CN108164551A - 吡咯并苯并二氮杂卓和靶向结合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及吡咯并苯并二氮杂卓和靶向结合物。具体而言，本发明涉及一种化合物，或其药用盐或溶剂化物，或者它们的结合物，选自由C1、C4和C6所组成的组，其中：(a)R10是H，且R11是OH、ORA，其中RA是饱和C1‑4烷基；(b)R10和R11形成键接它们的氮原子和碳原子之间的氮‑碳双键；或(c)R10是H且R11是SOzM，其中z为2或3且M是单价药用阳离子，或者两个M一起是二价药用阳离子。

Description

吡咯并苯并二氮杂卓和靶向结合物
本申请是申请日为2012年10月12日的题为“吡咯并苯并二氮杂卓和靶向结合物”的中国专利申请号201280062295.4的分案申请。
技术领域
本发明涉及吡咯并苯并二氮杂(吡咯并苯并二氮杂卓)(PBD)，具体而言是在每个单体单元中的C2位置处具有C2-C3双键和芳基的吡咯并苯并二氮杂二聚体，及其在靶向结合物中的包夹(内含，inclusion)。
背景技术
某些吡咯并苯并二氮杂(PBD)具有识别并结合至特异性DNA序列的能力；优选的序列是PuGPu。第一种PBD抗肿瘤抗生素，安曲霉素，发现于1965年(Leimgruber，et al.，J.Am.Chem.Soc.，87，5793-5795(1965)；Leimgruber，et al.，J.Am.Chem.Soc.，87，5791-5793(1965))。从那时起，已经报道了许多天然PBD，而对各种类似物已经开发出许多合成路径(Thurston，et al.，Chem.Rev.1994，433-465(1994)；Antonow，D.and Thurston，D.E.，Chem.Rev.2011 111(4)，2815-2864)。这些家族成员包括赤霉素(abbeymycin)(Hochlowski，et al.，J.Antibiotics，40，145-148(1987))、奇卡霉素(chicamycin)(Konishi，et al.，J.Antibiotics，37，200-206(1984))、DC-81(日本专利58-180 487；Thurston，et al.，Chem.Brit.，26，767-772(1990)；Bose，et al.，Tetrahedron，48，751-758(1992))、甲基氨茴霉素(mazethramycin)(Kuminoto，et al.，J.Antibiotics，33，665-667(1980))、新茴霉素(neothramycins)A和B(Takeuchi，et al.，J.Antibiotics，29，93-96(1976))、泊罗霉素(porothramycin)(Tsunakawa，et al.，J.Antibiotics，41，1366-1373(1988))、普拉卡素(prothracarcin)(Shimizu，et al，J.Antibiotics，29，2492-2503(1982)；Langley and Thurston，J.Org.Chem.，52，91-97(1987))、柴野霉素(sibanomicin)(DC-102)(Hara，et al.，J.Antibiotics，41，702-704(1988)；Itoh，et al.，J.Antibiotics，41，1281-1284(1988))、西伯利亚霉素(sibiromycin)(Leber，et al.，J.Am.Chem.Soc.，110，2992-2993(1988))和托马霉素(tomamycin)(Arima，et al.，J.Antibiotics，25，437-444(1972))。PBD具有以下通用结构：
它们的区别在于其芳族A环和吡咯C环二者中取代基的数量、类型和位置，以及C环的饱和度。在B环中负责烷基化DNA的亲电中心的N10-C11位置存在亚胺(N＝C)、甲醇胺(NH-CH(OH))或甲醇胺甲基醚(NH-CH(OMe))。所有已知的天然产物在手性C11a位置具有(S)-构型，这在从C环向A环观察时为其提供右手螺旋的扭转。这为其对于具有B-型DNA小沟的等螺旋性提供了适当的三维形状，导致在结合位点适贴配合(Kohn，In AntibioticsIII.Springer-Verlag，New York，pp.3-11(1975)；Hurley and Needham-VanDevanter，Acc.Chem.Res.，19，230-237(1986))。它们在小沟中形成加合物的能力，使其能够干扰DNA加工，因此，使之具有作为抗肿瘤剂的用途。
之前已经公开这些分子的生物活性能够通过经由柔性亚烷基连接子通过其C8/C'-羟基官能度将两个PBD单元连接至一起而增强(Bose，D.S.，et al.，J.Am.Chem.Soc.，114，4939-4941(1992)；Thurston，D.E.，et al.，J.Org.Chem.，61，8141-8147(1996))。PBD二聚体被认为形成了序列选择性DNA损伤，如回文型5'-Pu-GATC-Py-3'链间交联(Smellie，M.，et al.，Biochemistry，42，8232-8239(2003)；Martin，C.，et al.，Biochemistry，44，4135-4147)，其被认为主要负责其生物活性。PBD二聚体的一个实例，SG2000(SJG-136)：
近来在肿瘤学领域中已经进入II阶段临床试验(Gregson，S.，et al.，J.Med.Chem.，44，737-748(2001)；Alley，M.C.，et al.，Cancer Research，64，6700-6706(2004)；Hartley，J.A.，et al.，Cancer Research，64，6693-6699(2004))。
最近，本发明人早先已经在WO 2005/085251中公开了带有C2芳基取代基的二聚体PBD化合物，如SG2202(ZC-207)：
并且在WO 2006/111759中公开了这种PBD化合物的双亚硫酸盐，例如SG2285(ZC-423)：
这些化合物已经证明是高度有用的细胞毒性试剂(Howard，P.W.，et al.,Bioorg.Med.Chem.(2009),19(22),6463-6466,doi:10.1016/j.bmcl.2009.09.012)。
由于这些高强效化合物在交联DNA中发生作用的方式，这些分子已经对称制备。无论是通过同时构建已经形成二聚体连接子的PBD部分，还是通过将已经构建的PBD部分与二聚体连接基团反应，这提供了简单直接的合成。
WO 2010/043880公开了一种在每个单体C2位置含有芳基的不对称二聚体PBD化合物，其中这些芳基中之一含有设计用于为化合物连接至另一部分提供锚点(定点，anchor)的取代基。2011年4月15日提交的共同未决的国际申请PCT/US2011/032664公开了这些PBD二聚体化合物在靶向结合物中的内含。
发明内容
本发明人已经开发出进一步特异性的不对称二聚体PBD化合物用于靶向结合物中的包夹(内含，inclusion)。这些化合物可以在其制备和使用中，特别是在其生物特性和结合物的合成，以及这些结合物的生物学性质方面具有优势。
本发明包括一种选自由以下各项组成的组中的化合物，或其药用盐或溶剂化物：
其中：
(a)R10是H，且R11是OH或ORA，其中RA是饱和C1-4烷基；或
(b)R10和R11形成键接它们的氮原子和碳原子之间的氮-碳双键；或
(c)R10是H且R11是SOzM，其中z为2或3且M是单价药用阳离子，或两个M一起是二价药用阳离子。
本发明的第二方面提供了本发明第一方面的化合物在生产治疗增殖性疾病的药物中的用途。第二方面也提供了本发明第一方面的化合物用于治疗增殖性疾病。
本领域普通技术人员能够容易地确定候选结合物是否能够治疗对于任何具体细胞类型的增殖性病症。例如，可方便地用于评价具体化合物所提供的活性的分析方法将在以下实施例中进行描述。
本发明第三方面包括一种根据本发明第一方面的化合物，除了在以下任一种的情况下之外：
(a)R10是氨基甲酸酯氮保护基团，且R11是O-ProtO，其中ProtO是氧保护基团；或
(b)R10是半缩醛胺氮保护基团且R11是氧代基团。
本发明第四方面包括一种由第三方面的化合物、或其药用盐或溶剂化物通过亚胺键脱保护而制备第一方面的化合物、或其药用盐或溶剂化物的方法。
本发明的不对称二聚体PBD化合物由与之前用于制备对称二聚体PBD化合物所采用的策略不同的策略制备。具体而言，本发明人已经开发了涉及在独立的方法步骤中将每个C2取代基增添至对称的PBD二聚体核(core)的方法。因此，本发明第五方面提供了制备本发明第一或第三方面的化合物的方法，包括至少一个以下示出的方法步骤。
在第六方面中，本发明涉及含有连接至靶向试剂的PBD的二聚体的结合物，其中PBD二聚体是本文中的化合物、或其药用盐或溶剂化物(同上)。
在一些实施方式中，结合物具有以下式IV或其药用盐或溶剂化物：
L-(LU-D)p (IV)，
其中L是配体单元(即，靶向试剂)，LU是连接子单元且D是PBD二聚体的药物单元(参见以下内容)。下标p为1-20。因此，结合物包含通过连接子单元共价连接到至少一个药物单元的配体单元。配体单元，以下将更全面介绍，是结合至靶部分的靶向试剂。配体单元可以，例如，特异性结合至细胞组分(细胞结合剂)或结合至其它所关注的靶分子。因此，本发明也提供用于治疗，例如，各种癌症和自身免疫性疾病的方法。这些方法涵盖了其中配体单元是特异性结合至靶分子的靶向试剂的结合物的用途。配体单元可以是，例如，蛋白质、多肽或肽如抗体、抗体的抗原结合片段或其它结合剂如Fc融合蛋白。
在本发明的结合物中，PBD二聚体D选自由以下各项组成的组：
或其药用盐或溶剂化物，其中R10和R11如在第一方面中的定义，且星号指示连接子单元的连接点。
载药量由p表示，p为每个配体单元(例如，抗体)的药物分子数目。载药量的范围可以为1-20个药物单位(D)/配体单元(例如，Ab或mAb)。对于组合物，p表示结合物在组合物中的平均载药量，且p的范围为1-20。
在一些实施方式中，p为约1至约8个药物单位/配体单元。在一些实施方式中，p为1。在一些实施方式中，p为2。在一些实施方式中，p为约2至约8个药物单位/配体单元。在一些实施方式中，p为约2至约6、2至约5或2至约4个药物单位/配体单元。在一些实施方式中，p为约2、约4、约6或约8个药物单位/配体单元。
从结合反应的制备中每个配体单元的平均药物单元数目可以通过常规方法如质谱、ELISA测定法和HPLC进行表征。结合物依据p的定量分布也可以确定。在某些情况下，从具有其它载药量的结合物分离、纯化和表征均质结合物，其中p是某一定值，可借助如反相HPLC或电泳来完成。
在第七方面中，本发明涉及含连接至连接单元的PBD的二聚体(参见上文)的连接子-药物化合物(即，药物-连接子)。这些药物-连接子可以用作合成含连接至靶向试剂的PBD的二聚体的结合物的中间体。
这些药物-连接子具有以下式V：
LU-D (V)
或其药用盐或溶剂化物，其中LU是连接子单元且D是PBD二聚体的药物单元，正如在本发明的第六方面中的定义。
附图说明
图1显示了在用本发明两种结合物处理之后对平均肿瘤体积的影响。
具体实施方式
定义
药用阳离子
药用单价和二价阳离子的实例在文献Berge，et al.，J.Pharm.Sci.，66，1-19(1977)中进行了讨论，该文献以其全部内容和出于所有目的结合于本文中作为参考。
药用阳离子可以是无机的或有机的。
药用单价无机阳离子的实例包括，但不限于，碱金属离子如Na+和K+。药用二价无机阳离子的实例包括，但不限于，碱土金属阳离子如Ca2+和Mg2+。药用有机阳离子的实例包括，但不限于铵离子(即NH4 +)和取代的铵离子(例如，NH3R+，NH2R2 +，NHR3 +，NR4 +)。一些合适的取代铵离子的实例是衍生自以下的那些：乙胺，二乙胺，二环己胺，三乙胺，丁胺，乙二胺，乙醇胺，二乙醇胺，哌嗪，苄胺，苯基苄胺，胆碱，葡甲胺和氨丁三醇以及氨基酸、如赖氨酸和精氨酸。常见的季铵离子的实例是N(CH3)4 +。
基团
正如本文中所用的术语“饱和的C1-4烷基”，涉及从具有1-4个碳原子的烃化合物的碳原子除去一个氢原子的单价部分，其可以是脂族的或脂环族的。类似地，正如本文中所用的术语“饱和的C1-2烷基”，涉及从具有1-2个碳原子的烃化合物的碳原子除去一个氢原子的单价部分，即甲基或乙基。
饱和的烷基基团的实例包括，但不限于，甲基(C1)、乙基(C2)、丙基(C3)和丁基(C4)。
饱和的直链烷基基团的实例包括，但不限于，甲基(C1)、乙基(C2)、正丙基(C3)和正丁基(C4)。
饱和的支链烷基基团的实例包括异丙基(C3)、异丁基(C4)、仲丁基(C4)和叔丁基(C4)。
氧代基(酮，-酮)：＝O。
氧保护基团：术语“氧保护基团”是指掩蔽羟基基团的部分，且这些在本领域内都是众所周知的。大量的合适基团都描述于文献Greene，T.W.and Wuts，G.M.，ProtectiveGroups in Organic Synthesis，3rd Edition，John Wiley&Sons，Inc.，1999，p23-200中，以其全部内容且出于所有目的结合于本文中作为参考。特别感兴趣的类别包括甲硅烷基醚类(例如，TMS、TBDMS)，取代的甲基醚类(例如，THP)和酯类(例如，乙酸酯)。
氨基甲酸酯氮保护基团：术语“氨基甲酸酯氮保护基团”涉及掩蔽亚胺键中的氮的部分，而这些在本领域内是众所周知的。这些基团具有以下结构：
其中R’10是如下定义的R。大量合适的基团描述于文献Greene，T.W.and Wuts，G.M.，Protective Groups in Organic Synthesis，3rd Edition，John Wiley&Sons，Inc.，1999，p503-549中，以其全部内容且出于所有目的结合于本文中作为参考。
半缩醛胺氮保护基团：术语“半缩醛胺氮保护基团”涉及具有以下结构的基团：
其中R’10是如以下定义的R。大量合适的基团描述于文献Greene，T.W.and Wuts，G.M.，Protective Groups in Organic Synthesis，3rd Edition，John Wiley&Sons，Inc.，1999，p633-647中，以其全部内容且出于所有目的结合于本文中作为参考。
R
R选自可选取代的C1-12烷基、C3-20杂环基和C5-20芳基基团。
正如本文中所用的短语“可选取代的”，涉及可以是未取代的或可以是取代的母体基团(parent group)。
除非另外指明，正如本文所用的术语“取代的”，涉及带有一个或多个取代基的母体基团。术语“取代基”在本文中按照常规意义使用且是指共价连接到，或如果合适，稠合到母体基团的化学部分。各种各样的取代基是众所周知的，且对其形成和引入到各种母体基团中的方法也是众所周知的。
取代基的实例以下将会更详细地进行描述。
C1-12烷基：正如本文中所用的术语“C1-12烷基”，涉及通过从具有1-12个碳原子的烃化合物的碳原子除去一个氢原子的单价部分，其可以是脂族的或脂环族的，并可以是饱和的或不饱和的(例如，部分不饱和的，完全不饱和的)。正如本文中所用的术语“C1-4烷基”，涉及从具有1-4个碳原子的烃化合物的碳原子除去一个氢原子的单价部分，其可以是脂族的或脂环族的，并可以是饱和的或不饱和的(例如，部分不饱和的，完全不饱和的)。类似地，正如本文中所用的术语“C1-2烷基”，涉及从具有1-2个碳原子的烃化合物的碳原子除去一个氢原子的单价部分，即甲基或乙基。
由此，术语“烷基”包括以下进行讨论的子类烯基、炔基、环烷基等。
饱和的烷基基团的实例包括，但不限于，甲基(C1)、乙基(C2)、丙基(C3)、丁基(C4)、戊基(C5)、己基(C6)和庚基(C7)。
饱和的直链烷基基团的实例包括，但不限于，甲基(C1)、乙基(C2)、正丙基(C3)、正丁基(C4)、正戊基(戊基(amyl))(C5)、正己基(C6)和正庚基(C7)。
饱和的支链烷基基团的实例包括异丙基(C3)、异丁基(C4)、仲丁基(C4)、叔丁基(C4)、异戊基(C5)和新戊基(C5)。
C2-12烯基：正如本文中所用的术语“-C2-12烯基”，涉及具有一个或多个碳-碳双键的烷基基团。
不饱和的烯基基团的实例包括，但不限于，乙烯基(ethenyl)(乙烯基(vinyl)，-CH＝CH2)、1-丙烯基(-CH＝CH-CH3)、2-丙烯基(烯丙基，-CH-CH＝CH2)、异丙烯基(1-甲基乙烯基，-C(CH3)＝CH2)、丁烯基(C4)、戊烯基(C5)和己烯基(C6)。
C2-12炔基：正如本文中所用的术语“C2-12炔基”，涉及具有一个或多个碳-碳三键的烷基基团。
不饱和炔基基团的实例包括，但不限于，乙炔基(-C≡CH)和2-丙炔基(炔丙基，-CH2-C≡CH)。
C3-12环烷基：正如本文中所用的术语“C3-12环烷基”，涉及还是环基团的烷基基团；即，通过从环状烃(碳环)化合物的脂环族环原子上去除一个氢原子而获得的单价部分，这个部分具有3-7个碳原子，包括3至7个环原子。
环烷基基团的实例包括，但不限于，衍生自以下的那些：
饱和的单环烃化合物：
环丙烷(C3)、环丁烷(C4)、环戊烷(C5)、环己烷(C6)、环庚烷(C7)、甲基环丙烷(C4)、二甲基环丙烷(C5)、甲基环丁烷(C5)、二甲基环丁烷(C6)、甲基环戊烷(C6)、二甲基环戊烷(C7)和甲基环己烷(C7)；
不饱和的单环烃化合物：
环丙烯(C3)、环丁烯(C4)、环戊烯(C5)、环己烯(C6)、甲基环丙烯(C4)、二甲基环丙烯(C5)、甲基环丁烯(C5)、二甲基环丁烯(C6)、甲基环戊烯(C6)、二甲基环戊烯(C7)和甲基环己烯(C7)；和
饱和的多环烃化合物：
降蒈烷(C7)、降蒎烷(C7)、降莰烷(C7)。
C3-20杂环基：正如本文中所用术语“C3-20杂环基”，涉及从杂环化合物的环原子去除一个氢原子而获得的单价部分，这个部分具有3-20个环原子，其中1-10个是环杂原子。优选每个环具有3-7个环原子，其中1-4个是环杂原子。
在本文上下文中，前缀(例如，C3-20、C3-7、C5-6等)是指环原子的数目或环原子数的范围，无论是碳原子或是杂原子。例如，正如本文中所用的术语“C5-6杂环基”，涉及具有5或6个环原子的杂环基基团。
单环杂环基基团的实例包括，但不限于，衍生自以下的那些：
N1：吖丙啶(C3)、吖丁啶(C4)、吡咯烷(四氢吡咯)(C5)、吡咯啉(例如、3-吡咯啉、2,5-二氢吡咯)(C5)、2H-吡咯或3H-吡咯(异吡咯、异唑(异吡咯，isoazole))(C5)、哌啶(C6)、二氢吡啶(C6)、四氢吡啶(C6)、吖庚因(氮杂azepine)(C7)；
