KR20090059110A - 암 치료를 위한 ｅｐｈａ2에 대한 길항제 항체 - Google Patents

암 치료를 위한 ｅｐｈａ2에 대한 길항제 항체 Download PDF

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Abstract

A 클래스의 Eph 수용체에 특이적으로 결합하고, 이를 억제하며, 종양 세포의 성장 및 생존에 대한 성장 인자의 효과를 길항하고, 작동제 활성이 최소이거나 바람직하게는 작동제 활성이 없는 항체, 인간화 항체, 재포장 항체, 항체 단편, 유도체화 항체, 및 이들과 세포독성제의 접합체. 상기 항체 및 이의 단편은 상승된 수준의 A 클래스의 Eph 수용체를 발현하는 종양, 예컨대 유방암, 결장암, 폐암, 난소 암종, 활막 육종 및 췌장암의 치료에서 사용될 수 있고, 상기 유도체화 항체는 상승된 수준의 A 클래스의 Eph 수용체를 발현하는 종양의 진단 및 영상화에서 사용될 수 있다. 세포 결합제 및 세포독성제를 포함하는 세포독성 접합체가 또한 제공되고, 상기 접합체를 포함하는 치료용 조성물, 세포 성장의 억제 및 질환의 치료에서 상기 접합체를 사용하는 방법, 및 상기 세포독성 접합체를 포함하는 키트가 개시되며, 모두 본 발명의 실시양태이다. 특히, 세포 결합제는 A 클래스의 Eph 수용체를 인식하여 이에 결합하는 모노클로날 항체 및 이의 에피토프-결합 단편이다.
EphA2 수용체, 길항제성 항-EphA2 항체, 항-EphA2 항체-세포독성제 접합체

Description

암 치료를 위한 ＥＰＨＡ2에 대한 길항제 항체{ANTAGONIST ANTIBODY AGAINST EPHA2 FOR THE TREATMENT OF CANCER}
본 발명은 신규 뮤린(murine) 항-Eph 모노클로날(monoclonal) 항체 또는 이의 단편, 및 이의 인간화 또는 재포장(resurfaced) 버젼을 제공한다. 더욱 특히, 본 발명은 EphA 수용체 족과 상호작용하여 길항제로서 작용하는 신규 모노클로날 항체 또는 이의 단편, 및 이의 인간화 또는 재포장 버젼에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 EphA2 수용체의 세포 기능을 억제하는 항-EphA2 수용체 항체에 관한 것이다. 더욱 더 특히, 본 발명은 종양 세포의 성장 및 생존을 길항하고 작동제 활성이 없는 항-EphA2 수용체 항체에 관한 것이다.
추가로 본 발명은 세포 결합제 및 세포독성제를 포함하는 세포독성 접합체, 상기 접합체를 포함하는 치료용 조성물, 세포 성장의 억제 및 질환의 치료에서 상기 접합체를 사용하는 방법, 및 상기 세포독성 접합체를 포함하는 키트에 관한 것이다. 특히, 세포 결합제는 EphA 족의 수용체를 인식하여 이에 결합하는 모노클로날 항체, 또는 이의 에피토프-결합 단편, 및 이의 인간화 또는 재포장 버젼이다.
수용체 티로신 키나제는 정상적인 생리학적 응답 동안의 세포 성장 및 분화, 및 종양유전자성 형질전환 및 종양 진행에서 다양한 역할을 한다. Eph 수용체는 9 개의 막-결합 에프린 리간드와 상호작용하는 16개 이상의 수용체로 구성된, 게놈에서 가장 큰 수용체 티로신 키나제 (RTK)의 독특한 족이다 ([Pasquale, E. B. et al., 2005, Nature Reviews Mol. Cell Biol., 6: 462-475]). 이들은 서열 상동성 및 결합 친화력을 기초로 클래스 A 및 B의 2가지 군으로 추가로 나뉠 수 있다 ([Pasquale, E. B. et al., 2005, Nature Reviews Mol. Cell Biol., 6: 462-475]). 클래스 A Eph 수용체는 글리코실-포스파티딜이노시톨 (GPI)-연결 막 단백질의 군인 에프린-A 족의 다중 리간드와 상호작용하는 한편, 클래스 B Eph 수용체는 막횡단 단백질 족인 에프린-B 리간드에 결합한다. Eph 수용체들이 이들의 리간드에 결합하면 수용체 클러스터링(clustering), 키나제 활성의 활성화, 및 이어지는 티로신 잔기 상에서의 세포질 도메인의 인산전이(trans-phosphorylation)가 유도되어, 다수의 신호전달 단백질에 대한 도킹(docking) 부위가 생성된다 ([Kullander, K. and Klein, R., 2002, Nature Reviews Mol. Cell Biol., 3: 475-486]; [Noren, N. K. and Pasquale, E. B., 2004, Cell signal., 16: 655-666]).
암은 비정상적인 신호 전달로부터 초래되는 제어되지 않은 증식을 특징으로 하는 질환이다. 가장 위험한 형태의 암은 침범을 통한 인접 조직 내로의 직접적인 성장에 의해 또는 전이에 의한 원격 부위 내로의 이식에 의해 자신을 확산시키는 능력이 있는 악성 세포이다. 전이성 세포는 1차 종양으로부터 이탈하여, 혈류 또는 림프계를 통해 원격 부위로 이동하고, 원격 및 외래 미세환경에 이주하는 능력을 취득하였다.
Eph 분자가 암과 같은 질환 상태에서 또한 역할을 한다는 것이 현재 명백하 다. 특히, EphA2 수용체의 과발현이 난소, 유방, 전립선, 폐, 결장, 식도, 신장 세포, 자궁경부 및 흑색종의 암에서 보고되었다. EphA2는 악성 세포에서 세포 성장 및 생존의 양성 조절인자인 것으로 제안되었다 ([Landen, C. N. et al., 2005, Expert. Opin. Ther. Targets, 9 (6): 1179-1187]). EphA2 과발현만으로 유방 상피 세포를 악성 표현형으로 형질전환시키는데 충분하고 ([Zelinski et al., 2001, Cancer Res., 61: 2301-2306]), 원격 부위로의 자발적인 전이를 증가시키기 때문에 ([Landen, C. N. et al., 2005, Expert. Opin. Ther. Targets, 9 (6): 1179-1187]), 전이에서의 EphA2의 역할이 또한 기술되었다. 또한, 증가하는 증거가 EphA2가 종양 혈관생성에서 수반된다는 것을 시사한다 ([Ogawa et al., 2000, Oncogene, 19: 6043-6052]; [Cheng et al. 2002, Mol. Cancer Res., 1: 2-11]; [Cheng et al., 2003, Neoplasia, 5 (5): 445-456]; [Dobrzanski et al., 2004, Cancer Res., 64: 910-919]).
EphA2의 인산화가 이의 존재비에 연관되는 것으로 나타났다. 티로신 인산화된 EphA2는 신속하게 내입되어 분해될 운명인 반면, 인산화되지 않은 EphA2는 감소된 전환(turnover)을 나타내고, 따라서 세포 표면에 축적된다. 이러한 종류의 모델이 암에서의 높은 빈도의 EphA2 과발현에 기여할 수 있는 것으로 현재 생각된다 ([Landen, C. N. et al., 2005, Expert. Opin. Ther. Targets, 9 (6): 1179-1187]). 그러나, 최근의 데이터가 종양 진행에서의 EphA2 키나제-의존적 및 -비의존적 기능에 대한 역할을 가리키는 것으로 보이기 때문에 ([Fang W. B., 2005, Oncogene, 24: 7859-7868]), 실제로는 더욱 복잡할 수 있다.
EphA2 티로신 인산화 및 내입을 촉진하여, 궁극적으로 종양 세포 성장의 억제를 초래하는 작동제성 항체가 개발되었다 ([Dodge-Zantek et al., 1999, Cell Growth ＆ Differ., 10: 629-638]; WO 01/12172, WO 03/094859, WO 2004/014292, WO 2004/101764, WO 2006/023403, WO 2006/047637, WO 2007/030642). 이러한 항체는 EphA2의 세포외 도메인에 대해 지시된다. 이러한 작동제 항체는 EphA2 수용체 인산화 및 하류 신호를 억제하기보다는 자극하기 때문에, 이러한 항체는 EphA2 키나제 활성의 장점을 취하는 종양에 대해서 효과적이지 않을 수 있다. 한편, 항체가 포함되는 길항제성 작용제의 용도가 제안되었지만 (WO 2004/092343), 상기 문헌에 실제 길항제성 항체가 개시되어 있지 않다. 또한, 이같은 항체는 세포 증식을 억제하기보다는 자극하도록 제안되었다. WO 2006/084226 출원에는 EphA2 키나제 활성을 증가시키거나 감소시키지 않지만 종양 세포 증식을 방해할 수 있는 항체가 개시되어 있다. 그러나, 상기 출원에는 이러한 항체가 수용체에 대한 에프린A1 결합을 방지하고 에프린A1-유도 EphA2 인산화를 억제한다는 것이 지시되어 있지 않다. 그보다는, 이러한 항체는 전혀 상이한 메커니즘을 통해, 예를 들어, 에프린A1 결합 후의 수용체 클러스터링을 방지함으로써, 종양 세포 증식에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 당업자는 이러한 항체가 길항제라고 결론짓지 않을 것이고, 그보다는 이의 작용 메커니즘이 불명확하다고 결론지을 것이다.
따라서, EphA2 수용체의 세포외 도메인에 결합하고, 리간드 에프린 A1에 의한 이의 활성화를 억제하며, EphA2 키나제-의존적 종양 세포 성장을 억제하는 새로운 길항제성 항-EphA2 항체가 요구된다. 이러한 길항제성 항체는 암의 치료에 유 용할 것이다.
발명의 개요
따라서, 본 발명의 목표는 클래스 A Eph 수용체 족 구성원, 예컨대 EphA2에 특이적으로 결합하고, 수용체를 길항함으로써 수용체의 세포 활성을 억제하는 작용제를 제공하는 것이다. 따라서, 본 발명은 EphA2 수용체, 바람직하게는 인간의 수용체를 인식하고, 상기 수용체의 길항제로서 작용하는 항체 또는 이의 단편을 포함한다.
EphA2 수용체는 종양의 발달 및 성장에서의 역할이 있고, 전이에 또한 관여한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 암 세포의 성장을 억제할 수 있다. 또다른 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 전이성 암 세포의 이동을 방지할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 암 세포는 유방암, 결장암, 자궁내막암, 난소 암종, 골육종, 자궁경부암, 전립선암, 폐암, 활막 암종, 췌장암, 육종, 신경아교종, 두경부암, 위암, 간암, 및 기타 암종으로 구성된 군으로부터 선택된 암의 세포이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 혈관생성을 억제할 수 있다.
종래 기술에 개시된 항-EphA2 항체는 대부분 작동제였지만 (예를 들어 WO 03/094859, WO 2004/014292, WO 2004/101764, WO 2006/023403, WO 2006/047637, WO 2007/030642), 본 발명은 수용체에 대한 작동제성 활성이 최소이거나, 바람직하게는 어떠한 작동제 활성도 없는, 상기 수용체를 인식하는 항체를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 EphA2 티로신 인산화를 자극하지 않는다.
본 발명의 항체는 EphA2 수용체에 대한 리간드, 바람직하게는 에프린 A1의 결합을 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이는 EphA2 티로신 인산화를 억제할 수 있다. 또다른 실시양태에서, EphA2 티로신 인산화가 에프린A1의 존재 하에서도 본 발명의 항체에 의해 억제된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 EphA2-매개 신호전달을 차단할 수 있다; 특히, 이는 Akt의 EphA2-의존적 인산화를 억제할 수 있다.
본 발명은 0.3×10-9 M 이하의 KD로 EphA2 수용체에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명의 항체는 폴리클로날(polyclonal) 항체 또는 모노클로날 항체이다. 에피토프-결합 단편 예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, 또는 Fv 단편이 본 발명의 범주 내에 포함된다. 모노클로날 항-EphA2 항체가 바람직하다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 경쇄 및 중쇄 가변 영역 모두의 아미노산 서열, 경쇄 및 중쇄 가변 영역에 대한 유전자의 cDNA 서열, CDR (상보성-결정 영역)의 확인, 표면 아미노산의 확인, 및 재조합 형태로의 발현을 위한 수단과 관련하여 본원에서 충분히 특성화된, 37.3D7; 37.1F5; 53.2H11; EphA2-N1; 및 EphA2-N2로부터 선택된 뮤린 항체가 제공된다. 뮤린 항-EphA2 모노클로날 항체 37.3D7, 37.1F5, 및 53.2H11, 및 EphA2-N1 및 EphA2-N2를 생산하는 하이브리도마(hybridoma)가 부다페스트 조약 하에 2006년 6월 16일 및 2007년 5월 3일에 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection) (10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, USA)에 각각 수탁 번호 PTA-7660, PTA-7661, PTA-7662, PTA-8407, 및 PTA-8408 하에 기 탁되었다.
본 발명은 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1, 및 EphA2-N2로부터 선택된 뮤린 항-EphA2 모노클로날 항체, 및 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편의 가변 영역 프레임워크(framework)의 표면-노출 잔기가 경쇄 및 중쇄 모두에서 공지된 인간 항체 표면과 더욱 밀접하게 유사하도록 대체된, 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1, 및 EphA2-N2 항체의 재포장 또는 인간화 버젼을 포함한다. 본 발명의 인간화 항체 및 이의 에피토프-결합 단편은 이들이 투여되는 인간 대상에서 뮤린 버젼보다 덜 면역원성 (또는 완전히 비-면역원성)이라는 점에서 개선된 성질을 갖는다. 따라서, 본 발명의 여러 버젼의 인간화된 37.3D7; 37.1F5; 53.2H11; EphA2-N1; 및 EphA2-N2 항체 및 이의 에피토프-결합 단편은 인간에게 면역원성이지 않으면서 EphA2 수용체를 특이적으로 인식한다.
본 발명의 인간화 버젼의 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1, 및 EphA2-N2 항체는 각 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역 모두의 아미노산 서열, 경쇄 및 중쇄 가변 영역에 대한 유전자의 DNA 서열, 상보성 결정 영역 (CDR)의 확인, 가변 영역 프레임워크 표면 아미노산 잔기의 확인, 및 재조합 형태로의 발현을 위한 수단의 개시와 관련하여 본원에서 충분히 특성화된다.
본 발명에서 (1) EphA 수용체, 예컨대 EphA2 수용체를 인식하여 결합하는 세포 결합제, 및 (2) 세포독성제를 포함하는 세포독성 접합체들 간의 접합체의 용도가 또한 구현된다. 상기 세포독성 접합체에서, 세포 결합제는 EphA 수용체 (예를 들어, EphA2 수용체)에 대한 친화력이 높고, 세포독성제는 EphA 수용체를 발현하는 세포에 대한 세포독성의 정도가 높아서, 본 발명의 세포독성 접합체는 효과적인 사멸제를 형성한다.
바람직한 실시양태에서, 세포 결합제는 항-EphA2 항체 (예를 들어, 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1, 또는 EphA2-N2) 또는 이의 에피토프-결합 단편, 더욱 바람직하게는 인간화 항-EphA2 항체 (예를 들어, 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1, 또는 EphA2-N2) 또는 이의 에피토프-결합 단편이고, 이때 세포독성제는 직접적으로 또는 절단가능한 또는 절단가능하지 않은 링커(linker)를 통해 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편에 공유 결합으로 부착된다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 세포 결합제는 인간화 37.3D7; 37.1F5; 53.2H11; EphA2-N1; 및 EphA2-N2 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이고, 세포독성제는 탁솔, 메이탄시노이드, 토메이마이신 유도체, 렙토마이신 유도체, CC-1065 또는 CC-1065 유사체이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 세포 결합제는 인간화 항-EphA2 항체 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1, 또는 EphA2-N2이고, 세포독성제는 메이탄신 화합물, 예컨대 DM1 또는 DM4이다.
본 발명은 EphA2 수용체에 결합하는 능력이 유지된 항-EphA2 항체의 단편의 용도를 또한 포함한다. 본 발명의 또다른 양상에서, 항-EphA2 항체의 기능성 등가물의 용도가 구현된다.
본 발명은 EphA2 수용체를 발현하는 세포의 성장을 억제하는 방법을 또한 포함한다. 바람직한 실시양태에서, EphA2 수용체를 발현하는 세포의 성장을 억제하는 방법이 생체 내에서 일어나서 세포의 사망을 초래하지만, 시험관내 및 생체외 적용 또한 포함된다.
본 발명은 항-EphA2 항체 또는 항-EphA2 항체-세포독성제 접합체, 및 제약상 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 치료용 조성물을 또한 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 치료용 조성물은 제2의 치료제를 포함한다. 이러한 제2의 치료제는 섬유모세포-성장 인자 (FGF), 간세포 성장 인자 (HGF), 조직 인자 (TF), 단백질 C, 단백질 S, 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 또는 HER2 수용체의 길항제를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 상기 치료용 조성물을 사용하여 암에 걸린 대상을 치료하는 방법을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 암은 전이성 암이다. 특히, 암 세포는 유방암, 결장암, 자궁내막암, 난소 암종, 골육종, 자궁경부암, 전립선암, 폐암, 활막 암종, 췌장암, 육종, 신경아교종, 두경부암, 위암, 간암, 및 기타 암종으로 구성된 군으로부터 선택된 암의 세포이다. 바람직한 실시양태에서, 세포독성 접합체는 항-EphA2 항체 및 세포독성제를 포함한다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 세포독성 접합체는 인간화 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 및 EphA2-N2 항체-DM1 접합체, 인간화 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 및 EphA2-N2 항체-DM4, 인간화 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 및 EphA2-N2 항체-탁산 접합체, 또는 인간화 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 및 EphA2-N2 항체-토메이마이신 유도체 접합체를 포함하고, 접합체는 제약상 허용가능한 담체 또는 부형제와 함께 투여된다.
본 발명의 또다른 양상에서, 항-EphA2 항체는 생물학적 샘플 내의 EphA2 단백질을 검출하는데 사용된다. 바람직한 실시양태에서, 상기 항체는 종양 조직 내 의 EphA2 수준을 결정하는데 사용된다.
본 발명은 항-EphA2 항체 또는 항-EphA2 항체-세포독성제 접합체 및 사용 설명서를 포함하는 키트를 또한 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 항-EphA2 항체는 인간화 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1, 및 EphA2-N2 항체이고, 세포독성제는 메이탄신 화합물, 예컨대 DM1 또는 DM4, 탁산, 렙토마이신 유도체, 또는 토메이마이신 유도체이고, 설명서는 접합체를 암에 걸린 대상의 치료에서 사용하기 위한 것이다. 키트는 제약상 허용가능한 제형의 제조에 필요한 성분, 예컨대 접합체가 동결건조 상태 또는 농축 상태인 경우의 희석제, 및 제형의 투여에 필요한 성분을 또한 포함할 수 있다.
달리 언급되지 않는 한, 본원에서 인용된 모든 참조문헌 및 특허는 거명에 의해 포함된다.
도 1은 FACS 분석에 의한 인간 EphA2를 과발현하는 세포 (300-19/hu-EphA2 세포)에 대한 항-EphA2 항체의 특이적 결합의 분석을 나타낸다. 도 1A는 37.3D7 항체에 대한 데이터를, 도 1B는 37.1F5 항체에 대한 데이터를, 도 1C는 53.2H11 항체에 대한 데이터를 각각 나타낸다.
도 2는 BxPC3 인간 췌장암 세포, MDA-MB-231 인간 유방암 세포, 및 HT-29 인간 결장암 세포에 대한 정제된 37.3D7 항체의 특이적 결합을 나타낸다. FACS 분석의 막대그래프가 제시된다.
도 3은 인간 EphA2를 과발현하는 뮤린 300-19 세포 (300-19/hu-EphA2)로 수 립된 항체 37.3D7 (도 3A), 37.1F5 (도 3B), 및 53.2H11 (도 3C)에 대한 결합 곡선을 나타낸다.
도 4는 EphA2를 과발현하는 세포에 대한 정제된 37.3D7 및 53.2H11 항체의 특이적 결합을 나타낸다. FACS 분석의 막대그래프가 제시된다. 도 4A는 뮤린 EphA2를 과발현하는 세포 (300-19/mu-EphA2)에 대한 데이터를 나타내고, 도 4B는 래트 EphA2를 과발현하는 세포 (300-19/래트-EphA2)에 대한 데이터를 나타낸다.
도 5A는 VERO 원숭이 신장 상피 세포에 대한 정제된 37.3D7, 37.1F5, 및 53.2H11 항체의 특이적 결합을 나타낸다. FACS 분석의 막대그래프가 제시된다.
도 5B는 VERO 원숭이 신장 상피 세포로 수립된 항체 37.3D7, 37.1F5, 및 53.2H11에 대한 결합 곡선을 나타낸다.
도 6은 37.3D7, 37.1F5, 및 53.2H11 항체에 의한 유방 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 대한 비오틴화 에프린A1의 결합의 억제를 나타낸다.
도 7A는 37.3D7 및 37.1F5 항체에 의한 유방 MDA-MB-231 세포에서의 에프린A1-자극 EphA2-인산화의 억제를 나타낸다.
도 7B는 37.3D7 및 53.2H11 항체에 의한 유방 MDA-MB-231 세포에서의 에프린A1-자극 EphA2-인산화의 억제를 나타낸다..
도 7C는 37.3D7 및 37.1F5 항체에 의한 췌장 CFPAC-1 세포에서의 에프린A1-자극 Akt 인산화의 억제를 나타낸다.
도 8A 및 B는 유방 MDA-MB-231 세포에서의 에프린A1에 의한 EphA2-인산화의 자극, 및 항체 37.3D7, 37.1F5, 및 53.2H11에 의한 EphA2-인산화 자극의 부재를 나 타낸다.
도 9A-9D는 37.3D7 및 53.2H11 항체에 의한 결장 HT-29 세포 (9A), 결장 LoVo 세포 (9B), 췌장 CFPAC-1 세포 (9C) 및 흑색종 UACC-257 세포 (9D)의 혈청-자극 성장 및 생존의 억제를 나타낸다.
도 10A는 37.3D7 항체에 의한 췌장 BxPC3 세포의 혈청-자극 성장의 용량-의존적 억제를 나타낸다.
도 10B는 53.2H11 항체에 의한 결장 LoVo 세포의 혈청-자극 성장의 용량-의존적 억제를 나타낸다.
도 10C는 53.2H11 항체에 의한 결장 LoVo 세포의 EGF-자극 성장의 용량-의존적 억제를 나타낸다.
도 11A는 HUVEC 세포에 대한 37.3D7 항체의 결합 곡선을 나타낸다.
