TWI591176B - 抗ｌｉｖ－１之人化抗體類及彼等於治療癌症上之用途 - Google Patents

Description

抗LIV-1之人化抗體類及彼等於治療癌症上之用途 相關申請案的交互參照

本申請案係非臨時專利申請案，並主張US 61/420,291(2010年12月6日提出申請)及US 61/446,990(2011年2月25日提出申請)之權益，該二案各以參照方式整體納入此處以符合所有目的。

本發明關於抗LIV-1之人化抗體類及彼等於治療癌症上之用途。

LIV-1係鋅轉運蛋白類之LZT(LIV-1-ZIP鋅轉運蛋白)亞家族的一員。Taylor et al.,Biochim.Biophys.Acta 1611：16-30(2003)。LIV-1蛋白質之電腦分析顯示一可能的金屬蛋白酶模體，該模體符合鋅金屬蛋白酶之酶催化性鋅結合位點模體之一致序列。LIV-1 mRNA係主要表現於乳房、前列腺、腦下垂體及腦組織。

已知該LIV-1蛋白質亦與某些癌狀況有關，例如乳癌及前列腺癌。檢測到LIV-1係與雌激素受體陽性乳癌(McClelland et al.,Br.J.Cancer 77：1653-1656(1998))及這些癌轉移擴散至區域性淋巴結有關。Manninget al.,Eur.J.Cancer 30A：675-678(1994)。

本發明提供一種人化抗體，其包含成熟重鏈可變區及成熟輕鏈可變區，其中該成熟重鏈可變區具有與SEQ ID NO：53至少90%一致性之胺基酸序列，惟其位置H27係由L佔據、位置H29係由I佔據、H30由E且H94由V佔據，且該成熟輕鏈可變區具有與SEQ ID NO：60至少90%之一致性，惟其位置L36係由Y佔據且位置L46由P佔據。可任意選擇地，該人化抗體包含SEQ ID NO：53之三個互補決定區(CDR)及SEQ ID NO：60之三個CDR。這些CDR係顯示於圖16。可任意選擇地，位置H76係由N佔據。可任意選擇地，該人化抗體包含成熟重鏈可變區及成熟輕鏈可變區，該成熟重鏈可變區具有與SEQ ID NO：53至少95%一致性之胺基酸序列，且該成熟輕鏈可變區具有與SEQ ID NO：60至少95%一致性。可任意選擇地，該成熟重鏈可變區係與重鏈恆定區融合且該成熟輕鏈可變區係與輕鏈恆定區融合。可任意選擇地，該重鏈恆定區係天然人恆定區之突變形式，該突變形式之天然人恆定區相較於該天然人恆定區具有減少之與Fc γ受體之結合。可任意選擇地，該重鏈恆定區係IgG1同型。可任意選擇地，該重鏈恆定區具有包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列且該輕鏈恆定區具有包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列。可任意選擇地，該重鏈恆定區具有包含SEQ ID NO：46(S239C)之胺基酸序列且該輕鏈恆定區具有包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列。在一些該等人化抗體中，該分別源自SEQ ID NO：52及60之成熟重鏈可變區及成熟輕鏈可變區之CDR的任何差異係位於位置H60至H65。在一些該等人化抗體中，該成熟重鏈可變區具有被命名為SEQ ID NO：52或53之胺基酸序列，且該成熟輕鏈可變區具有被命名為SEQ ID NO：59或60之胺基酸序列。在一些該等人化抗體中，該成熟重鏈可變區具有被命名為SEQ ID NO：53之胺基酸序列，且該成熟輕鏈可變區具有被命名為SEQ ID NO：60之胺基酸序列。一些該等人化抗體係與細胞毒性劑或細胞靜止劑共軛。一些該等人化抗體與人或馬來猴(cynomolgus monkey)之LIV-1的結合常數係0.5至2×10⁹M^-1。

本發明亦提供一種人化抗體，其包含成熟重鏈可變區及成熟輕鏈可變區，該成熟重鏈可變區包含SEQ ID NO：52之三個卡巴(Kabat)CDR，其中位置H27係由L佔據、位置H29係由I佔據、H30由E、H76由N、及H94由V佔據，且該成熟輕鏈可變區包含SEQ ID NO：60之三個卡巴(Kabat)CDR，惟其位置L36係由Y佔據且位置L46由P佔據。

本發明亦提供一種核酸，其編碼如上述定義之人化抗體中任一者之成熟重鏈可變區及/或成熟輕鏈可變區。

本發明另外提供一種治療罹癌或有罹癌風險之病患的方法，該方法包含投予如上述定義之人化抗體中之任一者之有效配方至該病患。該癌可為例如乳癌、子宮頸癌、黑色素瘤或前列腺癌。

本發明另提供一種醫藥組成物，其包含如上述定義之人化抗體。

本發明另提供治療表現該LIV-1蛋白之黑色素瘤的病患之方法，該方法藉由投予足以抑制該黑色素瘤癌細胞生長之量的LIV-1特異性抗體或LIV-1抗體藥物共軛物至該病患。

本發明另提供治療表現該LIV-1蛋白之子宮頸癌的病患之方法，該方法藉由投予足以抑制該子宮頸癌細胞生長之量的LIV-1特異性抗體或LIV-1抗體藥物共軛物至該病患。

本發明另提供一種人化抗體，其包含成熟重鏈可變區及成熟輕鏈可變區，該成熟重鏈可變區具有與HB(SEQ ID NO：10)至少90%一致性之胺基酸序列，且該成熟輕鏈可變區具有與LB(SEQ ID NO：15)至少90%一致性。可任意選擇地，該抗體包含成熟重鏈可變區及成熟輕鏈可變區，其中該成熟重鏈可變區具有與HB至少有95%一致性之胺基酸序列，且該成熟輕鏈可變區與LB至少有95%一致性。可任意選擇地，在任何該抗體中，位置H29、H30及H76係由I、E及N佔據，且L36係由Y佔據。可任意選擇地，在該成熟重鏈可變區與SEQ ID NO：10之可變區架構之任何差異係選自由F佔據之H27、由N佔據之H28、由I佔據之H48、由K佔據之H66、由A佔據之H67、由A佔據之H71、由N佔據之H76、由N佔據之H93、由V佔據之H94、由L佔據之L37、由K佔據之 L39、由K佔據之L45、或由L佔據之L46。可任意選擇地，該成熟重鏈可變區之3個CDR係SEQ ID NO：10之3個CDR且該成熟輕鏈可變區之3個CDR係SEQ ID NO：15之3個CDR。這些CDR係顯示於圖1。可任意選擇地，該成熟重鏈可變區係與重鏈恆定區融合且該成熟輕鏈可變區係與輕鏈恆定區融合。可任意選擇地，該重鏈恆定區係天然人恆定區之突變形式，該突變形式之天然人恆定區相較於該天然人恆定區具有減少之與Fc γ受體之結合。可任意選擇地，該重鏈恆定區係IgG1同型。可任意選擇地，該重鏈恆定區具有包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列且該輕鏈恆定區具有包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列。可任意選擇地，該重鏈恆定區具有包含SEQ ID NO：8(S239C)之胺基酸序列且該輕鏈恆定區具有包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列。可任意選擇地，該分別源自SEQ ID NO：10及15之成熟重鏈可變區及成熟輕鏈可變區之CDR的任何差異係位於位置H60至H65。可任意選擇地，該成熟重鏈可變區具有包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列，且該成熟輕鏈可變區具有包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列。可任意選擇地，該抗體係與細胞毒性劑或細胞靜止劑共軛。較佳之人化抗體相較於抗體BR2-14a對LIV-1具有較高之親和性。在另一實施態樣中，該人化抗體與人或馬來猴(cynomolgus monkey)之LIV-1的結合常數係0.5至2×10⁹M^-1。

本發明另提供一種人化抗體，其包含成熟重鏈可變區 及成熟輕鏈可變區，該成熟重鏈可變區包含SEQ ID NO：10之3個CDR，其中位置H29、H30及H76係分別被I、E及N佔據，且該成熟輕鏈可變區包含SEQ ID NO：15之3個CDR，其中位置L36係被Y佔據。

本發明另提供一種核酸，其編碼如上述之人化抗體中任一者之成熟重鏈可變區及/或成熟輕鏈可變區。

本發明另外提供一種治療罹癌或有罹癌風險之病患的方法，該方法包含投予如上述之人化抗體之有效配方至該病患。可任意選擇地，該癌係乳癌、子宮頸癌、黑色素瘤或前列腺癌。

本發明另提供一種醫藥組成物，其包含如上述之人化抗體。

本發明另外提供一種治療罹患三陰性乳癌或有罹患該乳癌風險之病患的方法，該方法包含投予與LIV-1特異性結合之抗體的有效配方至該病患。可任意選擇地，在該些方法中，該抗體係與細胞毒性劑或細胞靜止劑共軛。

定義

單株抗體通常以分離形式提供。這表示抗體通常具有至少50% w/w之純度，其不含在彼之產製或純化所產生之干擾蛋白質及其他汙染物，但不排除該單株抗體與多餘之醫藥上可接受之載劑或其他載具組合以利彼之使用之可能性。有時單株抗體具有至少60%、70%、80%、90%、95或99% w/w不含源自產製或純化之干擾蛋白質及汙染 物之純度。

單株抗體與彼之標靶抗原之特異性結合係指至少10⁶、10⁷、10⁸、10⁹或10¹⁰ M^-1之親和性。特異性結合之強度係可檢測地較高，且可與發生於至少一種非相關性標靶之非特異性結合區別。特異性結合可為特定官能基之間形成鍵結與或特定空間契合(例如鎖及鑰匙類型)之結果，然而非特異性結合通常是凡得瓦(van der Waals)力之結果。然而，特異性結合不一定表示單株抗體與一且僅一標靶結合。

基本抗體結構單位係子單位之四聚體。每個四聚體包括二對相同之多肽鏈對，各對具有一條“輕鏈”(約25千道爾頓)及一條“重鏈”(約50至70千道爾頓)。各鏈之胺基端部分包括約100至110個或更多胺基酸之可變區，該可變區主要負責辨識抗原。此可變區在剛被表現時係與可切割之信號肽連接。不具有該信號肽之可變區有時被稱為成熟可變區。因此，舉例來說，輕鏈成熟可變區係指不具有輕鏈信號肽之輕鏈可變區。各鏈之羧基端部分定義主要負責效應功能之恆定區。

輕鏈被分類為κ或λ。重鏈被分成γ、μ、α、δ或ε，且分別定義該抗體之同型為IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。在輕鏈及重鏈之內，該可變區及恆定區係由約12或更多個胺基酸之"J"區連接，而重鏈亦包括約10或更多個胺基酸之"D"區。(一般見Fundamental Immunology(Paul,W.,ed.,2nd ed.Raven Press,N.Y.,1989,Ch.7，以參考 方式整體納入以符合所有目的)。

各輕鏈/重鏈對之成熟可變區形成抗體結合位點。因此，完整抗體具有二個結合位點。除了雙官能性或雙特異性抗體之外，該二個結合位點係相同的。該鏈皆展現相同之一般性結構，其中相對保守之架構區(FR)係由3個亦稱為互補決定區或CDR之超變異區連接。各對中之2條鏈的CDR係由該架構區排比，使其能與特定表位結合。從N端至C端，輕鏈及重鏈皆包含結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。分配胺基酸至各結構域係根據卡巴(Kabat)(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,MD,1987 and 1991))或柯西亞(Chothia & Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917(1987)；Chothia et al.,Nature 342：878-883(1989))之定義。卡巴亦提供廣泛使用之編號慣例(卡巴編號)，其中在不同重鏈之間或不同輕鏈之間的對應殘基係經分配相同編號。

用語「抗體」包括完整抗體及彼等之結合片段。通常，抗體片段會與彼等所起源之完整抗體競爭與標靶之特異性結合，包括分開重鏈、輕鏈Fab、Fab'、F(ab')₂、F(ab)c、雙價抗體、Dab、奈米抗體及Fv。片段可藉由重組DNA技術或藉由酶或化學分離完整免疫球蛋白加以產製。用語「抗體」亦包括雙價抗體(同型二聚體Fv片段)或迷你抗體(V_L-V_H-C_H3)、雙特異性抗體或該類似物。雙特異性或雙官能性抗體係具有二個不同重鏈/輕鏈對及二個 不同的結合位點之人工雜交抗體(見例如Songsivilai and Lachmann,Clin.Exp.Immunol.,79：315-321(1990)；Kostelny et al.,J.Immunol.,148：1547-53(1992))。用語「抗體」包括抗體本身(裸抗體)或與細胞毒性劑或細胞靜止劑共軛之抗體。

用語「表位」係指在抗原上與抗體結合之位點。表位可自連續胺基酸或藉由一或多個蛋白質之三級摺疊並列之非連續胺基酸形成。自連續胺基酸形成之表位在暴露於變性溶劑時通常仍被保留，然而藉由三級摺疊形成之表位通常在變性溶劑處理後消失。表位通常包括至少3個及更常地至少5或8至10個呈獨特空間構形之胺基酸。測定表位之空間構形之方法包括例如x光結晶學及二維核磁共振。見例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,Vol.66,Glenn E.Morris,Ed.(1996)。

辨識相同或重疊表位之抗體可在簡單之顯示一抗體與另一抗體競爭與標靶抗原結合之能力的免疫試驗中識別。抗體之表位亦可藉由與彼之抗原結合之抗體的X光結晶學定義以識別接觸殘基。另外，若在抗原中減少或消除一抗體之結合的所有胺基酸突變減少或消除另一抗體之結合，則該二個抗體具有相同表位。若減少或消除一抗體之結合的一些胺基酸突變減少或消除另一抗體之結合，則該二個抗體具有重疊之表位。

抗體之間的競爭係由試驗測定，其中受測抗體抑制參 考抗體與共同抗原之特異性結合(見例如Junghans et al.,Cancer Res.50：1495,1990)。若在競爭結合試驗中測量到多餘的受測抗體(例如至少2x、5x、10x、20x或100x)抑制該參考抗體至少50%、但較佳75%、90%或99%之結合，則該受測抗體與參考抗體競爭。由競爭試驗所識別之抗體(競爭性抗體)包括與參考抗體之相同表位結合之抗體及與該參考抗體所結合之表位夠近之鄰近表位結合而發生空間位阻之抗體。

用語「病患」包括人及其他接受預防性或治療性治療之哺乳動物個體。

為了區分保守性或非保守性之胺基酸取代，胺基酸被分成下列幾組：第一組(疏水性側鏈)：甲硫胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸；第二組(中性親水性側鏈)：半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸；第三組(酸性側鏈)：天冬胺酸、麩胺酸；第四組(鹼性側鏈)：天冬醯胺酸、麩醯胺酸、組胺酸、離胺酸、精胺酸；第五組(影響鏈方向性之殘基)：甘胺酸、脯胺酸；及第六組(芳香族側鏈)：色胺酸、酪胺酸、苯丙胺酸。保守性取代涉及在同一組當中不同胺基酸之間的取代。非保守性取代包括用這些分組中之一組的成員交換另一組的成員。

序列一致性百分比係由經卡巴編號慣例最佳排比之抗體序列測定。在排比後，若主題抗體區(例如重鏈或輕鏈之整個成熟可變區)係與參考抗體之該相同區域比較，則該主題及參考抗體區之間的序列一致性百分比係將該主題 及參考抗體區二者當中由相同胺基酸佔據之位置數目除以該二區之排比位置之總數(缺口不予計算)，並乘以100以換算成百分比。

「包含」一或多個列舉元件之組成物或方法可能包括未經特別列舉出之其他元件。舉例來說，包含抗體之組成物可能僅包含該抗體或包含該抗體與其他成分之組合。

指定一範圍之數值包括在該範圍內或定義該範圍之所有整數。

抗體效應功能係指由免疫球蛋白(Ig)之Fc結構域所貢獻之功能。該等功能可為例如抗體依賴性細胞性細胞毒性、抗體依賴性細胞性吞噬作用或補體依賴性細胞毒性。該等功能可由例如Fc效應結構域與具有吞噬細胞活性或溶解活性之免疫細胞上的Fc受體結合引起，或由Fc效應結構域與補體系統之成分結合引起。通常，由該Fc結合細胞或補體成分所媒介之效應導致該LIV-1標靶細胞之抑制及/或刪除。抗體之Fc區可吸引Fc受體(FcR)表現細胞，使這些細胞與被抗體包覆之標靶細胞連接。表現IgG之表面FcR包括FcγRIII(CD16)、FcγRII(CD32)及FcγRIII(CD64)的細胞可作為效應細胞以摧毀被IgG包覆之細胞。該等效應細胞包括單核球、巨噬細胞、自然殺手(NK)細胞、嗜中性球及嗜酸性球。IgG與FcγR之結合活化抗體依賴性細胞性細胞毒性(ADCC)或抗體依賴性細胞性吞噬作用(ADCP)。ADCC係由CD16⁺效應細胞經由分泌膜孔形成蛋白質及蛋白酶所媒介，然而吞噬作用係由 CD32⁺及CD64⁺效應細胞所媒介(見Fundamental Immunology,4^th ed.,Paul ed.,Lippincott-Raven,N.Y.,1997，第3、17及30章；Uchida et al.,2004,J.Exp.Med.199：1659-69；Akewanlopet al.,2001,Cancer Res.61：4061-65；Watanabe et al.,1999,Breast Cancer Res.Treat.53：199-207)。除了ADCC及ADCP之外，與細胞結合之抗體的Fc區亦可活化補體經典途徑以誘發補體依賴性細胞毒性(CDC)。當抗體與抗原結合時，補體系統之C1q與該抗體之Fc區結合。C1q與和細胞結合之抗體的結合可誘發涉及C4和C2之蛋白水解活化以產生C3轉換酶之事件級聯。藉由C3轉換酶將C3切割成C3b使終末補體成份包括C5b、C6、C7、C8及C9得以被活化。這些蛋白質一起在該被抗體包覆之細胞上形成膜攻擊複合體孔。這些孔擾亂細胞膜之完整性並殺死該標靶細胞(見Immunobiology,6^th ed.,Janeway et al.,Garland Science,N.Y.,2005,Chapter 2)。

用語「抗體依賴性細胞性細胞毒性」或ADCC係一種用於誘導細胞死亡之機轉，該機轉取決於被抗體包覆之標靶細胞與具有溶解活性之免疫細胞(亦稱為效應細胞)的交互作用。該等效應細胞包括自然殺手細胞、單核球/巨噬細胞及嗜中性球。該等效應細胞與和標靶細胞經由彼等之抗原結合部位結合之Ig的Fc效應結構域連接。被抗體包覆之標靶細胞因為效應細胞之活性而死亡。

用語「抗體依賴性細胞性吞噬作用」或ADCP係指被抗 體包覆之細胞被與Ig之Fc效應結構域結合之吞噬細胞性免疫細胞(例如巨噬細胞、嗜中性球及樹突細胞)內化(不論整體或部分)之過程。

