoácidos respecto a un epítopo lineal. Con respecto al reconocimiento de epítopos conformacionales, el anticuerpo reconoce una estructura tridimensional del péptido o proteína. Por ejemplo, cuando una molécula proteica se pliega para formar una estructura tridimensional, ciertos aminoácidos y/o la cadena principal polipeptidica que forman el epítopo conformacional se yuxtaponen permitiendo que el anticuerpo reconozca el epítopo. Los métodos de determinación de la conformación de epítopos incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, cristalografía de rayos x, espectroscopia de resonancia magnética nuclear bidimensional y mareaje de espín dirigido y espectroscopia de resonancia paramagnética electrónica. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996) Vol. 66, Morris (Ed.).

Los ligandos difundibles derivados de amiloide ?ß o ADDLs se refieren a oligómeros solubles de ?ß1-42 que, de forma deseable, están compuestos por agregados de menos de ocho o nueve péptidos de ?ß1-42 y que se encuentran asociados con la enfermedad de Alzheimer. Esto es al contrario que intermedios de agregación de alto peso molecular, que forman cadenas de micelas que conducen a la formación de fibrillas.

Como se ejemplifica en la presente memoria, los anticuerpos de la presente invención se unen a o reconocen al menos una conformación multidimensional de un ADDL. En modalidades particulares, estos anticuerpos se unen a al menos dos, al menos tres o al menos cuatro conformaciones multidimensionales de un ADDL. Las conformaciones multidimensionales de ADDLs pretenden incluir dímeros, trímeros, tetrámeros, pentámeros, hexámeros, heptámeros, octámeros, nonámeros, decámeros, etc., según se definen por análisis mediante SDS-PAGE. Debido a que las designaciones de trímero, tetrámero, etc. pueden variar con el método de ensayo empleado (véase, por ejemplo, Bitan, et al., 2005, Amyloid, 12: 88-95), la definición de trímero, tetrámero y similares, como se usan en la presente memoria, es de acuerdo con el análisis de SDS-PAGE. Para ilustrar las capacidades de unión diferencial de los anticuerpos del presente documento, se ha descubierto que ciertos anticuerpos reconocerán una conformación multidimensional, por ejemplo, tetrámeros de ADDLs (Patente de Estados Unidos No. 7,780,963, anticuerpos munnos 2D6 y 4E2), mientras que otros anticuerpos reconocen varias conformaciones multidimensionales, por ejemplo, trímeros y tetrámeros de ADDLs (Patente de Estados Unidos No. 7,780,963, anticuerpos murinos 2A10, 2B4, 5F10 y 20C2 y anticuerpo humanizado 20C2). Como tal, el anticuerpo de la presente invención tiene características especificas de oligómero. En modalidades particulares, una conformación multidimensional de un ADDL se asocia con una estructura polipeptídica específica que da como resultado un epítopo conformacional que es reconocido por un anticuerpo de la presente invención. En otras modalidades, un anticuerpo de la invención se une específicamente a un ADDL de conformación multidimensional que tiene un intervalo de tamaño de aproximadamente un trímero o tetrámero, que tiene pesos moleculares en exceso de >50 kDa.

Aunque los anticuerpos de la presente invención pueden tener epítopos lineales similares, dichos epítopos lineales no son totalmente indicativos de las características de unión de estos anticuerpos, es decir, habilidad para bloquear la unión de ADDL a neuronas, impedir la fosforilación de tau e inhibir el ensamblaje de ADDL, porque, como es bien sabido por el experto en la técnica, el epítopo lineal puede corresponder solamente a una porción del epítopo del antígeno (véase, por ejemplo, Breitling y Dübel, 1999, Recombinant Antibodies, John Wiley & Sons, Inc., NY, pág. 1 15). Los anticuerpos de la presente invención pueden distinguirse de los de la técnica como capaces de reconocer de forma diferencial ADDLs multidimensionales y, por consiguiente, bloquear de forma diferencial la unión de ADDL a neuronas, impedir de forma diferencial la fosforilación de tau e inhibir de forma diferencial el ensamblaje de ADDL.

Un anticuerpo, como se usa de acuerdo con la presente invención, incluye, pero sin limitación, anticuerpos policlonales o monoclonales, y anticuerpos quiméricos, humanos (por ejemplo, aislados de células B), humanizados, neutralizantes, biespecificos o de cadena sencilla de los mismos. En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención es monoclonal. Para la producción de anticuerpos, diversos hospedadores incluyendo cabras, conejos, pollos, ratas, ratones, seres humanos y otros pueden inmunizarse por inyección con ADDL naturales o sintéticos. Los métodos para producir anticuerpos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Kohler y Milstein, 1975, N ature, 256:495-497: Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1988.

Dependiendo de la especie de hospedador, pueden usarse diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica. Los adyuvantes usados de acuerdo con la presente invención aumentan de forma deseable la respuesta intrínseca a ADDLs sin causar cambios conformacionales en el inmunógeno que afecten a la forma cualitativa de la respuesta. Los adyuvantes particularmente adecuados incluyen monofosforil lípido A 3-des-O-acilado (MPL™¡ RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton, MT; véase GB 2220211) y emulsiones de aceite en agua, tales como escualeno o aceite de cacahuate, opcionalmente en combinación con inmunoestimulantes, tales como monofosforil lípido A (véase Stoute, et al. ,1997, N. Enql. J. Med., 336:86-91), péptidos de muramilo (por ejemplo, N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1 '-2'dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (E-PE), N-acetilglucosaminil-N-acetilmuramil-L-AI-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxi propilamida (DTP-DPP)) u otros componentes de la pared celular bacteriana. Los ejemplos específicos de emulsiones de aceite en agua incluyen MF59 (WO 90/14837), que contiene Escualeno al 5%, TWEEN™ 80 al 0,5% y SPAN 85 al 0,5% (que contiene opcionalmente diversas cantidades de MTP-PE), formulado en partículas submicrométricas usando un microfluidizador tal como el microfluidizador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA); SAF que contiene Escualeno al 10%, TWEEN™ 80 al 0,4%, polímero de bloque de PLURONIC® L121 al 5% y thr-MDP, microfluidizado en una emulsión submicrométrica o agitado vorticialmente para generar una emulsión de mayor tamaño de partícula; y sistema adyuvante RIBI™ (RAS) (Ribi ImmunoChem, Hamilton, MT), que contiene escualeno al 2%, TWEEN™ 80 al 0,2% y uno o más componentes de la pared celular bacteriana tales como monofosforil lípido A, dimicolato de trehalosa (TDM) y esqueleto de la pared celular (CWS).

Otra clase de adyuvantes son adyuvantes de saponina, tales como STIMULON™ (QS-21 , Aquila, Framingham, MA) o partículas generadas a partir de los mismos, tales como ISCOMs (complejos inmunoestimulantes) e ISCOMATRIX® (CSL Ltd., Parkville, Australia). Otros adyuvantes adecuados incluyen Adyuvante Completo de Freund (CFA), Adyuvante Incompleto de Freund (IFA), geles minerales tales como hidróxido de aluminio y sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles de PLURONIC®, polianiones, péptidos, CpG (WO 98/40100), hemocianina de lapa californiana, dinitrofenol y citocinas tales como interleucinas (IL-1 , IL-2 e IL-12), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) y factor de necrosis tumoral (TNF). Entre los adyuvantes usados en seres humanos, son particularmente adecuados BCG (bacilos de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.

Un anticuerpo contra un ADDL de conformación multidimensional se genera por inmunización de un animal con ADDLs. En general, pueden generarse ADDLs sintéticamente o por expresión y purificación de fragmentos recombinantes. Pueden prepararse ADDLs sintéticos como se describe en la presente memoria o de acuerdo con los métodos descritos en la Patente de Estados Unidos No. 6,218,506, y 7,811 ,563 o en las solicitudes de Estados Unidos en trámite junto con la presente No. 2007/0218499, 2010/0143396 y 2010/0240868, las cuales se incorporan aquí en su totalidad como referencia. Además, los ADDLs pueden fusionarse con otra proteína, tal como hemocianina de lapa californiana, para generar un anticuerpo contra la molécula quimérica. Los ADDLs pueden limitarse conformacionalmente para formar un epítopo útil como se describe en la presente memoria, y además pueden asociarse con una superficie, por ejemplo, unirse físicamente o enlazarse químicamente a una superficie de tal forma que se permita la producción de una conformación que sea reconocida por los anticuerpos de la presente invención.

Pueden prepararse anticuerpos monoclonales contra conformaciones multidimensionales de ADDLs usando cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo. Estas incluyen, pero sin limitación, la técnica del hibridoma, la técnica del hibridoma de células B humanas y la técnica del hibridoma con EBV (Kohler, et al. ,1975, Nature 256: 495-497; Kozbor, et al., 1985, J. Immunol. Methods 81 : 31-42; Cote, et al., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. 80: 2026-2030; Colé, et al., 1984, Mol. Cell Biol. 62:109-120).

En modalidades particulares, los anticuerpos de la presente invención están humanizados. Pueden producirse anticuerpos quiméricos o humanizados por corte y empalme de genes de anticuerpos de ratón con genes de anticuerpos humanos para obtener una molécula con una especificidad de antígeno y una actividad biológica apropiadas (véase Morrison, et al., 1984, Proc. Nati. Acad. Sci. 81 , 6851-6855; Neuberger, et al., 1984, Nature 312: 604-608; Takeda, et al., 1985, Nature 314: 452-454; Queen, et al., 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 10029-10033; WO 90/07861). Por ejemplo, un anticuerpo de ratón se expresa como el fragmento Fv o Fab en un vector de selección de fago. El gen para la cadena ligera (y en un experimento en paralelo, el gen para la cadena pesada) se intercambia por una biblioteca de genes de anticuerpos humanos. Los anticuerpos de fago que se unen todavía al antígeno se identifican después. Este método, comúnmente conocido como intercambio de cadenas, proporcionaba anticuerpos humanizados que deberían unirse al mismo epítopo que el anticuerpo de ratón del que descienden (Jespers, et al., 1994, Biotechnoloqy NY 12: 899-903). Como alternativa, el intercambio de cadenas puede realizarse a nivel de proteína (véase, Figini, et al., 1994, J. Mol. Biol. 239: 68-78).

También pueden obtenerse anticuerpos humanos usando métodos de presentación en fago. Véanse, por ejemplo, WO 91/17271 y WO 92/01047. En estos métodos, se producen bibliotecas de fagos en las que los miembros presentan diferentes anticuerpos en sus superficies externas. Los anticuerpos se presentan habitualmente como fragmentos Fv o Fab. Los anticuerpos de presentación en fago con una especificidad deseada se seleccionan mediante enriquecimiento por afinidad hacia ADDLs. También pueden producirse anticuerpos humanos contra ADDLs a partir de mamíferos transgénicos no humanos que tienen transgenes que codifican al menos un segmento del locus de inmunoglobulina humana y un locus de inmunoglobulina endógena inactivado. Véase, por ejemplo, WO 93/12227 y WO 91/10741. Los anticuerpos humanos pueden seleccionarse por experimentos de unión competitiva, o de otro modo, tener la misma especificidad de epítopo que un anticuerpo de ratón particular. Dichos anticuerpos conservan generalmente las propiedades funcionales útiles de los anticuerpos de ratón. También pueden proporcionarse anticuerpos policlonales humanos en forma de suero de seres humanos inmunizados con un agente inmunogénico. Opcionalmente, dichos anticuerpos policlonales pueden concentrarse mediante purificación por afinidad usando ADDLs como reactivo de afinidad.