도 11B는 HUVEC 세포에 대한 37.1F5 항체의 결합 곡선을 나타낸다.
도 12는 37.3D7 항체에 의한 VEGF-자극 HUVEC 세포 성장 및 생존의 억제를 나타낸다.
도 13은 HUVEC 세포에서의 37.3D7 항체에 의한 VEGF-유도 Akt 인산화의 억제를 나타낸다.
도 14는 마우스에서의 HT-29 결장암 이종이식편의 성장에 대한 37.3D7 항체로의 처치 효과를 나타낸다. 효과가 항-EGFR 항체 및 비-결합 대조군 IgG1 항체의 효과와 비교된다.
도 15A는 hu37.3D7-SPDB-DM4에 의한 PC3 전립선 종양 세포의 성장의 억제를 나타낸다.
도 15B는 hu53.2H11-SPDB-DM4에 의한 PC3 전립선 종양 세포의 성장의 억제를 나타낸다.
도 16A는 마우스에서의 MDA-MB-231 유방 종양 이종이식편의 성장에 대한 hu37.3D7-SPDB-DM4로의 처치 효과를 나타낸다.
도 16B는 마우스에서의 MDA-MB-231 유방 종양 이종이식편의 성장에 대한 hu53.2H11-SPDB-DM4로의 처치 효과를 나타낸다.
EphA 수용체에 특이적으로 결합하고 상기 수용체를 길항할 수 있는 신규 작용제가 본원에서 제공된다. 특히, 본 발명가들은 세포 표면 상의 EphA 수용체에 특이적으로 결합하는 신규 항체를 발견하였다. EphA 수용체에 특이적으로 결합하는 기존에 공지된 항체는 또한 상기 수용체를 이의 리간드의 부재 시에도 활성화시키지만, 본 발명의 항체 또는 단편은 차별적으로 어떠한 작동제 활성도 없다. 반면에, 본 발명의 항체 또는 단편에는 기존에 공지된 EphA2-결합 항체에는 전혀 없는 특성인, 상기 수용체의 세포성 기능을 이의 리간드의 존재 하에서도 억제하는 독특한 능력이 있다. 또한, 본 발명의 길항제성 항체 및 항체 단편은 인간 종양 세포의 성장 및/또는 이동, 및/또는 혈관생성을 억제하고, 이러한 3가지 성질은 종래 기술의 관점에서 전혀 뜻밖이었다 ([Landen, C. N. et al., 2005, Expert. Opin. Ther. Targets, 9 (6): 1179-1187]; WO 01/12172; WO 2004/014292; WO 2004/092343).
본원에서 사용된 용어 "Eph 수용체"는 Eph 수용체 족에 속하는 티로신 키나제를 지칭한다 ([Pasquale, E. B. et al., 2005, Nature Reviews Mol. Cell Biol., 6, 462-475]에서 재고됨). 본원에서 사용된 "클래스 A Eph 수용체 족" 또는 "EphA 수용체"는 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI)-연결 리간드 (현재 5개의 리간드를 포함하는 에프린-A 서브클래스의 리간드)와 우선적으로 상호작용한다. 구체적인 EphA 수용체에는 하기의 것들이 포함된다: EphA1 (Eph 및 Esk로 또한 칭해짐); EphA2 (Eck, mEck, Myk2, Sek2로 또한 칭해짐); EphA3 (Hek, Mek4, Tyro4 및 Cek4로 또한 명명됨); EphA4 (Hek8, Sek1, Tyrol, 및 Cek8로 또한 공지됨); EphA5 (Hek7, Bsk, Ehk1, Rek7 및 Cek7로 또한 칭해짐); EphA6 (mEhk2 및 Ehk2로 또한 칭해짐); EphA7 (다르게는 Hek11, Mdk1, Ebk, Ehk3로 명명됨); 및 EphA8 (Eek 및 mEek로 또한 명명됨) 및 이들의 천연 발생 변이체. 본원에서 바람직한 Eph 수용체는 Genbank 접속 번호 NM_004431 (인간 EphA2), NM_010139 (뮤린 EphA2), 또는 NXM_345596 (래트 EphA2)에서와 같은 아미노 서열을 예를 들어 포함하는 "EphA2 수용체"이다. 본원에서 사용된 용어 "Eph 리간드"는 Eph 수용체에 결합하고, 임의로 이를 활성화시키는 (예를 들어, 이의 자가인산화를 자극하는) 단백질을 지칭한다. 본원에서 바람직한 Eph 리간드는 "에프린A1"이고, 이는 EphA2 수용체에 결합하고, Genbank 접속 번호 NM_004428 (인간 에프린A1)에서와 같은 아미노 서열을 예를 들어 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "길항제"는 표적 분자, 예컨대 EphA 수용체의 하나 이상의 생물학적 활성을 억제할 수 있는 분자를 지칭한다. 길항제는 리간드에 대한 수용체의 결합을 방해하거나 수용체에 대한 리간드의 결합을 방해함으로써, EphA2 인산화를 감소시킴으로써, 및/또는 리간드에 의해 활성화된 세포를 무력화시키거나 사멸시킴으로써 작용할 수 있다. 길항제는 수용체-리간드 상호작용을 완전하게 차단할 수 있거나 또는 이같은 상호작용을 실질적으로 감소시킬 수 있다. 길항제에 의한 중재의 모든 이같은 점들은 본 발명의 목적을 위해 등가인 것으로 간주될 것이다. 따라서, EphA 수용체, Eph 리간드 또는 Eph 수용체와 Eph 리간드의 복합체에 결합하는 길항제 (예를 들어 중화 항체); EphA 수용체와 EphA 리간드 간의 상호작용을 길항하는 EphA 수용체 또는 EphA 리간드의 아미노산 서열 변이체 또는 유도체; 임의로 이종성 분자 예컨대 면역글로불린 영역에 융합된, 가용성 EphA 수용체 또는 가용성 EphA 리간드 (예를 들어 면역부착소); EphA 리간드와 회합된 EphA 수용체를 포함하는 복합체; EphA 수용체 또는 EphA 리간드에 결합하는 합성 또는 천연 서열 펩티드가 본 발명의 범주 내에 포함된다.
본원에서 사용된 용어 "작동제"는 표적 분자의 하나 이상의 생물학적 활성을 활성화시킬 수 있는, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 항체, 항체 단편, 접합체, 대형 분자, 소형 분자를 포함하는 임의의 화합물을 지칭한다. EphA 작동제는 단백질의 인산화를 자극하여 상기 단백질의 분해를 촉발함으로써 작용한다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 항-EphA 모노클로날 항체, 항-EphA 인간화 항체, 및 항-EphA 항체의 단편을 특히 제공한다. 각각의 본 발명의 항체 및 항체 단편은 EphA2 수용체를 특이적으로 인식하여 결합하도록 디자인되고, EphA2 수용체 길항제로서 작용한다. 또한, 본 발명의 길항제성 항체 및 항체 단편에는 인간 종양 세포의 성장, 및/또는 전이성 암 세포의 이동, 및/또는 혈관생성을 억제할 수 있는 독특한 성질이 있다.
본 발명의 길항제성 항체 및 항체 단편이 결합하는 바람직한 EphA 수용체는 EphA2 수용체이다. 인간 EphA2가 바람직한 EphA2 수용체이다.
EphA2 수용체는 리간드 결합 후 세포질 꼬리 인산화가 증가되어 다양한 어댑터(adapter) 및 신호전달 단백질과 상호작용하고, 이것이 여러 하류 세포성 신호전달 경로의 활성화에 이르는 수용체 족에 속한다 ([Kullander, K. and Klein, R., 2002, Nature Reviews Mol. Cell Biol., 3: 475-486]; [Noren, N. K. and Pasquale, E. B., 2004, Cell signal., 16: 655-666]). 본원에서 사용된 용어 "EphA2-매개 신호전달"은 EphA2에 의한 리간드 결합에 응답하여 발생하는 모든 세포성 이벤트를 지칭한다. 종래 기술에 개시된 항체들은 EphA2 수용체를 작동시키고, 특히 EphA2 단백질의 티로신 인산화를 증가시키는 반면, 본 발명의 항체 및 항체 단편은 차별적으로 어떠한 이같은 작동제성 성질도 없다. 특히, 본 발명의 항체 및 항체 단편은 독자적으로 EphA2 인산화를 자극할 수 없다.
한편, 본 발명은 실제로 길항제성인 항-EphA2 항체를 최초로 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체 및 항체 단편은 EphA 수용체에 대한 리간드의 결합을 억제할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, EphA2에 대한 에프린A1의 결합이 본 발명에 의해 제공되는 항체 및 이의 단편에 의해 방지된다. 두드러지게, 또다른 실시양태에서, 본 발명의 항체 및 항체 단편은, 에프린A1의 존재 하에서도, EphA2 수용체의 티로신 인산화를 억제할 수 있다. 또한, 상기 항체 및 이의 단편은 EphA2-매개 신호전달을 억제할 수 있다. 특히, Akt의 에프린A1-의존적 인산화가 본 발명의 항체 및 항체 단편에 의해 방지될 수 있다.
항체
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 본원에서 사용되고, 구체적으로 임의의 이소타입(isotype) 예컨대 IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE의 모노클로날 항체 (전장 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체, 키메라 항체, 및 항체 단편을 포함한다. 특정 항원과 반응성인 항체를 재조합 방법 예컨대 파지 또는 유사 벡터 내의 재조합 항체의 라이브러리의 선별에 의해, 또는 항원 또는 항원-코딩 핵산으로 동물을 면역화시킴으로써 생성시킬 수 있다.
전형적인 항체는 디술피드 결합에 의해 연결된 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄로 구성된다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역을 함유한다. 각각의 가변 영역은 "상보성-결정 영역" ("CDR") 또는 "초가변 영역"으로 칭해지는 3개의 절편을 함유하고, 이들은 항원의 에피토프에 결합하는 것을 주로 담당한다. 이들은 일반적으로 N-말단으로부터 순차적으로 번호가 매겨진 CDR1, CDR2, 및 CDR3으로 지칭된다. 가변 영역의 더욱 고도로 보존된 부분은 "프레임워크 영역"으로 칭해진다.
본원에서 사용된 "VH" 또는 "VH"는 Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab', 또는 F(ab')2 단편의 중쇄를 포함하는, 항체의 면역글로불린 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. "VL" 또는 "VL"에 대한 언급은 Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab', 또는 F(ab')2 단편의 경쇄를 포함하는, 항체의 면역글로불린 경쇄의 가변 영역을 지칭한다.
"폴리클로날 항체"는 하나 이상의 또다른 동일하지 않은 항체들 사이에서 또는 이러한 항체의 존재 하에 생산된 항체이다. 일반적으로, 폴리클로날 항체는 동일하지 않은 항체들을 생산하는 여러 또다른 B-림프구의 존재 하에 B-림프구로부터 생산된다. 일반적으로, 폴리클로날 항체는 면역화된 동물로부터 직접적으로 수득된다.
본원에서 사용된 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체들의 집단으로부터 수득된 항체이고, 즉, 이러한 집단을 형성하는 항체들은 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 본질적으로 동일하다. 이러한 항체들은 단일 에피토프에 대해 지시되고, 따라서 고도로 특이적이다.
"에피토프"는 항체가 결합하는 항원 상의 부위이다. 이는 인접한 잔기들에 의해, 또는 항원성 단백질의 폴딩(folding)에 의해 근접하게 되는 인접하지 않은 잔기들에 의해 형성될 수 있다. 인접한 아미노산들에 의해 형성된 에피토프는 변성 용매에의 노출 시에 전형적으로 유지되는 반면, 인접하지 않은 아미노산들에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 상기 노출 하에 손실된다.
본원에서 사용된 용어 "KD"는 특정 항체/항원 상호작용의 해리 상수를 지칭한다.
본 발명은 경쇄 및 중쇄 가변 영역 모두의 아미노산 서열, CDR의 확인, 표면 아미노산의 확인, 및 재조합 형태로의 발현을 위한 수단과 관련하여 충분히 특성화된, 뮤린 항-EphA2 항체인 본원의 37.3D7; 37.1F5; 53.2H11; EphA2-N1; 및 EphA2-N2로부터 진행된다. 항체 37.3D7; 37.1F5; 53.2H11; EphA2-N1; 및 EphA2-N2 경쇄 및 중쇄, 및 인간화 버젼의 일차 아미노산 및 DNA 서열이 본원에서 개시된다.
37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1, 및 EphA2-N2로 각각 지정되고 부다페스트 조약 하에 2006년 6월 16일 및 2007년 5월 3일에 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, USA)에 각각 수탁 번호 PTA-7660, PTA-7661, PTA-7662, PTA-8407, 및 PTA-8408 하에 기탁된 하이브리도마에 의해 항체 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1, 및 EphA2-N2가 생산된다.
본 발명의 범주는 이러한 서열들을 포함하는 항체 및 단편에 한정되지 않는다. 그보다는, EphA2 수용체에 특이적으로 결합하고, 수용체의 생물학적 활성을 길항하지만, 작동제 활성이 없는 모든 항체 및 단편이 본 발명의 범주 내에 속한다. 따라서, 항체 및 항체 단편은 스캐폴드(scaffold), CDR, 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열이 항체 37.3D7; 37.1F5; 53.2H11; EphA2-N1; 및 EphA2-N2 또는 인간화 유도체와 상이할 수 있지만, 여전히 본 발명의 범주 내에 속한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 및 72로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 CDR을 하나 이상 포함하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편을 제공한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 중쇄 및 하나 이상의 경쇄를 포함하고, 이때 상기 중쇄는 서열 1, 2, 3, 7, 8, 9, 13, 14, 15, 61, 62, 63, 67, 68, 및 69로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 3개의 순차적인 CDR을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 4, 5, 6, 10, 11, 12, 16, 17, 18, 64, 65, 66, 70, 71, 및 72로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 3개의 순차적인 CDR을 포함한다.
더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 1, 2, 3, 4, 5, 및 6의 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 3개의 CDR을 포함한다. 추가적인 더욱 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 중쇄 및 하나 이상의 경쇄를 포함하는 37.3D7 항체가 제공되고, 이때 상기 중쇄는 서열 1, 2, 및 3으로 구성된 아미노산 서열의 3개의 순차적인 CDR을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 4, 5, 및 6으로 구성된 아미노산 서열의 3개의 순차적인 CDR을 포함한다.
또다른 더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 7, 8, 9, 10, 11, 및 12의 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 3개의 CDR을 포함한다. 추가적인 더욱 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 중쇄 및 하나 이상의 경쇄를 포함하는 37.1F5 항체가 제공되고, 이때 상기 중쇄는 서열 7, 8, 및 9로 구성된 아미노산 서열의 3개의 순차적인 CDR을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 10, 11, 및 12로 구성된 아미노산 서열의 3개의 순차적인 CDR을 포함한다.
또다른 더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 13, 14, 15, 16, 17, 및 18의 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 3개의 CDR을 포함한다. 추가적인 더욱 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 중쇄 및 하나 이상의 경쇄를 포함하는 53.2H11이 제공되고, 이때 상기 중쇄는 서열 13, 14, 및 15로 구성된 아미노산 서열의 3개의 순차적인 CDR을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 16, 17, 및 18로 구성된 아미노산 서열의 3개의 순차적인 CDR을 포함한다.
또다른 더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 61, 62, 63, 64, 65, 및 66의 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 3개의 CDR을 포함한다. 추가적인 더욱 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 중쇄 및 하나 이상의 경쇄를 포함하는 EphA2-N1 항체가 제공되고, 이때 상기 중쇄는 서열 61, 62, 및 63으로 구성된 아미노산 서열의 3개의 순차적인 CDR을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 64, 65, 및 66으로 구성된 아미노산 서열의 3개의 순차적인 CDR을 포함한다.
또다른 더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 67, 68, 69, 70, 71, 및 72의 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 3개의 CDR을 포함한다. 추가적인 더욱 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 중쇄 및 하나 이상의 경쇄를 포함하는 EphA2-N2 항체가 제공되고, 이때 상기 중쇄는 서열 67, 68, 및 69로 구성된 아미노산 서열의 3개의 순차적인 CDR을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 70, 71, 및 72로 구성된 아미노산 서열의 3개의 순차적인 CDR을 포함한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 20, 22, 24, 74 및 76으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 VH를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 서열 20으로 구성된 아미노산 서열의 VH를 포함하는 37.3D7 항체가 제공된다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 서열 22로 구성된 아미노산 서열의 VH를 포함하는 37.1F5 항체가 제공된다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 서열 24로 구성된 아미노산 서열의 VH를 포함하는 53.2H11 항체가 제공된다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 서열 74로 구성된 아미노산 서열의 VH를 포함하는 EphA2-N1 항체가 제공된다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 서열 76으로 구성된 아미노산 서열의 VH를 포함하는 EphA2-N2 항체가 제공된다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 26, 28, 30, 78 및 80으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 VL을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 서열 26으로 구성된 아미노산 서열의 VL을 포함하는 37.3D7 항체가 제공된다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 서열 28로 구성된 아미노산 서열의 VL을 포함하는 37.1F5 항체가 제공된다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 서열 30으로 구성된 아미노산 서열의 VL을 포함하는 53.2H11 항체가 제공된다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 서열 78로 구성된 아미노산 서열의 VL을 포함하는 EphA2-N1 항체가 제공된다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 서열 80으로 구성된 아미노산 서열의 VL을 포함하는 EphA2-N2 항체가 제공된다.
인간화 또는 재포장 37.3D7, 37.1F5; 53.2H11; EphA2-N1; 및 EphA2-N2 항체
본원에서 사용된 용어 "인간화 항체"는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체를 지칭한다. 본원에서 사용된 "키메라 항체"는 가변 영역이 상이한 종의 불변 영역 또는 또다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 불변 영역에 연결되도록 불변 영역 또는 이의 일부분이 변경, 대체 또는 교환된 항체이다. "키메라 항체"는 불변 영역이 상이한 종의 가변 영역 또는 또다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 가변 영역에 연결되도록 가변 영역 또는 이의 일부분이 변경, 대체 또는 교환된 항체를 또한 지칭한다.
인간화의 목적은 항체의 완전한 항원 결합 친화력 및 특이성은 유지하면서 인간 내로 도입하기 위한 이종 항체, 예컨대 뮤린 항체의 면역원성을 감소시키는 것이다. 여러 기술, 예컨대 재포장 및 CDR 그래프트화(grafting)를 사용하여 인간화 항체, 또는 또다른 포유동물에 의해 거부되지 않도록 개조된 항체를 생산할 수 있다. 본원에서 사용된 재포장 기술은 분자 모델링, 통계학적 분석 및 돌연변이유발의 조합을 사용하여, 표적 숙주의 공지된 항체의 표면을 닮도록 항체 가변 영역의 비-CDR 표면을 변경시킨다.
항체의 재포장을 위한 전략 및 방법, 및 상이한 숙주 내에서 항체의 면역원성을 감소시키기 위한 기타 방법이 거명에 의해 전문이 본원에 포함된 미국 특허 5,639,641에 개시되어 있다. 간략하게, 바람직한 방법에서, (1) 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 풀(pool)의 위치 정렬이 생성되어, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 프레임워크 표면 노출 위치의 셋트가 제공되고, 이때 모든 가변 영역에 대한 정렬 위치가 적어도 약 98％ 동일하다; (2) 중쇄 및 경쇄 가변 영역 프레임워크 표면 노출 아미노산 잔기의 셋트가 설치류 항체 (또는 이의 단편)에 대해 규정된다; (3) 설치류의 표면 노출 아미노산 잔기의 셋트와 가장 근접하게 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 프레임워크 표면 노출 아미노산 잔기의 셋트가 확인된다; (4) 설치류 항체의 상보성-결정 영역의 임의의 잔기의 임의의 원자의 5 Å 이내에 있는 아미노산 잔기를 제외하고, 단계 (2)에서 규정된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 프레임워크 표면 노출 아미노산 잔기의 셋트가 단계 (3)에서 확인된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 프레임워크 표면 노출 아미노산 잔기의 셋트로 치환된다; (5) 결합 특이성이 있는 인간화된 설치류 항체가 생산된다.
CDR-그래프트화 (EP 0 239 400; WO 91/09967; 미국 특허 번호 5,530,101; 및 5,585,089), 배니어링(veneering) 또는 재포장 (EP 0 592 106; EP 0 519 596; [Padlan E. A., 1991, Molecular Immunology 28(4/5): 489-498]; [Studnicka G. M. et al., 1994, Protein Engineering 7(6): 805-814]; [Roguska M.A. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91:969-973]), 및 사슬 셔플링(shuffling) (미국 특허 번호 5,565,332)가 포함되는 다양한 기타 기술을 사용하여 항체를 인간화시킬 수 있다. 파지 디스플레이 방법이 포함되는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 인간 항체가 제조될 수 있다. 미국 특허 번호 4,444,887, 4,716,111, 5,545,806, 및 5,814,318; 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, 및 WO 91/10741을 또한 참조한다 (상기 참조문헌들은 거명에 의해 전문이 포함된다).
본 발명은 EphA2 수용체를 인식하고 길항제로 작용하는 인간화 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 이러한 인간화 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편은 EphA2 수용체를 발현하는 암 세포의 성장을 억제하는 추가적인 능력이 있다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 인간화 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편은 EphA2 수용체를 발현하는 전이성 암 세포의 이동을 억제하는 추가적인 능력이 있다.
이같은 인간화 항체의 바람직한 실시양태는 인간화 37.3D7, 37.1F5; 53.2H11; EphA2-N1 또는 EphA2-N2 항체, 또는 이의 에피토프-결합 단편이다.
더욱 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 이의 단편의 표면-노출 잔기가 공지된 인간 항체 표면을 더욱 밀접하게 닮도록 경쇄 및 중쇄 모두에서 대체된, 재포장 또는 인간화 버젼의 37.3D7, 37.1F5; 53.2H11; EphA2-N1 및 EphA2-N2 항체가 제공된다. 본 발명의 인간화 37.3D7, 37.1F5; 53.2H11; EphA2-N1 및 EphA2-N2 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편에는 개선된 성질이 있다. 예를 들어, 인간화 37.3D7, 37.1F5; 및 53.2H11 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편은 EphA2 수용체를 특이적으로 인식한다. 더욱 바람직하게는, 인간화 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1, 및 EphA2-N2 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편은 EphA2 수용체를 발현하는 세포의 성장을 억제하는 추가적인 능력이 있다.