用語「補體依賴性細胞毒性」或CDC係指一種誘導細胞死亡之機轉，其中與標靶結合之抗體的Fc效應結構域活化一系列酶反應以在該標靶細胞膜上形成孔。通常，抗原抗體複合物諸如該些在被抗體包覆之標靶細胞上之抗原抗體複合物與補體成份C1q結合並活化之，該經活化之C1q接著活化補體級聯以導致標靶細胞死亡。補體之活化亦可導致補體成份在該標靶細胞表面上沉積，此藉由與白血球上之補體受體(例如CR3)結合以利ADCC。

「細胞毒性效應」係指除盡、消除及/或殺死標靶細胞。「細胞毒性劑」係指對細胞具有細胞毒性效應之劑。細胞毒性劑可與抗體共軛或與抗體組合投予。

「細胞靜止效應」係指抑制細胞增生。「細胞靜止劑」係指對細胞具有細胞靜止效應之劑，藉以抑制特定細胞亞群之生長及/或擴張。細胞靜止劑可與抗體共軛或與抗體組合投予。

用語「醫藥上可接受」係指經美國聯邦或州政府管理機關核准或可核准，或經列示於美國藥典或其他公認藥典中以使用於動物及特別是人。用語「醫藥上可相容之成分」係指抗LIV-1抗體在醫藥上可接受之稀釋劑、佐劑、賦形劑、或載具。

用語「醫藥上可接受之鹽」係指抗LIV-1抗體或彼之共 軛物或與抗LIV-1抗體一起投予之劑的醫藥上可接受之有機或無機鹽。示範性鹽類包括硫酸鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽、草酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸式磷酸鹽、異菸鹼酸鹽、乳酸鹽、柳酸鹽、酸性檸檬酸鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、鞣酸鹽、泛酸鹽、二酒石酸鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、順丁烯二酸鹽、龍膽酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡萄糖酸鹽、葡萄糖酸酸鹽、蔗糖酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、麩胺酸鹽、甲烷磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽及雙羥萘酸鹽(即1,1’亞甲基雙-(2羥基3萘甲酸鹽))。醫藥上可接受之鹽可能涉及納入另一分子諸如乙酸離子、琥珀酸離子或其他反離子。該反離子可為穩定母體化合物之電荷的任何有機或無機基團。另外，醫藥上可接受之鹽在彼之結構中可具有超過一個帶電原子。多帶電原子係該醫藥上可接受之鹽的一部分之例可具有多重反離子。因此，醫藥上可接受之鹽可具有一或多個帶電原子及/或一或多個反原子。

除非在上下文中清楚明示，用語「約」包含在所述數值之標準差之內的數值。

本發明之詳細說明 I.通則

本發明提供與LIV-1特異性結合之單株抗體類。該等抗體可被用於治療及診斷各種癌及檢測LIV-1。

II.標靶分子

除非另外說明，否則LIV-1係指人LIV-1。示範性人序列具有Swiss Prot編號Q13433。Q13433係包括於此處為SEQ ID NO：83。已知有三種變異異構體及一種多形性。第二種人LIV-1蛋白質(編號AAA96258.2)係包括於此處為SEQ ID NO：84。Q13433之四個胞外結構域係分別由殘基29-325、377-423、679-686及746-755形成。

除非上下文另外清楚說明，提及LIV-1係指該蛋白質之至少一個胞外結構域且通常指不含可切割信號肽(Q13433之胺基酸1-28)之該完整蛋白質。

本發明之抗體 A.結合專一性及功能特性

本發明提供衍生自二個小鼠抗體BR2-14a及BR2-22a之人化抗體。除非另外清楚說明，本發明關於兩種抗體。該二種小鼠抗體之成熟重鏈及輕鏈可變區彼此顯示94%及91%序列一致性。該二種抗體與人LIV-1之相同或重疊表位結合。然而如圖22所示，該BR2-22a抗體對人LIV-1之親和性約為BR2-14a之10倍，對馬來猴LIV-1之親和性約為BR2-14a之3倍。

人化形式之小鼠BR2-14a抗體之親和性(即Ka)係較佳地為該小鼠抗體BR2-14a對人LIV-1之親和性的5倍或2倍之內。人化BR2-14a抗體如同彼等所源自之小鼠抗體般地與天然形式及/或CHO細胞重組表現之人LIV-1特異性結合。相較於BR2-14a，較佳之人化BR2-14a抗體對人 LIV-1具有相同或較高之親和性(即超過測量誤差之邊緣)(例如為BR2-14a之親和性的1.1至5倍、1.1至3倍、1.5至3倍、1.7至2.3倍、或1.7至2.1倍，或約為BR2-14a之親和性的兩倍)。較佳之人化BR2-14a抗體與BR2-14a所結合之人LIV-1上之相同表位結合及/或競爭。較佳之人化BR2-14a抗體亦與LIV-1之馬來猴同源物結合，因此允許在非人靈長動物中進行臨床前試驗。

人化形式之小鼠BR2-22a抗體對人LIV-1(天然表現或自CHO細胞表現)之親和性(即Ka)係較佳地為該小鼠抗體BR2-22之親和性的5倍或2倍之內。有些人化BR2-22a抗體具有實質上與BR2-22a相同之結合常數(即在實驗誤差之內)。有些人化BR2-22a抗體具有該BR2-22a抗體之結合常數的0.5至1倍或0.5至1.5倍之範圍內的結合常數。較佳之人化BR2-22a抗體對CHO細胞所表現之人LIV-1具有高於5×10⁸ M^-1、或在0.5至2×10⁹ M^-1或約0.8×10⁹ M^-1(+/-測量誤差)之結合常數。此處及本說明書中他處所述之親和性可根據實施例中之方法測量。較佳之人化BR2-22a抗體與BR2-22a所結合之人LIV-1上之相同表位結合及/或競爭。人化BR2-22a抗體與LIV-1之馬來猴同源物以及人LIV-1結合。較佳之人化BR2-22a抗體以實質上相同之結合常數與CHO細胞所表現之人及馬來猴LIV-1二者結合(在實驗誤差之內)，因此允許及增加在非人靈長動物之臨床前試驗之預測正確性。

較佳之抗體(人化BR2-14a及人化BR2-22a二者)在動 物模型或臨床試驗中抑制癌(例如細胞之生長、轉移及/或有機體之致死性)，如在培養中之癌性細胞之增殖。動物模型可藉由將LIV-1表現性人腫瘤細胞系植入適當之免疫缺陷鼠品系中形成，例如無胸腺裸鼠或SCID小鼠。這些腫瘤細胞系可被建立於免疫缺陷鼠宿主中，藉由皮下注射成為實質腫瘤或藉由靜脈注射成為散播型腫瘤。一旦在宿主體內建立後，這些腫瘤模型可被用於評估該抗LIV-1抗體或彼等之共軛形式之治療療效，如實施例中所述。

B.人化抗體

人化抗體係經遺傳工程化之抗體，其中源自非人「捐贈者」抗體之CDR被植入人「接受者」抗體序列(見例如Queen,US 5,530,101及5,585,089；Winter,US 5,225,539；Carter,US 6,407,213；Adair,US 5,859,205；及Foote,US 6,881,557)。該接受者抗體序列可為例如成熟人抗體序列、該等序列之組合物、人抗體序列之共同序列或種系區序列。較佳之用於重鏈之接受者序列係種系V_H外顯子V_H1-2(在文獻中亦稱為HV1-2)(Shin et al.,1991,EMBO J.10：3641-3645)及絞鏈區(J_H)之外顯子J_H-6(Mattila et al.,1995,Eur.J.Immunol.25：2578-2582)。以輕鏈而言，較佳之接受者序列係外顯子VK2-30(在文獻中亦稱為KV2-30)及絞鏈區之外顯子J κ-4(Hieter et al.,1982,J.Biol.Chem.257：1516-1522)。因此，人化抗體係具有完全或實質上源自捐贈者抗體之一些或所有CDR及完全或實質上源自人抗體序列之可變區架構序列及恆定區 (若存在的話)之抗體。類似地，人化重鏈具有至少一、二及通常所有三個完全或實質上源自捐贈者抗體重鏈之CDR，及實質上源自人重鏈可變區架構及恆定區序列之重鏈可變區架構序列及重鏈恆定區(若存在的話)。類似地，人化輕鏈具有至少一、二及通常所有三個完全或實質上源自捐贈者抗體輕鏈之CDR，及實質上源自人輕鏈可變區架構及恆定區序列之輕鏈可變區架構序列及輕鏈恆定區(若存在的話)。除了奈米抗體及dAb之外，人化抗體包含人化重鏈及人化輕鏈。當人化抗體中之CDR與非人抗體中之對應CDR之間的對應殘基(如卡巴定義)具有至少60%、85%、90%、95%或100%之一致性時，該人化抗體中之CDR係實質上源自該非人抗體中之對應CDR。抗體鏈之可變區架構序列或抗體鏈之恆定區係分別實質上源自人可變區架構序列或人恆定區，當彼等之由卡巴定義之對應殘基具有至少85%、90%、95%或100%之一致性。

雖然人化抗體通常納入所有六個來自小鼠抗體之CDR(較佳地由卡巴定義)，彼等亦可由少於所有源自小鼠抗體之CDR(例如至少3、4或5個CDR)組成(例如Pascalis et al.,J.Immunol.169：3076，2002；Vajdos et al.,Journal of Molecular Biology,320：415-428,2002；Iwahashi et al.,Mol.Immunol.36：1079-1091,1999；Tamura et al,Journal of Immunology,164：1432-1441,2000)。

源自人可變區架構殘基之某些胺基酸可根據彼等對 CDR構形及/或與抗原結合之可能影響經選擇加以取代。該等可能影響係藉由模型化、檢查在特定位置之胺基酸的特徵、或經驗性觀察特定胺基酸之取代或突變形成之效應加以調查。

舉例來說，當小鼠可變區架構殘基與經選擇之人可變區架構殘基之間的胺基酸不同時，該人架構胺基酸可利用源自該小鼠抗體之相等架構胺基酸加以取代，若能合理地預期該胺基酸：(1)非共價地與抗原直接結合；(2)比鄰CDR區；(3)以其他方式與CDR區交互作用(例如位於CDR區之約6 Å以內)；或(4)媒介該重鏈與輕鏈之間的交互作用。

本發明提供人化形式之小鼠BR2-14a抗體，其包括五個示範性人化重鏈成熟可變區(HA至HE)及六個示範性人化輕鏈成熟可變區(LA至LF)。具有最強結合力(最低EC50)之這些鏈的排列組合係HBLB、HBLF、HCLB、HCLF、HDLB、HDLF、HELE及HELF。在這些排列組合當中，HBLB(又稱為hLIV14)係為較佳，因為其具有最強之結合力(約為該小鼠捐贈抗體之2倍)及最少之回復突變(四個)。

本發明提供HBLB人化抗體之變異體，其中該人化重鏈成熟可變區顯示與SEQ ID NO：10至少90%、95%或99%一致性，且該人化輕鏈成熟可變區顯示與SEQ ID NO：15至少90%、95%或99%序列一致性。較佳地，在該等抗體中，HBLB中之一些或所有回復突變係經保留。換言之，至少1、2或較佳地所有3個重鏈位置H29、H30及H76係分別由I、E及N佔據。類似地，位置L36係由Y佔據。該等人化抗體之CDR區係較佳地與HBLB之CDR區實質上一致，這些區係與小鼠捐贈者抗體之該等區相同。該等CDR區可藉由任何習用定義(例如柯西亞(Chothia))定義，但較佳係由卡巴(Kabat)定義。在一實施態樣中，該人化抗體包含重鏈，該重鏈包含SEQ ID NO：10之3個CDR及與SEQ ID NO：10之可變區架構具有至少95%一致性之可變區架構。在另一實施態樣中，該人化抗體包含輕鏈，該輕鏈包含SEQ ID NO：15之3個CDR及與SEQ ID NO：15之可變區架構具有至少95%一致性之可變區架構。在另一實施態樣中，該人化抗體包含重鏈及輕鏈，該重鏈包含SEQ ID NO：10之3個CDR及與SEQ ID NO：10之可變區架構具有至少95%一致性之可變區架構，且該輕鏈包含SEQ ID NO：15之3個CDR及與SEQ ID NO：15之可變區架構具有至少95%一致性之可變區架構。

就與示範性HBLB人化抗體顯示任何差異之人化抗體而言，該額外差異之一種可能性係在該可變區架構中之額外的回復突變。在其他示範性人化重鏈或輕鏈成熟可變區中發生回復突變之任何或所有位置亦可發生回復突變(即1、2、3、4、5、6、7、8或所有9個在該重鏈中由F佔 據之H27、由N佔據之H28、由I佔據之H48、由K佔據之H66、由A佔據之H67、由A佔據之H71、由N佔據之H76、由N佔據之H93、及由V佔據之H94，及1、2、3、4或所有5個在該輕鏈中由L佔據之L37、由K佔據之L39、由K佔據之L45、及由L佔據之L46)。然而，該等額外之回復突變並不較佳，因為它們通常不改善親和性，且導入更多小鼠殘基可能導致增加免疫原性之風險。

本發明提供人化形式之小鼠BR2-22a抗體，其包括三個示範性人化重鏈成熟可變區(HE、HF及HG)和二個示範性人化輕鏈(LF及LG)，彼等可經不同排列加以組合以產生適當之結合力(見圖21)。在這些排列組合中，HGLG(又名hLIV22)係為較佳，因為其具有最佳結合特性之組合(實質上與小鼠BR2-22a抗體在實驗誤差內相同)及最少之回復突變(七個)。

本發明提供HGLG人化抗體之變異體，其中該人化重鏈成熟可變區顯示與SEQ ID NO：53至少90%、95%、98%或99%一致性，且該人化輕鏈成熟可變區顯示與SEQ ID NO：60至少90%、95%、98%或99%序列一致性。較佳地，在該等抗體中，HGLG中之一些或所有回復突變係經保留。換言之，至少1、2、3、4或較佳地所有5個重鏈位置H27、H29、H30、H76及H94係由L、I、E、N及V佔據(此處及本說明書他處使用卡巴編號以描述成熟可變區重鏈及輕鏈可變區中之位置)。在這些回復突變中，H94對於保留結合親和性之貢獻最大，H76最少。類似地，位 置L36及L46係分別由Y及P較佳地佔據。該等人化抗體之CDR區係較佳地與HGLG之CDR區實質上一致，這些區係與小鼠捐贈者抗體之該等區相同。該等CDR區可藉由任何習用定義(例如柯西亞(Chothia))定義，但較佳係由卡巴(Kabat)定義。在一實施態樣中，該人化抗體包含重鏈，該重鏈包含SEQ ID NO：53之3個CDR及與SEQ ID NO：53之可變區架構具有至少95%一致性之可變區架構。在另一實施態樣中，該人化抗體包含輕鏈，該輕鏈包含SEQ ID NO：60之3個CDR及與SEQ ID NO：60之可變區架構具有至少95%一致性之可變區架構。在另一實施態樣中，該人化抗體包含重鏈及輕鏈，該重鏈包含SEQ ID NO：53之3個CDR及與SEQ ID NO：53之可變區架構具有至少95%一致性之可變區架構，且該輕鏈包含SEQ ID NO：60之3個CDR及與SEQ ID NO：60之可變區架構具有至少95%一致性之可變區架構。

就與示範性HGLG人化抗體顯示任何差異之人化BR2-22a抗體而言，該額外差異之一種可能性係在該可變區架構中之額外的回復突變。在其他示範性人化重鏈或輕鏈成熟可變區中發生回復突變之任何或所有位置亦可發生回復突變(即1、2、3、4、5、或所有6個在該重鏈中由N佔據之H28、由I佔據之H48、由K佔據之H66、由A佔據之H67、由A佔據之H71、及由T佔據之H93，及1或2個在該輕鏈中由L佔據之L37、及由K佔據之L45)。然而，該等額外之回復突變並不較佳，因為它們通常不改善 親和性，且導入更多小鼠殘基可能導致增加免疫原性之風險。

另一可能之變異體係以源自人CDR序列之對應殘基取代小鼠抗體之CDR中之某些殘基，通常源自用於設計該示範性人化抗體之該人接受者序列之CDR。在一些抗體中，只需要部分之CDR(也就是結合所需之CDR殘基之亞群，稱為SDR)以維持人化抗體之結合力。不與抗原接觸且不位於SDR中之CDR殘基可根據先前試驗，藉由分子模型及/或經驗或如Gonzales et al.,Mol.Immunol.41：863(2004)中所述自位於柯西亞超變異環(Chothia,J.Mol.Biol.196：901,1987)以外之卡巴CDR之區識別(例如在CDR H2中之殘基H60至H65通常不被需要)。在該等人化抗體之其中一或多個捐贈者CDR殘基不存在之位置或其中完整之捐贈者CDR被遺漏之位置中，佔據該位置之胺基酸可為佔據該接受者抗體序列中之對應位置(卡巴編號)之胺基酸。在該等CDR中所包括之以接受者胺基酸取代捐贈者胺基酸之數目反映競爭考量之平衡。該等取代可能有利於減少人化抗體中之小鼠胺基酸之數量，因此減少可能之免疫原性。然而，取代亦可造成親和性之改變，因此親和性之顯著減少係較佳地避免。在其他變異體中，在人化BR2-22a抗體之CDR中之一或多個殘基(否則該CDR將與該小鼠BR2-22a抗體之CDR相同)可由源自小鼠BR2-14a抗體之CDR中之對應殘基取代(或反之亦然)。在CDR內經取代之位置及用於取代之胺基酸亦可憑經驗選 擇。

雖然並不偏好，但其他胺基酸取代可發生於例如不與CDR接觸之架構殘基中或甚至在CDR內之一些可能的CDR接觸殘基胺基酸。通常在變異體人化序列中發生之取代相對於經取代之HBLB胺基酸(人化BR2-14a)或HGLG胺基酸(人化BR2-22)係保守性的。較佳地，相對於HBLB或HGLG之取代(不論是否為保守性)對該人化單株抗體之結合親和性或效價(也就是彼與人LIV-1結合及抑制癌細胞生長之能力)不具實質效應。

變異體通常與HBLB(hLIV14)或HGLG(hLIV22)之重鏈及輕鏈成熟可變區序列具有少量(例如在該輕鏈或重鏈成熟可變區或二者中通常不超過1、2、3、5或10個)取代、刪除或插入之差異。

C.選擇恆定區

人化抗體之重鏈及輕鏈可變區可與至少一部份之人恆定區連接。恆定區之選擇部分取決於是否希望具備抗體依賴性細胞媒介性細胞毒性、抗體依賴性細胞性吞噬作用及/或補體依賴性細胞毒性。舉例來說，人同型IgG1及IgG3具有強烈之補體依賴性細胞毒性，人同型IgG2具有微弱之補體依賴性細胞毒性及人IgG4缺乏補體依賴性細胞毒性。人IgG1及IgG3相較於人IgG2及IgG4亦誘導更強之細胞媒介性效應功能。輕鏈恆定區可為λ或κ。抗體可被表現為含有二條輕鏈及二條重鏈之四聚體、分開之重鏈、分開之輕鏈、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、或其中重 鏈及輕鏈可變區結構域係透過間隔子連接之單鏈抗體。

人恆定區顯示在不同個體間之同種異型(allotypic)變異及同型同種異型(isoallotypic)變異，也就是不同個體之恆定區的一或多個多形性位置可互有差異。同型同種異型(Isoallotype)與同種異型(allotype)的不同之處在於，辨識一同型同種異型之血清與一或多種其他同型(isotype)之非多形性區域結合。