O1：环氧乙烷(C3)、氧杂环丁烷(C4)、氧杂环戊烷(四氢呋喃)(C5)、氧杂环戊二烯(二氢呋喃)(C5)、噁烷(四氢吡喃)(C6)、二氢吡喃(C6)、吡喃(C6)、噁庚因(C7)；
S1：环硫乙烷(C3)、硫杂环丁烷(C4)、噻吩烷(四氢噻吩)(C5)、硫杂环戊烷(四氢噻喃)(C6)、硫杂环庚烷(C7)；
O2：二噁茂烷(C5)、二噁烷(C6)和二氧杂环庚烷(C7)；
O3：三噁烷(C6)；
N2：咪唑烷(C5)、吡唑烷(二氮杂环戊烷)(C5)、咪唑啉(C5)、吡唑啉(二氢吡唑)(C5)、哌嗪(C6)；
N1O1：四氢噁唑(C5)、二氢噁唑(C5)、四氢异噁唑(C5)、二氢异噁唑(C5)、吗啉(C6)、四氢噁嗪(C6)、二氢噁嗪(C6)、噁嗪(C6)；
N1S1：噻唑啉(C5)、噻唑烷(C5)、噻吗啉(C6)；
N2O1：噁二嗪(C6)；
O1S1：氧硫杂环戊二烯(C5)和噻噁烷(硫杂噁烷)(C6)；和
N1O1S1：噁噻嗪(C6)。
代的单环杂环基基团的实例包括衍生自环状形式的糖类的那些，例如，呋喃型糖(C5)如阿拉伯呋喃糖、来苏呋喃糖、呋喃核糖和呋喃木糖，和吡喃型糖(C6)如吡喃阿洛糖、吡喃阿卓糖、吡喃葡萄糖、吡喃甘露糖、古洛吡喃糖、吡喃伊多糖、吡喃半乳糖和吡喃太洛糖。
C5-20芳基：正如本文中所用的术语“C5-20芳基”，涉及从部分具有3-20个环原子的芳族化合物的芳环原子除去一个氢原子而获得的单价部分。正如本文中所用的术语“C5-7芳基”，涉及从部分具有5-7个环原子的芳族化合物的芳环原子除去一个氢原子而获得的单价部分。正如本文中所用的术语“C5-10芳基”，涉及从部分具有5-10个环原子的芳族化合物的芳环原子除去一个氢原子而获得的单价部分。优选每个环具有5-7个环原子。
在本文上下文中，前缀(例如，C3-20、C5-7、C5-6、C5-10等)是指环原子的数目或环原子数目的范围，无论是碳原子或还是杂原子。例如，正如本文中所用的术语“C5-6芳基”，涉及具有5或6个环原子的芳基。
环原子可以全都是碳原子，正如在“碳芳基”中。
碳芳基的实例包括，但不限于，衍生自苯(即，苯基)(C6)、萘(C10)、甘菊环烃(C10)、蒽(C14)、菲(C14)、并四苯(C18)和芘(C16)的那些。
含有其中至少一个是芳环的稠合环的芳基的实例包括，但不限于，衍生自二氢茚(例如，2,3-二氢-1H-茚)(C9)、茚(C9)、异茚(C9)、四氢萘(1,2,3,4-四氢萘)(C10)、苊(C12)、芴(C13)、非那烯(C13)、醋菲(C15)和醋蒽(C16)的基团。
另外，环原子可以包括一个或多个杂原子，正如在“杂芳基”中那样。单环杂芳基的实例包括，但不限于，衍生自以下的那些：
N1：吡咯(唑)(C5)，吡啶(吖嗪)(C6)；
O1：呋喃(氧杂环戊二烯)(C5)；
S1：噻吩(硫杂茂)(C5)；
N1O1：噁唑(C5)、异噁唑(C5)、异噁嗪(C6)；
N2O1：噁二唑(呋咱(furazan))(C5)；
N3O1：噁三唑(C5)；
N1S1：噻唑(C5)，异噻唑(C5)；
N2：咪唑(1,3-二唑)(C5)、吡唑(1,2-二唑)(C5)、哒嗪(1,2-二嗪)(C6)、嘧啶(1,3-二嗪)(C6)(例如，胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶)、吡嗪(1,4-二嗪)(C6)；
N3：三唑(C5)，三嗪(C6)；和
N4：四唑(C5)。
含有稠合环的杂芳基的实例，包括，但不限于：
C9(具有2个稠合环)，衍生自苯并呋喃(O1)、异苯并呋喃(O1)、吲哚(N1)、异吲哚(N1)、吲哚嗪(N1)、吲哚啉(N1)、异吲哚啉(N1)、嘌呤(N4)(例如，腺嘌呤、鸟嘌呤)、苯并咪唑(N2)、吲唑(N2)、苯并噁唑(N1O1)、苯并异噁唑(N1O1)、苯并二噁茂(O2)、苯并呋咱(N2O1)、苯并三唑(N3)、硫茚(benzothiofuran)(S1)、苯并噻唑(N1S1)、苯并噻二唑(N2S)；
C10(具有两个稠合环)，衍生自色烯(O1)、异色烯(O1)、色满(O1)、异色满(O1)、苯并二噁烷(O2)、喹啉(N1)、异喹啉(N1)、喹嗪(N1)、苯并噁嗪(N1O1)、苯并二嗪(N2)、吡啶并吡啶(N2)、喹喔啉(N2)、喹唑啉(N2)、噌啉(N2)、酞嗪(N2)、萘啶(N2)、碟啶(N4)；
C11(具有两个稠合环)(N2)，衍生自苯并二氮杂(benzodiazepine)；
C13(具有三个稠合环)，衍生自咔唑(N1)、二苯并呋喃(O1)、二苯并噻吩(S1)、咔啉(N2)、呸啶(N2)、吡啶并吲哚(N2)；和
C14(具有三个稠合环)，衍生自吖啶(N1)、呫吨(xanthene)(O1)、噻吨(thioxanthene)(S1)、氧杂蒽烯(oxanthrene)(O2)、吩噁噻(phenoxathiin)(O1S1)、吩嗪(N2)、吩噁嗪(N1O1)、吩噻嗪(N1S1)、噻蒽(S2)、菲啶(N1)、邻二氮杂菲(N2)、吩嗪(N2)。
以上基团，无论是单独的或是另一取代基的部分，自身可以可选地用一个或多个选自其自身和以下所列的其它取代基进行取代。
卤代基：-F、-Cl、-Br和-I。
羟基：-OH。
醚：-OR，其中R是醚取代基，例如，C1-7烷基基团(也称之为C1-7烷氧基基团，以下进行讨论)，C3-20杂环基基团(也称之为C3-20杂环氧基基团)或C5-20芳基(也称之为C5-20芳氧基基团)，优选C1-7烷基基团。
烷氧基：-OR，其中R是烷基基团，例如，C1-7烷基基团。C1-7烷氧基基团的实例包括，但不限于，-OMe(甲氧基)、-OEt(乙氧基)、-O(nPr)(正丙氧基)、-O(iPr)(异丙氧基)、-O(nBu)(正丁氧基)、-O(sBu)(仲丁氧基)、-O(iBu)(异丁氧基)和-O(tBu)(叔丁氧基)。
缩醛：-CH(OR1)(OR2)，其中R1和R2独立地是缩醛取代基，例如，C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团、或C5-20芳基，优选C1-7烷基基团，或者在“环状”缩醛基团的情况下，R1和R2连同两个连接它们的氧原子，和连接它们的碳原子一起，形成具有4-8个环原子的杂环。缩醛基团的实例包括，但不限于，-CH(OMe)2、-CH(OEt)2和-CH(OMe)(OEt)。
半缩醛：-CH(OH)(OR1)，其中R1是半缩醛取代基，例如，C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团、或C5-20芳基，优选C1-7烷基基团。半缩醛基团的实例包括，但不限于，-CH(OH)(OMe)和-CH(OH)(OEt)。
缩酮：-CR(OR1)(OR2)，其中R1和R2如对于缩醛的定义，且R是除了氢之外的缩酮取代基，例如，C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团、或C5-20芳基，优选C1-7烷基基团。缩酮基团的实例包括，但不限于，-C(Me)(OMe)2、-C(Me)(OEt)2、-C(Me)(OMe)(OEt)、-C(Et)(OMe)2、-C(Et)(OEt)2和-C(Et)(OMe)(OEt)。
半缩酮：-CR(OH)(OR1)，其中R1如对于半缩醛的定义，且R是除了氢之外的半缩酮取代基，例如，C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团、或C5-20芳基，优选C1-7烷基基团。半缩醛基团的实例包括，但不限于，-C(Me)(OH)(OMe)、-C(Et)(OH)(OMe)、-C(Me)(OH)(OEt)和-C(Et)(OH)(OEt)。
氧代(酮，-酮)：＝O。
硫代(硫酮)：＝S。
亚氨基(亚胺)：＝NR，其中R是亚胺取代基，例如，氢、C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团、或C5-20芳基，优选氢或C1-7烷基基团。酯基团(亚氨基团)的实例包括，但不限于，＝NH、＝NMe、＝NEt和＝NPh。
甲酰基(醛，甲醛)：-C(＝O)H。
酰基(酮基)：-C(＝O)R，其中R是酰基取代基，例如，C1-7烷基基团(也称之为C1-7烷基酰基或C1-7烷酰基)、C3-20杂环基基团(也称之为C3-20杂环酰基)、或C5-20芳基(也称之为C5-20芳酰基)，优选C1-7烷基基团。酰基基团的实例包括，但不限于，-C(＝O)CH3(乙酰基)、-C(＝O)CH2CH3(丙酰基)、-C(＝O)C(CH3)3(叔丁酰基)和-C(＝O)Ph(苯甲酰基、苯酮基)。
羧基(羧酸)：-C(＝O)OH。
硫代羧基(硫代羧酸)：-C(＝S)SH。
硫赶(Thiolo)羧基(硫赶羧酸)：-C(＝O)SH。
硫逐(Thiono)羧基(硫逐羧酸)：-C(＝S)OH。
亚氨酸：-C(＝NH)OH。
羟肟酸：-C(＝NOH)OH。
酯(羧酸酯、羧酸酯、氧羰基)：-C(＝O)OR，其中R是酯取代基，例如，C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团、或C5-20芳基，优选C1-7烷基基团。酯基团的实例包括，但不限于，-C(＝O)OCH3、-C(＝O)OCH2CH3、-C(＝O)OC(CH3)3和-C(＝O)OPh。
酰氧基(反向酯)：-OC(＝O)R，其中R是酰氧基取代基，例如，C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团、或C5-20芳基，优选C1-7烷基基团。酰氧基基团的实例包括，但不限于，-OC(＝O)CH3(乙酰氧基)、-OC(＝O)CH2CH3、-OC(＝O)C(CH3)3、-OC(＝O)Ph和OC(＝O)CH2Ph。
酯氧基(Oxycarboyloxy)：-OC(＝O)OR，其中R是酯取代基，例如，C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团、或C5-20芳基，优选C1-7烷基基团。酯基团的实例包括，但不限于，-OC(＝O)OCH3、-OC(＝O)OCH2CH3、-OC(＝O)OC(CH3)3和-OC(＝O)OPh。
氨基：-NR1R2，其中R1和R2独立地是氨基取代基，例如，氢、C1-7烷基基团(也称之为C1-7烷氨基或二C1-7烷基氨基)、C3-20杂环基基团、或C5-20芳基，优选H或C1-7烷基基团，或者在“环状”氨基基团的情况下，R1和R2连同连接它们的氮原子一起，形成具有4-8个环原子的杂环。氨基基团可以是伯(-NH2)、仲(-NHR1)、或叔(-NHR1R2)，且以阳离子形式，可以是季铵(-+NR1R2R3)。氨基基团的实例包括，但不限于，-NH2、-NHCH3、-NHC(CH3)2、-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2和-NHPh。环状氨基基团的实例包括，但不限于，氮丙啶基、氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基和硫代吗啉基。
酰胺基(氨基甲酰基、氨甲酰基、氨基羰基、甲酰胺基)：-C(＝O)NR1R2，其中R1和R2独立地是氨基取代基，正如对于氨基基团的定义。酰胺基基团的实例包括，但不限于，-C(＝O)NH2、-C(＝O)NHCH3、-C(＝O)N(CH3)2、-C(＝O)NHCH2CH3和-C(＝O)N(CH2CH3)2，以及其中R1和R2连同连接它们的氮原子一起形成杂环结构的酰胺基团，正如在，例如，哌啶基羰基、吗啉基羰基、硫代吗啉基羰基和哌嗪基羰基中的那些。
硫代酰胺基(硫代氨甲酰基)：-C(＝S)NR1R2，其中R1和R2独立地是氨基取代基，正如对于氨基基团的定义。酰胺基基团的实例包括，但不限于，-C(＝S)NH2、-C(＝S)NHCH3、-C(＝S)N(CH3)2和-C(＝S)NHCH2CH3。
酰基酰胺(酰基氨基)：-NR1C(＝O)R2，其中R1是酰胺取代基，例如，氢、C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团、或C5-20芳基，优选氢或C1-7烷基基团，且R2是酰基取代基，例如，C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团、或C5-20芳基，优选氢或C1-7烷基基团。酰基酰胺基团的实例包括，但不限于，-NHC(＝O)CH3、-NHC(＝O)CH2CH3和-NHC(＝O)Ph。R1和R2可以一起形成环状结构，正如在，例如，琥珀酰亚胺、马来酰亚胺和邻苯二甲酰亚胺中的那些：
氨基羰氧基：-OC(＝O)NR1R2，其中R1和R2独立地是氨基取代基，正如对于氨基基团的定义。氨基羰氧基基团的实例包括，但不限于，-OC(＝O)NH2、-OC(＝O)NHMe、-OC(＝O)NMe2和-OC(＝O)NEt2。
脲基：-N(R1)CONR2R3，其中R2和R3独立地是氨基取代基，正如对于氨基基团的定义，且R1是脲基取代基，例如，氢、C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团、或C5-20芳基，优选氢或C1-7烷基基团。脲基基团的实例包括，但不限于，-NHCONH2、-NHCONHMe、-NHCONHEt、-NHCONMe2、-NHCONEt2、-NMeCONH2、-NMeCONHMe、-NMeCONHEt、-NMeCONMe2和-NMeCONEt2。
胍基：-NH-C(＝NH)NH2。
四唑基：具有四个氮原子和一个碳原子的五元芳环，
亚氨基：＝NR，其中R是亚氨基取代基，例如，例如，氢、C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团、或C5-20芳基，优选H或C1-7烷基基团。亚氨基基团的实例包括，但不限于，＝NH、＝NMe和＝NEt。
脒(脒基)：-C(＝NR)NR2，其中各个R是脒取代基，例如，氢、C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团、或C5-20芳基，优选H或C1-7烷基基团。脒基团的实例包括，但不限于，-C(＝NH)NH2、-C(＝NH)NMe2和-C(＝NMe)NMe2。
硝基：-NO2。
亚硝基：-NO。
叠氮基：-N3。
氰基(腈基、腈)：-CN。
异氰基：-NC。
氰酰：-OCN。
异氰酰：-NCO。
氰硫基(硫氰酸基)：-SCN。
异氰硫基(异硫氰酸基)：-NCS。
巯基(硫羟基，氢硫基)：-SH。
硫代醚(硫醚)：-SR，其中R是硫醚取代基，例如，C1-7烷基基团(也称之为C1-7烷硫基基团)、C3-20杂环基基团、或C5-20芳基，优选C1-7烷基基团。C1-7烷硫基基团的实例包括，但不限于，-SCH3和-SCH2CH3。
二硫醚：-SS-R，其中R是二硫化物取代基，例如，C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团、或C5-20芳基，优选C1-7烷基基团(本文中也称为C1-7烷基二硫醚)。C1-7烷基二硫化物基团的实例包括，但不限于，-SSCH3和-SSCH2CH3。
亚硫酰基(亚磺酰基，亚砜)：-S(＝O)R，其中R是亚硫酰基取代基，例如，C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团、或C5-20芳基，优选C1-7烷基基团。亚硫酰基基团的实例包括，但不限于，-S(＝O)CH3和-S(＝O)CH2CH3。
砜(磺酰基)：-S(＝O)2R，其中R是砜取代基，例如，C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团、或C5-20芳基，优选C1-7烷基基团，包括，例如，氟化或全氟化C1-7烷基基团。砜基团的实例包括，但不限于，-S(＝O)2CH3(甲基磺酰基，甲磺酰基)、-S(＝O)2CF3(三氟甲磺酰基)、-S(＝O)2CH2CH3(乙磺酰基)、-S(＝O)2C4F9(九氟丁磺酰基)、-S(＝O)2CH2CF3(三氟乙磺酰基)、-S(＝O)2CH2CH2NH2(牛磺酰基)、-S(＝O)2Ph(苯基磺酰基，苯磺酰基)、4-甲基苯磺酰基(甲苯磺酰基)、4-氯苯磺酰基(氯苯磺酰基)、4-溴苯磺酰基(溴苯磺酰基)、4-硝基苯基(硝基苯磺酰基)、2-萘磺酸酯(萘磺酰基)和5-二甲基氨基-萘-1-基磺酸酯(丹磺酰基)。
亚磺酸(亚磺基)：-S(＝O)OH，-SO2H。
磺酸(磺基)：-S(＝O)2OH，-SO3H。
亚磺酸酯(亚磺酸酯)：-S(＝O)OR；其中R是亚磺酸酯取代基，例如，C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团、或C5-20芳基，优选C1-7烷基基团。亚磺酸酯基团的实例包括，但不限于，-S(＝O)OCH3(甲氧基亚磺酰基；甲基亚磺酸酯)和-S(＝O)OCH2CH3(乙氧基亚磺酰基；亚磺酸乙基酯)。
磺酸酯(磺酸酯)：-S(＝O)2OR，其中R是磺酸酯取代基，例如，C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团、或C5-20芳基，优选C1-7烷基基团。磺酸酯基团的实例包括，但不限于，-S(＝O)2OCH3(甲氧基磺酰基；磺酸甲基酯)和-S(＝O)2OCH2CH3(乙氧基磺酰基；磺酸乙基酯)。
亚磺酰氧基：-OS(＝O)R，其中R是亚磺酰氧基取代基，例如，C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团、或C5-20芳基，优选C1-7烷基基团。亚磺酰氧基基团的实例包括，但不限于，-OS(＝O)CH3和-OS(＝O)CH2CH3。
磺酰氧基：-OS(＝O)2R，其中R是磺酰氧基取代基，例如，C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团、或C5-20芳基，优选C1-7烷基基团。磺酰氧基基团的实例包括，但不限于，-OS(＝O)2CH3(甲磺酸酯)和-OS(＝O)2CH2CH3(乙磺酸酯)。
硫酸酯：-OS(＝O)2OR；其中R是硫酸酯取代基，例如，C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团、或C5-20芳基，优选C1-7烷基基团。硫酸酯基团的实例包括，但不限于，-OS(＝O)2OCH3和SO(＝O)2OCH2CH3。
氨磺酰基(氨磺酰；亚磺酸酰胺；亚磺酰胺)：-S(＝O)NR1R2，其中R1和R2独立地是氨基取代基，正如对于氨基基团的定义。氨磺酰基基团的实例包括，但不限于，-S(＝O)NH2、-S(＝O)NH(CH3)、-S(＝O)N(CH3)2、-S(＝O)NH(CH2CH3)、-S(＝O)N(CH2CH3)2和-S(＝O)NHPh。