인간화 버젼의 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1, 및 EphA2-N2 항체 또한 이들 각각의 경쇄 및 중쇄 가변 영역 모두의 아미노산 서열, 경쇄 및 중쇄 가변 영역에 대한 유전자의 DNA 서열, CDR의 확인, 표면 아미노산의 확인, 및 재조합 형태로의 발현을 위한 수단의 개시와 관련하여 본원에서 충분히 특성화된다. 그러나, 본 발명의 범주는 이러한 서열을 포함하는 항체 및 단편에 한정되지 않는다. 그보다는, EphA2 수용체에 특이적으로 결합하는 모든 항체 및 단편이 본 발명에 포함된다. 바람직하게는, EphA2 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 및 단편이 수용체의 생물학적 활성을 길항한다. 더욱 바람직하게는, 이같은 항체에는 추가적으로 작동제 활성이 실질적으로 없다. 따라서, 본 발명의 항체 및 에피토프-결합 항체 단편은 스캐폴드, CDR, 및/또는 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열이 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 또는 EphA2-N2 항체 또는 이의 인간화 유도체와 상이할 수 있지만, 여전히 본 발명의 범주 내에 속한다.
37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 또는 EphA2-N2 항체의 CDR이 모델링에 의해 확인되고, 이들의 분자 구조가 예측되었다. 또다시, CDR이 에피토프 인식에 중요하지만, 이는 본 발명의 항체 및 단편에 본질적이지 않다. 따라서, 본 발명의 항체의 친화력 성숙에 의해 예를 들어 생산된 개선된 성질이 있는 항체 및 단편이 제공된다.
실험 실시예 섹션에 개시된 바와 같이, 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1, 및 EphA2-N2가 유래되었을 마우스 경쇄 IgVκ 및 Jκ 생식계열 유전자 및 중쇄 IgVh 및 Jh 생식계열 유전자가 확인되었다. 이같은 생식계열 유전자 서열은 항체에서의 체세포 돌연변이 (CDR에서의 돌연변이 포함)를 확인하는데 유용하다.
37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1, 및 EphA2-N2 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열, 및 이들의 CDR의 서열은 기존에 공지되지 않았고, 본 출원에 기재된다. 이같은 정보를 사용하여, 인간화 버젼의 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1, 및 EphA2-N2 항체를 생산할 수 있다. 이러한 인간화 항-EphA 항체 또는 이들의 유도체가 본 발명의 세포 결합제로 또한 사용될 수 있다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 및 72로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 CDR을 하나 이상 포함하는 인간화 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 인간화 항체는 하나 이상의 중쇄 및 하나 이상의 경쇄를 포함하고, 이때 상기 중쇄는 서열 1, 2, 3, 7, 8, 9, 13, 14, 15, 61, 62, 63, 67, 68, 및 69로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 3개의 순차적인 CDR을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 4, 5, 6, 10, 11, 12, 16, 17, 18, 64, 65, 66, 70, 71, 및 72로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 3개의 순차적인 CDR을 포함한다. 추가적인 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 인간화 항체는 하나 이상의 중쇄 및 하나 이상의 경쇄를 포함하고, 이때 상기 중쇄는 서열 1, 2, 및 3으로 표시되는 아미노산 서열의 3개의 순차적인 CDR을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 4, 5, 및 6으로 표시되는 아미노산 서열의 3개의 순차적인 CDR을 포함한다. 또다른 추가적인 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 인간화 항체는 하나 이상의 중쇄 및 하나 이상의 경쇄를 포함하고, 이때 상기 중쇄는 서열 7, 8, 및 9로 표시되는 아미노산 서열의 3개의 순차적인 CDR을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 10, 11, 및 12로 표시되는 아미노산 서열의 3개의 순차적인 CDR을 포함한다. 또다른 추가적인 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 인간화 항체는 하나 이상의 중쇄 및 하나 이상의 경쇄를 포함하고, 이때 상기 중쇄는 서열 13, 14, 및 15로 표시되는 아미노산 서열의 3개의 순차적인 CDR을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 16, 17, 및 18로 표시되는 아미노산 서열의 3개의 순차적인 CDR을 포함한다. 또다른 더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 인간화 항체는 하나 이상의 중쇄 및 하나 이상의 경쇄를 포함하고, 이때 상기 중쇄는 서열 61, 62, 및 63으로 표시되는 아미노산 서열의 3개의 순차적인 CDR을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 64, 65, 및 66으로 표시되는 아미노산 서열의 3개의 순차적인 CDR을 포함한다. 또다른 더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 인간화 항체는 하나 이상의 중쇄 및 하나 이상의 경쇄를 포함하고, 이때 상기 중쇄는 서열 67, 68, 및 69로 표시되는 아미노산 서열의 3개의 순차적인 CDR을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 70, 71, 및 72로 표시되는 아미노산 서열의 3개의 순차적인 CDR을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열 32, 34, 36, 37, 38, 40, 42, 43, 및 45로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 VH를 포함하는 인간화 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 서열 32, 34, 및 36으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 VH를 포함하는 인간화 37.1D7 항체가 제공된다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 서열 37 및 38로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 VH를 포함하는 인간화 37.1F5 항체가 제공된다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 서열 40, 42, 43, 및 45로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 VH를 포함하는 인간화 53.2H11 항체가 제공된다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 47, 48, 49, 50, 및 52로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 VL을 포함하는 인간화 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 서열 47로 구성된 아미노산 서열의 VL을 포함하는 인간화 37.1D7 항체가 제공된다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 서열 48, 49, 및 50로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 VL을 포함하는 인간화 37.1F5 항체가 제공된다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 서열 52로 구성된 아미노산 서열의 VL을 포함하는 인간화 53.2H11 항체가 제공된다.
본 발명의 인간화 37.3D7 항체 및 이의 에피토프-결합 단편은 원래의 뮤린 잔기로부터 인간 항체 28E4의 상응하는 프레임워크 표면 잔기로 교환된 뮤린 표면 프레임워크 잔기를 나타내는 표 1A 및 1B에서 회색 잔기로 규정된 하나 이상의 위치에서 경쇄 및/또는 중쇄 아미노산 잔기에서의 치환을 또한 포함할 수 있다. 표 1B 내의 별표(*) 잔기는 인간화 37.3D7 중쇄 변이체 (서열 34 및 서열 36)에서의 뮤린 복귀 돌연변이에 상응한다. 복귀 돌연변이에 대한 잔기는 CDR에 인접하고, 미국 특허 번호 5,639,641에 기술된 바와 같이 또는 기존의 인간화 시도에서 항원 결합 친화력에서의 감소가 초래된 잔기의 선별과 유사하게 선택되었다 ([Roguska et al., 1996, Protein Eng.;9(10): 895-904]; 미국 특허 출원 공보 2003/0235582 및 2005/0118183).
유사하게, 본 발명의 인간화 37.1F5; 53.2H11; EphA2-N1; 및 EphA2-N2 항체 및 이의 에피토프-결합 단편 또한 경쇄 및/또는 중쇄 아미노산 잔기에서의 치환을 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드, 벡터, 및 숙주 세포
본 발명의 항-EphA2 항체를 코딩하는 핵산이 제공된다. 한 실시양태에서, 핵산 분자는 항-EphA2 면역글로불린의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩한다. 바람직한 실시양태에서, 한 핵산이 항-EphA2 면역글로불린의 중쇄를 코딩하고, 또다른 핵산 분자가 항-EphA2 면역글로불린의 경쇄를 코딩한다.
본 발명의 또다른 양상에서, 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 37, 38, 40, 42, 43, 45, 47, 48, 49, 50, 52, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 74, 76, 78 및 80의 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 39, 41, 44, 46, 51, 73, 75, 77, 및 79로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드 자체에 한정되지 않고, 상기 폴리뉴클레오티드와 적어도 80％의 동일성을 나타내는 모든 폴리뉴클레오티드를 또한 포함한다.
본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 벡터는 항-EphA2 면역글로불린의 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 또다른 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 항-EphA2 면역글로불린의 경쇄를 코딩한다. 본 발명은 융합 단백질, 변형된 항체, 항체 단편, 및 이의 프로브를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 벡터를 또한 제공한다.
본 발명의 항-EphA2 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 발현시키기 위해, 상기 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유전자들이 전사 및 번역 서열에 작동가능하게 연결되도록 발현 벡터 내로 삽입한다. 발현 벡터에는 플라스미드, YAC, 코스미드, 레트로바이러스, EBV-유래 에피솜, 및 상기 중쇄 및/또는 경쇄의 발현을 확실하게 하는데 편리한 것으로 당업자에게 공지된 모든 기타 벡터가 포함된다. 당업자는 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드들이 상이한 벡터 내로 또는 동일한 벡터에 클로닝될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오티드들이 동일한 벡터에 클로닝된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드, 및 이러한 분자를 포함하는 벡터를 적절한 포유류 숙주 세포, 또는 당업자에게 공지된 임의의 기타 유형의 숙주 세포의 형질전환에 사용할 수 있다. 형질전환은 폴리뉴클레오티드를 세포 숙주 내로 도입하기 위한 임의의 공지된 방법에 의해 이루어질 수 있다. 이같은 방법은 당업자에게 주지되어 있고, 덱스트란-매개 형질전환, 인산칼슘 침전, 폴리브렌-매개 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 리포솜 내로의 폴리뉴클레오티드의 캡슐화, 유전자총(biolistic) 주사, 및 핵 내로의 DNA의 직접적인 미세주사가 포함된다.
항체 단편
본 발명의 항체는 상기 논의된 전장 항체, 뿐만 아니라 에피토프-결합 단편 모두를 포함한다. 본원에서 사용된 "항체 단편"은 일반적으로 "에피토프-결합 단편"으로 명명되는, 전장 항체가 인식하는 에피토프에 결합하는 능력이 유지된 항체의 임의의 부분을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, 단일쇄 Fv (scFv), 단일쇄 항체, 디술피드-연결 Fv (dsFv), 및 VL 또는 VH 영역을 포함하는 단편이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 단일쇄 항체가 포함되는 에피토프-결합 단편은 가변 영역(들)을 단독으로 또는 힌지(hinge) 영역, CH1, CH2, 및 CH3 도메인 전체 또는 이들의 일부분과 조합하여 포함할 수 있다.
이같은 단편은 Fab 단편 또는 F(ab')2 단편 중 하나 또는 양쪽 모두를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 항체 단편은 전체 항체의 6개의 CDR 모두를 함유하지만, 이같은 영역을 모두보다 적게 함유하는, 예를 들어 3개, 4개 또는 5개의 CDR을 함유하는 단편 또한 기능성이다. 또한, 단편은 면역글로불린 클래스 IgG, IgM, IgA, IgD, 또는 IgE, 및 이의 서브클래스 중 임의의 하나의 구성원일 수 있거나, 이러한 구성원들이 조합될 수 있다.
효소 예컨대 파파인 (Fab 단편) 또는 펩신 (F(ab')2 단편)을 사용하여, 단백질분해성 절단에 의해 Fab 및 F(ab')2 단편을 생산할 수 있다.
"단일쇄 FV" ("scFv") 단편은 항체 경쇄 가변 영역 (VL)의 하나 이상의 단편에 연결된 항체 중쇄 가변 영역 (VH)의 하나 이상의 단편을 함유하는 에피토프-결합 단편이다. 링커는 단일쇄 항체 단편이 유래된 전체 항체의 표적 분자 결합-특이성이 유지되도록 (VL) 및 (VH) 영역이 연결될 때 이들의 정확한 3차원 폴딩이 발생하는 것을 확실하게 하도록 선택되는 짧은 가용성 펩티드일 수 있다. (VL) 또는 (VH) 서열의 카르복실 말단이 링커에 의해 상보적인 (VL) 또는 (VH) 서열의 아미노산 말단에 공유결합으로 연결될 수 있다.
본 발명의 단일쇄 항체 단편은 본 명세서에 기술된 전체 항체의 가변 영역들 또는 상보성 결정 영역들 (CDR들) 중 하나 이상이 있는 아미노산 서열을 함유하지만, 이러한 항체의 불변 영역의 일부 또는 전체가 없다. 이러한 불변 도메인은 항원 결합에 필요하지 않지만, 전체 항체의 구조의 주요한 부분을 구성한다. 따라서 단일쇄 항체 단편은 불변 도메인의 일부분 또는 전체를 함유하는 항체의 사용과 관련된 문제점들의 일부를 극복할 수 있다. 예를 들어, 단일쇄 항체 단편은 생물학적 분자와 중쇄 불변 영역 간의 원치 않는 상호작용, 또는 기타 불필요한 생물학적 활성이 없는 경향이 있다. 추가적으로, 단일쇄 항체 단편은 전체 항체보다 상당히 작고, 따라서 전체 항체보다 모세혈관 투과성이 더 양호하여, 단일쇄 항체 단편이 표적 항원-결합 부위에 더욱 효율적으로 국소화되어 이에 결합하도록 한다. 또한, 항체 단편은 원핵생물 세포에서 비교적 대규모로 생산될 수 있어서, 이의 생산을 용이하게 한다. 또한, 단일쇄 항체 단편의 비교적 작은 크기는 전체 항체보다 이들이 수용자에서 면역 응답을 아마도 덜 일으키도록 한다.
단일쇄 항체 단편은 분자 클로닝, 항체 파지 디스플레이 라이브러리 또는 당업자에게 주지된 유사한 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 이러한 단백질들은 박테리아를 포함하는 진핵생물 세포 또는 원핵생물 세포에서 생산될 수 있다. 당업계에 공지된 다양한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 본 발명의 에피토프-결합 단편이 또한 생성될 수 있다. 파지 디스플레이 방법에서, 기능성 항체 도메인이 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 보유하는 파지 입자의 표면 상에 디스플레이된다. 특히, 레퍼토리 또는 조합형 항체 라이브러리 (예를 들어, 인간 또는 뮤린)로부터 발현된 에피토프-결합 도메인을 디스플레이하는데 이같은 파지가 이용될 수 있다. 당해 항원에 결합하는 에피토프-결합 도메인을 발현하는 파지를 항원으로, 예를 들어, 고체 표면 또는 비드(bead)에 결합 또는 포획된 표지된 항원을 사용하여 선별 또는 확인할 수 있다. 전형적으로, 이러한 방법에서 사용된 파지는 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질에 재조합적으로 융합된 Fab, Fv 또는 디술피드-안정화 Fv 항체 도메인과 함께 파지로부터 발현된 fd 및 M13 결합 도메인을 포함하는 필라멘트형 파지이다.
본 발명의 에피토프-결합 단편을 만드는데 사용될 수 있는 파지 디스플레이 방법의 예로는 [Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods, 182: 41-50]; [Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods, 184: 177-186]; [Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol., 24:952-958]; [Persic et al., 1997, Gene 187: 9-18]; [Burton et al., 1994, Advances in Immunology, 57: 191-280]; PCT 출원 번호 PCT/GB91/01134; PCT 공보 WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; 및 미국 특허 번호 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 및 5,969,108 (이들 각각은 거명에 의해 전문이 본원에 포함된다)에 개시된 것들이 포함된다.
파지 선별 후, 단편을 코딩하는 파지의 영역을 단리하여, 재조합 DNA 기술을 사용하여, 예를 들어, 하기에 상세하게 기술된 바와 같이, 포유류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 박테리아가 포함되는 선택된 숙주에서의 발현을 통해 에피토프-결합 단편을 생성시키는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 당업계에 공지된 방법 예컨대 PCT 공보 WO 92/22324; [Mullinax et al., 1992, BioTechniques, 12(6): 864-869]; [Sawai et al., 1995, AJRI, 34: 26-34]; 및 [Better et al., 1988, Science, 240: 1041-1043] (상기 참조문헌들은 거명에 의해 전문이 포함된다)에 개시된 것들을 사용하여 Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을 재조합적으로 생산하기 위한 기술을 쓸 수 있다. 단일쇄 Fv 및 항체를 생산하는데 사용될 수 있는 기술의 예로는 미국 특허 번호 4,946,778 및 5,258,498; [Huston et al., 1991, Methods in Enzymology 203: 46-88]; [Shu et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90: 7995-7999]; [Skerra et al., 1988, Science, 240: 1038-1040]에 기술된 것들이 포함된다.
기능성 등가물
항-EphA 항체 및 인간화 항-EphA2 수용체 항체의 기능성 등가물이 본 발명의 범주 내에 또한 포함된다. 용어 "기능성 등가물"에는 상동성 서열의 항체, 키메라 항체, 인공 항체 및 변형 항체가 예를 들어 포함되고, 이때 각각의 기능성 등가물은 EphA2 수용체에 결합하는 이의 능력을 특징으로 한다. 당업자는 "항체 단편"으로 불리는 분자들의 군과 "기능성 등가물"로 불리는 분자들의 군에 중복이 있다는 것을 이해할 것이다. 기능성 등가물의 생산 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어, PCT 출원 WO 93/21319, 유럽 특허 번호 EP 0239400; PCT 출원 WO 89/09622; 유럽 특허 번호 EP 0338745; 및 유럽 특허 출원 EP 0332424 (거명에 의해 각각의 전문에 포함됨)에 개시되어 있다.
상동성 서열의 항체는 본 발명의 항-EphA 항체 및 인간화 항-EphA 항체의 아미노산 서열과 서열 상동성이 있는 아미노산 서열의 항체이다. 바람직하게는, 상동성은 본 발명의 항-EphA 항체 및 인간화 항-EphA 항체의 가변 영역의 아미노산 서열과의 상동성이다. 본원에서 아미노산 서열에 적용된 "서열 상동성"은, 예를 들어, [Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85: 2444-2448]에 따른 FASTA 검색 방법에 의해 결정되었을 때, 또다른 아미노산 서열에 대한 서열 상동성이 적어도 약 90％, 91％, 92％, 93％, 또는 94％이고, 더욱 바람직하게는 적어도 약 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％인 서열로 정의된다.
키메라 항체는 항체의 상이한 부분들이 상이한 동물 종들로부터 유래된 항체이다. 예를 들어, 인간 면역글로불린 불변 영역과 쌍을 이룬 뮤린 모노클로날 항체로부터 유래된 가변 영역이 있는 항체. 키메라 항체의 생산 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, [Morrison, 1985, Science, 229: 1202]; [Oi et al., 1986, BioTechniques, 4: 214]; [Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods, 125: 191-202]; 미국 특허 번호 5,807,715; 4,816,567; 및 4,816,397 (거명에 의해 전문이 본원에 포함됨) 참조.
키메라 항체의 인간화 형태는 예를 들어 마우스 항체의 상보성 결정 영역을 인간 프레임워크 도메인 내로 치환함으로써 제조된다. 예를 들어, PCT 공보 번호 W092/22653 참조. 바람직하게는 인간화 키메라 항체에는 상응하는 인간 항체 영역으로부터 실질적으로 또는 배타적으로 유래된 불변 영역 및 상보성 결정 영역 (CDR) 이외의 가변 영역, 및 인간 이외의 포유동물로부터 실질적으로 또는 배타적으로 유래된 CDR이 있다.
인공 항체는 scFv 단편, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody) 및 mru를 포함하고 ([Winter, G. and Milstein, C., 1991, Nature, 349: 293-299]; [Hudson, P.J., 1999, Current Opinion in Immunology, 11: 548-557]의 리뷰 참조), 이들 각각은 항원-결합 능력을 갖는다. 단일쇄 Fv 단편 (scFv)에서, 항체의 VH 및 VL 도메인은 가요성 펩티드에 의해 연결된다. 전형적으로, 이러한 링커 펩티드는 아미노산 잔기 약 15개의 길이이다. 링커가 너무 작으면, 예를 들어 아미노산 5개이면, 2가 scFv 이량체인 디아바디가 형성된다. 링커가 아미노산 잔기 3개 미만으로 축소되면, 트리아바디 및 테트라바디로 칭해지는 삼량체성 및 사량체성 구조가 형성된다. 항체의 최소 결합 단위는 CDR, 전형적으로 중쇄의 CDR2이고, 이는 충분한 특이적 인식 및 결합이 있어 개별적으로 사용될 수 있다. 이같은 단편은 분자 인식 단위 또는 mru로 칭해진다. 여러 이같은 mru들이 짧은 링커 펩티드로 함께 연결되어, 단일 mru보다 결합성이 더 높은 인공 결합 단백질을 형성할 수 있다.
본 출원의 기능성 등가물은 변형 항체, 예를 들어, 임의의 유형의 분자가 항체에 공유결합으로 부착되어 변형된 항체를 또한 포함한다. 예를 들어, 변형 항체에는 글리코실화, 아세틸화, PEG화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해성 절단, 세포성 리간드 또는 기타 단백질에 대한 연결 등에 의해 예를 들어 변형된 항체가 포함된다. 공유결합 부착은 항체가 항-이디오타입 응답을 생성시키는 것을 방지하지 않는다. 이러한 변형은 특이적 화학 절단, 아세틸화, 포르밀화, 투니카마이신의 대사 합성 등이 포함되지만 이에 한정되지 않는 공지된 기술에 의해 수행될 수 있다. 추가적으로, 변형 항체는 하나 이상의 전통적이지 않은 아미노산을 함유할 수 있다.
상이한 프레임워크들 내에서 상이한 사슬 상의 상이한 CDR들을 상호교환시킴으로써 기능성 등가물이 생산될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 상이한 클래스들의 항체가 주어진 셋트의 CDR에 대해 상이한 중쇄의 치환에 의해 가능하고, 이에 의해, 예를 들어, IgG1-4, IgM, IgA1-2, IgD, IgE 항체 유형 및 이소타입이 생산될 수 있다. 유사하게, 소정의 셋트의 CDR을 전적으로 합성인 프레임워크 내에 매입함으로써 본 발명의 범주 내의 인공 항체가 생산될 수 있다.
당업계에 공지된 광범위한 방법을 사용하여, 특정 셋트의 CDR의 측면에 있는 가변 및/또는 불변 영역 서열 내에서의 돌연변이, 결실 및/또는 삽입에 의해 기능성 등가물이 쉽게 생산될 수 있다.
본 발명의 항체 단편 및 기능성 등가물은 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 또는 EphA2-N2 항체와 비교했을 때 EphA에 대한 검출가능한 정도의 결합이 있는 분자들을 포함한다. 검출가능한 정도의 결합은 EphA에 대한 뮤린 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 또는 EphA2-N2 항체의 결합 능력의 적어도 10-100％의 범위 내의 모든 값, 바람직하게는 적어도 50％, 60％ 또는 70％, 더욱 바람직하게는 적어도 75％, 80％, 85％, 90％, 95％ 또는 99％를 포함한다.
개선된 항체
CDR은 에피토프 인식 및 항체 결합에 일차적으로 중요하다. 그러나, 항체가 이의 동족 에피토프를 인식하여 이에 결합하는 능력을 방해하지 않으면서 CDR을 포함하는 잔기에 변화가 이루어질 수 있다. 예를 들어, 에피토프 인식에 영향을 미치지 않지만, 에피토프에 대한 항체의 결합 친화력을 증가시키는 변화가 이루어질 수 있다.