Como se ejemplifica en la presente memoria, también pueden producirse anticuerpos humanizados por revestimiento o recubrimiento superficial de anticuerpos murinos. El revestimiento implica sustituir solamente los aminoácidos de la región fijada a la superficie en las regiones variables pesada y ligera de ratón con los de una secuencia de anticuerpo humana homologa. La sustitución de los aminoácidos de la superficie de ratón con restos humanos en la misma posición de una secuencia humana homologa ha demostrado reducir la inmunogenicidad del anticuerpo de ratón, al tiempo que conserva su' unión a ligando. La sustitución de los restos exteriores generalmente tiene escaso o ningún efecto sobre los dominios interiores o sobre los contactos interdominio. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 6,797,492.

Pueden diseñarse anticuerpos humanos o humanizados para que tengan regiones constantes de IgG, IgD, IgA, IgM o IgE y cualquier isotipo, incluyendo lgG1 , lgG2, lgG3 e lgG4. En modalidades particulares, un anticuerpo de la invención es IgG o IgM, o una combinación de las mismas. En una modalidad específica, los anticuerpos de la presente invención son lgG2. Los expertos en la técnica entenderían que pueden utilizarse otras isoformas en la presente memoria. Se proporcionan secuencias ejemplares para estas isoformas en las SEQ ID NO: 43-45. Otras modalidades de la presente invención incluyen una región constante formada por la incorporación selectiva de secuencias de lgG4 humanas en una región constante de lgG2 humana convencional. Un Fe de lgG2 muíante ejemplar es lgG2m4, expuesto en la presente memoria como SEQ ID NO: 46. Los anticuerpos pueden expresarse como tetrámeros que contienen dos cadenas ligeras y dos pesadas, como cadenas pesadas separadas y cadenas ligeras separadas o como anticuerpos de cadena sencilla en los que los dominios variables de cadena pesada y ligera están unidos por un espaciador. Se conocen bien en la técnica procedimientos para la producción de anticuerpos de cadena sencilla.

Se describen anticuerpos humanizados ejemplares producidos por injerto de CDR y revestimiento en las Patentes de Estados Unidos Nos. 7,780,963, 7,731 ,962, y 7,8 1 ,563.

También se contemplan diacuerpos. Un diacuerpo se refiere a una construcción de anticuerpo obtenida por ingeniería genética preparada por aislamiento de los dominios de unión (tanto cadena pesada como ligera) de un anticuerpo de unión y suministro de un resto de enlace que une o relaciona operativamente las cadenas pesada y ligera en la misma cadena polipeptídica, conservando de este modo la función de unión (véase Holliger et al., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444; Poljak, 1994, Structure 2: 1 121-1123). Esto forma, en esencia, un anticuerpo radicalmente abreviado, que sólo tiene el dominio variable necesario para unirse al antígeno. Usando un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se fuerza a que los dominios se emparejen con los dominios complementarios de otra cadena y creen dos sitios de unión a antígeno. Estos fragmentos de anticuerpo diméricos, o diacuerpos, son bivalentes y biespecíficos. El experto en la técnica apreciará que puede usarse cualquier método para generar diacuerpos. Se describen métodos adecuados por Holliger, et al., 1993, anteriormente, Poljak, 1994, anteriormente, Zhu, et al., 1996, Biotechnology 14: 192-196 y Patente de Estados Unidos No. 6,492,123, incorporados en la presente memoria en su totalidad como referencia.

Los fragmentos de un anticuerpo aislado de la invención también pueden incluirse expresamente en la presente invención. Los fragmentos pretenden incluir fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos F(ab'), fragmentos scFv biespecíficos, fragmentos Fv y fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab, así como aptámeros peptídicos. Por ejemplo, se producen fragmentos F(ab')2 por digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo de la invención, mientras que se generan fragmentos Fab reduciendo los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')2. Como alternativa, pueden construirse bibliotecas de expresión de Fab para permitir una identificación rápida y sencilla de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada (véase Huse, et al., 1989, Science 254: 1275-1281). En modalidades particulares, los fragmentos de anticuerpo de la presente invención son fragmentos de anticuerpos neutralizantes que conservan el sitio de unión a la región variable de los mismos, es decir, el fragmento de unión a antígeno. Son ejemplares fragmentos F(ab')2, fragmentos F(ab') y fragmentos Fab. Véase, en general, Immunoloqy: Basic Processes, 1985, 2a edición, J. Bellanti (Ed.) págs. 95-97.

Los aptámeros peptídicos que reconocen de forma diferencial conformaciones multidimensionales de ADDLs pueden diseñarse de forma racional o explorarse en una biblioteca de aptámeros (por ejemplo, proporcionada por Aptanomics SA, Lyon, Francia). En general, los aptámeros peptídicos son moléculas de reconocimiento sintéticas cuyo diseño se basa en la estructura de anticuerpos. Los aptámeros peptídicos consisten en un bucle peptídico variable unido en ambos extremos a un armazón de proteína. Esta limitación estructural doble aumenta enormemente la afinidad de unión del aptámero peptídico hasta niveles comparables a los de un anticuerpo (intervalo nanomolar).

Se describen secuencias de ácido nucleico ejemplares que codifican regiones variables de cadena pesada y ligera para usar en la producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de la presente invención en la presente memoria en las SEQ ID NO: 14 y 16. Como apreciará el experto en la técnica, las regiones variables de cadena pesada descritas en la presente memoria, tales como las mostradas en la SEQ ID NO: 16, pueden usarse en combinación con cualquiera de las regiones variables de cadena ligera descritas en la presente memoria para generar anticuerpos con afinidades, disociación, epítopos y similares modificados.

Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la presente invención pueden tener restos adicionales unidos a los mismos. Por ejemplo, una microesfera o microparticula puede estar unida al anticuerpo o fragmento de anticuerpo, como se describe en la Patente de Estados Unidos No. 4,493,825, cuya descripción se incorpora en la presente memoria en su totalidad como referencia.

Además, una modalidad particular abarca un anticuerpo o fragmentos de anticuerpo que se mutan y seleccionan por un aumento de la afinidad de antígeno, la actividad neutralizante (es decir, la capacidad para bloquear la unión de ADDLs a células neuronales o la capacidad para bloquear el ensamblaje de ADDL) o una constante de disociación modificada. Cepas mutantes de E. coli (Low, et al., 1996, J. Mol. Biol. 260: 359-368), intercambio de cadenas (Figini, et al., 1994, anteriormente) y mutagénesis por PCR son métodos establecidos para mutar moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos. A modo de ilustración, puede seleccionarse una afinidad aumentada por contacto de un gran número de anticuerpos de fago con una pequeña cantidad de antígeno biotinilado de modo que los anticuerpos compitan por la unión. En este caso, el número de moléculas de antígeno debería superar el número de anticuerpos de fago, pero la concentración de antígeno debía estar algo por debajo de la constante de disociación. Por lo tanto, los anticuerpos de fago mutados predominantemente con una afinidad aumentada se unen al anticuerpo biotinilado, mientras la mayor parte de los anticuerpos de fago de afinidad más débil permanecen no unidos. Después, la estreptavidina puede contribuir al enriquecimiento de los anticuerpos de fago mutados de mayor afinidad a partir de la mezcla (Schier, et al., 1996, J. Mol. Biol. 255: 28-43). Se describen en la presente memoria secuencias de aminoácidos de CDR3 de cadena ligera madurada por afinidad (véase el Cuadro 4), abarcando modalidades particulares una secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO: 3 y modalidades específicas de las SEQ ID NO: 7-13. La presente invención también abarca variaciones alternativas para la CDR1 (SEQ ID NO: 53) y CDR2 (SEQ ID NO: 54) de la cadena ligera.

Para algunas aplicaciones terapéuticas puede ser deseable reducir la disociación del anticuerpo del antígeno. Para conseguir esto, los anticuerpos de fago se unen a antígeno biotinilado y se añade un exceso de antígeno no biotinilado. Después de un periodo de tiempo, predominantemente los anticuerpos de fago con la menor constante de disociación pueden recogerse con estreptavidina (Hawkins, et al., 1992, J. Mol. Biol. 226: 889-96).

Diversos inmunoensayos incluyendo los descritos en la presente memoria pueden usarse para una exploración para identificar anticuerpos, o fragmentos de los mismos, que tengan la especificidad deseada por conformaciones multidimensionales de ADDLs. Se conocen bien en la técnica numerosos protocolos para unión competitiva (por ejemplo, ELISA), ensayos de aglutinación con látex, ensayos inmunorradiométricos, cinética (por ejemplo, análisis BIACORE™) usando anticuerpos policlonales o monoclonales, o fragmentos de los mismos. Dichos inmunoensayos implican típicamente la medición de la formación de complejo entre un anticuerpo específico y su antígeno afín. Un inmunoensayo basado en monoclonales de dos sitios que utiliza anticuerpos monoclonales reactivos hacia dos epítopos no ¡nterferentes es adecuado, pero también puede emplearse un ensayo de unión competitiva. Dichos ensayos también pueden usarse en la detección de conformaciones multidimensionales de ADDLs en una muestra.

Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo también puede someterse a otros ensayos de actividad biológica, por ejemplo, desplazamiento de la unión de ADDL a neuronas o células hipocampales cultivadas o bloqueo del ensamblaje de ADDL, para evaluar la actividad neutralizante o farmacológica y la eficacia potencial como agente profiláctico o terapéutico. Dichos ensayos se describen en la presente memoria y son bien conocidos en la técnica.

Pueden producirse anticuerpos o fragmentos de anticuerpos y mantenerse como hibridomas o, como alternativa, producirse de forma recombinante en cualquier sistema de expresión bien establecido incluyendo, pero sin limitación, E. coli, levadura (por ejemplo, Saccharomyces spp. y Pichia spp.), baculovirus, células de mamífero (por ejemplo, mieloma, CHO, COS), plantas o animales transgénicos (Breitling y Dübel, 1999, en: Recombinant Antibodies, John Wiley & Sons, Inc., NY, págs. 1 19-132). Pueden aislarse anticuerpos y fragmentos de anticuerpos usando cualquier método apropiado incluyendo, pero sin limitación, cromatografía de afinidad, moléculas de unión a inmunoglobulinas (por ejemplo, proteínas A, L, G o H), etiquetas unidas operativamente al anticuerpo o fragmento de anticuerpo (por ejemplo, etiqueta His, etiqueta FLAG®, etiqueta Strep, etiqueta c-myc) y similares. Véase, Breitling y Dübel, 1999, anteriormente.

Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de la presente invención tienen una diversidad de usos incluyendo el diagnóstico de enfermedades asociadas con una acumulación de ADDLs, el bloqueo o la inhibición de la unión de ADDLs a células neuronales, el bloqueo del ensamblaje de ADDL, el tratamiento profiláctica o terapéuticamente de una enfermedad asociada con ADDLs, la identificación de agentes terapéuticos que impidan la unión de ADDLs a neuronas y la prevención de la fosforilación de proteína tau en Ser202/Thr205.

Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de la presente invención son útiles en un método para bloquear o inhibir la unión de ADDLs a células neuronales. Este método de la invención se lleva a cabo poniendo en contacto una neurona, ¡n vitro o in vivo, con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención, de modo que se bloquee la unión de ADDLs a la neurona. En modalidades particulares, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención consigue una disminución de al menos un 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 97% en la unión de ADDLs en comparación con la unión de ADDLs en ausencia del anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El grado con el que un anticuerpo puede bloquear la unión de ADDLs a una neurona puede determinarse de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria, es decir, inmunocitoquimica o ensayo de fosfatasa alcalina basado en células, o cualquier otro ensayo adecuado. Los anticuerpos particularmente útiles para disminuir la unión de ADDLs a células neuronales incluyen los anticuerpos anti-ADDL ejemplares mostrados en las Patentes de Estados Unidos Nos. 7,731 ,962, 7,780,963, y 7,811 ,563, así como derivados y fragmentos de los mismos.

Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de la presente invención son útiles además en un método para bloquear o inhibir el ensamblaje de ADDLs. Este método implica poner en contacto una muestra que contiene péptidos de amiloide ß 1-42 con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención, de modo que se inhibe el ensamblaje de ADDL. El grado con el que un anticuerpo puede bloquear el ensamblaje de ADDLs puede determinarse de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria, es decir, FRET o polarización de fluorescencia o cualquier otro ensayo adecuado. Los anticuerpos particularmente útiles para bloquear el ensamblaje de ADDLs incluyen anticuerpos anti-ADDL que tienen una secuencia de aminoácidos de CDR3 expuesta en la SEQ ID NO: 10, asi como derivados y fragmentos de los mismos.

Los anticuerpos descritos en la presente memoria también son útiles en métodos para prevenir la fosforilación de la proteína tau en Ser202/Thr205. Este método implica poner en contacto una muestra que contiene proteína tau con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención, de modo que la unión de ADDLs a neuronas se bloquea impidiendo de este modo la fosforilación de la proteína tau. El grado con el que un anticuerpo puede impedir la fosforilación de la proteína tau en Ser202/Thr205 puede determinarse de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria o cualquier otro ensayo adecuado.

El bloqueo o disminución de la unión de ADDLs a neuronas, la inhibición del ensamblaje de ADDLs y la prevención de la fosforilación de la proteína tau en Ser202/Thr205 encuentran todas aplicación en métodos de tratamiento profiláctica o terapéuticamente de una enfermedad asociada con la acumulación de ADDLs. Por consiguiente, la presente invención también abarca el uso de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo en la presente memoria para prevenir o tratar una enfermedad asociada con la acumulación de ADDLs (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer o trastornos similares relacionados con la memoria). Pruebas en la técnica indican que niveles elevados de ?ß, pero no necesariamente placas agregadas, causan la demencia asociada a la enfermedad de Alzheimer y las posteriores anomalías de tau. Los ligandos difundibles derivados de ?ß están directamente implicados en la neurotoxicidad asociada con la enfermedad de Alzheimer. La técnica indica que los ADDLs están elevados en ratones transgénicos y pacientes con enfermedad de Alzheimer, y modulan la actividad funcional asociada con los procesos nemotécnícos en modelos animales. Por lo tanto, la eliminación de esta forma de ?ß podría proporcionar un alivio de la neurotoxicidad asociada con la enfermedad de Alzheimer. Como tal, el tratamiento con un anticuerpo de la presente invención que reduce la carga de ADDL en el sistema nervioso central demuestra eficacia para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. Los pacientes susceptibles de tratamiento incluyen individuos en riesgo de enfermedad pero que no muestran síntomas, así como pacientes que actualmente presenten síntomas. En el caso de la enfermedad de Alzheimer, prácticamente cualquiera está en riesgo de padecer la enfermedad de Alzheimer si vive lo bastante. Por lo tanto, el anticuerpo o fragmentos de anticuerpo de la presente invención pueden administrarse profilácticamente a la población en general sin la necesidad de ninguna evaluación del riesgo del paciente objeto. Los presentes métodos son especialmente útiles para individuos que tengan un riesgo genético conocido de enfermedad de Alzheimer. Dichos individuos incluyen los que tienen parientes a los que se ha diagnosticado la enfermedad y aquellos cuyo riesgo se determina por análisis de marcadores genéticos o bioquímicos. Los marcadores genéticos de riesgo para la enfermedad de Alzheimer incluyen mutaciones en el gen de la APP, particularmente mutaciones en la posición 717 y en las posiciones 670 y 671 , denominadas mutaciones de Hardy y Swedish respectivamente. Otros marcadores de riesgo son mutaciones en los genes de presenilina, PS1 y PS2, y ApoE4, historia familiar de enfermedad de Alzheimer, hipercolesterolemia o arterosclerosis. Los individuos que actualmente padecen la enfermedad de Alzheimer pueden reconocerse por una demencia característica, así como por la presencia de los factores de riesgo descritos anteriormente. Además, están disponibles varios ensayos de diagnóstico para identificar a individuos que tengan la enfermedad de Alzheimer. Estos incluyen la medición de los niveles de tau y ?ß1-42 en CSF. Los individuos que padecen la enfermedad de Alzheimer también pueden diagnosticarse por los criterios de la ADRDA o el método descrito en la presente memoria.

En pacientes asintomáticos, el tratamiento puede comenzar a cualquier edad, (por ejemplo, 10, 20, 30 años de edad). Habitualmente, sin embargo, no es necesario comenzar el tratamiento hasta que el paciente alcanza 40, 50, 60 ó 70 años de edad. El tratamiento implica típicamente múltiples dosificaciones durante un periodo de tiempo. El tratamiento puede controlarse mediante un ensayo para determinar la presencia de ADDLs con el tiempo.

En aplicaciones terapéuticas, una composición farmacéutica o medicamento que contiene un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención se administra a un paciente sospechoso de, o que ya padece dicha enfermedad asociada con la acumulación de ADDLs en una cantidad suficiente para curar, o al menos detener parcialmente, los síntomas de la enfermedad (bioquímicos, histológicos y/o conductuales), incluyendo sus complicaciones y sus fenotipos patológicos intermedios en el desarrollo de la enfermedad. En aplicaciones profilácticas, una composición farmacéutica o medicamento que contiene un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención se administra a un paciente susceptible de, o de otro modo en riesgo de una enfermedad asociada con la acumulación de ADDLs en una cantidad suficiente para conseguir una inmunidad pasiva en el paciente, eliminando o reduciendo de este modo el riesgo, disminuyendo la gravedad o retrasando la aparición de la enfermedad, incluyendo los síntomas bioquímicos, histológicos y/o conductuales de la enfermedad, sus complicaciones y los fenotipos patológicos intermedios presentes durante el desarrollo de la enfermedad. En algunos métodos, la administración de agentes reduce o elimina la alteración miocognitiva en pacientes que no han desarrollado todavía una patología de Alzheimer característica. En modalidades particulares, una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención es una cantidad que consigue al menos una disminución del 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 97% en la unión de ADDL a neuronas en el paciente en comparación con la unión de ADDLs en ausencia de tratamiento. Como tal, se disminuye la alteración de la potenciación a largo plazo/formación de memoria.

Las dosis eficaces de las composiciones de la presente invención para el tratamiento de las afecciones descritas anteriormente varían dependiendo de muchos factores diferentes, incluyendo los medios de administración, el estado fisiológico del paciente, si el paciente es un ser humano o un animal, otras medicaciones administradas y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Habitualmente, el paciente es un ser humano pero también pueden tratarse mamíferos no humanos tales como perros o mamíferos transgénicos.

Las dosificaciones de tratamiento se valoran generalmente para optimizar la seguridad y la eficacia. Para la inmunización pasiva con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, son adecuados intervalos de dosificación de aproximadamente 0.0001 a 100 mg/kg y, más habitualmente, de 0.01 a 5 mg/kg del peso corporal del hospedador. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser de 1 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal, o estar dentro del intervalo de 1-10 mg/kg. En algunos métodos, se administran simultáneamente dos o más anticuerpos de la invención con especificidades de unión diferentes, en cuyo caso la dosificación de cada anticuerpo administrado se incluye dentro de los intervalos indicados. Los anticuerpos se administran habitualmente en múltiples ocasiones, en las que los intervalos entre dosificaciones individuales pueden ser semanales, mensuales o anuales. Un régimen de tratamiento ejemplar implica la dosificación subcutánea, una vez cada dos semanas o mensualmente. Los intervalos también pueden ser irregulares según se indique por medición de los niveles en sangre de anticuerpo contra ADDLs en el paciente. En algunos métodos, la dosificación se ajusta para conseguir una concentración de anticuerpo en plasma de 1-1000 µg/ml y, en algunas modalidades, 25-300 µg ml. Como alternativa, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede administrarse como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso es necesaria una administración menos frecuente. La dosificación y la frecuencia varían dependiendo de la semivida del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanos y humanizados tienen semividas más prolongadas que los anticuerpos quiméricos y anticuerpos no humanos. Como se ha indicado anteriormente, la dosificación y la frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas se administra una dosificación relativamente reducida a intervalos relativamente infrecuentes a lo largo de un periodo de tiempo prolongado. Algunos pacientes continúan recibiendo tratamiento durante el resto de sus vidas. En aplicaciones terapéuticas, a veces es necesaria una dosificación relativamente elevada a intervalos relativamente cortos hasta que se reduzca o ponga fin a la progresión de la enfermedad y, preferentemente, hasta que el paciente muestre una mejoría parcial o completa de los síntomas de enfermedad. Después de eso, al paciente se le puede administrar un régimen profiláctico.

El anticuerpo y fragmentos de anticuerpo de la presente invención pueden administrarse como un componente de una composición farmacéutica o medicamento. Las composiciones farmacéuticas o medicamentos contienen generalmente el agente terapéutico activo y una diversidad de otros componentes farmacéuticamente aceptables. Véase Reminqton: The Science and Practice of Pharmacv. Alfonso R. Gennaro, editor, 20a ed. Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2000. La forma preferida depende del modo de administración deseado y de la aplicación terapéutica. Las composiciones farmacéuticas pueden contener, dependiendo de la formulación deseada, transportadores o diluyentes no tóxicos farmacéuticamente aceptables, que se definen como transportadores usados comúnmente para formular composiciones farmacéuticas para administración animal o humana. Los diluyentes se seleccionan para no afectar a la actividad biológica de la combinación. Los ejemplos de dichos diluyentes son agua destilada, solución salina fisiológica tamponada con fosfato, solución de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank.

Las composiciones farmacéuticas también pueden contener macromoléculas grandes metabolizadas lentamente tales como proteínas, polisacáridos tales como quitosano, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos y copolímeros (tales como SEPHAROSE™ funcionalizada con látex, agarosa, celulosa y similares), aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y agregados lipidíeos (tales como gotas de aceite o liposomas).

La administración de una composición farmacéutica o medicamento de la invención puede llevarse a cabo en una diversidad de vías incluyendo, pero sin limitación, inyección oral, tópica, pulmonar, rectal, subcutánea, intradérmica, intranasal, intracraneal, intramuscular, infraocular, o intratecal o intraarticular, y similares. La vía de administración más típica es la intravenosa seguida de la subcutánea, aunque pueden ser igualmente eficaces otras vías. También puede realizarse una inyección intramuscular en los músculos del brazo o de la pierna. En algunos métodos, se inyectan agentes directamente en un tejido particular en el que se han acumulado depósitos, por ejemplo, inyección intracraneal o intratecal. En algunas modalidades, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo se inyecta directamente en el cráneo o CSF. En otras modalidades, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se administra como una composición o dispositivo de liberación sostenida, tal como un dispositivo MEDIPAD™.

