BR122021020513B1 - Anticorpos humanizados para liv-1 e uso dos mesmos para tratar câncer - Google Patents

Anticorpos humanizados para liv-1 e uso dos mesmos para tratar câncer Download PDF

Info

Publication number
BR122021020513B1
BR122021020513B1 BR122021020513-2A BR122021020513A BR122021020513B1 BR 122021020513 B1 BR122021020513 B1 BR 122021020513B1 BR 122021020513 A BR122021020513 A BR 122021020513A BR 122021020513 B1 BR122021020513 B1 BR 122021020513B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
antibody
liv
humanized
antibodies
binding
Prior art date
Application number
BR122021020513-2A
Other languages
English (en)
Inventor
Maria Leia Smith
Django Sussman
William Arthur
Albina Nesterova
Original Assignee
Seagen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Seagen Inc filed Critical Seagen Inc
Publication of BR122021020513B1 publication Critical patent/BR122021020513B1/pt

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6865—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from skin, nerves or brain cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3053—Skin, nerves, brain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/464—Igs containing CDR-residues from one specie grafted between FR-residues from another
    • C07K16/465—Igs containing CDR-residues from one specie grafted between FR-residues from another with additional modified FR-residues
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

A invenção provê anticorpos humanizados que se ligam especificamente a LIV-1. Os anticorpos são utilizáveis para o tratamento e diagnósticos de vários cânceres, bem como para a detecção de LIV-1.