磺酰胺基(胺亚磺酰基；磺酸酰胺；磺酰胺)：-S(＝O)2NR1R2，其中R1和R2独立地是氨基取代基，正如对于氨基基团的定义。磺酰胺基基团的实例包括，但不限于，-S(＝O)2NH2、-S(＝O)2NH(CH3)、-S(＝O)2N(CH3)2、-S(＝O)2NH(CH2CH3)、-S(＝O)2N(CH2CH3)2和-S(＝O)2NHPh。
磺氨基：-NR1S(＝O)2OH，其中R1是氨基取代基，正如对于氨基基团的定义。磺氨基基团的实例包括，但不限于，-NHS(＝O)2OH和-N(CH3)S(＝O)2OH。
磺酰氨基：-NR1S(＝O)2R，其中R1是氨基取代基，正如对于氨基基团的定义，且R是磺酰氨基取代基，例如，C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团、或C5-20芳基，优选C1-7烷基基团。磺酰氨基基团的实例包括，但不限于，-NHS(＝O)2CH3和-N(CH3)S(＝O)2C6H5。
亚磺酰氨基：-NR1S(＝O)R，其中R1是氨基取代基，正如对于氨基基团的定义，且R是亚磺酰氨基取代基，例如，C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团、或C5-20芳基，优选C1-7烷基基团。亚磺酰氨基基团的实例包括，但不限于，-NHS(＝O)CH3和-N(CH3)S(＝O)C6H5。
膦基(磷化氢)：-PR2，其中R是膦基取代基，例如，-H、C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团、或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基基团、或C5-20芳基。膦基基团的实例包括，但不限于，-PH2、-P(CH3)2、-P(CH2CH3)2、-P(t-Bu)2和P(Ph)2。
磷基：-P(＝O)2。
氧膦基(氧化膦)：-P(＝O)R2，其中R是氧膦基取代基，例如，C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团、或C5-20芳基，优选C1-7烷基基团或C5-20芳基。氧膦基基团的实例包括，但不限于，-P(＝O)(CH3)2、-P(＝O)(CH2CH3)2、-P(＝O)(t-Bu)2和-P(＝O)(Ph)2。
膦酸(膦酰基)：-P(＝O)(OH)2。
膦酸酯(膦酰基酯)：-P(＝O)(OR)2，其中R是膦酸酯取代基，例如，-H、C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团、或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基基团、或C5-20芳基。膦酸酯基团的实例包括，但不限于，-P(＝O)(OCH3)2、-P(＝O)(OCH2CH3)2、-P(＝O)(O-t-Bu)2和-P(＝O)(OPh)2。
磷酸(磷酸氧基)：-OP(＝O)(OH)2。
磷酸酯(磷酸氧基酯)：-OP(＝O)(OR)2，其中R是磷酸酯取代基，例如，-H、C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团、或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基基团、或C5-20芳基。磷酸酯基团的实例包括，但不限于，-OP(＝O)(OCH3)2、-OP(＝O)(OCH2CH3)2、-OP(＝O)(O-t-Bu)2和-OP(＝O)(OPh)2。
亚磷酸：-OP(OH)2。
亚磷酸酯：-OP(OR)2，其中R是亚磷酸酯取代基，例如，-H、C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团、或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基基团、或C5-20芳基。亚磷酸酯基团的实例包括，但不限于，-OP(OCH3)2、-OP(OCH2CH3)2、-OP(O-t-Bu)2和-OP(OPh)2。
亚磷酰胺酯：-OP(OR1)-NR2 2，其中R1和R2是亚磷酰胺取代基，例如，-H、(可选取代的)C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团、或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基基团、或C5-20芳基。亚磷酰胺基团的实例包括，但不限于，-OP(OCH2CH3)-N(CH3)2、-OP(OCH2CH3)-N(i-Pr)2和-OP(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2。
磷酰胺酯：-OP(＝O)(OR1)-NR2 2，其中R1和R2是磷酰胺酯取代基，例如，-H、(可选取代的)C1-7烷基基团、C3-20杂环基基团、或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基基团、或C5-20芳基。磷酰胺酯基团的实例包括，但不限于，-OP(＝O)(OCH2CH3)-N(CH3)2、-OP(＝O)(OCH2CH3)-N(i-Pr)2和-OP(＝O)(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2。
结合物
本发明提供了含有经由连接子单元连接至配体单元的PBD二聚体的结合物。在一个实施方式中，连接子单元包括延伸子(Stretcher)单元(A)，特异性单元(L1)和间隔子单元(L2)。连接子单元在一端连接至配体单元(L)且在另一端连接至PBD二聚体化合物(D)。
在一个方面中，这种结合物如下式IVa所示：
L-(A1 a-L1 s-L2 y-D)p (IVa)
或其药用盐或溶剂化物，其中：
L是配体单元；和
-A1 a-L1 s-L2 y-是连接子单元(LU)，其中：
-A1-是延伸子单元，
a为1或2，
-L1-是特异性单元，
s是0-12范围内的整数，
-L2-是间隔子单元，
y为0、1或2；
-D是PBD二聚体；和
p为1-20。
在另一方面中，这种结合物如以下式IVb所示：
也如以下所示：
L-(A1 a-L2 y(-L1 s)-D)p (IVb)
或其药用盐或溶剂化物，其中：
L是配体单元；和
-A1 a-L1 s(L2 y)-是连接子单元(LU)，其中：
-A1-是连接至延伸子单元(L2)的延伸子单元，
a为1或2，
-L1-是连接至延伸子单元(L2)的特异性单元，
s是0-12范围内的整数，
-L2-是间隔子单元，
y为0、1或2；
-D是PBD二聚体；和
p为1-20。
优先选择
以下优先选择可以适用于以上描述的本发明所有方面，或可以涉及单个方面。可以以任何组合将优先选择组合至一起。
在一个实施方式中，结合物具有以下式：
L-(A1 a-L1 s-L2 y-D)p，
L-(A1 a-Ls 1-D)p，
L-(A1-L1-D)p或
L-(A1-D)p
或其药用盐或溶剂化物，其中L、A1、a、L1、s、L2、D、y和p如以上。
在一个实施方式中，配体单元(L)是特异性结合至靶细胞表面上的靶分子的细胞结合剂(CBA)。示例性结构式如下所示：
其中星号指示连接至药物单元(D)的连接点，CBA是细胞结合剂，L1是特异性单元，A1是将L1连接至细胞结合剂的延伸子单元，L2是间隔子单元，其是共价键、自降解型(self-immolative)基团或连同-OC(＝O)-一起形成自降解型基团，且L2是可选的。-OC(＝O)-根据需要可以当作是L1或L2的部分。
在另一个实施方式中，配体单元(L)是特异性结合至靶细胞表面上的靶分子的细胞结合剂(CBA)。示例性结构简式如下所示：
CBA–A1 a–L1 s–L2 y–*。
其中星号指示连接至药物单元(D)的连接点，CBA是细胞结合剂，L1是特异性单元，A1是将L1连接至细胞结合剂的延伸子单元，L2是间隔子单元，其是共价键或自降解型基团，且a为1或2，s为0、1或2，且y为0或1或2。
在以上举例说明的实施方式中，L1可以是可分解的特异性单元，并当存在自降解型基团时可以称之为分解时激活自降解型基团(或多个自降解型基团)L2的“触发器”。当特异性单元L1分解时，或L1和L2之间的连接(即，共价键)分解时，自降解型基团释放药物单元(D)。
在另一个实施方式中，配体单元(L)是特异性结合至靶细胞表面上的靶分子的细胞结合剂(CBA)。示例性结构简式如下所示：
其中星号指示连接至药物(D)的连接点，CBA是细胞结合剂，L1是连接至L2的特异性单元，A1是将L2连接至细胞结合剂的延伸子单元，L2是自降解型基团，且a为1或2，s为1或2，且y为1或2。
在本文所讨论的各种实施方式中，L1和L2的性质可以有很大的不同。这些基团基于其特性进行选择，其特性可以部分由结合物要递送的位点的病症确定。在特异性单元L1可分解的情况下，L1的结构和/或序列经过选择而使之通过靶位点(例如，靶细胞)存在的酶的作用而发生分解。也可以使用通过pH(例如，酸或碱易分解的)、温度的变化或在辐照(例如，光易分解的)时可分解的L1单元。在还原或氧化条件下可分解的L1单元也可以在结合物中得到应用。
在一些实施方式中，L1可以包含一个氨基酸或氨基酸的连续序列。氨基酸序列可以是酶的靶底物。
在一个实施方式中，L1通过酶的作用是可分解的。在一个实施方式中，酶是酯酶或肽酶。例如，L1可以通过溶酶体蛋白酶如组织蛋白酶进行分解。
在一个实施方式中，存在L2并连同-C(＝O)O-一起形成一个自降解型基团或多个自降解型基团。在一些实施方式中，-C(＝O)O-也是自降解型基团。
在一个实施方式中，在L1是通过酶作用可分解且存在L2的情况下，酶分解L1和L2之间的键，由此自降解型基团释放药物单元。
L1和L2，在存在的情况下，可以通过选自以下的键连接：
-C(＝O)NH-，
-C(＝O)O-，
-NHC(＝O)-，
-OC(＝O)-，
-OC(＝O)O-，
-NHC(＝O)O-，
-OC(＝O)NH-，
-NHC(＝O)NH，和
-O-(糖苷键)。
连接至L2的L1的氨基基团可以是氨基酸的N-端或可以衍生自氨基酸侧链例如赖氨酸氨基酸侧链的氨基基团。
连接至L2的L1的羧基基团可以是氨基酸C-端或可以衍生自氨基酸侧链，例如，谷氨酸氨基酸侧链的羧基基团。
连接至L2的L1的羟基基团可以衍生自氨基酸侧链例如丝氨酸氨基酸侧链的羟基基团。
在一个实施方式中，-C(＝O)O-和L2一起形成基团：
其中星号指示连接至药物单元的连接点，波浪线指示连接至L1的连接点，Y是-N(H)-、-O-、-C(＝O)N(H)-或-C(＝O)O-，且n为0-3。亚苯基环用1、2或3个如本文中的取代基可选取代。
在一个实施方式中，Y是NH。
在一个实施方式中，n为0或1。优选，n为0。
在Y是NH且n为0的情况下，自降解型基团可以称之为对氨基苄基羰基连接子(PABC)。
自降解型基团在连接子中的远点(remote site)被活化且沿着以下示出线路(对于n＝0)进行时将会容许释放药物单元(即，不对称PBD)：
其中星号指示对药物的连接，L*是连接子活化形式的其余部分且释放的药物单元未显示。这些基团具有将活化位点与药物分离开的优点。
在另一个实施方式中，-C(＝O)O-和L2一起形成选自以下各项的基团：
其中星号、波浪线、Y和n如以上的定义。每个亚苯基环都用1、2或3个如本文中的取代基可选取代。在一个实施方式中，具有Y取代基的亚苯基环是可选取代的，并且没有Y取代基的亚苯基环是未取代的。
在另一个实施方式中，-C(＝O)O-和L2一起形成选自以下的基团：
其中星号、波浪线、Y和n如以上的定义，E是O、S或NR，D是N、CH、或CR，且F是N、CH、或CR。
在一个实施方式中，D是N。
在一个实施方式中，D是CH。
在一个实施方式中，E是O或S。
在一个实施方式中，F是CH。
在优选的实施方式中，L1和L2之间的共价键是组织蛋白酶易分解的(例如，可分解的)键。
在一个实施方式中，L1含有二肽。在二肽中的氨基酸可以是天然氨基酸和非天然氨基酸的任意组合。在一些实施方式中，二肽包含天然氨基酸。在连接子是组织蛋白酶易分解的连接子的情况下，二肽是对于组织蛋白酶介导分解的作用位点。二肽随后是组织蛋白酶的识别位点。
在一个实施方式中，在二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-选自：
-Phe-Lys-，
-Val-Ala-，
-Val-Lys-，
-Ala-Lys-，
-Val-Cit-，
-Phe-Cit-，
-Leu-Cit-，
-Ile-Cit-，
-Phe-Arg-，和
-Trp-Cit-；
其中Cit是瓜氨酸。在这种二肽中，-NH-是X1的氨基基团，且CO是X2的羰基基团。
优选在二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-选自：
-Phe-Lys-，
-Val-Ala-，
-Val-Lys-，
-Ala-Lys-，和
-Val-Cit-。
最优选二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-是-Phe-Lys-、Val-Cit或-Val-Ala-。
其它所关注的二肽组合包括：
-Gly-Gly-，
-Pro-Pro-，和
-Val-Glu-。
其它二肽组合可以使用，包括由文献Dubowchik et al.描述的那些，该文献以其全文和出于所有目的结合于本文中作为参考。
在一个实施方式中，氨基酸侧链在适当情况下是化学保护的。侧链保护基团可以是如下进行讨论的基团。受保护的氨基酸序列可以通过酶分解。例如，含有Boc侧链保护的Lys残基的二肽序列是组织蛋白酶可分解的。
氨基酸的侧链的保护基团在本领域是熟知的，且描述于Novabiochem产品目录中。其它保护基团策略描述于文献Protective Groups in Organic Synthesis，Greene andWuts中。
可能的侧链保护基团如下对于具有反应性侧链官能团的那些氨基酸所示：
Arg：Z、Mtr、Tos；
Asn：Trt、Xan；
Asp：Bzl、t-Bu；
Cys：Acm、Bzl、Bzl-OMe、Bzl-Me、Trt；
Glu：Bzl、t-Bu；
Gln：Trt、Xan；
His：Boc、Dnp、Tos、Trt；
Lys：Boc、Z-Cl、Fmoc、Z；
Ser：Bzl、TBDMS、TBDPS；
Thr：Bz；
Trp：Boc；
Tyr：Bzl、Z、Z-Br。
在一个实施方式中，-X2-间接连接至药物单元。在这个实施方式中，存在间隔子单元L2。
在一个实施方式中，-X2-直接连接至药物单元。在这个实施方式中，不存在间隔子单元L2。
在一个实施方式中，二肽与自降解型基团(间隔子单元)组合使用。自降解型基团可以连接至-X2-。
在存在自降解型基团的情况下，-X2-直接连接至自降解型基团。在一个实施方式中，-X2-连接至自降解型基团的基团Y。优选基团-X2-CO-连接至Y，其中Y是NH。
在一个实施方式中，-X1-直接连接至A1。优选基团NH-X1-(X1的氨基端)连接至A1。A1可以包含官能团-CO-由此与-X1-形成酰胺。
在一个实施方式中，L1和L2连同-OC(＝O)-一起包含基团-X1-X2-PABC-。PABC基团直接连接至药物单元。在一个实施例中，自降解型基团和二肽一起形成基团-Phe-Lys-PABC-，这如下所示：
其中星号指示连接至药物单元的连接点，且波浪线指示连接至L1其余部分的连接点或连接至A1的连接点。优选波浪线指示连接至A1的连接点。
另外，自降解型基团和二肽一起形成基团-Val-Ala-PABC-，这如下所示：
其中星号和波浪线如以上的定义。
在另一个实施方式中，L1和L2连同-OC(＝O)-一起表示：
其中星号指示连接至药物单元的连接点，波浪线指示连接至A1的连接点，Y是共价键或官能团，且E是易于分解从而活化自降解型基团的基团。
E经过选择而使基团，例如，通过光或通过酶的作用易于分解。E可以是-NO2或葡糖醛酸(例如，β-葡糖醛酸)，前者可以易于受到硝基还原酶的作用，后者易于受到β-葡糖苷酸酶的作用。
基团Y可以是共价键。
基团Y可以是选自以下的官能团：
-C(＝O)-，
-NH-，
-O-，
-C(＝O)NH-，
-C(＝O)O-，
-NHC(＝O)-，
-OC(＝O)-，
-OC(＝O)O-，
-NHC(＝O)O-，
-OC(＝O)NH-，
-NHC(＝O)NH-，
-NHC(＝O)NH，
-C(＝O)NHC(＝O)-，
SO2，和
-S-。
基团Y优选–NH-、-CH2-、-O-和-S-。
在一些实施方式中，L1和L2连同-OC(＝O)-一起表示：
其中星号指示连接至药物单元的连接点，波浪线指示连接至A的连接点，Y是共价键或官能团且E是葡萄糖醛酸(例如，β-葡萄糖醛酸)。Y优选是选自以下的官能团：-NH-。
在一些实施方式中，L1和L2一起表示：
其中星号指示连接至L2其余部分或药物单元的连接点，波浪线指示连接至A1的连接点，Y是共价键或官能团且E是葡萄糖醛酸(例如，β-葡萄糖醛酸)。Y优选是选自-NH-、-CH2-、-O-和-S-的官能团。
在一些进一步的实施方式中，Y是如上提出的官能团，官能团连接至氨基酸，且氨基连接至延伸子单元A1。在一些实施方式中，氨基酸是β-丙氨酸。在这个实施方式中，氨基酸等同当作延伸子单元的部分。
特异性单元L1和配体单元经由延伸子单元间接连接。
L1和A1可以通过选自以下的键连接：
-C(＝O)NH-，
-C(＝O)O-，
-NHC(＝O)-，
-OC(＝O)-，
-OC(＝O)O-，
-NHC(＝O)O-，
-OC(＝O)NH-，和
-NHC(＝O)NH-。
在一个实施方式中，基团A1是：
其中星号指示连接至L1、L2或D的连接点，波浪线指示连接至配体单元的连接点，且n为0-6。在一个实施方式中，n为5。
在一个实施方式中，基团A1是：
其中星号指示连接至L1、L2或D的连接点，波浪线指示连接至配体单元的连接点，且n为0-6。在一个实施方式中，n为5。
在一个实施方式中，基团A1是：
其中星号指示连接至L1、L2或D的连接点，波浪线指示连接至配体单元的连接点，n为0或1，且m为0-30。在优选的实施方式中，n为1且m为0-10、1-8，优选4-8，最优选4或8。
在一个实施方式中，基团A1是：
其中星号指示连接至L1、L2或D的连接点，波浪线指示连接至配体单元的连接点，n为0或1，且m为0-30。在优选的实施方式中，n为1且m为0-10、1-8，优选4-8，最优选4或8。
在一个实施方式中，基团A1是：
其中星号指示连接至L1、L2或D的连接点，波浪线指示连接至配体单元的连接点，且n为0-6。在一个实施方式中，n为5。
在一个实施方式中，基团A1是：