Para la administración parenteral, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de la invención pueden administrarse como dosificaciones inyectables de una solución o suspensión de la sustancia en un diluyente fisiológicamente aceptable con un transportador farmacéutico que puede ser un liquido estéril tal como agua, aceites, solución salina, glicerol o etanol. Además, pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, tensioactivos, sustancias tamponantes del pH y similares, en las composiciones. Otros componentes de las composiciones farmacéuticas son aquellos de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, por ejemplo, aceite de cacahuate, aceite de soya y aceite mineral. En general, los glicoles tales como propilenglicol o polietilenglicol son transportadores líquidos adecuados, particularmente para soluciones inyectables. Los anticuerpos pueden administrarse en forma de una preparación de implante o inyección de liberación prolongada que puede formularse de tal forma que permita una liberación sostenida del ingrediente activo.

Una composición ejemplar contiene un anticuerpo aislado, o fragmento de anticuerpo del mismo, de la presente invención formulado como un liquido transparente estéril a una concentración de al menos 10 mg/ml en solución salina isotónica tamponada (histidina 10 mM, cloruro sódico 150 mM, POLISORBATO 80 al 0,01% (p/v), pH 6,0). Una formulación de anticuerpo ejemplar se carga como viales de vidrio de 0.6 mi de una sola dosis cargados con 3.3 mi de solución por vial. Cada vial se tapona con un tapón revestido con TEFLON y se cierra herméticamente con una chapa de aluminio.

Típicamente, las composiciones se preparan como inyectables, como soluciones o suspensiones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución en o suspensión en transportadores líquidos antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse o encapsularse en liposomas o micropartículas tales como polilactida, poliglicolida o copolímero para una administración aumentada.

Para supositorios, los aglutinantes y transportadores incluyen, por ejemplo, políalquilenglicoles o triglicéridos; dichos supositorios pueden formarse a partir de mezclas que contienen el ingrediente activo en el intervalo del 0.5% al 0%, o de forma más deseable el 1 %-2%.

Las formulaciones orales incluyen excipientes, tales como calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sólida, celulosa y carbonato de magnesio. Estas composiciones adoptan la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, pildoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos, y contienen el 10%-95% de ingrediente activo, o más convenientemente el 25%-70%.

La aplicación tópica puede dar como resultado la administración transdérmica o intradérmica. La administración tópica puede facilitarse por coadministración del agente con toxina colérica o derivados destoxificados o subunidades de la misma, u otras toxinas bacterianas similares (véase Glenn, et al., 1998, Nature 391 : 851). La co-administración puede conseguirse usando los componentes como una mezcla o como moléculas unidas obtenidas por entrecruzamiento químico o expresión como una proteína de fusión.

Como alternativa, la administración transdérmica puede conseguirse usando un parche cutáneo o usando transferosomas (Paul, et al., 1995, Eur. J. Immunol. 25:3521-3524; Cevc, et al., 1998, Biochem. Biophvs. Acta 1368:201-215).

Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención puede administrarse opcionalmente en combinación con otros agentes que sean al menos parcialmente eficaces en el tratamiento de una enfermedad amiloidogénica. Por ejemplo, el presente anticuerpo puede administrarse con tratamiento paliativos existentes para la enfermedad de Alzheimer, tales como inhibidores de la acetilcolinesterasa tales como ARICEPT™, EXELON™ y REMINYL™ y, el antagonista de NMDA, NAMENDA™. Además de estos tratamientos autorizados, el presente anticuerpo puede usarse para proporcionar un beneficio sinérgico/aditivo para cualquiera de varias estrategias actualmente en desarrollo para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, que incluyen, sin limitación, inhibidores de la producción y agregación de ?ß.

El anticuerpo y fragmentos de anticuerpo de la presente invención también encuentran aplicación en la identificación de agentes terapéuticos que impidan la unión de ADDLs a neuronas (por ejemplo, una célula hipocampal), evitando de este modo los acontecimientos aguas abajo atribuidos a los ADDLs. Un ensayo de este tipo se lleva a cabo poniendo en contacto una neurona con ADDLs en presencia de un agente y usando un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención para determinar la unión de los ADDLs a la neurona en presencia del agente. Como apreciará el experto en la técnica, un agente que bloquee la unión de ADDLs a una neurona disminuirá la cantidad de ADDLs unidos a la neurona en comparación con una neurona que no se haya puesto en contacto con el agente; una cantidad que es detectable en un inmunoensayo que emplee un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención. Se describen en la presente memoria inmunoensayos adecuados para detectar ADDLs unidos a neuronas.

Los agentes que pueden explorarse usando el método proporcionado en la presente memoria incluyen numerosas clases químicas, aunque típicamente son moléculas orgánicas, preferentemente compuestos orgánicos pequeños que tienen un peso molecular de más de 100 y de menos de aproximadamente 2,500 daltons. Los agentes incluyen los grupos funcionales necesarios para la interacción estructural con proteínas, particularmente la formación de enlaces de hidrógeno, y típicamente incluyen al menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, preferentemente al menos dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes contienen con frecuencia estructuras heterocíclicas o de carbono cíclico y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriores. También pueden encontrarse agentes entre biomoléculas incluyendo péptidos, anticuerpos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos. Los agentes se obtienen a partir de una amplia diversidad de fuentes incluyendo bibliotecas de compuestos naturales o sintéticos.

Pueden incluirse una diversidad de otros reactivos tales como sales y proteínas neutras en los ensayos de exploración. Además, pueden usarse reactivos que de otro modo mejoran la eficacia del ensayo, tales como inhibidores de proteasa, inhibidores de nucleasa, agentes antimicrobianos y similares. La mezcla de componentes puede añadirse en cualquier orden que proporcione la unión necesaria.

Los agentes identificados mediante el ensayo de exploración de la presente invención serán beneficiosos para el tratamiento de enfermedades amiloidogénicas y/o tauopatias. Además, se contempla que los sistemas experimentales usados para ejemplificar estos conceptos representen herramientas de investigación para la evaluación, identificación y exploración de nuevos blancos farmacológicos asociados con la inducción por el amiloide beta de la fosforilación de tau.

La presente invención también proporciona métodos para detectar ADDLs y diagnosticar una enfermedad asociada con la acumulación de ADDLs usando un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente memoria. Una enfermedad asociada con la acumulación de ADDLs pretende incluir cualquier enfermedad en la que la acumulación de ADDLs dé como resultado una alteración fisiológica de la potenciación a largo plazo/formación de memoria. Las enfermedades de este tipo incluyen, pero sin limitación, la enfermedad de Alzheimer y trastornos similares relacionados con la memoria.

De acuerdo con estos métodos, una muestra de un paciente se pone en contacto con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención, y la unión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo a la muestra es indicativa de la presencia de ADDLs en la muestra. Como se usa en el contexto de la presente invención, una muestra pretende significar cualquier fluido corporal o tejido que sea susceptible de análisis usando inmunoensayos. Las muestras adecuadas que pueden analizarse de acuerdo con los métodos de la invención incluyen, pero sin limitación, muestras de biopsia y muestras de líquido del cerebro de un paciente (por ejemplo, un mamífero tal como un ser humano). Para los fines in vitro (por ejemplo, en ensayos que controlan la formación de oligómero), una muestra puede ser una línea celular neuronal o una muestra de tejido. Para fines de diagnóstico, se contempla que la muestra pueda ser de un individuo sospechoso de tener una enfermedad asociada con la acumulación de ADDLs o de un individuo en riesgo de tener una enfermedad asociada con la acumulación de ADDLs, por ejemplo, un individuo con un historial familiar que predisponga al individuo a una enfermedad asociada con la acumulación de ADDLs.

La detección de la unión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo a ADDLs en la muestra puede llevarse a cabo usando cualquier inmunoensayo convencional (por ejemplo, como se describe en la presente memoria) o, como alternativa, cuando el fragmento de anticuerpo es, por ejemplo, un aptámero peptídico, la unión puede detectarse directamente, por ejemplo, mediante una proteina marcadora detectable (por ejemplo, ß-galactosidasa, GFP o luciferasa) fusionada al aptámero. Posteriormente, la presencia o ausencia del complejo de ADDL-anticuerpo se correlaciona con la presencia o ausencia, respectivamente, de ADDLs en la muestra y, por lo tanto, con la presencia o ausencia, respectivamente, de una enfermedad asociada con la acumulación de ADDLs. Se contempla que uno o más anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de la presente invención puedan usarse junto con técnicas de formación de imagen basadas en el sistema inmune no invasivas actuales para aumentar enormemente la detección y el diagnóstico temprano de una enfermedad asociada con la acumulación de ADDLs.

Para facilitar el diagnóstico, la presente invención también se refiere a un kit que contiene un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente memoria. El kit incluye un recipiente que contiene uno o más anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que reconocen una conformación multidimensional de ADDLs e instrucciones para usar el anticuerpo con el fin de unirse a ADDLs para formar un complejo de antígeno-anticuerpo, y detectar la formación del complejo de antígeno-anticuerpo de modo que la presencia o ausencia del complejo de antígeno-anticuerpo se correlacione con la presencia o ausencia de ADDLs en la muestra. Los ejemplos de recipientes incluyen placas multipocillo que permiten la detección simultánea de ADDLs en múltiples muestras.

Todas las referencias citadas aquí con incorporadas en su totalidad como referencia.

La invención se describe en mayor detalle mediante los ejemplos no limitantes siguientes.

EJEMPLOS Las siguientes abreviaturas se usan aqui: Ab: anticuerpo; ?ß: proteina beta amiloide; AD: enfermedad de Alzheimer; ADDL: ligando difundible derivado de amiloide ß (?ß); Ag: antígeno; APP: proteina precursora amiloide; bADDLs: ADDLs biotinilados; CSF: liquido cefalorraquídeo; DMSO: dimetil sulfóxido; hAPP: proteína precursora de amiloide humana; medio HAT: medio de hipoxantina-aminopterina-timidina; HFIP: hexafluoro-2-propanol; IV: intravenoso(a); LB agar: agar de caldo de lisogenia; SC: subcutáneo(a); PBS: solución salina tamponada con fosfato; TEA: Trietílamina.

EJEMPLO 1 Materiales y métodos generales A. Generación de anticuerpos monoclonales de ADDL Se mezclaron oligómeros de ?ß soluble, denominados en la presente memoria ADDLs "sintéticos" 1 :1 con adyuvante completo de Freund (primera y segunda vacunación) o adyuvante incompleto de Freund (todas las vacunaciones posteriores), y se inyectaron por vía subcutánea (primeras dos vacunaciones) o por vía intraperitoneal en tres ratones en un volumen total de 1 ml/ratón. Cada inyección consistía en ADDLs purificados equivalentes a 194 ± 25 de proteína total. Los ratones recibieron inyecciones aproximadamente cada tres semanas. Después de seis inyecciones, un ratón murió y se congeló su bazo. El bazo del ratón con el suero de mayor título se fusionó después con células de mieloma SP2/0 en presencia de polietilenglicol y se sembraron en seis placas de 96 pocilios. Las células se cultivaron a 37 °C con CO2 al 5% durante 10 días en 200 µ? de medio de selección de hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT), que está compuesto de un medio sintético enriquecido, como el Medio de Dulbecco Modificado de Iscove (IMDM), (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), complementado con suero bovino fetal al 10% (FBS), HYBRIMAX® 1 µg/ml (azaserina-hipoxantína; Sigma-Aldrich, MO) y medios acondicionados recogidos de cultivo de células SP2/0 al 30%. A los cultivos se les suministró una vez IMDM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) complementado con FBS al 10% el día 10, y los sobrenadantes de cultivo se eliminaron el día 14 para explorar para pocilios positivos en ELISA. Los cultivos positivos se clonaron adicionalmente mediante diluciones limitantes con una probabilidad de 0.3 células por pocilio. Los clones positivos se confirmaron en ELISA y se expandieron adicionalmente. Después, se produjeron anticuerpos monoclonales y se purificaron para su uso (QED Bioscience, San Diego, CA).