Description

Dividido do pedido de patente brasileiro BR 11 2013 013781 9, depositado em 6 de dezembro de 2011. REFERÊNCIA CRUZADA PARA PEDIDOS RELACIONADOS
[001] O presente é um pedido não provisório e reivindica o benefício de 61/420,291, depositado em 06 de dezembro de 2010, e 61/446,990, depositado em 25 de fevereiro de 2011, cada incorporado por referência na sua totalidade para todos os fins.
ANTECEDENTES
[002] LIV-1 é um membro da subfamília LZT (Transportadores de zinco LIV1I-ZIP) de proteínas transportadoras de zinco. Taylor et al., Biochim. Biophys. Acta 1611:16-30 (2003). Análise de computador da proteína —LIV-1 revela - um motivo de metaloprotease potencial, ajustando a sequência de consenso para o motivo de sítio de ligação de zinco catalítico da metaloprotease de zinco. mRNA LIV-1 é expressado primariamente em tecido da mama, próstata, glândula pituitária e cerebral.
[003] A proteína LIV-1 também tem sido implicada em certas condições cancerosas, por exemplo, câncer de mama e câncer de próstata. A detecção de LIV-1 está associada com o câncer de mama positivo para o receptor de estrogênio,McClelland et. al., Br. J. Cancer 77:1653-1656 (1998), e o espalhamento metastático desses cânceres para os linfonodos regionais. Manninget al., Eur. J. Cancer 30A:675-678 (1994).
SUMÁRIO DA INVENÇÃO REIVINDICADA
[004] A invenção provê um anticorpo humanizado compreendendo uma região variável de cadeia pesada madura tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:53 com a condição que a posição H27 seja ocupada por L, a posição H29 seja ocupada por I, H30 por E e H94 por V e uma região variável de cadeia leve madura, pelo menos 90% idêntica à SEO ID NO:60 com a condição que a posição L36 seja ocupada por Y e a posição L46 por P. Opcionalmente, o anticorpo humanizado compreende três CDRs de SEQ ID NO:53 e três CDRs de SEQ ID NO0:60. Estas CDRs são apresentadas na Figura 16. Opcionalmente, a posição H76 é ocupada por N. Opcionalmente, o humanizado compreende a região variável de cadeia pesada madura tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:53 e uma região variável de cadeia leve madura, pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:60. Opcionalmente, a região variável de cadeia pesada madura está fusionada com uma região constante de cadeia pesada e a região constante de cadeia leve madura é fusionada à região constante de cadeia leve. Opcionalmente, a região constante de cadeia pesada é uma forma mutante de região constante humana natural, que tem uma ligação reduzida para um receptor Fcgama com relação à região constante humana natural. Opcionalmente, região constante de cadeia pesada é do isotipo IgG1. Opcionalmente, a região constante de cadeia pesada tem uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID N0:44 e a região constante de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO:42. Opcionalmente, a região constante de cadeia pesada tem uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO:46 (S239C) e a região constante de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO:42. Em alguns de tais anticorpos humanizados, quaisquer diferenças nas CDRs da região variável de cadeia pesada madura e da região variável de cadeia leve madura SEQ ID NOS. 52 e 60 residem respectivamente nas posições H60-H65. Em alguns de tais anticorpos humanizados, a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos designada SEQ ID NO0:52 ou 53 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos designada SEQ ID NO: 59 ou 60. Em alguns de tais anticorpos humanizados, a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos designada SEQ ID NO:53 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos designada SEQ ID NO:60. Alguns desses anticorpos humanizados são conjugados com um agente citotóxico ou citostático. Alguns desses anticorpos humanizados tem uma constante de associação para LIV-1 humano ou macaco cinomolgo de 0,5 a 2 x 109 M-1.
[005] A invenção também provê um anticorpo humanizado compreendendo uma região variável de cadeia pesada madura compreendendo as três CDRs de Kabat de SEQ ID NO:52, onde posição H27 é ocupada por L, posição H29 é ocupada por I, H30 por E, H76 por N, e H94 por V e uma região variável de cadeia leve madura compreendendo as três CDRs de Kabat de SEQ ID NO :60 com a condição que a posição L36 é ocupada por Y e posição L46 por P. A invenção também provê um ácido nucleico codificando a região variável de cadeia pesada madura e/ou a região variável de cadeia leve madura de qualquer um dos anticorpos humanizados acima definidos.
[006] A invenção ainda provê método de tratar um paciente tendo, ou em risco de câncer, compreendendo a administração ao paciente um regime eficaz de qualquer um dos anticorpos humanizados acima definidos. O câncer pode ser, por exemplo, um câncer de mama, câncer cervical, melanoma, ou um câncer de próstata.
[007] A invenção provê ainda uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo humanizado como acima definido.
[008] A invenção provê ainda métodos de tratamento de um indivíduo afligido com um melanoma que expressa a proteína LIV-1 através da administração ao indivíduo de um anticorpo específico para LIV-1 ou um conjugado anticorpo LIV-1 fármaco, em uma quantidade suficiente para inibir o crescimento das células de câncer melanoma.
[009] A invenção ainda provê métodos de tratamento de um indivíduo afetado com um câncer cervical que expressada uma proteína LIV-1 através da administração ao indivíduo de um anticorpo específico para LIV-1 ou um conjugado anticorpo LIV-1 fármaco, em uma quantidade suficiente para inibir o crescimento das células de câncer cervical.
[010] A invenção ainda provê um anticorpo humanizado compreendendo uma região variável de cadeia pesada madura tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a HB (SEQ ID NO:10) e uma região variável de cadeia leve madura, pelo menos 90% idêntica a LB (SEQ ID NO:15). Opcionalmente, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada madura tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 95% idêntica a HB e uma região variável de cadeia leve madura, pelo menos 95% idêntica a LB. Opcionalmente, em tais anticorpos, as posições H29, H30 e H76 são ocupadas por I, E e N, e L36 é ocupada por Y. Opcionalmente, qualquer diferença nos arcabouços da região variável da região variável de cadeia pesada madura e SEQ ID NO:10 é/são selecionada(s) dentre o grupo consistindo de H27 ocupado por F, H28 ocupado por N, H48 ocupado por I, H66 ocupado por K, H67 ocupado por A, H71 ocupado por A, H76 ocupado por N, H93 ocupado por N, H94 ocupado por V, L37 ocupado por L, L39 ocupado por K, L45 ocupado por K, e L46 ocupado por L.Opcionalmente, as 3 CDRs da região variável de cadeia pesada madura são aquelas de SEQ ID NO. 10 e as 3 CDRSs da região variável de cadeia leve madura são aquelas de SEQ ID NO:15. As CDRs são apresentadas na Figura 1. Opcionalmente, a região variável de cadeia pesada madura está fusionada a uma região constante de cadeia pesada e a região constante de cadeia leve madura está fusionada a uma região constante de cadeia leve. Opcionalmente, a região constante de cadeia pesada é uma forma mutante de região constante humana natural, que tem uma ligação reduzida para um receptor Fcgama com relação à região constante humana natural. Opcionalmente, a região constante de cadeia pesada é do isotipo IgG1. Opcionalmente, a região constante de cadeia pesada tem uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO:6 e a região constante de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO:4. Opcionalmente, a região constante de cadeia pesada tem uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO:8 (S239C) e a região constante de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO:4, Opcionalmente, quaisquer diferenças nas CDRS da região variável de cadeia pesada madura e região variável de cadeia leve madura SEQ ID NOS. 10 e 15 residem respectivamente nas posições H60-H65. Opcionalmente, a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO:10 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO:15. Opcionalmente, o anticorpo é conjugado com um agente citotóxico ou citostático. Os anticorpos humanizados preferidos têm maior afinidade para LIV-1 do que o anticorpo BR2-14a. Em outra forma de realização, o anticorpo humanizado tem uma constante de associação para LIV-1 humano ou macaco cinomolgo de 0,5 a 2 x 109 M-1.
[011] A invenção ainda provê um anticorpo humanizado compreendendo a região variável de cadeia pesada madura compreendendo as 3 CDRs de SEQ ID NO:10 e em que as posições H29, H30 e H76 são ocupadas pelos I, E e N respectivamente, e a região variável de cadeia leve madura compreendendo as 3 CDRs de SEQ ID NO:15, e em que posição L36 é ocupada por Y.
[012] A invenção ainda provê um ácido nucleico codificando a região variável de cadeia pesada madura e/ou a região variável de cadeia leve madura de qualquer um dos anticorpos humanizados acima descritos.
[013] A invenção ainda provê um método de tratar um paciente tendo, ou em risco de câncer, compreendendo a administração ao paciente de um regime eficaz de um anticorpo humanizado, como acima descrito. Opcionalmente, o câncer é câncer de mama, câncer cervical, melanoma, ou um câncer de próstata.
[014] A invenção ainda provê uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo humanizado, como acima descrito.
[015] A invenção ainda provê um método de tratamento de um paciente tendo ou em risco de câncer de mama triplo- negativo, compreendendo a administração ao paciente de um regime eficaz de um anticorpo que se liga especificamente a LIV-1. Opcionalmente, em tais métodos, o anticorpo é conjugado a um agente citotóxico ou citostático.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[016] Figura 1 mostra um alinhamento das sequências de. aminoácidos do mAb murino parental (referido como BR2-14a) com as regiões pesada LIV-1 humanizado (dois painéis superiores) e variável de cadeia leve (dois painéis inferiores).
[017] Figura 2 mostra as curvas de ligação para LIV-1 mAbs humanizado e o anticorpo murino parental (referido como BR2-14a).
[018] Figura 3 mostra os resultados de estudos de ligação de competição de LIV-1 mAbs humanizado e o anticorpo murinho parental (referido como BR2-14a). Os números entre parêntesis depois de cada variante indicam o número de retromutações.
[019] Figura 4 mostra os resultados dos estudos de ligação de saturação nas células MCF7. BR2-14a-AF refere-se a anticorpo murino parental rotulado com AF. hLIV-14 refere- se a anticorpo HBLB rotulado com AF, um anticorpo humanizado que se liga especificamente a LIV-1.
[020] Figura 5 mostra os resultados de estudos de ligação de competição em células CHO expressando uma proteína LIV-1 recombinante. BR2-14a refere-se ao anticorpo murino parental nLIV-14 HBLB WT refere-se ao anticorpo HBLB. hLIV-14 HBLB S239C refere-se ao anticorpo HBLB tendo substituições de serina para cisteína em cada posição na cadeia pesada.
[021] Figura 6 mostra uma análise da expressão da proteína LIV-1 por IHC nas amostras de pacientes de câncer de mama pós-tratados com hormônios.
[022] Figura 7 apresenta uma análise da expressão da proteína LIV-1 por IHC metastáticos em amostras de pacientes com câncer de próstata hormônio-refratário.
[023] Figura 8 apresenta uma análise da expressão da proteína LIV-1 por IHC em amostras de pacientes de câncer de mama triplo-negativo.
[024] Figura 9 mostra os resultados de ensaios de citotoxicidade em conjugados anticorpo hLIV-14 fármaco, isto é, o mAb HBLB conjugado com vcMMAE (1006) ou mcMMAF (1269), bem como conjugados de anticorpos de controle murino (mIgG) e humano (hIgG). hLIV-14-SEA-1006 refere-se a uma forma não- fucosilada do mAb HBLB conjugado com vcMMAE (1006).
[025] Figura 10 mostra os resultados de um ensaio ADCC in vitro em células MCF-7, usando células NK humanas (doador 1; V/V). hLIV-14 WT refere-se a HBLB mAb. hLIV-14 SEA refere- se a forma não fucosilada do HBLB mAb. hLIV-14 mcMMAF refere- se a um conjugado anticorpo fármaco do HBLB mAbL conjugado com mcMMAF. NhLIV-14 vcMMAE refere-se a um conjugado anticorpo fármaco do HBLB mAb conjugado com vcMMAE. NLIV-14 SEA vcMMAE refere-se a uma forma não-fucosilada do conjugado anticorpo fármaco HBLB mAb-vcMMAE.
[026] Figura 11 mostra os resultados de um ensaio ADCC in vitro em células MCF-7, usando células NK humanas (doador 2). hLIV-14 WT refere-se ao HBLB mAb. hLIV-14 SEA refere-se a forma não fucosilada do HBLB mAb. CLIV-14 SEA refere-se a forma não fucosilada do anticorpo quimérico murino parental. hLIV-14 mcF(4) refere-se a um conjugado anticorpo fármaco de HBLB mAb com uma média de 4 moléculas de ligador de fármaco mCMMAF por anticorpo. hLIV-14 vcE(4) refere-se a um conjugado anticorpo fármaco do HBLB mAb com uma média de 4 moléculas de ligador de fármaco vcMMAE por anticorpo. hLIV-14 vcE(4) SEA refere-se a uma forma não-fucosilada do conjugado anticorpo fármaco HBLB mAb-vcMMAE tendo uma média de quatro moléculas de ligador de fármaco vcMMAE por anticorpo. hIgG refere-se ao IgG de controle humano. H00-mcF(4) refere-se a um conjugado de controle anticorpo fármaco de um anticorpo de não ligação com uma média de 4 moléculas de ligador de fármaco mcMMAF por anticorpo. H00-vcE(4) refere-se a um conjugado de controle anticorpo fármaco de um anticorpo de não ligação com uma média de 4 moléculas de ligador de fármaco vcMMAE por anticorpo.
[027] Figura 12 mostra os resultados de um estudo de xenoenxerto da linhagem de câncer de mama MCF7 em camundongos nude. CLIV-14 -meMMAS (4) refere-se a um conjugado anticorpo fármaco da forma quimérica do anticorpo murino parental tendo uma média de 4 moléculas de ligador de fármaco mcMMAF por anticorpo. CLIV-14-vcMMAE (4) refere-se a um conjugado anticorpo fármaco da forma quimérica do anticorpo de murinho parental tendo uma média de 4 moléculas de ligador de fármaco vcMMAE por anticorpo. HO0-mcMMAF (4) refere-se a um conjugado anticorpo fármaco de um anticorpo de controle de não ligação tendo uma média de 4 moléculas de ligador de fármaco mcMMAF por anticorpo. H0O0-vcMMAE (4) refere-se a um conjugado anticorpo fármaco de um anticorpo de controle de não ligação tendo uma média de 4 moléculas de ligador de fármaco vcMMAE por anticorpo. A dose e tempo de administração são indicados na figura.
[028] Figura 13 mostra os resultados de um estudo de xenoenxerto da linhagem de câncer de próstata PC3 em camundongos nude machos. CLIV-14-vcMMAE (4) refere-se a um conjugado anticorpo fármaco da forma quimérica do anticorpo murino parental tendo uma média de 4 moléculas de ligador de fármaco vcMMAE por anticorpo. hBUl2- vcMMAE (4) refere-se a um conjugado anticorpo fármaco de um anticorpo anti-CDi9 tendo uma média de 4 moléculas de ligador de fármaco vcMMAE por anticorpo. A dose e tempo de administração são indicados na figura.
[029] Figura 14 mostra os resultados de um estudo de xenoenxerto da linhagem de câncer de mama MCF7 em camundongos nude. hLIV-14-vcMMAE (4) refere-se a um conjugado anticorpo fármaco do anticorpo HBLB tendo uma média de 4 moléculas de ligador de fármaco vcMMAE por anticorpo. hLIV-14d-vcMMAE (2) refere-se a um conjugado anticorpo fármaco do anticorpo HBLB tendo uma média de 2 moléculas de ligador de fármaco vcMMAE por anticorpo, cada um conjugado na posição S239C de cada cadeia pesada. H0O0-vcMMAE (4) refere-se a um conjugado anticorpo fármaco de um anticorpo de controle de não ligação tendo uma média de 4 moléculas de ligador de fármaco vcMMAE por anticorpo. A dose e tempo de administração são indicados na figura.
[030] Figura 15 mostra os resultados de um estudo de xenoenxerto da linhagem de câncer de próstata PC3 em camundongos nude machos. hLIV-14-vcMMAE (4) refere-se a um conjugado anticorpo fármaco do anticorpo HBLB tendo uma média de 4 moléculas de ligador de fármaco vcMMAE por anticorpo. hLIV-14-mcMMAF (4) refere-se a um conjugado anticorpo fármaco do anticorpo HBLB tendo uma média de 4 moléculas de ligador de fármaco mcMMAF por anticorpo. hLIV-14d-vcMMAE (2) refere-se a um conjugado anticorpo fármaco do anticorpo HBLB tendo uma média de 2 moléculas de ligador de fármaco vcMMAE por anticorpo, cada conjugado na posição S239C de cada cadeia pesada. hLIV-14d-mcMMAF (2) refere-se a um conjugado anticorpo fármaco do anticorpo HBLB tendo uma média de 2 moléculas de ligador de fármaco mcMMAF por anticorpo, cada um conjugado na posição S239C de cada cadeia pesada. H0O0- vcMMAE (4) refere-se a um conjugado anticorpo fármaco de um anticorpo de controle de não ligação tendo uma média de 4 moléculas de ligador de fármaco vcMMAE por anticorpo. H00- mcMMAF (4) refere-se a um conjugado anticorpo fármaco de um anticorpo de controle de não ligação tendo uma média de 4 moléculas de ligador de fármaco mcMMAF por anticorpo. A dose e tempo de administração são indicados na figura.
[031] Figuras 16A e 16B mostram os alinhamentos das regiões variáveis maduras de cadeia pesada humanizada (Figura 16A) e cadeia leve (Figura 16B) com aqueles do camundongo BR2-22a.
[032] Figura 17 mostra os ensaios de ligação de competição de permutações diferentes de cadeias pesadas humanizadas HA-HF e cadeias leves humanizadas LA-LF derivadas do anticorpo monoclonal anti-LIV-1 murino BR2-22a. O número total de retromutações murino em cada cadeia leve ou pesada é mostrado entre parênteses. Apenas HELF mostrou retenção suficiente de ligação.
[033] Figura 18 mostra uma variação sistemática das cadeias HE e LF para testar contribuição de retromutações individuais para ligação ao antígeno. Sítios de hipermutação somática em potencial estão entre parênteses. Resíduos de camundongo estão sublinhados. Os restantes resíduos são resíduos da linhagem germinal humana.
[034] Figura 19 mostra ligação de competição das variantes LF no topo da figura. As retromutações testadas são mostradas no fundo da figura. Resíduos de camundongo estão sublinhados. Os resíduos restantes são resíduos da linhagem germinal humana.
[035] Figura 20 mostra ligação de competição das variantes HE no topo da figura. As retromutações testadas são mostradas no fundo da figura. Resíduos de camundongo estão sublinhados. Os resíduos restantes são resíduos da linhagem germinal humana.
[036] Figura 21 mostra ligação de competição de diferentes permutações de HE, HF, HG e LF e IG.
[037] Figura 22 mostra ligação de saturação de anticorpo LIV14 humanizado e anticorpo LIV22 humanizado em LIV-1 humano e cinomolgo expressado a partir de células CHO.
[038] Figura 23 mostra a atividade citotóxica do LIV22- vcMMAE humanizado em células MCF-7 após 144 horas de tratamento. h00-1006 é um anticorpo conjugado a fármaco de controle.
[039] Figura 24 mostra a atividade citotóxica de hLIV22- mcMMAF sobre células MCF-7 após 144 horas de tratamento.n00-1269 é um anticorpo conjugado a fármaco de controle.
[040] Figura 25 mostra a atividade de anticorpo hLIV22 no modelo de carcinoma de próstata PC3 (DSMZ) em camundongos nude fêmeas. os dias de dose são indicados por triângulos no eixo X.
[041] Figura 26 mostra que a atividade de anticorpo hLIV22 em tumores de carcinoma da mama MCF7 (NCI) em camundongos nude.
[042] Figura 27 compara a atividade de hLIV22 e hLIV1I4 no mesmo modelo que Figura 26.
[043] Figura 28 mostra uma análise da expressão da proteína LIV-1 por IHC nas amostras de pacientes com câncer de melanoma.
DEFINIÇÕES
[044] Os anticorpos monoclonais são tipicamente providos na forma isolada. Isto significa que um anticorpo é tipicamente pelo menos 50% peso/peso puro de proteínas interferentes e outros contaminantes resultantes da sua produção ou purificação, mas não excluem a possibilidade de que o anticorpo monoclonal é combinado com um excesso de carreador (es) farmacêutico(s) aceitável (is) ou outro veículo, destinado(s) a facilitar o seu uso. Por vezes, os anticorpos monoclonais são, pelo menos, 60%, 70%, 80%, 90%, 95 ou 99% peso/peso puros de proteínas interferentes e contaminantes de produção ou purificação.
[045] Ligação específica de um anticorpo monoclonal para o seu antígeno alvo significa uma afinidade de pelo menos 106, 107, 108, 109, ou 1010 M-1. A ligação específica é, como detectável, maior em grandeza e distinguível de ligação não específica ocorrendo em, pelo menos, um alvo não relacionado. A ligação específica pode ser o resultado da formação de ligações entre os grupos funcionais particulares ou um ajuste espacial particular (por exemplo, do tipo fechadura e chave), enquanto que a ligação não especifica é geralmente o resultado de forças de van der waals. A ligação específica, contudo, não implica necessariamente que um anticorpo monoclonal se liga a um e apenas um alvo.
[046] A unidade estrutural do anticorpo básica é um tetrâmero de subunidades. Cada tetrâmero inclui dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo, cada par tendo uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma "pesada" (cerca de 5070 kDa). A porção amino-terminal de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos primariamente responsáveis pelo reconhecimento do antígeno. Esta região variável é inicialmente expressada ligada a um peptídeo de sinal clivável. A região variável sem o peptídeo de sinal é, por vezes, referida como uma região variável madura. Assim, por exemplo, a região variável de cadeia leve madura significa uma região variável de cadeia leve sem um peptídeo sinal de cadeia leve. A porção carbóxi-terminal de cada cadeia define uma região constante primariamente responsável pela função efetora.
[047] Cadeias leves são classificadas como Kappa ou lambda. Cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou épsilon, e definem o isotipo do anticorpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. No interior das cadeias leve e pesada, as regiões variáveis e constantes são unidas por uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada incluindo também uma região "D" de cerca de 10 ou mais aminoácidos. (Ver geralmente, Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2a, ed. Raven Press, N.Y., 1989, Ch. 7, incorporado por referência na sua totalidade para todos os fins).
[048] As regiões variáveis maduras de cada par cadeia leve/pesada formam o sítio de ligação do anticorpo. Assim, um anticorpo intacto tem dois sítios de ligação. Exceto nos anticorpos bifuncionais ou biespecíficos, os dois sítios de ligação são iguais. As cadeias exibem, todas, a mesma estrutura geral de regiões de arcabouço relativamente conservadas (FR) unidas por três regiões hipervariáveis, também chamadas regiões de determinação de complementaridade ou CDRs. As CDR das duas cadeias de cada par estão alinhadas pelas regiões de arcabouço, permitindo ligação a um epítopo específico. Desde N-terminal to C-terminal, tanto cadeias leve como pesadas compreendem os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A atribuição de aminoácidos a cada domínio estã de acordo com as definições de Kabat, Sequences Of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 e 1991), ou Chothia & Lesk, JU. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989). Kabat também fornece uma convenção de numeração amplamente usada (numeração Kabat) em que os resíduos correspondentes entre diferentes cadeias pesadas ou entre cadeias leves diferentes são atribuídos com o mesmo número.
[049] O termo "anticorpo" inclui anticorpos intactos e fragmentos de ligação dos mesmos. Tipicamente, os fragmentos de anticorpos competem com o anticorpo intacto a partir do qual eles são derivados para ligação específica para o alvo, incluindo cadeias pesadas separadas, cadeias leves Fab, Fab', F(ab')>, F(ab)c, diacorpos, Dabs, nanocorpos, e Fv. Os fragmentos podem ser produzidos por técnicas de DNA recombinante ou por separação enzimática ou química de imunoglobulinas intactas. O termo "anticorpo" inclui também um diacorpo (fragmento Fv homodimérico) ou um minicorpo (VL- Vg-CH3), um anticorpo biespecífico ou semelhantes. Um anticorpo biespecífico ou bifuncional é um anticorpo híbrido artificial com dois diferentes pares de cadeia pesada/leve e dois sítios de ligação diferentes (ver, por exemplo, Songsivilai e Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-53 (1992)). O termo nanticorpo" inclui um anticorpo sozinho (anticorpo nu) ou um anticorpo conjugado com um fármaco citotóxico ou citostático.
[050] O termo “epítopo” refere-se a um sítio em um antígeno ao qual um anticorpo se liga. Um epítopo pode ser formado a partir de aminoácidos contíguos ou aminoácidos não contíguos justapostos por duplicação terciária de uma ou mais proteínas. Epítopos formados a partir de aminoácidos contíguos são tipicamente retidos em exposição a solventes desnaturantes enquanto que epítopos formados por duplicação terciária são tipicamente perdidas em tratamento com solventes desnaturantes. Um epítopo inclui, tipicamente, pelo menos 3, e, mais geralmente, pelo menos 5 ou 8-10 aminoácidos em uma conformação espacial única. Os métodos de determinação da conformação espacial de epítopos incluem, por exemplo, cristalografia de raios-x e ressonância magnética nuclear bi-dimensional. Ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996).
[051] Os anticorpos que reconhecem os mesmos ou epítopos de sobreposição podem ser identificados em um imunoensaio simples mostrando a capacidade de um anticorpo para competir com a ligação de outro anticorpo para um antígeno alvo. O epítopo de um anticorpo, também pode ser definido por cristalografia de raios-x do anticorpo ligado ao seu antígeno para identificar resíduos de contato. Alternativamente, dois anticorpos têm o mesmo epítopo se todas as mutações de aminoácidos no antígeno que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo reduzem ou eliminem a ligação do outro. Dois anticorpos têm epítopos de sobreposição se algumas mutações de aminoácidos que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo reduzem ou eliminam a ligação do outro.
[052] A competição entre anticorpos é determinada através de um ensaio em que um anticorpo sob teste inibe a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum (ver, por exemplo, vJunghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990). Um anticorpo de teste compete com um anticorpo de referência, se um excesso de um anticorpo de teste (por exemplo, pelo menos 2x, 5x, 10x, 20x ou 100x) inibir a ligação do anticorpo de referência por pelo menos 50%, mas preferivelmente 75%, 90% ou 99%, como medido em um ensaio de ligação competitiva. Os anticorpos identificados por ensaio de competição (anticorpos de competição) incluem anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência e anticorpos que se ligam a um epítopo adjacente suficientemente proximal para o epítopo ligado pelo anticorpo de referência para que ocorra impedimento estereoquímico.
[053] O termo “paciente” inclui indivíduos humanos e outros mamíferos que recebem tratamento, profilático ou terapêutico. Para fins de classificação de substituições de aminoácidos como conservativo ou não conservativo, aminoácidos são agrupadas como se segue: Grupo I (cadeias laterais hidrofóbicas): met, ala, val, leu, ile; Grupo II (cadeias laterais hidrófilas neutras): cys, ser, thr; Grupo III (cadeias laterais ácidas): asp, glu; Grupo IV (cadeias laterais básicas): asn, gln, his, lys, arg; Grupo V (resíduos influenciando a orientação da cadeia): gly, pro; e Grupo VI (cadeias laterais aromáticas): trp, tyr, phe. Substituições conservativas envolvem substituições entre aminoácidos na mesma classe. As substituições não conservativas constituem a troca de um membro de uma destas classes por um membro de outra.
[054] Identidades de sequência percentuais são determinadas com sequências de anticorpos alinhadas maximamente pela convenção de numeração Kabat. Após o alinhamento, se uma região de anticorpo do indivíduo (por exemplo, toda a região variável madura de uma cadeia pesada ou leve) está sendo comparado com a mesma região de um anticorpo de referência, a identidade de sequência percentual entre o indivíduo e as regiões do anticorpo de referência é o número de posições ocupadas pelo mesmo aminoácido, tanto no indivíduo como na região de anticorpo de referência, dividido pelo número total de posições alinhadas das duas regiões, com lacunas não contadas, multiplicado por 100 para converter a percentagem.
[055] Composições e métodos "compreendendo" um ou mais elementos recitados podem incluir outros elementos não especificamente recitados. Por exemplo, a composição que compreende anticorpo pode conter o anticorpo isoladamente ou em combinação com outros ingredientes.
[056] A designação de uma faixa de valores incluindo todos os inteiros dentro de ou definindo a faixa.
[057] Uma função efetora de anticorpo refere-se a uma função contribuída por um domínio(s) Fc de um Ig. Estas funções podem ser, por exemplo, citotoxicidade celular dependente de anticorpos, fagocitose celular dependente de anticorpos ou citotoxicidade dependente do complemento. Esta função pode ser efetuada por, por exemplo, ligação de domínio(s) de efetor Fc a um receptor de Fc de uma célula imune com atividade fagocítica ou lítica ou por ligação de domínio(s) de efetor Fc a componentes do sistema complemento. Tipicamente, o(s) efeito (s) mediado(s) pelas células ligando Fc ou componentes complementos resulta em inibição e/ou depleção da célula-alvo LIV-1. As regiões Fc de anticorpos podem recrutar células expressando receptor Fc (FcR) e justapondo as mesmas com células alvo revestidas com anticorpo. Células expressando FcR na superfície para IgGs incluindo FcyRIII (CD16), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD64) podem atuar como células efetoras para a destruição de células revestidas com IgG. Tais células efetoras incluem monócitos, macrófagos, células exterminadoras naturais (NK), neutrófilos e eosinófilos. O engajamento de FcyR por IgG ativa a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) ou fagocitose celular dependente de anticorpos (ADCP). ADCC é mediada pelas células efetoras CD16* através da secreção de proteínas de formação de poros de membrana e proteases, enquanto que a fagocitose é mediada por células efetoras CD32* e CD64* (ver Fundamental Immunology, 4°: ed., Paul ed., Lippincott-Raven, N.Y., 1997, caps. 3, 17 e 30; Uchida et al., 2004, J. Exp. Med. 199:1659-69; Akewanlop et al., 2001, Cancer Res. 61:4061-65; Watanabe et al., 1999, Breast Cancer Res. Treat. 53:199-207). Além de ADCC e ADCP, regiões Fc de anticorpos ligados às células também podem ativar a via clássica do complemento para elicitar citotoxicidade dependente do complemento (CDC). Ciga do sistema de complemento liga às regiões Fc de anticorpos quando eles são complexados com antígenos. Ligação de Clq aos anticorpos ligados às células pode iniciar uma cascata de eventos que envolvem a ativação proteolítica de C4 e C2 para gerar a C3 convertase. Clivagem de C3 para C3b por C3 convertase permite a ativação de componentes de complemento terminais incluindo C5b, C6, C7, C8 e C9. Coletivamente, estas proteínas formam poros complexos de ataque de membrana sobre as células revestidas com anticorpos. Estes poros rompem a integridade da membrana celular, matando a célula alvo (ver Immunobiology, 6° ed., vJaneway et al., Garland Science, N. Y., 2005, Cap. 2).
[058] O termo “citotoxicidade celular dependente de anticorpos”, ou ADCC, é um mecanismo para indução de morte celular que depende da interação de células alvo revestidas com anticorpo com células imunes possuindo atividade lítica (também referidas como células efetoras). Tais células efetoras incluem células exterminadoras naturais, monócitos/macrófagos e neutrófilos. As células efetoras fixam a(aos) domínio(s) de efetor Fc de Ig ligado a células alvo via seus sítios de combinação com o antígeno. Morte da célula alvo revestida com anticorpo ocorre como um resultado da atividade das células efetoras.
[059] O termo “fagocitose celular dependente de anticorpos”, ou ADCP, refere-se ao processo nas quais células revestidas com anticorpos são internalizadas, no todo ou em parte, por células imunes fagocíticas (por exemplo, macrófagos, neutrófilos e células dendríticas) que ligam a domínio(s) de efetor Fc de Ig.
[060] O termo “citotoxicidade dependente do complemento”, ou CDC, refere-se a um mecanismo para a indução de morte celular em que um domínio(s) de efetor Fc de um anticorpo ligado ao alvo ativa uma série de reações enzimáticas culminando na formação de buracos na membrana da célula alvo. Tipicamente, complexos antígeno-anticorpo tais como aquelas em células alvo revestidas com anticorpo ligam e ativam componente do complemento Clqg que, por sua vez, ativa a cascata do complemento levando à morte de células alvo. Ativação de complemento podem também resultar em deposição de componentes do complemento sobre a superfície da célula alvo que facilita ADCC por receptores de complemento de ligação (por exemplo, CR3) nos leucócitos.
[061] Um “efeito citotóxico” refere-se à depleção, eliminação e / ou a morte da célula alvo. Um “agente citotóxico” refere-se a um agente que tem um efeito citotóxico sobre uma célula. Agentes citotóxicos podem ser conjugados com um anticorpo ou administrados em combinação com um anticorpo.
[062] Um “efeito citostático” refere-se à inibição da proliferação de células. Um “agente citostático” refere-se a um agente que tem um efeito citostático sobre uma célula, inibindo assim o crescimento e/ou a expansão de um subconjunto específico de células. Agentes citostáticos podem ser conjugados com um anticorpo ou administrados em combinação com um anticorpo.
[063] O termo “farmaceuticamente aceitável” significa aprovado ou de aprovável por uma agência regulatória do governo federal ou estadual ou listados na Farmacopéia dos EUA ou outra farmacopéia geralmente reconhecida para uso em animais, e mais particularmente em humanos. O termo “ingrediente farmaceuticamente compatível” refere-se a um diluente farmaceuticamente aceitável, adjuvante, excipiente ou veículo com um anticorpo anti-l LIV.
[064] A frase “sal farmaceuticamente aceitável,” refere- se a sais orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis de um anticorpo anti-LIV-1 ou conjugado do mesmo ou agente administrado com um anticorpo anti-LIV-1. Sais exemplares incluem sais sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloreto, brometo, iodeto, nitrato, bissulfato, fosfato, fosfato de âcido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato de ácido, tartrato, oleato, tannato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucuronato, saccarato, formato, benzoato, glutamato, metanossulfonato, etanossulfonato, benzenossulfonato, p toluenossulfonato, e pamoato (isto é, 1,1' metileno bis -(2 hidróxi 3 naftoato)). Um sal farmaceuticamente aceitável pode envolver a inclusão de outra molécula, tal como um íon acetato, íon succinato ou outro contra-íon. O contra-íon pode ser qualquer porção orgânica ou inorgânica, que estabiliza a carga sobre o composto parental. Além disso, um sal farmaceuticamente aceitável pode ter mais de um átomo carregado em sua estrutura. Casos em que vários átomos carregados múltiplos fazem parte do sal farmaceuticamente aceitável podem ter contra-íons múltiplos. Assim, um sal farmaceuticamente aceitável pode ter um ou mais átomos carregados e / ou um ou mais contra-íons.
[065] Salvo disposição em contrário do contexto, o termo "sobre" engloba valores dentro de um desvio padrão de um valor declarado.
DESCRIÇÃO DETALHADA I. Geral
[066] A invenção provê anticorpos monoclonais que especificamente se ligam a JLIV-1. Os anticorpos são utilizáveis vara tratamento e diagnóstico de vários cânceres, bem como detectar LIV-l1.
II. Moléculas-alvo