其中星号指示连接至L1、L2或D的连接点，波浪线指示连接至配体单元的连接点，且n为0-6。在一个实施方式中，n为5。
在一个实施方式中，基团A1是：
其中星号指示连接至L1、L2或D的连接点，波浪线指示连接至配体单元的连接点，n为0或1，且m为0-30。在优选的实施方式中，n为1且m为0-10、1-8，优选4-8，最优选4或8。
在一个实施方式中，基团A1是：
其中星号指示连接至L1、L2或D的连接点，波浪线指示连接至配体单元的连接点，n为0或1，且m为0-30。在优选的实施方式中，n为1且m为0-10、1-8，优选4-8，最优选4或8。
在一个实施方式中，配体单元和A1之间通过配体单元的巯基残基和A1的马来酰亚胺基团连接。
在一个实施方式中，配体单元和A1之间的连接是：
其中星号指示连接至A1、L1、L2或D的其余部分的连接点，且波浪线指示连接至配体单元的其余部分的连接点。在这个实施方式中，S原子通常衍生自配体单元。
在以上每一个实施方式中，其它官能团都以用于代替如下所示的马来酰亚胺(maleimide)衍生的基团：
其中波浪线如前指示连接至配体单元的连接点，且星号指示键接至A1基团的其余部分的键，或键接至L1、L2或D的键。
在一个实施方式中，马来酰亚胺衍生的基团用以下基团代替：
其中波浪线指示连接至配体单元的连接点，且星号指示键接至A1基团的其余部分的键，或键接至L1、L2或D的键。
在一个实施方式中，马来酰亚胺衍生的基团用以下基团代替，其可选地连同配体单元(例如，细胞结合剂)一起，选自：
-C(＝O)NH-，
-C(＝O)O-，
-NHC(＝O)-，
-OC(＝O)-，
-OC(＝O)O-，
-NHC(＝O)O-，
-OC(＝O)NH-，
-NHC(＝O)NH-，
-NHC(＝O)NH，
-C(＝O)NHC(＝O)-，
-S-，
-S-S-，
-CH2C(＝O)-
-C(＝O)CH2-，
＝N-NH-，和
-NH-N＝。
在这些之中，当羰基基团键连至-NH-时，可以特别优选-C(＝O)CH2-。
在一个实施方式中，马来酰亚胺衍生的基团用以下基团代替，其可选地连同配体单元一起，选自：
其中波浪线指示连接至配体单元的连接点或键接至A1基团其余部分的键，且星号指示连接至配体单元的其它连接点或键连至A1基团的其余部分的键。
其它适合将L1连接至细胞结合剂的基团描述于WO 2005/082023中。
在一个实施方式中，存在延伸子单元A1，存在特异性单元L1且不存在间隔子单元L2。由此，L1和药物单元经由键直接连接。相同地在这个实施方式中，L2是键。
L1和D可以通过选自以下的键进行连接：
-C(＝O)N<，
-OC(＝O)N<，和
-NHC(＝O)N<，
其中N<是D的部分。
在一个实施方式中，L1和D优选通过以下键连接：
-C(＝O)N<。
在一个实施方式中，L1包含二肽且二肽的一端连接至D。正如以上，二肽中的氨基酸可以是天然氨基酸或非天然氨基酸的任意组合。在一些实施方式中，二肽包含天然氨基酸。在连接子是组织蛋白酶易分解连接子的情况下，二肽是组织蛋白酶介导分解的作用位点。二肽随后就是组织蛋白酶的识别位点。
在一个实施方式中，二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-选自：
-Phe-Lys-，
-Val-Ala-，
-Val-Lys-，
-Ala-Lys-，
-Val-Cit-，
-Phe-Cit-，
-Leu-Cit-，
-Ile-Cit-，
-Phe-Arg-，和
-Trp-Cit-；
其中Cit是瓜氨酸。在这种二肽中，-NH-是X1的氨基基团，且CO是X2的羰基基团。
优选二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-选自：
-Phe-Lys-，
-Val-Ala-，
-Val-Lys-，
-Ala-Lys-，和
-Val-Cit-。
最优选二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-是-Phe-Lys-或-Val-Ala-。
其它所关注的二肽组合包括：
-Gly-Gly-，
-Pro-Pro-，和
-Val-Glu-。
其它二肽组合可以使用，包括以上的那些。
在一个实施方式中，L1-D是：
-NH-X1-X2-CO-N＜*。
其中-NH-X1-X2-CO是二肽，-N<是药物单元的部分，星号指示连接至药物单元的其余部分的连接点，且波浪线指示连接至L1的其余部分的连接点或连接至A1的连接点。优选波浪线指示连接至A1的连接点。
在一个实施方式中，二肽是缬氨酸-丙氨酸且L1-D是：
其中星号，-N<和波浪线如以上的定义。
在一个实施方式中，二肽是苯丙氨酸-赖氨酸且L1-D是：
其中星号，-N<和波浪线如以上的定义。
在一个实施方式中，二肽是缬氨酸-瓜氨酸。
在一个实施方式中，基团A1-L1是：
其中星号指示连接至L2或D的连接点，波浪线指示连接至配体单元的连接点，且n为0-6。在一个实施方式中，n为5。
在一个实施方式中，基团A1-L1是：
其中星号指示连接至L2或D的连接点，波浪线指示连接至配体单元的连接点，且n为0-6。在一个实施方式中，n为5。
在一个实施方式中，基团A1-L1是：
其中星号指示连接至L2或D的连接点，波浪线指示连接至配体单元的连接点，n为0或1，且m为0-30。在优选的实施方式中，n为1且m为0-10。1-8，优选4-8，最优选4或8。
在一个实施方式中，基团A1-L1是：
其中星号指示连接至L2或D的连接点，波浪线指示连接至配体单元的连接点，n为0或1，且m为0-30。在优选的实施方式中，n为1且m为0-10、1-7，优选3-7，最优选3或7。
在一个实施方式中，基团A1-L1是：
其中星号指示连接至L2或D的连接点，波浪线指示连接至配体单元的连接点，且n为0-6。在一个实施方式中，n为5。
在一个实施方式中，基团A1-L1是：
其中星号指示连接至L2或D的连接点，波浪线指示连接至配体单元的连接点，且n为0-6。在一个实施方式中，n为5。
在一个实施方式中，基团A1-L1是：
其中星号指示连接至L2或D的连接点，波浪线指示连接至配体单元的连接点，n为0或1，且m为0-30。在优选的实施方式中，n为1且m为0-10、1-8，优选4-8，最优选4或8。
在一个实施方式中，基团A1-L1是：
其中星号指示连接至L2或D的连接点，波浪线指示连接至配体单元的连接点，n为0或1，且m为0-30。在优选的实施方式中，n为1且m为0-10、1-8，优选4-8，最优选4或8。
在一个实施方式中，基团L-A1-L1是：
其中星号指示连接至L2或D的连接点，S是配体单元的硫基团，波浪线指示连接至配体单元的其余部分的连接点，且n为0-6。在一个实施方式中，n为5。
在一个实施方式中，基团L-A1-L1是：
其中星号指示连接至L2或D的连接点，S是配体单元的硫基团，波浪线指示连接至配体单元的其余部分的连接点，且n为0-6。在一个实施方式中，n为5。
在一个实施方式中，基团L-A1-L1是：
其中星号指示连接至L2或D的连接点，S是配体单元的硫基团，波浪线指示连接至配体单元的其余部分的连接点，n为0或1，且m为0-30。在优选的实施方式中，n为1且m为0-10、1-8，优选4-8，最优选4或8。
在一个实施方式中，基团L-A1-L1是：
其中星号指示连接至L2或D的连接点，波浪线指示连接至配体单元的连接点，n为0或1，且m为0-30。在优选的实施方式中，n为1且m为0-10、1-7，优选4-8，最优选4或8。
在一个实施方式中，基团L-A1-L1是：
其中星号指示连接至L2或D的连接点，波浪线指示连接至配体单元的其余部分的连接点，且n为0-6。在一个实施方式中，n为5。
在一个实施方式中，基团L-A1-L1是：
其中星号指示连接至L2或D的连接点，波浪线指示连接至配体单元的其余部分的连接点，且n为0-6。在一个实施方式中，n为5。
在一个实施方式中，基团L-A1-L1是：
其中星号指示连接至L2或D的连接点，波浪线指示连接至配体单元的其余部分的连接点，n为0或1，且m为0-30。在优选的实施方式中，n为1且m为0-10、1-8，优选4-8，最优选4或8。
在一个实施方式中，基团L-A1-L1是：
其中星号指示连接至L2或D的连接点，波浪线指示连接至配体单元的其余部分的连接点，n为0或1，且m为0-30。在优选的实施方式中，n为1且m为0-10、1-8，优选4-8，最优选4或8。
在一个实施方式中，延伸子单元是乙酰胺单元，具有下式：
-CH2-CO-N-*。
其中星号指示连接至延伸子单元的其余部分L1或D的连接点，且波浪线指示连接至配体单元的连接点。
连接子-药物
在其它实施方式中，提供连接子-药物化合物用于对配体单元进行结合。在一个实施方式中，连接子-药物化合物设计用于连接至细胞结合剂。
在一个实施方式中，药物连接子化合物具有下式：
其中星号指示连接至药物单元(D，正如以上的定义)的连接点，G1是形成对配体单元连接的延伸基团(A1)，L1是特异性单元，L2(间隔子单元)是共价键或连同-OC(＝O)-一起形成自降解型基团。
在另一个实施方式中，药物连接子化合物具有下式：
G1-L1-L2-*。
其中星号指示连接至药物单元(D)的连接点，G1是形成对配体单元连接的延伸子单元(A1)，L1是特异性单元，L2(间隔子单元)是共价键或自降解型基团。
L1和L2如以上的定义。所指对A1的连接在本文中可以解释为是指对G1的连接。
在一个实施方式中，在L1含有氨基酸的情况下，该氨基酸的侧链可以进行保护。任何合适的保护基团都可以使用。在一个实施方式中，侧链保护基团可以与化合物中的其它如果存在的保护基团一起去除。在其它实施方式中，保护基团可以与分子中如果存在的其它保护基团正交(orthogonal)。
氨基酸侧链合适的保护基团包括描述于Novabiochem Catalog2006/2007中的那些。对于在组织蛋白酶易分解连接子中的保护基团也在文献Dubowchik et al中讨论。
在本发明的某些实施方式中，基团L1包含Lys氨基酸残基。氨基酸的侧链可以用Boc或Alloc保护基团进行保护。Boc保护基团是最优选的。
官能团G1一旦与配体单元(例如，细胞结合剂)反应就形成连接子基团。
在一个实施方式中，官能团G1是或者包含与配体单元上合适的基团反应的氨基、羧酸、羟基、巯基、或马来酰亚胺基团。在优选的实施方式中，G1包含马来酰亚胺基团。
在一个实施方式中，基团G1是烷基马来酰亚胺基团。基团适合与存在于细胞结合剂中，例如，存在于抗体中的巯基基团，尤其是半胱氨酸的巯基基团发生反应。
在一个实施方式中，基团G1是：
其中星号指示连接至L1、L2或D的连接点，且n为0-6。在一个实施方式中，n为5。
在一个实施方式中，基团G1是：
其中星号指示连接至L1、L2或D的连接点，且n为0-6。在一个实施方式中，n为5。
在一个实施方式中，基团G1是：
其中星号指示连接至L1、L2或D的连接点，n为0或1，且m为0-30。在优选的实施方式中，n为1且m为0-10、1-2，优选4-8，且最优选4或8。
在一个实施方式中，基团G1是：
其中星号指示连接至L1、L2或D的连接点，n为0或1，且m为0-30。在优选的实施方式中，n为1且m为0-10、1-8，优选4-8，且最优选4或8。
在一个实施方式中，基团G1是：
其中星号指示连接至L1、L2或D的连接点，且n为0-6。在一个实施方式中，n为5。
在一个实施方式中，基团G1是：
其中星号指示连接至L1、L2或D的连接点，且n为0-6。在一个实施方式中，n为5。
在一个实施方式中，基团G1是：
其中星号指示连接至L1、L2或D的连接点，n为0或1，且m为0-30。在优选的实施方式中，n为1且m为0-10、1-2，优选4-8，且最优选4或8。
在一个实施方式中，基团G1是：
其中星号指示连接至L1、L2或D的连接点，n为0或1，且m为0-30。在优选的实施方式中，n为1且m为0-10、1-8，优选4-8，且最优选4或8。
在以上每一个实施方式中，可以使用另一种官能团代替以下所示的马来酰亚胺基团：
其中星号指示键连G基团的其余部分的键。
在一个实施方式中，马来酰亚胺衍生的基团用以下基团代替：
其中星号指示键连G基团的其余部分的键。
在一个实施方式中，马来酰亚胺基团用选自以下的基团代替：
-C(＝O)OH，
-OH，
-NH2，
-SH，
-C(＝O)CH-2X，其中X是Cl、Br或I，
-CHO，
-NHNH2，
-C≡CH，和
-N3(叠氮)。
在这些基团中，尤其是在羰基基团键接至-NH-时，可以优选-C(＝O)CH-2X。
在一个实施方式中，存在L1，且G1是-NH2、-NHMe、-COOH、-OH或-SH。
在一个实施方式中，在存在L1的情况下，G1是-NH2或-NHMe。任一个基团可以是L1氨基酸序列的N-端。
在一个实施方式中，存在L1且G1是-NH2，且L1是氨基酸序列-X1-X2-，正如以上的定义。
在一个实施方式中，存在L1且G1是COOH。该基团可以是L1氨基酸序列的C-端。
在一个实施方式中，存在L1且G1是OH。
在一个实施方式中，存在L1且G1是SH。
基团G1可以从一个官能团转化成另一个。在一个实施方式中，存在L1且G1是-NH2。基团可转化成含有马来酰亚胺基团的另一个基团G1。例如，基团-NH2可以与这些含以上所示的马来酰亚胺的G1基团的酸或活化的酸(例如，N-琥珀酰亚胺形式)发生反应。
因此基团G1可以转化成更适合与配体单元反应的官能团。
正如以上，在一个实施方式中，存在L1且G1是-NH2、-NHMe、-COOH、-OH或-SH。在进一步的实施方式中，这些基团以化学保护的形式提供。因此化学保护的形式是提供官能团的连接子的前体。
在一个实施方式中，G1是化学保护形式的-NH2。基团可以用氨基甲酸酯保护基团进行保护。氨基甲酸酯保护基团可以选自由以下组成的组：
Alloc、Fmoc、Boc、Troc、Teoc、Cbz和PNZ。
优选在G1是-NH2的情况下，其用Alloc或Fmoc基团进行保护。
在一个实施方式中，在G1是-NH2的情况下，其用Fmoc基团进行保护。
在一个实施方式中，保护基团与封端基团(capping group)的氨基甲酸酯保护基团相同。
在一个实施方式中，保护基团与封端基团的氨基甲酸酯保护基团不相同。在这个实施方式中，优选保护基团在不除去封端基团的氨基甲酸酯保护基团的条件下是可以除去的。
化学保护基团可以去除从而提供形成对配体单元连接的官能团。可选地，官能团然后可转化为如以上的另一种官能团。
在一个实施方式中，活性基团是胺，这种胺优选肽的N-端胺，并可以是本发明的优选二肽的N-端胺。
活性基团可以经过反应而产生意图形成对配体单元连接的官能团。
在其它实施方式中，连接子单元是具有活性基团的连接子单元的前体。在这个实施方式中，连接子单元包含活性基团，其是通过保护基团的方式进行保护的。保护基团可以被除去从而提供具有活性基团的连接子单元。
在活性基团是胺的情况下，保护基团可以是胺保护基团，如文献Green and Wuts中描述的那些。
保护基团优选与连接子单元中如果存在的其它保护基团正交正交。
在一个实施方式中，保护基团与封端基团正交。由此，活性基团保护基团在保留封端基团时是可以除去的。在其它实施方式中，保护基团和封端基团在与用于除去封端基团的相同条件下是可以除去的。
在一个实施方式中，连接子单元是：
其中星号指示连接至药物单元的连接点，且波浪线如果合适指示连接至连接子单元的其余部分的连接点，或连接至G1的连接点。优选波浪线指示连接至G1的连接点。
在一个实施方式中，连接子单元是：
其中星号和波浪线如以上的定义。
其它适用于形成L1和细胞结合剂之间的连接的官能团描述于WO2005/082023中。
配体单元
配体单元可以是任何类型的，并且包括特异性结合至靶标分子的蛋白质、多肽、肽和非肽试剂。在一些实施方式中，配体单元可以是蛋白质、多肽或肽。在一些实施方式中，配体单元可以是环状的多肽，这些配体单元可以包括抗体或包含至少一个靶分子结合位点的抗体片段、淋巴因子、激素、生长因子或任何其它可以特异性结合至靶标的细胞结合分子或物质。配体单元本文中也称为“结合剂”或“靶向试剂”。
术语“特异性地结合”和“特异性的结合”是指抗体或其它蛋白质、多肽或肽对预定分子(例如，抗原)的结合。通常，抗体或其它分子会以至少约1×107M-1的亲合力进行结合，并以相比于其结合至除了预定分子或密切相关的分子的非特异性分子(例如，BSA、酪蛋白)的亲合力高至少2倍的亲合力结合至预定分子。
配体单元的实例包括那些适用于WO 2007/085930中的试剂，其以其全部内容和出于所有目的并入本文。
在一些实施方式中，配体单元是结合至细胞上胞外靶标的细胞结合剂，这些细胞结合剂可以是蛋白质、多肽、肽或非肽试剂。在一些实施方式中，细胞结合剂可以是蛋白质、多肽或肽。在一些实施方式中，细胞结合剂可以是环状多肽。细胞结合剂还可以是抗体或抗体的抗原结合片段。由此，在一个实施方式中，本发明提供了抗体-药物结合物(ADC)。
在一个实施方式中，抗体是单克隆抗体；嵌合抗体；人源化抗体；全人抗体；或单链抗体。在一个实施方式中，抗体是那些具有生物活性的抗体之一的片段。这种片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段。
抗体可以是双价抗体，域抗体(domain antibody，DAB)或单链抗体。
在一个实施方式中，抗体是单克隆抗体。
本发明中使用的抗体包括在WO 2005/082023中描述的那些抗体，该专利以其全部内容和出于所有目的结合于本文中作为参考，特别优选的是那些肿瘤相关抗原的抗体。本领域已知这些抗原的实例包括，但不限于，那些描述于WO 2005/082023的肿瘤相关的抗原，参见，例如，第41-55页。
在一些实施方式中，结合物经过设计而经由其细胞表面抗原靶向肿瘤细胞。抗原可以是过表达或者在异常时间或细胞类型下表达的细胞表面抗原。优选靶抗原仅仅表达于增殖性细胞(优选肿瘤细胞)上；然而，这种情况很少在实际中观察到。因此，靶抗原通常基于增殖性和健康组织之间的差异表达进行选择。
针对靶标特异性肿瘤相关的抗原已经提出的抗体、包括：Cripto、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、糖蛋白NMB、CanAg、Her2(ErbB2/Neu)、CD56(NCAM)、CD70、CD79、CD138、PSCA、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、BCMA、E-选择蛋白、EphB2、黑素转铁蛋白(Melanotransferin)、Muc16和TMEFF2。在本文提供的任何实施方式中，配体单元可以是特异性结合至Cripto抗原、CD19抗原、CD20抗原、CD22抗原、CD30抗原、CD33抗原、糖蛋白NMB、CanAg抗原、HER2(ErbB2/Neu)抗原、CD56(NCAM)抗原、CD70抗原、CD79抗原、CD138抗原、PSCA、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、BCMA、E-选择蛋白、EphB2、黑素转铁蛋白、MUC16抗原或抗原TMEFF2的单克隆抗体。