B. Preparación de ADDLs y bADDLs Se prepararon ADDLs usando métodos descritos anteriormente (Hepler et al., 2006, Biochemistry, 45: 15157-15167; Shughrue et al., 2010, Neurobiol. Aging, 31 : 189-202). En resumen, se disolvió péptido ?ß1-42 sintético (American Peptide, Sunnyvale, CA) en hexafluoro-2-propanol (HFIP) a una concentración de 10 mg/ml y se incubó a temperatura ambiente (RT) durante una hora. La solución de péptido se dispensó en alícuotas de 50 µ? en tubos de microcentrífuga de polipropileno de 1.5 mi. El HFIP se eliminó usando un Speedvac® (Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA), y las películas de péptido resultantes se almacenaron desecadas a -70 °C hasta que fueran necesarias. Se disolvió una película de HFIP seca de 0.5 mg en 22 µ? de dimetilsulfóxido (DMSO) anhidro con agitación durante 10 minutos en una mezcladora vorticial. Posteriormente, se añadió rápidamente 1 mi de medio de Ham F12 frío sin rojo fenol (United Biosource, San Francisco, CA) a la mezcla de DMSO/péptido. El tubo se tapó, se invirtió para asegurar una mezcla completa y se incubó durante una noche a 4 °C. A la mañana siguiente, las muestras se centrifugaron durante diez minutos a 12,000 x g en una microcentrífuga Beckman (Beckman Coulter, Brea, CA) que funcionaba a 2-8 °C. El sobrenadante se recogió y se filtró a través de un filtro de centrífuga Centricon® YM50 (punto de corte molecular de 50,000 kDa) (Millipore, Billerica, MA) para enriquecer las especies oligoméricas. Se prepararon ADDLS biotinilados (bADDLS) usando los mismos métodos, pero comenzando con péptido ?ß1-42 biotinílado N-terminal (American Peptide, Sunnyvale, CA).

C. Preparaciones de monómero y fibrilla Para generar preparaciones de monómero, se disolvió película de péptido ?ß1-42 o ?ß1-40 RT en 2 mi de tampón borato 25 mM (pH 8.5) por mg de péptido, se dividió en alícuotas y se congeló a -70 °C hasta usarse. Las preparaciones de fibrilla se realizaron añadiendo 2 ml_ de ácido clorhídrico 10 mM por mg de película de péptido ?ß1-42. La solución se mezcló en una mezcladora vorticial a la menor velocidad posible durante cinco-diez minutos, y la preparación resultante se almacenó a 37 °C durante 18-24 horas antes del uso.

D. Neuronas primarias Se prepararon cultivos de neuronas primarias a partir de tejidos corticales y/o hipocampales de rata adquiridos en BrianBits (Springfield, IL). Después de la disociación, las células se sembraron a 35,000 células/pocilio en placas de 96 pocilios previamente recubiertas con laminina y poli-D-lisina (Corning Life Sciences, Lowell, MA). Las células se mantuvieron a 37 °C con CO2 al 5% en medio (Neurobasal complementado con B27 al 2%, L-glutamina al 1 % y pen/estrep al 1 %; Invitrogen, Carlsbad, CA) durante dos-tres semanas, y después se usaron para los estudios de unión.

E. Ensayo de unión a ADDL basado en células Para medir los efectos de anticuerpos anti-ADDL sobre el bloqueo de la unión de ADDL se mezclaron anticuerpos anti-ADDL con bADDLs 500 nM con concentraciones finales de anticuerpo que variaban de 1.8 nM a 450 nM. Como control, se mezcló la misma concentración de anticuerpo desnaturalizado térmicamente (98 °C durante 30 minutos) con bADDLs. Las mezclas de anticuerpo-bADDL se incubaron en tubos de microcentrífuga tratados con silicona (Fischer Scientific, Pittsburg, PA) a 37 °C durante una hora con rotación de extremo a extremo constante a una baja velocidad. Las mezclas se aplicaron después a cultivos corticales y/o hipocampales primarios y se incubaron a 37 °C durante una hora. La incubación se finalizó eliminando el medio de cultivo. Las células se sometieron a tratamientos de fijación y post-fijación como se ha descrito anteriormente. Las células se incubaron después con estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina (AP) a 4 °C durante una noche, se lavaron cinco veces con PBS y se hicieron reaccionar con el sustrato quimioluminiscente Tropix® CDP®-Star (Life Technologies™, Carlsbad, CA) a temperatura ambiente durante 30 minutos. La intensidad de unión de bADDL se midió y se registró con un lector de microplacas Envision® (PerkinElmer, Waltham, MA).

F. ELISA Se añadieron ADDLs biotinilados (bADDLs) o ?ß1-40 o ?ß1-42 monomérico a una placa revestida con estreptavidina de alta capacidad (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) con 100 µ? por pocilio de reactivo de revestimiento en PBS a 1 µ? y se incubó durante dos horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron en PBS con Tween al 0.05% (seis veces) y después con PBS solamente (tres veces) antes de bloquear los pocilios con leche en polvo desnatada al 5% en PBS durante una hora a temperatura ambiente. Después, los pocilios se lavaron y se añadió una dilución seriada de muestras de anticuerpo a las placas y se dejó que se unieran durante dos horas a temperatura ambiente. Después de la incubación y del lavado, la unión de anticuerpo se detectó con un anticuerpo secundario Fe de cabra anti-IgG humana conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (1 :1 ,1000; una hora a temperatura ambiente). El marcador HRP se visualizó con tetrametil benzidina (Virolabs, Chantilly, VA) como sustrato y se leyó a 450 nm en un lector de microplacas.

EJEMPLO 2 Selección de anticuerpos anti-ADDL A. Selección de una biblioteca de anticuerpos humanizados Se construyó una biblioteca madurada por afinidad de un anticuerpo anti-ADDL humanizado, h3B3, (véanse US 2006/0228349 y US 2008/0175835), en la que parte de las secuencias de aminoácidos de CDR3 de cadena ligera se sometieron a mutagénesis aleatoria. Para abarcar la región CDR3 completa se construyeron dos sub-bibliotecas. Una biblioteca estaba compuesta por la región variable de cadena pesada parental y aminoácidos mutados en la mitad izquierda de la CDR3 de la cadena ligera, y la otra en la mitad derecha de la CDR3 de la cadena ligera. Se usó una estrategia similar para mutagénesis aleatoria de las CDR de la cadena pesada con tres sub-bibliotecas.

Se sometió el 3B3 humanizado (h3B3) a maduración por afinidad usando métodos conocidos en la técnica. Las regiones variables de h3B3 se clonaron en un vector de presentación de Fab (pFab3D). En este vector, las regiones variables para las cadenas pesada y ligera se insertaron en fase de lectura para coincidir con el dominio CH1 de la región constante y la región constante kappa, respectivamente. En Fab3D, el epitopo myc y la etiqueta de 6 aminoácidos de histidina consecutivos siguen a la secuencia de CH1 , que después se une a la proteína de fago plll para su presentación. Todas las posiciones en las CDR3 de cadena pesada y ligera se mutaron aleatoriamente usando secuencias oligonucleotídicas degeneradas incorporadas en los iniciadores de PCR. Para alojar el tamaño físico, se construyeron las sub-bibliotecas centrándose cada una en 5-6 aminoácidos. El ADN de vector de 3B3 humano (H3B3) se usó como ADN de molde para amplificar las cadenas tanto pesada como ligera con los iniciadores de PCR mutados (Cuadro 1 ). Después de la amplificación por PCR, los fragmentos de ADN sintetizados se procesaron en un gel de agarosa al 1.3%, se eliminaron los iniciadores y los fragmentos variables se digirieron con enzimas de restricción, sitios de clonación BsiWI y Xbal para la clonación variable de la cadena ligera, Xhol y Apal para la clonación variable de la cadena pesada.

CUADRO 1 Para construir una biblioteca de maduración por afinidad en vector de presentación en fago pFab3D se digirió el ADN de pFab3D-3B3 con la misma pareja de enzimas de restricción, se purificó y los fragmentos de PCR para las regiones variables de cadena pesada o ligera se ligaron con ligasa T4 (Invitrogen) durante una noche a 16 °C. Los productos de ligación se transfectaron después en células competentes de electroporación TG1 de E. coli (Stratagene, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) y se sembraron alícuotas del cultivo bacteriano en placas de agar LB-carbenicilina (50 pg/ml) para valorar el tamaño de la biblioteca. Los cultivos restantes se sembraron en una gran placa con carbenicilina y se incubaron a 30 °C durante una noche para una reserva de biblioteca de E. coli o se infectaron con fago auxiliar M13K07 (Invitrogen, Carlsbad, CA, 1011 ufp/mL) por incubación a temperatura ambiente y a 37 °C durante diez minutos. Después, se añadió medio 2YT con carbenicilina (50 µg/ml) y se incubó a 37 °C durante una hora con agitación.

Después se añadió kanamicina (70 µg/ml) y los cultivos se cultivaron durante una noche a 30 °C con agitación. El sobrenadante de cultivo de fago se valoró y se concentró por precipitación con PEG (polietilenglicol) al 20% (v/v)/NaCI, se resuspendió en PBS, se esterilizó con un filtro de 0.22 µ?? y se generaron alícuotas para la selección de la biblioteca de fago.

La selección de la biblioteca de fago se realizó después como se resume en el Cuadro 2.

CUADRO 2 Los fagos aportados a partir de las bibliotecas de fago de presentación de Fab (100 µ?, aproximadamente 1011 12 ufp) se bloquearon con 900 µ? de solución de bloqueo (leche en polvo desnatada al 3% en PBS) para reducir la unión inespecífica a la superficie de fago. Se prepararon perlas recubiertas con estreptavidina recogiendo 200 µ? de la suspensión de perlas en un separador magnético y eliminando los sobrenadantes. Después, las perlas se suspendieron en 1 mi de solución de bloqueo y se pusieron en una mezcladora rotatoria durante 30 minutos. Para eliminar el fago con unión inespecífica a estreptavidina la biblioteca de fago bloqueada se mezcló con las perlas recubiertas con estreptavidina bloqueadas y se pusieron en una mezcladora rotatoria durante 30 minutos. Las suspensiones de fago del procedimiento de deselección se transfirieron a un nuevo tubo y se añadieron 200 µ? de antígeno, bADDL al 10%, y se incubaron durante dos horas para la unión de anticuerpo y antígeno. Después de la incubación, la mezcla se añadió a las perlas recubiertas con estreptavidina bloqueadas y se incubaron en una mezcladora rotatoria durante una hora para capturar el complejo de Ab/Ag en perlas de estreptavidina. Las perlas con complejos de bADDL al 10%/fago capturados se lavaron cinco veces con PBS/Tween 20 al 0.05% y después dos veces con PBS solamente. Los fagos unidos se eluyeron del bADDL con 200 µ? de TEA 100 mM (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) y se incubaron durante veinte minutos. El fago eluido se transfirió después a un tubo de 50 mL, se neutralizó con 100 µ? de Tris-HCI 1 M, pH 7.5 y se añadió 10 mi de células TG1 de E. coli con una DO 600 nm de entre 0.6-0.8. Después de la incubación a 37 °C con agitación durante una hora, las alícuotas de cultivo se sembraron en placas de agar LB-carbenicilina (50 µg/ml) para valorar el número de fagos producidos, y las bacterias restantes se centrifugaron y se suspendieron con 500 µ? de medio 2xTY, se sembraron en placas agar YT Bioassay (Teknova, Hollister, CA) que contenían ampicilina 100 µg/ml y glucosa al 1 %. Las placas de bioensayo se cultivaron durante una noche a 30 °C.