在輕鏈及/或重鏈之胺基或羧基端的一或多個胺基酸(諸如重鏈C端之離胺酸)可能在該等分子之一部分或全部當中被遺失或衍生化。取代可發生於恆定區以減少或增加效應功能諸如補體媒介性細胞毒性或ADCC(見例如Winter et al.,US Patent No.5,624,821；Tso et al.,US Patent No.5,834,597；及Lazar et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103：4005,2006)或延長在人體中之半衰期(見例如Hinton et al.,J.Biol.Chem.279：6213,2004)。

示範性取代包括將天然胺基酸取代成半胱胺酸殘基之胺基酸取代被導入胺基酸位置234、235、237、239、267、298、299、326、330、或332，較佳地在人IgG1同型中之S239C突變(US 20100158909)。額外之半胱胺酸殘基之存在允許鏈間雙硫鍵形成。該等鏈間雙硫鍵形成可造成空間位阻，藉此減少該Fc區-Fc γ R結合交互作用之親和性。被導入或靠近IgG恆定區之Fc區中的半胱胺酸殘基亦可作為與治療劑共軛之位點(即利用硫醇特定試劑共軛細胞毒性藥物諸如藥物之順丁烯二醯亞胺衍生物)。治 療劑之存在可造成空間位阻，藉此進一步減少該Fc區-Fc γ R結合交互作用之親和性。其他在234、235、236及/或237任一位置之取代減少對Fc γ受體之親和性，特別是Fc γ RI受體(見例如US 6,624,821、US 5,624,821)。

抗體之活體內半衰期亦可影響彼之效應功能。抗體之半衰期可被增加或減少以調整彼之治療活性。FcRn係結構類似MHC第一型抗原之受體，該MHC第一型抗原與β 2-微球蛋白非共價結合。FcRn調節IgG之分解代謝及彼等在組織間之胞移作用(Ghetie and Ward,2000,Annu.Rev.Immunol.18：739-766；Ghetie and Ward,2002,Immunol.Res.25：97-113)。IgG-FcRn交互作用發生在pH 6.0(胞內囊泡之pH)但不發生於pH 7.4(血液之pH)；此交互作用使得IgG能被再循環回到循環中(Ghetie and Ward,2000,Ann.Rev.Immunol.18：739-766；Ghetie and Ward,2002,Immunol.Res.25：97-113)。人IgG1中與FcRn結合有關之區域已被定位(Shields et al.,2001,J.Biol.Chem.276：6591-604)。在人IgG1之位置Pro238、Thr256、Thr307、Gln311、Asp312、Glu380、Glu382或Asn434的丙胺酸取代增進FcRn之結合(Shields et al.,2001,J.Biol.Chem.276：6591-604)。發生這些取代之IgG1分子具有較長之血清半衰期。因此，這些經修飾之IgG1分子可能可以發揮彼等之效應功能，因而相較於未經修飾之IgG1能在較長之時間展現彼等之治療療效。其他用於增加與FcRn結合之示範性取代包括在位置250之Gln及/或在位 置428之Leu。EU編號係用於恆定區之所有位置。

與該保守性Asn297共價連接之寡糖係與IgG之Fc區與FcγR結合之能力有關(Lund et al.,1996,J.Immunol.157：4963-69；Wright and Morrison,1997,Trends Biotechnol.15：26-31)。此糖化形式之IgG的工程化可顯著增進IgG媒介性ADCC。添加平分型N-乙醯葡萄糖胺修飾(Umana et al.,1999,Nat.Biotechnol.17：176-180；Davies et al.,2001,Biotech.Bioeng.74：288-94)至此糖化形式或自此糖化形式移除岩藻糖(Shields et al.,2002,J.Biol.Chem.277：26733-40；Shinkawa et al.,2003,J.Biol.Chem.278：6591-604；Niwa et al.,2004,Cancer Res.64：2127-33)係二種改善IgG Fc與FcγR之間的結合之IgG Fc工程化實例，藉此增進Ig媒介性ADCC活性。

系統性取代以溶劑暴露之人IgG1 Fc區之胺基酸產生具有經改變之FcγR結合親和性之IgG變異體(Shields et al.,2001,J.Biol.Chem.276：6591-604)。當與母體IgG1比較時，這些涉及在Thr256/Ser298、Ser298/Glu333、Ser298/Lys334、或Ser298/Glu333/Lys334取代成Ala之變異體的亞群顯示對FcγR之結合親和性及ADCC活性增加(Shields et al.,2001,J.Biol.Chem.276：6591-604；Okazaki et al.,2004,J.Mol.Biol.336：1239-49)。

抗體之補體固定活性(C1q結合及CDC活性二者)可藉由Lys326及Glu333之取代而改善(Idusogie et al.,2001,J.Immunol.166：2571-2575)。在人IgG2主鏈上之相同取 代可將與C1q結合不良且嚴重缺乏補體活化活性之抗體同型轉換成可與C1q結合且能媒介CDC之抗體同型(Idusogie et al.,2001,J.Immunol.166：2571-75)。一些其他方法亦可被用於改善抗體之補體固定活性。舉例來說，將IgM之18個胺基酸羧基端尾片段植入IgG之羧基端大幅增強彼等之CDC活性。此甚至可在IgG4中觀察到，IgG4通常不具有可檢測之CDC活性(Smith et al.,1995,J.Immunol.154：2226-36)。同樣地，以Cys取代位於靠近IgG1重鏈之羧基端的Ser444誘發IgG1之尾對尾二聚化，其CDC活性比單體IgG1增加200倍(shopes et al.,1992,J.Immunol.148：2918-22)。此外，對C1q具有特異性之雙特異性雙價抗體建構體亦授予CDC活性(Kontermann et al.,1997,Nat.Biotech.15：629-31)。

補體活性可藉由使重鏈之胺基酸殘基318、320及322中之至少一者突變成具有不同側鏈之殘基(諸如Ala)而被減少。以其他烷基取代之非離子性殘基(諸如Gly、Ile、Leu或Val)或芳香族非極性殘基(諸如Phe、Tyr、Trp及Pro)取代該三個殘基中之任一者亦減少或阻斷C1q結合。Ser、Thr、Cys及Met可被用於殘基320及322(但非318)以減少或阻斷C1q結合活性。以極性殘基取代該318(Glu)殘基可能調節但不會阻斷C1q結合活性。以Ala取代殘基297(Asn)導致去除溶解活性，但僅輕微減少(大約減少三倍)對C1q之親和性。此改變破壞該糖基化位點及補體活化所需之碳水化合物之存在。任何在此位點 之其他取代亦破壞該糖基化位點。下列突變及彼等之任何組合亦減少C1q結合：D270A、K322A、P329A或P311S(見WO 06/036291)。

指涉人恆定區包括具有任何天然同種異型或具有佔據天然同種異型之多形性位置的任何排列組合之殘基的恆定區。同樣地，多達1、2、5或10個突變可存在於天然人恆定區，諸如該些如上所述之可減少Fcgamma受體結合或增加與FcRN結合者。

D.重組抗體之表現

人化抗體通常係由重組表現產製。重組多核苷酸建構體通常包括與抗體鏈之編碼序列可操作地連接之表現控制序列，包括天然連接或異源性啟動子區。較佳地，該表現控制序列係能轉形或轉染真核宿主細胞之載體中之真核啟動子系統。一旦該載體被納入適當宿主之後，該宿主被維持在適合高度表現該核苷酸序列之條件下，並收集及純化該交叉反應性抗體。

哺乳動物細胞係用於表現編碼免疫球蛋白或彼之片段之核苷酸區段的較佳宿主。見Winnacker,From Genes to Clones,(VCH Publishers,NY,1987)。一些可分泌完整異源性蛋白質之適當的宿主細胞系已在該領域中被發展，包括CHO細胞系(例如DG44)、各種COS細胞系、HeLa細胞、HEK293細胞、L細胞及非抗體產生性骨髓瘤(包括Sp2/0及NS0)。較佳地，該些細胞係非人細胞。用於這些細胞之表現載體可包括表現控制序列，諸如複製起點、啟 動子、增強子(Queen et al.,Immunol.Rev.89：49(1986))及必要處理資訊位點，諸如核糖體結合位點、RNA剪切位點、聚腺苷酸化位點及轉錄終止子序列。較佳之表現控制序列係源自內源性基因、巨細胞病毒、SV40、腺病毒、牛乳頭狀瘤病毒及該類似物之啟動子。見Co et al.,J.Immunol.148：1149(1992)。

在經表現後，抗體可根據該領域之標準程序純化，包括HPLC純化、管柱層析、膠體電泳及該類似方法(一般見Scopes,Protein Purification(Springer-Verlag,NY,1982))。

IV.核酸

本發明另提供編碼上述之人化重鏈及輕鏈之任一者之核酸。通常，該核酸亦編碼與該成熟重鏈及輕鏈融合之信號肽。核酸上之編碼序列可與調節序列可操作地連接以確保該編碼序列之表現，諸如啟動子、增強子、核糖體結合位點、轉錄終止信號及該類似序列。編碼重鏈及輕鏈之核酸可發生於經分離之形式或可被選殖至一或多個載體。該等核酸可藉由例如固相合成或重疊寡核苷酸之PCR加以合成。編碼重鏈及輕鏈之核酸可在例如表現載體內被接合成一個連續核酸，或可被各自分開選殖至自己的表現載體。

V.抗體藥物共軛物

抗LIV-1抗體可與細胞毒性劑或細胞靜止劑(包括彼之醫藥上可相容之鹽)共軛以形成抗體藥物共軛物(ADC)。 特別適合用於與抗體共軛之劑係細胞毒性劑(例如化學治療劑)、前藥轉換酶、放射性同位素、放射性化合物、或毒素(這些劑被統稱為治療劑)。舉例來說，抗LIV-1抗體可與細胞毒性劑諸如化學治療劑或毒素共軛(例如細胞靜止劑或殺細胞劑諸如相思豆毒素(abrin)、蓖麻毒蛋白(ricin)A、假單胞菌外毒素、或白喉毒素)。

抗LIV-1抗體可與前藥轉換酶共軛。該前藥轉換酶可利用已知方法與抗體重組融合或與其化學共軛。示範性前藥轉換酶係羧基肽酶G2、β-葡萄糖苷酸酶、青黴素-V-醯胺酶、青黴素-G-醯胺酶、β-內醯胺酶、β-葡萄糖苷酶、硝基還原酶及羧基肽酶A。

用於共軛治療劑至蛋白質(特別是抗體)之技術係廣為周知。(見例如Arnon et al.,“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy,”in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy(Reisfeld et al.eds.,Alan R.Liss,Inc.,1985)；Hellstrom et al.,“Antibodies For Drug Delivery,”in Controlled Drug Delivery(Robinson et al.eds.,Marcel Dekker,Inc.,2nd ed.1987)；Thorpe,“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review,”in Monoclonal Antibodies‘84：Biological And Clinical Applications (Pinchera et al.eds.,1985)；“Analysis,Results,and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy,”in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy(Baldwin et al.eds.,Academic Press,1985)；及Thorpe et al.,1982,Immunol.Rev.62：119-58。亦見例如PCT publication WO 89/12624。)

該治療劑可以減少彼之活性之方式共軛，除非其自該抗體被切割(例如藉由水解、抗體降解或切割劑)。該治療劑係以可切割之連接子與該抗體連接，該可切割之連接子在LIV-1表現性癌細胞之胞內環境中對切割具敏感性，但在胞外環境則不具實質上之敏感性，因此該共軛物會在被LIV-1表現性癌細胞內化後(例如在核內體或(舉例來說藉由pH敏感性或蛋白酶敏感性)在溶酶體環境或在微坑洞環境中)自該抗體被切割。

通常，該ADC包含介於該治療劑及該抗LIV-1抗體之間的連接子區域。如上所述，一般來說，該連接子可在胞內環境中被切割，以使該連接子之切割自該抗體釋放該治療劑至胞內環境(例如在溶酶體或核內體或微坑洞之內)。該連接子可為例如由胞內肽酶或蛋白酶切割之肽基連接子，包括溶酶體或核內體蛋白酶。通常，該肽基連接子係至少二個胺基酸長或至少三個胺基酸長。切割劑可包括組織蛋白酶B、組織蛋白酶D及纖維蛋白溶酶(見例如Dubowchik and Walker,1999,Pharm.Therapeutics 83：67-123)。最典型的是可被存在於LIV-1表現性細胞中之酶所切割之肽基連接子。舉例來說，可被硫醇依賴性蛋白酶組織蛋白酶B(其高度表現於癌性組織中)切割之肽基連接子 可被使用(例如包含Phe-Leu或Gly-Phe-Leu-Gly肽之連接子)。其他該等連接子係描述於例如美國專利第6,214,345號。在特定實施態樣中，該可被胞內蛋白酶切割之肽基連接子包含Val-Cit連接子或Phe-Lys二肽(見例如美國專利第6,214,345號，其描述合成多柔比星(doxorubicin)與該Val-Cit連接子)。利用胞內蛋白水解釋放治療劑之一項優點在於該劑在共軛時通常被減弱，且該共軛物之血清穩定性通常很高。

可切割之連接子可為pH敏感性，即在特定pH值下對水解敏感。通常，該pH敏感性連接子可在酸性條件下被水解。舉例來說，可使用會在溶酶體中被水解之不耐酸之連接子(例如腙、半卡巴腙、硫半卡巴腙、順烏頭醯胺、原酯、縮醛、縮酮或該類似物)。(見例如美國專利第5,122,368、5,824,805、5,622,929號、Dubowchik and Walker,1999,Pharm.Therapeutics 83：67-123、Neville et al.,1989,Biol.Chem.264：14653-14661。)該等連接子在中性pH條件下(諸如在血液中)相對穩定，但在低於pH 5.5或5.0下(約為溶酶體之pH)不穩定。在某些實施態樣中，該可水解之連接子係硫醚連接子(諸如例如經由醯腙鍵與治療劑連接之硫醚(見例如美國專利第5,622,929號))。

其他連接子可在還原條件下被切割(例如雙硫連接子)。雙硫連接子包括該些可利用SATA(N-琥珀醯亞胺基-S-乙醯基硫乙酸酯)、SPDP(N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡 啶基二硫)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫)丁酸酯)和SMPT(N-琥珀醯亞胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫)甲苯)、SPDB和SMPT形成者。(見例如Thorpe et al.,1987,Cancer Res.47：5924-5931；Wawrzynczak et al.,In Immunoconjugates：Antibody Conjugates in Radioimagery and TherapyofCancer(C.W.Vogel ed.,Oxford U.Press,1987。亦見美國專利第4,880,935號。)

該連接子亦可為丙二酸酯連接子(Johnson et al.,1995,Anticancer Res.15：1387-93)、順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基連接子(Lau et al.,1995,Bioorg-Med-Chem.3(10)：1299-1304)、或3’-N-醯胺類似物(Lau et al.,1995,Bioorg-Med-Chem.3(10)：1305-12)。

該連接子亦可為不可切割之連接子，諸如與治療劑(例如藥物)直接連接之順丁烯二醯亞胺基-伸烷基-或順丁烯二醯亞胺-芳基連接子。活性藥物-連接子係藉由降解該抗體時釋放。

通常，對胞外環境實質上不敏感之連接子代表當ADC存在於胞外環境(例如血漿)中時，在該ADC樣本中不超過約20%、通常不超過約15%、更常不超過約10%、甚至更常不超過約5%、不超過約3%、或不超過約1%之連接子係經切割。可測定該連接子是否對胞外環境實質上不敏感，例如藉由使(a)該ADC(“ADC樣本”)及(b)等莫耳量之未共軛抗體或治療劑(“對照樣本”)與血漿獨立培 養一段預定之時間(例如2、4、8、16或24小時)，接著以例如高效液相層析法測量並比較存在於該ADC樣本中與存在於對照樣本中之未經共軛之抗體或治療劑之量。

該連接子亦可增進細胞性內化作用。當與治療劑共軛時，該連接子可增進細胞性內化作用(即在如此處所述之ADC或ADC衍生物之連接子-治療劑基團之環境中)。或者，當與治療劑及抗LIV-1抗體二者共軛時，該連接子可增進細胞性內化作用(即在此處所述之ADC之環境中)。

可被用於本組成物之各種連接子係描述於WO 2004-010957，且具有下式

其中：-A-係延伸單位；a係0或1；各-W-獨立地係胺基酸單位；w獨立地係介於0至12之整數；-Y-係間隔子單位；且y係0、1或2。

代表性延伸單位係如式(Ia)及式(Ib；見下)中之方形括弧內所示，其中A-、-W-、-Y-、-D、w及y係如上定義，且R¹係選自-C₁-C₁₀伸烷基-、-C₃-C₈碳環基-、-O-(C₁-C₈烷基)-、-伸芳基-、-C₁-C₁₀伸烷基-伸芳基-、-伸芳基-C₁-C₁₀伸烷基-、-C₁-C₁₀伸烷基-(C₃-C₈碳環基)- 、-(C₃-C₈碳環基)-C₁-C₁₀伸烷基-、-C₃-C₈雜環基-、-C₁-C₁₀伸烷基-(C₃-C₈雜環基)-、-(C₃-C₈雜環基)-C₁-C₁₀伸烷基-、-(CH₂CH₂O)_r-、或-(CH₂CH₂O)_r-CH₂-；且r係介於1至10之整數。Ab係抗體。

藥物裝載係由p表示，即每抗體之藥物-連接子分子數。根據上下文，p可代表每抗體之藥物-連接子分子之平均數，亦稱為平均藥物裝載。P係介於1至20，且較佳係1至8。在一些較佳之實施態樣中，當p代表平均藥物裝載時，p係介於約2至約5。在一些實施態樣中，p係約2、約3、約4、或約5。在製劑中之每抗體之藥物的平均數可由習用裝置諸如質譜儀、ELISA試驗及HPLC測定。胺基酸單位(-W-)(若存在時)連接該延伸單位(-A-)與該若存在之間隔子單位(-Y-)，若間隔子單位不存在的話，則該胺基酸單位連接該延伸單位與該細胞毒性劑或細胞靜止劑(藥物單位；D)。

若存在的話，-W_w-較佳地係雙肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽單位。

當存在時，該間隔子單位(-Y-)連接胺基酸單位與該藥物單位。間隔子單位通常呈現二種類型：自毀型及非自毀型。非自毀型間隔子單位係指當酶自該抗LIV-1抗體-連接子-藥物共軛物或該藥物-連接子化合物切割胺基酸單位後，該間隔子單位之部分或全部仍與該藥物單位維持連接者。非自毀型間隔子單位之實例包括(甘胺酸-甘胺酸)間隔子單位及甘胺酸間隔子單位。當含有甘胺酸-甘胺酸間隔子單位或甘胺酸間隔子單位之抗LIV-1抗體-連接子-藥物共軛物係經由腫瘤細胞相關性蛋白酶、癌細胞相關性蛋白酶或淋巴細胞相關性蛋白酶進行酶切割時，甘胺酸-甘胺酸-藥物基團或甘胺酸-藥物基團係自Ab-A_a-W_w-切割。為了釋放該藥物，應在標靶細胞內發生獨立之水解反應以切割該甘胺酸-藥物單位鍵結。