配体单元连接至连接子单元。在一个实施方式中，配体单元连接至连接子单元如果存在的A。
在一个实施方式中，配体单元和连接子单元之间的连接通过硫醚键进行连接。
在一个实施方式中，配体单元和连接子单元之间的连接通过二硫醚键进行连接。
在一个实施方式中，配体单元和连接子单元之间的连接通过酰胺键进行连接。
在一个实施方式中，配体单元和连接子单元之间的连接通过酯键进行连接。
在一个实施方式中，配体单元和连接子之间的连接形成于配体单元的半胱氨酸残基的巯基基团和连接子单元的马来酰亚胺基团之间。
配体单元的半胱氨酸残基可以用于与连接子单元的官能团反应而形成连接。在其它实施方式中，例如，在配体单元是抗体的情况下，抗体的巯基基团可以参与链间二硫醚键。这些链间键在与连接子单元的官能团反应之前可以通过，例如，用DTT处理抗体而转化成游离的巯基基团。
在一些实施方式中，半胱氨酸残基引入到抗体的重或轻链中。通过在抗体重或轻链中取代半胱氨酸插入的位置包括描述于公开的美国专利申请US 2007-0092940和国际专利出版物WO 2008/070593中的那些，这两个专利以其全部内容和出于所有目结合于本文中作为参考。
治疗的方法
本发明的化合物或结合物可以用于治疗方法中。本发明还提供了治疗的方法，包括向需要治疗的受试者给予治疗有效量的本文中所公开的化合物或结合物。术语“治疗有效量”是足以显示对患者受益的用量。这样的受益可以是至少缓解至少一种症状。实际的给药量、以及给药的速率和时程将取决于要治疗的对象的性质和严重度。治疗的处方，例如对剂量的决策，在普通医师和其它医疗大夫的职责之内。
化合物或结合物可以单独或与其它治疗组合给予，同时或按序给予，这取决于要治疗的病症。治疗和疗法的实例包括，但不限于，化疗(活性剂，包括，例如药物的给予)；手术；和放射治疗。
根据本发明的药物组合物，以及根据本发明使用的药物组合物，除了活性成分，即本文中公开的化合物或结合物之外，可以包含药用赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员所熟知的其它物质。这样的物质应是无毒的，并且不应干扰活性成分的功效。载体或其它物质的精确性质将取决于给予的途径，这可以是口服或通过注射，例如皮内、皮下、或静脉内注射。
口服给予的药物组合物可以是片剂、胶囊剂、散剂或液体形式。片剂可以包含固体载体或佐剂。液体药物组合物通常包含液体载体如水、石油(petroleum)、动物或植物油、矿物油或合成油。生理盐水溶液，葡萄糖或其它糖类溶液、或二醇类如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇都可以包括在内。胶囊剂可以包含固体载体，例如明胶。
对于静脉内、皮内或皮下注射、或者痛苦部位注射，活性成分将是以非肠道用的水溶液形式，这种形式是无热原的，且具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域相关的技术人员能够使用，例如，等渗载体如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸化林格氏注射液制备合适的溶液。防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加剂都可以按需要包括在内。
化合物和结合物可以用于治疗增殖性疾病和自身免疫性疾病。术语“增殖性疾病”涉及体外或体内非所需的过量或异常细胞的有害或失控细胞增殖，如肿瘤性或增生性生长。
增殖性病症的实例包括，但不限于，良性、前恶性和恶性细胞增殖，包括但不限于，赘生物和肿瘤(例如，组织细胞瘤、神经胶质瘤、星形胶质细胞瘤、骨瘤)、癌症(例如，肺癌、小细胞肺癌、胃肠道癌、肠癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、脑癌、肉瘤、骨肉瘤、卡波西氏肉瘤、黑色素瘤)、白血病、银屑病、骨疾病、纤维性增殖障碍(例如，结缔组织的)和动脉粥样硬化。其它所关注的癌症包括，但不限于，血液性疾病；恶性肿瘤如白血病和淋巴瘤，如非霍奇金淋巴瘤，和亚型如DLBCL，边缘区，外套区，和滤泡，霍奇金淋巴瘤，AML，和其它B或T细胞源的癌症。
自身免疫性疾病的实例包括以下这些：类风湿关节炎、自身免疫性脱髓鞘疾病(例如，多发性硬化、过敏性脑脊髓炎)、银屑病关节炎、内分泌性眼病、葡萄膜视网膜炎、系统性红斑狼疮、重症肌无力、格雷夫斯氏病、肾小球性肾炎、自身免疫性肝病、炎性肠病(例如，克罗恩氏病)、过敏症、过敏性反应、干燥综合征、I型糖尿病、原发性胆汁性肝硬化、韦格纳氏肉芽肿病、纤维肌痛、多发性肌炎、皮肌炎、多发性内分泌衰竭、施密特氏综合征、自身免疫性葡萄膜炎、阿狄森氏病、肾上腺炎、甲状腺炎、桥本氏甲状腺炎、自身免疫性甲状腺疾病、恶性贫血、胃萎缩、慢性肝炎、狼疮状肝炎、动脉粥样硬化、亚急性皮肤红斑狼疮、甲状旁腺功能减退、德雷斯勒氏综合征、自身免疫性血小板减少症、特发性血小板减少性紫癜、溶血性贫血、寻常性天疱疮、天疱疮、疱疹样皮炎、斑秃、类天疱疮、硬皮病、进行性全身性硬化症、CREST综合征(钙质沉着症、雷诺氏现象、食管运动功能障碍、指端硬化和毛细血管扩张)、男性和女性自身免疫性不孕不育、强直性脊椎炎、溃疡性结肠炎、混合性结缔组织病、结节性多动脉炎、系统性坏死性血管炎、特应性皮炎、过敏性鼻炎、肺出血肾炎综合征、美洲锥虫病、结节病、风湿热、哮喘、复发性流产、抗磷脂综合征、农民肺、多形性红斑、心脏切开术后综合征、皮质醇增多症、自身免疫性慢性活动性肝炎、鸟类爱好者肺、中毒性表皮坏死松解症、奥尔波特综合征、肺泡炎、过敏性肺泡炎、纤维化肺泡炎、间质性肺病、结节性红斑、坏疽性脓皮、输血反应、高安氏动脉炎、风湿性多肌痛、颞动脉炎、血吸虫病、巨细胞动脉炎、蛔虫病、曲霉病、阿司匹林三联症(Sampter’s syndrome)、湿疹、淋巴瘤样肉芽肿病、贝切特氏病、卡普兰综合征、川崎氏病、登革热、脑脊髓炎、心内膜炎、心内膜心肌纤维化、眼内炎、持久性隆起性红斑(erythema elevatum et diutinum)、银屑病、胎儿成红细胞增多症、嗜酸细胞性筋膜炎、舒尔曼综合征、费尔蒂氏综合征、丝虫病、睫状体炎、慢性睫状体炎、异时睫状体炎、富克斯氏异色虹膜睫状体炎、IgA肾病、过敏性紫癜、移植物抗宿主病、移植排斥反应、心肌病、伊顿-兰伯特综合征、复发性多软骨炎、冷球蛋白血症、原发性巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulemia)、埃文氏综合征和自身免疫性腺衰竭。
在一些实施方式中，自身免疫性疾病是B淋巴细胞的失调(例如，系统性红斑狼疮、肺出血肾炎综合征、类风湿性关节炎和I型糖尿病)、Th1-淋巴细胞(例如，类风湿关节炎、多发性硬化、牛皮癣、干燥综合征、桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯病、原发性胆汁性肝硬化、韦格纳氏肉芽肿病、肺结核、或移植物抗宿主病)、或Th2淋巴细胞(例如，特应性皮炎、系统性红斑狼疮、特应性哮喘、结膜炎、过敏性鼻炎、欧门氏综合征(Omenn’s syndrome)、系统性硬化病、或慢性移植物抗宿主病)。一般而言，涉及树突状细胞的疾病会涉及Th1淋巴细胞或Th2型淋巴细胞性的失调症。在一些实施方式中，自身免疫性紊乱症是T细胞介导的免疫学疾病。
在一些实施方式中，所给予的结合物的量范围为约0.01-约10mg/kg/剂量。在一些实施方式中，所给予的结合物的量范围为约0.01-约5mg/kg/剂量。在一些实施方式中，所给予的结合物的量范围为约0.05-约5mg/kg/剂量。在一些实施方式中，所给予的结合物的量范围为约0.1-约5mg/kg/剂量。在一些实施方式中，所给予的结合物的量范围为约0.1-约4mg/kg/剂量。在一些实施方式中，所给予的结合物的量范围为约0.05-约3mg/kg/剂量。在一些实施方式中，所给予的结合物的量范围为约0.1-约3mg/kg/剂量。在一些实施方式中，所给予的结合物的量范围为约0.1-约2mg/kg/剂量。
包括的其它形式
除非另有说明，以上包括的是这些取代基公知的离子、盐、溶剂化物和受保护形式。例如，所指的羧酸(COOH)也包括阴离子(羧酸盐)形式(-COO-)、其盐或溶剂化物、以及常规的受保护形式。类似地，所指的氨基基团包括氨基基团的质子化形式(-N+HR1R2)、盐或溶剂化物，例如盐酸盐，以及氨基基团的常规受保护形式。类似地，所指的羟基基团还包括阴离子形式(-O-)、其盐或其溶剂化物、以及常规的受保护形式。
盐
制备、纯化、和/或处理活性化合物的相应盐，例如，药用盐，可以是方便或合乎需要的。药用盐的实例讨论于文献Berge，et al.，J.Pharm.Sci.，66，1-19(1977)中。
例如，如果化合物是阴离子性的，或具有可以是阴离子的官能团(例如-COOH可以是-COO-)，则盐可以与合适的阳离子一起形成。合适的无机阳离子的实例包括，但不限于，碱金属离子如Na+和K+、碱土金属阳离子如Ca2+和Mg2+以及其它阳离子如Al3+。合适的有机阳离子的实例包括，但不限于，铵离子(即，NH4 +)和取代的铵离子(例如，NH3R+、NH2R2 +、NHR3 +、NR4 +)。一些合适的取代铵离子的实例是衍生自以下的那些：乙胺、二乙胺、二环己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苄胺、苯基苄胺、胆碱、甲葡胺和氨基丁三醇、以及氨基酸，如赖氨酸和精氨酸。常见的季铵离子的实例是N(CH3)4 +。
如果化合物是阳离子，或具有可以是阳离子的官能团(例如，-NH2可以是-NH3 +)，则盐可与合适的阴离子形成。合适的无机阴离子的实例包括，但不限于，衍生自以下无机酸的那些：盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、亚硫酸、硝酸、亚硝酸、磷酸和亚磷酸。
合适的有机阴离子的实例包括，但不限于，衍生自以下有机酸的那些：2-乙酰氧基苯甲酸、乙酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯甲酸、樟脑磺酸、肉桂酸、柠檬酸、依他酸、乙二磺酸、乙磺酸、富马酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、羟基马来酸、羟基萘甲酸、羟乙磺酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、甲磺酸、粘酸、油酸、草酸、棕榈酸、双羟萘酸、泛酸、苯乙酸、苯磺酸、丙酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、对氨基苯磺酸、酒石酸、甲苯磺酸和戊酸。合适的聚合有机阴离子的实例包括，但不限于，衍生自以下聚合物酸的那些：单宁酸、羧基甲基纤维素。
溶剂化物
制备、纯化和/或处理活性化合物的相应溶剂化物可以是方便的或合乎需要的。在本文中术语“溶剂化物”按照常规意义使用且是指溶质(例如，活性化合物、活性化合物的盐)和溶剂的复合物。如果溶剂是水，则溶剂化物可以方便地称为水合物，例如，单水合物、二水合物、三水合物，等。
甲醇胺
本发明包括其中溶剂加成在横跨PBD部分的亚胺键的化合物，其如下所示，其中溶剂是水或醇(RAOH，其中RA是C1-4烷基)：
这些形式可以称之为PBD的甲醇胺和甲醇胺醚的形式。这些平衡形式的平衡取决于发现化合物的条件，以及部分自身的性质。
这些具体的化合物可以是以固体形式，例如，通过冻干进行分离。
异构体
某些化合物可以以一种或多种以下形式存在：特定几何形状、光学、对映异构体、非对映异构体、差向异构体、阿托异构体(反转异构体，atropic)、立体异构体、互变异构体、构象、或端基异构(异头)形式，包括，但不限于，顺式(cis-)和反式(trans-)；E-和Z-形式；c-、t-和r-形式；内-和外-形式；R-、S-和内消旋形式；D-和L-形式；d-和l-形式；(+)和(-)形式；酮基-、烯醇-和烯醇化物的形式；顺式(syn-)和反式(anti-)；顺错(synclinal-)式和反错(anticlinal-)式；α-和β-形式；经式和面式；船式、椅式、扭式、信封式和半椅式；以及它们的组合，此后统称为“异构体”(或者“异构体形式”)。
需要注意的是，除了如以下对互变异构形式进行的讨论外，尤其是从如本文中所用的术语“异构体”排除的是结构(或构造)异构体(即，原子之间的连接，且不仅仅是由原子的空间位置存在差异)。例如，所指的甲氧基基团，-OCH3，不应当解释为是指其结构异构体，羟甲基基团，-CH2OH。类似地，所指的邻-氯苯基不应解释为是指其结构异构体，间-氯苯基。然而，所指的结构分类可以充分包括属于该类别中的结构异构体形式(例如，C1-7烷基包括正丙基和异丙基；丁基包括正、异、仲和叔丁基；甲氧基苯基包括邻、间和对甲氧基苯基)。
上述排除不涉及正如在，例如，下列互变异构对中的互变异构形式，例如，酮基-、烯醇-和烯醇化物的形式：酮基/烯醇(如下所示)、亚胺/烯胺、酰胺/亚氨基醇、脒/脒、亚硝基/肟、硫酮/烯硫醇、N-亚硝基/羟基偶氮(hyroxyazo)、以及硝基/酸式硝基。
应指出，尤其是包括于术语“异构体”中的是具有一个或多个同位素的取代的化合物。例如，H可以是任何同位素形式，包括1H、2H(D)和3H(T)；C可是任何同位素形式，包括12C、13C和14C；O可以是任何同位素形式，包括16O和18O；等。
除非另外指明，所指的具体化合物包括所有这些异构体形式，包括(全部或部分)外消旋体及它们的其它混合物。制备(例如，不对称合成)和分离(例如，分步结晶和色谱手段)这种异构体形式的方法在本技术领域内是已知的或可以通过按照已知的方式调整本文教导的方法，或已知的方法而很容易获得。
一般合成路径
PBD化合物的合成广泛地讨论于以下文献中，这些讨论以其全部内容和出于所有目的结合于本文中作为参考：
a)WO 00/12508(第14-30页)；
b)WO 2005/023814(第3-10页)；
c)WO 2004/043963(第28-29页)；和
d)WO 2005/085251(第30-39页)。
合成路径
本发明的化合物，其中R10和R11形成氮和碳原子之间键接它们的氮-碳双键，可以由下式2的化合物进行合成：
其中n为0或1，且R2和R12代表本发明化合物的C2芳族基团，正如下表所示：
ProtN是用于合成的氮保护基团且ProtO是用于合成的氧保护基团或氧代基团，通过标准方法进行亚胺键的去保护。
所产生的化合物可以是以其甲醇胺或甲醇胺醚形式，这取决于所使用的溶剂。例如，如果ProtN是Troc且ProtO是进行合成的氧保护基团，则脱保护使用Cd/Pd对进行以得到本发明的化合物。如果ProtN是SEM，或类似基团，且ProtO是氧代基团，则氧代基团可以通过还原而去除，这种还原会导致产生受保护的甲醇胺中间体，其随后可以经过处理从而去除SEM保护基团，接着消除水。式2的化合物的还原可以通过，例如，超氢化物或四硼氢化锂完成，同时除去SEM保护基团的合适手段是用硅胶进行处理。
式2的化合物可以由式3a的化合物通过偶联含有R12的有机金属衍生物如有机硼衍生物而进行合成：
其中R2、ProtN和ProtO正如对于式2的化合物的定义。有机硼衍生物可以是硼酸酯(盐)或硼酸。
式2的化合物可以由式3b的化合物通过偶联含有R2的有机金属衍生物如有机硼衍生物而进行合成：
其中R12、ProtN和ProtO正如对于式2的化合物的定义。有机硼衍生物可以是硼酸酯(盐)或硼酸。
式3a和3b的化合物可以由式4的化合物通过偶联单一当量(例如，0.9或1-1.1或1.2)的含R2或R12的有机金属衍生物，如有机硼衍生物进行合成：
其中ProtN和ProtO正如对于式2的化合物的定义。
上述偶联反应通常在钯催化剂，例如Pd(PPh3)4、Pd(OCOCH3)2、PdCl2、Pd2(dba)3存在下进行。偶联可以在标准条件下进行，或也可以在微波条件下进行。
两个偶联步骤通常按序进行。它们可以在两个步骤之间进行纯化或不无需纯化的情况下进行。如果没有进行纯化，则这两个步骤可以在同一反应容器中进行。在第二个偶联步骤后通常需要纯化。从不需要的副产物中纯化出化合物可以通过柱色谱或离子交换分离进行。
式4中ProtO是氧代基团且ProtN是SEM的化合物的合成详细描述于WO 00/12508中，该文献以其全部内容和出于所有目的结合于本文中作为参考。具体而言，参照第24页的图解式(scheme)7，其中上述化合物标示为中间体P。该合成方法也描述于WO 2004/043963中，该文献以其全部内容和出于所有目的结合于本文中作为参考。也进一步参照WO2010/043880(第36-45页)中式化合物8a和8b的合成，该文献以其全部内容和出于所有目的结合于本文中作为参考。
式4中ProtO是用于合成的氧保护基团的化合物的合成描述于WO2005/085251中，其合成以其全部内容和出于所有目的结合于本文中作为参考。
本发明的化合物，其中R10和R10’是H且R11和R11’是SOzM，可以由其中R10和R11形成氮和碳原子之间键接它们的氮-碳双键的本发明的化合物通过加入合适的亚硫酸氢盐或亚磺酸盐，随后通过适当的纯化步骤进行合成。进一步的方法描述于GB 2053894中，该文献结合于本文中作为参考。
在本发明的一些实施方式中，这可以是式2的化合物用于药物连接子化合物的合成中。在这些实施方式中，N10/C11保护基团的去除可以发生于药物连接子化合物的合成期间。
用于合成的氮保护基团
用于合成的氮保护基团在本领域内是众所周知的。在本发明中，尤其感兴趣的保护基团是氨基甲酸酯氮保护基团和半缩醛胺氮保护基团。
氨基甲酸酯氮保护基团具有以下结构：
其中R’10是正如以上的R。大量的合适基团描述于文献Greene，T.W.and Wuts，G.M.，Protective Groups in Organic Synthesis，3rd Edition，John Wiley&Sons，Inc.，1999，p503-549中，以其全部内容和出于所有目的结合于本文中作为参考。
尤其优选的保护基团包括Troc、Teoc、Fmoc、BOC、Doc、Hoc、TcBOC、1-Adoc和2-Adoc。
其它可能的基团是硝基苄氧基羰基(例如，4-硝基苄氧基羰基)和2-(苯基磺酰基)乙氧基羰基。
这些可以采用钯催化剂去除的保护基团是非优选的，例如Alloc。
半缩醛胺氮保护基团具有以下结构：