Después de cada ronda de planificación, se escogieron aleatoriamente colonias individuales para producir fagos en placas de 96 pocilios. Los procedimientos para la preparación de fagos en una placa de 96 pocilios eran similares a los descritos anteriormente excepto por que no se usó ningún paso de precipitación de fago. Las placas de cultivo que contenían colonias que crecían en 120 µ? de medio 2xTY con ampicilina 100 µg/ml y glucosa al 0.1 % se incubaron durante una noche en un agitador HiGro® (Genomic Solutions, Ann Harbor, MI) a 30 °C con agitación a 450 rpm. Los sobrenadantes de fago (aproximadamente 100 µ?) se usaron directamente para su análisis en el ELISA de unión de ADDL descrito anteriormente. Una diferencia es que la unión de fago a ADDLs se detectó con un anticuerpo anti-M13 conjugado con HRP (Amersham Bioscience, GE Healthcare, Waukesha, Wl).

EJEMPLO 3 Identificación de anticuerpos anti-ADDL A partir del intento de maduración por afinidad de la cadena ligera, un panel de siete clones mostraban actividades de unión fuertes a ADDLs en comparación con h3B3 en un ELISA de fago/Fab (no se muestran los datos). Los siete clones se seleccionaron para su conversión a IgG y los anticuerpos monoclonales se produjeron y se purificaron para una caracterización adicional.

A. Selección de anticuerpo anti-ADDL Después de la planificación y exploración de la biblioteca descritas en el Ejemplo 2, se seleccionaron siete clones de Fab candidato (Cuadros 3-5) para la conversión de IgG. El Cuadro 3 muestra la similitud de aminoácidos para los clones seleccionados a partir de la biblioteca de maduración por afinidad de la cadena ligera respecto al anticuerpo parental, h3B3. El Cuadro 4A resume el número de diferencias de aminoácido en la CDR3 de la cadena ligera de los clones seleccionados a partir de la CDR3 de la cadena ligera para el anticuerpo parental, h3B3. El Cuadro 4B resume el número de diferencias de aminoácido en la CDR1 de la cadena ligera de los clones seleccionados a partir de la CDR3 de la cadena ligera para el anticuerpo parental, 19.3. El Cuadro 4C resume el número de diferencias de aminoácido en la CDR2 de la cadena ligera de los clones seleccionados a partir de la CDR3 de la cadena ligera para el anticuerpo parental, 19.3. El Cuadro 5 es un alineamiento de una porción (posiciones 21-117) de las regiones variables de cadena ligera para los clones seleccionados y el anticuerpo parental, h3B3. La CDR3 de cada clon se muestra en negrita.

CUADRO 3 CUADRO 4A CUADRO 4B CUADRO 4C CUADRO 5 17.1 PASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKASNRFSGVPDRFSGS GSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSRVPASFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 33) GSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSRVPVRFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 39) h3B3 PASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKASNRFSGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPPTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 40) B. Conversión de IgG Las IgG convertidas pueden expresarse usando vectores basados en plásmidos. Los vectores de expresión se construyeron de modo que contuvieran todos los componentes necesarios excepto las regiones variables. En los vectores básicos, la expresión de las cadenas tanto pesada como ligera estaba dirigida por el promotor de CMV humano y la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. Para los siete clones seleccionados para conversión de IgG, la región variable de la cadena pesada se fusionó en fase de lectura con una región constante de cadena pesada de lgG2 humana (SEQ ID NOS: 20 y 21), mientras que la región variable de la cadena ligera se fusionó en fase de lectura con la región constante de cadena ligera kappa (SEQ ID NOS: 18 y 19). Las secuencias líder de cadena pesada (SEQ ID NOS: 29 y 30) y ligera (SEQ ID NOS: 31 y 32), que median la secreción de los anticuerpos hacia los medios de cultivo, también se fusionaron en fase de lectura con las regiones variables por consiguiente. Para los vectores de expresión de la cadena pesada, la región constante puede seleccionarse de un isotipo de subclase diferente, por ejemplo, lgG1 o lgG2. Entre la secuencia líder y la región constante, las secuencias intergénicas contienen secuencias de clonación para una fusión en fase de lectura sin juntas de la región variable entrante con la secuencia líder en su extremo 5' y la región constante en su extremo 3' usando una estrategia de clonación In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). Se usaron los kits de clonación por PCR con secado In-Fusion™ (Clontech, Mountain View, CA) para la amplificación por PCR de las regiones variables. El secado contiene todos los componentes necesarios para la reacción de PCR. Se añadieron iniciadores de PCR y ADNs de molde. Los vectores de expresión llevan el oriP del genoma viral de EBV. La pareja oriP/EBNA1 se usa con frecuencia para prolongar la presencia del vector de expresión en el interior de las células transfectadas, y se usa ampliamente para la ampliación de la duración de la expresión (Lindner et al. , 2007, Plasmid 58: 1 -12) para una expresión prolongada en células 293EBNA, secuencias bacterianas para un marcador de selección de kanamicina y un origen de replicación en E. coli. Cuando se insertaron las regiones variables, las IgG se expresaban directamente en células de mamífero. Todas las regiones variables de cadena pesada de la presente memoria se clonaron en un vector de expresión de lgG1 (pV1 JNSA-BF-HCG1 ) y las regiones variables de cadena ligera se clonaron en un vector de expresión de kappa o lambda coincidente (pV1 JNSA-GS-FB-LCK).

C. Clonación de anticuerpo El procedimiento de clonación para los vectores de expresión de anticuerpo resultantes era el siguiente. Las regiones variables se amplificaron por PCR, en el que las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un volumen de 25 µ? que contenía mezcla maestra de PCR de alta fidelidad, 1 µ? de volumen de molde e iniciadores directo e inverso: 1 µ? de cada uno. Condiciones de PCR: un ciclo de 94 °C, 2 minutos; 25 ciclos de 94 °C, 1.5 minutos; 60 °C, 1.5 minutos; 72 °C 1.5 minutos y 72 °C, 7 minutos; 4 °C hasta retirarse. Los productos de PCR se digirieron después con Dpnl y se purificaron con un kit de placas QIAquick (Qiagen, Venlo, Países Bajos). 100 ng de los vectores de cadena pesada o cadena ligera previamente linealizados correspondientes se hibridaron con 10 ng del fragmento de PCR con una reacción In-Fusion (kit de clonación de secado IN-Fusion de Clontech, Mountain View, CA). La mezcla de reacción se usó para transformar células competentes XL2 Blue MRF' y se sembraron durante una noche en placas de Agar que contenían kanamicina 50 µg/ml. Las construcciones de cadena ligera se digirieron con Hindlll + Notl y las construcciones de cadena pesada se digirieron con AspI + Hindlll para comprobar la estructura por análisis de restricción. Las secuencias de ADN para todos los clones se confirmaron por secuenciación.

D. Expresión de anticuerpo en células de mamífero y purificación Construcciones de ADN de cadena pesada y de cadena ligera confirmadas por secuenciación se usaron para transfectar células 293 Freestyle (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las células 293 Freestyle se transfectaron usando Transfectina 293 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se transfectaron células en monocapa EBNA usando reactivos de transfección basados en PEI. Las células transfectadas se incubaron a 37 °C/CO2 al 5% durante siete días en medio sin suero Opti-MEM (Invitrogen, Carlsbad, CA). El medio se recogió, se centrifugó, se filtró a través de un sistema de filtración de 0.22 µ?? (Millipore, Billerica, MA), y después se concentró mediante un Centricon® (Millipore, Billerica, MA). El medio concentrado se mezcló 1 :1 con tampón de unión (Pierce, Termo Fisher Scientific, Rockford, IL), y después se cargó sobre una columna de proteína A/G preequilibrada (Pierce, Termo Fisher Scientific, Rockford, IL) o una Hl trap rProtein A FF de GE Healthcare, Waukesha, Wl. La columna cargada se lavó con tampón de unión y se eluyó con tampón de elución (Pierce, Termo Fisher Scientific, Rockford, IL). El anticuerpo eluido se neutralizó inmediatamente y se dializó contra tampón PBS durante una noche. El anticuerpo dializado se concentró con un Amicon (Pierce, Termo Fisher Scientific, Rockford, IL) y la concentración de proteína se determinó mediante la DO2eo nm con el coeficiente de extinción de 1 ,34 mg/ml. Se analizó el anticuerpo purificado usando SDS-PAGE (Invitrogen, Carlsbad, CA), o un Labchip de proteínas (Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA). El SDS-PAGE se procesó en condiciones no reducidas.

La mutagénesis de la asparangina en la posición 33 (N33) de la cadena ligera de CDR1 para el anticuerpo 19.3 en N33S (SEQ ID NO: 55), N33T (SEQ ID NO: 56), N33E (SEQ ID NO: 67), o N33D (SEQ ID NO: 68) se llevó a cabo por medio de mutagénesis dirigida a sitio a partir del vector de expresión WT de pV1JASN-GS-19.3-LCK usando el Kit de Mutagénesis Dirigida a Sitio QuikChange II XL (Agilent Technologies, La Jolla, CA). El codón AAT para N fue mutado a AGT para S en 19.3S33 (SEQ ID NO: 55), ACT para T en 19.3T33 (SEQ ID NO: 56), GAA para E en 19.3E33 (SEQ ID NO: 67), o GAT para D en 19.3D33 (SEQ ID NO: 68), y los nuevos codones es esa posición fueron confirmados por secuenciación de ADN. Para generar anticuerpos IgG de longitud completa para estos mutantes, los plásmidos de cadena ligera respectivos fueron pareados con el cognado de plásmido de cadena pesada, Pv1jnsa-19.3-hcg2, para transfección transitoria en células Freestyle 293 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los métodos de expresión y purificación fueron descritos arriba en este ejemplo. Se incubaron las alícuotas de anticuerpos mutantes purificados junto con el anticuerpo parental 19.3 (SEQ ID NO: 1) bajo varias condiciones a 4°C, 25°C ó 40°C por un mes antes de ser sometidos a análisis ELISA que se muestra en las Figuras 4A-4C.