另外，含有自毀型間隔子單位之抗LIV-1抗體藥物共軛物不須分開之水解步驟即可釋放該藥物(D)。在該些實施態樣中，-Y-係p-胺基苯甲基醇(PAB)單位，其經由該PAB基團之氮原子與-W_w-連接，並經由碳酸酯、胺基甲酸酯或醚基團與-D直接連接。其他自毀型間隔子之實例包括帶電性相當於PAB基團之芳香族化合物諸如2-胺基咪唑-5-甲醇衍生物(例如見Hay et al.,1999,Bioorg.Med.Chem.Lett.9：2237)及鄰或對-胺基苯甲基縮醛。當醯胺鍵 水解時快速環化之間隔子可被使用，諸如經取代及未經取代之4-胺基丁酸醯胺(Rodrigues et al.,1995,Chemistry Biology 2：223)、經適當取代之雙環[2.2.1]及雙環[2.2.2]環系統(Storm et al.,1972,J.Amer.Chem.Soc.94：5815)及2-胺基苯基丙酸醯胺(Amsberry et al.,1990,J.Org.Chem.55：5867)。消除在甘胺酸之α-位置上經取代之含胺藥物(Kingsbury,et al.,1984,J.Med.Chem.27：1447)亦為可被應用於抗LIV-1抗體-連接子-藥物共軛物之自毀型間隔子策略之實例。或者，該間隔子單位係分支之雙(羥基甲基)苯乙烯(BHMS)單位，其可被用於納入額外之藥物。

可用於與抗LIV-1抗體共軛之細胞毒性劑類型包括例如抗微管蛋白劑、DNA次要凹槽結合劑、DNA複製抑制劑、化學治療致敏劑或該類似物。其他示範性類別之細胞毒性劑包括蒽環類、耳抑素、喜樹鹼、雙聯黴素(duocarmycin)、依扥泊苷(etoposide)、類美坦素(maytansinoid)及長春花生物鹼。一些示範性細胞毒性劑包括耳抑素(例如耳抑素E、AFP、MMAF、MMAE)、DNA次要凹槽結合劑(例如烯二炔及萊克西托素(lexitropsin))、雙聯黴素(duocarmycin)、紫杉烷(例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)及多西紫杉醇(docetaxel))、長春花生物鹼、多柔比星(doxorubicin)、嗎啉基-多柔比星及氰基嗎啉基-多柔比星。

細胞毒性劑可為化學治療劑諸如舉例來說多柔比星(doxorubicin)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、黴法蘭 (melphalan)、長春花生物鹼、甲胺喋呤(methotrexate)、絲裂黴素C或依扥泊苷(etoposide)。該劑亦可為CC-1065類似物、卡利奇黴素(calicheamicin)、美坦素(maytansine)、海兔毒素10(dolastatin 10)之類似物、利索新(rhizoxin)或沙海葵毒素(palytoxin)。

該細胞毒性劑亦可為耳抑素(auristatin)。該耳抑素可為耳抑素E衍生物，例如在耳抑素E和酮酸之間形成的酯。舉例來說，耳抑素E可與對乙醯基苯甲酸或苯甲醯基戊酸反應以分別產生AEB及AEVB。其他典型耳抑素包括AFP、MMAF及MMAE。各種耳抑素之合成及結構係描述於例如US 2005-0238649及US2006-0074008。

該細胞毒性劑可為DNA次要凹槽結合劑。(見例如美國專利第6,130,237號。)舉例來說，該次要凹槽結合劑可為CBI化合物或烯二炔(例如卡利奇黴素(calicheamicin))。

該細胞毒性劑或細胞靜止劑可為抗微管蛋白劑。抗微管蛋白劑之實例包括紫杉烷類(例如Taxol®(太平洋紫杉醇(paclitaxel))、Taxotere®(多西紫杉醇(docetaxel))、T67(Tularik公司)、長春花生物鹼(例如長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、長春地辛(vindesine)、及長春瑞濱(vinorelbine))、及耳抑素(例如耳抑素E、AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB)。(示範性耳抑素亦以下式III至XIII顯示。)其他適當之抗微管蛋白劑包括例如漿果赤黴素(baccatin)衍生物、紫杉烷類 似物(例如埃博黴素(epothilone)A及B)、噻氨酯噠唑(nocodazole)、秋水仙鹼(colchicine)及秋水仙醯胺(colcimid)、雌二醇氮芥(estramustine)、念珠藻素(cryptophysin)、西馬多丁(cemadotin)、類美坦素(maytansinoid)、考布他丁(combretastatin)、圓皮海綿內酯(discodermolide)、及艾榴塞洛素(eleutherobin)。

該細胞毒性劑可為另一類抗微管蛋白劑類美坦素(maytansinoid)。舉例來說，該類美坦素可為美坦素(maytansine)或含美坦素藥物連接子諸如DM-1或DM-4(免疫基因(ImmunoGen)公司；亦見Chari et al.,1992,Cancer Res.52：127-131)。

示範性抗體藥物共軛物包括如下之vcMMAE及 mcMMAF抗體藥物共軛物，其中p及Ab係如此處前述： 或彼等之醫藥上可接受之鹽。

VI.其他抗LIV-1抗體

除了上述人化形式之BR2-14a及BR2-22a抗體之外，其他與LIV-1之胞外域結合之抗體可被用於本發明之一些方法，特別是三陰性乳癌之治療。一些抗LIV-1之小鼠抗體係描述於US20080175839。這些抗體包括1.1F10、1.7A4、BR2-10b、BR2-11a、BR2-13a、BR2-14a、BR2-15a、BR2-16a、BR2-17a、BR2-18a、BR2-19a、BR2-20a、BR2-21a、BR2-22a、BR2-23a、BR2-24a、及BR2-25a，其中由雜交瘤ATCC編號PTA-5706所產製之BR2-19a或由雜交瘤ATCC編號PTA-5707所產製之BR2-23a加上BR2-14a及BR2-22a係為較佳。這些抗體之人化、嵌合或修飾形式可藉由下述之習用方法製備。

其他抗LIV-1抗體可藉由以LIV-1或彼之一或多個胞 外域免疫加以從頭製備。產製抗免疫原之其他非人單株抗體例如小鼠、天竺鼠、靈長動物、兔或大鼠可藉由Harlow & Lane,Antibodies,A Laboratory Manual(CSHP NY,1988)所述據以實施(以參照方式納入以符合所有目的)。該免疫原可自天然來源獲得，藉由肽合成或藉由重組表現。

人化、嵌合或修飾形式之非人抗體可被製備。用於產製人化抗體之一般方法係描述於Queen,US 5,530,101及5,585,089、Winter,US 5,225,539、Carter,US 6,407,213、Adair,US 5,859,205、及Foote,US 6,881,557。嵌合抗體係指其中非人抗體(例如小鼠)之輕鏈及重鏈的成熟可變區係與人輕鏈及重鏈恆定區組合之抗體。該等抗體實質上或完全保留該小鼠抗體之結合特異性，且具有大約三分之二的人序列。經修飾之抗體係一種人化抗體之類型，其保留非人抗體之一些及通常所有的CDR及一些非人可變區架構殘基，但以來自人抗體序列之對應位置的殘基取代其他可能貢獻B-或T-細胞表位之可變區架構殘基，例如經暴露之殘基(Padlan,Mol.Immunol.28：489,1991)。結果係一種其中該CDR係完全或實質上源自非人抗體抗體且該非人抗體之可變區架構藉由取代以使其更加人樣。

抗LIV-1之人抗體可藉由下述之各種技術提供。用於產製人抗體之方法包括三源雜交瘤方法(Oestberg et al.,Hybridoma 2：361-367(1983)、Oestberg之美國專利第 4,634,664號、及Engleman等人之美國專利第4,634,666號)、使用基因轉殖小鼠包括人免疫球蛋白基因(見例如Lonberg et al.,WO93/12227(1993)；US 5,877,397,US 5,874,299,US 5,814,318,US 5,789,650,US 5,770,429,US 5,661,016,US 5,633,425,US 5,625,126,US 5,569,825,US 5,545,806,Nature 148,1547-1553(1994),Nature Biotechnology 14,826(1996),Kucherlapati,WO 91/10741(1991))及噬菌體展示方法(見例如Dower et al.,WO 91/17271及McCafferty et al.,WO 92/01047,US 5,877,218,US 5,871,907,US 5,858,657,US 5,837,242,US 5,733,743及US 5,565,332)。

任一抗體可藉由競爭性結合試驗或其他方式選擇以具有和示範抗體(諸如BR2-14a)相同或重疊之表位特異性。

VII.治療性應用

本發明之人化抗體(單獨或作為彼之LIV-1抗體藥物共軛物)可被用於治療癌。一些癌顯示可檢測之量的LIV-1，其係以蛋白質(例如藉由使用示範性抗體之一者的免疫試驗)或mRNA之量被測量。一些癌相較於該相同類型之非癌組織(較佳地源自該相同病患)顯示上升量之LIV-1。應受治療之癌細胞的示範性LIV-1之量係每細胞5000至150000 LIV-1分子，雖然更高或更低之量可被治療。可任意選擇地，癌之LIV-1之量係於實施治療前測量。

與LIV-1表現有關且應受治療之癌實例包括乳癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、肝癌、胃癌、 腎癌、鱗狀細胞癌(例如膀胱、頭、頸及肺)、皮膚癌(例如黑色素瘤)、小細胞肺癌或肺類癌。該治療可應用至具有這些種類之原發性或轉移性腫瘤之病患。該治療亦可被應用至對習用治療(例如荷爾蒙、它莫西芬(tamoxifen)、賀癌平)反應不佳之病患，或對該等治療出現反應後又復發之病患。該等方法亦可被用於三陰性乳癌。三陰性乳癌係一種癌之術語，其係指當以任何下列受體之抗體染色時缺乏可檢測之雌激素受體及助孕素受體，並缺乏過度表現之HER2/neu之乳癌，如實施例中所述。染色可相對於不相關之對照抗體實施，缺乏表現係在背景染色量中顯示在實驗誤差內與對照之染色量相同或類似。同樣地，缺乏過度表現係藉由染色量在實驗誤差內和非癌性乳房組織(較佳地得自該相同病患)相同或類似顯示。另外或額外地，三陰性乳癌具有對與這些受體交互反應之荷爾蒙無反應性、侵略性行為及獨特之轉移模式之特徵。

hLIV14抗體可被用於治療表現LIV-1之癌。在一實施態樣中，hLIV14抗體被用於治療LIV-1表現性乳癌之個體。在另一實施態樣中，hLIV14抗體被用於治療LIV-1表現性前列腺癌之個體。在另一實施態樣中，hLIV14抗體被用於治療LIV-1表現性黑色素瘤之個體。在另一實施態樣中，hLIV14抗體被用於治療LIV-1表現性卵巢癌之個體。在另一實施態樣中，hLIV14抗體被用於治療LIV-1表現性子宮內膜癌之個體。在另一實施態樣中，hLIV14抗體被用於治療LIV-1表現性子宮頸癌之個體。在另一實 施態樣中，hLIV14抗體被用於治療LIV-1表現性肝癌之個體。在另一實施態樣中，hLIV14抗體被用於治療LIV-1表現性胃癌之個體。在另一實施態樣中，hLIV14抗體被用於治療LIV-1表現性腎癌之個體。在另一實施態樣中，hLIV14抗體被用於治療LIV-1表現性鱗狀細胞癌(例如膀胱癌、頭癌、頸癌及肺癌)之個體。在另一實施態樣中，hLIV14抗體被用於治療LIV-1表現性乳癌之個體。在另一實施態樣中，hLIV14抗體被用於治療LIV-1表現性皮膚癌之個體。在另一實施態樣中，hLIV14抗體被用於治療LIV-1表現性小細胞肺癌或肺類癌之個體。hLIV22抗體可被用於治療表現LIV-1之癌。在一實施態樣中，hLIV22抗體被用於治療LIV-1表現性乳癌之個體。在另一實施態樣中，hLIV22抗體被用於治療LIV-1表現性前列腺癌之個體。在另一實施態樣中，hLIV22抗體被用於治療LIV-1表現性黑色素瘤之個體。在另一實施態樣中，hLIV22抗體被用於治療LIV-1表現性卵巢癌之個體。在另一實施態樣中，hLIV22抗體被用於治療LIV-1表現性子宮內膜癌之個體。在另一實施態樣中，hLIV22抗體被用於治療LIV-1表現性子宮頸癌之個體。在另一實施態樣中，hLIV22抗體被用於治療LIV-1表現性肝癌之個體。在另一實施態樣中，hLIV22抗體被用於治療LIV-1表現性胃癌之個體。在另一實施態樣中，hLIV22抗體被用於治療LIV-1表現性腎癌之個體。在另一實施態樣中，hLIV22抗體被用於治療LIV-1表現性鱗狀細胞癌(例如膀 胱癌、頭癌、頸癌及肺癌)之個體。在另一實施態樣中，hLIV22抗體被用於治療LIV-1表現性乳癌之個體。在另一實施態樣中，hLIV22抗體被用於治療LIV-1表現性皮膚癌之個體。在另一實施態樣中，hLIV22抗體被用於治療LIV-1表現性小細胞肺癌或肺類癌之個體。本說明書首次揭示LIV-1蛋白係表現於黑色素瘤細胞之表面。因此，與LIV-1結合之抗體可被用於治療罹患表現LIV-1之黑色素瘤之病患。該抗體包括此處揭示之抗體，例如hLIV14及hLIV22，但不限於此處所揭示之抗體。

單獨或呈共軛物形式之人化抗體係以有效配方投予，此表示延緩癌之發生、減少癌之嚴重性、抑制癌之進一步惡化、及/或改善癌之至少一種徵候或症狀之劑量、投予途徑及投予頻率。若病患已經罹癌，該配方可指治療性有效配方。若該病患相較於一般大眾具有較高之罹癌風險但尚未出現症狀，則該配方可指預防性有效配方。在一些實例中，治療性或預防性療效可於個體病患中相對於歷史對照或相同病患之過去經驗比較觀察。在其他實例中，治療性或預防性療效可於治療病患族群相對於未經治療之對照病患族群的臨床前或臨床試驗中顯示。

單株抗體之示範性劑量係每公斤病患體重0.1 mg至50 mg、更典型為1 mg/kg至30 mg/kg、1 mg/kg至20 mg/kg、1 mg/kg至15 mg/kg、1 mg/kg至12 mg/kg、或1 mg/kg至10 mg/kg、或2 mg/kg至30 mg/kg、2 mg/kg至20 mg/kg、2 mg/kg至15 mg/kg、2 mg/kg至12 mg/kg、 或2 mg/kg至10 mg/kg、或3 mg/kg至30 mg/kg、3 mg/kg至20 mg/kg、3 mg/kg至15 mg/kg、3 mg/kg至12 mg/kg、或3 mg/kg至10 mg/kg。單株抗體或彼之抗體藥物共軛物之示範性劑量係每公斤個體體重1 mg至7.5 mg、或2 mg至7.5 mg、或3 mg至7.5 mg、或每公斤體重0.1至20、或0.5至5 mg(例如0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 mg/kg)、或10至1500或200至1500 mg之固定劑量。在一些方法中，該病患係經投予至少1.5 mg/kg、至少2 mg/kg或至少3 mg/kg之劑量，每三週投予一次或更高之劑量。該劑量取決於投予頻率、病患狀態、對先前治療之反應(若有的話)、預防性或治療性之治療、或急性或慢性之疾病等其他因素。

投予可為非經腸、經靜脈、經口、皮下、動脈內、顱內、脊椎鞘內、腹膜內、局部、鼻內或肌肉內。投予亦可被直接集中至腫瘤內。藉由靜脈內或皮下投予至系統性循環內係為較佳。靜脈內投予可藉由例如在諸如30至90分鐘期間輸注或藉由單次快速濃注。

投予頻率取決於抗體或共軛物於循環中之半衰期、病患之狀況及投予途徑等其他因素。該頻率可為每天、每週、每月、每季或因應病患狀況之改變或該被治療之癌的進展而在不規則之間隔投予。示範性靜脈投予之頻率係在一連續治療療程中介於每週二次至每季一次，雖然更高或更低頻率之投藥亦為可能。其他示範性靜脈投予之頻率係在一連續治療療程中介於每週一次至每四週三次，雖然更 高或更低頻率之投藥亦為可能。以皮下投予而言，示範性投藥頻率係每天至每月一次，雖然更高或更低頻率之投藥亦為可能。

投予之劑量次數取決於該癌之特性(例如是否出現急性或慢性症狀)及疾病對治療之反應。以急性疾病或慢性疾病之急性惡化而言，介於1至10個劑量通常足夠。有時單次快速濃注(可任意選擇地呈分開之形式)係足以用於急性疾病或慢性疾病之急性惡化。治療可重複用於急性疾病或急性惡化之復發。以慢性疾病而言，抗體可於規律之間隔投予，例如每週、隔週、每月、每季、每六個月一次至少1、5或10年或病患終生。

用於非經腸投予之醫藥組成物係較佳地無菌、實質上等滲性且在GMP條件下製造。醫藥組成物可以單位劑量形式提供(即用於單次投予之劑量)。醫藥組成物可利用一或多種生理上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或助劑調製。該調製劑取決於所選擇之投予途徑。以注射而言，抗體可被調製於水性溶液，較佳地生理上可相容之緩衝液，諸如漢氏(Hanks’s)溶液、林格氏(Ringer’s)液或生理鹽水或醋酸緩衝液(以減少注射部位之不適)。該溶液可包含調製劑諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。選擇性地，抗體可呈凍乾形式以供使用前與適當載具例如無致熱原之無菌水組成。抗體於液體調製劑中之濃度可為例如1至100 mg/ml，諸如10 mg/ml。

本發明之抗體治療可與化學療法、放射線、幹細胞治 療、手術及其他能有效對抗該被治療之疾病的治療組合。其他可與抗LIV-1人化抗體一起被投予之劑的有用類別包括例如與癌性細胞上表現之其他受體結合之抗體、抗微管蛋白劑(例如耳抑素)、DNA次要凹槽結合劑、DNA複製抑制劑、烷化劑(例如鉑複合物諸如順鉑(cisplatin)、單(鉑)、二(鉑)及三核鉑複合物及卡鉑(carboplatin))、蒽環類(anthracycline)、抗生素、抗葉酸劑、抗代謝物、化學療法致敏劑、雙聯黴素(duocarmycin)、依扥泊苷(etoposide)、氟化嘧啶、離子載體、萊克西托素(lexitropsin)、亞硝基尿素、普拉汀諾(platinol)、預先形成化合物、嘌呤抗代謝物、嘌呤黴素(puromycin)、放射線致敏劑、類固醇、紫杉烷、拓撲異構酶抑制劑、長春花生物鹼及該類似物。