[067] Salvo indicação em contrário, LIV-1 significa um LIV-1 humano. Uma sequência humana exemplar é atribuída com o número de acesso Swiss Prot Q13433. Q13433 é aqui incluído como SEQ ID NO:83. Três isoformas variantes e um polimorfismo são conhecidos. Uma segunda versão da proteína LIV-lhumana, número de acesso AAA96258.2, é aqui incluída como SEQ ID NO0O:84. Quatro domínios extracelulares são limitados por resíduos 29-325, 377-4283, 679-686 e 746-755 de Q13433 respectivamente.
[068] Salvo disposição em contrário de referência do contexto, LIV-1 significa pelo menos um domínio extracelular da proteína e, geralmente, a proteína completa diferente de um peptídeo de sinal clivável (aminoácidos 1-28 de Q13433).
III. Anticorpos da invenção A. Propriedades de especificidade de ligação e funcionais
[069] A invenção provê anticorpos humanizados derivados de dois anticorpos de camundongo, BR2-14a e BR2-22a. Salvo especificamente indicado em contrário, as presentes descrições se relacionam com ambos os anticorpos. Os dois anticorpos de camundongo mostram 94% e 91% de identidade de sequência com a outra nas regiões variáveis de cadeia pesada e leve maduras. Os dois anticorpos ligam-se ao mesmo ou epítopos de sobreposição em LIV-1 humano. No entanto, o anticorpo BR2-22a tem cerca de dez vezes maior afinidade para o ser LIV-1 humano e cerca de 3 vezes maior afinidade para LIV-1 macaco cinomolgo que BR2-14a, como mostrado na Figura 22.
[070] A afinidade de formas humanizadas do anticorpo BR2-14a de camundongo (isto é, Ka) é preferivelmente dentro de um fator de cinco ou um fator de dois do anticorpo BR2- 14a de camundongo para LIV-lhumano. Anticorpos BR2-14a humanizados especificamente se ligam a LIV-1 humano na forma nativa e/ou recombinante expressado a partir de células CHO assim como os anticorpo de camundongos a partir dos quais eles foram derivados . Preferidos anticorpos BR2-14a humanizados tem uma afinidade igual ou superior a (isto é, maiores do que além da margem de erro na medição) de que BR2-14a para LIV-1 humano (por exemplo, 1.1-5 vezes, 1,1 a 3 vezes, 1,5 a 3-vezes, 1,7 a 2,3 vezes ou 1,7-2,1-vezes a afinidade ou cerca de duas vezes a afinidade de BR2-14a). Preferidos anticorpos BR2-14a humanizados se ligam ao mesmo epítopo e/ou competem com BR2-l14a para a ligação a LIV-1 humano. Preferidos anticorpos BR2-14a humanizados também se ligam ao homólogo de LIV-1 cyno permitindo assim testes pré- clínicos em primatas não humanos.
[071] A afinidade de formas humanizadas do anticorpo BR2-22a de camundongo (isto é, Ka) para LIV-1 humano, nativamente expressado ou expressado a partir de células CHO, está preferivelmente dentro de um fator de cinco ou um fator de dois do anticorpo BR2-22 de camundongo. Alguns anticorpos BR2-22a humanizados têm uma constante de associação, que é essencialmente a mesma que a de BR2-22a (isto é, dentro do erro experimental). Algum anticorpos BR2- 22a humanizados tem uma constante de associação dentro de uma faixa de 0,5 a 1 ou 0,5-1, 5 a da constante de associação do anticorpo BR2-22a. Os anticorpos BR2-22a humanizados preferidos tem uma constante de associação maior do que 5 x108 M-1, ou em uma faixa de 0,5 a 2 x 109 M-1 ou cerca de 0,8 x109 M-1 (+/- erro na medição) para LIV-1 humano expressado a partir de células CHO. Aqui como em outras partes do presente pedido, as afinidades podem ser medidas em conformidade com os métodos dos Exemplos. Preferidos anticorpos BR2-22a humanizados se ligam ao mesmo epítopo e/ou competem com BR2-22a para a ligação a LIV-1 humano. Anticorpos BR2-22a humanizados se ligam ao homólogo de LIV- i cyno bem como LIV-1 humano. Preferidos anticorpos BR2-22a, humanizados ligam-se, essencialmente, à mesma constante de associação a LIV-lhumano e macaco cinomolgo ambos expressados a partir de células CHO (dentro do erro experimental) e permitindo assim aumentar a precisão da previsão de testes pré-clínicos em primatas não humanos.
[072] Preferidos anticorpos (tanto BR2-14a humanizado como BR2-22a humanizado) inibem o câncer (por exemplo, crescimento das células, metástases e / ou letalidade para organismos) como mostrado nas células cancerosas se propagando em cultura, em um modelo animal ou ensaio clínico. Os modelos animais podem ser formados através do implante de linhagens celulares de tumor humano expressando LIV-1 em cepas de roedores imunodeficientes adequadas, por exemplo, camundongos nu ou camundongos SCID atímicos. Essas linhagens celulares de tumor podem ser estabelecidas em hospedeiros roedores imunodeficientes como tumor sólido por injeção subcutânea ou como tumores disseminados por injeção intravenosa. Uma vez estabelecidos dentro de um hospedeiro, estes modelos de tumor podem ser aplicados para avaliar as eficácias terapêuticas dos anticorpos anti-LIV-1 ou formas conjugadas dos mesmos, como descrito nos Exemplos.
B. Anticorpos humanizados
[073] Um anticorpo humanizado é um anticorpo geneticamente modificado na qual os CDRs a partir de um anticorpo “doador” não-humano são enxertados em sequências de anticorpos aceitadores “humanos” (ver, por exemplo, Queen, US 5,530,101 e 5,585,089; Winter, US 5,225,539; Carter, US 6,407,213; Adair, US 5,859,205; e Foote, US 6,881,557). As sequências de anticorpos aceitadoras podem ser, por exemplo, uma sequência de anticorpo humano maduro, um composto de tais sequências, uma sequência de consenso de sequência de anticorpo humano, ou uma sequência de região de linhagem germinal. Uma sequência aceitadora preferida para cadeia pesada é a linha germinal VH exon VHl-2 (também referida na literatura como HV1-2) (Shin et al., 1991, EMBO J. 10:3641-3645) e para a região de dobradiça (Ju), exon Jy- 6 (Mattila et al., 1995, Eur. J. Immunol. 25:2578-2582). Para a cadeia leve, uma sequência aceitadora preferida é exon VK2-30 (também referida na literatura como KV2-30) e para a região de dobradiça exon JkKx-4 (Hieter et al., 1982, 7. Biol. Chem. 257:1516-1522). Assim, um anticorpo humanizado é um anticorpo tendo algumas ou todas as CDRs totalmente ou substancialmente a partir de um anticorpo doador e sequências de arcabouço da região variável e regiões constantes, se presentes, totalmente ou substancialmente a partir de sequência de anticorpo humano. Similarmente uma cadeia pesada humanizada tem pelo menos uma, duas e, geralmente, todas as três CDRs totalmente ou substancialmente a partir de uma cadeia pesada de anticorpo doador, e uma sequência de arcabouço da região variável de cadeia pesada e região constante de cadeia pesada, se presente, substancialmente a partir de sequências de arcabouço variável de cadeia pesada humanas e de região constante. Similarmente uma cadeia leve humanizada tem pelo menos uma, duas e, geralmente, todas as três CDRs totalmente ou substancialmente a partir de uma cadeia leve de anticorpo doador, e uma sequência de arcabouço da região variável de cadeia leve e região constante de cadeia leve, se presente, substancialmente a partir de sequências de arcabouço da região variável de cadeia leve humanas e região constante. Diferente dos: nanocorpos e dAbs, um anticorpo humanizado compreende uma cadeia pesada humanizada e uma cadeia leve humanizada. Uma CDR em um anticorpo humanizado é substancialmente de uma CDR correspondente em um anticorpo não humano quando pelo menos 60%, 85%, 90%, 95% ou 100% de resíduos correspondentes (como definido por Kabat) .são idênticos entre as respectivas CDRs. As sequências de arcabouço da região variável de uma cadeia de anticorpo ou a região constante de uma cadeia de anticorpo são substancialmente de uma sequência de arcabouço da região variável humana ou região constante humana respectivamente quando pelo menos 85%, 90%, 95% ou 100% de resíduos correspondentes definidas por Kabat são idênticos.
[074] Apesar de anticorpos humanizados muitas vezes incorporam todas as seis CDRs (preferivelmente, tal como definido por Kabat) a partir de um anticorpo de camundongo, eles também pode ser feitos com menos do que todas as CDRs (por exemplo, pelo menos 3, 4, ou 5) CDRs a partir de um anticorpo de camundongo (por exemplo, Pascalis et al., J. Immunol. 169:3076, 2002; Vajdos et al., Journal of Molecular Biology, 320: 415-428, 2002; Iwahashi et al., Mol. Immunol. 36:1079- 1091, 1999; Tamura et al, Journal of Immunology, 164:1432- 1441, 2000).
[075] Certos aminoácidos a partir de resíduos de arcabouço da região variável humana podem ser selecionados para substituição com base na sua influência possível na conformação de CDR e / ou ligação ao antígeno. A investigação de tais possíveis influências é por modelagem, análise das características dos aminoácidos, em locais particulares, ou observação empírica dos efeitos de substituição ou mutagênese de aminoácidos particulares.
[076] Por exemplo, quando um aminoácido difere entre um resíduo de arcabouço da região variável murino e um resíduo de arcabouço da região variável numana selecionada, o aminoácido de arcabouço humano pode ser substituído pelo aminoácido de arcabouço equivalente a partir do anticorpo de camundongo quando se pode esperar razoavelmente que o aminoácido: (1) se liga não covalentemente ao antígeno diretamente, (2) está adjacente a uma região CDR, (3) de outro modo interage com uma região CDR (por exemplo está dentro de cerca de 6 Â da região CDR); ou (4) media a interação entre as cadeias pesada e leve.
[077] A invenção provê formas humanizadas dos anticorpo BR2-l4a camundongo incluindo cinco regiões variáveis maduras de cadeia pesada humanizadas exemplificadas (HA-HE) de seis regiões variáveis maduras de cadeia leve humanizadas exemplificadas (LA-LF). As permutações destas cadeias possuindo a ligação mais forte (menor EC50) são HBLB, HBLF, HCLB, HCLF, HDLB, HDLF, HELE e HELF. Destes permutações, HBLB (também conhecido como hLIV14) é preferido porque tem a ligação mais forte, cerca de 2 vezes mais forte do que o anticorpo doador do camundongo, e tem as menores retromutações (quatro).
[078] A invenção provê variantes do anticorpo humanizado HBLB na qual a região variável madura de cadeia pesada humanizada mostra pelo menos identidade de 90%, 95% ou 99% para SEQ ID NO:10 e a região variável madura de cadeia leve humanizada mostra pelo menos identidade de sequência de 90%, 95% ou 99% para SEQ “ID NO:15. Preferivelmente, em tais anticorpos algumas ou todas as retromutações em HBLB são retidas. Em outras palavras, pelo menos 1, 2 ou preferivelmente todas 3 das posições de cadeia pesada H29, H30 e H76 são ocupadas pelos I e E e N, respectivamente. Do mesmo modo, a posição L36 é preferivelmente ocupada por Y. As regiões CDRs de tais anticorpos humanizados são preferivelmente substancialmente idênticas às regiões de CDR de HBLB, que são as mesmas que aquelas do anticorpo doador do camundongo. As regiões CDRs podem ser definidas por qualquer definição convencional (por exemplo, Chothia) mas são preferivelmente como definidas por Kabat. Em uma forma de realização, o anticorpo humanizado compreende a cadeia pesada compreendendo as 3 CDRs de SEQ ID NO:10 e arcabouços de região variável com pelo menos 95% de identidade para os arcabouços da região variável de SEQ ID NO:10. Em outra forma de realização, o anticorpo humanizado compreende uma cadeia leve compreendendo as 3 CDRs de SEQ ID NO:15 e os arcabouços de região variável com pelo menos identidade de 95% para arcabouços de região variável de SEQ ID NO:15. Em uma outra forma de realização, o anticorpo humanizado compreende uma cadeia pesada compreendendo as 3 CDRs de SEQ ID NO:10 e arcabouços de região variável com pelo menos identidade de 95% para os arcabouços da região variável de SEQ ID NO:10, e a cadeia leve compreendendo as 3 CDRs de SEQ ID NO:15, e arcabouços da região variável com pelo menos identidade de 95% para os arcabouços de região variável de SEQ ID NO:15.
[079] Na medida em que anticorpos humanizados mostram qualquer variação do anticorpo humanizado HBLB exemplificado, uma possibilidade para tal variação adicional são as retromutações adicionais nos arcabouços de região variável. Algumas ou todas as posições retro-mudadas em outras regiões variáveis maduras de cadeia pesada ou leve humanizadas exemplificadas também pode ser feitas (isto é, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou todos 9 de H27 ocupados por F, H28 ocupado por N, H48 ocupado por I, H66 ocupado por K, H67 ocupado por A, H71 ocupado por A, H76 ocupado por N, H93 ocupado por N e H94 ocupado por V na cadeia pesada e 1, 2, 3, 4 ou todos 5 de L37 ocupados por L, L39 ocupado por K, L45 ocupado por K, e 146 ocupado por L na cadeia leve. No entanto, tais retromutações adicionais não são preferidas porque, em geral, não melhoram a afinidade e a introdução de mais resíduos de camundongo pode dar um aumentado risco de imunogenicidade.
[080] A invenção provê formas humanizadas dos anticorpo BR2-22a de camundongo incluindo três regiões variáveis maduras de cadeia pesada humanizadas exemplificadas (HE, HF e HG) e duas de cadeia leve humanizadas exemplificadas (LF e LG) que podem ser combinadas em diferentes permutações com ligação adequada (ver Figura 21). Destas permutações, HGLG (também conhecido como hLIV22) é preferido porque tem a melhor combinação de propriedades de ligação (essencialmente o mesmo que o anticorpo BR2-22a de camundongo dentro do erro experimental) e menor número de retromutações (sete).
[081] A invenção provê variantes de anticorpo humanizado HGLG em que a região variável madura de cadeia pesada humanizada mostra pelo menos identidade de 90%, 95%, 98% ou 99% para SEQ ID NO:53 e a região variável madura de cadeia leve humanizada mostra pelo menos identidade de sequência de 90%, 95%, 98% ou 99% para SEQ ID NO:60. Preferivelmente, em tais anticorpos algumas ou todas as retromutações HGLG são retidas. Em outras palavras, pelo menos 1, 2, 3, 4 ou preferivelmente todas as 5 das posições de cadeia pesada H27, H29, H30, H76, e H94 são ocupadas por L, I, E, Ne V (aqui, como em outros lugares no presente pedido a numeração de Kabat é usada para descrever regiões de posições na cadeia variável pesada e cadeia variável leve). Destas retromutações, H94 contribui, ao máximo, para a retenção de afinidade de ligação e H76, ao mínimo. Do mesmo modo, posições L36 e L46 são, preferivelmente, ocupadas por Y e P respectivamente. As regiões CDRs de tais anticorpos humanizados são preferivelmente substancialmente idênticas às regiões CDR de HGLG, que são iguais que aquelas do anticorpo doador do camundongo. As regiões CDR podem ser definidas por qualquer definição convencional (por exemplo, Chothia) mas são, preferivelmente, tais como definidas por Kabat. Em uma forma de realização, o anticorpo humanizado compreende a cadeia pesada compreendendo as 3 CDRS de SEQ ID NO:53 e arcabouços da região variável com pelo menos identidade de 95% para os arcabouços da região variável de SEQ ID NO:53. Em outra forma de realização, o anticorpo humanizado compreende uma cadeia leve compreendendo as 3 CDR's de SEQ ID NO:60 e arcabouços da região variável com pelo menos identidade de 95% para os arcabouços da região variável de SEQ ID N0:60. Em uma outra forma de realização, o anticorpo. humanizado compreende uma cadeia pesada compreendendo as 3 CDRs de SEQ ID NO:53 e arcabouços da região variável com pelo menos identidade de 95% para os arcabouços da região variável de SEQ ID NO:53, e a cadeia leve compreende as 3 CDRS de SEQ ID N0:60, e arcabouços da região variável com pelo menos identidade de 95% para Os arcabouços da região variável de SEQ ID NO:60.
[082] Na medida em que anticorpos BR2-22a humanizados mostram qualquer variação do anticorpo humanizado HGLG exemplificado, uma possibilidade para tal variação adicional são as retromutações adicionais nos arcabouços de região variável. Algumas ou todas as posições retro-mudadas em outras regiões variáveis maduras de cadeia pesada ou leve humanizadas exemplificadas também pode ser feitas (isto é, 1, 2, 3, 4, 5, ou todas as 6, de H28, ocupadas por N, de H48 ocupadas por I, de H66 ocupadas por K, de H67 ocupadas por A, de H71 ocupadas por A, de H93 ocupadas por T na cadeia pesada e 1 ou, 2 de L37 ocupadas por L37 ocupadas por L, de L45 ocupadas por K. No entanto, tais retromutações adicionais não são preferidas porque, em geral, não melhoram a afinidade e a introdução de mais resíduos de camundongo podem dar um risco aumentado de imunogenicidade.
[083] Outra possível variação consiste em substituir certos resíduos nas CDRs do anticorpo de camundongo com resíduos correspondentes a partir de sequências CDRs humanas, tipicamente a partir de (CDRs das sequências aceitadoras humanas utilizadas na concepção dos anticorpos humanizados exemplificados. Em alguns anticorpos apenas uma parte das CDRs, notadamente o subconjunto de resíduos de CDR necessários para a ligação, denominados SDRs, são necessários para reter a ligação em um anticorpo humanizado. Os resíduos de CDR não contatando o antígeno e não nos SDRs podem ser identificados com base em estudos anteriores (por exemplo, resíduos H60-H65 em CDR H2 muitas vezes não são necessários), a partir de regiões de CDRs de Kabat estando fora dos laços hipervariáveis de Chothia (Chothia, J. Mol. Biol. 196:901, 1987), por modelagem molecular e/ou empiricamente, ou como descrito em Gonzales et al., Mol. Immunol. 41: 863 (2004). Em tais anticorpos humanizados em posições em que um ou mais resíduos de CDR doadores está ausente ou em que todo um CDR doador é omitido, o aminoácido ocupando a posição pode ser um aminoácido ocupando a posição correspondente (por numeração de Kabat) na sequência do anticorpo aceitador. O número de tais substituições de aceitador nos aminoácidos doadores para incluir nas CDRs reflete um equilíbrio de considerações de competição. Tais substituições são potencialmente vantajosas na diminuição do número de aminoácidos de camundongo em um anticorpo humanizado e, consequentemente, diminuindo a imunogenicidade potencial. No entanto, substituições também podem causar alterações de afinidade, e reduções significativas na afinidade são, preferivelmente evitadas. Em outra variação, um ou mais resíduos em uma CDR de um BR2-22a anticorpo humanizado (que de outra forma seriam iguais que as CDRs do anticorpo BR2-22a de camundongo) podem ser substituídos por resíduos correspondentes de um CDR a partir de anticorpo BR2-14a de camundongo (ou vice versa). Posições para substituição dentro das CDRs e aminoácidos para substituir também podem ser selecionadas empiricamente.
[084] Apesar de não ser preferido, outras substituições de aminoácidos podem ser feitas, por exemplo, em resíduos de arcabouços não em contato com as CDRs, ou ainda alguns resíduos de contato CDR- potenciais, os aminoácidos dentro das CDRs. Frequentemente as substituições feitas nas sequências humanizadas variantes são conservativas com relação aos aminoácidos HBLB substituídos (no caso do BR2- 14a humanizado) ou aminoácidos HGLG (no caso do BR2-22 humanizado). Preferivelmente, substituições em relação à HBLB ou HGLG (sendo ou não conservativas) não têm efeito substancial sobre a afinidade de ligação ou potência do mAb humanizado, isto é, a sua capacidade para ligar LIV-1 humano e inibir o crescimento de células de câncer.
[085] Variantes tipicamente diferem de uma sequências de região variável de cadeia pesada e leve maduras de HBLB (nLIV14) ou HCLC (hLIV22) por um número pequeno (por exemplo, tipicamente não mais do que 1, 2, 3, 5 ou 10 tanto na região variável maduro de cadeia leve como na de cadeia pesada, ou ambas) de substituições, deleções ou inserções.
C. Seleção de região constante
[086] As regiões variáveis de cadeia pesada e leve de anticorpos humanizados podem ser ligadas a pelo menos uma porção da região constante humana. A escolha de uma região constante depende, em parte, de se a citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo, fagocitose celular dependente de anticorpo e/ou citotoxicidade dependente de complemento são desejadas. Por exemplo, isótopos humanos IgGl e IgG3 têm forte citotoxicidade dependente do complemento, citotoxicidade dependente do complemento fraca de IgG2 isotipo humano e IgG4 humano falta citotoxicidade dependente do complemento. IgG1 e IgG3 humanos também induzem funções efetoras mediadas por células mais fortes do que IgG2 e IgG4 humano. Regiões constantes de cadeia leve podem ser lambda ou kappa. Anticorpos podem ser expressados como tetrâmeros contendo duas cadeias leves e duas pesadas, como cadeia pesadas separadas, cadeia leves, como Fab, Fab', F(ab')2, e Fv, ou como anticorpos de cadeia única em que domínios variáveis de cadeia pesada e leve são ligados através de um espaçador.
[087] Regiões constantes humanas mostram variação alotípica e variação isoalotípica entre diferentes indivíduos, que é, as regiões constantes podem diferir em diferentes indivíduos em uma ou mais posições polimórficas. Isoalotipos diferem de alotipos em que soros reconhecendo um isoalotipo ligam a uma região não polimórfica de um ou mais de outros isotipos.
[088] Um ou vários aminoácidos no terminal amino ou carbóxi da cadeia leve e/ou cadeia pesada, tais como a lisina C-terminal da cadeia pesada, podem estar faltando ou derivatizados em uma proporção ou todas das moléculas. Substituições podem ser feitas nas regiões constantes para reduzir ou aumentar a função efetora tais como citotoxicidade mediada por complemento ou ADCC (ver, por exemplo, Winter et al., Patente US No. 5,624,821; Tso et al., Patente US No. 5,834,597; e Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006), ou para prolongar a meia- vida em humanos (ver, por exemplo, Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004).
[089] Substituição exemplar incluindo a substituição de aminoácido do aminoácido nativo para um resíduo de cisteína é introduzida na posição de aminoácido 234, 235, 237, 239, 267, 298, 299, 326, 330, ou 332, preferivelmente, uma mutação S239C no isotipo IgG1l humano (US 20100158909). A presença de um resíduo adicional de cisteína permite a formação de uma ligação dissulfeto intercadeia. Tal formação de uma ligação dissulfeto intercadeia pode causar impedimento estereoquímico, reduzindo, assim, a afinidade da interação de ligação região Fc -FcyR. O(s) resíduo(s) de cisteína introduzido(s) em ou na proximidade da região Fc de uma região constante IgG também pode(s) servir como sítios para a conjugação a agentes terapêuticos (isto é, copulação de fármacos citotóxicos usando reagentes específicos tiol, tais como os derivados de maleimida de fármacos. A presença de um agente terapêutico causa o impedimento estereoquímico, assim ainda reduzindo a afinidade da interação de ligação região Fc -FcyR. Outras substituições em qualquer uma das posições 234, 235, 236 e/ou 237 reduzem a afinidade para receptores Fey, particularmente receptor FcyRI (ver, por exemplo, US 6,624,821, US 5,624,821.
[090] A meia-vida in vivo de um anticorpo também pode impactar sobre suas funções efetoras. A meia-vida de um anticorpo pode ser aumentada ou diminuída para modificar suas atividades terapêuticas. FcRn é um receptor que é estruturalmente semelhante ao antígeno MHC Classe II que se associa não covalentemente com B2-microglobulina. FcRn regula O catabolismo de IgGs e sua transcitose através de tecidos (Ghetie e Ward, 2000, Annu. Rev. Immunol. 18:739766; Ghetie e Ward, 2002, Immunol. Res. 25:97-113). A interação IgG-FcRn ocorre em pH 6,0 (pH de vesículas intracelulares) mas não em pH 7,4 (pH de sangue); essa interação permite que IgGs sejam reciclados de volta para a circulação (Ghetie e Ward, 2000, Ann. Rev. Immunol. 18:739766; Ghetie e Ward, 2002, Immunol. Res. 25:97-113). A região em IgG1 humano envolvido em ligação FcRn foi mapeada (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-604). As substituições alanina nas posições Pro238, Thnr256, Thr307, Gln311, Asp312, Glu380, Glu382, ou Asn434 de IgG1 humano melhoram a ligação FcRn (Shields et al., 2001, qd. Biol. Chem. 276:6591604). As moléculas de IgGl abrigando estas substituições têm meias-vidas séricas mais longas. Consequentemente, essas moléculas IgGl modificadas podem ser capazes de realizar suas funções efetoras, e, portanto, exercem suas eficácias terapêuticas, durante um período de tempo mais longo em comparação com IgGinão modificado. Outras substituições exemplares para aumentar a ligação a FeRn incluem um Gln na posição 250 e/ou Leu na posição 428. A numeração EU é usada para todas posições na região constante.I. Oligossacarídeos fixados covalentemente ao Asn297 conservado estão envolvidos na capacidade da região Fc de IgG de ligar FcyR (Lund et al., 1996, J. Immunol. 157:496369; Wright e Morrison, 1997, Trends Biotechnol. 15:26-31). Engenharia deste glicoforma em IgG pode melhorar significativamente ADCC mediado por IgG. Adição de modificações de N-acetilglucosamina bisseccionais (Umana et al., 1999, Nat. Biotechnol. 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotech. Bioceng. 74:288-94) para esta glicoforma ou remoção de fucose (Shields et al., 2002, J. Biol. Chem. 277:26733-40; Shinkawa et al., 2003, J. Biol. Chem. 278:6591-604; Niwa et al., 2004, Cancer Res. 64:2127-33) a partir desta glicoforma são dois exemplos de engenharia de IgG Fc que melhora a ligação entre IgG Fc e FcyR, assim melhorando a atividade de ADCC mediada por Ig.
[091] Uma substituição sistêmica de aminoácidos expostos a solvente de região IgGl Fc humano gerou variantes de IgG com afinidades de ligação de PR alteradas (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-604). Quando comparado a IgG1 parental, um subconjunto dessas variantes envolvendo substituições em Thr256/Ser298, Ser298/G1u333, Ser298/Lys334, ou Ser298/G1u333/Lys334 para Ala demonstrou aumento em tanto afinidade de ligação para FcyR como atividade de ADCC (Shields et al., 2001, JU. Biol. Chem. 276:6591-604; Okazaki et al., 2004, J. Mol. Biol. 336:123949).
[092] Atividade de fixação de complemento de anticorpos (tanto ligação de Clqg como atividade de CDC) pode ser melhorada por substituições em Lys326 e Glu333 (Idusogie et al., 2001, JU. Immunol. 166:2571-2575). As mesmas substituições em uma estrutura dorsal de IgG2 humano podem converter um isotipo de anticorpo que liga fracamente a Clg e é severamente deficiente em atividade de ativação de complemento para um que pode tanto ligar Clq como mediar CDC (Idusogie et al., 2001, J. Immunol. 166:2571-75). Vários outros métodos foram também aplicados para melhorar a atividade de fixação de complemento de anticorpos. Por exemplo, o enxerto de um pedaço de cauda carboxil-terminal de 18-aminoácidos de IgM aos términos carboxila de IgG aumenta muito sua atividade de CDC. Isso é observado mesmo quando IgG4, que normalmente não tem atividade de CDC detectável (Smith et al., 1995, JU. Immunol. 154:2226-36). Também, substituindo Ser444 localizado próximo do carbóxi- terminal de cadeia pesada de IgG1 com Cys induziu dimerização cauda a cauda de IgGl com um aumento de 200 vezes de atividade de CDC sobre IgGl monomérico (Shopes et al., 1992, J. Immunol. 148:2918-22). Em adição, um constructo de diacorpo biespecífico com especificidade para Ciqg também confere atividade de CDC (Kontermann et al., 1997, Nat. Biotech. 15:629-31).
[093] Atividade de complemento pode ser reduzida mudando pelo menos um dos resíduos de aminoácido 318, 320, e 322 da cadeia pesada para um resíduo tendo uma diferente cadeia lateral, tal como Ala. Outros resíduos não iônicos substituídos por alquila, tais como Gly, Ile, Leu, ou Val, ou tais resíduos não polares aromáticos como Phe, Tyr, Trp e Pro em vez de qualquer um dos três resíduos também reduzem ou abolem ligação de Clg. Ser, Thr, Cys, e Met podem ser usados em resíduos 320 e 322, mas não 318, para reduzir ou abolir a atividade de ligação de Clq. Substituição do resíduo 318 (Glu) por um resíduo polar pode modificar, mas não abolir atividade de ligação de Clq. Substituindo resíduo 297 (Asn) com Ala resulta em remoção de atividade lítica, mas apenas levemente reduz (cerca de três vezes mais fraca) a afinidade para Clq. Essa alteração destrói o sítio de glicosilação e a presença de carboidrato que é requerida para ativação de complemento. Qualquer outra substituição nesse sítio também destrói o sítio de glicosilação. As seguintes mutações e qualquer combinação das mesmas também reduzem a ligação de Ciq: D270A, K322A, P329A, e P311S (ver WO 06/036291).
[094] Referência a uma região constante humana inclui uma região constante com qualquer alotipo natural ou qualquer permutação de resíduos ocupando posições polimórficas em alotipos naturais. Também, até 1, 2, 5, ou 10 mutações podem estar presentes relativas a uma região constante humana natural, tal como as indicadas acima para reduzir a ligação de receptor Fcgama ou aumentar ligação para FCcRN.
D. Expressão de Anticorpos recombinantes
[095] Anticorpos humanizados são tipicamente produzidos por expressão recombinante. Construtos polinucleotídicos recombinantes tipicamente incluem uma sequência de controle da expressão operativamente ligada às sequências de codificação de cadeias de anticorpo, incluindo regiões de promotor naturalmente associadas ou heterólogas. Preferivelmente, as sequências de controle de expressão são sistemas promotores eucarióticos em vetores capazes de transformar ou transfectar células hospedeiras eucarióticas. Uma vez que o vetor tenha sido incorporado no hospedeiro apropriado, o hospedeiro é mantido sob condições apropriadas para a expressão de alto nível das sequências nucleotídicas, e a coleta e purificação do anticorpo reagindo de modo cruzado.
[096] Células de mamíferos são um hospedeiro preferido para a expressão de segmentos de nucleotídeos codificando imunoglobulinas ou fragmentos das mesmas. Ver Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987). Várias linhagens de células hospedeiras adequadas, capazes de secretar proteínas heterólogas intactas, foram desenvolvidas na arte, e incluem linhagens celulares CHO (por exemplo, DG44), várias linhagens celulares COS, células Hela, células HEK293, células L, e mielomas não produzindo anticorpos, incluindo Sp2/0 e NSO. Preferivelmente, as células não são humanas. Vetores de expressão para estes células podem incluir sequências de controle da expressão, tais como uma origem de replicação, um promotor, um melhorador (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)), e sítios de informação de processamento necessários, tais como sítios de ligação de ribossomos, sítios de emenda de RNA, sítios de poliadenilação, e sequências de terminador transcripcional. As sequências de controle de expressão preferidas são promotores derivados de genes endógenos, citomegalovírus, SV40, adenovírus, vírus do papiloma bovino, e semelhantes. Ver Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992).
[097] Uma vez expressados, anticorpos podem ser purificados de acordo com procedimentos padronizados da técnica, incluindo purificação de HPLC, cromatografia de coluna, eletroforese de gel e semelhantes (ver geralmente, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)).
IV. Ácidos nucléicos
[098] A invenção ainda provê ácidos nucléicos codificando qualquer uma das cadeias pesadas e leves humanizadas acima descritas. Tipicamente, os ácidos nucléicos também codificam um peptídeo de sinal fusionado às cadeias pesadas e leves maduras. Sequências de codificação em ácidos nucléicos podem estar em ligação operável com sequências regulatórias para assegurar expressão das sequências de codificação, tal como um promotor, melhorador, sítio de ligação de ribossoma, sinal de terminação de transcrição e similares. Os ácidos nucléicos codificando cadeias pesadas e leves podem ocorrer em forma isolada ou podem ser clonados em um ou mais vetores. Os ácidos nucléicos podem ser sintetizados por, por exemplo, síntese em estado sólido ou PCR de oligonucleotídeos de sobreposição. Ácidos nucléicos codificando cadeias pesadas e leves podem ser unidos como um ácido nucléico contínuo, por exemplo, dentro de um vetor de expressão, ou podem ser separados, por exemplo, cada clonado em seu próprio vetor de expressão.
V. Conjugados anticorpo fármaco
[099] Anticorpos Anti-LIV-1 podem ser conjugados com porções citotóxicas e citoestáticas (incluindo sais farmaceuticamente compatíveis destes) para formar um conjugado anticorpo fármaco (ADC). Porções particularmente adequadas para conjugação para anticorpos são agentes citotóxicos (por exemplo, agentes quimioterapêuticos), enzimas de conversão de pró-fármacos, isótipos radioativos ou compostos, ou toxinas (estas porções sendo coletivamente referidas como um agente terapêutico). Por exemplo, um anticorpo anti-LIV-1 pode ser conjugado com um agente citotóxico tal como um agente quimioterapêutico, ou uma toxina (por exemplo, um agente citoestático ou citocida tal como, por exemplo, abrina, ricina A, exotoxina pseudomonas, ou toxina de difteria).
[100] Um anticorpo anti-LIV-1 pode ser conjugado com uma enzima de conversão de pró-fármaco. A enzima de conversão de pró-fármaco pode ser recombinantemente fusionada ao anticorpo ou quimicamente conjugada ao mesmo usando métodos conhecidos. Enzimas de conversão de pró-fármacos exemplares são carboxipeptidase G2, beta-glucuronidase, penicilina-V- amidase, penicilina-G-amidase, B-lactamase, B-glucosidase, nitroreductase e carboxipeptidase A.
[101] Técnicas para a conjugação de agentes terapêuticos para proteínas, e em particular para anticorpos, são bem conhecidas. (ver, por exemplo, Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy,” em Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy (Reisfeld et al. eds., Alan JR. Liss, Inc., 1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery,” em Controlled Drug Delivery (Robinson et al. eds., Marcel Dekker, Inc., 2nd ed. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,” em Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (Pinchera et al. eds., 1985); “Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy,” em Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy (Baldwin et al. eds., Academic Press, 1985); and Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58. Ver, também, por exemplo, publicação PCT WO 89/12624).
[102] O agente terapêutico pode ser conjugado de uma maneira que reduz a sua atividade, a menos que seja clivado o anticorpo (por exemplo, por hidrólise, por degradação do anticorpo ou por um agente de clivagem). Tal agente terapêutico é fixado ao anticorpo com um ligador clivável que é sensível a clivagem no ambiente intracelular da célula de câncer expressando LIV-1, mas não é substancialmente sensível ao ambiente extracelular, tal que o conjugado é clivado a partir do anticorpo quando ele é internalizado pela célula de câncer expressando LIV-1 (por exemplo, no endossoma ou, por exemplo, em virtude de sensibilidade a pH ou a sensibilidade a protease, no ambiente lisossomal ou no ambiente caveolear).
[103] Tipicamente o ADC compreende a região de ligador entre o agente terapêutico e o anticorpo anti-LIV-1. Como observado supra, tipicamente, o ligador é clivável sob condições intracelulares, tal que a clivagem do ligador libera o agente terapêutico a partir do anticorpo no ambiente intracelular (por exemplo, dentro de um lisossoma ou endossoma ou caveolea). O ligador pode ser, por exemplo, um ligador peptidil que é clivado por uma peptidase intracelular ou enzima protease, incluindo uma protease lisossômica ou endossômica. Tipicamente, o ligador peptidil tem pelo menos um comprimento de dois aminoácidos ou pelo menos um comprimento de três aminoácidos. Agentes de clivagem podem incluir catepsinas B e D e plasmina (ver, por exemplo, Dubowchik e Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123). Mais típicos são os ligadores peptidil que são cliváveis por enzimas que estão presentes nas células expressando LIV-1. Por exemplo, um ligador peptidil que é clivável pela protease catepsina -B dependente de tiol, que é altamente expressado em tecido canceroso, pode ser usado (por exemplo, um ligador compreendendo um Ppeptídeo Phe-Leu ou a Gly-Phe-Leu-Gly). Outros tais ligadores são descritos, por exemplo, na patente US no. 6,214,345. Em formas de realização específicas, o ligador peptidil clivável por uma protease intracelular compreende um ligador Val-Cit ou um dipeptídeo Fen-Lis (ver, por exemplo, patente US 6,214,345, que descreve a síntese de doxorrubicina com o ligador Val-Cit). Uma vantagem de usar liberação proteolítica intracelular do agente terapêutico é que o agente é tipicamente atenuado quando conjugado e as estabilidades de soro dos conjugados são tipicamente elevadas.