따라서, 뮤린 및 인간화 항체 모두의 개선된 버젼이 본 발명의 범주 내에 또한 포함되고, 이들 또한 EphA를 특이적으로 인식하여 이에 결합하며, 바람직하게는 친화력이 증가된다.
항체의 성질 예컨대 결합 및 발현 수준에 대한, 1차 항체 서열의 지식을 기초로 항체의 서열에 다양한 위치에서 하나 이상의 아미노산 변화를 도입하는 것의 효과가 여러 연구에서 조사되었다 ([Yang, W. P. et al., 1995, J. Mol. Biol., 254: 392-403]; [Rader, C. et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95: 8910-8915]; [Vaughan, T. J. et al., 1998, Nature Biotechnology, 16: 535-539]).
이러한 연구에서, 올리고뉴클레오티드-매개 부위-지정 돌연변이유발, 카세트 돌연변이유발, 에러 경향이 있는 PCR, DNA 셔플링과 같은 방법, 또는 대장균의 돌연변이 유발 유전자(mutator)-균주를 사용하여, CDR1, CDR2, CDR3, 또는 프레임워크 영역에서 중쇄 및 경쇄 유전자의 서열을 변화시킴으로써 1차 항체의 등가물이 생성되었다 ([Vaughan, T. J. et al., 1998, Nature Biotechnology, 16: 535-539]; [Adey, N. B. et al., 1996, Chapter 16, pp. 277-291, "Phage Display of Peptides and Proteins", Eds. Kay, B. K. et al., Academic Press]). 1차 항체의 서열을 변화시키는 이러한 방법들로 2차 항체의 개선된 친화력이 초래되었다 ([Gram, H. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89: 3576-3580]; [Boder, E. T. et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97: 10701-10705]; [Davies, J. and Riechmann, L., 1996, Immunotechnolgy, 2: 169-179]; [Thompson, J. et al., 1996, J. Mol. Biol., 256: 77-88]; [Short, M. K. et al., 2002, J. Biol. Chem., 277: 16365-16370]; [Furukawa, K. et al., 2001, J. Biol. Chem., 276: 27622-27628]).
항체의 하나 이상의 아미노산 잔기를 변화시키는 유사한 지시된 전략에 의해, 본 발명에 기술된 항체 서열을 사용하여, EphA에 대한 친화력이 개선되는 것을 포함하여 기능이 개선된 항-EphA 항체를 개발할 수 있다.
바람직한 아미노산 치환은 (1) 단백질분해에 대한 감수성을 감소시키고, (2) 산화에 대한 감수성을 감소시키고, (3) 단백질 복합체를 형성하기 위한 결합 친화력을 변경시키고, (4) 이같은 유사체의 또다른 물리화학적 또는 기능적 성질을 부여하거나 이를 변형시키는 것이다. 유사체는 천연-발생 펩티드 서열 이외의 서열의 다양한 뮤테인(mutein)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일 또는 다중 아미노산 치환 (바람직하게는 보존성 아미노산 치환)이 천연-발생 서열에서 이루어질 수 있다 (바람직하게는, 분자간 접촉을 형성하는 도메인(들) 외부의 폴리펩티드의 부분에서). 보존성 아미노산 치환은 어버이 서열의 구조적 특성을 실질적으로 변화시키지 않아야 한다 (예를 들어, 대체 아미노산이 어버이 서열에서 발생하는 나선을 파괴하거나 어버이 서열을 특성화하는 또다른 유형의 2차 구조를 중단시키는 경향이 없어야 한다). 당업계에 인지된 폴리펩티드 2차 및 3차 구조의 예가 [Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984))]; [Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991))] ; 및 [Thornton et al., 1991, Nature, 354: 105] (각각 거명에 의해 본원에 포함됨)에 기술되어 있다.
개선된 항체에는 동물 면역화, 하이브리도마 형성 및 특정 특성이 있는 항체의 선별의 표준 기술에 의해 제조된, 개선된 특성이 있는 항체들이 또한 포함된다.
본 발명은 세포독성 접합체를 또한 포함한다. 이러한 세포독성 접합체는 2개의 주요 성분인 세포 결합제 및 세포독성제를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "세포 결합제"는 세포 표면 상의 EphA 수용체를 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 작용제를 지칭한다. 한 실시양태에서, 세포 결합제는 접합체가 비-특이적 결합으로부터 초래되는 부작용이 거의 없으면서 표적화된 방식으로 작용하도록 EphA 수용체를 특이적으로 인식한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 세포 결합제는 접합체의 세포독성 약물 부분이 세포 상에서 작용하도록 하는데, 및/또는 접합체에게 세포에 의해 내입될 충분한 시간을 허용하는데 충분한 기간의 시간 동안 접합체가 표적 세포와 접촉하도록, EphA 수용체를 또한 특이적으로 인식한다.
바람직한 실시양태에서, 세포독성 접합체는 세포 결합제로서 항-EphA 항체, 더욱 바람직하게는 뮤린 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 또는 EphA2-N2 항-EphA 모노클로날 항체를 포함한다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 세포독성 접합체는 인간화 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 또는 EphA2-N2 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편을 포함한다. 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 또는 EphA2-N2 항체는 EphA 수용체, 예컨대 EphA2를 특이적으로 인식할 수 있고, 세포독성제를 표적화된 방식으로 비정상적인 세포 또는 조직, 예컨대 암 세포로 지시한다.
본 발명의 세포독성 접합체의 두번째 성분은 세포독성제이다. 본원에서 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능 또는 성장을 감소시키거나 차단하고/하거나 세포의 파괴를 야기하는 물질을 지칭한다.
바람직한 실시양태에서, 세포독성제는 탁소이드, 메이탄시노이드 예컨대 DM1 또는 DM4, 소형 약물, 토메이마이신 유도체, 렙토마이신 유도체, 전구약물, CC-1065 또는 CC-1065 유사체이다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 세포 결합제는 직접적으로 또는 절단가능한 또는 절단가능하지 않은 링커를 통해 세포독성제에 공유결합으로 부착된다.
세포 결합제, 세포독성제, 및 링커가 하기에서 더욱 상세하게 논의된다.
세포 결합제
치료제로서의 본 발명의 화합물의 유효성은 적합한 세포 결합제의 신중한 선별에 좌우된다. 세포 결합제는 현재 공지된 또는 공지될 임의의 종류일 수 있고, 펩티드 및 비-펩티드를 포함한다. 세포 결합제는 특이적 또는 비-특이적 방식으로 세포에 결합할 수 있는 임의의 화합물일 수 있다. 일반적으로, 이들은 항체 (특히 모노클로날 항체), 림포카인, 호르몬, 성장 인자, 비타민, 영양소-전달 물질 (예컨대 트랜스페린), 또는 임의의 기타 세포 결합 분자 또는 물질일 수 있다.
사용될 수 있는 세포 결합제의 더욱 구체적인 예로는 하기의 것들이 포함된다:
ㆍ 폴리클로날 항체;
ㆍ 모노클로날 항체;
ㆍ 항체 단편 예컨대 Fab, Fab', 및 F(ab')2, Fv ([Parham, 1983, J. Immunol., 131:2895-2902]; [Spring et al., 1974, J. Immunol., 113: 470-478]; [Nisonoff et al., 1960, Arch. Biochem. Biophys., 89: 230-244]).
바람직하게는, 인간화 항-EphA 항체가 본 발명의 세포 결합제로서 사용된다. 더욱 바람직하게는, 인간화 항-EphA 항체는 인간화 또는 재포장 37.3D7, 37.1F5; 53.2H11; EphA2-N1 및 EphA2-N2 항체로부터 선택된다.
세포독성제
또다른 실시양태에서, 인간화 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 약물, 예컨대 메이탄시노이드 또는 토메이마이신 유도체에 접합되어, 약물을 EphA2 수용체에 표적화시킴으로써 항원-발현 세포에 대한 특이적 세포독성이 있는 전구약물을 형성할 수 있다. 이같은 항체 및 고도로 독성인 소형 약물 (예를 들어, 메이탄시노이드, 탁산, 토메이마이신 유도체, 렙토마이신 유도체, CC-1065, 및 CC-1065 유사체)를 포함하는 세포독성 접합체를 종양, 예컨대 유방 및 난소 종양의 치료를 위한 치료제로서 사용할 수 있다.
본 발명의 세포독성 접합체에서 사용된 세포독성제는 세포의 사망을 초래하거나, 세포 사망을 유도하거나, 또는 일부 방식에서는 세포 생육력을 감소시키는 임의의 화합물일 수 있다. 바람직한 세포독성제에는, 예를 들어, 하기 정의된, 메이탄시노이드 및 메이탄시노이드 유사체, 전구약물, 토메이마이신 유도체, 탁소이드, 렙토마이신 유도체, CC-1065 및 CC-1065 유사체가 포함된다. 이러한 세포독성제들이 본원에 개시된 바와 같은 항체, 항체 단편, 기능성 등가물, 개선된 항체 및 이들의 유사체에 접합된다.
시험관내 방법으로 세포독성 접합체가 제조될 수 있다. 약물 또는 전구약물을 항체에 연결시키기 위해, 연결기가 사용된다. 적절한 연결기는 당업계에 주지되어 있고, 디술피드 기, 티오에테르 기, 산-불안정 기, 광-불안정기, 펩티다제-불안정 기 및 에스테라제-불안정 기가 포함된다. 바람직한 연결기는 디술피드 기 및 티오에테르 기이다. 예를 들어, 디술피드 교환 반응을 사용하여 또는 항체와 약물 또는 전구약물 간에 티오에테르 결합을 형성시킴으로써 접합체가 구축될 수 있다.
메이탄시노이드
메이탄시노이드 및 메이탄시노이드 유사체는 세포독성 접합체를 형성하는데 본 발명에서 사용될 수 있는 세포독성제 중 하나이다. 적절한 메이탄시노이드의 예로는 메이탄시놀 및 메이탄시놀 유사체가 포함된다. 메이탄시노이드는 미세관 형성을 억제하고 포유류 세포에 고도로 독성인 약물이다.
적절한 메이탄시놀 유사체의 예로는 변형된 방향족 고리가 있는 것들 및 기타 위치에 변형이 있는 것들이 포함된다. 이같은 적절한 메이탄시노이드가 미국 특허 번호 4,424,219; 4,256,746; 4,294,757; 4,307,016; 4,313,946; 4,315,929; 4,331,598; 4,361,650; 4,362,663; 4,364,866; 4,450,254; 4,322,348; 4,371,533; 6,333,410; 5,475,092; 5,585,499; 및 5,846,545에 개시되어 있다.
변형된 방향족 고리가 있는 적절한 메이탄시놀 유사체의 구체적인 예로는 하기의 것들이 포함된다:
(1) C-19-데클로로 (미국 특허 번호 4,256,746) (안사마이토신 P2의 LAH 환원에 의해 제조됨);
(2) C-20-히드록시 (또는 C-20-데메틸) +/-C-19-데클로로 (미국 특허 번호 4,361,650 및 4,307,016) (스트렙토마이세스(Streptomyces) 또는 악티노마이세스(Actinomyces)를 사용한 탈메틸화 또는 LAH를 사용한 탈염소화에 의해 제조됨); 및
(3) C-20-데메톡시, C-20-아실옥시 (-OCOR), +/-데클로로 (미국 특허 번호 4,294,757) (아실 클로라이드를 사용한 아실화에 의해 제조됨).
기타 위치에 변형이 있는 적절한 메이탄시놀 유사체의 구체적인 예로는 하기의 것들이 포함된다:
(1) C-9-SH (미국 특허 번호 4,424,219) (메이탄시놀과 H2S 또는 P2S5의 반응의 의해 제조됨);
(2) C-14-알콕시메틸 (데메톡시/CH2OR) (미국 특허 번호 4,331,598);
(3) C-14-히드록시메틸 또는 아실옥시메틸 (CH2OH 또는 CH2OAc) (미국 특허 번호 4,450,254) (노카르디아(Nocardia)로부터 제조됨);
(4) C-15-히드록시/아실옥시 (미국 특허 번호 4,364,866) (스트렙토마이세스에 의한 메이탄시놀의 전환에 의해 제조됨);
(5) C-15-메톡시 (미국 특허 번호 4,313,946 및 4,315,929) (트레위아 누디플로라(Trewia nudiflora)로부터 단리됨);
(6) C-18-N-데메틸 (미국 특허 번호 4,362,663 및 4,322,348) (스트렙토마이세스에 의한 메이탄시놀의 탈메틸화에 의해 제조됨); 및
(7) 4,5-데옥시 (미국 특허 번호 4,371,533) (메이탄시놀의 삼염화티타늄/LAH 환원에 의해 제조됨).
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 세포독성 접합체는 티올-함유 메이탄시노이드 (DM1) (기존에 N2'-데아세틸-N2'-(3-메르캅토-1-옥소프로필)-메이탄신으로 명명됨)를 세포독성제로서 사용한다. DM1은 하기 화학식 I로 표시된다:
Figure 112009009678261-PCT00001
또다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 세포독성 접합체는 티올-함유 메이탄시노이드 N2'-데아세틸-N-2'(4-메틸-4-메르캅토-1-옥소펜틸)-메이탄신을 세포독성제로서 사용한다. DM4는 하기 화학식 II로 표시된다:
Figure 112009009678261-PCT00002
본 발명의 추가적인 실시양태에서, 황 원자를 지니는 탄소 원자 상에 모노- 또는 디-알킬 치환을 지니는 티올- 및 디술피드-함유 메이탄시노이드가 포함되는 기타 메이탄신이 사용될 수 있다. 여기에는 힌더드(hindered) 술프히드릴 기를 지니는 아실 기가 있는 아실화 아미노산 측쇄가 C-3, C-14 히드록시메틸, C-15 히드록시, 또는 C-20 데스메틸에 있는 메이탄시노이드가 포함되고, 이때 티올 관능기를 지니는 아실 기의 탄소 원자에는 CH3, C2H5, 탄소수 1 내지 10의 선형 또는 분지형 알킬 또는 알케닐, 탄소수 3 내지 10의 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환형 페닐, 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼인 치환기가 1개 또는 2개 있으며, 또한 치환기 중 하나는 H일 수 있고, 아실 기는 카르보닐 관능기와 황 원자 사이에 길이가 탄소수 3 이상인 선형 사슬을 갖는다.
이같은 추가적인 메이탄신에는 하기 화학식 III으로 표시되는 화합물이 포함된다:
Figure 112009009678261-PCT00003
[식중,
Y'은 (CR7R8)l(CR9=CR10)p(C≡C)qAr(CR5R6)mDu(CR11=CR12)r(C≡C)sBt(CR3R4)nCR1R2SZ를 나타내고,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 CH3, C2H5, 탄소수 1 내지 10의 선형 알킬 또는 알케닐, 탄소수 3 내지 10의 분지형 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환형 페닐 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이고, 추가적으로 R2는 H일 수 있고,
A, B, D는 탄소수 3 내지 10의 시클로알킬 또는 시클로알케닐, 단순형 또는 치환형 아릴 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이고,
R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, 및 R12는 각각 독립적으로 H, CH3, C2H5, 탄소수 1 내지 10의 선형 알킬 또는 알케닐, 탄소수 3 내지 10의 분지형 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환형 페닐 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이고,
l, m, n, o, p, q, r, s, 및 t는 각각 독립적으로 0 또는 1 내지 5의 정수이고, 단 l, m, n, o, p, q, r, s 및 t 중 둘 이상은 어떤 경우에도 0이 아니고,
Z는 H, SR 또는 -COR이고, 이때 R은 탄소수 1 내지 10의 선형 알킬 또는 알케닐, 탄소수 3 내지 10의 분지형 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 또는 단순형 또는 치환형 아릴 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이다].
화학식 III의 바람직한 실시양태에는 하기와 같은 화학식 III의 화합물이 포함된다:
R1이 메틸이고, R2가 H이고, Z가 H인 화합물,
R1 및 R2가 메틸이고, Z가 H인 화합물,
R1이 메틸이고, R2가 H이고, Z가 -SCH3인 화합물,
R1 및 R2가 메틸이고, Z가 -SCH3인 화합물.
이같은 추가적인 메이탄신에는 하기 화학식 IV-L, IV-D, 또는 IV-D,L로 표시되는 화합물이 또한 포함된다:
<화학식 IV-L>
Figure 112009009678261-PCT00004
<화학식 IV-D>
Figure 112009009678261-PCT00005
<화학식 IV-D,L>
Figure 112009009678261-PCT00006
[식중,
Y는 (CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ를 나타내고,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 CH3, C2H5, 탄소수 1 내지 10의 선형 알킬 또는 알케닐, 탄소수 3 내지 10의 분지형 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환형 페닐, 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이고, 추가적으로 R2는 H일 수 있고,
R3, R4, R5, R6, R7 및 R8은 각각 독립적으로 H, CH3, C2H5, 탄소수 1 내지 10의 선형 알킬 또는 알케닐, 탄소수 3 내지 10의 분지형 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환형 페닐 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이고,
l, m 및 n은 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이고, 추가적으로 n은 0일 수 있고,
Z는 H, SR 또는 -COR이고, 이때 R은 탄소수 1 내지 10의 선형 또는 분지형 알킬 또는 알케닐, 탄소수 3 내지 10의 고리형 알킬 또는 알케닐, 또는 단순형 또는 치환형 아릴 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이고,
May는 C-3, C-14 히드록시메틸, C-15 히드록시 또는 C-20 데스메틸에서 측쇄를 지니는 메이탄시노이드를 나타낸다].
화학식 IV-L, IV-D 및 IV-D,L의 바람직한 실시양태에는 하기와 같은 화학식 IV-L, IV-D 및 IV-D,L의 화합물이 포함된다:
R1이 메틸이고, R2가 H이고, R5, R6, R7, 및 R8이 각각 H이고, l 및 m이 각각 1이고, n이 0이고, Z가 H인 화합물,
R1 및 R2가 메틸이고, R5, R6, R7, 및 R8이 각각 H이고, l 및 m이 1이고, n이 0이고, Z가 H인 화합물,
R1이 메틸이고, R2가 H이고, R5, R6, R7, 및 R8이 각각 H이고, l 및 m이 각각 1이고, n이 0이고, Z가 -SCH3인 화합물,
R1 및 R2가 메틸이고, R5, R6, R7, 및 R8이 각각 H이고, l 및 m이 1이고, n이 0이고, Z가 -SCH3인 화합물.
바람직하게는, 세포독성제는 화학식 IV-L로 표시된다.
이같은 추가적인 메이탄신에는 하기 화학식 V로 표시되는 화합물이 또한 포함된다:
Figure 112009009678261-PCT00007
[식중,
Y는 (CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ를 나타내고,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 CH3, C2H5, 탄소수 1 내지 10의 선형 알킬 또는 알케닐, 탄소수 3 내지 10의 분지형 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환형 페닐 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이고, 추가적으로 R2는 H일 수 있고,
R3, R4, R5, R6, R7 및 R8은 각각 독립적으로 H, CH3, C2H5, 탄소수 1 내지 10의 선형 알킬 또는 알케닐, 탄소수 3 내지 10의 분지형 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환형 페닐 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이고,
l, m 및 n은 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이고, 추가적으로 n은 0일 수 있고,
Z는 H, SR 또는 -COR이고, 이때 R은 탄소수 1 내지 10의 선형 알킬 또는 알케닐, 탄소수 3 내지 10의 분지형 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 또는 단순형 또는 치환형 아릴 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이다].
화학식 V의 바람직한 실시양태에는 하기와 같은 화학식 V의 화합물이 포함된다:
R1이 메틸이고, R2가 H이고, R5, R6, R7, 및 R8이 각각 H이고, l 및 m이 각각 1이고, n이 0이고, Z가 H인 화합물,
R1 및 R2가 메틸이고, R5, R6, R7, R8이 각각 H이고, l 및 m이 1이고, n이 0이고, Z가 H인 화합물,
R1이 메틸이고, R2가 H이고, R5, R6, R7, 및 R8이 각각 H이고, l 및 m이 각각 1이고, n이 0이고, Z가 -SCH3인 화합물,
R1 및 R2가 메틸이고, R5, R6, R7, 및 R8이 각각 H이고, l 및 m이 1이고, n이 0이고, Z가 -SCH3인 화합물.
이같은 추가적인 메이탄신에는 하기 화학식 VI-L, VI-D, 또는 VI-D,L로 표시되는 화합물이 추가로 포함된다:
<화학식 VI-L>
Figure 112009009678261-PCT00008
<화학식 VI-D>
Figure 112009009678261-PCT00009
<화학식 VI-D,L>
Figure 112009009678261-PCT00010
[식중,
Y2는 (CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ2를 나타내고,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 CH3, C2H5, 탄소수 1 내지 10의 선형 알킬 또는 알케닐, 탄소수 3 내지 10의 분지형 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환형 페닐 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이고, 추가적으로 R2는 H일 수 있고,
R3, R4, R5, R6, R7 및 R8은 각각 독립적으로 H, CH3, C2H5, 탄소수 1 내지 10의 선형 알킬 또는 알케닐, 탄소수 3 내지 10의 분지형 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환형 페닐 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이고,
l, m 및 n은 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이고, 추가적으로 n은 0일 수 있고,
Z2는 SR 또는 -COR이고, 이때 R은 탄소수 1 내지 10의 선형 알킬 또는 알케닐, 탄소수 3 내지 10의 분지형 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 또는 단순형 또는 치환형 아릴 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이고,
May는 메이탄시노이드이다].
이같은 추가적인 메이탄신에는 하기 화학식 VII로 표시되는 화합물이 또한 포함된다:
Figure 112009009678261-PCT00011
[식중,
Y2'은 (CR7R8)l(CR9=CR10)p(C≡C)qAr(CR5R6)mDu(CR11=CR12)r(C≡C)sBt(CR3R4)nCR1R2SZ2를 나타내고,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 CH3, C2H5, 탄소수 1 내지 10의 선형 또는 분지형 알킬 또는 알케닐, 탄소수 3 내지 10의 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환형 페닐 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이고, 추가적으로 R2는 H일 수 있고,
A, B 및 D는 각각 독립적으로 탄소수 3 내지 10의 시클로알킬 또는 시클로알케닐, 단순형 또는 치환형 아릴, 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디 칼이고,
R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, 및 R12는 각각 독립적으로 H, CH3, C2H5, 탄소수 1 내지 10의 선형 알킬 또는 알케닐, 탄소수 3 내지 10의 분지형 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환형 페닐 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이고,
l, m, n, o, p, q, r, s, 및 t는 각각 독립적으로 0 또는 1 내지 5의 정수이고, 단 l, m, n, o, p, q, r, s 및 t 중 둘 이상은 어떤 경우에도 0이 아니고,
Z2는 SR 또는 -COR이고, 이때 R은 탄소수 1 내지 10의 선형 알킬 또는 알케닐, 탄소수 3 내지 10의 분지형 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 또는 단순형 또는 치환형 아릴 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이다].