人化抗LIV-1抗體之治療(可任意選擇地與上述其他劑或配方之任一者單獨組合或作為抗體藥物共軛物)相較於給予該相同治療(例如化學治療)但不單獨組合抗LIV-1抗體或作為共軛物，可增加腫瘤(例如乳癌、前列腺癌、黑色素瘤)病患特別是復發或頑固性病患之無疾病進展中位存活期或整體存活期至少30%或40%，但較佳地50%、60%至70%或甚至100%或更久。此外或選擇性地，包括以單獨或作為共軛物形式之抗LIV-1抗體之治療(例如標準化學治療)相較於不包括該抗LIV-1抗體之相同治療(例如化學治療)，可增加至少30%或40%但較佳地50%、60%至70%或甚至100%之腫瘤病患的完全反應率、部分反應 率、或客觀反應率(完全+部分)。

通常，在臨床試驗中(例如第II、II/III或III期試驗)，前述以標準治療加上抗LIV-1人化抗體治療病患之無疾病進展中位存活期及/或反應率之增加相較於單獨接受標準治療之對照組病患(或加上安慰劑)係具有統計顯著性，例如p=0.05或0.01或甚至0.001。完全及部分反應率係由經常用於癌之臨床試驗中的客觀標準決定，例如由美國國家癌症研究所及/或食品藥物管理局列示或接受之標準。

VIII.其他應用

該抗LIV-1人化抗體可在臨床診斷、臨床治療或研究中被用於檢測LIV-1。在癌中之LIV-1的表現表示該癌係可由本發明之抗體治療。該抗體亦可被販售作為實驗室研究之研究試劑以檢測帶有LIV-1之細胞及彼等對各種刺激之反應。在該等用途中，單株抗體可以螢光分子、自旋標記分子、酶或放射性同位素標示，且可以含有實施LIV-1之試驗所需之所有試劑的套組形式提供。此處所描述之抗體，BR2-14a、BR2-22a及彼等之人化形式(例如hLIV14及hLIV22)可被用於檢測LIV-1蛋白質表現及決定癌是否可利用LIV-1抗體藥物共軛物治療。舉例來說，BR2-14a、BR2-22a及彼等之人化形式(例如hLIV14及hLIV22)可被用於檢測LIV-1在乳癌細胞、黑色素瘤細胞、子宮頸癌細胞或前列腺癌細胞上之表現。該抗體亦可被用於純化LIV-1，例如在親和性層析中。

IX.馬來猴(cynomolgus monkey)LIV-1

本發明另提供源自馬來猴之含有信號肽或不含信號肽之LIV-1的胺基酸序列(CY LIV-1)為SEQ ID NO：85，該信號肽佔據SEQ ID NO：85之大約殘基1至28，以及編碼該胺基酸序列之核酸。本發明亦包括多達1、2、3、4或5個取代、刪除或插入差異之變異體，惟其CY變異體不包括天然人LIV-1序列。與人LIV-1類似的是，提及CY-LIV-1係指該蛋白質之至少一個胞外結構域且通常指不含可切割信號肽(胺基酸1-28)之該完整蛋白質。本發明另提供與SEQ ID NO：85特異性結合之抗體，不論是否與人LIV-1特異性結合(即與人LIV-1以陰性對照不相關抗體之程度結合)。本發明另提供與CY-LIV-1優先結合而不與人LIV-1結合之抗體及反之亦然之抗體。優先結合係指以高於實驗誤差之結合且較佳地至少高出2、3或4倍。本發明另提供與下述示範性抗體之任一者顯示與人及CY LIV-1在實驗誤差內之相同結合特性之抗體。本發明另提供分析抗體與CY LIV-1之結合性的方法。該等方法涉及使抗體與CY LIV-1接觸，測定該抗體是否與CY LIV-1特異性結合，並可任意選擇地測定結合之強度，諸如結合常數。

所有以上或以下所引述之專利申請案、網站、其他公開資料、編號及類似物係以參照方式整體納入此處以符合所有目的，如同每個個別項目係經具體及個別明示而以參照方式納入之相同範圍。若不同版本之序列在不同時間與 一編號相關，此處係指在本申請案之有效申請日與該編號相關之版本。該有效申請日係指較早之提及該編號之優先權之實際申請日或申請日，若有的話。同樣地，若不同版本之公開資料、網站或該類似物係於不同時間出版，此處係指在最近本申請案之有效申請日以前所發表之版本，除非另外說明。本發明之任何特徵、步驟、元件、實施態樣或態樣可與任何其他者組合使用除非特別說明不可如此。雖然本發明已由說明和示例之方式詳加描述以求清晰認識，但顯而易見的是某些改變及修飾可在該隨附之權利要求的範圍內實施。

I. BR2-14a之人化 材料

在下列實施例中描述之細胞系係維持於培養狀態，根據美國菌種保存中心(American Type Culture Collection,ATCC)、美國國家癌症研究所(NCI)或德國布朗斯威克德國微生物菌種保藏中心(DMSZ)所指明之條件。細胞培養試劑係得自英維特基(Invitrogen)公司(加州卡斯巴德市)或其他廠商。

方法 飽和結合試驗

將1×10⁵抗原表現細胞(表現人LIV-1之MCF7細胞(ATCC)、或表現人LIV-1之轉染CHO細胞系、或表現馬 來猴LIV-1之轉染CHO細胞系)等分置於96孔v底孔盤之每孔中。經AlexaFluor-647標示之小鼠LIV-1單株抗體(例如BR2-14a)以自0.66 pM至690 nM之濃度添加，於冰上培養30分鐘。細胞經離心形成團塊，以PBS/BSA清洗三次。該細胞接著再離心形成團塊，以125 μL之PBS/BSA重懸。以流式細胞儀分析螢光，使用飽和螢光信號之百分比以測定結合百分比，接著計算表觀Kd。

競爭結合試驗

將於PBS/BSA中之1×10⁵個表現重組人LIV-1之CHO細胞等分置於冰上之96孔v底孔盤之每孔中。該些細胞係與5 nM之經AlexaFluor-647(AF)標示之小鼠LIV-1母體單株抗體及漸增濃度(自0.038 nM至600 nM)之未經標示之人化LIV-1單株抗體(人化輕鏈LA至LF與人化重鏈HA至HE之組合)培養1小時。細胞經離心形成團塊，以PBS/BSA清洗三次。該細胞再離心形成團塊，以125 μL之PBS/BSA重懸。以流式細胞儀分析螢光，使用飽和螢光信號之百分比測定經結合之標示小鼠LIV-1單株抗體之百分比，接著藉由將該資料帶入不同斜率之S形劑量反應曲線以外插求出EC50。

將於PBS/BSA中之1×10⁵個表現LIV-1之MCF7細胞等分置於冰上之96孔v底孔盤之每孔中。該些細胞係與5 nM之經AlexaFluor-647標示之小鼠LIV-1單株抗體及漸增濃度(自0.038 nM至600 nM)之未經標示之人化LIV-1單株抗體(人化輕鏈LA至LF與人化重鏈HA至HE 之組合)培養1小時。細胞經離心形成團塊，以PBS清洗三次。該細胞再離心形成團塊，以125 μL之PBS/BSA重懸。以流式細胞儀分析螢光，使用飽和螢光信號之百分比測定經結合之標示小鼠LIV-1單株抗體之百分比，接著藉由將該資料帶入不同斜率之S形劑量反應曲線以外插求出EC50。

將於PBS中之1×10⁵個表現重組馬來猴LIV-1之CHO細胞等分置於冰上之96孔v底孔盤之每孔中。該些細胞係與5 nM之經AlexaFluor-647標示之小鼠LIV-1單株抗體及漸增濃度(自0.038 nM至600 nM)之未經標示之人化LIV-1單株抗體(人化輕鏈LA至LF與人化重鏈HA至HE之組合)培養1小時。細胞經離心形成團塊，以PBS清洗三次。該細胞再離心形成團塊，以125 μL之PBS/BSA重懸。以流式細胞儀分析螢光，使用飽和螢光信號之百分比測定經結合之標示小鼠LIV-1單株抗體之百分比，接著藉由將該資料帶入不同斜率之S形劑量反應曲線以外插求出EC50。

定量流式細胞分析

定量測定LIV-1在細胞表面上之表現數，使用小鼠LIV-1單株抗體作為一級抗體，根據廠商(DAKO A/S,Glostrup,Denmark)說明進行DAKO QiFiKit流式細胞間接試驗，並利用Becton Dickinson公司之FACS®can流式細胞儀評估。

細胞毒性試驗

使腫瘤細胞與LIV-1抗體藥物共軛物於37℃中一起培養96至144小時。非結合性(H00)ADC被用來作為陰性對照。細胞存活性係由終濃度50 μM之刃天青(西格瑪(Sigma)公司)測量。細胞係於37℃中培養4至6小時。螢光信號係於Fusion HT螢光孔盤讀取儀(珀金埃爾默(Perkin Elmer)公司，麻州瓦爾珊(Waltham,MA))上測量。結果以IC₅₀報告，此為相較於經載具處理之細胞(對照=100%)要產生存活性減少50%所需之化合物的濃度。

產製抗體藥物共軛物

LIV-1抗體之抗體藥物共軛物之製備係如US20050238649中所述。藥物連接子vcMMAE(亦稱為1006)及mcMMAF(稱為1269)皆於US20050238649中描述。IgG1抗體之半胱胺酸突變物之製備係大致於US20100158919中描述。US20050238649及US20100158919係以參照方式納入此處以符合所有目的。

產製非岩藻糖化之抗LIV-1單株抗體

產製人化IgG1抗LIV-1單株抗體HBLB單株抗體(hLIV-14)之CHO DG44細胞系係以每毫升3.0×10⁵細胞，培養於30 mL之CHO培養基、37℃ 5% CO₂中、以100 RPM搖晃之125 mL振盪培養瓶中。在培養基中添加胰島素樣生長因子(IGF)、青黴素、鏈黴素及65 μM 2-氟基岩藻糖全乙酸酯(SGD-2084)(見US20090317869)。第3天在培養中加入2%體積之餵養培養基。第4天，將該培養物分成1：4至新鮮培養基。在第5、7、9及10天， 用6%體積之產製餵養培養基餵飼該培養物。在第13天藉由使該培養物通過0.2 μm過濾器以收集條件培養基。抗體純化係藉由將該條件培養基施用於經1倍磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)pH 7.4預先平衡之蛋白質A管柱加以實施。

以20倍管柱體積之1X PBS清洗管柱後，用5倍管柱體積之Immunopure IgG洗脫液(皮爾斯生技(Pierce Biotechnology)公司，伊利諾州羅克福市(Rockford,IL))洗脫抗體。添加10%體積之1M Tris pH 8.0至洗脫組分。樣本經隔夜透析至1x PBS中。

抗體依賴性細胞性細胞毒性(ADCC)

ADCC活性係利用標準⁵¹Cr釋放試驗測量。簡言之，MCF-7標靶腫瘤細胞係經100 μCi Na⁵¹CrO₄標示、清洗，並在添加效應(自然殺手(NK))細胞之前與測試抗體預先培養。NK(CD16⁺ CD56⁺)細胞係利用得自正常Fc γ RIIIA 158V/V捐贈者(Lifeblood,Memphis,TN)之非黏附性週邊血液單核細胞(PBMC)，使用免疫磁珠(EasySep,StemCell Technologies,Vancouver,BC,Canada)加以製備。存活之NK細胞以效應細胞對標靶細胞10：1之比例被添加至標靶細胞。人IgG1(Ancell,Bayport,MN)被用來作為此試驗中之陰性對照。在培養4小時後，收集上清液並於Luma板上隔夜乾燥。接著利用TopCount微量盤閃爍發光計數器(Perkin Elmer,Waltham,Massachusetts)檢測自經溶解之MCF-7細胞所發射之伽瑪射線。ADCC活性以特異性溶胞%表示。

活體內活性試驗

裸(nu/nu)小鼠(7至8隻動物/組)係經植入培養生長之腫瘤細胞：來自NCI之MCF-7(5×10⁶細胞於25%基質膠)、來自ATCC之PC3(2.5×10⁶細胞於25%基質膠)及來自DSMZ之PC3(5×10⁵於25%基質膠)。在MCF-7細胞之活體內生長方面，母小鼠亦藉由植入緩釋型雌激素丸(釋放90天)以補充雌激素。當腫瘤生長至100 mm³時，開始投予嵌合性或人化LIV-1 ADC或非結合性之對照ADC(3 mg/kg)(q4d x 4次腹膜內注射)。利用卡尺測量腫瘤體積，當腫瘤體積到達約800 mm³時安樂死動物。持續作圖以了解各組之中位數腫瘤體積，直到一或多隻動物被安樂死。所有動物試驗係根據獲得實驗動物管理評鑑及認證協會認可之機構中的實驗動物照顧及使用委員會所核准之程序實施。

LIV-1免疫組織化學(IHC)染色 方法

腫瘤微陣列(TMA)及個別腫瘤樣本係得自商業來源。源自福馬林固定及石蠟包埋(FFPE)之正常或腫瘤組織的組織微陣列係購自美國Biomax公司或Cybrdi公司。冷凍陣列係購自BioChain公司。單一切片係購自NDRI公司、Asterand公司、Tissue Solution公司或CHTN公司。一組25個轉移荷爾蒙難治型前列腺癌之石蠟包埋樣本(對應之骨及軟組織轉移部位)係由華盛頓大學泌尿生殖系統癌症系之R.Vessella博士提供。所有樣本係於Bond-Max^TM自 動染色機(徠卡(Leica)公司)上處理。

IHC染色FFPE組織：

FFPE切片或固定在玻片上之TMA係於72℃利用Bond^TM Dewax溶液(Leica，產品編號AR9222)去石蠟化及復水化。抗原修復係利用以EDTA為基底之Bond^TM表位修復溶液2(Leica，產品編號AR9640)於95至100℃進行20分鐘，之後與小鼠LIV-1一級單株抗體一起培養(1至2 μg/ml培養30至45分鐘於25℃)。同型匹配之小鼠IgG1(Sigma，產品編號M5284)被用來作為背景染色之陰性對照。在自動化IHC染色方面，我們利用Refine DAB套組或是以鹼性磷酸酶為基底之檢測套組：Bond^TM Polymer AP Red檢測套組(Leica，產品編號DS9305)。玻片與1 μg/ml之抗小鼠LIV-1之小鼠單株一級抗體一起培養45分鐘，且預先經30分鐘之蛋白質封片(DAKO產品編號X0909)。在色原體發色之後，該切片以蘇木精對比染色並覆上蓋玻片。玻片係由病理學家評估及計分，利用Zeiss Axiovert 200M顯微鏡(Carl Zeiss,Inc.,Thornwood,NY)攝像。

冷凍組織之IHC：

5 μm之冷凍/OCT樣本切片係以丙酮固定10分鐘，風乾30分鐘，並於室溫中以1xMorphosave預處理20分鐘。該些切片被裝上Bond-Max^TM自動染色機(Leica)，以一級抗體染色45分鐘，且預先經30分鐘之蛋白質封片(DAKO產品編號X0909)。小鼠IgG1(BD Pharmingen，產 品編號550878)被用來作為陰性對照。在檢測方面，我們使用以DAB為基底之Bond Polymer Refine套組(Leica，產品編號DS9800)。在色原體發色之後，該切片以蘇木精對比染色並覆上蓋玻片。切片係由病理學家評估及計分。

結果 1.小鼠抗體之結合

小鼠LIV-1單株抗體BR2-14a抗體(US2004141983)對人LIV-1之K_D係經測定，該人LIV-1係以內源性蛋白質表現於人乳癌細胞系或以重組蛋白質表現於CHO細胞系。小鼠LIV-1抗體BR2-14a對馬來猴LIV-1之K_D亦經測定，該馬來猴LIV-1係以重組蛋白質表現於CHO細胞系。MCF7係人乳癌細胞系。239F係人胚胎腎細胞系。表1顯示該抗體對人細胞系所表現之非重組LIV-1的解離常數比重組LIV-1(不論為人(hLIV-1)或馬來猴(cyLIV-1))之解離常數低大約5倍。

2.設計及測試人化抗體

在此實施例中用來人化之起始或捐贈者抗體係小鼠抗體BR2-14a，其係由美國菌種保存中心(ATCC)寄存編號 PTA-5705A之雜交瘤產製及描述於US2004141983。適當之人接受體序列係由VH1-02和JH5提供之重鏈及由VK2-30和Jk4提供之輕鏈的基因組序列。該等人接受體序列顯示與該捐贈者序列之可變區架構具有68%及85%一致性。該等人接受體序列之輕鏈CDR係與該捐贈者序列之CDR具有相同典型結構類型。相反地，該人接受體序列之重鏈CDR在彼等之典型結構類型上不同(種系為1-3，相對於小鼠捐贈者之1-2)。

排比捐贈者序列識別出重鏈中的11個位置(H27、H28、H29、H30、H48、H66、H67、H71、H76、H93及H94)及輕鏈中的5個位置(L36、L37、L45、L46及L39)是該人接受體序列與該捐贈者序列之間不同者，此可能因為直接與抗原接觸、影響CDR之構形或影響重鏈與輕鏈之間的包裝而改變抗體之結合。五個人化重鏈及六個人化輕鏈係經製備，彼等納入這些位置之不同排列組合的回復突變(圖1(序列排比)及表2)。

人化抗體接著被表現以代表這些人化重鏈及輕鏈的各種排列組合(30種可能性)。自CHO細胞所表現之重組人LIV-1的結合曲線係顯示於圖2。EC50之結果摘列於下表3。

表3源自BR2-14a的人化LIV-1單株抗體對CHO細胞上所表現之人LIV-1的EC₅₀

這些資料顯示這30個測試之人化抗體具有差異極大之EC50，其中HBLB及HELE之結合性優於次佳之人化抗體HBLF至少二倍且高出其他人化抗體更多倍。圖2之結合曲線顯示HBLB及HELE具有比原始小鼠抗體更強之結合。

該HBLB抗體被選為最佳之人化抗體，因為其具有(和HELE一樣)最強之結合，但其回復突變比HELE還少，即HBLB有四個回復突變而HELE有十二個。

該些與CHO細胞上表現之人LIV-1結合之人化LIV-1單株抗體對MCF7細胞系上所表現之天然人LIV-1蛋白質的EC50係經測定(圖3)。同樣地，LIV-1單株抗體HBLB及HELE係具有最強結合之單株抗體。

HBLB對MCF7細胞系上之人LIV-1的Kd係自數個飽和結合曲線之平均值得出為1.5 nM，然而小鼠抗體之該值為2.9 nM。換言之，該HBLB抗體對天然人LIV-1之親和性係為該小鼠抗體之約二倍。圖4顯示之飽和結合曲線係一代表性實例。

比較二種形式之HBLB對CHO細胞所重組表現之人LIV-1的結合。一種形式係表現為具有野生型人IgG1及κ恆定區。另一種形式相同，除了在IgG1重鏈中有S239C突變(EU編號)(被稱為LIV-14d或HBLB S239C)，其減少該抗體與Fc γ受體之結合。這些抗體與小鼠捐贈者抗體比較之結合曲線及EC50係顯示於圖5。二種形式之HBLB的EC50彼此類似(在試驗誤差範圍內)，二者皆 強過該小鼠抗體。

人化LIV-1單株抗體HBLB及HBLB S239C對馬來猴LIV-1之EC50亦經測定，該馬來猴LIV-1係以重組蛋白質表現於CHO細胞系。二種抗體之結合親和性相同(優於小鼠LIV-1 mAb)。