EJEMPLO 4 Caracterización de anticuerpos anti-ADDL Los anticuerpos anti-ADDL seleccionados, es decir, los derivados del anticuerpo parental, h3B3, se evaluaron primero en un ELISA de ?ß de tres frentes para evaluar la unión del anticuerpo a ?ß monomérico, ADDLs y ?ß fibrilar. Como se muestra en la Figura 1 , con la excepción del anticuerpo 9.2, todos los anticuerpos anti-ADDL mostraban una unión preferente a ADDLs respecto a h3B3, anticuerpos de comparación selectivos (Comp 1 y 3: se unen sólo a ADDLs), no selectivos (Comp 2: se une a todas las formas de ?ß evaluado) y un control (sin anticuerpo). El anticuerpo 9.2 mostraba una unión reducida a todas las formas de ?ß, lo que sugería que su afinidad de unión se veía afectada negativamente durante la conversión de IgG y/o la producción de anticuerpo. Se generó una curva de titulación completa (Figura 2) para cada anticuerpo y h3B3 para determinar su afinidad de unión por ADDLs, en comparación con el ?ß monomérico. A pesar de que seis de los siete anticuerpos madurados por afinidad mostraban una unión preferente a ADDLs, los Solicitantes han demostrado anteriormente que algunos anticuerpos anti-ADDL que tienen una unión preferente a ADDLs no son capaces de impedir la unión de ADDL a neuronas hipocampales primarias (Shughrue et al., 2010, Neurobiol. Aqinq, 31 : 189-202, Figura 1).

En el sentido de que la unión preferente a ADDLs solamente puede no ser un predictor exacto de eficacia, sería deseable identificar anticuerpos anti-ADDL que también bloqueen la unión de ADDL a neuronas, lo que puede evaluarse en un ensayo de unión basado en células de la forma siguiente. Se preincubaron anticuerpos con ADDLs y después se añadieron a cultivos hipocampales primarios para evaluar su bloqueo de la unión de ADDL. Los resultados de este estudio mostraron que los anticuerpos anti-ADDL de la presente memoria, en concreto el anticuerpo 19.3, reducían radicalmente la unión de ADDL a neuronas (Figura 3). Sin embargo, se observó una reducción marcada en la actividad de anticuerpo en este ensayo cuando los anticuerpos se desnaturalizaron térmicamente (Figura 3).

Determinación de EC50 Las placas de unión de proteína alta (Costar, Corning, Lowell, MA), fueron recubiertas con ligando blanco en PBS durante la noche a 4°C. La concentración de la proteína de recubrimiento fue de 100 pmol/pocillo para ?ß40 (American Peptide, Sunnyvale, CA) y de 50 pmol/pocillo para ADDLs. Los ADDLs fueron generados como se describe en el Ejemplo 1 B. Al día siguiente, las placas fueron lavadas cinco veces con PBS + Tween-20 al 0.05% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y se bloquearon durante la noche con un tampón de bloqueo de Caseína (ThermoScientific, Waltham, MA) y Tween-20 al 0.05%. Tres anticuerpos representativos , 19.3 (Figura 4A), 19.3S33 (Figura 4B), y 19.3T33 (Figura 4C), generados como se describe en el Ejemplo 3, fueron probados a 15 pg/ml a 0 pg/ml en una serie de diluciones de tres repeticiones y 12 puntos. Después de 2 horas de incubación a temperatura ambiente, las placas fueron lavadas y se agregó IgG anti-humano conjugado con fosfatasa alcalina (ThermoScientific, Waltham, MA) a 0.08 pg/ml. Después de 45 minutos de incubación a temperatura ambiente, las placas fueron lavadas y se agregó sustrato quimioluminiscénte Tropix®CDP®-Star (Life Technologies™, Carlsbad, CA). La luminiscencia fue detectada después de 30 minutos en un lector de microplacas EnVision® (PerkinElmer, Waltham, MA). Los ajustes de curva se completaron usando el software GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA).

EJEMPLO 5 Unión a FcRn in vitro de anticuerpos anti-ADDL Para caracterizar la habilidad de anticuerpos anti-ADDL para unirse a y disociar FcRn humano inmovilizado, los siete anticuerpos anti-ADDL de la presente memoria se evaluaron en un ensayo de unión a FcRn de Biacore, un sistema sustituto usado para evaluar el PK del anticuerpo y predecir la semivida terminal (tv2) de anticuerpos en primates no humanos.

En resumen, se inmovilizó proteína FcRn humana purificada en un chip biosensor CM5 de Biacore y se usó PBSP (NaPO4 50 mM, NaCI 150 nM y Tensioactivo 20 al 0,05% (v/v)) pH 7.3 como tampón de procesamiento. Los mAbs se diluyeron con PBSP pH 6.0 a 100 nM, se dejó que se unieran a FcRn durante 3 min para alcanzar el equilibrio y se siguió de la disociación en tampón de procesamiento pH 7.3. Se insertó un punto de aviso (Estabilidad) a los 5 segundos después del final de la unión de mAb y el "% unido" se calculó como UREstabiiidad URunión (%)· Los Solicitantes encontraron que anticuerpos monoclonales (mAbs) con secuencias de Fe idénticas pero dominios de Fab diferentes pueden unirse y disociarse de FcRn con diferencias considerables (no se muestran los datos). Además, se observó una correlación clara entre la disociación a pH neutro y la farmacocinética in vivo, en la que los mAbs con fracciones de disociación lenta (es decir, mayor "% unido") tendían a presentar una ti 2 más corta in vivo. Esta característica se usó como una herramienta de exploración in vitro para la farmacocinética de anticuerpos.

Se realizó una comparación de los siete anticuerpos anti-ADDL de la presente memoria junto con h3B3, dos anticuerpos que preferían ADDL (Comp 1 y 3) y un anticuerpo de comparación no selectivo (Comp 2: se une a todas las formas de ?ß evaluadas) en el ensayo de unión a FcRn. Se generó un sensograma (Figura 5) que mostraba la unión inicial del anticuerpo a pH 6.0 y después la disociación del anticuerpo a pH 7.3 a partir de 180 segundos. Como se muestra en la Figura 5, no había una diferencia perceptible entre h3B3 y los otros anticuerpos evaluados. Aunque el h3B3 tenía un alto porcentaje unido a FcRn, los siete anticuerpos anti-ADDL de la presente invención, así como los dos anticuerpos de comparación, presentaban una unión considerablemente inferior.

EJEMPLO 6 Caracterización del anticuerpo anti-ADDL 19.3 Se seleccionó el anticuerpo 9.3 madurado por afinidad para una caracterización adicional. Se determinó la secuencia de ADN completa y la secuencia de aminoácidos deducida para la región variable de la cadena ligera, SEQ ID NOS: 14 y 15, respectivamente. El alineamiento de las regiones variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 17) y ligera (SEQ ID NO: 15) se muestra en la Figura 6A, junto con la secuencia de línea germinal más próxima (SEQ ID NO: 47). Se muestra en la Figura 6B un modelo 3D de regiones variables de cadena pesada y ligera y la localización de las seis regiones determinantes de complementariedad (CDRs).

Se llevaron a cabo análisis de Biacore™ (GE Healthcare, Waukesha, Wl) y KinExA (Sapidyne, Boise, ID) para determinar la afinidad de unión del anticuerpo anti-ADDL 19.3 por ADDLs y determinar la selectividad de 19.3 por ADDLs frente a ?ß monomérico. Las tecnologías basadas en Biacore™ y KinExA se usan ampliamente para la medición de la afinidad de unión entre macromoléculas tales como anticuerpo y blanco proteico. En la tecnología de Resonancia de Plasmón Superficial (SPR) en la que se basa el Biacore™, las mediciones cuantitativas de la interacción de unión entre una o más moléculas dependen de la inmovilización de una molécula blanco en la superficie del chip sensor. Pueden capturarse compañeros de unión para el blanco a medida que pasan sobre el chip. La Resonancia de Plasmón Superficial (SPR) detecta cambios en la masa en la capa acuosa próxima a la superficie del chip sensor midiendo los cambios en el índice de refracción. Cuando las moléculas en la solución de ensayo se unen a una molécula blanco la masa aumenta (ka), cuando se disocian la masa disminuye (/íd). Este simple principio constituye la base del sensograma— un control continuo a tiempo real de la asociación y disociación de las moléculas que interaccionan. El sensograma proporciona información cuantitativa a tiempo real sobre la especificidad de unión, la concentración activa de molécula en una muestra, la cinética y la afinidad.

La tecnología KinExA de Sapidyne Instruments, Boise, Idaho, mide constantes de unión para caracterizar acontecimientos de unión biomolecular en la fase de solución, no acontecimientos de unión entre una fase en solución y una fase sólida. En solución, los compañeros de unión alcanzan el equilibrio después de una incubación suficiente. Las moléculas no unidas se cuantifican con una valoración, que reflejará la porción de moléculas unidas a los compañeros. El método KinExA no requiere la modificación de las moléculas bajo estudio. Con KinExA, la reacción que se está midiendo se produce entre moléculas no modificadas en solución. Por lo tanto, se eliminan las preocupaciones de cómo altera la modificación a las reacciones de unión "nativas'. El método KinExA permite un intervalo más amplio de constantes de unión tan fuertes como de 10"13 M. El software KinExA realiza análisis de datos que se basan en soluciones exactas a ecuaciones de unión clásicas (Matemática de /^), no aproximaciones de pseudo-primer orden. El KinExA no requiere manipulaciones de datos arbitrarios o selecciones de intervalo.

Como se muestra en el Cuadro 6, el anticuerpo 19.3 tenía una afinidad de 4.8 nM por ADDLs en comparación con una afinidad de 150 nM por ?ß monomérico en el ensayo de Biacore™. La selectividad de treinta veces del anticuerpo 19.3 por ADDLs sobre el monómero de ?ß era notablemente mejor que la observada para el anticuerpo parental, h3B3, que presentaba solamente una preferencia de 10 veces por ADDLs frente al monómero de ?ß.

CUADRO 6 De forma similar, el anticuerpo 19.3 se evaluó en una medición de la constante de equilibrio basada en KinExA. Como se muestra en el Cuadro 7, el anticuerpo 19.3 tenía una constante de equilibrio de 2.7 nM, que representa una preferencia de más de seis veces por oligómeros de ADDL frente a la unión a monómero de ?ß40 en el mismo ensayo.

CUADRO 7 EJEMPLO 7 Caracterización biofísica del anticuerpo anti-ADDL 19.3 Se llevó a cabo la caracterización biofísica para demostrar que los anticuerpos anti-ADDL de la presente memoria son estables en condiciones de estrés y adecuados para usarse como agente terapéutico. El anticuerpo anti-ADDL 19.3 se concentró hasta >50 mg/ml y se puso en varias formulaciones con un pH que variaba de 5.0 a 8.0. Se incubaron dos conjuntos de muestras a 37 °C y 45 °C durante una semana. Se puso un tercer conjunto de muestras a -70 °C para iniciar una serie de cinco ciclos de congelación/descongelación. El análisis de cromatografía de exclusión por tamaño indicó que las preparaciones de anticuerpo estaban predominantemente (>95%) en el estado monomérico, con una pequeña cantidad de dimeros, que eran típicos de preparaciones de anticuerpos monoclonales. La cantidad de dimeros y oligómeros de mayor peso molecular no aumentaba después del estrés térmico en todos los tampones y no se observaba fragmentación. Como se resume en el Cuadro 8, los análisis de turbidez en el ultravioleta cercano también indicaban ausencia de agregación. Las muestras sometidas a estrés por congelación/descongelación mostraban un aumento dependiente del tampón en la turbidez que era comparable a otros anticuerpos monoclonales. La viscosidad a 50 mg/mL estaba por debajo de 2 centipoises, indicando una facilidad de inyección aceptable, ya que en general se considera que el nivel de 20 centipoises es un limite práctico para inyecciones subcutáneas. La calorimetría diferencial de barrido también puso de manifiesto una estabilidad térmica aceptable, desplegándose el Fab a aproximadamente 72 °C y desplegándose el dominio CH2 menos estable por encima de 65 °C. En su conjunto, el anticuerpo 19.3 demostró una estabilidad estructural muy buena con propiedades biofísicas compatibles con la administración subcutánea.