화학식 VII의 바람직한 실시양태에는 R1이 메틸이고, R2가 H인 화학식 VII의 화합물이 포함된다.
상기 업급된 메이탄시노이드들이 항-EphA 항체 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 또는 EphA2-N2 또는 이의 상동체 또는 단편에 접합될 수 있고, 이때 항체는 메이탄시노이드의 C-3, C-14 히드록시 메틸, C-15 히드록시 또는 C-20 데스메틸에서 발견되는 아실화 아미노산 측쇄의 아실 기 상에 존재하는 티올 또는 디술피드 관능기를 사용하여 메이탄시노이드에 연결되고, 아실화 아미노산 측쇄의 아실 기에서 이의 티올 또는 디술피드 관능기는 CH3, C2H5, 탄소수 1 내지 10의 선형 알킬 또는 알케닐, 탄소수 3 내지 10의 분지형 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환 형 페닐 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼인 치환기가 1개 또는 2개 있는 탄소 원자에 위치하며, 추가적으로 치환기 중 하나는 H일 수 있고, 아실 기는 카르보닐 관능기와 황 원자 사이에 길이가 탄소수 3 이상인 선형 사슬을 갖는다.
바람직한 본 발명의 접합체는 하기 화학식 VIII의 메이탄시노이드에 접합된 항-EphA 항체 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 또는 EphA2-N2 또는 이의 상동체 또는 단편을 포함하는 것이다:
Figure 112009009678261-PCT00012
[식중,
Y1'은 (CR7R8)l(CR9=CR10)p(C≡C)qAr(CR5R6)mDu(CR11=CR12)r(C≡C)sBt(CR3R4)nCR1R2S-를 나타내고,
A, B 및 D는 각각 독립적으로 탄소수 3 내지 10의 시클로알킬 또는 시클로알케닐, 단순형 또는 치환형 아릴, 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이고,
R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, 및 R12는 각각 독립적으로 H, CH3, C2H5, 탄소수 1 내지 10의 선형 알킬 또는 알케닐, 탄소수 3 내지 10의 분지형 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환형 페닐 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이고,
l, m, n, o, p, q, r, s, 및 t는 각각 독립적으로 0 또는 1 내지 5의 정수이고, 단 l, m, n, o, p, q, r, s 및 t 중 둘 이상은 어떤 경우에도 0이 아니다].
바람직하게는, R1은 메틸이고 R2는 H이거나, 또는 R1 및 R2가 메틸이다.
더욱 더 바람직한 본 발명의 접합체는 하기 화학식 IX-L, IX-D, 또는 IX-D,L의 메이탄시노이드에 접합된 항-EphA 항체 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 또는 EphA2-N2 또는 이의 상동체 또는 단편을 포함하는 것이다:
<화학식 IX-L>
Figure 112009009678261-PCT00013
<화학식 IX-D>
Figure 112009009678261-PCT00014
<화학식 IX-D,L>
Figure 112009009678261-PCT00015
[식중,
Y1은 (CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2S-를 나타내고,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 CH3, C2H5, 탄소수 1 내지 10의 선형 알킬 또는 알케닐, 탄소수 3 내지 10의 분지형 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환형 페닐 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이고, 추가적으로 R2는 H일 수 있고,
R3, R4, R5, R6, R7 및 R8은 각각 독립적으로 H, CH3, C2H5, 탄소수 1 내지 10의 선형 알킬 또는 알케닐, 탄소수 3 내지 10의 분지형 또는 고리형 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환형 페닐 또는 헤테로고리형 방향족 또는 헤테로시클로알킬 라디칼이고,
l, m 및 n은 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이고, 추가적으로 n은 0일 수 있고,
May는 C-3, C-14 히드록시메틸, C-15 히드록시 또는 C-20 데스메틸에서 측쇄를 지니는 메이탄시놀을 나타낸다].
화학식 IX-L, IX-D, 또는 IX-D,L의 바람직한 실시양태에는 하기와 같은 화학식 IX-L, IX-D, 또는 IX-D,L의 화합물이 포함된다:
R1이 메틸이고 R2가 H이거나, 또는 R1 및 R2가 메틸인 화합물,
R1이 메틸이고, R2가 H이고, R5, R6, R7 및 R8이 각각 H이고, l 및 m이 각각 1이고, n이 0인 화합물,
R1 및 R2가 메틸이고, R5, R6, R7 및 R8이 각각 H이고, l 및 m이 1이고, n이 0인 화합 물.
바람직하게는, 세포독성제는 화학식 IX-L로 표시된다.
추가적인 바람직한 본 발명의 접합체는 하기 화학식 X의 메이탄시노이드에 접합된 항-EphA 항체 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 또는 EphA2-N2 또는 이의상동체 또는 접합체를 포함하는 것이다:
Figure 112009009678261-PCT00016
[식중, 치환기들은 상기 화학식 IX에 대해 정의된 바와 같다].
R1이 H이고, R2가 메틸이고, R5, R6, R7 및 R8이 각각 H이고, l 및 m이 각각 1이고, n이 0인 임의의 상기 기술된 화합물이 특히 바람직하다.
R1 및 R2가 메틸이고, R5, R6, R7 및 R8이 각각 H이고, l 및 m이 1이고, n이 0인 임의의 상기 기술된 화합물이 추가적으로 특히 바람직하다.
또한, L-아미노아실 입체이성질체가 바람직하다.
계류 중인 미국 특허 출원 번호 10/849,136 (2004년 5월 20일 출원)에 교시된 각각의 메이탄시노이드가 또한 본 발명의 세포독성 접합체에서 사용될 수 있다. 미국 특허 출원 번호 10/849,136의 전문은 거명에 의해 본원에 포함된다.
디술피드-함유 연결 기
메이탄시노이드를 세포 결합제, 예컨대 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 또는 EphA2-N2 항체에 연결시키기 위해, 메이탄시노이드는 연결 모이어티(moiety)를 포함한다. 연결 모이어티는 완전히 활성인 메이탄시노이드가 특정 부위에서 방출되도록 하는 화학 결합을 함유한다. 적절한 화학 결합은 당업계에 주지되어 있고, 디술피드 결합, 산-불안정 결합, 광-불안정 결합, 펩티다제-불안정 결합 및 에스테라제-불안정 결합이 포함된다. 디술피드 결합이 바람직하다.
연결 모이어티는 반응성 화학기를 또한 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 반응성 화학기는 디술피드 결합 연결 모이어티를 통해 메이탄시노이드에 공유결합으로 결합될 수 있다.
특히 바람직한 반응성 화학기는 N-숙신이미딜 에스테르 및 N-술포숙신이미딜 에스테르이다.
반응성 화학기를 함유하는 연결 모이어티를 포함하는 특히 바람직한 메이탄시노이드는 연결 모이어티가 디술피드 결합을 함유하고 반응성 화학기가 N-숙신이미딜 또는 N-술포숙신이미딜 에스테르를 포함하는 메이탄시놀 및 이의 유사체의 C-3 에스테르이다.
메이탄시노이드 상의 다수의 위치가 연결 모이어티를 화학적으로 연결시키는 위치로 작용할 수 있다. 예를 들어, 히드록실 기가 있는 C-3 위치, 히드록시 메틸로 변형된 C-14 위치, 히드록시로 변형된 C-15 위치 및 히드록시 기가 있는 C-20 위치가 모두 유용할 것으로 예상된다. 그러나, C-3 위치가 바람직하고, 메이탄시놀의 C-3 위치가 특히 바람직하다.
연결 모이어티가 있는 메이탄시놀의 에스테르의 합성이 디술피드 결합-함유 연결 모이어티의 관점에서 기술되지만, 당업자는 기타 화학 결합 (상기 기술된 바와 같음)이 있는 연결 모이어티가 다른 메이탄시노이드와 같이 본 발명에서 또한 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 기타 화학 결합의 구체적인 예로는 산-불안정 결합, 광-불안정 결합, 펩티다제-불안정 결합 및 에스테라제-불안정 결합이 포함된다. 본원에 포함된 미국 특허 번호 5,208,020의 명세서에 이같은 결합을 지니는 메이탄시노이드의 생산이 교시된다.
반응성 기를 지니는 디술피드 모이어티가 있는 메이탄시노이드 및 메이탄시노이드 유도체의 합성이 미국 특허 번호 6, 441,163 및 6,333,410, 및 미국 출원 번호 10/161,651 (각각 거명에 의해 본원에 포함됨)에 기술되어 있다.
반응성 기-함유 메이탄시노이드, 예컨대 DM1이 항체 예컨대 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 또는 EphA2-N2 항체와 반응되어, 세포독성 접합체가 생산된다. 이러한 접합체를 HPLC 또는 젤-여과에 의해 정제할 수 있다.
이같은 항체-메이탄시노이드 접합체를 생산하기 위한 여러 우수한 계획들이 미국 특허 번호 6,333,410, 및 미국 출원 번호 09/867,598, 10/161,651 및 10/024,290 (각각 전문이 본원에 포함됨)에서 제공된다.
일반적으로, 수성 완충제 내의 항체의 용액을 반응성 기를 지니는 디술피드 모이어티가 있는 몰 과량의 메이탄시노이드와 함께 인큐베이션할 수 있다. 과량의 아민 (예컨대 에탄올아민, 타우린 등)의 첨가에 의해 반응 혼합물을 켄칭(quenching)시킬 수 있다. 그후, 메이탄시노이드-항체 접합체를 젤-여과에 의해 정제할 수 있다.
252 nm에서의 흡광도와 280 nm에서의 흡광도의 비율을 분광광도법으로 측정함으로써 항체 분자 당 결합된 메이탄시노이드 분자의 개수를 결정할 수 있다. 평균 1-10개의 메이탄시노이드 분자/항체 분자가 바람직하다.
항체와 메이탄시노이드 약물의 접합체를 시험관 내에서 다양한 원치않는 세포주의 증식을 억제하는 능력에 대해 평가할 수 있다. 예를 들어, 인간 표피양 암종 세포주 A-431, 인간 소세포 폐암 세포주 SW2, 인간 유방 종양 세포주 SKBR3 및 버킷(Burkitt) 림프종 세포주 나말와(Namalwa)와 같은 세포주가 이러한 화합물들의 세포독성을 평가하는데 사용될 수 있다. 평가될 세포를 화합물에 24시간 동안 노출시키고, 세포의 생존 분율을 공지된 방법에 의해 직접적인 분석법으로 측정할 수 있다. 그후, IC50 값을 분석 결과로부터 계산할 수 있다.
PEG-함유 연결 기
미국 출원 번호 10/024,290에 기재된 바와 같이 PEG 연결기를 사용하여 메이탄시노이드를 세포 결합제에 또한 연결시킬 수 있다. 이러한 PEG 연결기는 물 및 비-수성 용매 모두에 가용성이고, 하나 이상의 세포독성제를 세포 결합제에 연결시키는데 사용될 수 있다. 대표적인 PEG 연결 기에는 한쪽 말단의 관능성 설프히드릴 또는 디술피드 기 및 다른쪽 말단의 활성 에스테르를 통해 링커의 양쪽 말단에 서 세포독성제 및 세포 결합제에 결합하는 헤테로-2관능성 PEG 링커가 포함된다.
PEG 연결 기를 사용하는 세포독성 접합체의 합성의 일반적인 예로서, 구체적인 상세사항을 위해 미국 출원 번호 10/024,290가 또다시 참조된다. 합성은 반응성 PEG 모이어티를 지니는 하나 이상의 세포독성제와 세포결합제의 반응으로 시작되고, 각각의 반응성 PEG 모이어티의 말단 활성 에스테르가 세포 결합제, 예컨대 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 또는 EphA2-N2 항체의 아미노산 잔기로 치환되어, PEG 연결 기를 통해 세포 결합제에 공유결합으로 결합된 하나 이상의 세포독성제를 포함하는 세포독성 접합체가 산출된다.
탁산
본 발명에 따른 세포독성 접합체에서 사용된 세포독성제는 또한 탁산 또는 이의 유도체일 수 있다.
탁산은 천연 세포독성 제품인 파클리탁셀 (탁솔), 및 반-합성 유도체인 도세탁셀 (탁소텔(Taxotere))을 포함하는 화합물 족이고, 두 화합물은 암의 치료에서 널리 사용된다. 탁산은 튜불린의 탈중합을 억제하여 세포 사망을 초래하는 유사분열-방추사 억제제이다. 도세탁셀 및 파클리탁셀은 암의 치료에서 유용한 작용제이지만, 정상 세포에 대한 비-특이적 독성으로 인해 항-종양 활성이 제한된다. 또한, 파클리탁셀 및 도세탁셀과 같은 화합물 자체가 세포 결합제의 접합체에서 사용되기에 충분히 강력하지 않다.
세포독성 접합체의 제조에서 사용하기 위한 바람직한 탁산은 하기 화학식 XI의 탁산이다:
Figure 112009009678261-PCT00017
본 발명의 세포독성 접합체에서 사용될 수 있는 탁산의 합성 방법이, 탁산을 세포 결합제, 예컨대 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 또는 EphA2-N2 항체에 접합시키는 방법과 함께, 미국 특허 번호 5,416,064, 5,475,092, 6,340,701, 6,372,738 및 6,436,931, 및 미국 출원 번호 10/024,290, 10/144,042, 10/207,814, 10/210,112 및 10/369,563에 상세하게 기술되어 있다.
토메이마이신 유도체
본 발명에 따른 세포독성제는 또한 토메이마이신 유도체일 수 있다. 토메이마이신 유도체는 DNA의 마이너 그루브(minor groove) 내의 구아닌의 N2에 공유결합으로 결합함으로써 생물학적 성질을 발휘하는 공지된 부류의 화합물인 피롤로[1,4]벤조디아제핀 (PBD)이다. PBD에는 다수의 마이너 그루브 결합제 예컨대 안트라마이신, 네오트라마이신 및 DC-81이 포함된다.
고도의 세포독성을 보유하고 세포 결합제에 효과적으로 연결될 수 있는 신규 토메이마이신 유도체가 국제 출원 번호 PCT/IB2007/000142 (거명에 의해 내용이 본원에 포함됨)에 기술되어 있다. 세포 결합제-토메이마이신 유도체 복합체는 토메 이마이신 유도체의 충분한 양의 세포독성 작용이 오직 원치 않는 세포에 대해서만 표적화된 방식으로 적용되도록 하여, 표적화되지 않은 건강한 세포에 대한 손상으로 인한 부작용을 방지하도록 한다.
본 발명에 따른 세포독성제는 연결 기를 통해 세포 결합제, 예컨대 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 또는 EphA2-N2 항체에 연결된 하나 이상의 토메이마이신 유도체를 포함한다. 연결 기는 통상적인 방법을 통해 토메이마이신 유도체에 공유결합으로 결합된 화학 모이어티의 일부분이다. 바람직한 실시양태에서, 화학 모이어티는 디술피드 결합을 통해 토메이마이신 유도체에 공유결합으로 결합될 수 있다.
본 발명에서 유용한 토메이마이신 유도체는 하기에 제시된 화학식 XII의 화합물, 또는 이의 제약상 허용가능한 염, 수화물, 또는 수화염, 또는 이러한 화합물들의 다형성 결정질 구조물 또는 이들의 광학 이성질체, 라세미체(racemate), 부분입체이성질체 또는 거울상이성질체이다:
Figure 112009009678261-PCT00018
상기 식에서,
Figure 112009009678261-PCT00019
는 임의의 단일 결합을 나타내고;
Figure 112009009678261-PCT00020
은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고;
단,
Figure 112009009678261-PCT00021
가 단일 결합을 나타내는 경우, 동일하거나 상이한 U 및 U'은 독립적으로 H를 나타내고, 동일하거나 상이한 W 및 W'은 OH, 에테르 예컨대 -OR, 에스테르 (예를 들어 아세테이트), 예컨대 -OCOR, 카르보네이트 예컨대 -OCOOR, 카르바메이트 예컨대 -OCONRR', 고리형 카르바메이트 (N10 및 C11이 고리의 일부분을 형성함), 요소 예컨대 -NRCONRR', 티오카르바베이트 예컨대 -OCSNHR, 고리형 티오카르바메이트 (N10 및 C11이 고리의 일부분을 형성함), -SH, 술피드 예컨대 -SR, 술폭시드 예컨대 -SOR, 술폰 예컨대 -SOOR, 술포네이트 예컨대 -S03-, 술폰아미드 예컨대 -NRSOOR, 아민 예컨대 -NRR', 임의로 고리형 아민 (N10 및 C11이 고리의 일부분을 형성함), 히드록실아민 유도체 예컨대 -NROR', 아미드 예컨대 -NRCOR, 아지도 예컨대 -N3, 시아노, 할로, 트리알킬 또는 트리아릴포스포늄, 아미노산-유래 기로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고; 바람직하게는 W 및 W'은 동일하거나 상이하고, OH, Ome, Oet, NHCONH2, SMe이고;
Figure 112009009678261-PCT00022
가 이중 결합을 나타내는 경우, U 및 U'은 존재하지 않고, W 및 W'은 H를 나타낸다;
ㆍ R1, R2, R1', R2'는 동일하거나 상이하고, 할라이드 또는 하나 이상의 Hal, CN, NRR', CF3, OR, 아릴, Het, S(O)qR로 임의 치환된 알킬로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R1 및 R2 및 R1' 및 R2'은 각각 =B 및 =B' 기를 함유하는 이중 결합을 함께 형성한다.
바람직하게는, R1 및 R2 및 R1' 및 R2'은 각각 =B 및 =B' 기를 함유하는 이 중 결합을 함께 형성한다.
ㆍ B 및 B'은 동일하거나 상이하고, 하나 이상의 Hal, CN, NRR', CF3, OR, 아릴, Het, S(O)qR로 임의 치환된 알케닐로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 B 및 B'은 산소 원자를 나타낸다.
바람직하게는, B = B'이다.
더욱 바람직하게는, B = B' = =CH2 또는 =CH-CH3이다.
ㆍ X, X'은 동일하거나 상이하고, 하나 이상의 -O-, -NR-, -(C=O)-, -S(O)q-로부터 독립적으로 선택된다.
바람직하게는, X = X'이다.
더욱 바람직하게는, X = X' = O이다.
ㆍ A, A'은 동일하거나 상이하고, 산소, 질소 또는 황 원자를 임의로 함유하는 알킬 또는 알케닐 (각각 하나 이상의 Hal, CN, NRR', CF3, OR, S(O)qR, 아릴, Het, 알킬, 알케닐로 임의 치환됨)로부터 독립적으로 선택된다.
바람직하게는, A = A'이다.
더욱 바람직하게는, A = A' = 치환되지 않은 선형 알킬이다.
ㆍ Y, Y'은 동일하거나 상이하고, H, OR로부터 독립적으로 선택된다;
바람직하게는, Y = Y'이다.
더욱 바람직하게는, Y = Y' = O알킬이고, 더욱 바람직하게는 O메틸이다.
ㆍ T는 -NR-, -O-, -S(O)q-, 또는 4 내지 10-원의 아릴, 시클로알킬, 헤테로고리형또는 헤테로아릴 (각각 하나 이상의 Hal, CN, NRR', CF3, R, OR, S(O)qR, 및/또는 링커(들)로 임의 치환됨), 또는 하나 이상의 Hal, CN, NRR', CF3, OR, S(O)qR 및/또는 링커(들)로 임의 치환된 분지형 알킬, 또는 하나 이상의 Hal, CN, NRR', CF3, OR, S(O)qR 및/또는 링커(들)로 치환된 선형 알킬이다.
바람직하게는, T는 하나 이상의 링커(들)로 임의 치환된, 4 내지 10-원 아릴 또는 헤테로아릴이고, 더욱 바람직하게는 페닐 또는 피리딜이다.
상기 링커는 연결 기를 포함한다. 적절한 연결 기는 당업계에 주지되어 있고, 티올, 술피드, 디술피드 기, 티오에테르 기, 산-불안정 기, 광-불안정 기, 펩티다제-불안정 기 및 에스테라제-불안정 기를 포함한다. 디술피드 기 및 티오에테르 기가 바람직하다.
연결 기가 티올-, 술피드 (또는 소위 티오에테르 -S-) 또는 디술피드 (-S-S-)-함유 기인 경우, 티올, 술피드 또는 디술피드 기를 지니는 측쇄는 선형 또는 분지형, 방향족 또는 헤테로고리형일 수 있다. 당업자는 적절한 측쇄를 쉽게 확인할 수 있다.
바람직하게는, 상기 링커는 하기 화학식의 링커이다:
Figure 112009009678261-PCT00023
[식중,
G는 단일 또는 이중 결합, -O-, -S-또는 -NR-이고;
D는 단일 결합 또는 -E-, -E-NR-, -E-NR-F-, -E-O-, -E-O-F-, -E-NR-CO-, -E-NR-CO-F-, -E-CO-, -CO-E-, -E-CO-F, -E-S-, -E-S-F-, -E-NR-C-S-, -E-NR-CS-F-이고;
E 및 F는 동일하거나 상이하고, 선형 또는 분지형 -(OCH2CH2)i알킬(OCH2CH2)j-, -알킬(OCH2CH2)i-알킬-, -(OCH2CH2)i-, -(OCH2CH2)i시클로알킬(OCH2CH2)j-, -(OCH2CH2)i헤테로고리형(OCH2CH2)j-, -(OCH2CH2)i아릴(OCH2CH2)j-, -(OCH2CH2)i헤테로아릴(OCH2CH2)j-, -알킬-(OCH2CH2)i알킬(OCH2CH2)j-, -알킬-(OCH2CH2)i-, -알킬-(OCH2CH2)i시클로알킬(OCH2CH2)j-, -알킬(OCH2CH2)i헤테로고리형(OCH2CH2)j-, -알킬-(OCH2CH2)i아릴(OCH2CH2)j-, -알킬(OCH2CH2)i헤테로아릴(OCH2CH2)j-, -시클로알킬-알킬-, -알킬-시클로알킬-, -헤테로고리형-알킬-, -알킬-헤테로고리형-, -알킬-아릴-, -아릴-알킬-, -알킬-헤테로아릴-, -헤테로아릴-알킬-로부터 독립적으로 선택되고;
i 및 j는 동일하거나 상이하고, 정수이며, 0, 1 내지 2000으로부터 독립적으로 선택되고;
Z는 선형 또는 분지형 -알킬-이고;
p는 0 또는 1이고;
Z'는 H, 티올 보호기 예컨대 COR, R20 또는 SR20 (식중, R20은 H, 메틸, 알킬, 임의 치환된 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로고리형을 나타낸다)을 나타내고, 단 Z'이 H인 경우, 상기 화합물은 PBD 모이어티 중 하나의 이민 결합 -NH= 상에 티올 기 -SH가 부가되어 초래된 분자내 고리화에 의해 형성된 상응하는 화합물 과 평형 상태이다].