LIV-1之表現資料

小鼠LIV-1單株抗體(至少2種以求一致性)被用於免疫組織化學試驗以分析福馬林固定石蠟包埋組織之各種腫瘤類型。

我們發現在使用組織微陣列之試驗中觀察到比起大組 織切片較低之LIV-1 IHC陽性。此表現差異具有高度顯著性，顯示在較大組織切片中分析LIV-1表現係為較佳。使用至少2種不同的抗LIV-1單株抗體顯示良好之表現一致性。圖6及7顯示在荷爾蒙(它莫西芬(tamoxifen)或芳香酶抑制劑)治療後之乳癌及前列腺腫瘤中之高量LIV-1表現，此提供使用LIV-1 ADC標靶這些腫瘤之有力理論基礎。圖8顯示在三重陰性(ER-、PgR-、Her2-)乳癌組織中可檢測之LIV-1表現。在三重陰性乳癌中由免疫組織化學染色所檢測之LIV-1表現量係與PC3動物模型中之量可相比，其中我們證實LIV-1 ADC之抗腫瘤活性。因此三重陰性乳癌係可能的目標族群，特別是被發現有表現LIV-1之三重陰性乳癌。

hLIV-14單株抗體作為ADC及效應功能增強性單株抗體(SEA)之活體外抗腫瘤活性

LIV-1 ADC於活體外之抗腫瘤活性係利用細胞毒性試驗(圖9)及抗體依賴性細胞性細胞毒性試驗(ADCC)(圖10及11)測量。首先，藉由定量性FACS分析測定各種細胞系中之LIV-1表現。來自ATCC之乳癌細胞系MCF-7相較於來自其他來源之MCF-7細胞系具有最高量之LIV-1結合部位/細胞(資料未顯示)。因此我們使用此細胞系進行這兩種活體外試驗。參見圖9，各種hLIV-14 ADC(HBLB抗體與vcMMAE共軛(稱為1006)或與mcMMAF共軛(稱為1269)(二者皆為在US20050238649中描述之小分子及/或 連接子))皆能高度有效地殺滅MCF-7細胞，相較於非結合性及小鼠對照共軛物(mIgG-1006、mIgG-1269、hIgG-1006及hIgG-1269)。此外，每抗體具有平均二個藥物連接子之半胱胺酸突變LIV-14d ADC亦能高度有效地在細胞毒性試驗中殺滅MCF-7細胞。參見圖10及11，在ADCC試驗中比較該岩藻糖化/野生型(WT)單株抗體及ADC與該效應功能增強版本(非岩藻糖化單株抗體及ADC，稱為SEA)之活性。結果顯示效應功能增強版本之LIV-1單株抗體及ADC對MCF-7細胞相較於非效應功能增強版本之單株抗體或ADC具有良好之ADCC活性(例如比較圖10之hLIV-1 SEA vcMMAE與hLIV-1 vcMMAE)。再參照圖9，效應功能增強之LIV-1 ADC(以SEA表示)亦和野生型(非岩藻糖化)ADC具有類似之細胞毒性活性(比較hLIV-1 SEA 1006(vcMMAE)與hLIV-1 1006(vcMMAE))。因此細胞毒性可受到效應功能及共軛作用二者之影響。

hLIV-14 ADC之活體內抗腫瘤活性

利用乳癌(MCF-7)及前列腺癌(PC-3)模型，我們測定LIV-1 ADC(嵌合性及人化(HBLB)單株抗體，平均每抗體具有4個藥物)於活體內之抗腫瘤活性(圖12至15)。與vcMMAE共軛之LIV-1 ADC相較於未處理及對照ADC顯示顯著之腫瘤延緩。在所有試驗中，使用3 mg/kg之LIV-1-vcMMAE造成至少一例完全緩解(CR)，其中許多動物之腫瘤相較於對照組靜止或生長緩慢。參照圖12，與 vcMMAE共軛之嵌合形式之母體小鼠抗體導致7隻小鼠中的3隻完全緩解。參照圖13，該相同之嵌合性ADC在8隻小鼠中的1隻產生完全緩解。參照圖14，與vcMMAE共軛之人化ADC(HBLB)(hLIV-14-vcMMAE(4))在8隻小鼠中的1隻產生完全緩解。此外，在HBLB抗體之半胱胺酸突變形式中vcMMAE藥物連接子與各重鏈之位置239共軛以產生每抗體有2個藥物連接子之平均藥物裝載之共軛物(命名為hLIV-14d-vcMMAE(2))，其展現與裝載4個藥物形式類似之活性。參照圖15，與vcMMAE共軛之人化ADC(HBLB)(hLIV-14-vcMMAE(4))在前列腺癌模型之8隻小鼠中的1隻產生完全緩解。相反地，該裝載二個藥物之半胱胺酸突變體的活性在此模型中並不顯著(比較hLIV-14-vcMMAE(4)與hLIV-14d-vcMMAE(2)，及hLIV-14-mcMMAF(4)與hLIV-14d-mcMMAF(2))。總結來說，這些試驗顯示LIV-1 ADC可停止或延緩LIV-1表現性癌之生長，包括乳癌及前列腺癌

II. BR2-22a之人化

BR2-22a(有時亦被稱為mAb2)係同型IgG1 κ之小鼠單株抗體。

方法

除非在以下另外說明，上述用於人化及測試BR2-14a之方法亦適用於BR2-22。

飽和結合試驗

將1×10⁵抗原表現細胞(表現人LIV-1之MCF7細胞、293細胞、或表現人LIV-1之轉染CHO細胞系、或表現馬來猴LIV-1之轉染CHO細胞系)等分置於96孔v底孔盤之每孔中。經AlexaFluor-647標示之小鼠BR2-22a以自0.66 pM至690 nM之濃度添加，於冰上培養30分鐘。細胞經離心形成團塊，以PBS/BSA清洗三次。該細胞接著再離心形成團塊，以125 μL之PBS/BSA重懸。以流式細胞儀分析螢光，使用飽和螢光信號之百分比以測定結合百分比，接著計算表觀Kd。

競爭結合試驗

將於PBS中之1×10⁵個表現重組LIV-1之CHO細胞等分置於冰上之96孔v底孔盤之每孔中。該些細胞係與5 nM之經AlexaFluor-647(AF)標示之母體BR2-22a及漸增濃度(自0.038 nM至600 nM)之未經標示之人化BR2-22a抗體(所有人化輕鏈LA至LG與人化重鏈HA至HG之組合)培養1小時。細胞經離心形成團塊，以PBS清洗三次。該細胞接著再離心形成團塊，以125 μL之PBS/BSA重懸。以流式細胞儀分析螢光，使用飽和螢光信號之百分比測定經結合之標示人化BR2-22a抗體之百分比，接著藉由將該資料帶入不同斜率之S形劑量反應曲線以外插求出EC50。

活體內活性試驗

裸(nu/nu)小鼠(7至8隻動物/組)係經植入培養生長之 腫瘤細胞：來自NCI之MCF-7(5×10⁶細胞於25%基質膠)、來自ATCC之PC3(2.5×10⁶細胞於25%基質膠)及來自DSMZ之PC3(5×10⁵於25%基質膠)。在MCF-7細胞之活體內生長方面，母小鼠亦藉由植入緩釋型雌激素丸(釋放90天)以補充雌激素。當腫瘤生長至100 mm³時，開始投予嵌合性或人化LIV-1 ADC或非結合性之對照ADC(3 mg/kg)(q4d x 4次腹膜內注射)。利用卡尺測量腫瘤體積，當腫瘤體積到達約800 mm³時安樂死動物。持續作圖以了解各組之中位數腫瘤體積，直到一或多隻動物被安樂死。所有動物試驗係根據獲得實驗動物管理評鑑及認證協會認可之機構中的實驗動物照顧及使用委員會所核准之程序實施。

結果概述及討論 飽和結合

BR2-22a與BR2-14a顯示在成熟重鏈可變區具有94%一致性，在成熟輕鏈可變區具有91%一致性。小鼠Liv1抗體BR2-22a對人LIV-1之KD(表5)係經測定，該人LIV-1係以內源性蛋白質表現於人乳癌細胞系、293F細胞或以重組蛋白質表現於CHO細胞系。BR2-22a對馬來猴LIV-1之KD亦經測定，該馬來猴LIV-1係以重組蛋白質表現於CHO細胞系。

人化策略

該BR2-22a抗體係利用VH1-02 JH5種系接受體序列人化重鏈及VK2-30 JK4接受體序列人化輕鏈。這些接受體序列係根據彼等與BR2-22A重鏈及輕鏈之成熟可變區架構具有最高之序列一致性而選擇。初期建構五種變異體重鏈。各變異體重鏈包括源自BR2-22a之重鏈的三個卡巴CDR，這些鏈之差異在於具有自零(VA)至11個(VE)回復突變。初期建構六種變異體輕鏈。各變異體輕鏈包括源自BR2-22a之輕鏈的三個卡巴CDR及自零(LA)至四個回復突變(LF)。這些回復突變是根據BR2-22A抗體之模型被選擇以識別有可能與抗原直接交互作用、影響CDR構形或影響重鏈與輕鏈之間的介面之位置，並根據先前人化BR2-14a之經驗因為BR2-14a與BR2-22a之間具有高度序列一致性。事實上，在BR2-14a及BR2-22a中相同的11個重鏈位置及相同的4個輕鏈位置被考慮進行回復突變(BR2-22a中之L39不被考慮因為該小鼠殘基係與該人殘基相同)。下表6及7中顯示存在於人化BR2-22a之各變異體中的回復突變。

各變異體之成熟可變區的全長序列係顯示於圖16A及16B。

這五個重鏈及六個輕鏈之所有排列組合接著於競爭試驗中相較於BR2-22a被測試(見圖17)。意外地的是，雖然在BR2-14a抗體之經驗中，相對於該小鼠抗體增強之結合 僅得自4個回復突變，額外之回復突變並不一定增進結合親和性，但對於BR2-22a而言，唯一顯示結合親和性大約等於BR2-22a之人化鏈的組合係具有15個回復突變之HELF。其他排列組合顯示與LIV-1不良或無顯著結合性。該些不同的排列組合之EC50係顯示於下表8。

DNB表示無結合

雖然HELF顯示滿意之結合，但該抗體包含總共15個回復突變，就可能的免疫原性而言此數量大於理想數量。因此，HE及LF鏈被系統性地改變以測試移除個別回復突變之影響。圖18顯示該些測試之變異體。LF-1至LF-4各缺少一個存在於LF中之不同的回復突變而與LF不同。類似地，HE-1至HE-11各缺少一個存在於HE中之回復突變。圖19比較LF-1至LF-4(各與HE配對)。圖19顯示LF-2及LF-3相較於LF(在圖中以HELF歷史對照表示)失去實質結合親和性，然而LF-1及LF-4則否。因此結論是回復突變L36及L46實質上對保留結合親和性有所貢獻，而位置L37及L45之回復突變則可被放棄而不顯著影響結合性。圖20顯示HE變異體之類似結合曲線。圖20顯示HE-11失去大部分之結合，表示在位置H94之回復突變對於該些測試之回復突變的結合親和性有最大影響。喪失位置H27、H29及H30之回復突變亦造成親和性之顯著喪失。H30之角色可被該小鼠殘基係體突變之結果的解釋合理化。失去位置H76之回復突變造成一些親和性之喪失。其他在位置H28、H48、H66、H67、H71及H93之回復突變可被放棄而很少或不會影響結合親和性。

由這些實驗之結果，我們建構重鏈HF及HG與輕鏈LG。HF包括H27、H29、H30及H94之回復突變，HG包括這些突變及H76之回復突變。LG包含L36及L46之回 復突變。 一些HF、HG、LE及LF之排列組合係如圖21所示經競爭結合測試，所有皆顯示在小鼠BR2-22a三倍內之結合性。

由此試驗的結果，選擇HGLG以作為結合親和性與最少回復突變之最佳組合以供進一步測試。此抗體以下稱為hLIV22。hLIV22對CHO細胞所表現之人及馬來猴LIV-1的飽和結合親和性係顯示於圖22，並與hLIV14比較。圖22顯示hLIV22對人LIV-1之親和性(解離常數之倒數)約為hLIV14之四倍。另外，hLIV22對人LIV-1之親和性係在實驗誤差內和彼對馬來猴LIV-1之親和性相同，然而hLIV14對人LIV-1之親和性係彼對馬來猴LIV-1親和性之二倍。hLIV22對人LIV-1之親和性係在實驗誤差內和該母體小鼠抗體BR2-22a對人LIV-1之親和性相同。

hLIV22 ADC之活體外抗腫瘤活性

hLIV22 ADC之活體外抗腫瘤活性係利用細胞毒性試驗測量。首先，藉由定量性FACS分析測定各種細胞系中之LIV-1表現。來自ATCC之乳癌細胞系MCF-7相較於來自其他來源之MCF-7細胞系具有最高量之LIV-1結合部位/細胞(資料未顯示)。因此我們使用此細胞系進行活體外試驗。我們在活體外細胞毒性試驗中觀察到不同的hLIV22 ADC(與vcMMAE共軛(稱為1006)或與mcMMAF共軛(稱為1269)(二者皆為US 2005-0238649中描述之小分子))皆能高度有效地殺滅MCF-7細胞。圖23及24比較 1006或1269共軛之hLIV22與1006或1269共軛之非結合性對照抗體。

LIV-1 ADC之活體內抗腫瘤活性

利用如圖25及26所示之前列腺癌(PC-3)及乳癌(MCF-7)模型，我們測定hLIV22 ADC(每抗體平均4個藥物)於活體內之抗腫瘤活性。與vcMMAE共軛之hLIV22 ADC相較於未處理及對照ADC顯示顯著之腫瘤延緩。我們在MCF-7試驗中觀察到使用3 mg/kg之hLIV22-vcMMAE造成多例完全緩解。此外，在所有試驗中，有許多動物的腫瘤相較於對照組呈現靜止或生長緩慢。這些試驗顯示hLIV22 ADC可停止或延緩LIV-1表現性癌之生長，包括乳癌及前列腺癌。圖27比較hLIV22及hLIV14 ADC於MCF-7模型中之活性。雖然二種抗體皆有效，但hLIV22稍微更有效。hLIV22 ADC亦於子宮頸癌模型中測試。海拉(HeLa)細胞異種移植模型被用於該試驗。在腫瘤生長至適當大小後，與vcMMAE共軛之hLIV22以3 mg/kg及1 mg/kg被投予至動物。對照抗體共軛物係以3 mg/kg投予。完全及部分緩解係於接受3 mg/kg hLIV22 vc MMAE共軛物之動物中觀察到。(資料未顯示。)因此，LIV-1抗體及抗體藥物共軛物可被用於治療LIV-1表現性子宮頸癌。

III.使用抗LIV-1抗體治療皮膚癌 LIV-1蛋白質在黑色素瘤腫瘤樣本上之表現

源自病患之黑色素瘤樣本係利用IHC染色評估LIV-1 表現。FFPE玻片係利用Bond^TM Dewax溶液(Leica，產品編號AR9222)於72℃去石蠟。抗原修復係利用以EDTA為基底之Bond^TM表位修復溶液2(Leica，產品編號AR9640)於100℃進行20分鐘。在IHC染色方面，我們使用以鹼性磷酸酶為基底之檢測套組：Bond^TM Polymer Refine Red檢測套組(Leica，產品編號DS9390)。玻片與1 μg/ml之抗LIV-1之小鼠單株一級抗體(BR2-14a)一起培養45分鐘，且預先經30分鐘之蛋白質封片(DAKO產品編號X0909)。小鼠IgG(Sigma，產品編號M5284)被用來作為陰性對照。在色原體發色之後，該切片以蘇木精對比染色並覆上蓋玻片。切片係由病理學家評估及計分。

結果顯示於圖28。百分之72的受測黑色素瘤病患樣本(21/29)係LIV-1表現陽性。這表示LIV-1抑制劑例如抗LIV-1抗體可被用於治療黑色素瘤。

LIV-1 ADC之活體內抗黑色素瘤活性

裸(nu/nu)鼠(7至8隻動物/組)係經植入於培養中生長之10×10⁶ SK-MEL-5細胞(黑色素瘤衍生性細胞系)。允許腫瘤於活體內生長至100 mm³，利用卡尺測量。投予3 mg/kg之人化LIV-1 ADC，例如hLIV14或hLIV22。藥物共軛物係例如vcMMAE或mcMMAF。對照ADC亦以3 mg/kg被投予至對照動物。ADC係以q4d x 4次腹膜內注射給予。利用卡尺測量腫瘤體積，當腫瘤體積到達約800 mm³時安樂死動物。投予hLIV14 ADC或hLIV22 ADC相較於該些接受對照ADC之動物大幅減少動物體內之腫瘤 生長。

序列表

SEQ ID NO：1<LIV-1 mAb輕鏈前導序列；PRT/1；家鼷鼠(mus musculus)>MKLPVRLLVLMFWIPVSTS

SEQ ID NO：2<LIV-1 mAb重鏈前導序列；PRT/1；家鼷鼠(mus musculus)>MKCSWVIFFLMAVVLGINS

SEQ ID NO：3<替代重鏈前導序列；PRT/1；家鼷鼠(mus musculus)>MAWVWTLLFLMAAAQSAQA

SEQ ID NO：4<輕鏈恆定區；PRT/1；智人(homo sapiens)>TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO：5<CH1-CH3；PRT/1；智人(homo sapiens)>ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO：6<重鏈CH1-CH3(無c端K)；PRT/1；智人(homo sapiens)>ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

SEQ ID NO：7<S239C重鏈CH1-CH3；PRT/1；智人(homo sapiens)>

SEQ ID NO：8<S239C重鏈CH1-CH3(無c端K)；PRT/1；智人(homo sapiens)>

SEQ ID NO：9<hLIV-1 mAb HA；PRT/1；人工>

SEQ ID NO：10<hLIV-1 mAb HB；PRT/1；人工>

SEQ ID NO：11<hLIV-1 mAb HC；PRT/1；人工>

SEQ ID NO：12<hLIV-1 mAb HD；PRT/1；人工>

SEQ ID NO：13<hLIV-1 mAb HE；PRT/1；人工>

SEQ ID NO：14<hLIV-1 mAb LA；PRT/1；人工>

SEQ ID NO：15<hLIV-1 mAb LB；PRT/1；人工>

SEQ ID NO：16<hLIV-1 mAb LC；PRT/1；人工>

SEQ ID NO：17<hLIV-1 mAb LD；PRT/1；人工>

SEQ ID NO：18<hLIV-1 mAb LE；PRT/1；人工>

SEQ ID NO：19<hLIV-1 mAb LF；PRT/1；人工>

DNA序列：SEQ ID NO：20<LIV-1 mAb重鏈前導序列；DNA；家鼷鼠(mus musculus)>atgaaatgcagctgggtcatcttcttcctgatggcagtggttctaggaatcaattca

SEQ ID NO：21<LIV-1 mAb輕鏈前導序列；DNA；家鼷鼠(mus musculus)>atgaagttgcctgttaggctgttggtgctgatgttctggattcctgtttctaccagt