其中R’10是正如以上的R。大量合适的基团描述于文献Greene，T.W.and Wuts，G.M.，Protective Groups in Organic Synthesis，3rd Edition，John Wiley&Sons，Inc.，1999，p633-647中作为酰胺保护基团，以其全部内容和出于所有目的结合于本文中作为参考。本文中公开的基团可以适用于本发明的化合物。这种基团包括，但不限于，SEM、MOM、MTM、MEM、BOM、硝基或甲氧基取代的BOM、Cl3CCH2OCH2-。
用于合成的氧保护基团
用于合成的氧保护基团在本领域内是众所周知的。大量合适的氧保护基团描述于文献Greene，T.W.and Wuts，G.M.，Protective Groups in Organic Synthesis，3rdEdition，John Wiley&Sons，Inc.，1999，p23-200中，该文献以其全文和出于所有目的结合于本文中作为参考。
尤其感兴趣的类型包括甲硅烷基醚、甲基醚、烷基醚、苄基醚、酯、乙酸酯、苯甲酸酯、碳酸酯和磺酸酯。
优选的氧保护基团包括乙酸酯类，TBS和THP。
药物结合物的合成
如本文中含有PBD二聚体的结合物可以使用本领域技术人员的知识结合本文所提供的教导进行制备。例如，连接子描述于美国专利号6,214,345、美国专利号7,498,298以及WO 2009/0117531中，每一个以其全部内容并出于所有目的结合于本文中作为参考。其它连接子可以根据本文引用的参考文献或按照本领域技术人员所知进行制备。
连接子-药物化合物可以按照本领域内已知的方法结合本文所提供的教导进行制备。例如，胺-基的X取代基(PBD二聚体药物单元的)连接至连接子单元的活性基团，可以按照美国专利号6,214,345和7,498,298；以及WO 2009-0117531中概述的方法，或按照本领域技术人员的所知进行。
抗体可以结合于连接子-药物化合物，正如文献Doronina et al.，NatureBiotechnology，2003，21，778-784中。简言之，含有50mM硼酸钠pH 7.4的PBS中的抗体(4-5mg/mL)在37℃下用三(羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)还原。反应还原链间二硫键，其进程通过与5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)反应进行监测并允许进行直至达到巯基/mAb的所需水平。还原的抗体随后冷却至0℃，并每抗体巯基用1.5当量的马来酰亚胺药物-连接子进行烷基化。1小时后，通过加入5当量的N-乙酰基半胱氨酸冷激(终止，quench)反应。经冷激的药物-连接子通过在PD-10柱上凝胶过滤而去除。ADC然后通过0.22μm针筒过滤器进行无菌过滤。蛋白浓度可以分别通过280nm和329nm处的光谱分析并在280nm处对药物吸光度的贡献进行校正而测定。尺寸排阻色谱法可以用于测定抗体团聚的程度，而RP-HPLC法可以用于测定剩余NAC冷激的药物-连接子的水平。
具有所引入的半胱氨酸残基的抗体按照国际专利出版物WO2008/070593中或如下结合至连接子-药物化合物，该专利以其全部内容和出于所有目的结合于本文中作为参考。在重链中含有所引入的半胱氨酸残基的抗体通过加入10当量TCEP和1mM EDTA并用1M Tris缓冲液(pH9.0)调节pH至7.4进行完全还原。经过37℃下1小时温育之后，将反应冷却至22℃并加入30当量的脱氢抗坏血酸进行选择性再氧化天然二硫键，同时使引入的半胱氨酸处于还原态。pH值用1M的Tris缓冲液(pH3.7)调节至6.5，反应允许在22℃下进行1小时。然后通过加入1M的Tris缓冲液(pH9.0)将溶液的pH值再次升高到7.4。3.5当量在DMSO中的PBD药物连接子放置于合适的容器中用丙二醇进行稀释后加入到反应中。为了保持PBD药物连接子的溶解性，抗体本身首先用丙二醇稀释至33％的最终浓度(例如，如果抗体溶液处于60mL的反应体积中，则加入30mL丙二醇)。这种相同体积的丙二醇(本实施例中30mL)作为稀释剂加入到PBD药物连接子中。混合后，PBD药物连接子的丙二醇溶液加入到抗体溶液中以完成结合；丙二醇的最终浓度为50％。反应允许继续进行30分钟，随后通过加入5当量N-乙酰半胱氨酸冷激。ADC通过30kD膜超滤进行纯化。(应指出，在反应中使用的丙二醇的浓度可以对于任何具体的PBD进行降低，因为其唯一的目的是为了维持药物连接子在水性介质中的溶解度。)
对于基于卤代乙酰胺的连结剂-药物化合物，结合一般可以如下进行。向在10mMTris(pH 7.4)中的还原和再氧化的抗体(重链中具有引入的半胱氨酸)、50mM氯化钠和2mMDTPA的溶液中加入0.5体积的丙二醇。基于乙酰胺的连接子-药物化合物在二甲基乙酰胺中的10mM溶液在结合之前立即制备。将与加入到抗体溶液中等量的丙二醇加入到6倍摩尔过量的上述连接子-药物化合物中。稀的连接子-药物溶液加入到抗体溶液中并将pH用1MTris(pH 9)调节至8-8.5。结合反应容许在37℃下进行45分钟。结合通过还原和变性反相PLRP-S色谱验证。过量的连接子-药物化合物用Quadrasil MP树脂除去并采用PD-10脱盐柱将缓冲剂交换到10mM Tris(pH 7.4)、50mMNaCl和5％丙二醇中。
药物连接子的示例性合成图解方案
以下图解方案是用于合成药物连接子的示例性路径。
图解方案A
R2’代表将PBD核连接至NH2基团(对于化合物C1，NH2基团被NHMe代替)的R2(如以上的定义)的部分。n是如以上的定义。
葡萄糖醛酸连接子中间体S1(参考：Jeffrey et al.，Bioconjugate Chemistry，2006，17，831-840)，可以用双光气于-78℃下二氯甲烷中进行处理以获得葡萄糖醛酸氯甲酸酯，其随后通过逐滴滴加与溶解于CH2Cl2中的PBD二聚体S2进行反应。在2小时内升温反应至0℃，接着进行萃取，获得化合物S3。用氢氧化锂一水合物处理S3在MeOH、四氢呋喃和水的等溶剂混合物(冷却至0℃)中的溶液4小时，然后与冰醋酸的反应将产生化合物S4。将马来酰亚胺己酰基NHS加入至S4在DMF中的溶液中，接着加入二异丙基乙胺，并在室温和氮气之下搅拌2小时，将获得所需的药物连接子S5。
实施例2、3、4、6、7和8的方法可以适用于本发明的所有PBD化合物。
进一步的优选
以下优选可以适用于如上本发明的所有方面，或可以涉及单个方面。这些优选可以以任何组合形式组合至一起。
当R10是氨基甲酸酯氮保护基团时，其可以优选是Teoc、Fmoc和Troc，且可以更优选是Troc。
当R11是O-ProtO时，其中ProtO是氧保护基团，则ProtO可以优选是TBS或THP，并可以更优选是TBS。
当R10是半缩醛胺氮保护基团时，其可以优选是MOM、BOM或SEM，且可以更优选是SEM。
结合物
(a)本发明的结合物包括，例如，以下式的那些：
CBA–A1–L1–*。
其中星号指示连接至PBD二聚体(D)或间隔子单元的连接点，CBA是细胞结合剂，L1是通过酶作用可分解的特异性单元，且A1是将L1连接至细胞结合剂的延伸子单元。
(b)本发明的结合物包括，例如，下式的那些：
CBA–A1–L1–*。
其中星号指示连接至PBD二聚体(D)的连接点，CBA是细胞结合剂A1是将L1连接至细胞结合剂的延伸子单元且L1是通过酶作用可分解的特异性单元，L1是二肽，L1是通过组织蛋白酶的作用可分解的二肽或L1是选自-Phe-Lys-、-Val-Ala-、-Val-Lys-、-Ala-Lys-和-Val-Cit-的二肽。
本发明优选的结合物包括在(a)和(b)中描述任何那些，其中A1是：
其中星号指示连接至L1的连接点，波浪线指示连接至CBA的连接点，且n为0-6(优选n为5)。
本发明优选的结合物包括其中连接子单元是以下的那些：
其中波浪线指示连接至配体单元(例如，抗体)的连接点且星号指示连接至D的连接点。
在尤其优选的实施方式中，对于所有这些结合物，抗体和连接子之间的连接形成于抗体的半胱氨酸残基的巯基基团和连接子单元的马来酰亚胺基团之间。
在尤其优选的实施方式中，对于所有这些优选的结合物，抗体是特异性结合至Cripto抗原、CD19抗原、CD20抗原、CD22抗原、CD30抗原、CD33抗原、糖蛋白NMB、CanAg抗原、Her2(ErbB2/Neu)抗原、CD56(NCAM)抗原、CD70抗原、CD79抗原、CD138抗原、PSCA、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、BCMA、E-选择蛋白、EphB2、黑素转铁蛋白、Muc16抗原或TMEFF2抗原的单克隆抗体。
实施例
实施例1的通用实验方法
在ADP 220旋光仪(Bellingham Stanley Ltd.)上测定旋光度且浓度(c)以g/100mL给出。使用数字熔点测定仪(电热)测定熔点。在Perkin-Elmer Spectrum 1000FT-IR光谱仪上记录IR光谱。以300K使用Bruker Avance NMR仪分别在400和100MHz下采集1H和13CNMR谱。化学位移相对于TMS(δ＝0.0ppm)报告，且信号标识为s(单峰)、d(双峰)、t(三重峰)、dt(双三重峰)、dd(双二重峰)、ddd(双双重双峰)或m(多重峰)，且耦合常数以赫兹(Hz)给出。质谱(MS)数据采用以Waters 2996PDA偶联至Waters 2695HPLC的Waters Micromass ZQ仪进行收集。所用的Waters Micromass ZQ参数为：毛细管(kV)，3.38；锥(V)，35；萃取器(V)，3.0；源温度(℃)，100；脱溶剂化温度(℃)，200；锥流量(L/h)，50；脱溶剂化流量(L/h)，250。使用金属涂层的硼硅酸盐玻璃尖将样品引入到仪器中以正W-模式于WatersMicromass QTOF Global上采集高分辨质谱(HRMS)数据。薄层色谱法(TLC)在硅胶铝板(Merck 60，F254)上进行，且快速色谱法使用硅胶(Merck 60，230-400目，ASTM)。除了HOBt(Novabiochem)和固载试剂(Argonaut)之外，所有其它化学品和溶剂均购自Sigma-Aldrich，并且并未进一步纯化便直接使用。无水溶剂在适当的干燥剂存在下于干燥氮气氛下通过蒸馏进行制备，并存放于分子筛或钠丝上。石油醚是指在40-60℃下沸腾的馏分。
通用LC/MS条件：HPLC(Waters Alliance 2695)使用水(A)(甲酸0.1％)和乙腈(B)(甲酸0.1％)的流动相操作。梯度：初始组成5％B，1.0分钟，然后3min内5％B-95％B。组成固定在95％B达0.5分钟，随后在0.3分钟内恢复至5％B。总梯度运行时间等于5分钟。流速3.0mL/min。经由穿过质谱仪的零死体积T型件(tee plece)分流400μL。波长检测范围：220-400nm。函数类型：二极管阵列(535次扫描)。柱：Onyx Monolithic C18 50×4.60mm。
实施例1
(a)(S)-2-(4-甲氧基苯基)-7-甲氧基-8-(3-((S)-7-甲氧基-2-(三氟甲基磺酰基)-5,11-二氧代-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-8-氧基)戊氧基氧基)-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡咯[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-5,11(10H,11aH)-二酮(2)
将四-三苯基膦钯复合物(38mg，3.23×10-5mol，0.02当量))加入到1,1’-[[(戊烷-1,5-二基)二氧基]二(11aS)-7-甲氧基-2-[[(三氟甲基)磺酰基]氧基]-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1,10,11,11a-四氢-5H-吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮杂-5,11-二酮](1)(WO 2010/043880中的化合物8b)(185mg，1.62mmol，1.0当量)，4-甲氧基苯基硼酸(234mg，1.54mmol，0.95当量)和Na2CO3(274mg，2.59mmol，1.6当量)在甲苯/乙醇/水(10mL/5mL/5mL)中的搅拌脱气混合物中。反应混合物在室温氩气氛下搅拌3h。反应混合物用乙酸乙酯稀释并分离出含水部分。有机部分用水冲洗，盐水饱和，干燥(MgSO4)并减压蒸发。通过快速柱色谱[梯度洗脱，乙酸乙酯30％/正己烷70％至乙酸乙酯80％/正己烷20％]纯化从而获得呈黄色泡沫的产物(0.7g，39％)。分析数据：RT 3.97min；MS(ES+)m/z(相对强度)1103([M+H]+.，100)。
(b)(S)-2-(4-(氨基甲基)苯基)-7-甲氧基-8-((5-(((S)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5,11-二氧代-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-8-基)氧基)戊基)氧基)-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-5,11(10H,11aH)-二酮(3)
将四-三-苯基膦钯复合物(30mg，2.5×10-5mol，0.04当量)加入到甲氧基三氟甲磺酸酯(2)(700mg，0.63mmol，1.0当量)，4-氨基甲基苯基硼酸(190mg，1.015mmol，1.6当量)和Na2CO3(303mg，2.85mmol，4.5当量)在甲苯/乙醇/水(20mL/10mL/10mL)中的搅拌脱气混合物中。反应混合物在75℃和氩气氛下3h。反应混合物用乙酸乙酯稀释并分离出含水部分。有机部分用水，饱和盐水洗涤，干燥(MgSO4)并在减压下蒸发，获得呈褐色泡沫的粗产物。通过快速柱色谱[梯度洗脱，乙酸乙酯50％/正己烷50％至乙酸乙酯100％]进行纯化而获得产品(0.55g，82％)。分析数据：RT 3.48min；MS(ES+)m/z(相对强度)1060([M+H]+，100)。
实施例2的通用实验方法
所有可商购的无水溶剂都未经进一步纯化而进行使用。分析薄层色谱在硅胶60F254铝板(EMD Chemicals，Gibbstown，NJ)上进行。径向色谱法在Chromatotron仪(Harris Research，Palo Alto，CA)上进行。分析HPLC在配置Varian ProStar 330PDA检测器的Varian ProStar 210溶剂递送系统上进行。样品在C12Phenomenex Synergi 2.0×150mm，4μm，反相柱上洗脱。酸性流动相由都含0.05％三氟乙酸或0.1％甲酸(对每种化合物都指出)的乙腈和水构成。化合物用线性梯度的酸性乙腈从在注入后1min的5％至11min时的95％，接着恒溶剂(isocratic)95％乙腈至15min(流速＝1.0mL/min)洗脱。LC-MS在接口至配备C12 Phenomenex Synergi2.0×150mm，4μm，反相柱的HP Agilent1100HPLC仪的ZMD Micromass质谱仪上进行。酸性洗脱液由0.1％甲酸水溶液中乙腈在10min内从5％到达95％的线性梯度，接着恒溶剂95％乙腈持续5min(流速＝0.4mL/min)构成。制备HPLC在配置Varian ProStar 330PDA检测器的Varian ProStar 210溶剂递送系统上进行。产物在Phenomenex C12 Synergi10.0×250mm，4μm，反相柱上用0.1％甲酸水溶液(溶剂A)和0.1％甲酸乙腈溶液(溶剂B)洗脱进行纯化。纯化方法由以下构成：溶剂A比溶剂B的下列梯度：90:10，0至5分钟；90:10-10:90，5分钟至80分钟；接着恒溶剂10:90，5分钟。流速为4.6mL/min，在254nm处监测。NMR谱数据在Varian Mercury 400MHz光谱仪上收集。耦合常数(J)以赫兹报告。
实施例2
(a)((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-7-甲氧基-8-((5-(((S)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5,11-二氧代-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-8-基)氧基)戊基)氧基)-5,11-二氧代-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-2-基)苄基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸烯丙酯(4)
向10mL烧瓶中充入alloc-Val-Ala(15mg，57μmol)，EEDQ(17mg，69μmol)和0.72mL无水CH2Cl2。加入甲醇(40μL)以辅助溶解并将混合物在氮气氛下搅拌15min。随后加入SEM-二内酰胺苄胺3(40mg，38μmol)并将反应在室温下搅拌4h，此时LC-MS显示转化成产物。反应经过浓缩，溶解于最低量的CH2Cl2中，并通过径向离心薄层色谱在1mm离心薄层色谱板上用CH2Cl2/MeOH混合物(100:0-90:10CH2Cl2/MeOH)洗脱进行纯化从而获得4(42mg，85％)。LC-MS：tR 15.50min，m/z(ES+)实验值1315.1(M+H)+。
(b)((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-7-甲氧基-8-((5-(((S)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-8-基)氧基)戊基)氧基)-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-2-基)苄基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸烯丙酯(5)