CUADRO 8 EJEMPLO 8 Análisis Farmacocinético de 19.3 y Eficacia en un Modelo de AD A. Estudio farmacocinético en ratones con FcRn humano Recientemente se ha sugerido a los ratones con FcRn humano (Tg276 heterocigotos) (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) como un sistema sustituto valioso para evaluar la farmacocinética de anticuerpos monoclonales. Para caracterizar la farmacocinética del anticuerpo anti-ADDL 19.3 en ratones con FcRn humano, tres animales recibieron una sola inyección intravenosa de anticuerpo 19.3 a 10 mg/kg a través de la vena de la cola. Después se recogieron una serie de 10 µ? de muestras de sangre a los puntos temporales 0, 25, 50, 75, 100, 150, 250 y 350 horas después de la administración IV de anticuerpo 9.3 o h3B3 y se usó un inmunoensayo anti-IgG humana validado para determinar los niveles en sangre de anticuerpo. Como se muestra en la Figura 7, los niveles en sangre para el anticuerpo 19.3 disminuían de una forma bifásica con una ti/2 aparente de 77 ± 6 horas, que era considerablemente más prolongada que la semivida para el anticuerpo parental, h3B3, de aproximadamente 29 ± 9 horas. Estas semividas concordaban con la diferencia predicha por el ensayo de unión a FcRn in vitro (Figura 5). La semivida terminal de la fase de eliminación se determinó usando un modelo no compartimental (WinNonlin®, Pharsight, Sunnyvale, CA) y puntos de datos entre el día 3 y el día 15 post-dosis.

B. Estudio farmacocinético en primates no humanos Para confirmar la ti 2 predicha de 19.3 en primates se realizó un estudio farmacocinético en primates para el anticuerpo anti-ADDL 19.3 en un cohorte de monos rhesus con cisterna magna cateterizada. Seis animales (tres machos/tres hembras) se dosificaron con una sola inyección intravenosa en embolada de anticuerpo 19.3 (5 mg/kg) y se recogieron muestras de sangre después de la administración del anticuerpo. Al mismo tiempo, se recogieron muestras de CSF del catéter de la cisterna magna a 0, 2, 4, 8, 12, 24, 30, 48, 54 y 72 horas y la concentración de anticuerpo 19.3 en el suero y el CSF se determinó con un ensayo de ELISA anti-lgG humana. Cuando a los animales se les administró una sola inyección IV en embolada de anticuerpo 19.3, se observó una ti/2 de 254 ± 28 horas, mientras que se vio una [ 2 de 204 ± 49 horas después de la administración subcutánea (Figura 8). Además, los Solicitantes descubrieron que el anticuerpo 19.3 era capaz de atravesar hacia el CSF de primates, donde aumentaba en concentración durante las primeras 48 horas y alcanzaba un máximo a aproximadamente 0.1 % del anticuerpo dosificado (Figura 9).

C. Distribución del anticuerpo anti-ADDL 19.3 marcado con 1251 en cerebro de ratón En un intento por determinar la concentración de anticuerpo que alcanzaba el cerebro, se inyectó (vena de la cola) a ratones Tg2576 macho de doce meses de edad (línea B6¡ SJL-TgN APPSWE) 200 µg de anticuerpo 19.3 marcado con 125l (~8 mg/kg), o uno de dos anticuerpos de comparación, y se recogió la sangre y el CSF dos horas después. La radiactividad residual se aclaró de los vasos del cerebro por perfusión cardiaca con PBS antes de la extirpación del cerebro. Después, se puso una muestra de sangre, CSF y de cerebro completo en un contador gamma para determinar la cantidad de anticuerpo radiomarcado presente en cada muestra. Después del recuento, los cerebros se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 48 horas y después se procesaron para inmunocitoquímica por flotación. La localización del anticuerpo 19.3 en el cerebro de ratón se detectó con un anticuerpo secundario anti-humano y un método de detección ABC convencional. Esta inmunorreactividad se combinó después con la tinción con tioflavina S (un colorante que detecta placas) para determinar la colocalización de anticuerpo con placas en el cerebro de ratón.

Como se muestra en las Figuras 10A y 10B, el anticuerpo radiomarcado 19.3 era capaz de atravesar la barrera hematoencefálica hacia el CSF y el cerebro de ratón. Además, los datos indicaban que el anticuerpo 19.3 estaba enriquecido en el cerebro (0.19%) en comparación con los niveles observados en el CSF (0.02%). Para determinar si esta concentración en el cerebro se debía a la asociación del anticuerpo 19.3 con ?ß, los cerebros se fijaron y se procesaron para inmunocitoquimica. El análisis de la distribución de anticuerpo en el cerebro de ratón Tg2576 de edad avanzada puso de manifiesto que el anticuerpo 19.3 se asociaba con placas de amiloide positivas a tioflavina S en el cerebro (Figuras 10C y 10D). Estos datos proporcionaron la primera prueba de que el anticuerpo 19.3 era capaz de penetrar en el cerebro de ratón transgénico y unirse a especies de ?ß de interés.

EJEMPLO 9 Modelo de deposición de placas Para evaluar adicionalmente la capacidad del anticuerpo anti-ADDL 19.3 para disminuir la deposición de ADDL en placas de amiloide en el cerebro, se canularon unilateralmente ratones Tg2576 macho de doce meses de edad (Taconic, NY) semanalmente y se les infundieron bADDLs (50 pmol/µ?) durante 4 semanas en el hipocampo (Figura 1 1 A). Una semana después del último tratamiento con bADDL, la mitad de los ratones (n = 5/tratamiento) se dosificaron (vena de la cola) semanalmente durante 4 semanas con PBS, mientras que los animales restantes se dosificaron semanalmente con 200 pg de anticuerpo anti-ADDL (aproximadamente 8 mg/kg). Todos los animales se eutanasiaron una semana después del último tratamiento y sus cerebros se procesaron para inmunocitoquimica. Para la detección de bADDL y placas, se incubaron secciones de cerebro con Streptavidin Alexa Fluor® 594 (Invitrogen, Carlsbad, CA), se montaron sobre portaobjetos y las placas se tiñeron con tioflavina S. Después se capturaron imágenes fluorescentes de las placas con un Formador de Imágenes Confocal Rápido de PerkinElmer con el software UltraVIEW ERS, y la diferencia en el crecimiento de placas se cuantificó. Los detalles de este modelo se publicaron recientemente (Gaspar et. al., 2010, Exp. Neurol.. 223: 394-400). Después de un mes de tratamiento, se observó una reducción significativa en la deposición de nuevos ADDLs en placas existentes en animales tratados con anticuerpo 19.3 (Figura 11 C) en comparación con animales tratados con transportador solamente (Figura 1 B).

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a ligandos difundibles derivados de amiloide ß, que comprende: (a) una región variable de cadena ligera que comprende, (i) una CDR1 de SEQ ID NO: 1 , (¡i) una CDR2 de SEQ ID NO: 2, y (iii) una CDR3 que tiene la secuencia Phe-Gln-Gly-Ser-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5 (SEQ ID NO: 3), en donde Xaa1 es Arg, Lys o Tyr, Xaa2 es Val, Ala o Leu, Xaa3 es Pro, His o Gly, Xaa4 es Ala, Pro o Val, y Xaa5 es Ser, Gly o Phe; y (b) una región variable de cadena pesada que comprende, (i) una CDR1 de SEQ ID NO: 4, (ii) una CDR2 de SEQ ID NO: 5, y (iii) una CDR3 de SEQ ID NO: 6.

2 - El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la CDR3 de región variable de cadena ligera se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13.

3 - El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la CDR3 de la región variable de cadena ligera es la SEQ ID NO: 10.

4 - El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la región variable de cadena ligera de dicho anticuerpo comprende la SEQ ID NO: 15 y la región variable de cadena pesada de dicho anticuerpo comprende la SEQ ID NO: 17.

5. - El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende adicionalmente una región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 21.

6. - El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende adicionalmente una región variable de cadena ligera CDR1 que tiene la secuencia Arg-Ser-Ser-Gln-Ser-lle-Val-His-Ser-Xaa1-Gly-Xaa2-Thr-Thy-Leu-Glu (SEQ ID NO: 53), en donde Xaa1 es Asn, Ser, Thr, Ala, Asp o Glu y Xaa2 es Asn, His, Gln, Ser, Thr, Ala o Asp.

7. - El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende adicionalmente una región variable de cadena ligera CDR2 que tiene la secuencia Lys-Ala-Ser-Xaa1-Arg-Phe-Ser (SEQ ID NO: 54), en donde Xaa1 es Asn, Gly, Ser, Thr o Ala.

8. - El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

9. - Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 , en mezcla con un transportador farmacéuticamente aceptable.

10. - Un método in vitro para atenuar la unión de ligandos difundibles derivados de amiloide ß a una neurona, que comprende poner en contacto la neurona con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 , de modo que se atenúe la unión de ligandos difundibles derivados de ?ß a la neurona.

1 1. - Un método para inhibir el ensamblaje de ligandos difundibles derivados de amiloide ß, que comprende poner en contacto una muestra que contiene péptidos de amiloide ß1-42 con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 , inhibiendo de este modo el ensamblaje de ligandos difundibles derivados de ?ß.

12. - Un método para inhibir la fosforilación de la proteína tau en Ser202n"hr205, que comprende poner en contacto una muestra que contiene una proteína tau con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 , inhibiendo de este modo la fosforilación de la proteína tau en Ser202/Thr205.

13. - El uso de la composición farmacéutica de la reivindicación 9 en la fabricación de un medicamento para atenuar los síntomas de una enfermedad asociada con ligandos difundibles derivados de amiloide ß.

14. - Un método para identificar un agente terapéutico putativo que atenúe la unión de ligandos difundibles derivados de amiloide ß a neuronas, que comprende (a) poner en contacto una composición que comprende una neurona con ligandos difundibles derivados de amiloide ß en presencia de un agente; (b) poner en contacto la composición con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 ; y (c) detectar la cantidad de anticuerpo o fragmento de unión a antígeno unido en presencia del agente, en donde una disminución en la cantidad del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno unido en presencia del agente en comparación con la cantidad de anticuerpo unido en ausencia del agente indica que el agente es un agente terapéutico putativo para atenuar la unión de ligandos difundibles derivados de amiloide ß a neuronas.

15. - Un método para detectar ligandos difundibles derivados de amiloide ß en una muestra que comprende poner en contacto una muestra con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 y determinar la presencia de un complejo que comprende los ligandos difundibles derivados de amiloide ß y dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno.

16. - Un método para diagnosticar una enfermedad asociada con ligandos difundibles derivados de amiloide ß, que comprende poner en contacto una muestra con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 y determinar la presencia de un complejo que comprende los ligandos difundibles derivados de amiloide ß y dicho anticuerpo o fragmento de unión a antigeno, en donde el complejo es diagnóstico de una enfermedad asociada con ligandos difundibles derivados de amiloide ß.

17.- Un kit para detectar ligandos difundibles derivados de amiloide ß que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1.