SEQ ID NO：22<替代重鏈前導序列；DNA；家鼷鼠(mus musculus)>atggcttgggtgtggaccttgctattcctgatggcagctgcccaaagtgcccaagca

SEQ ID NO：23<輕鏈恆定區；DNA；家鼷鼠(mus musculus)>acggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt

SEQ ID NO：24<CH1-CH3；DNA；智人(homo sapiens)>gctagcaccaagggcccatctgtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagctgccctgggctgcctggtcaaggactacttccctgaacctgtgacagtgtcctggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaa

SEQ ID NO：25<CH1-CH3(無c端K)；DNA；智人(homo sapiens)>gctagcaccaagggcccatctgtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagctgccctgggctgcctggtcaaggactacttccctgaacctgtgacagtgtcctggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgcc ctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggt

SEQ ID NO：26<S239C CH1-CH3；DNA；人工>gctagcaccaagggcccatctgtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagctgccctgggctgcctggtcaaggactacttccctgaacctgtgacagtgtcctggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtgtgtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaa

SEQ ID NO：27<S239C CH1-CH3(無c端K)；DNA；人工>gctagcaccaagggcccatctgtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagctgccctgggctgcctggtcaaggactacttccctgaacctgtgacagtgtcctggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtgtgtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagccc ccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggt

SEQ ID NO：28<hLIV-1 mAb HA；DNA；人工>caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcacagactactatatgcactgggtgaggcaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggattgatcctgagaatggtgatactgaatatgcccccaccttccagggcagggtcaccatgaccagggacacctccatcagcacagcctacatggagctgagcaggctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtgccagacatgatgctcactatgggacctggtttgcttactggggccaaggaaccctggtcacagtctcctca

SEQ ID NO：29<hLIV-1 mAb HB；DNA；人工>caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccattgaagactactatatgcactgggtgaggcaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggattgatcctgagaatggtgatactgaatatgcccccaccttccagggcagggtcaccatgaccagggacacctccatcaacacagcctacatggagctgagcaggctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtgccagacatgatgctcactatgggacctggtttgcttactggggccaaggaaccctggtcacagtctcctca

SEQ ID NO：30<hLIV-1 mAb HC；DNA；人工>caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcacagactactatatgcactgggtgaggcaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggattgatcctgagaatggtgatactgaatatgcccccaccttccagggcaaggccactatgactgcagacacctccatcagcacagcctacatggagctgagcaggctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtgccagacatgatgctcactatgggacctggtttgcttactggggccaaggaaccctggtcacagtctcctca

SEQ ID NO：31<hLIV-1 mAb HD；DNA；人工>caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggattcaccttcacagactactatatgcactgggtgaggcaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggattgatcctgagaatggtgatactgaatatgcccccaccttccagggcagggtcaccatgaccagggacacctccatcagcacagcctacatggagctgagcaggctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtgccagacatgatgctcactatgggacctggtttgcttactggggccaaggaaccctggtcacagtctcctca

SEQ ID NO：32<hLIV-1 mAb HE；DNA；人工>Caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggattcaacattgaagactactatatgcactgggtgaggcaggcccctggacaagggcttgagtggattggatggattgatcctgagaatggtgatactgaatatgcccccaccttccagggcaaggccactatgactgca gacacctccatcaacacagcctacatggagctgagcaggctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtaatgtccatgatgctcactatgggacctggtttgcttactggggccaaggaaccctggtcacagtctcctca

SEQ ID NO：33<hLIV-1 mAb LA；DNA；人工>gatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcctgtcacccttggacagcctgcctccatctcctgcagatctagtcagagcattataaggaatgatggaaacacctatttggaatggtttcagcagaggccaggccaatctccaaggaggctaatttatagagtttccaacaggttttctggggtcccagacagattctctggcagtgggtcaggcactgatttcacactgaaaatcagcagggtggaggctgaggatgttggggtttattactgctttcaaggttcacatgttccctacacctttggaggagggaccaaggtggagatcaaacgt

SEQ ID NO：34<hLIV-1 mAb LB；DNA；人工>gatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcctgtcacccttggacagcctgcctccatctcctgcagatctagtcagagcattataaggaatgatggaaacacctatttggaatggtaccagcagaggccaggccaatctccaaggaggctaatttatagagtttccaacaggttttctggggtcccagacagattctctggcagtgggtcaggcactgatttcacactgaaaatcagcagggtggaggctgaggatgttggggtttattactgctttcaaggttcacatgttccctacacctttggaggagggaccaaggtggagatcaaacgt

SEQ ID NO：35<hLIV-1 mAb LC；DNA；人工>gatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcctgtcacccttggacagcctgcctccatctcctgcagatctagtcagagcattataaggaatgatggaaacacctatttggaatggtttctgcagaggccaggccaatctccaaggaggctaatttatagagtttccaacaggttttctggggtcccagacagattctctggcagtgggtcaggcactgatttcacactgaaaatcagcagggtggaggctgaggatgttggggtttattactgctttcaaggttcacatgttccctacacctttggaggagggaccaaggtggagatcaaacgt

SEQ ID NO：36<hLIV-1 mAb LD；DNA；人工>gatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcctgtcacccttggacagcctgcctccatctcctgcagatctagtcagagcattataaggaatgatggaaacacctatttggaatggtttcagcagaggccaggccaatctccaaagaggctaatttatagagtttccaacaggttttctggggtcccagacagattctctggcagtgggtcaggcactgatttcacactgaaaatcagcagggtggaggctgaggatgttggggtttattactgctttcaaggttcacatgttccctacacctttggaggagggaccaaggtggagatcaaacgt

SEQ ID NO：37<hLIV-1 mAb LE；DNA；人工>gatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcctgtcacccttggacagcctgcctccatctcctgcagatctagtcagagcattataaggaatgatggaaacacctatttggaatggtttcagcagaggccaggccaatctccaaggctcctaatttatagagtttccaacaggttttctggggtcccagacagattctctggcagtgggtcaggcactgatttcacactgaaaatcagcagggtggaggctgaggatgttggggtttattactgctttcaaggttcacatgttccctacacctttggaggagggaccaaggtggagatcaaacgt

SEQ ID NO：38<hLIV-1 mAb LF；DNA；人工>

SEQ ID NO：39<Liv1 mAb2輕鏈前導序列；PRT/1；家鼷鼠(mus musculus)>MKLPVRLLVLMFWIPVATSS

SEQ ID NO：40<Liv1 mAb2重鏈前導序列；PRT/1；家鼷鼠(mus musculus)>MKCSWVIFFLMAVVIGINS

SEQ ID NO：41<替代重鏈前導序列；PRT/1；家鼷鼠(mus musculus)>MAWVWTLLFLMAAAQSAQA

SEQ ID NO：42<輕鏈恆定區；PRT/1；智人(homo sapiens)>

SEQ ID NO：43<CH1-CH3；PRT/1；智人(homo sapiens)>

SEQ ID NO：44<重鏈CH1-CH3(無c端K)；PRT/1；智人(homo sapiens)>

SEQ ID NO：45<S239C重鏈CH1-CH3；PRT/1；智人(homo sapiens)>

SEQ ID NO：46<S239C重鏈CH1-CH3(無c端K)；PRT/1；智人(homo sapiens)>

SEQ ID NO：47<hLiv1 mAb2 HA；PRT/1；人工>

SEQ ID NO：48<hLiv1 mAb2 HB；PRT/1；人工>

SEQ ID NO：49<hLiv1 mAb2 HC；PRT/1；人工>

SEQ ID NO：50<hLiv1 mAb2 HD；PRT/1；人工>

SEQ ID NO：51<hLiv1 mAb2 HE；PRT/1；人工>

SEQ ID NO：52<hLiv1 mAb2 HF；PRT/1；人工>

SEQ ID NO：53<hLiv1 mAb2 HG；PRT/1；人工>

SEQ ID NO：54<hLiv1 mAb2 LA；PRT/1；人工>

SEQ ID NO：55<hLiv1 mAb2 LB；PRT/1；人工>

SEQ ID NO：56<hLiv1 mAb2 LC；PRT/1；人工>

SEQ ID NO：57<hLiv1 mAb2 LD；PRT/1；人工>

SEQ ID NO：58<hLiv1 mAb2 LE；PRT/1；人工>

SEQ ID NO：59<hLiv1 mAb2 LF；PRT/1；人工>

SEQ ID NO：60<hLiv1 mAb2 LG；PRT/1；人工>

DNA序列：

SEQ ID NO：61<Liv1 mAb2重鏈前導序列；DNA；家鼷鼠(mus musculus)>atgaaatgcagctgggtcatcttcttcctgatggcagtggttataggaatcaattca

SEQ ID NO：62<Liv1 mAb2輕鏈前導序列；DNA；家鼷鼠(mus musculus)>atgaagttgcctgttaggctgttggtgctgatgttctggattcctgctaccagcagt

SEQ ID NO：63<替代重鏈前導序列；DNA；家鼷鼠(mus musculus)>atggcttgggtgtggaccttgctattcctgatggcagctgcccaaagtgcccaagca

SEQ ID NO：64<輕鏈恆定區；DNA；智人(homo sapiens)>

SEQ ID NO：65<CH1-CH3；DNA；智人(homo sapiens)> ccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaa

SEQ ID NO：66<CH1-CH3(無c端K)；DNA；智人(homo sapiens)>gctagcaccaagggcccatctgtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagctgccctgggctgcctggtcaaggactacttccctgaacctgtgacagtgtcctggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggt

SEQ ID NO：67<S239C CH1-CH3；DNA；人工>gctagcaccaagggcccatctgtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagctgccctgggctgcctggtcaaggactacttccctgaacctgtgacagtgtcctggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtgtgtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaa

SEQ ID NO：68<S239C CH1-CH3(無c端K)；DNA；人工>gctagcaccaagggcccatctgtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagctgccctgggctgcctggtcaaggactacttccctgaacctgtgacagtgtcctggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgcc ctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtgtgtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggt

SEQ ID NO：69<hLiv1 mAb2 HA；DNA；人工>caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcacagactactatatgcactgggtgaggcaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggattgatcctgaaaatggtgatactgaatatggcccgaagttccagggcagggtcaccatgaccagggacacctccatcagcacagcctacatggagctgagcaggctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtgccagacataatgctcactacgggacctggtttgcttactggggccaaggaaccctggtcacagtctcctca

SEQ ID NO：70<hLiv1 mAb2 HB；DNA；人工>caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccattgaagactactatatgcactgggtgaggcaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggattgatcctgaaaatggtgatactgaatatggcccgaagttccagggcagggtcaccatgaccagggacacctccatcaacacagcctacatggagctgagcaggctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtgccagacataatgctcactacgggacctggtttgcttactggggccaaggaaccctggtcacagtctcctca

SEQ ID NO：71<hLiv1 mAb2 HC；DNA；人工>caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcacagactactatatgcactgggtgaggcaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggattgatcctgaaaatggtgatactgaatatggcccgaagttccagggcaaggccaccatgaccgcagacacctccatcagcacagcctacatggagctgagcaggctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtgccagacataatgctcactacgggacctggtttgcttactggggccaaggaaccctggtcacagtctcctca

SEQ ID NO：72<hLiv1 mAb2 HD；DNA；人工>Caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggactcaccttcacagactactatatgcactgggtgaggcaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggattgatcctgaaaatggtgatactgaatatggcccgaagttccagggcagggtcaccatgaccagggacacctccatcagcacagcctacatggagctgagcaggctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtactgtccataatgctcactacgggacctggtttgcttactggggccaaggaaccctggtcacagtctcctca

SEQ ID NO：73<hLiv1 mAb2 HE；DNA；人工>caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggactcaacattgaagactactatatgcactgggtgaggcaggcccctggacaagggcttgagtggattggatggattgatcctgaaaatggtgatactgaatatggcccgaagttccagggcaaggccaccatgaccgcagacacctccatcaacacagcctacatggagctgagcaggctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtactgtccataatgctcactacgggacctggtttgcttactggggccaaggaaccctggtcacagtctcctca

SEQ ID NO：74<hLiv1 mAb2 HF；DNA；人工>caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggactcaccattgaagactactatatgcactgggtgaggcaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggattgatcctgaaaatggtgatactgaatatggcccgaagttccagggcagggtcaccatgaccagggacacctccatcagcacagcctacatggagctgagcaggctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtgccgtccataatgctcactacgggacctggtttgcttactggggccaaggaaccctggtcacagtctcctca

SEQ ID NO：75<hLiv1 mAb2 HG；DNA；人工>caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggactcaccattgaagactactatatgcactgggtgaggcaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggattgatcctgaaaatggtgatactgaatatggcccgaagttccagggcagggtcaccatgaccagggacacctccatcaacacagcctacatggagctgagcaggctgagatctgatgacacagctgtgtattactgtgccgtccataatgctcactacgggacctggtttgcttactggggccaaggaaccctggtcacagtctcctca

SEQ ID NO：76<hLiv1 mAb2 LA；DNA；人工>gatgttctggattcctgctaccagcagtgatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcctgtcacccttggacagcctgcctccatctcctgcagatctagtcagagccttttacacagtagtggaaacacctatttagaatggtttcagcagaggccaggccaatctccaaggaggctaatttataaaatttccacccgattttctggggtcccagacagattctctggcagtgggtcaggcactgatttcacactgaaaatcagcagggtggaggctgaggatgttggggtttattactgctttcaaggttcacatgttccctacacctttggaggagggaccaaggtggagatcaaacgtacg

SEQ ID NO：77<hLiv1 mAb2 LB；DNA；人工>gatgttctggattcctgctaccagcagtgatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcctgtcacccttggacagcctgcctccatctcctgcagatctagtcagagccttttacacagtagtggaaacacctatttagaatggtaccagcagaggccaggccaatctccaaggaggctaatttataaaatttccacccgattttctggggtcccagacagattctctggcagtgggtcaggcactgatttcacactgaaaatcagcagggtggaggctgaggatgttggggtttattactgctttcaaggttcacatgttccctacacctttggaggagggaccaaggtggagatcaaacgtacg

SEQ ID NO：78<hLiv1 mAb2 LC；DNA；人工> gatgttctggattcctgctaccagcagtgatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcctgtcacccttggacagcctgcctccatctcctgcagatctagtcagagccttttacacagtagtggaaacacctatttagaatggtttctgcagaggccaggccaatctccaaggaggctaatttataaaatttccacccgattttctggggtcccagacagattctctggcagtgggtcaggcactgatttcacactgaaaatcagcagggtggaggctgaggatgttggggtttattactgctttcaaggttcacatgttccctacacctttggaggagggaccaaggtggagatcaaacgtacg

SEQ ID NO：79<hLiv1 mAb2 LD；DNA；人工>gatgttctggattcctgctaccagcagtgatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcctgtcacccttggacagcctgcctccatctcctgcagatctagtcagagccttttacacagtagtggaaacacctatttagaatggtttcagcagaggccaggccaatctccaaagaggctaatttataaaatttccacccgattttctggggtcccagacagattctctggcagtgggtcaggcactgatttcacactgaaaatcagcagggtggaggctgaggatgttggggtttattactgctttcaaggttcacatgttccctacacctttggaggagggaccaaggtggagatcaaacgtacg

SEQ ID NO：80<hLiv1 mAb2 LE；DNA；人工>gatgttctggattcctgctaccagcagtgatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcctgtcacccttggacagcctgcctccatctcctgcagatctagtcagagccttttacacagtagtggaaacacctatttagaatggtttcagcagaggccaggccaatctccaaggcccctaatttataaaatttccacccgattttctggggtcccagacagattctctggcagtgggtcaggcactgatttcacactgaaaatcagcagggtggaggctgaggatgttggggtttattactgctttcaaggttcacatgttccctacacctttggaggagggaccaaggtggagatcaaacgtacg

SEQ ID NO：81<hLiv1 mAb2 LF；DNA；人工>gatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcctgtcacccttggacagcctgcctccatctcctgcagatctagtcagagccttttacacagtagtggaaacacctatttagaatggtacctgcagaggccaggccaatctccaaagcccctaatttataaaatttccacccgattttctggggtcccagacagattctctggcagtgggtcaggcactgatttcacactgaaaatcagcagggtggaggctgaggatgttggggtttattactgctttcaaggttcacatgttccctacacctttggaggagggaccaaggtggagatcaaacgt

SEQ ID NO：82<hLiv1 BR2-22a LG；DNA；人工>gatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcctgtcacccttggacagcctgcctccatctcctgcagatctagtcagagccttttacacagtagtggaaacacctatttagaatggtaccagcagaggccaggccaatctccaaggcccctaatttataaaatttccacccgattttctggggtcccagacagattctctggcagtgggtcaggcactgatttcacactgaaaatcagcagggtggaggctgaggatgttggggtttattactgctttcaaggttcacatgttccctacacctttggaggagggaccaaggtggagatcaaacgt

SEQ ID NO：83<Q13433；蛋白質MARKLSVILI LTFALSVTNP LHELKAAAFP QTTEKISPNW ESGINVDLAI STRQYHLQQLFYRYGENNSL SVEGFRKLLQ NIGIDKIKRI HIHHDHDHHS DHEHHSDHER HSDHEHHSEH EHHSDHDHHS HHNHAASGKN KRKALCPDHD SDSSGKDPRN SQGKGAHRPE HASGRRNVKDSVSASEVTST VYNTVSEGTH FLETIETPRP GKLFPKDVSS STPPSVTSKS RVSRLAGRKT NESVSEPRKG FMYSRNTNEN PQECFNASKL LTSHGMGIQV PLNATEFNYL CPAIINQIDARSCLIHTSEK KAEIPPKTYS LQIAWVGGFI AISIISFLSL LGVILVPLMN RVFFKFLLSF LVALAVGTLS GDAFLHLLPH SHASHHHSHS HEEPAMEMKR GPLFSHLSSQ NIEESAYFDSTWKGLTALGG LYFMFLVEHV LTLIKQFKDK KKKNQKKPEN DDDVEIKKQL SKYESQLSTN EEKVDTDDRT EGYLRADSQE PSHFDSQQPA VLEEEEVMIA HAHPQEVYNE YVPRGCKNKCHSHFHDTLGQ SDDLIHHHHD YHHILHHHHH QNHHPHSHSQ RYSREELKDA GVATLAWMVI MGDGLHNFSD GLAIGAAFTE GLSSGLSTSV AVFCHELPHE LGDFAVLLKA GMTVKQAVLYNALSAMLAYL GMATGIFIGH YAENVSMWIF ALTAGLFMYV ALVDMVPEML HNDASDHGCS RWGYFFLQNA GMLLGFGIML LISIFEHKIV FRINF