[104] O ligador clivável pode ser sensível a pH, isto é, sensível à hidrólise em certos valores de pH. Tipicamente, o ligador sensível a pH é hidrolisável sob condições ácidas.Por exemplo, um ligador lábil a ácido que é hidrolisável no lisossoma (por exemplo, uma hidrazona, semicarbazona, tiosemicarbazona, amida cis-aconítica, ortoéster, acetal, cetal, ou semelhantes) pode ser usado. (ver, por exemplo, patentes US nos. 5.122.368; 5.824.805; 5.622.929; Dubowchik e Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661.) Estes ligadores são relativamente estáveis sob condições de pH neutro, tais como as do sangue, mas são instáveis abaixo de pH 5,5 ou 5,0, o pH aproximado de lisossomo. Em certas formas de realização, O ligador hidrolisável é um ligador tioéter (tal como, por exemplo, um tioéter fixado ao agente terapêutico via uma ligação acilhidrazona (ver, por exemplo, Patente US No. 5.622.929)).
[105] Outros ligadores são cliváveis sob condições redutoras (por exemplo, um ligador dissulfeto). Ligadores dissulfetos incluem aqueles que podem ser formados usando SATA (N-succinimidil-S-acetiltioacetato), SPDP (N- succinimidil-3-(2- piridilditio)propionato), SPDB (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)butirato) e SMPT (N-succinimidil-oxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridil- ditio)tolueno), SPDB e SMPT. (ver, por exemplo, Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak et al., em Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (c. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987.ver também Patente US No. 4,880,935.)
[106] O ligador pode também ser um ligador malonato (Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93), um ligador maleimidobenzoila (Lau et al., 1995, Bioorg-Med- Chem. 3(10):1299-1304), ou um análogo de 3'-N-amida (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1305-12).
[107] O ligador também pode ser um ligador não clivável, tal como um ligador maleimido-alquileno ou aril-maleimida que é diretamente ligado ao agente terapêutico (por exemplo, um fármaco). Um ligador de fármaco ativo é 1iberado pela degradação do anticorpo.
[108] Tipicamente, o ligador não é substancialmente sensível ao ambiente extracelular, significando que não mais do que cerca de 20%, tipicamente não mais do que cerca de 15%, mais tipicamente não mais do que cerca de 10%, e ainda mais tipicamente não mais do que cerca de 5%, não mais do que cerca de 3%, ou não mais do que cerca de 1% dos ligadores em uma amostra de ADC são clivados quando o ADC está presente em um ambiente extracelular (por exemplo, no plasma). Se um ligador não é substancialmente sensível ao ambiente extracelular pode ser determinado, por exemplo, por incubação independentemente com plasma de tanto (a) o ADC (a “ADC amostra”) como (b) uma quantidade molar igual de anticorpo não conjugado ou um agente terapêutico (a "amostra de controle") durante um período predeterminado de tempo (por exemplo, 2, 4, 8, 16, ou 24 horas) e, então, comparando a quantidade de anticorpo não conjugado ou agente terapêutico presente na amostra de ADC com a que estã presente na amostra de controle, como medido, por exemplo, por cromatografia líquida de alta eficiência.
[109] O ligador também pode promover a internalizarão celular. O ligador pode promover internalização celular quando conjugado com o agente terapêutico (isto é, no meio da porção ligador - agente terapêutico do ADC ou derivado de ADC, como aqui descrito). Alternativamente, o ligador pode promover “internalização celular quando conjugado tanto com o agente terapêutico como com o anticorpo anti-LIV-1 (isto é, no meio do ADC tal como aqui descrito).
[110] Uma variedade de ligadores que podem ser usados com as presentes composições são descritos nos documentos WO 2004-010957 e com a fórmula
Figure img0001
onde: -A- é uma unidade esticadora; a é 0 ou 1; cada -W- é independentemente, uma unidade de aminoácido; w é independentemente, um número inteiro na faixa de 0 tol2; -Y- é uma unidade espaçadora; e y é o 1 ou 2.
[111] Unidades esticadoras representativas são representadas dentro dos colchetes de Fórmulas (Ia) e (Ib; ver infra), em que A-, -W-, -Y-, -D, w e y são como definidos acima e R1 é selecionada de -C1;-C10 alquileno-, -C3-C8 carbociclo-, -O-(C1-C8 alquil)-, -arileno-, -C1-C10 alquileno-arileno-, -arileno-C1-C10 alquileno-, -C1-C10 alquileno- (C3-C8 carbociclo)-, -(C3-C8 carbociclo)-C1-C10 alquileno-, -C3-C8 heterociclo-, -C1-C10 alquileno-(C3-C8 heterociclo)-, - (C3-C8 heterociclo)-C1-C10 alquileno-, - (CH2CH2O)r-, e -(CH2CH2O),-CH2-; e r é um número inteiro na faixa de 1-10. Ab é anticorpo.
Figure img0002
[112] A carga de fármaco é representada por p, o número das moléculas de fármaco - ligador por anticorpo. Dependendo do contexto, p pode representar o número médio das moléculas fármaco - Jligador por anticorpo, também referido a carga média de fármaco. P está na faixa de 1 a 20 e preferivelmente de 1 a 8. Em algumas formas de realização preferidas, quando p representa a carga média de fármaco, p está na faixa de cerca de 2 a cerca de 5. Em algumas formas de realização, p é cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, ou cerca de 5. O número médio de fármacos por anticorpo em uma preparação pode ser caracterizado por meios convencionais, tais como espectroscopia de massa, teste ELISA, e HPLC.
[113] A unidade de aminoácido (-W-), se presente, liga a unidade esticadora (-A-) para a unidade espaçadora (-Y-) se a unidade espaçadora estiver presente, e liga a unidade esticadora ao agente citotóxico ou citostático (unidade de fármaco; D) se a unidade espaçadora estiver ausente.
[114] Se presente, -Ww- é preferivelmente uma unidade dipeptídeo, tripeptídeo, tetrapeptídeo, pentapeptídeo, hexapeptídeo, heptapeptídeo, octapeptídeo, nonapeptídeo, decapeptídeo, undecapeptídeo ou dodecapeptídeo.
[115] A unidade espaçadora (-Y-), quando presente, liga uma unidade de aminoácido à unidade de fármaco. Unidades espaçadoras são de dois tipos gerais: auto-imolativas e não auto-imolativas. Uma unidade espaçadora não auto-imolativa é uma em que uma parte ou todas as unidades espaçadoras permanecem ligadas à unidade de fármaco depois da clivagem enzimática de uma unidade de aminoácido a partir de conjugado anticorpo anti-LIV-1-ligador - fármaco ou composto ligador de fármacos. Exemplos da unidade espaçadora não auto- imolativas incluem a unidade espaçadora (glicina-glicina) e a unidade espaçadora glicina. Quando um conjugado anticorpo anti-LIV-1- ligador-fármaco contendo uma unidade espaçadora glicina-glicina ou uma unidade espaçadora glicina sofre clivagem enzimática via uma protease associada com célula tumoral, uma protease associada com célula de câncer ou uma protease associada com linfócito, uma porção de glicina- glicina-fármaco ou uma porção de glicina-fármaco é clivada a partir de Ab-Aa-Ww-. Para liberar o fármaco, uma reação de hidrólise independente deve ocorrer dentro da célula alvo para clivar a unidade de ligação de glicina-fármaco.
[116] Alternativamente, um conjugado anticorpo anti-LIV- 1 fármaco contendo a unidade espaçadora auto-imolativa pode liberar o fármaco (D) sem a necessidade de uma etapa de hidrólise separada. Em algumas dessas formas de realização, -Y- é uma unidade álcool p-aminobenzílico (PAB) que é ligada a -Ww- via O átomo de nitrogênio do grupo PAB, e conectado diretamente ao -D via um grupo carbonato, carbamato ou éter. Outros exemplos de espaçadores auto-imolativos incluem compostos aromáticos que são eletronicamente equivalentes a grupo PAB tal como derivados 2-aminoimidazol-5-metanol (ver Hay et al., 1999, Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237 Por exemplos) e orto ou para-aminobenzil acetais. Espaçadores podem ser usados que sofrem ciclização fácil mediante hidrólise da ligação amida, tal como amidas de ácido 4- aminobutírico substituído e não substituído (Rodrigues et al., 1995, Chemistry Biology 2:223), sistemas de anel biciclo[2.2.1] e biciclo[2.2.2] apropriadamente substituídos (Storm et al., 1972, J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) e amidas de ácido 2-aminofenil propiônico (Amsberry et al., 1990, J. Org. Chem. 55:5867). Eliminação de fármacos contendo aminas que são substituídas na Q-posição de glicina (Kingsbury, et al., 1984, JJ. Med. Chem. 27:1447) são também exemplos de estratégias do espaçador auto-imolativo que podem ser aplicados aos conjugados anticorpo anti-LIV-1-ligador - fármaco. Alternativamente, a unidade espaçadora é uma unidade bis (hidróximetil)estireno ramificado (BHMS), que pode ser usada para incorporar fármacos adicionais.
[117] As classes utilizáveis de agente citotóxicos para conjugar a anticorpos anti-LIV-1 incluem, por exemplo, agentes antitubulina, agentes de ligação de sulco menor de DNA, inibidores de replicação de DNA, sensibilizadores de quimioterapia, ou semelhantes. Outras classes exemplares de agentes citotóxicos incluem antraciclinas, auristatinas, camptotecinas, duocarmicinas, etoposídeos, maitansinóides e vinca alcalóides. Alguns agentes citotóxicos exemplares incluem auristatinas (por exemplo, auristatina E, AFP, MMAF, MMAE), ligadores de sulco menor de DNA (por exemplo, enediinas e lexitropsinas), duocarmicinas, taxanos (por exemplo, paclitaxel e docetaxel), vinca alcalóides, doxorrubicina, morfolino-doxorrubicina, e cianomorfolino- doxorrubicina.
[118] O agente citotóxico pode ser um agente quimioterapêutico como, por exemplo, doxorrubicina, paclitaxel, melfalano, vinca alcalóides, o metotrexato, mitomicina C ou etoposídeo. O agente também pode ser um análogo CC-1065, caliqueamicina, maitansina, um análogo de dolastatina 10, rizoxina, ou palitoxina.
[119] O agente citotóxico também pode ser uma auristatina. A auristatina pode ser um derivado de auristatina E é, por exemplo, um éster formado entre auristatina E e um ácido ceto. Por exemplo, auristatina E pode ser reagida com ácido paraacetil hbenzóico ou ácido benzoilvalérico para produzir AEB e JAEVB, respectivamente. Outras auristatinas típicas incluem AFP, MMAF, e MMAE. A síntese e a estrutura de várias auristatinas são descritas em, por exemplo, US 2005-0238649 e US2006-0074008.
[120] O agente citotóxico pode ser um agente de ligação de sulco menor de DNA. (ver, por exemplo, patente US no. 6.130.237.) Por exemplo, o agente de ligação de sulco menor pode ser um composto CBI ou uma enediina (por exemplo, caliqueamicina).
[121] O agente citotóxico ou citostático pode ser um agente anti-tubulina. Exemplos de agentes anti-tubulina incluem taxanos (por exemplo, Taxol® (paclitaxel), Taxotere® (docetaxel), T67 (Tularik), vinca alquilóides (por exemplo, vincristina, vinblastina, vindesina, e vinorelbina), e auristatinas (por exemplo, auristatina E, AFP, MMAF, JMMAE, AEB, AEVB). (Auristatinas exemplares são mostradas abaixo nas fórmulas III-XIII. Outros agentes antitubulina adequados incluem, por exemplo, derivados de baccatina, análogos de taxano (por exemplo, epotilona A e B), nocodazol, colquicina e colcimida, estramustina, criptoficinas, cemadotina, mailtansinóide, combretastatinas, discodermolida, e eleuterobina.
Figure img0003
Figure img0004
Figure img0005
Figure img0006
[122] O agente citotóxico pode ser uma maitansinóide, outro grupo de agentes anti-tubulina. Por exemplo, um maitansinóide pode ser maitansina ou uma maitansina contendo fármaco ligador como DM-1 ou DM-4 (ImmunoGen, Inc.; ver também Chari et al., 1992, Cancer Res. 52:127-131).
[123] Exemplares conjugados anticorpo fármaco incluem conjugados anticorpo fármaco vcMMAE e mcMMAF, como a seguir, em que p e Ab são como aqui anteriormente descritos:
Figure img0007
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmos.
VI. Outros Anticorpos para LIV-1
[124] Assim como as formas humanizadas dos anticorpos BR2-14a e BR2-22a discutidos acima, outros anticorpos ligando a um domínio extracelular de LIV-i podem ser usados em algum dos métodos da invenção, particularmente o tratamento de cânceres de mama triplo-negativo. Uma coleção de anticorpos de camundongo para LIV-1 é descrita em US20080175839. Esses anticorpos incluem 1.1F10, 1.7A4, BR2- 10b, BR2-lla, BR2-13a, BR2-14a, BR2-15a, BR2-16a, BR2-17a, BR2-18a, BR2-19a, BR2-20a, BR2-21a, BR2-22a, BR2-23a, BR2- 24a, e BR2-25a, dos quais BR2-19a produzido pelo hibridoma Número de Acesso ATCC PTA-5706 ou BR2-23a produzido pelo hibridoma Número de Acesso ATCC PTA-5707 além de BR2-14a e BR2-22a são preferidos. As formas humanizadas, quiméricas ou “chapadas” desses anticorpos podem ser feitas por métodos convencionais, resumidos a seguir.
[125] Outros anticorpos para LIV-1 podem ser feitos de novo por imunização com LIV-1 ou um ou mais domínios extracelulares dos mesmos. A produção de outros anticorpos monoclonais não humanos, por exemplo, murinos, porquinho-da- índia, primata, coelho ou rato, contra um imunogene pode ser realizada como descrito por Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (CSHP NY, 1988) (incorporado por referência para, todos os fins). Este imunogene pode ser obtido a partir de uma fonte natural, por síntese de peptídeo ou por expressão recombinante.
[126] Formas humanizadas, quiméricas ou revestidas de anticorpos não humanos podem ser feitas. Metodologia geral para produzir anticorpos humanizados é descrita por Queen, US 5,530,101 e 5,585,089; Winter. US 5,225,539; Carter. US 6,407,213; Adair. US 5,859,205; e Foote, US 6,881,557). Um anticorpo quimérico é um anticorpo em que as regiões variáveis maduras de cadeia leve e pesada de um anticorpo não humano (por exemplo, um camundongo) são combinadas com regiões constantes de cadeia leve e pesada humanas. Estes anticorpos substancialmente ou completamente retém a especificidade de ligação do anticorpo de camundongo, e são cerca de dois terços de sequência humana. Um anticorpo 'chapado' é um tipo de anticorpo humanizado que retém algumas e geralmente todas as CDRs e alguns dos resíduos de arcabouço da região variável não humana de um anticorpo não humano que substitui outros resíduos de arcabouço de região variável que podem contribuir para epítopos de células B ou T, por exemplo, resíduos expostos (Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991) com resíduos a partir de posições correspondentes de uma sequência de anticorpo humano. O resultado é um anticorpo em que as CDRs são totalmente ou substancialmente a partir de um anticorpo não humano e os arcabouços da região variável do anticorpo não humano são tornados mais de tipo humano pelas substituições.
[127] Anticorpos humanos contra LIV-1 podem ser providos por uma variedade de técnicas descritas abaixo. Métodos para produzir anticorpos humanos incluem o método de trioma de Oestberg et al., Hibridoma 2:361-367 (1983); Oestberg, patente US no. 4.634.664; e Engleman et al.. patente US no. 4.634.666; uso de camundongos transgênicos incluindo genes de imunoglobulinas humanas (ver, por exemplo, Lonberg et al., WO0O93/12227 (1993); US 5,877,397, US 5,874,299, US 5,814,318, US 5,789,650, US 5,770,429, US 5,661,016, US 5,633,425, US 5,625,126, US 5,569,825, US 5,545,806, Nature 148. 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, WO 91/10741 (1991) e métodos de exibição de fagos (ver, por exemplo, Dower et al., WO 91/17271 e McCafferty et al., WO 92/01047, US 5,877,218, US 5,871,907, US 5,858,657, US 5,837,242, US 5,733,743 e US 5,565,332.
[128] Qualquer um dos anticorpos pode ser selecionado para ter a mesma ou especificidade de epítopo de sobreposição como um anticorpo exemplar, tal como o anticorpo BR2-14a, por um ensaio de ligação competitiva ou de outro modo.
VII. Aplicações Terapêuticas
[129] Os anticorpos humanizados da invenção, sozinhos ou como conjugados anticorpo LIV-1 fármaco dos mesmos, podem ser usados para tratar o câncer. Alguns desses cânceres mostram níveis detectáveis de LIV-1 medidos em qualquer uma dentre a proteína (por exemplo, por imunoensaio usando um dos anticorpos exemplificados) ou nível de mRNA. Alguns desses cânceres apresentam níveis elevados de LIV-1 em relação ao tecido não canceroso do mesmo tipo, preferivelmente do mesmo paciente. Um exemplar nível de LIV- 1 em células de câncer passíveis de tratamento é 5000-150000 moléculas LIV-1-:/ por célula, apesar de níveis mais altos ou mais baixos poderem ser tratados. Opcionalmente, um nível de LIV-1 em um câncer é medido antes de realizar o tratamento.
[130] Exemplos de cânceres associados com expressão de LIV-1 e passívels a tratamento incluem câncer de mama, câncer de próstata, câncer de ovário, câncer endometrial, cervical, fígado, gástrico, rim, e carcinomas de célula escamosa, por exemplo, bexiga, cabeça, pescoço, e pulmão), cânceres de pele, por exemplo, melanoma, carcinoma de pulmão de célula pequena ou carcinóide de pulmão. O tratamento pode ser aplicado a pacientes tendo tumores primários ou metastáticos destes tipos. O tratamento também pode ser aplicado a pacientes que são refratários a tratamentos convencionais (por exemplo, hormônios, tamoxifeno, herceptina), ou que apresentam relapso após uma resposta a tal tratamentos. Os métodos também podem ser usados nos cânceres de mama triplo- negativo. Um câncer de mama triplo-negativo é um termo de arte para um câncer faltando receptores detectáveis de estrogênio e progesterona e faltando superexpressão de HER2/neu quando coloridos com um anticorpo para qualquer um destes receptores, como descrito nos Exemplos. Coloração pode ser realizada com relação a um anticorpo de controle irrelevante e falta de expressão mostrada a partir de um nível de fundo de coloração do mesmo ou similar ao do controle dentro do erro experimental. Do mesmo modo, a falta de superexpressão é mostrada por coloração ao mesmo nível ou similar dentro do erro experimental do tecido de mama não canceroso, preferivelmente obtido a partir do mesmo paciente. Alternativamente ou adicionalmente cânceres de mama triplo nativos são caracterizados por falta de capacidade de resposta a hormônios interagindo com estes receptores, comportamento agressivo e um padrão distinto de metástase. Os anticorpos hLIV14 podem ser usados para tratar cânceres que expressam LIV-1l. Em uma forma de realização, um anticorpo hLIV1I4 é usado para tratar um indivíduo com um câncer de mama expressando LIV-1. Em outra forma de realização, um anticorpo hLIV1I4 é usado para tratar um indivíduo com um câncer de próstata expressando LIV-1. Em outra forma de realização, um anticorpo hLIVI4 é usado para tratar um indivíduo com um melanoma expressando LIV-1. Em outra forma de realização, um anticorpo hLIVI4 é usado para tratar um indivíduo com um câncer ovariano expressando LIV- 1. Em outra forma de realização, um anticorpo hLIVI4 é usado para tratar um indivíduo com um câncer endometrial expressando LIV-1. Em outra forma de realização, um anticorpo hLIV1i4 é usado para tratar um indivíduo com um câncer cervical expressando LIV-1. Em outra forma de realização, um anticorpo hLIVI4 é usado para tratar um indivíduo com um câncer de fígado expressando LIV-1. Em outra forma de realização, um anticorpo hLIVI4 é usado para tratar um indivíduo com um câncer gástrico expressando LIV-1. Em outra forma de realização, um anticorpo hLIV1I4 é usado para tratar um indivíduo com um câncer de rim expressando LIV-1. Em outra forma de realização, um anticorpo hLIVI4 é usado para tratar um indivíduo com carcinomas de célula escamosa expressando LIV-1 (por exemplo, câncer de bexiga, cabeça, pescoço e pulmão). Em outra forma de realização, um anticorpo hLIVI4 é usado para tratar um indivíduo com um câncer de mama expressando LIV-1. Em outra forma de realização, um anticorpo hLIVI4 é usado para tratar um indivíduo com um câncer de pele expressando LIV-1. Em outra forma de realização, um anticorpo hLIVI4 é usado para tratar um indivíduo com um carcinoma de pulmão de célula pequena expressando LIV-1 ou carcinóide de pulmão. Os anticorpos hLIV22 podem ser usados para tratar os cânceres que expressam LIV-1. Em uma forma de realização, um anticorpo hLIV22 é usado para tratar um indivíduo com um câncer de mama expressando LIV-1. Em outra forma de realização, um anticorpo hLIV22 é usado para tratar um indivíduo com um câncer de próstata expressando LIV-1. Em outra forma de realização, um anticorpo hLIV22 é usado para tratar um indivíduo com um melanoma expressando LIV-1. Em outra forma de realização, um anticorpo hLIV22 é usado para tratar um indivíduo com um câncer ovariano expressando LIV- 1. Em outra forma de realização, um anticorpo hLIV22 é usado para tratar um indivíduo com um câncer endometrial expressando LIV-1. Em outra forma de realização, um anticorpo hLIV22 é usado para tratar um indivíduo com um câncer cervical expressando LIV-1. Em outra forma de realização, um anticorpo hLIV22 é usado para tratar um indivíduo com um câncer de fígado expressando LIV-1. Em outra forma de realização, um anticorpo hLIV22 é usado para tratar um indivíduo com um câncer gástrico expressando LIV-1. Em outra forma de realização, um anticorpo hLIV22 é usado para tratar um indivíduo com um câncer de rim expressando LIV-1. Em outra forma de realização, um anticorpo hLIV22 é usado para tratar um indivíduo com carcinomas de célula escamosa expressando LIV-1 (por exemplo, câncer de bexiga, cabeça, pescoço e pulmão). Em outra forma de realização, um anticorpo hLIV22 é usado para tratar um indivíduo com um câncer de mama expressando LIV-1. Em outra forma de realização, um anticorpo hLIV22 é usado para tratar um indivíduo com um câncer de pele expressando LIV-1. Em outra forma de realização, um anticorpo hLIV22 é usado para tratar um indivíduo com um carcinoma de pulmão de célula pequena expressando LIV-1 ou carcinóide de pulmão. Este pedido provê a primeira descrição de que a proteína LIV-1 é expressada sobre a superfície de células de melanoma. Assim, anticorpos que ligam a LIV-1 podem ser usados para tratar pacientes que são afligido com melanomas que expressam LIV-1. Tais anticorpos incluem anticorpos aqui descritos, por exemplo, hLIV1I4 e NLIV22, mas não estão limitados aos anticorpos aqui descritos.
[131] Anticorpos humanizados, sozinhos ou como conjugados dos mesmos, são administrados em um regime eficaz significando uma dose, via de administração e frequência de administração que retarda o início, reduz a severidade, inibe outra deterioração, e/ou melhora pelo menos um sinal ou sintoma de câncer. Se um paciente já sofre de câncer, o regime pode ser referido como um regime terapeuticamente eficaz. Se o paciente está em risco elevado de câncer em relação à população em geral, mas ainda não está experimentando sintomas, o regime pode ser referido como um regime profilaticamente eficaz. Em alguns casos, a eficácia terapêutica ou a profilática podem ser observadas em um paciente individual com relação com controles históricos ou experiência passada no mesmo paciente. Em outros casos, eficácia terapêutica ou profilática pode ser demonstrada em um ensaio pré-clínico ou clínico em uma população de pacientes tratados em relação a uma população de controle de pacientes não tratados.
[132] As dosagens exemplificativas para um anticorpo monoclonal são 0,1 mg/kg a 50 mg/kg de peso corporal do paciente, mais tipicamente 1 mg/kg a 30 mg/kg, 1 mg/kg a 20 mg/kg, 1 mg/kg a 15 mg/kg, 1 mg/kg a 12 mg/kg, ou 1 mg/kg a 10 mg/kg, ou 2 mg/kg a 30 mg/kg, 2 mg/kg a 20 mg/kg, 2 mg/kg a 15 mg/kg, 2 mg/kg a 12 mg/kg, ou 2 mg/kg a 10 mg/kg, ou 3 mg/kg a 30 mg/kg, 3 mg/kg a 20 mg/kg, 3 mg/kg a 15 mg/kg, 3 mg/kg a 12 mg/kg, ou 3 mg/kg a 10 mg/kg. Dosagens exemplares para um anticorpo monoclonal ou conjugados anticorpo fármaco do mesmo são 1 mg/kg a 7,5 mg/kg, ou 2 mg/kg a 7,5 mg/kg ou 3 mg/kg a 7,5 mg/kg de peso corporal do indivíduo, ou 0,120, ou 0,5-5 mg/kg peso corporal (por exemplo, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 mg/kg) ou 10-1500 ou 200-1500 mg como uma dose fixa. Em alguns métodos, o paciente é administrado uma dose de pelo menos 1,5 mg/kg, pelo menos 2 mg/kg ou pelo menos 3 mg/k9, administrada uma vez a cada três semanas ou mais. A dosagem depende da frequência de administração, da condição do paciente e da resposta ao tratamento prévio, conforme o caso, se o tratamento é profilático ou terapêutico e se a doença é aguda ou crônica, entre outros fatores.
[133] Administração pode ser parenteral, intravenosa, oral, subcutânea, intra-arterial, intracranial, intratecal, intraperitoneal, tópica, intranasal ou intramuscular. Administração também pode ser localizada diretamente para um tumor. Administração na circulação sistêmica pela administração intravenosa ou subcutânea é preferida. Administração intravenosa pode ser, por exemplo, por infusão ao longo de um período tal como 30-90 min ou por uma única injeção de bolo.
[134] A frequência da administração depende da meia-vida do anticorpo ou conjugado na circulação, a condição do paciente e a via de administração entre outros fatores. A frequência pode ser diária, semanal, mensal, trimestral ou em intervalos irregulares, em resposta a mudanças na condição do paciente ou a progressão do câncer a ser tratado. Uma frequência exemplar para administração intravenosa é entre duas vezes por semana e trimestrais ao longo de um curso contínuo do tratamento, embora uma dosagem mais ou menos frequente também é possível. Outras frequências exemplares para administração intravenosa estão entre semanalmente ou três de cada quatro semanas ao longo de um curso de contínuo de tratamento, embora dosagem mais ou menos frequente também é possível. Para administração subcutânea, uma frequência de administração exemplar é diária a mensal, embora dosagem mais ou menos frequente também é possível.
[135] O número de doses administradas depende da natureza do câncer (por exemplo, se apresentando sintomas agudos ou crônicos) e a resposta do distúrbio ao tratamento. Para distúrbios agudos ou exacerbações agudas de uma doença crônica entre 1e 10 doses são geralmente suficientes. Por vezes, uma única dose de bolo, opcionalmente em forma dividida, é suficiente para um distúrbio agudo ou exacerbação aguda de uma doença crônica. Tratamento pode ser repetido para recorrência de um distúrbio agudo ou exacerbação aguda. Para doenças crônicas, um anticorpo pode ser administrado em intervalos regulares, por exemplo, semanal, quinzenal, mensal, trimestral, a cada seis meses durante, pelo menos, 1, 5 ou 10 anos, ou a vida toda do paciente.
[136] Composições farmacêuticas para administração parenteral são, preferivelmente, estéreis e substancialmente isotônicas e fabricadas em condições GMP. Composições farmacêuticas podem ser fornecidas na forma de dosagem unitária (isto é, uma dose para administração única). Composições farmacêuticas podem ser formuladas usando um ou mais carreadores fisiologicamente aceitáveis, diluentes, excipientes ou auxiliares. A formulação depende da via de administração escolhida. Para injeção, os anticorpos podem ser formulados em soluções aquosas, preferivelmente em tampões fisiologicamente compatíveis tais como solução de Hank, solução de Ringer ou solução salina fisiológica ou tampão acetato (para reduzir o desconforto no local da injeção). A solução pode conter agentes de formulação, tais como agentes de colocação em suspensão, estabilizantes e/ou dispersantes. Alternativamente anticorpos podem estar na forma liofilizada para reconstituição com um veículo adequado, por exemplo, água estéril isenta de pirogênio, antes do uso. A concentração de anticorpo em uma formulação líquida pode ser, por: exemplo, 1-100 mg/ml, como 10 mg/ml.
[137] Tratamento com anticorpos da invenção pode ser combinado com quimioterapia, radioterapia, tratamento com células-tronco, cirurgia e outros tratamentos eficazes contra o distúrbio a ser tratado. Classes úteis de outros fármacos que podem ser administrados com anticorpos humanizados para LIV-1 incluem, por exemplo, anticorpos para outros receptores expressados em células cancerosas, agentes antitubulina (por exemplo, auristatinas), ligadores de sulco menor de DNA, inibidores de replicação de DNA, agentes alquilantes (por exemplo, complexos de platina tal como complexos de cis-platina, mono (platina), bis (platina) e platina tri-nuclear e carboplatina), antraciclinas, antibióticos, antifolatos, antimetabólitos, sensibilizadores de quimioterapia, duotarmicinas, etoposídeos, pirimidinas fluoradas, ionóforos, lexitropsinas, nitrosouréias, platinóis, compostos de pré- formação, antimetabólitos de purina, puromicinas, sensibilizadores de radiação, esteróides, taxanos, inibidores de topoisomerase, vinca alcalóides, e semelhantes.
[138] Tratamento com o anticorpo anti-LIV-1 humanizado, opcionalmente em combinação com qualquer outro dos agentes ou regimes acima descritos sozinhos ou como conjugado anticorpo fármaco, pode aumentar a sobrevivência mediana livre de progressão ou tempo de sobrevivência geral dos pacientes com tumores (por exemplo, da mama, próstata, melanoma), especialmente quando recorrente ou refratário, por pelo menos 30% ou 40% mas preferivelmente 50%, 60% a 70% ou ainda 100% ou mais, comparado ao mesmo tratamento (por exemplo, quimioterapia) mas sem um anticorpo anti-LIV-1 sozinho ou como um conjugado. Em adição ou alternativamente, o tratamento (por exemplo, quimioterapia padrão) incluindo o anticorpo anti-LIV-1 sozinho ou como um conjugado pode aumentar a taxa de resposta completa, a taxa de resposta parcial, ou taxa de resposta objetiva (completo + parcial) de pacientes com tumores por pelo menos 30% ou 40% mas preferivelmente 50%, 60% to 70% ou ainda 100% comparado ao mesmo tratamento (por exemplo, quimioterapia), mas sem o anticorpo anti-LIV-1.
[139] Tipicamente, em uma experiência clínica (por exemplo, uma experiência fase II, fase JII/III ou fase III), os aumentos acima mencionados na sobrevivência mediana livre de progressão e/ou taxa de resposta dos pacientes tratados com terapia padrão mais o anticorpo anti-LIV-1 humanizado, em relação ao grupo de controle de pacientes recebendo terapia padrão apenas (ou placebo), são estatisticamente significativos, por exemplo, em p = nível 0,05 ou 0,01 ou ainda 0,001. As taxas de resposta completadas e parciais são determinadas por critérios objetivos comumente utilizados em experiências clínicas para câncer, por exemplo, como listados ou aceitos pelos National Cancer Institute e/ou Food and Drug Administration.
Outras Aplicações
[140] Os anticorpos anti-LIV-1 humanizados podem ser usados para detectar LIV-1 no contexto de diagnóstico clínico ou tratamento ou em pesquisa. Expressão de LIV-1 em câncer fornece uma indicação de que o câncer é passível para tratamento com os anticorpos da presente invenção. Os anticorpos também podem ser vendidos como reagentes de pesquisa vara pesquisa de laboratório visando “detectar células contendo LIV-1 e suas respostas a vários estímulos. Em tais usos, os anticorpos monoclonais podem ser rotulados com. moléculas fluorescentes, moléculas rotuladas por giro, enzimas ou radioisótopos, e podem ser fornecidos na forma de kit com todos os reagentes necessários para realizar o teste para LIV-1. Os anticorpos descritos aqui, BR2-14a, BR2-22a e versões humanizadas dos mesmos, por exemplo, hLIV1I4 e hnLIV22, podem ser usados para detectar a expressão de proteína LIV-1 e determinar se o câncer é passível para tratamento com LIV-1 ADCs. Como um exemplo, BR2-14a, BR2-22a é versões humanizadas dos mesmos, por exemplo, hLIVI4 e hLIV22, podem ser usados para detectar expressão de LIV-1 nas células de câncer de mama, células de melanoma, células de câncer cervical, ou células de câncer de próstata. Os anticorpos também podem ser usados para purificar LIV-1, por exemplo, por cromatografia de afinidade.
IX. LIV-1 macaco cinomolgo
[141] A invenção ainda provê uma sequência de aminoácidos para LIV-1 (CY LIV-1) de macacos cinomolgos a SEQ ID NO:85 com ou sem um peptídeo de sinal, que ocupa aproximadamente. resíduos 1-28 de SEQ ID NO:85, bem como ácidos nucléicos que codificam esta sequência de aminoácidos. Variantes diferindo em até 1, 2, 3, 4, Ou 5. substituições, deleções ou inserções são também incluídas desde que as variantes CY não incluam uma sequência LIV-1 humana natural. Análogo a LIV-1 humano, referência a CY-LIV- 1 significa pelo menos um domínio extracelular da proteína e, geralmente, a proteína completa que não seja um peptídeo de sinal clivável (aminoácidos 1-28). A invenção ainda provê anticorpos que se ligam especificamente a SEQ ID NO: 85 com ou sem especificamente ligação a LIV-1 humano (isto é, ligação a LIV-1 humano a nível de anticorpo irrelevante de controle negativo) . A invenção ainda provê anticorpos que preferivelmente ligam CY-LIV-1 mais LIV-1 humano e vice versa. Ligação preferencial significa uma associação maior além do erro experimental e preferivelmente pelo menos 2, 3 ou 4 vezes maior. A invenção ainda provê anticorpos que mostram o mesmo perfil de ligação para LIV-1 humano e CY dentro do erro experimental como de qualquer um dos anticorpos exemplificados descritos abaixo. A invenção ainda provê métodos de análise de ligação de um anticorpo a LIV- 1CY. Tais métodos envolvem o contato de um anticorpo com LIV-1 CY, determinando se o anticorpo especificamente liga a LIV-1 CY e, opcionalmente, a determinação de uma medição da resistência da ligação, como uma constante de associação.
[142] Todos os pedidos de patentes, sites da web, outras publicações, números de acesso e similares citados acima ou abaixo são aqui incorporados por referência na sua totalidade para todos os fins na mesma medida como se cada item individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser assim incorporado por referência. Se versões diferentes de uma sequência estão associadas com um número de acesso em tempos diferentes, a versão associada com o número de acesso na data do depósito efetivo do pedido é considerada. A data efetiva de depósito significa o início da data de depósito real ou data de depósito de um pedido de prioridade com referência ao número de acesso, se aplicável. Do mesmo modo, se versões diferentes de uma publicação, site ou similares forem publicadas em tempos diferentes, a versão mais recentemente publicada na data de depósito eficaz do pedido é considerada, salvo indicação em contrário. Qualquer recurso, etapa, elemento, forma de realização, ou aspecto da invenção pode ser usado em combinação com qualquer outro, a menos que especificamente indicado em contrário. Apesar de a presente invenção ter sido descrita em detalhes por meio de ilustração e exemplo para fins de clareza e compreensão, será evidente que certas mudanças e modificações podem ser praticadas dentro do âmbito das reivindicações anexas.
EXEMPLOS 1. Humanização de BR2-l4a Materiais
[143] Linhagens celulares descritas nos exemplos seguintes foram mantidas em cultura de acordo com as condições especificadas pela American Type Culture Collection (ATCC), o National Cancer Institute (NCI) ou o Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemanha (DMSZ). Reagentes de cultura de células foram obtidos a partir de Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA.) ou outros fornecedores.
Metodologias: Ensaios de ligação de saturação