向10mL火焰干燥烧瓶中充入4(40mg，30μmol)和无水THF(0.6mL)，并冷却至-78℃。逐滴滴加三乙基硼氢化锂(60μL 1M THF溶液)并将反应在氮气氛下-78℃搅拌2h，此时LC-MS显示大致50％的转化率。随后另加30μL还原剂并继续搅拌另外2h，此时反应完成。反应随后经由加入1mL水冷激并回温至室温，随后用25mL盐水稀释并用25mL二氯甲烷萃取3次。合并的有机相用盐水冲洗，硫酸钠干燥，并浓缩至干。所获得的残余物溶解于氯仿(0.75mL)，乙醇(2mL)和水(0.3mL)中，并加入800mg硅胶，提供的厚料浆经过密封并在室温下搅拌4天。在那时TLC分析显示转化成亚胺5。然后滤出硅胶，多次用在氯仿中的10％甲醇洗涤，直到滤液中观察不到进一步的PBD吸光度。合并的有机相用盐水洗涤，硫酸钠干燥，并浓缩至干。然后将残余物溶解于最少的CH2Cl2中，并通过径向色谱法在1mm离心薄层色谱板上用CH2Cl2/MeOH混合物(100:0至90:10CH2Cl2/MeOH)洗脱进行纯化从而获得3(19mg，61％)。分析HPLC：tR 11.99min。LC-MS：tR 12.76min，m/z(ES+)实验值1022.4(M+H)+。
(c)6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-7-甲氧基-8-((5-(((S)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-8-基)氧基)戊基)氧基)-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-2-基)苄基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)己酰胺(6)
将Alloc-保护的二亚胺PBD 5(19mg，19μmol)加入到火焰干燥烧瓶中并溶解于无水二氯甲烷(1.9mL)中。加入三苯基膦(0.25mg，1μmol)，吡咯啶(3.1μL，38μL)和四(三苯基膦)钯(0)(0.5mg，0.5μmol)，随后反应在氮气氛下以及在室温下搅拌30min，此时LC-MS显示完全实现alloc-脱保护。反应直接载入到1mm离心薄层色谱板上用CH2Cl2/MeOH混合物(100:0-80:20CH2Cl2/MeOH)洗脱从而获得游离胺(14mg，79％)。分析HPLC：tR 9.32min。LC-MS：tR11.61min，m/z(ES+)实验值938.5(M+H)+。随后游离胺溶解于无水DMF(0.37mL)中并加入马来酰亚胺己酰基NHS酯(6.9mg，22μmol)，接着加入二异丙基乙基胺(13μL，75μL)。反应室温搅拌3h，此时LC-MS显示起始原料完全消耗。反应混合物用二氯甲烷稀释并通过径向色谱法在1mm离心薄层色谱板上用CH2Cl2/MeOH混合物(100:0-90:10CH2Cl2/MeOH)洗脱进行纯化从而获得4(15mg，89％)。分析HPLC：tR 11.63min。LC-MS：tR 12.73min，m/z(ES+)实验值1132.1(M+H)+。
实施例3-7的通用实验方法
所有可商购的无水溶剂都未经进一步纯化而进行使用。分析薄层色谱在硅胶60F254铝板(EMD Chemicals，Gibbstown，NJ)上进行。径向色谱法在Chromatotron仪(Harris Research，Palo Alto，CA)上实施。分析HPLC在配置Varian ProStar 330PDA检测器的Varian ProStar 210溶剂递送系统上进行。样品在C12Phenomenex Synergi 2.0×150mm，4μm，反相柱上洗脱。酸性流动相由都含0.05％三氟乙酸或0.1％甲酸(对每种化合物都指出)的乙腈和水构成。化合物用线性梯度的酸性乙腈从在注入后1min的5％至11min时的95％，接着恒溶剂95％乙腈至15min(流速＝1.0mL/min)洗脱。LC-MS在接口至配备C12Phenomenex Synergi2.0×150mm，4μm，反相柱的HP Agilent 1100HPLC仪的ZMD Micromass质谱仪上完成。酸性洗脱液由0.1％甲酸水溶液中乙腈在10min内从5％到达95％的线性梯度，接着恒溶剂95％乙腈5min(流速＝0.4mL/min)构成。制备HPLC在配置Varian ProStar 330PDA检测器的Varian ProStar 210溶剂递送系统上进行。产物在C12Phenomenex Synergi10.0×250mm，4μm，反相柱上用0.1％甲酸水溶液(溶剂A)和0.1％甲酸乙腈溶液(溶剂B)洗脱进行纯化。纯化方法由以下构成：溶剂A比溶剂B的下列梯度：90:10，0至5分钟；90:10-10:90，5分钟至80分钟；接着恒溶剂10:90，5分钟。流速为4.6mL/min，在254nm处监测。NMR谱数据在Varian Mercury 400MHz光谱仪上收集。耦合常数(J)以赫兹报告。
实施例3
(a)(S)-2-(4-(氨基甲基)苯基)-7-甲氧基-8-((5-(((S)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-8-基)氧基)戊基)氧基)-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-5(11aH)-酮(7)
向火焰干燥烧瓶中充入溶解于无水四氢呋喃(THF，1.9mL)中的SEM二内酰胺3(100mg，94μmol，1当量)，并冷却至-78℃。逐滴滴加三乙基硼氢化锂(0.19mL 1M THF溶液，188μmol，2当量)并在氮气氛下反应搅拌1h，在此时LC显示未完全转化成产物。另外加入0.1mL还原剂并将反应搅拌一个多小时。反应通过加入水(3mL)冷激并容许回温至室温，随后用盐水(25mL)稀释并用二氯甲烷(25mL)萃取3次。合并的有机相用盐水(25mL)冲洗，硫酸钠干燥，并蒸发至干。残余物溶解于二氯甲烷(2.4mL)，乙醇(6.2mL)和水(0.9mL)的混合物中，并加入硅胶(2.4g)。所得的料浆室温下搅拌3天。TLC分析显示转化成亚胺7，在此时料浆在烧结玻璃漏斗上过滤，而硅胶滤饼用在氯仿中的10％甲醇洗涤直至滤液中观察不到进一步的PBD吸光度。浓缩滤液从而提供70mg粗亚胺二聚体7，其经过分份而取出40mg用于纯化。物料溶解于最少量的二氯甲烷中并通过径向色谱法在1mm离心薄层色谱板上用CH2Cl2/MeOH混合物(100:0-80:20)洗脱进行纯化从而提供7(11mg，27％相对于分份出的物料)。TLC：Rf＝0.21，20％在CH2Cl2中的MeOH。LC-MS：tR 11.30min，m/z(ES+)实验值768.3(M+H)+。
(b)4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基4-((S)-7-甲氧基-8-((5-(((S)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-8-基)氧基)戊基)氧基)-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-2-基)苄基氨基甲酸酯(9)
向火焰干燥烧瓶充入溶解于无水二甲基甲酰胺(0.2mL)中的苄胺7(7.3mg，9.5μmol，1当量)。加入马来酰亚胺基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-PAB-OCO-pNP(Dubowchik et al.，Bioconjugate Chemistry，2002，13，855-869)(7mg，9.5μmol，1当量)，接着加入二异丙基乙基胺(16.5μL，95μmol，10当量)，随后反应在室温以及氮气氛下搅拌。LC显示1.5h后转化成产物；反应用二氯甲烷稀释并直接载入到1mm离心薄层色谱板上用CH2Cl2/MeOH混合物(100:0-80:20)洗脱从而提供纯化的药物连接子9(9.3mg，72％)。TLC：Rf＝0.24，10％在CH2Cl2中的MeOH。LC-MS：tR 12.61min，m/z(ES+)实验值1366.8(M+H)+。
实施例4
(a)(2S,3R,4S,5R,6R)-2-(2-(3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙酰胺基)-4-((((4-((S)-7-甲氧基-8-((5-(((S)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-8-基)氧基)戊基)氧基)-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-2-基)苄基)氨甲酰基)氧基)甲基)苯氧基)-6-甲基四氢-2H-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(12)
向火焰干燥烧瓶充入溶解于无水四氢呋喃(0.8mL)中的SEM二内酰胺3(40mg，38μmol，1当量)，并冷却至-78℃。逐滴滴加三乙基硼氢化锂(80μL THF中的1M溶液，76μmol，2当量)并在氮气氛下反应搅拌1.5h，在此时LC显示未完全转化成产物。另外加入40μL还原剂并将反应搅拌一个多小时。反应通过加入水(1mL)冷激并容许回温至室温，随后用盐水(25mL)稀释并用二氯甲烷(25mL)萃取3次。合并的有机相用盐水(25mL)冲洗，硫酸钠干燥，并蒸发至干。SEM甲醇胺10(39mg)无需进一步纯化直接使用。活化的葡糖苷酸连接子11(Jeffreyet al.，Bioconjugate Chemistry，2006，17，831-840)(38mg，42μmol，1.1当量)溶解于无水二甲基甲酰胺(0.6mL)中并加入到含有10(39mg，37μmol，1当量)的烧瓶中。加入二异丙基乙基胺(13μL，74μmol，2当量)并在氮气氛和室温下搅拌反应；1.5h后LC-MS显示转化成偶联产物。反应用盐水(25mL)稀释并用二氯甲烷(25mL)萃取3次。合并的有机相用盐水(25mL)冲洗，硫酸钠干燥，并蒸发至干。所获得的残余物溶解于氯仿(0.7mL)，乙醇(1.25mL)和水(0.17mL)的混合物中，并加入硅胶(1g)。所得的料浆室温下搅拌3天。TLC分析显示转化成药物-连接子12，在此时料浆在烧结玻璃漏斗上过滤而硅胶滤饼用在氯仿中的10％甲醇洗涤直至滤液中观察不到进一步的PBD吸光度。浓缩滤液从而提供70mg粗产物12。物质溶解于最少量的二氯甲烷中并通过径向色谱法在1mm离心薄层色谱板上用CH2Cl2/MeOH混合物(100:0-80:20)洗脱进行纯化从而提供12(25mg，36％)。LC-MS：m/z(ES+)实验值1542.9(M+H)+。
(b)(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-(3-氨基丙酰胺基)-4-((((4-((S)-7-甲氧基-8-((5-(((S)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-8-基)氧基)戊基)氧基)-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-2-基)苄基)氨甲酰基)氧基)甲基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-甲酸(13)
将受保护的葡糖苷酸连接子12(25mg，16μmol，1当量)溶解于甲醇(0.5mL)和四氢呋喃(0.5mL)中，并冷却至0℃。氢氧化锂一水合物(4mg，96μmol，6当量)溶解于水(0.5mL)中，并滴加到反应中，然后将其温热至室温，并通过LC-MS监测。在2h之后另外向反应中加入在0.4mL水中的LiOH(3.2mg，76μmol，4.8当量)，以进一步促进向产物的转化。加入冰乙酸(11μL，195μmol，12当量)，接着加入1mL二甲基亚砜中，随后通过旋蒸除去挥发性溶剂。粗产品通过制备性HPLC纯化从而提供脱保护的葡糖苷酸连接子13(2mg，11％)。LC-MS：tR11.54min，m/z(ES+)实验值1180.0(M+H)+。
(c)(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-(3-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)丙酰胺基)-4-((((4-((S)-7-甲氧基-8-((5-(((S)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-8-基)氧基)戊基)氧基)-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-2-基)苄基)氨甲酰基)氧基)甲基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-甲酸(14)
向火焰干燥烧瓶充入葡糖苷酸连接子13(2mg，1.7μmol，1当量)，马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(0.8mg，2.6μmol，1.5当量)和无水二甲基甲酰胺(85μL)。加入二异丙基乙基胺(1.5uL，8.5μmol，5当量)，随后反应在氮气氛下室温搅拌。2h后HPLC显示转化成产物。反应稀释于二甲基亚砜中并通过制备HPLC纯化从而提供PBD葡糖苷酸连接子14(1.4mg，61％)。LC-MS：tR 12.30min，m/z(ES+)实验值1373.7(M+H)+。
实施例5
(a)(S)-8-((5-(((S)-2-(4-氨基苯基)-7-甲氧基-5,11-二氧代-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-8-基)氧基)戊基)氧基)-7-甲氧基-5,11-二氧代-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-2-基三氟甲磺酸酯(15)
向烧瓶充入溶解于甲苯(6.5mL)，乙醇(3.2mL)和水(3.2mL)中的双三氟甲磺酸酯1(500mg，437μmol，1当量)。向搅拌的溶液中加入4-氨基苯基硼酸频哪醇酯(87mg，398μmol，0.91当量)，碳酸钠(213mg，2.0mmol，4.6当量)和四(三苯基膦)钯(0)(20mg，17.5μmol，0.04当量)，反应在氮气氛和室温下剧烈搅拌，通过LC-MS监测。在3小时后，反应进行至约50％转化成所需产物。反应经过浓缩随后在乙酸乙酯(100mL)和水(100mL)之间分配。有机层随后用水(100mL)，盐水(100mL)洗涤，硫酸钠干燥，并浓缩至干从而提供粗苯胺三氟甲磺酸酯15。粗产物通过快速色谱法纯化，用己烷:乙酸乙酯(60:40-30:70)混合物洗脱，从而提供纯的苯胺三氟甲磺酸酯15(118mg，25％)。TLC：Rf＝0.43，25％在乙酸乙酯中的己烷。LC-MS：tR8.30min，m/z(ES+)实验值1088.2(M+H)+。
(b)(S)-2-(4-氨基苯基)-8-((5-(((S)-2-(4-(3-(二甲基氨基)丙氧基)苯基)-7-甲氧基-5,11-二氧代-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-8-基)氧基)戊基)氧基)-7-甲氧基-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-5,11(10H,11aH)-二酮(16)
向烧瓶中充入溶解于甲苯(0.7mL)，乙醇(2.3mL)和水(0.3mL)中的苯胺三氟甲磺酸酯15(118mg，109μmol，1当量)。向搅拌的溶液中加入4-[3-(二甲基氨基)丙氧基]苯基硼酸频哪醇酯(43mg，142μmol，1.3当量)，碳酸钠(53mg，0.5mmol，4.6当量)和四(三苯基膦)钯(0)(5mg，4.4μmol，0.04当量)，反应在氮气氛下室温剧烈搅拌，通过LC-MS监测。在4h后，反应进行完全。反应经过浓缩随后在乙酸乙酯(25mL)和水(25mL)之间分配。含水层随后用乙酸乙酯(25mL)萃取2次。有机层随后用水(50mL)，盐水(50mL)洗涤，硫酸钠干燥，并浓缩至干从而提供粗SEM二内酰胺16。粗产物通过快速色谱法纯化，用己烷:乙酸乙酯(50:50-0:100)混合物洗脱，从而提供纯的产物16(78mg，64％)。TLC：Rf＝0.38，在CH2Cl2中的20％甲醇。LC-MS：m/z(ES+)实验值1117.8(M+H)+。1H NMR(d7-DMF)δ(ppm)0.00(s，18H)，0.90(m，4H)，1.74(m，3H)，1.96(m，6H)，2.21(s，6H)，2.44(t，J＝7.2Hz，2H)，3.25(m，2H)，3.62(m，4H)，3.80(m，2H)，3.96(s，6H)，4.11(t，J＝6.4Hz，2H)，4.20(m，3H)，4.92(m，2H)，5.31(dd，J＝6，10Hz，2H)，5.48(m，4H)，6.73(t，J＝8.4Hz，2H)，7.01(t，J＝8.8Hz，2H)，7.29(m，3H)，7.40(m，4H)，7.47(m，1H)，7.56(t，J＝8.4Hz，2H)。
(c)(S)-2-(4-氨基苯基)-8-((5-(((S)-2-(4-(3-(二甲基氨基)丙氧基)苯基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-8-基)氧基)戊基)氧基)-7-甲氧基-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-5(11aH)-酮(17)
向火焰干燥烧瓶中充入溶解于无水四氢呋喃(1.3mL)中的SEM二内酰胺16(70mg，63μmol，1当量)，并冷却至-78℃。逐滴滴加三乙基硼氢化锂(0.13mL 1M THF溶液，126μmol，2当量)并在氮气氛下反应搅拌1.5h，在此时LC显示未完全转化成产物。另外加入65μL还原剂并反应搅拌一个多小时。反应通过加入水(1mL)冷激并容许回温至室温，随后盐水(25mL)稀释并用二氯甲烷(25mL)萃取3次。合并的有机相用盐水(25mL)冲洗，硫酸钠干燥，并蒸发至干。残余物溶解于二氯甲烷(1.2mL)，乙醇(3.2mL)和水(0.5mL)的混合物中，并加入硅胶(1.6g)。所得的料浆在室温下搅拌4天。TLC分析显示转化成亚胺二聚体17，在此时料浆在烧结玻璃漏斗上过滤而硅胶滤饼用在氯仿中的10％甲醇洗涤直至滤液中观察不到进一步的PBD吸光度。浓缩滤液从而提供粗亚胺二聚体17。物质溶解于最少量的二氯甲烷中并通过径向色谱法在1mm离心薄层色谱板上用CH2Cl2/MeOH混合物(100:0-60:40)洗脱进行纯化而提供17(31mg，60％)。LC-MS：tR 11.14min，m/z(ES+)实验值825.4(M+H)+。
实施例6