SEQ ID NO：84<AAA96258.2；蛋白質MARKLSVILI LTFALSVTNP LHELKAAAFP QTTEKISPNW ESGINVDLAI STRQYHLQQLFYRYGENNSL SVEGFRKLLQ NIGIDKIKRI HIHHDHDHHS DHEHHSDHER HSDHEHHSDH EHHSDHNHAA SGKNKRKALC PDHDSDSSGK DPRNSQGKGA HRPEHASGRR NVKDSVSASEVTSTVYNTVS EGTHFLETIE TPRPGKLFPK DVSSSTPPSV TSKSRVSRLA GRKTNESVSE PRKGFMYSRN TNENPQECFN ASKLLTSHGM GIQVPLNATE FNYLCPAIIN QIDARSCLIHTSEKKAEIPP KTYSLQIAWV GGFIAISIIS FLSLLGVILV PLMNRVFFKF LLSFLVALAV GTLSGDAFLH LLPHSHASHH HSHSHEEPAM EMKRGPLFSH LSSQNIEESA YFDSTWKGLTALGGLYFMFL VEHVLTLIKQ FKDKKKKNQK KPENDDDVEI KKQLSKYESQ LSTNEEKVDT DDRTEGYLRA DSQEPSHFDS QQPAVLEEEE VMIAHAHPQE VYNEYVPRGC KNKCHSHFHDTLGQSDDLIH HHHDYHHILH HHHHQNHHPH SHSQRYSREE LKDAGVATLA WMVIMGDGLH NFSDGLAIGA AFTEGLSSGL STSVAVFCHE LPHELGDFAV LLKAGMTVKQ AVLYNALSAMLAYLGMATGI FIGHYAENVS MWIFALTAGL FMYVALVDMV PEMLHNDASD HGCSRWGYFF LQNAGMLLGF GIMLLISIFE HKIVFRINF

SEQ ID NO：85>Cyno LIV-1 MARKLSVILILTFTLSVTNPLHELKSAAAFPQTTEKISPNWESGINVDLAITTRQYHLQQLFYRYGENNSLSVEGFRKLLQNIGIDKIKRIHIHHDHDHHSDHEHHSDHEHHSDHEHHSHRNHAASGKNKRKALCPEHDSDSSGKDPRNSQGKGAHRPEHANGRRNVKDSVSTSEVTSTVYNTVSEGTHFLETIETPKLFPKDVSSSTPPSVTEKSLVSRLAGRKTNESMSEPRKGFMYSRNTNENPQECFNASKLLTSHGMGIQVPLNATEFNYLCPAIINQIDARSCLIHTSEKKAEIPPKTYSLQIAWVGGFIAISIISFLSLLGVILVPLMNRVFFKFLLSFLVALAVGTLSGDAFLHLLPHSHASHHHSHSHEEPAMEMKRGPLFSHLSSQNIEESAYFDSTWKGLTALGGLYFMFLVEHVLTLIKQFKDKKKKNQKKPENDDDVEIKKQLSKYESQLSTNEEKVDTDDRTEGYLRADSQEPSHFDSQQPAILEEEEVMIAHAHPQEVYNEYVPRGCKNKCHSHFHDTLGQSDDLIHHHHDYHHILHHHHHQNHHPHSHSQRYSREELKDAGIATLAWMVIMGDGLHNFSDGLAIGAAFTEGLSSGLSTSVAVFCHELPHELGDFAVLLKAGMTVKQAVLYNALSAMLAYLGMATGIFIGHYAENVSMWIFALTAGLFMYVALVDMVPEMLHNDASDHGCSRWGYFFLQNAGMLLGFGIMLLISIFEHKIVFRINF

圖1顯示該母體小鼠mAb(稱為BR2-14a)與該人化LIV-1重鏈可變區(上二圖)及輕鏈可變區(下二圖)之胺基酸序列排比。

圖2顯示該等人化LIV-1 mAb與該母體小鼠抗體(稱為BR2-14a)之結合曲線。

圖3顯示該等人化LIV-1 mAb與該母體小鼠抗體(稱為BR2-14a)之競爭結合試驗之結果。在每個變異體後之括弧內之數字顯示回復突變之次數。

圖4顯示在MCF7細胞上之飽和結合試驗之結果。BR2-14a-AF係指經AF標記之母體小鼠抗體。hLIV-14係指經AF標記之HBLB抗體，此為與LIV-1特異性結合之人化抗體。

圖5顯示在表現重組LIV-1蛋白質之CHO細胞上之競爭結合試驗之結果。BR2-14a係指該母體小鼠抗體。hLIV-14 HBLB WT係指該HBLB抗體。hLIV-14 HBLB S239C係指重鏈各位置之絲胺酸被取代成半胱胺酸之HBLB抗體。

圖6顯示在經荷爾蒙處理後之乳癌病患樣本上之LIV-1蛋白表現之IHC分析。

圖7顯示在荷爾蒙頑固性轉移性前列腺癌病患樣本上之LIV-1蛋白表現之IHC分析。

圖8顯示在三重陰性乳癌病患樣本上之LIV-1蛋白表現 之IHC分析。

圖9顯示hLIV-14抗體藥物共軛物之細胞毒性試驗之結果，即與vcMMAE(1006)或mcMMAF(1269)共軛之HBLB mAb，以及對照小鼠(mIgG)及人(hIgG)抗體之之共軛物。hLIV-14-SEA-1006係指非岩藻糖化形式之與vcMMAE(1006)共軛之HBLB mAb。

圖10顯示在MCF7細胞上使用人NK細胞(捐贈者1；V/V)之活體外ADCC試驗之結果。hLIV-14 WT係指HBLB單株抗體。hLIV-14 SEA係指非岩藻糖化形式之HBLB單株抗體。hLIV-14 mcMMAF係指與mcMMAF共軛之HBLB單株抗體的抗體藥物共軛物。hLIV-14 vcMMAE係指與vcMMAE共軛之HBLB單株抗體的抗體藥物共軛物。hLIV-14 SEA vcMMAE係指非岩藻糖化形式之HBLB mAb-vcMMAE抗體藥物共軛物。

圖11顯示在MCF7細胞上使用人NK細胞(捐贈者2)之活體外ADCC試驗之結果。hLIV-14 WT係指HBLB單株抗體。hLIV-14 SEA係指非岩藻糖化形式之HBLB單株抗體。cLIV-14 SEA係指非岩藻糖化形式之嵌合性母體小鼠抗體。hLIV-14 mcF(4)係指每抗體具有平均4個mcMMAF藥物連接子分子之HBLB單株抗體的抗體藥物共軛物。hLIV-14 vcE(4)係指每抗體具有平均4個vcMMAE藥物連接子分子之HBLB單株抗體的抗體藥物共軛物。hLIV-14 vcE(4)SEA係指非岩藻糖化形式之每抗體具有平均4個vcMMAE藥物連接子分子之HBLB單株抗體- vcMMAE抗體藥物共軛物。hIgG係指對照人IgG。H00-mcF(4)係指每抗體具有平均4個mcMMAF藥物連接子分子之非結合抗體的對照抗體藥物共軛物。H00-vcE(4)係指每抗體具有平均4個vcMMAE藥物連接子分子之非結合抗體的對照抗體藥物共軛物。

圖12顯示異種移植MCF7乳癌細胞系至裸鼠之試驗結果。cLIV-14-mcMMAF(4)係指每抗體具有平均4個mcMMAF藥物連接子分子之嵌合形式之母體小鼠抗體的抗體藥物共軛物。cLIV-14-vcMMAE(4)係指每抗體具有平均4個vcMMAE藥物連接子分子之嵌合形式之母體小鼠抗體的抗體藥物共軛物。H00-mcMMAF(4)係指每抗體具有平均4個mcMMAF藥物連接子分子之非結合對照抗體的抗體藥物共軛物。H00-vcMMAE(4)係指每抗體具有平均4個vcMMAE藥物連接子分子之非結合對照抗體的抗體藥物共軛物。劑量及投予時間係如圖所示。

圖13顯示異種移植PC3前列腺癌細胞系至公裸鼠之試驗結果。cLIV-14-vcMMAE(4)係指每抗體具有平均4個vcMMAE藥物連接子分子之嵌合形式之母體小鼠抗體的抗體藥物共軛物。hBU12-vcMMAE(4)係指每抗體具有平均4個vcMMAE藥物連接子分子之抗CD19抗體的抗體藥物共軛物。劑量及投予時間係如圖所示。

圖14顯示異種移植MCF7乳癌細胞系至裸鼠之試驗結果。hLIV-14-vcMMAE(4)係指每抗體具有平均4個vcMMAE藥物連接子分子之HBLB抗體的抗體藥物共軛 物。hLIV-14d-vcMMAE(2)係指每抗體具有平均2個vcMMAE藥物連接子分子之HBLB抗體的抗體藥物共軛物，該等vcMMAE各共軛連接於每條重鏈之S239C位置。H00-vcMMAE(4)係指每抗體具有平均4個vcMMAE藥物連接子分子之非結合對照抗體的抗體藥物共軛物。劑量及投予時間係如圖所示。

圖15顯示異種移植PC3前列腺癌細胞系至公裸鼠之試驗結果。hLIV-14-vcMMAE(4)係指每抗體具有平均4個vcMMAE藥物連接子分子之HBLB抗體的抗體藥物共軛物。hLIV-14-mcMMAF(4)係指每抗體具有平均4個mcMMAF藥物連接子分子之HBLB抗體的抗體藥物共軛物。hLIV-14d-vcMMAE(2)係指每抗體具有平均2個vcMMAE藥物連接子分子之HBLB抗體的抗體藥物共軛物，該等vcMMAE各共軛連接於每條重鏈之S239C位置。hLIV-14d-mcMMAF(2)係指每抗體具有平均2個mcMMAF藥物連接子分子之HBLB抗體的抗體藥物共軛物，該等mcMMAF各共軛連接於每條重鏈之S239C位置。H00-vcMMAE(4)係指每抗體具有平均4個vcMMAE藥物連接子分子之非結合對照抗體的抗體藥物共軛物。H00-mcMMAF(4)係指每抗體具有平均4個mcMMAF藥物連接子分子之非結合對照抗體的抗體藥物共軛物。劑量及投予時間係如圖所示。

圖16A及16B顯示人化重鏈(圖16A)及輕鏈(圖16B)成熟可變區與小鼠BR2-22a之重鏈及輕鏈成熟可變區的排 比。

圖17顯示源自抗LIV-1小鼠單株抗體BR2-22a之人化重鏈HA至HF與人化輕鏈LA至LF之不同排列組合的競爭結合試驗。在各輕鏈或重鏈中之小鼠回復突變之總數係顯示於括弧中。只有HELF顯示保留足夠之結合性。

圖18顯示HE和LF鏈之系統化差異以測試各回復突變對抗原結合性之貢獻。可能的體細胞超突變之位置係顯示於括弧內。小鼠殘基以畫底線表示。其餘殘基係人種系殘基。

圖19之上圖顯示LF變異體之競爭結合。下圖顯示該經測試之回復突變。小鼠殘基以畫底線表示。其餘殘基係人種系殘基。

圖20之上圖顯示HE變異體之競爭結合。下圖顯示該經測試之回復突變。小鼠殘基以畫底線表示。其餘殘基係人種系殘基。

圖21顯示HE、HF、HG和LF及LG之不同排列組合的競爭結合。

圖22顯示人化LIV14抗體與人化LIV22抗體對CHO細胞所表現之人及馬來猴(cynomolgus)LIV-1的飽和結合。

圖23顯示在處理144小時後，人化LIV22-vcMMAE對MCF-7細胞之細胞毒性活性。h00-1006係對照之藥物共軛抗體。

圖24顯示在處理144小時後，人化LIV22-mcMMAF 對MCF-7細胞之細胞毒性活性。h00-1269係對照之藥物共軛抗體。

圖25顯示hLIV22抗體對母裸鼠之PC3(DSMZ)前列腺癌模型之活性。投藥日係以三角形標示於X軸上。

圖26顯示hLIV22抗體對裸鼠之MCF7(NCI)乳癌腫瘤之活性。

圖27比較hLIV22和hLIV14在如圖26所示之相同模型中之活性。

圖28顯示在黑色素瘤病患樣本上之LIV-1蛋白表現之IHC分析。

<110> 西雅圖遺傳學股份有限公司(Seattle Genetics,Inc.)

<120> 抗LIV-1之人化抗體類及彼等於治療癌症上之用途

<140> TW 100148654

<141> 2011-12-26

<150> US 61/446,990

<151> 2011-02-25

<160> 90

<170> FastSEQ Windows版本4.0

<210> 1

<211> 19

<212> PRT

<213> 家鼷鼠(mus musculus)

<400> 1

<210> 2

<211> 19

<212> PRT

<213> 家鼷鼠(mus musculus)

<400> 2

<210> 3

<211> 19

<212> PRT

<213> 家鼷鼠(mus musculus)

<400> 3

<210> 4

<211> 106

<212> PRT

<213> 智人(homo sapiens)

<400> 4

<210> 5

<211> 330

<212> PRT

<213> 智人(homo sapiens)

<400> 5

<210> 6

<211> 329

<212> PRT

<213> 智人(homo sapiens)

<400> 6

<210> 7

<211> 330

<212> PRT

<213> 智人(homo sapiens)

<400> 7

<210> 8

<211> 329

<212> PRT

<213> 智人(homo sapiens)

<400> 8

<210> 9

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 9

<210> 10

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 10

<210> 11

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 11

<210> 12

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 12

<210> 13

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 13

<210> 14

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 14

<210> 15

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 15

<210> 16

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 16

<210> 17

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 17

<210> 18

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 18

<210> 19

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 19

<210> 20

<211> 57

<212> DNA

<213> 家鼷鼠(mus musculus)

<400> 20

<210> 21

<211> 57

<212> DNA

<213> 家鼷鼠(mus musculus)

<400> 21

<210> 22

<211> 57

<212> DNA

<213> 家鼷鼠(mus musculus)

<400> 22

<210> 23

<211> 318

<212> DNA

<213> 家鼷鼠(mus musculus)

<400> 23

<210> 24

<211> 990

<212> DNA

<213> 智人(homo sapiens)

<400> 24

<210> 25

<211> 987

<212> DNA

<213> 智人(homo sapiens)

<400> 25

<210> 26

<211> 990

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 26

<210> 27

<211> 987

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 27

<210> 28

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 28

<210> 29

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 29

<210> 30

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 30

<210> 31

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 31

<210> 32

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 32

<210> 33

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 33

<210> 34

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 34

<210> 35

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 35

<210> 36

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 36

<210> 37

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 37

<210> 38

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 38

<210> 39

<211> 20

<212> PRT

<213> 家鼷鼠(mus musculus)

<400> 39

<210> 40

<211> 19

<212> PRT

<213> 家鼷鼠(mus musculus)

<400> 40

<210> 41

<211> 19

<212> PRT

<213> 家鼷鼠(mus musculus)

<400> 41

<210> 42

<211> 106

<212> PRT

<213> 智人(homo sapiens)

<400> 42

<210> 43

<211> 330

<212> PRT

<213> 智人(homo sapiens)

<400> 43

<210> 44

<211> 329

<212> PRT

<213> 智人(homo sapiens)

<400> 44

<210> 45

<211> 330

<212> PRT

<213> 智人(homo sapiens)

<400> 45

<210> 46

<211> 329

<212> PRT

<213> 智人(homo sapiens)

<400> 46

<210> 47

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 47

<210> 48

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 48

<210> 49

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 49

<210> 50

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 50

<210> 51

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 51

<210> 52

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 52

<210> 53

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 53

<210> 54

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 54

<210> 55

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 55

<210> 56

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 56

<210> 57

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 57

<210> 58

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 58

<210> 59

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 59

<210> 60

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 60

<210> 61

<211> 57

<212> DNA

<213> 家鼷鼠(mus musculus)

<400> 61

<210> 62

<211> 57

<212> DNA

<213> 家鼷鼠(mus musculus)

<400> 62

<210> 63

<211> 57

<212> DNA

<213> 家鼷鼠(mus musculus)

<400> 63

<210> 64

<211> 324

<212> DNA

<213> 智人(homo sapiens)

<400> 64

<210> 65

<211> 990

<212> DNA

<213> 智人(homo sapiens)

<400> 65

<210> 66

<211> 987

<212> DNA

<213> 智人(homo sapiens)

<400> 66

<210> 67

<211> 990

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 67

<210> 68

<211> 987

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 68

<210> 69

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 69

<210> 70

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 70

<210> 71

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 71

<210> 72

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 72

<210> 73

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 73

<210> 74

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 74

<210> 75

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 75

<210> 76

<211> 370

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 76

<210> 77

<211> 370

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 77

<210> 78

<211> 370

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 78

<210> 79

<211> 370

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 79

<210> 80

<211> 370

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 80

<210> 81

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 81

<210> 82

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 82

<210> 83

<211> 755

<212> PRT

<213> 智人(homo sapiens)

<400> 83

<210> 84

<211> 749

<212> PRT

<213> 智人(homo sapiens)

<400> 84

<210> 85

<211> 741

<212> PRT

<213> 馬來猴(Cynomolgous sp.)

<400> 85

<210> 86

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 86

<210> 87

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 87

<210> 88

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 88

<210> 89

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 89

<210> 90

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 90

Claims (17)

1. 一種人化抗體，其包含成熟重鏈可變區及成熟輕鏈可變區，其中該成熟重鏈可變區具有SEQ ID NO：53之胺基酸序列且該成熟輕鏈可變區具有SEQ ID NO：59或60之胺基酸序列。
2. 如申請專利範圍第1項之人化抗體，其中該成熟重鏈可變區係與重鏈恆定區融合且該成熟輕鏈可變區係與輕鏈恆定區融合。
3. 如申請專利範圍第2項之人化抗體，其中該重鏈恆定區係天然人恆定區之突變形式，該突變形式之天然人恆定區相較於該天然人恆定區具有減少之與Fc γ受體之結合。
4. 如申請專利範圍第2項之人化抗體，其中該重鏈恆定區係IgG1同型。
5. 如申請專利範圍第2項之人化抗體，其中該重鏈恆定區具有包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列且該輕鏈恆定區具有包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列。
6. 如申請專利範圍第2項之人化抗體，其中該重鏈恆定區具有包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列(S239C)且該輕鏈恆定區具有包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列。
7. 如申請專利範圍第1項之人化抗體，其中該成熟重鏈可變區具有SEQ ID NO：53之胺基酸序列，且該成熟輕鏈可變區具有SEQ ID NO：60之胺基酸序列。
8. 如申請專利範圍第7項之人化抗體，其中該抗體係 與細胞毒性劑或細胞靜止劑共軛。
9. 如申請專利範圍第8項之人化抗體，其中該細胞毒性劑係耳抑素。
10. 如申請專利範圍第8項之人化抗體，其中該細胞毒性劑係單甲基耳抑素F(MMAF)。
11. 如申請專利範圍第8項之人化抗體，其中該細胞毒性劑或細胞靜止劑係單甲基耳抑素E(MMAE)。
12. 如申請專利範圍第1項之人化抗體，其與人或馬來猴(cynomolgus monkey)之LIV-1的結合常數係0.5至2×10⁹M^-1。
13. 一種核酸，其編碼如申請專利範圍第1至12項中任一項所定義之成熟重鏈可變區及/或成熟輕鏈可變區。
14. 一種如申請專利範圍第1至12項中任一項之人化抗體於製備供治療癌的藥物之用途。
15. 如申請專利範圍第14項之用途，其中該癌係三陰性乳癌。
16. 如申請專利範圍第14項之用途，其中該癌係乳癌、前列腺癌、子宮頸癌或黑色素瘤。
17. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至12項中任一項之人化抗體。