[144] 1x106 células expressando antígenos, (ou células MCF7 (ATCC) expressando LIV-1 humano, linhagem de células CHO transfectadas expressando LIV-1 humano ou linhagem de células CHO transfectadas expressando cyno LIV-1) foram divididas em alíquotas por cavidade de placas de fundo em v de 96-cavidades. LIV-1 mAb murino rotulado AlexaFluor-647, por exemplo, BR2-14a, foi adicionado em concentrações que variam de 0,66 pM a 690 nM e incubado em gelo durante 30 minutos. Células foram sedimentadas e lavadas 3X com PBS/BSA. As células foram então sedimentadas e recolocadas em suspensão em 125 uL de PBS/BSA. Fluorescência foi analisada por citometria de fluxo, usando porcentagem de sinal fluorescente saturado para determinar porcentagem de ligado e para calcular subsequentemente Kd aparente.
Ensaios de ligação de competição
[145] 1x10° células CHO expressando LIV-1 humano recombinante em PBS/BSA foram divididas em alíquotas para cada cavidade de uma placa de fundo v de 96 cavidades em gelo. As células foram incubadas durante 1 hora com 5 nM LIV-1 mAb murino parental Rotulado AlexaFluor-647 (AP) e concentrações crescentes (de 0,038 nM a 600 nM) de LIV-1 mAb humanizado não rotulado, combinações de LA-LF de cadeias leves humanizadas e HA-HE de cadeias pesadas humanizadas. Células foram sedimentadas e lavadas 3 vezes com PBS/BSA. As células foram sedimentadas e recolocadas em suspensão em 125 uL de PBS/BSA. Fluorescência foi analisada por citometria de fluxo, usando porcentagem de sinal fluorescente saturado para determinar a percentagem LIV-1 mAb murino rotulado ligado e para subsequentemente extrapolar o EC5SO ajustando os dados a uma curva de resposta a dose sigmoidal com declive variável.
[146] 1x106 células MCF7 expressando LIV-1 em PBS/BSA foram divididas em alíquotas em cada cavidade de uma placa de fundo v de 96 cavidades em gelo. As células foram incubadas durante 1 hora com 5 nM LIV-1 mAb murino rotulado AlexaFluor-647 e concentrações crescentes (de 0,038 nM a 600 nM) de LIV-1 mAb humanizado não rotulado, combinações de LA- LF de cadeias leves humanizadas e HA-HE de cadeias pesadas humanizadas . Células foram sedimentadas e lavadas 3 vezes com PBS. As células foram sedimentadas e recolocadas em suspensão em 125 uL de PBS/BSA. Fluorescência foi analisada por citometria de fluxo, usando porcentagem de sinal fluorescente saturado para determinar a percentagem LIV-1 mAb murino rotulado ligado e para subsequentemente extrapolar o EC50 ajustando os dados a uma curva resposta a dose sigmoidal com declive variável.
[147] 1x106 células CHO expressando LIV-1 cyno recombinante em PBS foram divididas em alíquotas em cada cavidade de uma placa de fundo v de 96 cavidades em gelo. As células foram incubadas durante 1 hora com 5 nM LIV-1 mAb murino rotulado AlexaFluor-647 e concentrações crescentes (de 0,038 nM a 600 nM) de LIV-1 mAb humanizado não rotulado, combinações de LA-LF de cadeias leves humanizadas e HA-HE de cadeias pesadas humanizadas. Células foram sedimentadas e lavadas 3 vezes com PBS. As células foram sedimentadas e recolocadas em suspensão em 125 uL de PBS/BSA. Fluorescência foi analisada por citometria de fluxo, usando porcentagem de sinal fluorescente saturado para determinar a percentagem e LIV-1 mAb murino rotulado ligado e para subsequentemente extrapolar o EC50 ajustando os dados a uma curva de resposta a dose sigmoidal com declive variável.
Análise por citometria de fluxo quantitativa
[148] Quantificação de número de cópias de LIV-1 nas superfícies das células foi determinada usando LIV-1 maAb murino como anticorpo primário e o ensaio de citometria de fluxo indireta DAKO QiFikit como descrito pelo fabricante (DAKO A/S, Glostrup, Dinamarca) e avaliadas com um citômetro de fluxo Becton Dickinson FACS®can.
Ensaio de citotoxicidade
[149] Células de tumor foram incubadas com conjugados LIV-1 anticorpo fármaco durante 96-144 horas a 37°C. Um ADC não ligador (H0O0) foi usado como um controle negativo. A viabilidade celular foi medida por resazurina (Sigma) na concentração final de 50 uM. Células foram incubadas durante quatro a seis horas a 37°. O sinal fluorescente foi medido em uma leitora de placas fluorescentes Fusion HT (Perkin Elmer, Waltham, Ma). Os resultados são reportados como IC50, a concentração do composto necessária para produzir uma redução de 50% na viabilidade comparada com células tratadas com veículo (controle = 100%).
Produção de conjugados anticorpo fármaco
[150] Conjugados anticorpo fármaco de anticorpos LIV-1 foram preparados como descrito em US20050238649. Os ligadores de fármaco VCMMAE (também referido como 1006) e mcMMAF (referido como 1269) são ambos descritos em US20050238649. preparação de mutantes de cisteína do anticorpos IgGl é geralmente descrita em US20100158919. US20050238649 e US20100158919, aqui incorporados por referência para todos os fins.
Produção de mAb anti-LIV-1 não-fucosilado
[151] A linhagem de células CHO DG44 produzindo o anticorpo monoclonal anti-LIV-1 de IgGlhumanizado, HBLB mAb (hLIV-14), foi cultivada em 3,0 x 105 células por mL em 30 mL de meios de cultura de CHO em 37°, 5% CO, e agitação a 100 RPM em um frasco de agitação de 125 mL. O meio foi suplementado com fator de crescimento semelhante à insulina (IGF), penicilina, estreptomicina e 65 uM 2-fluorofucose peracetato (SGD-2084) (ver US20090317869). As culturas foram alimentadas no dia 3, com 2% de volume de meios de alimentação. No dia quatro, a cultura foi dividida 1:04 em meio de cultura fresco. As culturas foram alimentadas com um volume 6% dos meios de alimentação de produção nos dias 5, 7, 9 e 10. O meio condicionado foi coletado no dia 13, passando a cultura através de um filtro de 0,2 um. A purificação do anticorpo foi realizada aplicando os meios condicionados para uma coluna pré-equilibrada de proteína A com solução salina tamponada com fosfato 1X (PBS), pH 7,4.
[152] Após lavagem da coluna com 20 volumes de coluna 1X PBS, anticorpos foram eluídos com 5 volumes de coluna de tampão de eluição de IgG ImmunoPure (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Um volume de 10% de 1M Tris pH 8,0 foi adicionado à fração eluída. Amostra foi dialisada durante a noite em 1x PBS.
Citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC)
[153] A atividade de ADCC foi medida usando teste de liberação de 52Cr padrão. Brevemente, as células de tumor alvo MCF-7 foram rotuladas com 100 uCl Na52CrO4, lavadas, e pre-incubadas com os anticorpos de teste antes da adição das células efetoras (exterminadoras naturais NK). As células NK (CD16+ CD56+) foram preparadas a partir de células mononucleares não aderentes de sangue periférico (PBMCS) obtidas a partir de doadores FcyRIIIA 158V/V (Lifeblood, Memphis, IN) com contas imunomagnéticas (EasySep, StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canadá). As células viáveis NK foram adicionadas nas células alvo a uma relação de célula efetora para célula alvo de 10:1. Um IgGlkx humano (Ancell, Bayport, MN) foi utilizado como controle negativo neste ensaio. Após 4 horas de incubação, os sobrenadantes foram coletados e secados durante a noite em placas Luma. A radiação gama emitida por células MCF-7 lisadas foi então detectada usando o contador de cintilação e luminescência de microplaca TopCount (Perkin Elmer, Waltham, Massachusetts). A atividade de ADCC é relatada como % de lise específica.
Estudo de atividade In Vivo
[154] Camundongos Nude (nu/nu) (7-8 animais/grupo) foram implantados com células de tumor cultivadas em cultura: MCF- 7 de NCI (5x106 células em 25% matrigel), PC3 de ATCC (2,5 x 106 células em 25% matrigel), e PC3 de DSMZ (5 x 106 em 25% matrigel). Para o crescimento in vivo de células MCF-7, camundongos fêmeas também receberam suplementação de estrogênio através do implante de um grânulo de estrogênio de liberação lenta (90 dias de liberação). A dosagem com LIV-1 ADC humanizado ou quimérico, ou ADC controle de não ligação (3 mg/kg) começou quando os tumores alcançaram 100 mm3 (q4d x 4 injeções intraperitoneais). Volumes tumorais foram monitorados usando calibres e animais foram sacrificados quando volume do tumor alcançou -800 mm3. Os gráficos de volume de tumor medianos foram continuados para cada grupo até um ou mais animais serem submetidos a eutanásia. Todos os procedimentos com animais foram realizados sob um protocolo aprovado pelo Institutional Animal Care and Use Committee em uma instalação certificada pela Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care.
Coloração imunohistoquímica de LIV-1 (IHC) Método
[155] Microarranjos de tumor (TMAs) e amostras individuais de tumor foram obtidos a partir de fontes comerciais. Microarranjos de tecidos a partir de tecidos normais ou de tumor fixados em formalina e incrustados em parafina (FFPE) foram adquiridos a partir Us Biomax Inc. ou Cybrdi. Um arranjo congelado foi adquirido de BioChain. Seções individuais foram adquiridas de NDRI, Asterand, solução de tecido ou CHTN. Um conjunto de 25 amostras de câncer de próstata refratário a hormônio metastático incrustadas em parafina (sítios metastáticos de tecido mole e osso correspondentes) foi fornecido por Dr. R. Vessella, University of Washington, Genitourinary (Cancer Department.Todas as amostras foram processadas em dispositivo auto- colorante Bond-Max" (Leica).
Coloração IHC de tecidos FFPE:
[156] Lâminas de FFPE ou TMAS seccionados em lâminas de vidro foram desparafinizados usando solução de Bond Dewax (Leica, # cat AR9222) a 72°C e reidratadas. A recuperação do antígeno foi realizada usando solução de recuperação de epítopo Bond com base em EDTA (Leica, # cat AR9640) durante 20 min a 95-100°C antes da incubação com o LIV-1 mAb murino primário (1-2 ug/ml durante 30 -45 minutos a 25°C). Ig6G1 murino correspondendo com isotipo (Sigma; # cat M5284) foi usado como controle negativo para a coloração de fundo. Para a coloração IHC automatizada, os requerentes usaram ou um kit Refine DAB ou um kit de detecção com base em fosfatasae alcalina: Bond Polymer AP Red Detection kit (Leica, # cat. DS9305). As lâminas foram incubadas com anticorpos primários monoclonais de murinos contra LIV-1 mAb murino durante 45 min al ug/ml com um bloco de proteína de 30 min preliminar (DAKO cat FX0909). Após a revelação do cromogênio, as seções foram contra-coloridas com hematoxilina e tampadas . As laminas foram avaliadas e classificadas por um patologista e as imagens foram tomadas usando um microscópio Zeiss Axiovert 200M (Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY).
IHC de tecidos congelados:
[157] Seções de 5 um de amostras congeladas /OCT foram fixadas com acetona durante 10 min., secadas ao ar durante 30 min, e prétratadas 20 min com 1xMorphosave a temperatura ambiente. As laminas foram carregas em auto-colorante Bond-Max” (Leica) e coloridas durante 45 min com anticorpo primário com bloco de proteína preliminar 30 min (DAKO catf X0909). IgGl1 camundongo (BD Pharmingen cat H550878) foi usado como controle negativo. Para a detecção, os requerentes usaram DAB-based Bond Polymer Refine kit (Leica, # cat. DS9800). Após a revelação do cromogênio, as seções foram contra-coloridas com hematoxilina e tampadas. As laminas foram avaliadas e classificadas por um patologista.
Resultados 1. Ligação de anticorpo de camundongo
[158] O Kp para anticorpo monoclonal LIV-1 murino anticorpo BR2-14a (US2004141983) foi determinado para LIV- 1 humano expressado como uma proteína endógena em uma linhagem de células de câncer de mama humano ou como uma proteína recombinante em uma linhagem de células CHO. O XK para anticorpo LIV-1 murino BR2-14a foi também determinado para cyno LIV-1 expressado como uma proteína recombinante em uma linhagem de células CHO. MCF7 é uma linhagem de células de câncer de mama humano. 293F é uma linhagem de células de rim embriônico humano. Tabela 1 mostra que o anticorpo tem cerca de uma constante de dissociação 5 vezes menor para LIV-1 não recombinante expressado a partir de uma linhagem de células humana do que LIV-1 recombinante, seja humana (hLIV-1) ou de macacos cinomolgos (cyLIV-1).Tabela 1
Figure img0008
2. Projeto e teste de anticorpos humanizados
[159] O ponto de partida ou anticorpo doador para humanização neste Exemplo é o anticorpo de camundongo BR2- 14a produzido pelo hibridoma tendo ATCC Número de Acesso PTA-5705A e descrito em US2004141983. As sequências humanas aceitadoras apropriadas são sequências genômicas fornecidas por VH1-02 e JH5S para cadeia pesada e por VK2-30 e Jk4 para cadeia leve. As sequências humanas aceitadoras mostram uma porcentagem de 68 e 85 de identidade para as sequências doadoras nos arcabouços de região variável. As CDRs de cadeia leve das sequência aceitadoras humanas são do mesmo tipo canônico que as CDRs das sequências doadoras. Em contraste, as CDRs de cadeia pesada das sequências humanas aceitadoras diferiram em seu tipo canônico (a linhagem germinal foi 1-3 versus 1-2 para o doador murino).
[160] O alinhamento das sequências doadoras identificou onze posições na cadeia pesada (H27,H28, H29, H30, H48, H66, H67, H71, H76, H93 e H94) e cinco posições na cadeia leve (L36, L37, L45, 146 e L39) em que a sequência aceitadora humana diferiu a partir da sequência doadora e que pode afetar a ligação do anticorpo como um resultado de contatar o antígeno diretamente, afetando a conformação de CDRs ou afetando a compactação entre as cadeias pesadas e leves. Cinco cadeias pesadas humanizadas e seis cadeias leves humanizadas foram feitas incorporando retromutações em diferentes permutações destas posições (Figura 1 (alinhamento de sequência) e Tabela 2).Tabela 2: Retromutações
Figure img0009
Figure img0010
[161] Anticorpos humanizados foram então expressados representando | cada permutação destas cadeias (30 possibilidades) das cadeias pesadas e leves humanizadas. As curvas de ligação para LIV-1 humano recombinante expressado a partir de células CHO são apresentadas na Figura 2. Os EC50's são resumidos na Tabela 3 abaixo.Tabela 3: ECsos para anticorpos LIV-1 mAb humanizados, derivados de BR2-14a, em LIV-1 humano expressado em células CHO
Figure img0011
Figure img0012
Figure img0013
DNB significa “não ligou”
[162] Estes dados indicam uma variação considerável de EC50 entre os 30 anticorpos humanizados testados com HBLB e HELE mostrando uma melhor ligação de pelo menos duas vezes que o próximo HBLF anticorpo humanizado e margens maiores sobre a maior parte dos anticorpos humanizados. As curvas de ligação da Figura 2 mostram que tanto HBLB como HELE tinham ligação mais forte que o anticorpo camundongo original.
[163] O anticorpo HBLB foi selecionado como o melhor dos anticorpos humanizados porque tem (juntamente com HELE) a ligação mais forte, mas tem menos retromutações contra HELE, havendo quatro retromutações em HBLB e doze em HELE.
[164] Os EC50s para o LIV-1 mAb humanizado que ligam LIV-1 humano expressado sobre células CHO foram determinados para LIV-1 humano expressado como uma proteína nativa em linhagem “de células MCF7 (Figura 3). Novamente, HBLB e HELE de LIV-1mAb foram determinados como sendo os ligadores mais firmes.
[165] O Kd para HBLB para LIV-1 humano sobre a linhagem de células MCF7 foi determinado a partir da média das várias curvas de ligação de saturação como 1,5 nM enquanto que a para o anticorpo de camundongo é 2,9 nM. Em outras palavras, o anticorpo HBLB tinha cerca de duas vezes a afinidade para LIV-1 humano nativo como o anticorpo de camundongo. A curva de ligação de saturação mostrada na Figura 4 é um exemplo representativo.
[166] Duas formas do HBLB foram comparadas para a ligação de um LIV-1 humano recombinantemente expressado a partir de células CHO. Uma forma foi expressada com IgGl humano tipo selvagem e regiões kappa constantes. A outra forma foi igual exceto por uma mutação S239C (numeração EU) na cadeia pesada de IgGl (referida como LIV-14d ou HBLB S239C), que reduz a ligação do anticorpo para os receptores Fc gama. As curvas de ligação e EC50's desses anticorpos comparados com o anticorpo doador de camundongo são apresentados na Figura 5. Os EC50's de ambas as formas de HBLB foram similares um ao outro (dentro do erro do estudo) e ambos foram mais fortes do que o anticorpo de camundongo.
[167] Os EC50s para os LIV-1 mAb humanizados HBLB e HBLB S239C também foram determinados para cyno LIV-1 expressado como uma proteína recombinante em uma linhagem de células CHO. Ambos os anticorpos ligaram com afinidade igual (melhor do que LIV-1 mAb murino).
Dados de expressão para LIV-1
[168] LIV-1 mAbs murino (pelo menos 2 para concordância) foram usados para a análise imunohistoquímica de vários tipos de tumor usando tecidos fixados com formalina e incrustados em parafina.Tabela 4: Resumo dos dados de expressão para LIV-1 em amostras de tumors
Figure img0014
Figure img0015
[169] Os requerentes observaram uma menor positividade para LIV-1 IHC em estudos feitos usando microarranjos de tecido comparados com seções de tecido grandes. A diferença na expressão é altamente significante sugerindo que a análise da expressão de LIV-1 em seções de tecido maiores preferida. Foi notada uma boa concordância de expressão usando pelo menos 2 mAbs anti-LIV-1 diferentes. Figuras 6 e 7 mostram um nível alto de expressão de LIV-1 em tumores de mama e próstata pós- tratados com hormônios (tamoxifeno ou inibidores de aromatase) provendo uma base para razões para alvo-marcar estes tumores usando LIV-1 ADC. Figura 8 mostra expressão de LIV-1 detectável em tecidos de câncer de mama triplo negativos (ER-, PgR-, Her2-). O nível de expressão de LIV-1 em câncer de mama triplo-negativo por coloração imunohistoquímica foi comparável com o nível do modelo de animal PC3, em que os requerentes demonstraram atividade anti-tumoral de LIV-1 ADC. Cânceres de mama triplo-negativos são assim uma população alvo potencial, particularmente cânceres de mama triplo-negativos que foram verificados como expressando LIV-1.
[170] Atividade anti-tumor in vitro de hLIV-14 mAb como ADC e mAb com função efetora melhorada (SEA)
[171] Atividade anti-tumoral de LIV-1 ADCs in vitro foi medida usando ambos tos testes de citotoxicidade (Figura 9) e citotoxicidade de células dependente de anticorpo (ADCC) (Figuras 10 e 11). Primeiro, os requerentes realizaram uma pesquisa de expressão de LIV-1 em várias linhagens celulares por análise FACS quantitativa. A linhagem de células de câncer de mama MCF-7 de ATCC tinha o maior nível de sítios de ligação de LIV-1 célula, como comparado com a linhagem de células MCF-7 a partir de outras fontes (dados não apresentados). Os requerentes usaram esta linhagem de célula para ambos os testes in vitro. Com referência à figura 9, vários hLIV-14 ADCs (o anticorpo HBLB conjugado com vcMMAE (referido como 1006) ou mcMMAF (referido como 1269) (ambos moléculas pequenas e/ou ligadores descritos em US20050238649)) foram altamente eficazes para matar as células MCF-7, como comparado com os conjugados de não ligação e de controle murinos (mIgG-1006, mIgG-1269, hIgG- 1006 e hIgG-1269). Em adição, LIV-l14d ADCs mutantes de cisteína, tendo uma média de dois ligadores de fármaco por anticorpo também foram altamente eficazes para exterminar as células MCF-7 tal como medido pelo ensaio citotóxico. Com referência às Figuras 10 e 11, em ensaios ADCC, as atividades de mAb e ADCs fucosilados/tipo selvagem (WT) foram comparadas com as versões melhoradas de função efetora (mAbs e ADCs não fucosilados, referidos como SEA). Os resultados demonstraram que a função efetora melhorou LIV-1 mAbs e ADCs tem uma boa atividade ADCC contra células MCF-7, como comparada com mAbs ou ADCs não melhorados em função efetora (comparar, por exemplo, Figura 10 hLIV-1 SEA vcMMAE com hLIV-1 vcMMAE). Com referência novamente à Figura 9, um LIV-1 ADC melhorado em função efetora (indicado como SEA) também tem um nível similar de atividade citotóxica como ADCs de tipo selvagem (não fucosilado) (comparar hLIV-1 SEA 1006 (vcMMAE) com hLIV- 1 1006 (vcMMAE)). Assim citotoxicidade pode ser afetada tanto pela função efetora como por ação conjugada.
Atividade anti-tumor in vivo de hLIV-14 ADC
[172] Usando modelos de câncer de mama (MCF-7) e câncer de próstata (PC-3), determinou-se a atividade anti-tumoral de LIV-1 ADCs (mAbs quimérico e humanizado (HBLB) com uma média de 4 fármacos por anticorpo) in vivo (Figuras 12-15). LIV-1 ADCs conjugados com vVCMMAE apresentaram um retardo significativo do tumor em comparação com o controle não tratado e ADCs. Pelo menos uma regressão completa (CR) foi observada em todos os estudos que utilizam LIV-1-vcMMAE a 3 mg / kg, com vários animais com tumores que eram estáticos ou cresceram lentamente, em comparação com os controles. Com referência à figura 12, uma forma quimérica do anticorpo parental murino conjugado com vcMMAE resultou em regressões completas em 3 de 7 camundongos. Com referência à figura 13, o mesmo ADC quimérico produziu uma regressão completa em 1 de 8 camundongos. Com referência à figura 14, um ADC humanizado (HBLB) conjugado com VCMMAE (nLIV-14-vcMMAE (4)) produziu uma regressão completa em 1 de 8 camundongos. Além disso, uma forma mutante de cisteína do anticorpo HBLB, um ligador vcMMAE fármaco conjugado com cada cadeia pesada em posição 239, produzindo um conjugado com uma carga média de fármaco de dois ligadores de fármaco por anticorpo; designado hLIV- 14d-vcMMAE (2)) exibiram uma atividade similar à da forma 4- carregada. Com referência à figura 15, o ADC humanizado (HBLB) conjugado com vcMMAE (hLIV-14-vcMMAE (4)) produziu uma regressão completa em 1 de 8 camundongos em um modelo de carcinoma da próstata. Em contraste, a atividade dos dois mutantes de cisteína carregados não foi tão pronunciada neste modelo (comparar hLIV-14-vcMMAE (4) com hLIV-14d-vcMMAE (2), e hLIV-14-mcMMAF (4) com hLIV-14d- mcMMAF (2). Em resumo, estes estudos demonstram que LIV-1 ADC pode parar ou retardar o crescimento de cânceres expressando LIV-1 incluindo câncer de mama e de próstata.
Humanização de BR2-22a
[173] BR2-22a, por vezes, também referido como mAb2, é um anticorpo monoclonal camundongo de isotipo IgG1 Kappa.
Metodologias:
[174] A menos que indicado de outra forma a seguir, os métodos descritos para a humanização e teste de BR2-14a são também aplicáveis aos BR2-22.
Ensaios de ligação de saturação
[175] 1 x 105 células expressando antígenos (ou células MCF7 expressando LIV-1 humano, células 293F, uma linhagem de células CHO transfectada expressando LIV-1 humano ou uma linhagem de células CHO transfectadas expressando cyno LIV- 1) foram divididas em alíquotas por cavidade de uma placas de 96 poços de fundo em V. BR2-22a murino rotulado AlexaFluor-647 foi adicionado em concentrações que variam a partir de 0,66 pM a 690 nM e incubadas em gelo durante 30 minutos. Células foram sedimentadas e lavadas 3X com PBS/BSA. As células foram então sedimentadas e recolocadas em suspensão em 125 uL de PBS/BSA. A fluorescência foi analisada por citometria de fluxo, usando uma porcentagem de sinal fluorescente saturado para determinar a porcentagem de ligado e para calcular subsequentemente Kd aparente.
Ensaios de ligação de competição
[176] 1 x105 células CHO expressando LIV-1 recombinante em PBS foram divididas em alíquotas para cada cavidade de uma placa de fundo v de 96 cavidades em gelo. As células foram incubadas durante 1 hora com 5 nM (AF) BR2-22a parental rotulado AlexaFluor-647 e concentrações crescentes (de 0,038 nM a 600 nM) de anticorpo BR2-22a não rotulado humanizado em todas as combinações de cadeias leves LA-LG humanizadas e cadeia pesadas HA-HG humanizadas. Células foram sedimentadas e lavadas 3 vezes com PBS. As células foram então sedimentadas e recolocadas em suspensão em 125 uL de PBS/BSA. Fluorescência foi analisada por citometria de fluxo, usando porcentagem de sinal fluorescente saturado para determinar a percentagem de anticorpo BR2-22a humanizado rotulado ligado e para subsequentemente extrapolar o EC50 ajustando os dados a uma curva de resposta a dose sigmoidal com declive variável.
Estudo de atividade in vivo
[177] Camundongos Nude (nu/nu) (7-8 animais/grupo) foram implantados com células de tumor cultivadas em cultura: MCF-7 (NCI) a 5x106 em 25% matrigel, PC3 de ATCC (2,5x 106 células em 25% matrigel), e PC3 de DSMZ (5 x 105 em 25% matrigel). Para o crescimento “in vivo de células MCF-7, camundongos fêmeas também receberam suplementação com estrogênio por implante de um grânulo de estrogênio de liberação lenta (90 dias de liberação). A dosagem com LIV-1 ADC quimérico ou humanizado ou ADC de controle não ligação (3 mg/kg) foi iniciada quando os tumores alcançaram 100 mm3 (q4d x 4 injeções intraperitoneais). Os volumes de tumor foram monitorados usando compassos e os e animais foram submetidos a eutanásia quando o volume do tumor alcançou - 800 mm3. Parcelas de volume do tumor mediana foram continuados para cada grupo até que um ou mais animais foram sacrificados. Todos os procedimentos com os animais foram realizados sob um protocolo aprovado pela Institutional Animal Care and Use Committee em uma instalação credenciada pela Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care.
Resumo dos resultados e discussão Ligação de saturação
[178] BR2-22a mostra 94% de identidade para BR2-14a em uma região variável de cadeia pesada madura e 91% de identidade em uma região variável de cadeia leve madura. O KD para o Livl murino de BR2-22a (Tabela 5) foi determinado para LIV-1 humano expressado como uma proteína endógena em uma linhagem de células de câncer de mama humano, em células 293F ou como uma proteína recombinante em uma linhagem de células CHO. O KD para BR2-22a foi também determinado para LIV-1 cyno expressado como uma proteína recombinante em uma linhagem de células CHO.Tabela 5: Medições de afinidade de BR2-22a para (nLIV-1) humano e LIV-1 (cyLIV-1 cyno).
Figure img0016
Figure img0017
Estratégia de humanização
[179] O anticorpo BR2-22a foi humanizado usando uma sequência aceitadora de linha germinal VH1-02 JH5S para cadeia pesada e uma sequência aceitadora VK2-30 JK4 para cadeia leve. Estas sequências aceitadoras foram escolhidas com base em terem a maior identidade de sequência para os arcabouços de regiões variáveis maduras de cadeias pesadas e leves BR2-22A. Inicialmente, cinco cadeias pesadas variantes foram construídas. Cada incluía as três CDRs de Kabat a partir de cadeia pesada de BR2-22a, as cadeias deferindo ao terem de zero (VA) a 11 (VE) retromutações. Inicialmente, seis cadeias leves variantes foram construídas. Cada incluía três CDRs de Kabat a partir de cadeia leve de BR2-22a e de zero (LA) a quatro retromutações (LF). Estas retromutações foram escolhidas como um resultado da modelagem do anticorpo BR2-22A para identificar as posições com potencial para interagir com o antígeno diretamente, efetuar a conformação de CDR ou efetuar a interface entre cadeias pesadas e leves e com base na experiência anterior na humanização de BR2-14a devido à elevada identidade de sequência entre BR2-14a e BR2-22A. De fato, as mesmas onze posições na: cadeia pesada e as mesmas quatro posições na cadeia leve foram consideradas para retromutações em ambos BR2-14a e BR2-22a (L39 não foi considerado em BR2-22a devido ao resíduo de camundongo ser o mesmo que o resíduo humano). As retromutações presentes em cada variante de BR2-22a humanizado são mostradas em Tabelas 6 e 7 abaixo.Tabela 6
Figure img0018
Tabela 7
Figure img0019
[180] A sequência completa da região variável madura de cada variante é mostrada nas Figuras 16A e 16B.
[181] Todas as permutações destas cinco cadeias pesadas e seis cadeias leves foram então testadas em um ensaio de competição comparado com BR2-22a (ver Figura 17). Surpreendentemente, em vista da experiência com o anticorpo BR2-14a em que uma melhorada ligação com relação ao anticorpo de camundongo foi obtida com somente . quatro retromutações e outras retromutações não melhoram necessariamente a afinidade de ligação, a única combinação de cadeias humanizadas que mostrou afinidade de ligação se aproximando da de BR2-22a foi HELF com 15 retromutações. As outras permutações mostraram uma fraca ou nenhuma ligação significante para LIV-1. Os EC5S0s das diferentes permutações são mostrado em Tabela 8 abaixo.Tabela 8: EC50s para anticorpos BR2-22a humanizados
Figure img0020
Figure img0021
DNB significa não se ligaram
[182] Apesar de HELF mostrar uma ligação satisfatória, o anticorpo contém um total de 15 retromutações, um número acima do ideal com relação à imunogenicidade potencial. Assim, as cadeias HE e LF foram sistematicamente variadas para testar o efeito de remoção de retromutações individuais. A Figura 18 mostra as variantes testadas. LF-1 a LF-4 diferem de LF em cada faltando uma diferente retromutação presente em LF. Similarmente, HE-1 a HE-11 faltam uma das retromutações presentes em HE. Figura 19 compara LF-1 a LF- 4 (cada uma em par com HE). Figura 19 mostra que LF-2 e LF- 3 perdem afinidade de ligação substancial relativa a LF (indicado como controle histórico de HELF no gráfico), enquanto LF-1 e LF-4 não perdem. Deve ser concluído que as retromutações L36 e L46 contribuem substancialmente para a retenção da afinidade de ligação, enquanto as retromutações nas posições L37 e L45 podem ser dispensadas sem efeito significativo sobre a ligação. Figura 20 mostra curvas de ligação similares para as variantes HE. Figura 20 mostra que HE-11 perdeu a maior parte da sua ligação indicando que a retromutação na posição H94 tem o maior efeito sobre afinidade de ligação das retromutações testadas. Perda de retromutações nas posições 027, H29 e H30 também causou perda significativa de afinidade. O papel de H30 pode ser racionalizado pelo resíduo de camundongo sendo o resultado de uma mutação somática. A perda de uma retromutação na posição H76 causou alguma perda de afinidade. As outras retromutações nas posições H28, H48, H66, H67, H71 e H93 podem ser dispensada com pouco ou nenhum efeito na afinidade de ligação.
[183] À luz destas experiências, HF e HG de cadeias pesadas foram construídos assim como LG de cadeia leve. HF incluía retromutações em H27, H29, H30 e H94 e HG incluía estas mutações e uma retromutação em H76. LG contém retromutações em L36 e 1L46. Várias permutações de HF, HG, LE e LF foram testadas para a ligação de competição como mostrado na Figura 21 e todas mostraram uma ligação dentro de um fator de três de BR2-22a camundongo.
[184] Á luz desta experiência, HCGLG foi selecionado para novas experiências como representando a melhor combinação de afinidade de ligação e menor número de retromutações. Este anticorpo é a seguir referido como hLIV22. A afinidade de ligação de saturação de hLIV22 de para LIV-1 humano e cyno expressado a partir de células CHO é mostrada na Figura 22 comparada com a. de hLIV14. Figura 22 mostra que hLIV22 tem cerca de quatro vezes maior afinidade (inverso da constante de dissociação) para LIV-1 humano do que de hNLIV1I4. Além disso, a afinidade de hLIV22 para LIV-1 humano é igual dentro do mesmo erro experimental, como a sua afinidade para LIV-1 cinomolgo, enquanto que hLIVI4 mostra o dobro da afinidade para LIV-1 humano como para LIV-i cinomolgo. A afinidade de hLIV22 para LIV-1 humano é igual dentro do erro experimental como a de anticorpo camundongo parental, BR2-22a.
Atividade anti-tumoral in Vitro de hLIV22 ADCs
[185] Atividade anti-tumoral de hLIV22 ADC in vitro foi medida usando ensaios de citotoxicidade. Primeiro, foi realizado um levantamento de expressão de LIV-1 em várias linhagens de células por análise FACS quantitativa. A linhagem de células de tumor de mama MCF-7 a partir de ATCC teve o maior nível de sítios de ligação de LIV-1/ célula, em comparação com a linhagem de células MCF-7 a partir de outras fontes (dados não apresentados). Os requerentes utilizaram para esta linhagem de células ensaios in vitro. Os requerentes observaram que vários hLIV 22 ADCs (conjugados com vcMMAE (referido como 1006) ou mcMMAF (referido como 1269) (ambas moléculas pequenas descritas em Us 20050238649)) foram altamente eficazes para exterminar as células MCF-7, tal como medido pelo ensaio citotóxico in vitro. Figuras 23 e 24 comparam hLIV22 conjugado com 1006 ou 1269 com um anticorpo de controle não ligador conjugado com 1006 ou 1269.
Atividade anti-tumoral in vivo de LIV-1 ADC
[186] Usando modelos de câncer de próstata (PC-3) e câncer de mama (MCF-7) como mostrados nas Figuras 25 e 26, determinou-se a atividade de hLIV22 ADCs anti-tumoral (com uma média de 4 fármacos por anticorpo) in vivo. hLIV22 ADCs conjugados com vcMMAE apresentaram retardo significativo do tumor em comparação com o controle não tratado e ADCs. Foram observadas múltiplas regressões completas no estudo MCF-7 usando hLIV22-vcMMAE a 3 mg/kg. Além disso, em todos os estudos havia um número de animais que apresentavam tumores que eram estáticos ou cresceram lentamente, em comparação com os controles. Estes estudos demonstram que hLIV22 ADC pode parar ou retardar o crescimento de tipos de câncer expressando LIV-1, incluindo câncer de mama e de próstata. Figura 27 compara a atividade de hLIV22 e hLIV1I4 ADCs no modelo MCF-7. Embora ambos os anticorpos tenham sido eficazes, hLIV22 foi levemente mais eficaz. hLIV22 ADCs também foram testados em um modelo de câncer cervical. Um modelo de xenoenxerto de células HeLA foi utilizado para o ensaio. Depois de tumores cresceram a um tamanho apropriado, hLIV22 conjugado com VCMMAE foi administrado aos animais em 3 mg/kg e 1 mg/kg. Um conjugado de anticorpo de controle foi administrado 3 mg/kg. A regressão completa e parcial foi observada em animais que receberam 3 mg/kg conjugado hLIV22 vc MMAE. (dados não apresentados.) Assim, anticorpos LIV-1 e conjugados anticorpo fármaco podem ser usados para tratar cânceres cervicais expressando LIV-1.
Tratamento de câncer de pele, usando anticorpos anti- LIV-1 Expressão de proteína LIV-1 em amostras de tumor de melanoma
[187] Amostras de melanoma de pacientes foram avaliadas para a expressão de LIV-1 usando coloração IHC. Lâminas de FFPE foram desparafinizadas usando solução de Bond” Dewax (Leica, E cat AR9222) a 72°C. A recuperação do antígeno foi realizada usando solução de recuperação de epítopo Bond com base em EDTA (Leica, H cat AR9640) durante 20 min a 100°C; Para a coloração IHC, os requerentes usaram kit de detecção com base em fosfatasae alcalina: Bond Polymer Refine Red Detection kit (Leica, HF cat. DS9305). As lâminas foram incubadas com anticorpos primários monoclonais de murinos contra LIV-1 (BR2-14a) durante 45 min a 1 ug/ml com um bloco de proteína de 30 min preliminar (DAKO cat %X0909). IgG camundongo (Sigma, M5284) foi usado como um controle negativo. Após a revelação do cromogênio, as seções foram contra-coloridas com hematoxilina e tampadas. As lâminas foram avaliadas e classificadas por patologista.
[188] Resultados são apresentados na Figura 28. Setenta e dois por cento das amostras de pacientes de melanoma testados (21/29) foram positivos para LIV-1. Isto indica que os inibidores de LIV-1, por exemplo, anticorpos anti-LIV-1, podem ser utilizados para tratar cânceres de melanoma.
Atividade anti-melanoma in vivo de LIV-1 ADC
[189] Camundongos Nude (nu/nu) (7-8 animais/ grupo) são implantados com 10x10° células SK-MEL-5 (uma linhagem celular derivada de tumor de melanoma) cultivadas em cultura. Tumores são deixados crescer in vivo até atingir 100 mm”, como medido usando um compasso. ADCs LIV-1 humanizados, por exemplo, hLIVI4 ou hLIV22, são administrados a 3 mg/kg. Conjugados de fármacos são, por exemplo, vcMMAE ou mcMMAF.Controles de ADC são também administrados a animais de controle em 3 mg/kg. ADCs são dados como q4d x 4 injeções intraperitoneais. Volumes do tumor são monitorados usando calibres e os animais são sacrificados, quando o volume do tumor atinge -800 mm3. Administração de hLIV1I4 ADC ou hLIV22 ADC reduz o crescimento do tumor em animais, em comparação com os animais que receberam os ADC's de controle.