ㆍ 동일하거나 상이한 n, n'은 0 또는 1이다.
ㆍ q는 O, 1 또는 2이다.
ㆍ R, R'은 동일하거나 상이하고, H, 알킬, 아릴 (각각 Hal, CN, NRR', CF3, R, OR, S(O)qR, 아릴, Het로 임의 치환됨)로부터 독립적으로 선택된다.
기하이성질체 및 입체이성질체가 있는 화학식 XII의 화합물 또한 본 발명의 일부이다.
화학식 XII의 토메이마이신 유도체의 N-10, C-11 이중 결합은 물, 알콜, 티올, 1차 또는 2차 아민, 요소 및 기타 친핵체의 존재 하에 가역적인 방식으로 상응하는 이민 부가물로 용이하게 전환가능한 것으로 공지되어 있다. 이러한 공정은 가역적이고, 진공 또는 고온에서 비-양성자성 용매 내에서 탈수제의 존재 하에 상응하는 토메이마이신 유도체가 쉽게 재생성될 수 있다 ([Z. Tozuka, 1983, J. Antibiotics, 36: 276]).
따라서, 하기 화학식 XIII의 토메이마이신 유도체의 가역적 유도체가 본 발명에서 또한 사용될 수 있다:
Figure 112009009678261-PCT00024
[식중, A, X, Y, n, T, A', X', Y', n', R1, R2, R1', R2'는 화학식 XII에서 정의 된 바와 같고, W, W'은 동일하거나 상이하고, OH, 에테르 예컨대 -OR, 에스테르 (예를 들어 아세테이트), 예컨대 -OCOR, -COOR, 카르보네이트 예컨대 -OCOOR, 카르바메이트 예컨대 -OCONRR', 고리형 카르바메이트 (N10 및 C11이 고리의 일부분을 형성함), 요소 예컨대 -NRCONRR', 티오카르바베이트 예컨대 -OCSNHR, 고리형 티오카르바메이트 (N10 및 C11이 고리의 일부분을 형성함), -SH, 술피드 예컨대 -SR, 술폭시드 예컨대 -SOR, 술폰 예컨대 -SOOR, 술포네이트 예컨대 -S03-, 술폰아미드 예컨대 -NRSOOR, 아민 예컨대 -NRR', 임의로 고리형 아민 (N10 및 C11이 고리의 일부분을 형성함), 히드록실아민 유도체 예컨대 -NROR', 아미드 예컨대 -NRCOR, 아지도 예컨대 -N3, 시아노, 할로, 트리알킬 또는 트리아릴포스포늄, 아미노산-유래 기로 구성된 군으로부터 선택되고; 바람직하게는 W 및 W'은 동일하거나 상이하고, OH, Ome, Oet, NHCONH2, SMe이다].
따라서 화학식 XIII의 화합물은 용매가 물인 경우 물을 포함하는 용매화물로 간주될 수 있다; 이러한 용매화물이 특히 유용할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 토메이마이신 유도체는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:
ㆍ 8,8'-[1,3-벤젠디일비스(메틸렌옥시)]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
ㆍ 8,8'-[5-메톡시-1,3-벤젠디일비스(메틸렌옥시)]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
ㆍ 8,8'-[1,5-펜탄디일비스(옥시)]-비스[(S)-에트-(E)-일리덴-7-메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
ㆍ 8,8'-[1,4-부탄디일비스(옥시)]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
ㆍ 8,8'-[3-메틸-1,5-펜탄디일비스(옥시)]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
ㆍ 8,8'-[2,6-피리딘디일비스(옥시)]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
ㆍ 8,8'-[4-(3-tert-부톡시카르보닐아미노프로필옥시)-2,6-피리딘디일비스-(메틸렌옥시)]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
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ㆍ 8,8'-[5-(N-메틸-3-tert-부톡시카르보닐아미노프로필)-1,3-벤젠디일비스-(메틸렌옥시)]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
ㆍ 8,8'-{5-[3-(4-메틸-4-메틸디술파닐-펜타노일아미노)프로필옥시]-1,3-벤젠디일비스(메틸렌옥시)}-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
ㆍ 8,8'-[5-아세틸티오메틸-1,3-벤젠디일비스(메틸렌옥시)]-비스[(S)-2-메틸렌-7-메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
ㆍ 비스-{2-[(S)-2-메틸렌-7-메톡시-5-옥소-1,3,,11a-테트라히드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일옥시]-에틸}-카르밤산 tert-부틸 에스테르
ㆍ 8,8'-[3-(2-아세틸티오에틸)-1,5-펜탄디일비스(옥시)]-비스[(S)-2-메틸렌-7-메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
ㆍ 8,8'-[5-(N-4-메르캅토-4,4-디메틸부타노일)아미노-1,3-벤젠디일비스(메틸렌옥시)]-비스[7-메톡시-2-메틸렌-1,2,3,11a-테트라히드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
ㆍ 8,8'-[5-(N-4-메틸디티오-4,4-디메틸부타노일)-아미노-1,3-벤젠디일비스(메틸렌옥시)]-비스[7-메톡시-2-메틸렌-1,2,3,11a-테트라히드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
ㆍ 8,8'-[5-(N-메틸-N-(2-메르캅토-2,2-디메틸에틸)아미노-1,3-벤젠디일(메틸렌옥시)]-비스[7-메톡시-2-메틸렌-1,2,3,11a-테트라히드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
ㆍ 8,8'-[5-(N-메틸-N-(2-메틸디티오-2,2-디메틸에틸)아미노-1,3-벤젠디일(메틸렌옥시)]-비스[7-메톡시-2-메틸렌-1,2,3,11a-테트라히드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
ㆍ 8,8'-[(4-(2-(4-메르캅토-4-메틸)-펜탄아미도-에톡시)-피리딘-2,6-디메틸)-디옥시]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-디메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-피롤로[2,1- c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
ㆍ 8,8'-[(1-(2-(4-메틸-4-메틸디술파닐)-펜탄아미도-에톡시)-벤젠-3,5-디메틸)-디옥시]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-디메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
ㆍ 8,8'-[(4-(3-(4-메틸-4-메틸디술파닐)-펜탄아미도-프로폭시)-피리딘-2,6-디메틸)-디옥시]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-디메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
ㆍ 8,8'-[(4-(4-(4-메틸-4-메틸디술파닐)-펜탄아미도-부톡시)-피리딘-2,6-디메틸)-디옥시]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-디메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
ㆍ 8,8'-[(4-(3-[4-(4-메틸-4-메틸디술파닐-펜타노일)-피페라진-1-일]-프로필)-피리딘-2,6-디메틸)-디옥시]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-디메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
ㆍ 8,8'-[(1-(3-[4-(4-메틸-4-메틸디술파닐-펜타노일)-피페라진-1-일]-프로필)-벤젠-3,5-디메틸)-디옥시]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-디메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
ㆍ 8,8'-[(4-(2-{2-[2-(4-메틸-4-메틸디술파닐-펜타노일아미노)-에톡시]-에톡시}-에톡시)-피리딘-2,6-디메틸)-디옥시]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-디메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
ㆍ 8,8'-[(1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-메틸-4-메틸디술파닐-펜타노일아미노)-에톡시]- 에톡시}-에톡시)-에톡시]-에톡시}-에톡시)-벤젠-3,5-디메틸)-디옥시]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-디메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
ㆍ 8,8'-[(1-(2-{2-[2-(4-메틸-4-메틸디술파닐-펜타노일아미노)-에톡시]-에톡시}-에톡시)-벤젠-3,5-디메틸)-디옥시]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-디메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
ㆍ 8,8'-[(4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-메틸-4-메틸디술파닐-펜타노일아미노)-에톡시]-에톡시}-에톡시)-에톡시]-에톡시}-에톡시)-피리딘-2,6-디메틸)-디옥시]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-디메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
ㆍ 8,8'-[(1-(2-[메틸-(2-메틸-2-메틸디술파닐-프로필)-아미노]-에톡시)-벤젠-3,5-디메틸)-디옥시]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-디메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
ㆍ 8,8'-[(4-(3-[메틸-(4-메틸-4-메틸디술파닐-펜타노일)-아미노]-프로필)-피리딘-2,6-디메틸)-디옥시]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-디메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
ㆍ 8,8'-[(4-(3-[메틸-(2-메틸-2-메틸디술파닐-프로필)-아미노]-프로필)-피리딘-2,6-디메틸)-디옥시]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-디메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
ㆍ 8,8'-[(1-(4-메틸-4-메틸디술파닐)-펜탄아미도)-벤젠-3,5-디메틸)-디옥시]-비 스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-디메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
뿐만 아니라 상응하는 메르캅토 유도체, 또는 이의 제약상 허용가능한 염, 수화물, 또는 수화염, 또는 이러한 화합물들의 다형성 결정질 구조물 또는 이들의 광학 이성질체, 라세미체, 부분입체이성질체 또는 거울상이성질체.
바람직한 화합물은 하기 화학식의 화합물이다:
Figure 112009009678261-PCT00025
[식중, X, X', A, A', Y, Y', T, n, n'은 상기 정의된 대로이다].
화학식 XII의 화합물은 당업자에게 주지된 다수의 방식으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 하기 기술된 방법의 적용 또는 개조, 또는 당업자가 이해하는 바와 같은 이에 대한 변동에 의해 화합물이 합성될 수 있다. 적합한 변형 및 치환이 당업자에게 용이하게 명백하고 주지되어 있거나, 또는 과학 문헌으로부터 용이하게 수득될 수 있다. 특히, 이같은 방법을 [R.C. Larock, Comprehensive Organic Transformations, Wiley-VCH Publishers, 1999]에서 발견할 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 토메이마이신 유도체의 합성 방법이 국제 출원 번호 PCT/IB2007/000142에 기술되어 있다. 본 발명의 화합물은 다양한 합성 경로 에 의해 제조될 수 있다. 시약 및 출발 재료는 시판되거나, 또는 당업자가 주지된 기술에 의해 용이하게 합성할 수 있다 (예를 들어, WO 00/12508, WO 00/12507, WO 2005/040170, WO 2005/085260, FR1516743, [M. Mori et al., 1986, Tetrahedron, 42: 3793-3806] 참조).
임의의 기술을 사용하여 본 발명의 접합 분자가 형성될 수 있다. 산-불안정 링커를 통해, 또는 광-불안정 링커에 의해 본 발명의 토메이마이신 유도체가 항체 또는 기타 세포 결합제에 연결될 수 있다. 펩티다제-불안정 링커가 생산되도록, 유도체가 적절한 서열이 있는 펩티드와 축합되고, 이어서 세포 결합제에 연결될 수 있다. 유리 유도체가 방출되도록 세포내 에스테라제에 의해 절단될 수 있는 접합체를 생산하기 위해, 숙신화되어 세포 결합제에 연결될 수 있는 1차 히드록실 기를 함유하도록 접합체가 제조될 수 있다. 바람직하게는, 유리 또는 보호 티올 기를 함유하도록 유도체가 합성된 후, 하나 이상의 디술피드 또는 티올-함유 유도체가 디술피드 결합 또는 티오에테르 연결을 통해 세포 결합제에 각각 공유결합으로 연결된다.
수많은 접합 방법이 USP 5,416,064 및 USP 5,475,092에 교시되어 있다. 유리 아미노 기가 산출되도록 토메이마이신 유도체가 변형된 후, 항체 또는 기타 세포 결합제에 산-불안정 링커 또는 광-불안정 링커를 통해 연결될 수 있다. 펩티다제-불안정 링커가 생산되도록, 유리 아미노 또는 카르복실 기가 있는 토메이마이신 유도체가 펩티드와 축합되고, 이어서 세포 결합제에 연결될 수 있다. 유리 약물이 방출되도록 세포내 에스테라제에 의해 절단될 수 있는 접합체를 생산하기 위해, 링 커 상에 유리 히드록실 기가 있는 토메이마이신 유도체가 숙신화되어 세포 결합제에 연결될 수 있다, 가장 바람직하게는, 토메이마이신 유도체가 유리 또는 보호 티올 기가 생성되도록 처리된 후, 디술피드-또는 티올 함유 토메이마이신 이량체가 세포 결합제에 디술피드 결합을 통해 연결된다.
바람직하게는, 모노클로날 항체-또는 세포 결합제-토메이마이신 유도체 접합체는 상기 기술된 바와 같이 디술피드 결합을 통해 연결되고, 토메이마이신 유도체를 전달할 수 있는 것이다. 이같은 세포 결합 접합체는 공지된 방법에 의해 예컨대 모노클로날 항체를 숙신이미딜 피리딜-디티오프로피오네이트 (SPDP)로 변형시킴으로써 제조된다 ([Carlsson et al., 1978, Biochem. J., 173: 723-737]). 그후, 생성된 티오피리딜 기가 티올-함유 토메이마이신 유도체로의 처리에 의해 치환되어, 디술피드-연결 접합체가 생산된다. 별법적으로, 아릴디티오-토메이마이신 유도체의 경우, 항체 분자 내로 앞서 도입된 설프히드릴 기에 의한 토메이마이신 유도체의 아릴-티올의 직접적인 치환에 의해 세포 결합 접합체가 형성된다. 디술피드 다리를 통해 연결된 1 내지 10개의 토메이마이신 유도체 약물을 함유하는 접합체가 양쪽 방법에 의해 용이하게 제조된다.
더욱 구체적으로, 2 mM EDTA를 함유하는 0.05 M 인산칼륨 완충제 (pH 7.5) 내의 2.5 ㎎/㎖ 농도의 디티오-니트로피리딜 변형 항체의 용액을 티올-함유 토메이마이신 유도체 (1.3 몰 당량/디티오피리딜 기)로 처리한다. 변형된 항체로부터의 티오-니트로피리딘의 방출을 분광광도법으로 325 nm에서 모니터링하고, 이는 약 16시간 내에 완료된다. 항체-토메이마이신 유도체 접합체를 정제하고, 미반응 약물 및 기타 저분자량 물질을 세파덱스(Sephadex) G-25 또는 세파크릴(Sephacryl) S300 컬럼을 통한 젤 여과에 의해 제거한다. 230 nm에서의 흡광도와 275 nm에서의 흡광도의 비율을 측정함으로써 항체 분자 당 결합된 토메이마이신 유도체 모이어티의 개수를 결정할 수 있다. 평균 1-10개의 토메이마이신 유도체/항체 분자가 이러한 방법에 의해 디술피드 결합을 통해 연결될 수 있다.
항원-발현 세포에 대한 결합 친화력에 대한 접합의 효과를 [Liu et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93: 8618-8623]에 의해 기존에 기술된 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 세포주에 대한 토메이마이신 유도체 및 이의 항체 접합체의 세포독성을 [Goldmacher et al., 1985, J. Immunol., 135: 3648-3651]에 기술된 바와 같이 세포 증식 곡선의 역-외삽(back-extrapolation)에 의해 측정할 수 있다. 부착성 세포주에 대한 이러한 화합물들의 세포독성을 [Goldmacher et al., 1986, J. Cell Biol., 102: 1312-1319]에 기술된 바와 같이 클론원성 분석에 의해 결정할 수 있다.
렙토마이신 유도체
본 발명에 따른 세포독성제는 또한 렙토마이신 유도체일 수 있다. 본 발명에 따르면, "렙토마이신 유도체"는 [Kalesse et al., 2002, Synthesis 8: 981-1003]에 정의된 바와 같은 렙토마이신 족의 구성원을 지칭하고, 렙토마이신, 예컨대 렙토마이신 A 및 렙토마이신 B, 칼리스타틴, 랏자돈 예컨대 랏자돈 A 및 랏자돈 B, 앙기노마이신 예컨대 앙기노마이신 A, B, C, D, 카수사마이신, 렙톨스타틴, 렙토푸라닌, 예컨대 렙토푸라닌 A, B, C, D가 포함된다. 렙토마이신 A 및 B의 유도 체가 바람직하다.
더욱 구체적으로, 본 발명의 유도체는 하기 화학식 I의 화합물, 또는 이의 제약상 허용가능한 염, 수화물, 또는 수화염, 또는 이러한 화합물들의 다형성 결정질 구조물 또는 이들의 광학 이성질체, 라세미체, 부분입체이성질체 또는 거울상이성질체이다:
<화학식 I>
Figure 112009009678261-PCT00026
[식중,
Ra 및 Ra'은 H 또는 -Alk이고; 바람직하게는 Ra는 -Alk, 바람직하게는 메틸이고, Ra'은 H이고;
R17은 OR, CN, NRR', 퍼플루오로알킬로 임의 치환된 알킬이고; 바람직하게는, R17은 알킬, 더욱 바람직하게는 메틸 또는 에틸이고;
R9는 OR, CN, NRR', 퍼플루오로알킬로 임의 치환된 알킬이고; 바람직하게는, R9는 알킬, 더욱 바람직하게는 메틸이고;
X는 -O-또는 -NR-이고; 바람직하게는, X는 -NR-이고;
Y는 -U-, -NR-U-, -O-U-, -NR-CO-U-, -U-NR-CO-, -U-CO-, -CO-U-이고;
바람직하게는, X가 -O-인 경우, Y는 -U-, -NR-U-, -U-NR-CO-이고;
U는 선형 또는 분지형 -Alk-, -Alk(OCH2CH2)m-, -(OCH2CH2)m-Alk-, -Alk(OCH2CH2)m- Alk-, -(OCH2CH2)m-, -시클로알킬-, -헤테로고리형-, -시클로알킬-Alk-, -Alk-시클로알킬-, -헤테로고리형-Alk-, -Alk-헤테로고리형-으로부터 선택되고;
m은 1 내지 2000으로부터 선택된 정수이고;
바람직하게는, U는 선형 또는 분지형 -Alk-이고;
Z는 -Alk-이고;
n은 0 또는 1이고; 바람직하게는 n은 0이고;
T는 H, 티올 보호기 예컨대 Ac, R1 또는 SR1 (식중, R1은 H, 메틸, Alk, 시클로알킬, 임의 치환된 아릴 또는 헤테로고리형을 나타낸다)을 나타내거나, 또는 하기 화학식을 나타내고:
Figure 112009009678261-PCT00027
(식중, Ra, Ra', R17, R9, X, Y, Z, n은 상기 정의된 바와 같다);
바람직하게는, T는 H 또는 SR1 (식중, R1은 Alk, 더욱 바람직하게는 메틸을 나타낸다)이고;
동일하거나 상이한 R, R'은 H 또는 알킬이고;
Alk는 선형 또는 분지형 알킬을 나타내고; 바람직하게는, Alk는 (-(CH2-q(CH3)q)p- (식중, p는 1 내지 10의 정수를 나타내고, q는 0 내지 2의 정수를 나타낸다)를 나타내고; 바람직하게는, Alk는 -(CH2)- 또는 -C(CH3)2-를 나타낸다].
바람직한 화합물은 하기로부터 선택될 수 있다:
ㆍ (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-히드록시-3,5,7,9,11,15,17-헵타메틸-19-((2S,3S)-3-메틸-6-옥소-3,6-디히드로-2H-피란-2-일)-8-옥소-노나데카-2,10,12,16,18-펜타엔산의 (2-메틸술파닐-에틸)-아미드
ㆍ 비스-[(2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-히드록시-3,5,7,9,11,15,17-헵타메틸-19-((2S,3S)-3-메틸-6-옥소-3,6-디히드로-2H-피란-2-일)-8-옥소-노나데카-2,10,12,16,18-펜타엔산의 (2-메르캅토에틸)-아미드]
ㆍ (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-히드록시-3,5,7,9,11,15,17-헵타메틸-19-((2S,3S)-3-메틸-6-옥소-3,6-디히드로-2H-피란-2-일)-8-옥소-노나데카-2,10,12,16,18-펜타엔산의 (2-메르캅토-에틸)-아미드
ㆍ (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-히드록시-3,5,7,9,11,15,17-헵타메틸-19-((2S,3S)-3-메틸-6-옥소-3,6-디히드로-2H-피란-2-일)-8-옥소-노나데카-2,10,12,16,18-펜타엔산의 (2-메틸디술파닐-에틸)-아미드
ㆍ (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-히드록시-3,5,7,9,11,15,17-헵타메틸-19-((2S,3S)-3-메틸-6-옥소-3,6-디히드로-2H-피란-2-일)-8-옥소-노나데카-2,10,12,16,18-펜타엔산의(2-메틸-2-메틸디술파닐-프로필)-아미드
ㆍ (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-히드록시-3,5,7,9,11,15,17-헵타메틸-19-((2S,3S)-3-메틸-6-옥소-3,6-디히드로-2H-피란-2-일)-8-옥소-노나데카-2,10,12,16,18-펜타엔산의 (2-메르캅토-2-메틸-프로필)-아미드
또는 이의 제약상 허용가능한 염, 수화물, 또는 수화염, 또는 이러한 화합물들의 다형성 결정질 구조물 또는 이들의 광학 이성질체, 라세미체, 부분입체이성질체 또는 거울상이성질체.
유도체를 세포결합제에 연결시키기 위해, 유도체는 디술피드 결합, 술피드 (또는 본원에서 티오에테르로 칭해짐) 결합, 산-불안정 기, 광-불안정 기, 펩티다제-불안정 기, 또는 에스테라제-불안정 기와 같은 연결을 통해 유도체가 세포 결합제에 연결되도록 하는 모이어티 (연결 기)를 포함하여야 한다. 렙토마이신 유도체를, 예를 들어, 디술피드 결합, 티오에테르 결합, 산-불안정 기, 광-불안정 기, 펩티다제-불안정 기, 또는 에스테라제-불안정 기를 통해 세포 결합제에 연결시키는데 필요한 모이어티를 함유하도록 유도체가 제조된다. 수성 용액에서의 용해도를 추가로 증강시키기 위해, 연결 기는 폴리에틸렌 글리콜 스페이서(spacer)를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 조합된 세포독성 증가와 함께, 표적화된 세포의 환원성 환경이 술피드 또는 디술피드의 절단 및 유도체의 방출을 초래하기 때문에 술피드 또는 디술피드 연결이 사용된다.
본 발명의 화합물은 다양한 합성 경로에 의해 제조될 수 있다. 시약 및 출발 재료는 시판되거나, 또는 당업자가 주지된 기술에 의해 용이하게 합성할 수 있다. 본 발명의 세포독성 접합체에서 사용될 수 있는 렙토마이신 유도체의 합성 방법이, 상기 렙토마이신 유도체를 세포 결합제 예컨대 항체에 접합시키는 방법과 함께, 유럽 특허 출원 번호 06290948.6 (거명에 의해 내용이 본원에 포함됨)에 상세하게 기술되어 있다.