N-(4-((S)-8-((5-(((S)-2-(4-(3-(二甲基氨基)丙氧基)苯基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-8-基)氧基)戊基)氧基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-2-基)苯基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(18)
向火焰干燥烧瓶中充入溶解于0.33mL 5％甲醇的无水二氯甲烷溶液中的马来酰亚胺基己酸(5.2mg，25μmol，1.5当量)。酸通过加入N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉(7.3mg，30μmol，1.8当量)，接着在室温和氮气氛下搅拌15min进行预活化。所活化的酸随后加入到装有PBD二聚体17(13.5mg，16μmol，1当量)的火焰干燥烧瓶中。反应在室温和氮气氛下搅拌4h，在此时LC-MS显示转化成产物。物质稀释于二氯甲烷中并通过径向色谱法在1mm离心薄层色谱板上用CH2Cl2/MeOH混合物(100:0-80:20)洗脱进行纯化从而提供18(7.3mg，44％)。LC-MS：tR 9.09min，m/z(ES+)实验值1018.3(M+H)+。
实施例7
N-((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-((5-(((S)-2-(4-(3-(二甲基氨基)丙氧基)苯基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-8-基)氧基)戊基)氧基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-2-基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(19)
向火焰干燥烧瓶中充入溶解于0.33mL 5％甲醇的无水二氯甲烷溶液中的马来酰亚胺基己酰基-缬氨酸-丙氨酸连接子(WO 2011/130613 A1的实施例13中的化合物36)(9mg，24μmol，1.5当量)。酸通过加入N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉(7.1mg，29μmol，1.8当量)，接着在室温和氮气氛下搅拌15min进行预活化。所活化的酸随后加入到装有PBD二聚体17(13mg，16μmol，1当量)的火焰干燥烧瓶中。反应在室温和氮气氛下搅拌7h，在此时LC-MS显示转化成产物。物质稀释于二氯甲烷中并通过径向色谱法在1mm离心薄层色谱板上用CH2Cl2/MeOH混合物(100:0-80:20)洗脱进行纯化从而提供19(5.1mg，27％)。LC-MS：tR 9.09min，m/z(ES+)实验值1188.4(M+H)+。
实施例8
(a)2-(4-(2,5,8,11-四氧代十三烷-13-基氧基)苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧代环戊硼烷(21)
向4-羟基苯基硼酸频哪醇酯(880mg，4mmol)，溴甲基四乙二醇(1.6g，6mmol)和DMF(10ml)的混合物中加入Cs2CO3(1.5g；8mmol)。反应混合物搅拌约65h，并倒入乙酸乙酯(100mL)中。混合物用0.1N HCl(200mL)，水(3×100mL)和盐水(50mL)洗涤而有机相用Na2SO4干燥。倾析并浓缩从而获得的褐色油状物在2mm径向离心薄层色谱板上用50％己烷中的乙酸乙酯接着100％的乙酸乙酯洗脱进行纯化从而获得1.21g(74％)：NMR(d6-DMSO，400MHz)7.59(d，J＝8.6Hz，2H)，6.93(d，J＝8.6Hz，2H)，4.11(t，J＝4.7Hz，2H)，3.73(m，2H)，3.60-3.45(m，14H)，3.41(m，2H)，3.23(s，3H)，1.27(s，12H)；LC-MS：m/z(ES+)实验值433.64(M+Na)+。
(b)(R)-2-(4-(2,5,8,11-四氧代十三烷-13-基氧基)苯基)-8-((5-(((R)-2-(4-氨基苯基)-7-甲氧基-5,11-二氧代-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-5,10,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-8-基)氧基)戊基)氧基)-7-甲氧基-10-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-5,11(10H,11aH)-二酮(22)
向单三氟甲磺酸酯15(200mg，0.18mmol)和TEG硼酸酯(111mg，0.27mmol)在甲苯(2mL)和乙醇(1mL)混合物中的混合物中加入2M Na2CO3(0.5mL)和四Pd(6mg，0.054mmol)。室温下搅拌3h之后，反应混合物倒入乙酸乙酯中，用水(3×50mL)和盐水(50mL)洗涤并用Na2SO4干燥。倾析出溶液，浓缩随后在2mm径向离心薄层色谱板上用在二氯甲烷中的5％甲醇洗脱进行纯化。这提供207mg(94％)黄色固体：1H NMR(CDCl3，400MHz)7.39-7.34(m，7H)，7.26(m，2H)，6.89(d，J＝9.0Hz，2H)，6.66(d，J＝8.6Hz，2H)，4.70(dd，J＝10.2，2.0Hz，2H)，4.18-4.03(m，8H)，3.93(s，3H)，3.90-3.62(m，21H)，3.55(dd，J＝5.1，3.2Hz，2H)3.38(s，3H)，3.12(五重，J＝5.0H，2H)，2.05(m，6H)，1.72(m，2H)，1.0(m，4H)，0.3(s，18H)；LC-MS：m/z(ES+)实验值1222.98(M+H)+。
(c)(R)-2-(4-(2,5,8,11-四氧代十三烷-13-基氧基)苯基)-8-((5-(((R)-2-(4-氨基苯基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-8-基)氧基)戊基)氧基)-7-甲氧基-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-5(11aH)-酮(23)
向SEM二内酰胺(207mg，0.17mmol)在-78℃的THF(10mL)中的混合物中加入超氢化物(LiHBEt4作为THF中的1N溶液，0.34mL，0.34mmol)。反应混合物搅拌约2h，在此时LC-MS分析反应混合物表明约50％转化成完全还原的SEM-甲醇胺中间体，但仍然存在单还原物质。加入另外等分试样的超氢化物(0.34mL，0.34mmol)且反应在-78℃下搅拌另外一个小时。LC-MS检测表明反应仍然并未进行完全，因此加入第三个等分试样的超氢化物(0.34mL，0.34mmol)并将反应混合物置于-80℃冷冻室16h。反应混合物随后用水(5mL)冷激，容许回温至室温并倒入乙酸乙酯(100mL)中。在用盐水冲洗后，混合物用Na2SO4干燥。倾析出有机相，减压浓缩，并随后用乙醇(14mL)二氯甲烷(5mL)，水(7mL)和硅胶(5g)的混合物处理72h。混合物通过多孔玻璃漏斗过滤并用10％二氯甲烷中的甲醇冲洗几次之后，将溶液减压浓缩。混合物在2mm径向离心薄层色谱板上用5％在二氯甲烷中的甲醇洗脱进行纯化从而获得46mg(29％)：LC-MS：m/z(ES+)实验值930.85(M+H)+。
(d)N-((S)-1-(((S)-1-((4-((R)-8-((5-(((R)-2-(4-(2,5,8,11-四氧代十三烷-13-基氧基)苯基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-8-基)氧基)戊基)氧基)-7-甲氧基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-2-基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(24)
向mc-val-ala-OH(50mg，0.129mmol)在5％甲醇的二氯甲烷(1mL)溶液中的0℃混合物中加入EEDQ(32mg，0.129mmol)。混合物搅拌15min，并随后加入苯胺(44mg，0.044mmol)在5％甲醇的二氯甲烷(1mL)溶液中的溶液。反应混合物容许搅拌3h，用二氯甲烷(2mL)稀释并直接抽吸到2mm径向离心薄层色谱板上。产物用二氯甲烷中2.5％-5％甲醇的梯度洗脱从而获得22.5mg(40％)：LC-MS：m/z(ES+)实验值1294(M+H)+。
实施例9-PBD二聚体结合物的制备
具有所引入的半胱氨酸的抗体：在重链第239位含半胱氨酸残基的CD70的抗体通过加入10当量TCEP和1mM EDTA并用1M Tris缓冲液(pH 9.0)调节pH至7.4而进行完全还原。在37℃下温育1小时之后，将反应冷却至22℃并加入30当量脱氢抗坏血酸从而选择性地再氧化天然二硫化物，同时使半胱氨酸239处于还原状态。用1M Tris缓冲液(pH 3.7)将pH调节至6.5并使反应在22℃下进行1小时。将溶液的pH值随后通过加入1M Tris缓冲液(pH9.0)再次升高到7.4。将3.5当量DMSO中的PBD药物连接子置于合适的容器中用丙二醇稀释之后加入到反应中。为了保持PBD药物连接子的溶解度，抗体本身首先用丙二醇稀释至最终浓度33％(例如，如果抗体溶液是60mL反应体积，则加入30mL丙二醇)。相同体积的丙二醇(在该实施例中是30mL)随后加入到PBD药物连接子中作为稀释剂。混合后，PBD药物连接子的丙二醇溶液加入到抗体溶液中进行结合；丙二醇的最终浓度为50％。反应进行30分钟，然后通过加入5当量N-乙酰半胱氨酸冷激。ADC然后通过超滤通过30kD膜进行纯化。(应指出，在反应中使用的丙二醇的浓度可以对于任何具体的PBD进行降低，因为其唯一的目的是为了维持药物连接子在水性介质中的溶解度。)
实施例10：所选结合物体外活性的测定
所选的抗体药物结合物的体外细胞毒性活性使用刃天青(resazurin)(Sigma，St.Louis，MO，USA)还原分析法进行评价(参考文献：Doronina et al.，NatureBiotechnology，2003，21，778-784)。抗体药物结合物按照以上进行制备。
对于96小时的分析测试，对数期生长温育的细胞在含150μL RPMI1640补充有20％FBS的96孔板中接种24小时。在细胞培养基中的ADC系列稀释液按照4×工作浓度进行制备；50μL的每种稀释液加入到96孔板中。在加入ADC之后，这些细胞在37℃下用测试制品温育4天。然后，将刃天青加入到每个孔中从而达到50μM的终浓度，并将这些孔板在37℃下温育另外4小时。然后在Fusion HT酶标仪(Packard Instruments，Meridien，CT，USA)上分别用525nm和590nm的激发波长和发射波长对染料还原的程度进行读数。IC50值，以一式三份测定，在本文中定义为相对于未处理对照物导致细胞生长50％降低的浓度。
参照下表，使用96小时分析法显示了这些ADC的体外细胞毒性。这些ADC针对抗原阳性和抗原阴性细胞系进行了测试。h1F6是以下的人源化抗-CD-70抗体。
体外活性
表1–48h处理之后以pM计的IC50
化合物 786-O Caki-1 HL60 HEL9217
17 7 2 3 2
23 100 100 40 100
表2–96h处理之后以pM计的IC50
ADC 药物/Ab 786-O Caki-1 抗原阴性细胞系
h1F6ec-6 1.8 260 12 28,000
h1F6ec-9 1.5 120 4.9 60,000
h1F6ec-14 1.8 380 24 20,000
表3–96h处理之后以pM计的IC50
ADC 药物/Ab 786-O Caki-1 UMRC3 抗原阴性细胞系
h1F6ec-18 1.9 540 63 1000 4000
h1F6ec-19 1.9 13 3.8 25 2000
h1F6ec-24 2.0 30 8 - 3000
实施例11：所选的结合物体内细胞毒性的测定
所有的研究都根据由实验室动物护理的评价和认可协会(Association forAssessment and Accreditation of Laboratory Animal Care)完全认可的机构中的动物护理和使用委员会(Animal Care and Use Committee)进行。首先评价ADC的耐受性，从而确保结合物耐受对异种移植实验所选的这些剂量。BALB/c小鼠采用配制于含0.5M精氨酸和0.01％吐温20的PBS中的剂量渐增ADC进行处理。处理之后监测小鼠的体重下降和发病的外在标志；对那些经历了超过20％体重下降或显示疾病迹象的小鼠处以安乐死。所使用的抗体是CD70抗体，人源化的h1F6(WO 2006/113909，以其全部内容和出于所有目的结合于本文中作为参考)，采用了在位置239处用半胱氨酸代替丝氨酸的点突变。对药物单元的结合通过在位置239处所引入的半胱氨酸进行。每个抗体平均载有2个药物。
体内治疗实验在异种移植模型中于带有CD70+肾细胞癌的小鼠中进行。肿瘤(Caki-1)片段植入裸鼠右侧肢。这些小鼠随机分配到研究组(n＝5(786-0)中，而每个组平均约为100mm3。这些ADC或对照根据所指示的方案腹腔注射(ip)给药。作为时间的函数的肿瘤体积使用公式(L×W2)/2进行确定。当肿瘤体积达到1000mm3时对动物处以安乐死。显示出持久回归的小鼠在植入后约100天时终结。
参照图1，显示了在CD70+肾细胞癌模型中使用h1F6-化合物18和h1F6-化合物19结合物的治疗研究结果。剂量按照q7d×2实施。在图1中，是未经处理，■是用h1F63c-18按照0.1mg/kg进行处理，□是采用h1F63c-18按照0.3mg/kg进行处理，▲是用h1F63c-19按照1mg/kg进行处理，Δ是用h1F63c-19按照3mg/kg进行处理。
小鼠耐受性试验h1F6-化合物6结合物的结果证实，按照1mg/kg的单剂量ADC耐受性很好，至30天无体重下降或外在病态迹象出现。更高剂量(2.5mg/kg)的给予导致体重下降。

Claims (23)

1.一种化合物，或其药用盐或溶剂化物，选自由以下各项组成的组：
其中：
(a)R10是H，且R11是OH、ORA，其中RA是饱和C1-4烷基；
(b)R10和R11形成键接它们的氮原子和碳原子之间的氮-碳双键；或者
(c)R10是H且R11是SOzM，其中z为2或3且M是单价药用阳离子，或两个M一起是二价药用阳离子。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中R10和R11形成氮-碳双键。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的化合物在制备用于治疗肾癌和白血病的药物中的用途。
4.一种化合物，选自由以下各项组成的组：
其中：
(a)R10是氨基甲酸酯氮保护基团，且R11是O-ProtO，其中ProtO是氧保护基团；或者
(b)R10是半缩醛胺氮保护基团且R11是氧代基团。
5.根据权利要求4所述的化合物，其中R10是Troc。
6.根据权利要求4或权利要求5所述的化合物，其中R11是OTBS。
7.根据权利要求4所述的化合物，其中R11是氧代基且R10是SEM。
8.一种结合物，具有式IV：
L-(LU-D)p (IV)
或其药用盐或溶剂化物；
其中L是配体单元，
LU是连接子单元，
p为1-20；以及
D选自由以下各项组成的组：
其中R10和R11如权利要求1或权利要求2中的定义，并且星号指示连接至所述连接子单元的点。
9.根据权利要求8所述的结合物，其中所述连接子单元LU具有式IVa或IVb：
-A1 a-L1 s-L2 y-， (IVa)
其中：
-A1-是延伸子单元，
a为1或2，
-L1-是通过酶作用可分解的特异性单元，
s是0-12范围内的整数，
-L2-是间隔子单元，和
y为0、1或2；或者
其中：
-L2-是间隔子单元，
-A1-是连接至间隔子单元L2的延伸子单元，
a为1或2，
-L1-是连接至间隔子单元L2的通过酶作用可分解的特异性单元，
s是1-12范围内的整数，
y为1或2。
10.根据权利要求9所述的结合物，其中所述连接子单元LU具有式IVa。
11.根据权利要求10所述的结合物，其中A1选自：
其中星号指示连接至L1的点，波浪线指示连接至所述配体单元的连接点，并且n为0-6；
其中星号指示连接至L1的点，波浪线指示连接至所述配体单元的点，并且n为0-6；
其中星号指示连接至L1的点，波浪线指示连接至所述配体单元的点，n为0或1，并且m为0-30；或者
其中星号指示连接至L1的点，波浪线指示连接至所述配体单元的点，n为0或1，并且m为0-30。
12.根据权利要求10所述的结合物，其中A1为：
其中星号指示连接至L1的点，波浪线指示连接至所述配体单元的点，以及n为0-6。
13.根据权利要求12所述的结合物，其中n为5。
14.根据权利要求9-13中任一项所述的结合物，其中L1包含氨基酸序列。
15.根据权利要求14所述的结合物，其中L1是二肽。
16.根据权利要求15所述的结合物，其中L1选自由缬氨酸-丙氨酸、缬氨酸-瓜氨酸和苯丙氨酸-赖氨酸组成的组。
17.根据权利要求9-13中任一项所述的结合物，其中y为0。
18.根据权利要求9-13中任一项所述的结合物，其中y为1或2。
19.根据权利要求18所述的结合物，其中L2是：
其中星号指示连接至药物单元D的点，波浪线指示连接至所述L1的点，Y是-N(H)-、-O-、-C(＝O)N(H)-或-C(＝O)O-，并且n为0-3。
20.根据权利要求19所述的结合物，其中L2是：
21.根据权利要求8-20中任一项所述的结合物在制备用于治疗肾癌的药物中的用途。
22.一种式V的连接子：
LU-D (V)
或其药用盐或溶剂化物，其中LU是连接子单元且D选自由以下各项组成的组：
其中R10和R11如权利要求1或权利要求2中的定义，并且星号指示连接至所述连接子单元的点。
23.根据权利要求22所述的连接子，其为下式：
(a)其中G1是形成对配体单元的连接的延伸子基团，L1是通过酶作用可分解的特异性单元，L2是共价键或连同-OC(＝O)-一起形成自降解型基团；或者
(b)G1-L1-L2-D，其中G1是形成对配体单元的连接的延伸子单元，L1是通过酶作用可分解的特异性单元，L2是共价键或自降解型基团，其中L1和L2如在权利要求9-20中任一项的定义。
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