Claims (13)

1. Anticorpo humanizado caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura tem uma sequência de aminoácidos designada SEQ ID NO: 53 e a região variável de cadeia leve madura tem uma sequência de aminoácidos designada SEQ ID NO: 60.
2. Anticorpo humanizado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada madura é fusionada a uma região constante de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve madura é fusionada a uma região constante de cadeia leve.
3. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada é do isotipo IgG1.
4. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada tem uma sequência de aminoácidos compreendendo a SEQ ID NO:44 e a região constante de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos compreendendo a SEQ ID NO:42.
5. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada tem uma sequência de aminoácidos compreendendo a SEQ ID NO: 46 (S239C) e a região constante de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos compreendendo a SEQ ID NO: 42.
6. Anticorpo humanizado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é conjugado com um agente citotóxico ou citostático.
7. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o agente citotóxico ou citostático é monometil auristatina E (MMAE).
8. Anticorpo humanizado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que tem uma constante de associação para LIV-1 humano ou macaco cinomolgo de 0,5 a 2 x 109 M-1.
9. Ácido nucléico caracterizado pelo fato de que compreende a SEQ ID NO:75 que codifica uma região variável de cadeia pesada madura e/ou compreende a SEQ ID NO:82 que codifica uma região variável de cadeia leve madura conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.
10. Uso de um anticorpo humanizado conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 caracterizado pelo fato de que é na produção de um medicamento para o tratamento de câncer.
11. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer de mama negativo triplo.
12. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer de mama, câncer de próstata, câncer cervical ou melanoma.
13. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo humanizado conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 e um ou mais veículos, diluentes, excipientes ou auxiliares fisiologicamente aceitáveis.
BR122021020513-2A 2010-12-06 2011-12-06 Anticorpos humanizados para liv-1 e uso dos mesmos para tratar câncer BR122021020513B1 (pt)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US42029110P 2010-12-06 2010-12-06
US61/420,291 2010-12-06
US201161446990P 2011-02-25 2011-02-25
US61/446,990 2011-02-25
PCT/US2011/063612 WO2012078688A2 (en) 2010-12-06 2011-12-06 Humanized antibodies to liv-1 and use of same to treat cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR122021020513B1 true BR122021020513B1 (pt) 2022-10-25