CC-1065 유사체
본 발명에 따른 세포독성 접합체에서 사용된 세포독성제는 또한 CC-1065 또는 이의 유도체일 수 있다.
CC-1065는 스트렙토마이세스 젤렌시스(Streptomyces zelensis)의 배양 브로스(broth)로부터 단리된 강력한 항-종양 항생제이다. CC-1065는 통상적으로 사용되는 항암 약물, 예컨대 독소루비신, 메토트렉세이트 및 빈크리스틴보다 약 1000배 더 강력하다 ([B.K. Bhuyan et al., 1982, Cancer Res., 42, 3532-3537)]. CC-1065 및 이의 유사체는 미국 특허 번호 6,372,738, 6,340,701, 5,846,545 및 5,585,499에 개시되어 있다.
CC-1065의 세포독성 효능은 이의 알킬화 활성 및 이의 DNA-결합 또는 DNA-삽입(intercalating) 활성과 상관되었다. 이러한 2가지 활성은 분자의 별도의 부분들에 존재한다. 따라서, 알킬화 활성은 시클로프로파피롤로인돌 (CPI) 서브유닛 내에 함유되고, DNA-결합 활성은 2개의 피롤로인돌 서브유닛 내에 존재한다.
CC-1065에 세포독성제로서의 특정한 매력적인 특색이 있지만, 치료적 사용에는 한계가 있다. 마우스에 CC-1065를 투여하면 지연형 간독성을 야기하여, 12.5 ㎍/㎏의 단일 정맥내 투여 후 제50일에 사망에 이르렀다 ([V. L. Reynolds et al., 1986, J. Antibiotics, XXIX: 319-334]). 이는 지연형 독성을 야기하지 않는 유사체를 개발하려 노력하도록 자극하였고, CC-1065를 모델로 하는 더욱 단순한 유사체의 합성이 기술되었다 ([M.A. Warpehoski et al., 1988, J. Med. Chem., 31: 590-603]).
또다른 일련의 유사체에서, CPI 모이어티가 시클로프로파벤즈인돌 (CBI) 모 이어티로 대체되었다 ([D. L. Boger et al., 1990, J. Org. Chem., 55: 5823-5833]; [D. L. Boger et al., 1991, BioOrg. Med. Chem. Lett., 1: 115-120]). 이러한 화합물들은 마우스에서 지연형 독성을 야기하지 않으면서 어버이 약물의 높은 시험관내 효능을 유지한다. CC-1065와 유사하게, 이러한 화합물들은 공유결합 방식으로 DNA의 마이너 그루브에 결합하여 세포 사망을 야기하는 알킬화제이다. 그러나, 가장 유망한 유사체인 아도젤레신(Adozelesin) 및 카르젤레신(Carzelesin)의 임상 평가는 실망스러운 결과에 이르렀다 ([B. F. Foster ef al., 1996, Investigational New Drugs, 13: 321-326]; [I. Wolff et al., 1996, Clin. Cancer Res., 2: 1717-1723]). 이러한 약물들은 높은 전신 독성으로 인해 불량한 치료 효과를 나타낸다.
종양 부위로의 표적화된 전달을 통해 생체내 분포를 변화시킴으로써 CC-1065 유사체의 치료 효능이 크게 개선될 수 있고, 결과적으로 표적화되지 않은 조직에서의 더 낮은 독성, 및 따라서 더 낮은 전신 독성이 초래된다. 이러한 목표를 달성하기 위해, CC-1065의 유사체 및 유도체와 종양 세포를 특이적으로 표적으로 하는 세포결합제의 접합체가 기술되었다 (미국 특허 5,475,092; 5,585,499; 5,846,545). 전형적으로 이러한 접합체들은 높은 표적-특이적 세포독성을 시험관내에서 나타내고, 마우스에서의 인간 종양 이종이식 모델에서 뛰어난 항-종양 활성을 나타낸다 ([R. V. J. Chari et al., 1995, Cancer Res., 55: 4079-4084]).
최근, 수성 매질에서의 용해도가 개선된 CC-1065 유사체의 전구약물이 기술되었다 (유럽 특허 출원 번호 06290379.4). 이러한 전구약물에서, 약물이 산성 수 용액에서의 보관 시에 안정적이도록 하고, 보호되지 않은 유사체와 비교하여 약물에 증가된 수용성을 부여하는 관능기로 분자의 알킬화 부분의 페놀성 기가 보호된다. 생체 내에서 생리학적 pH에서 보호기가 쉽게 절단되어, 상응하는 활성 약물이 제공된다. EP 06290379.4에 기술된 전구약물에서, 페놀성 치환기가 술폰산 함유 페닐 카르바메이트로서 보호되고, 이는 생리학적 pH에서 전하를 띠고, 따라서 수용성이 증강된다. 수용성을 추가로 증강시키기 위해, 임의의 폴리에틸렌 글리콜 스페이서가 인돌릴 서브유닛과 절단가능한 연결 예컨대 디술피드 기 사이의 링커 내로 도입될 수 있다. 이러한 스페이서의 도입은 약물의 효능을 변경시키지 않는다.
본 발명의 세포독성 접합체에서 사용될 수 있는 CC-1065 유사체의 합성 방법이, 유사체를 세포 결합제 예컨대 항체에 접합시키는 방법과 함께, EP 06290379.4 (거명에 의해 내용이 본원에 포함됨) 및 미국 특허 번호 5,475,092, 5,846,545, 5,585,499, 6,534,660 및 6,586,618 및 미국 출원 번호 10/116,053 및 10/265,452에 상세하게 기술되어 있다.
기타 약물
메토트렉세이트, 다우노루비신, 독소루비신, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 칼리키아마이신, 투불리신 및 투불리신 유사체, 듀오카르마이신 및 듀오카르마이신 유사체, 돌라스타틴 및 돌라스타틴 유사체와 같은 약물이 본 발명의 접합체의 제조에 또한 적절하다. 혈청 알부민과 같은 중개 담체 분자를 통해 약물 분자가 항체 분자에 또한 연결될 수 있다. 미국 특허 번호 6,630,579에 예를 들어 기술된 바와 같은 독사루비신 및 다우노루비신 화합물이 또 한 유용한 세포독성제일 수 있다.
치료용 조성물
또한 본 발명은 치료적 유효량의 본 발명의 화합물 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는, 과증식성 장애의 치료를 위한 치료용 조성물에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 상기 제약 조성물은 하기를 포함하는 (그러나 이에 한정되지 않는) 암의 치료를 위한 것이다: 방광, 유방, 결장, 신장, 간, 폐, 난소, 췌장, 위, 자궁경부, 갑상선 및 피부의 암종이 포함되는 암종 (편평세포 암종 포함); 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 버킷(Burkitt) 림프종이 포함되는, 림프구 계통의 조혈성 종양; 급성 및 만성 골수성 백혈병 및 전골수구성 백혈병이 포함되는 골수 계통의 조혈성 종양; 섬유육종 및 횡문근육종이 포함되는, 중간엽 기원의 종양; 흑색종, 고환종, 기형암종, 신경모세포종 및 신경아교종이 포함되는, 기타 종양; 별아교세포종, 신경모세포종, 신경아교종, 및 신경집종이 포함되는, 중추 및 말초 신경계의 종양; 섬유육종, 횡문근육종, 및 골육종이 포함되는, 중간엽 기원의 종양; 및 흑색종, 색소성 건피증, 각질가시세포종, 고환종, 갑상선 여포암 및 기형암종이 포함되는 기타 종양, 및 EphA가 두드러지게 발현된, 아직 결정되지 않은 기타 암. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 폐, 유방, 결장, 전립선, 신장, 췌장, 난소, 자궁경부 및 림프 기관의 암, 골육종, 활막 암종, 육종, 두경부암, 신경아교종, 위암, 간암 또는 EphA가 발현된 기타 암종의 치료에 사용된다. 특히, 암은 전이성 암이다. 또다른 실시양태에서, 상기 제약 조성물은, 예를 들어, 자가면역 질환, 예컨대 전신성 루 푸스, 류머티스 관절염, 및 다발성 경화증; 이식편 거부, 예컨대 신장 이식 거부, 간 이식 거부, 폐 이식 거부, 심장 이식 거부, 및 골수 이식 거부; 이식편 대 숙주 질환; 바이러스 감염, 예컨대 mV 감염, HIV 감염, AIDS 등; 및 기생충 감염, 예컨대 편모충증, 아메바증, 주혈흡충증, 및 당업자에 의해 결정되는 바와 같은 기타 감염과 같은 기타 장애에 관한 것이다.
본 발명은 하기를 포함하는 제약 조성물을 제공한다:
ㆍ 유효량의 본 발명의 항체, 항체 단편 또는 항체 접합체, 및
ㆍ 불활성이거나 생리적으로 활성일 수 있는, 제약상 허용가능한 담체.
본원에서 사용된 "제약상 허용가능한 담체"에는 생리적으로 혼화성인 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항-박테리아 및 항-진균 작용제 등이 포함된다. 적절한 담체, 희석제 및/또는 부형제의 예로는 물, 염수, 포스페이트 완충 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 중 하나 이상, 뿐만 아니라 이들의 조합물이 포함된다. 다수의 사례에서, 등장성 작용제, 예컨대 당, 폴리알콜, 또는 염화나트륨이 조성물 내에 포함되는 것이 바람직할 것이다. 특히, 적절한 담체의 관련된 예로는 (1) 약 1 ㎎/㎖ 내지 25 ㎎/㎖의 인간 혈청 알부민을 함유하거나 함유하지 않는 둘베코(Dulbecco) 포스페이트 완충 염수 (pH가 약 7.4), (2) 0.9％ 염수 (0.9％ w/v 염화나트륨 (NaCl)), 및 (3) 5％ (w/v) 덱스트로스가 포함되고; 이는 항산화제 예컨대 트립타민 및 안정화제 예컨대 트윈(Tween) 20을 또한 함유할 수 있다.
본원의 조성물은 치료될 특정 장애에 필요하다면 추가적인 치료제를 또한 함유할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체, 항체 단편 또는 항체 접합체, 및 보충적인 활성 화합물은 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 상보적인 활성을 가질 것이다. 바람직한 실시양태에서, 추가적인 치료제는 섬유모세포-성장 인자 (FGF), 간세포 성장 인자 (HGF), 조직 인자 (TF), 단백질 C, 단백질 S, 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 또는 HER2 수용체의 길항제이다.
본 발명의 조성물은 형태가 다양할 수 있다. 여기에는, 예를 들어, 액체, 반고체, 및 고체 투약 형태가 포함되지만, 바람직한 형태는 의도된 투여 방식 및 치료 용도에 좌우된다. 전형적인 바람직한 조성물은 주사용 또는 주입용 용액의 형태이다. 바람직한 투여 방식은 비경구 투여 (예를 들어 정맥내, 근육내, 복강내, 피하)이다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 볼루스(bolus)로서 또는 장기간에 걸친 연속적인 주입에 의해 정맥내로 투여된다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 이는 근육내, 피하, 관절내, 윤활막내, 종양내, 종양주위, 병변내, 또는 병변주위 경로에 의해 주사되어, 국소적, 뿐만 아니라 전신성 치료 효과를 발휘한다.
비경구 투여를 위한 무균성 조성물은 필요한 양의 본 발명의 항체, 항체 단편 또는 항체 접합체를 적합한 용매에 혼입시킨 후, 미세여과에 의해 무균화시킴으로써 제조될 수 있다. 용매 또는 비히클로서, 물, 염수, 포스페이트 완충 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등, 뿐만 아니라 이들의 조합물이 사용될 수 있다. 다수의 사례에서, 등장성 작용제, 예컨대 당, 폴리알콜, 또는 염화나트륨이 조성물 내에 포함되는 것이 바람직할 것이다. 이러한 조성물들은 보조제, 특히 습윤화제, 등장화제, 유화제, 분산제 및 안정화제를 또한 함유할 수 있다. 비경구 투여를 위 한 무균성 조성물은 사용 시점에 무균수 또는 임의의 또다른 주사용 무균성 매질에 용해될 수 있는 무균성 고체 조성물의 형태로 또한 제조될 수 있다.
본 발명의 항체, 항체 단편 또는 항체 접합체는 또한 경구 투여될 수 있다. 경구 투여를 위한 고체 조성물로서, 정제, 알약, 분말 (젤라틴 캡슐, 새세이(sachet)) 또는 과립이 사용될 수 있다. 이러한 조성물에서, 본 발명에 따른 활성 성분이 아르곤 기류 하에 하나 이상의 불활성 희석제, 예컨대 전분, 셀룰로스, 수크로스, 락토스 또는 실리카와 혼합된다. 이러한 조성물은 희석제 이외의 물질, 예를 들어 하나 이상의 윤활제 예컨대 스테아르산마그네슘 또는 탈크, 착색제, 코팅제 (당의정) 또는 글레이즈(glaze)를 또한 포함할 수 있다.
경구 투여를 위한 액제 조성물로서, 불활성 희석제 예컨대 물, 에탄올, 글리세롤, 식물성 오일 또는 파라핀 오일을 함유하는 제약상 허용가능한 용액, 현탁액, 에멀션, 시럽 및 엘릭서(elixir)가 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 희석제 이외의 물질, 예를 들어 습윤화제, 감미제, 증점제, 풍미제 또는 안정화제를 포함할 수 있다.
용량은 원하는 효과, 치료 기간 및 사용된 투여 경로에 좌우된다; 이는 일반적으로 성인에 대해 경구용으로 5 내지 1000 ㎎/일이고, 단위 용량은 1 ㎎ 내지 250 ㎎의 활성 물질 범위이다. 일반적으로, 의사는 연령, 체중 및 치료될 대상에 특이적인 임의의 기타 인자에 따라 적합한 투여량을 결정할 것이다.
치료용 사용 방법
또다른 실시양태에서, 본 발명은 EphA2 수용체를 억제하는 것을 필요로 하는 환자에게 EphA2 수용체를 길항하는 항체를 투여함으로써 EphA2 수용체 활성을 억제하는 방법을 제공한다. 임의 유형의 본 발명의 항체, 항체 단편, 또는 세포독성 접합체가 치료용으로 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 의약으로서의 길항제성 항-EphA2 항체, 이의 단편, 또는 이의 세포독성 접합체의 용도를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체, 항체 단편 또는 세포독성 접합체는 포유동물에서의 과증식성 장애의 치료에 사용된다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 상기 개시되고, 본 발명의 항체, 항체 단편, 또는 세포독성 접합체를 함유하는 제약 조성물들 중 하나가 포유동물에서의 과증식성 장애의 치료에 사용된다. 한 실시양태에서, 상기 장애는 암이다. 특히, 암은 전이성 암이다. 본 발명의 항체, 항체 단편, 및 세포독성 접합체는 상기 암 종양의 신생혈관증식을 치료하는데 또한 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 제약 조성물은 하기를 포함하는 (그러나 이에 한정되지 않는) 다양한 암의 치료 또는 예방에 유용하다: 방광, 유방, 결장, 신장, 간, 폐, 난소, 췌장, 위, 자궁경부, 갑상선 및 피부의 암종이 포함되는 암종 (편평세포 암종 포함); 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 버킷 림프종이 포함되는, 림프구 계통의 조혈성 종양; 급성 및 만성 골수성 백혈병 및 전골수구성 백혈병이 포함되는 골수 계통의 조혈성 종양; 섬유육종 및 횡문근육종이 포함되는, 중간엽 기원의 종양; 흑색종, 고환종, 기형암종, 신경모세포종 및 신경아교종이 포함되는, 기타 종양; 별아교세포종, 신경모세포종, 신경아교종, 및 신경집종이 포함되는, 중추 및 말초 신경계의 종양; 섬유육 종, 횡문근육종, 및 골육종이 포함되는, 중간엽 기원의 종양; 및 흑색종, 색소성 건피증, 각질가시세포종, 고환종, 갑상선 여포암 및 기형암종이 포함되는 기타 종양, 및 EphA가 두드러지게 발현된, 아직 결정되지 않은 기타 암. 바람직한 실시양태에서, 암은 폐, 유방, 결장, 전립선, 신장, 췌장, 자궁, 난소, 자궁경부 및 림프 기관의 암, 골육종, 활막 암종, 육종, 두경부암, 신경아교종, 위암, 간암 또는 EphA가 발현된 기타 암종이다. 또다른 실시양태에서, 상기 제약 조성물은, 예를 들어, 자가면역 질환, 예컨대 전신성 루푸스, 류머티스 관절염, 및 다발성 경화증; 이식편 거부, 예컨대 신장 이식 거부, 간 이식 거부, 폐 이식 거부, 심장 이식 거부, 및 골수 이식 거부; 이식편 대 숙주 질환; 바이러스 감염, 예컨대 mV 감염, HIV 감염, AIDS 등; 및 기생충 감염, 예컨대 편모충증, 아메바증, 주혈흡충증, 및 당업자에 의해 결정되는 바와 같은 기타 감염과 같은 기타 장애에 관한 것이다.
유사하게, 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체, 항체 단편 또는 항체 접합체, 또는 세포독성 접합체를 포함하는 항체, 항체 단편 또는 치료제를, 단독으로 또는 또다른 세포독성제 또는 치료제와 조합하여, 표적 세포, 또는 표적 세포를 함유하는 조직과 접촉시키는 것을 포함하는, 선별된 세포 집단의 성장을 억제하는 방법을 제공한다.
선별된 세포 집단의 성장을 억제하는 방법은 시험관 내에서, 생체 내에서, 또는 생체외에서 실행될 수 있다. 본원에서 사용된 "성장 억제"는 단기간이든지 또는 장기간이든지 세포의 성장을 느리게 하는 것, 세포 생육력을 감소시키는 것, 세포의 사망을 야기하는 것, 세포를 용해시키는 것 및 세포 사망을 유도하는 것을 의미한다.
시험관내 용도의 예로는 질환 또는 악성 세포를 사망시키기 위한 동일한 환자 내로의 이식 전의 자가 골수의 처치; 적격성 T 세포를 사망시키고 이식편-대-숙주 질환 (GVHD)을 예방하기 위한 이식 전의 골수의 처치; 표적 항원을 발현하지 않는 원하는 변이체를 제외한 모든 세포를 사망시키기 위한 또는 원치 않는 항원을 발현하는 변이체를 사망시키기 위한 세포 배양물의 처치가 포함된다.
비-임상성 시험관내 용도의 조건은 당업자에 의해 쉽게 결정된다.
임상용 생체외 용도의 예는 암 치료 또는 자가면역 질환의 치료에서 자가 이식 전에 골수로부터 종양 세포 또는 림프계 세포를 제거하는 것, 또는 이식편-대-숙주 질환 (GVHD)을 예방하기 위해 이식 전에 자가 또는 동종 골수 또는 조직으로부터 T 세포 또는 기타 림프계 세포를 제거하는 것이다. 하기와 같이 처치가 수행될 수 있다. 환자 또는 기타 개체로부터 골수를 수확한 후, 본 발명의 세포독성제가 첨가된 혈청을 함유하는 배지에서 인큐베이션한다. 약 37℃에서 약 30분 내지 약 48시간 동안, 농도는 약 10 μM 내지 1 pM 범위이다. 농도 및 인큐베이션 시간의 정확한 조건, 즉 용량은 당업자에 의해 쉽게 결정된다. 인큐베이션 후, 골수 세포를 혈청을 함유하는 배지로 세정하고, 공지된 방법에 따라 정맥내 주입에 의해 환자에게 돌려보낸다. 골수의 수확 시점과 처치된 세포의 재주입 사이에 환자에게 다른 치료 예컨대 절제성 화학요법 또는 전신 방사선조사의 과정이 제공되는 경우, 처치된 골수 세포를 표준 의학 장비를 사용하여 액체 질소에서 동결시켜 보관한다.
임상용 생체내 용도를 위해, 본 발명의 항체, 에피토프-결합 항체 단편, 또 는 세포독성 접합체가 무균성 및 내독소 수준에 대해 테스트된 용액으로서 공급될 수 있다. 세포독성 접합체 투여의 적절한 프로토콜의 예는 하기와 같다. 접합체를 정맥내 볼루스로서 4주 동안 매주 주 1회 제공한다. 볼루스 용량은 5 내지 10 ㎖의 인간 혈청 알부민이 첨가될 수 있는 50 내지 100 ㎖의 생리식염수로 제공된다. 투여량은 정맥내 투여 당 10 ㎍ 내지 100 ㎎ (하루에 100 ng 내지 1 ㎎/㎏ 범위)일 것이다. 더욱 바람직하게는, 투여량은 50 ㎍ 내지 30 ㎎ 범위일 것이다. 가장 바람직하게는, 투여량은 1 ㎎ 내지 20 ㎎ 범위일 것이다. 4주 치료 후, 계속해서 환자에게 치료를 주 1회 제공할 수 있다. 투여 경로, 부형제, 희석제, 투여량, 시간 등과 관련된 구체적인 임상 프로토콜은 임상 상황이 허가함에 따라 당업자에 의해 결정될 수 있다.
진단
본 발명의 항체 또는 항체 단편은 시험관내에서 또는 생체내에서 생물학적 샘플 내의 EphA2를 검출하는데 또한 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-EphA2는 조직 또는 조직으로부터 유래된 세포 내의 EphA2의 수준을 결정하는데 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 조직은 질환 조직이다. 방법의 바람직한 실시양태에서, 조직은 종양 또는 이의 생검이다. 방법의 바람직한 실시양태에서, 조직 또는 이의 생검을 먼저 환자로부터 절제한 후, 조직 또는 생검 내의 EphA2의 수준을 본 발명의 항체 또는 항체 단편으로 면역분석법에서 결정할 수 있다. 조직 또는 이의 생검은 동결되거나 고정될 수 있다. 동일한 방법을 사용하여 EphA2 단백질의 또다른 성질, 예컨대 이의 티로신 인산화 수준, 세포 표면 수준, 또는 세포성 국소화를 결정할 수 있다.
상기 기술된 방법을 사용하여 암에 걸린 것으로 알려졌거나 암에 걸린 것으로 추측되는 대상에서 암을 진단할 수 있고, 이때 상기 환자에서 측정된 EphA2의 수준이 정상적인 기준 대상 또는 표준물의 수준과 비교된다. 그후, 상기 방법을 사용하여 종양이 EphA2를 발현하는지 여부를 결정할 수 있고, 이는 종양이 본 발명의 항체, 항체 단편 또는 항체 접합체로의 치료에 응답할 것임을 시사할 수 있다. 바람직하게는, 종양은 폐, 유방, 결장, 전립선, 신장, 췌장, 자궁, 난소, 자궁경부 및 림프 기관의 암, 골육종, 활막 암종, 육종, 신경아교종, 위암, 간암, 두경부암, 또는 EphA가 발현된 기타 암종, 및 EphA가 두드러지게 발현된, 아직 결정되지 않은 기타 암이다.