Family

ID=46207694

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112013013781A BR112013013781A2 (pt) 2010-12-06 2011-12-06 anticorpos humanizados para liv-1 e uso dos mesmos para tratar câncer
BR122021020513-2A BR122021020513B1 (pt) 2010-12-06 2011-12-06 Anticorpos humanizados para liv-1 e uso dos mesmos para tratar câncer

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112013013781A BR112013013781A2 (pt) 2010-12-06 2011-12-06 anticorpos humanizados para liv-1 e uso dos mesmos para tratar câncer

Country Status (25)

Country Link
US (5) US9228026B2 (pt)
EP (4) EP3461847B1 (pt)
JP (5) JP6105481B2 (pt)
KR (5) KR101993921B1 (pt)
CN (1) CN103533957B (pt)
AU (4) AU2011338480B8 (pt)
BR (2) BR112013013781A2 (pt)
CA (2) CA3211246A1 (pt)
CY (3) CY1118874T1 (pt)
DK (3) DK3156420T3 (pt)
ES (3) ES2842895T3 (pt)
HR (1) HRP20170567T1 (pt)
HU (3) HUE052806T2 (pt)
IL (4) IL299837A (pt)
LT (1) LT2648752T (pt)
MX (2) MX351027B (pt)
NZ (1) NZ611468A (pt)
PL (3) PL3461847T3 (pt)
PT (3) PT2648752T (pt)
RS (1) RS55843B1 (pt)
RU (1) RU2608646C2 (pt)
SG (3) SG10201510041QA (pt)
SI (3) SI2648752T1 (pt)
WO (1) WO2012078688A2 (pt)
ZA (1) ZA201303803B (pt)

Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUE052806T2 (hu) * 2010-12-06 2021-05-28 Seagen Inc LIV-1 elleni humanizált antitestek és azok alkalmazása a rák kezelésében
CA2889170C (en) 2012-10-25 2021-09-07 True North Therapeutics, Inc. Anti-complement c1s antibodies and uses thereof
RS63212B1 (sr) 2012-11-02 2022-06-30 Bioverativ Usa Inc Antikomplementna c1s antitela i njihove primene
WO2014089177A2 (en) 2012-12-04 2014-06-12 Massachusetts Institute Of Technology Compounds, conjugates and compositions of epipolythiodiketopiperazines and polythiodiketopiperazines
EA201690004A1 (ru) 2012-12-27 2016-07-29 Санофи Антитела против lamp1 и конъюгаты антитела и лекарственного средства, а также их применение
EA035319B1 (ru) * 2013-07-31 2020-05-27 Эмджен Инк. СТАБИЛИЗАЦИЯ Fc-СОДЕРЖАЩИХ ПОЛИПЕПТИДОВ
CA2921707C (en) 2013-10-15 2023-03-28 Seattle Genetics, Inc. Pegylated drug-linkers for improved ligand-drug conjugate pharmacokinetics
SG10202001468UA (en) 2014-02-17 2020-04-29 Seattle Genetics Inc Hydrophilic antibody-drug conjugates
EP4212175A1 (en) 2015-04-06 2023-07-19 Bioverativ USA Inc. Humanized anti-c1s antibodies and methods of use thereof
AU2016363013B2 (en) 2015-12-04 2022-03-10 Seagen Inc. Conjugates of quaternized tubulysin compounds
US11793880B2 (en) 2015-12-04 2023-10-24 Seagen Inc. Conjugates of quaternized tubulysin compounds
IL260732B1 (en) * 2016-02-17 2024-04-01 Seagen Inc BCMA antibodies and their use for the treatment of cancer and immune disorders
MA45324A (fr) * 2016-03-15 2019-01-23 Seattle Genetics Inc Polythérapie utilisant un adc-liv1 et un agent chimiothérapeutique
SG11201807827VA (en) 2016-03-25 2018-10-30 Seattle Genetics Inc Process for the preparation of pegylated drug-linkers and intermediates thereof
US10918627B2 (en) 2016-05-11 2021-02-16 Massachusetts Institute Of Technology Convergent and enantioselective total synthesis of Communesin analogs
TW201808343A (zh) 2016-08-09 2018-03-16 美商西雅圖遺傳學公司 具有改善之生理化學性質之具自我穩定連接子之藥物結合物
EA201891851A1 (ru) * 2016-09-16 2019-04-30 Сиэтл Дженетикс, Инк. Антитела против bcma и их применение для лечения злокачественных новообразований и иммунологических нарушений
BR112019006778A2 (pt) 2016-10-18 2019-10-15 Seattle Genetics Inc Composição de conjugado de aglutinante-fármaco, formulação, uso da mesma, método para preparar uma composição ou composto de conjugado de aglutinantefármaco,e, composto de ligante de fármaco
CA3055652A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Silverback Therapeutics, Inc. Benzazepine compounds, conjugates, and uses thereof
IL269398B2 (en) 2017-03-24 2024-05-01 Seagen Inc A process for the preparation of glucuronide-drug binders and their intermediates
US11305224B2 (en) 2017-04-18 2022-04-19 3M Innovative Properties Company Air filter media with post-pleat-deposited sorbent particles
KR20190141181A (ko) 2017-04-27 2019-12-23 시애틀 지네틱스, 인크. 사차화된 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오타이드 구제 경로 억제제 콘쥬게이트
US11932650B2 (en) 2017-05-11 2024-03-19 Massachusetts Institute Of Technology Potent agelastatin derivatives as modulators for cancer invasion and metastasis
AU2018326877A1 (en) * 2017-09-02 2020-03-05 Abbvie Inc. Anti-EGFR antibody drug conjugates (ADC) and uses thereof
SG11202001762RA (en) * 2017-09-02 2020-03-30 Abbvie Inc Anti-egfr antibody drug conjugates (adc) and uses thereof
US10640508B2 (en) 2017-10-13 2020-05-05 Massachusetts Institute Of Technology Diazene directed modular synthesis of compounds with quaternary carbon centers
AU2018375182A1 (en) * 2017-12-01 2020-06-11 Seagen Inc. Humanized anti-LIV1 antibodies for the treatment of breast cancer
SG11202007540SA (en) 2018-02-20 2020-09-29 Seattle Genetics Inc Hydrophobic auristatin f compounds and conjugates thereof
CN113166113A (zh) 2018-09-12 2021-07-23 希沃尔拜克治疗公司 取代的苯并氮杂䓬化合物、缀合物及其用途
CN113164618A (zh) 2018-09-12 2021-07-23 希沃尔拜克治疗公司 用免疫刺激性缀合物治疗疾病的方法和组合物
WO2020056194A1 (en) 2018-09-12 2020-03-19 Silverback Therapeutics, Inc. Benzazepine compounds, conjugates, and uses thereof
US20220323596A1 (en) 2018-09-12 2022-10-13 Silverback Therapeutics, Inc. Antibody conjugates of toll-like receptor agonists
EP3877419A1 (en) 2018-11-07 2021-09-15 CRISPR Therapeutics AG Anti-liv1 immune cell cancer therapy
TW202112801A (zh) 2019-06-05 2021-04-01 美商西雅圖遺傳學公司 純化遮蔽抗體之方法
US11535634B2 (en) 2019-06-05 2022-12-27 Massachusetts Institute Of Technology Compounds, conjugates, and compositions of epipolythiodiketopiperazines and polythiodiketopiperazines and uses thereof
TW202112354A (zh) 2019-06-05 2021-04-01 美商西雅圖遺傳學公司 遮蔽抗體調配物
MX2022000853A (es) * 2019-07-22 2022-03-17 Seagen Inc Anticuerpos anti-liv1 humanizados para el tratamiento de cancer.
AU2020331036A1 (en) 2019-08-15 2022-03-03 Silverback Therapeutics, Inc. Formulations of benzazepine conjugates and uses thereof
WO2021067644A1 (en) 2019-10-01 2021-04-08 Silverback Therapeutics, Inc. Combination therapy with immune stimulatory conjugates
BR112022011268A2 (pt) 2019-12-09 2022-09-06 Seagen Inc Terapia de combinação com antagonista de liv1-adc e pd1
TW202138388A (zh) 2019-12-30 2021-10-16 美商西根公司 以非海藻糖苷化抗－ｃｄ７０抗體治療癌症之方法
WO2021168274A1 (en) 2020-02-21 2021-08-26 Silverback Therapeutics, Inc. Nectin-4 antibody conjugates and uses thereof
JP2023532304A (ja) 2020-07-01 2023-07-27 エーアールエス ファーマシューティカルズ オペレーションズ，インク． 抗ａｓｇｒ１抗体コンジュゲートおよびその使用
MX2023003404A (es) 2020-09-28 2023-03-31 Seagen Inc Anticuerpos anti-l1vi humanizados para el tratamiento del cancer.
AR124681A1 (es) 2021-01-20 2023-04-26 Abbvie Inc Conjugados anticuerpo-fármaco anti-egfr
EP4370211A1 (en) 2021-07-14 2024-05-22 Seagen Inc. Antibody masking domains
WO2023049825A1 (en) 2021-09-24 2023-03-30 Seagen Inc. Improved antibody masking domains
WO2023111913A1 (en) 2021-12-15 2023-06-22 Crispr Therapeutics Ag Engineered anti-liv1 cell with regnase-1 and/or tgfbrii disruption
WO2024109944A1 (zh) * 2022-11-25 2024-05-30 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗liv-1抗体、其药物偶联物及其医药用途

Family Cites Families (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH652145A5 (de) 1982-01-22 1985-10-31 Sandoz Ag Verfahren zur in vitro-herstellung von hybridomen welche humane monoklonale antikoerper erzeugen.
US4634666A (en) 1984-01-06 1987-01-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Human-murine hybridoma fusion partner
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4880935A (en) 1986-07-11 1989-11-14 Icrf (Patents) Limited Heterobifunctional linking agents derived from N-succinimido-dithio-alpha methyl-methylene-benzoates
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
IL89220A (en) 1988-02-11 1994-02-27 Bristol Myers Squibb Co Immunoconjugates of anthracycline, their production and pharmaceutical preparations containing them
DE68921982D1 (de) 1988-06-14 1995-05-04 Cetus Oncology Corp Kupplungsmittel und sterisch gehinderte, mit disulfid gebundene konjugate daraus.
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
AU633698B2 (en) 1990-01-12 1993-02-04 Amgen Fremont Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
WO1992003918A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5871907A (en) 1991-05-15 1999-02-16 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US5858657A (en) 1992-05-15 1999-01-12 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
ES2129454T3 (es) 1991-08-22 1999-06-16 Becton Dickinson Co Procedimientos y composiciones de tratamientos de cancer y pronostico de reacciones a los indicados tratamientos.
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
EP0746609A4 (en) 1991-12-17 1997-12-17 Genpharm Int NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS CAPABLE OF PRODUCING HETEROLOGOUS ANTIBODIES
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5837242A (en) 1992-12-04 1998-11-17 Medical Research Council Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US5877218A (en) 1994-01-10 1999-03-02 Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. Compositions containing and methods of using 1-aminoindan and derivatives thereof and process for preparing optically active 1-aminoindan derivatives
CA2132500A1 (en) 1994-09-20 1996-03-21 David Lockwood Manning Methods for predicting the behaviour of breast tumours
PT871490E (pt) 1995-12-22 2003-07-31 Bristol Myers Squibb Co Ligantes de hidrazona ramificada
US5834597A (en) 1996-05-20 1998-11-10 Protein Design Labs, Inc. Mutated nonactivating IgG2 domains and anti CD3 antibodies incorporating the same
US6130237A (en) 1996-09-12 2000-10-10 Cancer Research Campaign Technology Limited Condensed N-aclyindoles as antitumor agents
CA2269634C (en) 1996-10-31 2010-08-17 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting diseases of the breast
US6066778A (en) 1996-11-06 2000-05-23 The Regents Of The University Of Michigan Transgenic mice expressing APC resistant factor V
WO1998034118A1 (en) 1997-01-30 1998-08-06 Yale University Diagnostic methods and compositions based on the distribution of rad51
EP1027444A1 (en) 1997-10-31 2000-08-16 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting diseases of the breast
EP1032706A1 (en) 1997-11-18 2000-09-06 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting diseases of the breast
JP2002507387A (ja) 1997-12-24 2002-03-12 コリクサ コーポレイション 乳癌の免疫療法および診断のための化合物ならびにそれらの使用のための方法
CA2347906A1 (en) 1998-08-04 2000-02-17 Diadexus, Inc. A novel method of diagnosing, monitoring, staging, imaging and treating breast cancer
EP1121437B1 (en) 1998-10-15 2008-02-20 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Metastatic breast and colon cancer regulated genes
DE60045319D1 (de) 1999-02-05 2011-01-13 Samsung Electronics Co Ltd Verfahren und Vorrichtung zum Wiederauffinden von Texturbildern
AU3395900A (en) 1999-03-12 2000-10-04 Human Genome Sciences, Inc. Human lung cancer associated gene sequences and polypeptides
US6762020B1 (en) 1999-03-15 2004-07-13 Protein Design Labs, Inc. Methods of diagnosing breast cancer
US20040141983A1 (en) 1999-03-15 2004-07-22 Protein Design Labs, Inc. Compositions against cancer antigen LIV-1 and uses thereof
CA2395832A1 (en) 2000-01-25 2001-08-02 Genentech, Inc. Liv-1 related protein, polynucleotides encoding the same and use thereof for treatment of cancer
WO2001096372A2 (en) 2000-06-13 2001-12-20 University College Cardiff Consultants Ltd Zinc transporters proteins and their use in medicinal preparations
US6964849B2 (en) 2001-01-11 2005-11-15 Curagen Corporation Proteins and nucleic acids encoding same
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
EP1410013A4 (en) 2001-06-21 2006-02-01 Millennium Pharm Inc COMPOSITIONS, NEEDS AND METHODS FOR THE IDENTIFICATION, EVALUATION, PREVENTION AND TREATMENT OF BREAST CANCERS AND OVARIA
WO2003004989A2 (en) 2001-06-21 2003-01-16 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast cancer
EP1539233B1 (en) 2001-07-12 2011-04-27 FOOTE, Jefferson Super humanized antibodies
US7091186B2 (en) 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
WO2003075855A2 (en) 2002-03-08 2003-09-18 Protein Design Labs, Inc. Antibodies against cancer antigen tmeff2 and uses thereof
WO2004010957A2 (en) 2002-07-31 2004-02-05 Seattle Genetics, Inc. Drug conjugates and their use for treating cancer, an autoimmune disease or an infectious disease
CA2514062A1 (en) 2003-01-27 2004-08-12 Biogen Idec Ma Inc. Compositions and methods for treating cancer using igsf9 and liv-1
WO2004067564A2 (en) 2003-01-29 2004-08-12 Protein Design Labs, Inc. Compositions against cancer antigen liv-1 and uses thereof
KR20050010267A (ko) 2003-07-18 2005-01-27 삼성전자주식회사 식각장치
BR122018071808B8 (pt) 2003-11-06 2020-06-30 Seattle Genetics Inc conjugado
WO2005058961A2 (en) * 2003-12-12 2005-06-30 Amgen Inc. Antibodies specific for human galanin, and uses thereof
US7501121B2 (en) 2004-06-17 2009-03-10 Wyeth IL-13 binding agents
EP2298807A3 (en) 2004-07-30 2011-05-18 Rinat Neuroscience Corp. Antibodies directed against amyloid-beta peptide and methods using same
US20060222653A1 (en) 2004-11-12 2006-10-05 Xencor, Inc. Antibodies operably linked to selected chemoattractants
WO2006124269A2 (en) 2005-05-16 2006-11-23 Amgen Fremont Inc. Human monoclonal antibodies that bind to very late antigen-1 for the treatment of inflammation and other disorders
JP2009506790A (ja) 2005-09-07 2009-02-19 メディミューン，エルエルシー 毒素とコンジュゲートしたｅｐｈ受容体抗体
EP2407483A1 (en) 2006-04-13 2012-01-18 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Methods of treating, diagnosing or detecting cancers
ES2523915T5 (es) 2006-12-01 2022-05-26 Seagen Inc Agentes de unión a la diana variantes y usos de los mismos
RU2009140134A (ru) 2007-04-23 2011-05-27 Вайет (Us) Способы и композиции для лечения и мониторинга лечения связанных с ил-13 нарушений
CL2008003561A1 (es) 2007-11-30 2010-02-05 Glaxo Group Ltd Construccion de union a il - 13 que comprende a lo menos un dominio simple (dab) de anticuerpo injertado en un anticuerpo monoclonal ( mabdab); polinucleotido y celula huesped; procedimiento para preparar la construccion; composicion farmaceutica que la comprende y uso para tratar cancer o enfermedades inflamatorias.
CA2723197C (en) 2008-05-02 2017-09-19 Seattle Genetics, Inc. Methods and compositions for making antibodies and antibody derivatives with reduced core fucosylation
US20110166838A1 (en) 2008-06-16 2011-07-07 Sividon Diagnostics Algorithms for outcome prediction in patients with node-positive chemotherapy-treated breast cancer
WO2010045234A1 (en) 2008-10-14 2010-04-22 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Methods of optimizing treatment of estrogen-receptor positive breast cancers
WO2010069858A1 (en) 2008-12-19 2010-06-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Pharmaceutical composition
US8642270B2 (en) 2009-02-09 2014-02-04 Vm Institute Of Research Prognostic biomarkers to predict overall survival and metastatic disease in patients with triple negative breast cancer
US20110165566A1 (en) 2009-07-09 2011-07-07 Wittliff James L Methods of optimizing treatment of breast cancer
MX2012002766A (es) 2009-09-03 2012-04-02 Genentech Inc Metodos para el tratamiento, diagnosis y monitoreo de artritis reumatoide.
HUE052806T2 (hu) 2010-12-06 2021-05-28 Seagen Inc LIV-1 elleni humanizált antitestek és azok alkalmazása a rák kezelésében
WO2012125712A2 (en) 2011-03-14 2012-09-20 Respira Health, Llc Lung tumor classifier for current and former smokers
PT2839860T (pt) 2012-10-12 2019-07-29 Medimmune Ltd Pirrolobenzodiazepinas e conjugados das mesmas
MA45324A (fr) 2016-03-15 2019-01-23 Seattle Genetics Inc Polythérapie utilisant un adc-liv1 et un agent chimiothérapeutique
AU2018375182A1 (en) 2017-12-01 2020-06-11 Seagen Inc. Humanized anti-LIV1 antibodies for the treatment of breast cancer
EP3877419A1 (en) 2018-11-07 2021-09-15 CRISPR Therapeutics AG Anti-liv1 immune cell cancer therapy
GB201908208D0 (en) 2019-06-10 2019-07-24 Univ College Cardiff Consultants Ltd An anti-mitotic agent

Also Published As

Publication number Publication date
ES2620264T3 (es) 2017-06-28
AU2017203851B2 (en) 2019-01-31
JP6453924B2 (ja) 2019-01-16
PT3461847T (pt) 2020-12-24
JP2017149717A (ja) 2017-08-31
EP3786185A1 (en) 2021-03-03
HUE031726T2 (en) 2017-07-28
CY1118874T1 (el) 2018-01-10
ZA201303803B (en) 2014-07-30
US20200165335A1 (en) 2020-05-28
EP3156420B1 (en) 2019-02-20
DK2648752T3 (en) 2017-03-27
AU2019202530A1 (en) 2019-05-02
PL3156420T3 (pl) 2019-08-30
JP2021106599A (ja) 2021-07-29
EP2648752B1 (en) 2017-02-15
AU2019202530B2 (en) 2021-04-01
AU2017203851A1 (en) 2017-06-22
EP2648752A4 (en) 2015-05-20
LT2648752T (lt) 2017-04-10
CY1123883T1 (el) 2022-03-24
KR101993921B1 (ko) 2019-06-28
IL261900A (en) 2018-10-31
CN103533957B (zh) 2016-06-22
SG190938A1 (en) 2013-07-31
ES2719548T3 (es) 2019-07-11
SG10201510041QA (en) 2016-01-28
HRP20170567T1 (hr) 2017-06-16
PL2648752T3 (pl) 2017-07-31
NZ611468A (en) 2015-06-26
IL226754B (en) 2018-10-31
AU2011338480B2 (en) 2017-03-16
RU2013130609A (ru) 2015-01-20
US9228026B2 (en) 2016-01-05
BR112013013781A2 (pt) 2016-09-13
HUE043355T2 (hu) 2019-08-28
WO2012078688A3 (en) 2012-08-23
PL3461847T3 (pl) 2021-07-05
EP2648752A2 (en) 2013-10-16
SI2648752T1 (sl) 2017-06-30
JP2019073515A (ja) 2019-05-16
KR20220011811A (ko) 2022-01-28
USRE48959E1 (en) 2022-03-08
US20180079810A1 (en) 2018-03-22
US9783608B2 (en) 2017-10-10
AU2021204473A1 (en) 2021-07-29
AU2011338480A8 (en) 2017-03-23
PT3156420T (pt) 2019-05-27
JP2023011709A (ja) 2023-01-24
KR20200145867A (ko) 2020-12-30
EP3461847A1 (en) 2019-04-03
CA3211246A1 (en) 2012-06-14
AU2011338480A1 (en) 2013-06-13
CA2819038A1 (en) 2012-06-14
DK3461847T3 (da) 2020-12-14
JP6105481B2 (ja) 2017-03-29
IL299837A (en) 2023-03-01
SI3156420T1 (sl) 2019-05-31
JP7166384B2 (ja) 2022-11-07
MX2020010639A (es) 2020-10-28
HUE052806T2 (hu) 2021-05-28
DK3156420T3 (en) 2019-04-29
AU2011338480B8 (en) 2017-03-23
IL273607B2 (en) 2023-06-01
JP2014506120A (ja) 2014-03-13
US20130259860A1 (en) 2013-10-03
RS55843B1 (sr) 2017-08-31
CA2819038C (en) 2023-10-17
RU2608646C2 (ru) 2017-01-23
EP3461847B1 (en) 2020-09-23
MX351027B (es) 2017-09-28
WO2012078688A2 (en) 2012-06-14
SG10201912646UA (en) 2020-02-27
JP6869218B2 (ja) 2021-05-12
SI3461847T1 (sl) 2021-03-31
CN103533957A (zh) 2014-01-22
EP3461847A8 (en) 2021-04-14
ES2842895T3 (es) 2021-07-15
KR20130135884A (ko) 2013-12-11
KR102198189B1 (ko) 2021-01-05
EP3156420A1 (en) 2017-04-19
US20160185858A1 (en) 2016-06-30
MX2013006365A (es) 2013-08-15
KR20230057485A (ko) 2023-04-28
IL273607A (en) 2020-05-31
CY1121546T1 (el) 2020-05-29
KR20190076068A (ko) 2019-07-01
PT2648752T (pt) 2017-03-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7166384B2 (ja) Ｌｉｖ－１に対するヒト化抗体および癌治療のためのその使用
CN116568337A (zh) 抗cd228抗体和抗体-药物缀合物
TWI591176B (zh) 抗ｌｉｖ－１之人化抗體類及彼等於治療癌症上之用途

Legal Events

Date Code Title Description
B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B25D Requested change of name of applicant approved

Owner name: SEAGEN INC. (US)

B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 06/12/2011, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF, QUE DETERMINA A ALTERACAO DO PRAZO DE CONCESSAO.