본 발명은 연구 또는 진단 용도에서의 사용을 위해 추가로 표지된 모노클로날 항체, 인간화 항체 및 이의 에피토프-결합 단편을 추가로 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 표지는 방사성표지, 형광단, 발색단, 영상화제 또는 금속 이온이다.
상기 표지된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편을 암에 걸린 것으로 추측되는 대상에게 투여하고, 대상의 신체 내에서의 표지의 분포를 측정 또는 모니터링하는 진단 방법이 또한 제공된다.
키트
본 발명은 기술된 세포독성 접합체 및 특정 세포 유형의 사멸을 위한 세포독성 접합체의 사용에 대한 설명서를 예를 들어 포함하는 키트를 또한 포함한다. 설명서는 세포독성 접합체를 시험관 내에서, 생체 내에서, 또는 생체 외에서 사용하 기 위한 지침을 포함할 수 있다.
전형적으로, 키트에는 세포독성 접합체를 함유하는 구획이 있을 것이다. 세포독성 접합체는 동결건조된 형태, 액체 형태, 또는 키트 내에 포함되도록 개조될 수 있는 기타 형태일 수 있다. 키트는 키트 내의 설명서 상에 기술된 방법을 실행하는데 필요한 추가적인 요소, 예컨대 동결건조 분말을 재구성시키기 위한 멸균 용액, 환자에게 투여하기 전에 세포독성 접합체와 조합시키기 위한 추가적인 작용제, 및 접합체를 환자에게 투여하는 것을 보조하는 도구를 또한 함유할 수 있다.
실시예 1
항-EphA2 모노클로날 항체 하이브리도마의 생성
4마리의 BALB/c VAF 마우스를 BALB/c 마우스로부터 유래된 프리(pre)-B 세포주인 인간 EphA2-형질감염 300-19 세포로 면역화시켰다. 300-19 세포를 전장 인간 EphA2 cDNA로 형질감염시킴으로써 항원을 과발현하는 안정적으로 형질감염된 세포가 생성되었고, 유동 세포측정법에 의해 고발현 클론에 대해 선별되었다. 세포 표면 상에 인간 EphA2 수용체를 고도로 발현하는 클론인 클론 4-6을 마우스의 면역화 및 하이브리도마의 항체 스크리닝을 위한 면역원으로서 선별하였다. EphA2-형질감염 세포를 1 ㎎/㎖의 최종 농도로 G418을 함유하는 선별 배지에서 유지시켰고, 시판되는 항체를 사용하여 정기적으로 EphA2 발현에 대해 테스트하였다.
Balb/c 마우스에게 마우스 당 200 ㎕의 포스페이트 완충 염수 (PBS) 내의 약 5×106 개의 EphA2-형질감염 300-19 세포를 피하 주사하였다. ImmunoGen, Inc.에서 사용된 표준 면역화 프로토콜에 의해 2-3주마다 주사하였다. 세포 융합 3일 전에, 동일한 용량의 항원의 복강내 주사로 마우스를 한번더 부스팅(boosting)시키고, 세포 융합 당일에 동물 사용 시술에 대한 표준 프로토콜에 따라 비장 세포를 제조하기 위해 희생시켰다.
면역화된 마우스로부터 멸균 수술 조건 하에 비장을 수집하고, 2개의 무균성이고 냉동된 현미경용 슬라이드 사이에서 분쇄하여, RPMI-1640 배지 내의 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 비세포를 펠렛화시키고, 세포 융합 전에 RPMI-1640 배지로 2회 세정하였다. 비장 세포를 뮤린 골수종 P3X63Ag8.653 세포 ([Kearney, J. F. et al., 1979. J. Immunol., 123: 1548-1550])와 혼합하고, 폴리에틸렌 글리콜-1500 (Roche 783 641)을 융합유도물질(fusogen)으로 사용하여 융합시켰다. 세포 융합 및 원심분리 후, 세포를 하이포잔틴-아미노프테린-티미딘 (HAT) 보충물 (Sigma H-0262)을 함유하는 완전 RPMI-1640 배지 (200 ㎖)에 현탁시키고, 10개의 96-웰 편평바닥 플레이트 (Corning-Costar 3596, 웰 당 200 ㎕의 세포 현탁액)에 플레이팅하였다. 37℃, 5％ CO2에서 5일 동안 인큐베이션한 후, 100 ㎕의 배양 상청액을 플레이트의 각각의 웰로부터 제거하고, 하이포잔틴-티미딘 (HT) 보충물 (Sigma H-0137)을 함유하는 동일한 부피의 RPMI-1640 배지로 교체하였다. 하이브리도마 클론이 항체 스크리닝에 충분한 대형 콜로니로 성장할 때까지 계속 인큐베이션하였다 (5％ CO2의 대기, 37℃에서).
융합 10일 후에, 하이브리도마 세포가 웰에서 절반의 전면성장으로 성장하고 상청액이 주황색으로 변했을 때, 하이브리도마 상청액을 면역분석법에 의한 항체 스크리닝을 위해 융합 플레이트로부터 샘플로 만들었다. 예비 스크리닝을 위해, 하이브리도마 상청액을 EphA2-형질감염 세포 대 어버이 300-19 세포 상에서 유동 세포측정법에 의해 테스트하였다. 세포를 50 ㎕의 하이브리도마 상청액으로 염색한 후, 플루오레세인-염소 항-마우스 IgG (H+L) 접합체와 함께 인큐베이션하고, Becton Dickinson FACSCalibur 또는 FACSArray 기계로 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. EphA2-형질감염 세포에 대해서는 양성으로, 300-19 세포에 대해서는 음성으로 분석된 하이브리도마 클론을 선별하고, 확장시키고, 보관용으로 동결시키거나, 한계 희석에 의해 서브클로닝하여 모노클로날 집단을 달성하였다. 하이브리도마 세포에 의해 분비되는 특정 항체의 이소타입을 시판되는 이소타입-결정 시약 (Roche 1493027)을 사용하여 결정하였다.
유동 세포측정법 데이터를 기초로, 인간 EphA2-형질감염 세포와 특이적으로 반응성이었지만 어버이 300-19 세포와는 반응성이지 않은 29개의 하이브리도마 클론을 인간 EphA2 항원으로의 마우스의 면역화로부터 확인 및 선별하였다.
실시예 2
항-EphA2 항체 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 및 EphA2-N2의 결합 특성화
인간 EphA2를 과발현하는 세포를 사용하는 형광 활성화 세포 분류 (FACS)에 의해, 그리고 EphA2를 발현하지 않는 세포를 사용함으로써, 정제된 항-EphA2 항체 37.3D7, 37.1F5 및 53.2H11 각각의 특이적 결합이 설명되었다 (도 1A, B, 및 C). 얼음 상의 둥근 바닥 96-웰 플레이트에서 EphA2를 과발현하는 세포 및 EphA2를 발현하지 않는 세포를 사용하여 100 ㎕ 저온 FACS 완충제 (둘베코 MEM 배지 내의 1 ㎎/㎖ BSA) 내의 37.3D7 항체, 또는 37.1F5 항체 또는 53.2H11 항체 (60 nM)의 인큐베이션을 수행하였다. 1시간 후, 원심분리에 의해 세포를 펠렛화하고, 저온 FACS 완충제로 세정한 후, 염소 항-마우스 IgG-항체-FITC 접합체 (100 ㎕, FACS 완충제 내의 6 ㎍/㎖)와 함께 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그후, 세포를 펠렛화하고, 세정하고, PBS 내의 1％ 포름알데히드 용액 200 ㎕에 재현탁시켰다. 그후, 세포 샘플을 FACSCalibur 판독기 (BD Biosciences)를 사용하여 분석하였다.
인간 EphA2-과발현 세포를 37.3D7, 37.1F5, 또는 53.2H11 항체와 함께 인큐베이션했을 때 강한 형광 시프트(shift)가 수득되었지만, 반면에 인간 EphA2를 발현하지 않는 세포를 37.3D7, 37.1F5, 또는 53.2H11 항체와 함께 인큐베이션했을 때는 시프트가 무의미하였고 (도 1A, 1B, 및 1C), 이는 37.3D7, 37.1F5 및 53.2H11 항체가 인간 EphA2에 선택적으로 결합하고 있음을 설명한다. 양성 대조군 항-EphA2 항체인 B2D6 (Upstate)은 인간 EphA2를 과발현한 세포와 함께 인큐베이션했을 때 유사한 형광 시프트를 나타냈다 (도 1A). 37.3D7 및 인간 암 세포, 예컨대 인간 유방암 MDA-MB-231 세포, 인간 결장암 HT-29 세포, 인간 췌장암 BxPC3 세포를 사용한 FACS 분석에 의해 강한 형광 시프트가 또한 관찰되었고, 이는 37.3D7 항체가 인간 종양 세포의 표면 상의 인간 EphA2에 결합한다는 것을 나타낸다 (도 2). 37.1F5 및 53.2H11 항체와 인간 종양 세포주를 사용하여 유사한 데이터가 또한 수 득되었다.
37.3D7, 37.1F5 및 53.2H11 항체와 세포 표면 상의 인간 EphA2의 결합에 대한 겉보기 해리 상수 (KD)를 인간 EphA2를 과발현하는 세포 및 인간 유방암 MDA-MB-231 세포에 대한 여러 농도의 항체의 결합의 FACS 분석에 의해 측정하였다 (도 3). KD 값을 단일-부위 결합에 대한 비-선형 회귀에 의해 추정하였다. 결합 곡선으로 37.3D7 항체에 대해 0.3 nM, 37.1F5 항체에 대해 0.07 nM, 53.2H11 항체에 대해 0.14 nM의 겉보기 KD 값이 산출되었다 (도 3A, 3C, 및 3E).
동일한 실험 프로토콜을 사용하여, EphA2-N1 및 EphA2-N2에 대해 각각 0.18 nM 및 0.05 nM의 겉보기 KD 값이 측정되었다.
뮤린 EphA2 또는 래트 EphA2를 과발현하는 세포를 37.3D7 항체 또는 53.2H11 항체와 함께 인큐베이션했을 때 강한 형광 시프트가 수득되었지만, 반면에 뮤린 EphA2 또는 래트 EphA2를 발현하지 않는 세포를 37.3D7 항체 또는 53.2H11 항체와 함께 인큐베이션했을 때는 시프트가 무의미하였고 (도 4), 이는 37.3D7 및 53.2H11 항체가 뮤린 EphA2 및 래트 EphA2에 또한 결합한다는 것을 설명한다. 37.3D7 또는 37.1F5 또는 53.2H11 항체를 원숭이 (Cercopithecus aethiops) 상피 VERO 세포와 함께 사용한 FACS 분석에 의해 강한 형광 시프트가 또한 관찰되었고, 이는 37.3D7, 37.1F5 및 53.2H11이 원숭이 EphA2에 또한 결합한다는 것을 나타낸다. 겉보기 KD 값을 단일-부위 결합에 대한 비-선형 회귀에 의해 추정하였다. FACS 분석에 의한 결합 곡선으로 원숭이 세포 상에서 37.3D7에 대해 0.15 nM, 37.1F5에 대해 0.05 nM, 53.2H11에 대해 0.07 nM의 KD 값이 산출되었다 (도 5B, 5D 및 5F).
실시예 3
37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 및 EphA2-N2 항체에 의한 MDA-MB-231 세포에 대한 에프린A1의 결합의 억제
MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 대한 에프린A1의 결합이 37.3D7, 37.1F5 및 53.2H11 항체에 의해 억제되었다 (도 6). MDA-MB-231 세포를 5 ㎍/㎖의 37.3D7, 37.1F5, 또는 53.2H11 항체와 함께 또는 이러한 항체 없이 2시간 동안 인큐베이션한 후, 100 ng/㎖의 비오틴화 에프린A1과 함께 30분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 그후, 세포를 무혈청 배지로 2회 세정하여, 결합되지 않은 비오틴-에프린A1을 제거한 후, 1％ NP-40 및 프로테아제 억제제를 함유하는 50 mM HEPES 완충제 (pH 7.4)에서 용해시켰다. Immulon-2HB ELISA 플레이트를 마우스 모노클로날 항-EphA2 항체 (D7, Upstate)로 코팅하고, 용해물로부터 EphA2 및 결합된 비오틴-에프린A1을 포획하는데 사용하였다. EphA2의 세포질성 C-말단 도메인에 대한 코팅된 항체의 결합은 EphA2의 세포외 도메인에 대한 비오틴-에프린A1의 결합을 방해하지 않았다. 웰을 세정하고, 스트렙타비딘-양고추냉이 과산화효소 접합체와 함께 인큐베이션하고, 다시 세정한 후, ABTS/H2O2 기질로 현상하였다. 5 ㎍/㎖ 37.3D7, 37.1F5, 또는 53.2H1 항체에 의한 MDA-MB-231 세포에 대한 에프린A1 결합의 억제는 본질적으로 정량적이었다; 신호는 비오틴-에프린A1이 없는 대조군을 사용하여 수득된 ELISA 배경 신호와 거의 등가였다 (도 6A, 6B 및 6C).
EphA2-N1 및 Epha2-N2 모두 37.3D7과 동일한 정도로 MDA-MB-231 세포에 대한 인간 에프린A1의 결합을 억제할 수 있었다.
실시예 4
37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1 및 EphA2-N2 항체에 의한 EphA2 매개 세포 신호전달의 억제
MDA-MB-231 인간 유방암 세포를 37.3D7, 또는 37.1F5 항체로 처리하는 것은 EphA2 수용체 자가인산화의 억제 (도 7A) 및 이의 하류 이펙터 예컨대 Akt의 인산화의 억제 (도 7B)에 의해 나타난 바와 같이 세포내 EphA2 수용체 신호전달을 완전히 억제하였다. 췌장암 CFPAC-1 세포를 37.3D7 항체 또는 53.2H11 항체로 처리하는 것은 EphA2 수용체 자가인산화의 억제 (도 7C)에 의해 나타난 바와 같이 세포내 EphA2 수용체 신호전달을 완전히 억제하였다.
도 7A 및 7C에서, 유방 MDA-MB-231 세포 또는 췌장 CFPAC-1 세포를 정규 배지 (각각의 세포주에 대해 ATCC로부터 제안된 바와 같음)에서 혈청과 함께 3일 동안 성장시킨 후, 무혈청 배지에서 12-14시간 동안 배양하였다. 혈청이 고갈된 세포를 15 ㎍/㎖의 37.3D7, 37.1F5, 또는 53.2H11 항체 또는 대조군 IgG1로 2시간 동안 처리한 후, 1 ㎍/㎖ 에프린 A1-Fc (R＆D)로 10분 동안 37℃에서 자극하였다. 그후, 세포를 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 함유하는 빙냉 용해 완충제 (50 mM HEPES 완충제, pH 7.4, 1％ NP-40, 1 mM 오르토바나듐산나트륨, 100 mM 플루오 르화나트륨, 10 mM 피로인산나트륨, 2.5 mM EDTA, 10 μM 류펩틴, 5 μM 펩스타틴, 1 mM PMSF, 5 mM 벤즈아미딘, 및 5 ㎍/㎖ 아프로티닌)에서 용해시켰다. 용해물을 단백질 A/G 비드에 커플링된 항-EphA2 항체 D7 (Upstate)로 면역침전시켰다. 면역침전된 EphA2를 SDS-폴리아크릴아미드 젤 상에서 용해시키고, 포스포티로신 특이적 모노클로날 항체인 4G10 (Cell Signaling Technology)으로 웨스턴 블롯팅(Western blotting)하였다. 각각의 면역침전된 샘플 내의 EphA2 단백질 수준을 평가하기 위해, 동일한 막을 항-EphA2 항체 D7 (Upstate)로 다시 블롯팅하였다. 대조군 항체를 사용했을 때, EphA2 수용체의 에프린 A1-자극 자가인산화의 억제가 나타나지 않았다 (도 7C). 반면에, 37.3D7, 37.1F5, 또는 53.2H11 항체로 처리했을 때 EphA2 수용체의 에프린 A1-자극 자가인산화의 완전한 억제가 수득되었다 (도 7A 및 7C). 용해물 및 토끼 폴리클로날 항-포스포-Ser473 Akt 항체 (Cell Signaling Technology)의 웨스턴 블롯을 사용하여 나타난 바와 같이, 하류 이펙터, 예컨대 Akt의 에프린 A1-자극 활성화가 37.3D7 또는 37.1F5 항체에 의해 MDA-MB-231 세포에서 또한 억제되었다 (도 7B).
MDA-MB-231 세포에서의 EphA2 자가인산화에 대한 에프린A1의 자극 효과와 대조적으로, 37.3D7 및 53.2H11 항체 자체는 인간 유방암 MDA-MB-231 세포에서 EphA2 자가인산화를 자극하지 않았다 (도 8A 및 8B). 유사한 데이터가 MDA-MB-231을 사용하여 37.1F5 항체에 대해 수득되었다. 도 8에서, MDA-MB-231 세포를 정규 배지에서 혈청과 함께 3일 동안 성장시킨 후, 무혈청 배지에서 12-14시간 동안 배양하 였다. 혈청이 고갈된 세포를 1 ㎍/㎖의 에프린A1-Fc 또는 15 ㎍/㎖의 37.3D7 또는 53.2H11 항체로 10분 동안 처리하였다. 세포 용해물을 항-EphA2 항체 D7 (Upstate)로 면역침전시켰다. SDS-폴리아크릴아미드 젤에서의 분리 후, 블롯을 항-포스포티로신 항체 4G10 (Cell Signaling Technology) 및 항-EphA2 항체 D7 (Upstate)로 프로빙(probing)하였다. 어느 항체도 독자적으로 EphA2 자가인산화를 자극하지 않은 반면, 이들 각각은 EphA2 수용체의 에프린A1-의존적 인산화를 방지한 바와 같이, 인간 유방암 MDA-MB-231 세포에서 EphA2-N1 및 EphA2-N2 모두 유사한 결과가 수득되었다.
따라서 37.3D7, 37.1F5, 53.2H11, EphA2-N1, 및 EphA2-N2 항체는 에프린A1-자극 EphA2 세포내 신호전달을 억제하는 유효성의 면에서 모든 공지된 항-EphA2 항체들 중에서 독특하다.
실시예 5
37.3D7 및 53.2H11 항체에 의한 인간 종양 세포의 혈청-자극 성장 및 생존의 억제
여러 인간 종양 세포주를 37.3D7 또는 53.2H11 항체의 존재 하에 혈청에 대한 이들의 성장 및 생존 응답에 대해 무혈청 상태에서 테스트하였다. 약 3000 개의 세포/웰을 96-웰 플레이트에 정규 배지 (각각의 세포주에 대해 ATCC로부터 제안된 바와 같음) 내에 혈청과 함께 플레이팅하고, 다음날 이를 무혈청 배지로 교체하였다. 무혈청 배지에서 하루 성장시킨 후, 세포를 15 ㎍/㎖의 37.3D7 항체 또는 53.2H11 항체 또는 대조군 IgG1과 함께 인큐베이션하고, 이어서 1％ 또는 1.5％ 혈 청의 최종 농도를 수득하도록 혈청을 첨가하였다. 그후, 세포를 또다른 3일 동안 성장시켰다. 그후, MTT 용액 [3-(4, 5)-디메틸티아졸-2-일-2,3-디페닐테트라졸륨 브로마이드; PBS 내의 5 ㎎/㎖ 용액 25 ㎕]을 첨가하고, 세포를 2-3시간 동안 인큐베이터로 돌려보냈다. 그후, 배지를 제거하고, 100 ㎕ DMSO로 교체하고, 혼합하고, 플레이트의 흡광도를 545 nm에서 측정하였다. 여러 인간 종양 세포주가 혈청의 첨가 시 성장 및 생존 응답을 나타냈고, 이는 37.3D7 또는 53.2H11 항체에 의해 현저하게 억제되었다. 예로서, 결장 종양 세포주인 HT-29, LoVo; 췌장 종양 세포주인 CFPAC-2, BxPC3; 및 흑색종 UACC-257으로의 발견이 제시된다.
37.3D7 항체는 인간 결장암 HT-29 세포의 혈청-자극 성장 및 생존을 강하게 억제하였다 (도 9A). 또다른 실험에서, 37.3D7 항체는 4 nM의 IC50 값으로 용량-의존적 방식으로 BxPC3 인간 췌장암 세포의 혈청-자극 성장 및 생존을 강하게 억제하였다 (도 10A). 또한, 37.3D7 또는 53.2H11 항체는 LoVo 인간 결장암 세포 (도 9B), CFPAC-1 인간 췌장암 세포 (도 9C) 및 UACC-257 흑색종 암 세포 (도 9D)의 혈청-자극 성장 및 생존을 강하게 억제하였고, 53.2H11 항체는 2 nM의 IC50 값으로 용량-의존적 방식으로 LoVo 세포의 혈청 또는 EGF-자극 성장 및 생존을 억제하였다 (도 10B 및 10C). 도 10에서, 0％ 혈청-처리 샘플에 대한 OD545 값을 100％ 억제로 설정하였고, 1.5％ 혈청 또는 10 ng/㎖ EGF로 처리된 샘플을 사용하여 0％ 억제를 설정하였다. 기존에 보고된 항-EphA2 항체들은 인간 종양 세포의 부착-의존적 (단층) 성장에 대한 억제 활성이 없었다. 따라서, 37.3D7 및 53.2H11 항체는 인간 종 양 세포의 부착-의존적 성장 (단층 성장)을 억제하는 능력 면에서 독특하다.
실시예 6
37.3D7, 37.1F5, 및 53.2H11 항체에 의한 인간 배꼽 정맥 내피 세포 (HUVEC)의 VEGF-매개 세포신호전달 및 VEGF-자극 성장 및 생존의 억제
FACS 분석에 의해 HUVEC 세포를 37.3D7, 37.1F5, 또는 53.2H11 항체와 함께 인큐베이션했을 때 강한 형광 시프트가 수득되었고, 이는 37.3D7, 37.1F5 및 53.2H11 항체가 HUVEC 세포 상에서 발현된 EphA2 수용체에 결합한다는 것을 가리킨다. 37.3D7, 37.1F5, 및 53.2H11 항체와 세포 표면 상의 EphA2의 결합에 대한 겉보기 해리 상수 (KD)를 여러 농도에서 수행된 FACS 결합 분석으로 수립되고 도 11에 제시된 결합 곡선으로부터 결정하였다. 단일-부위 결합에 대한 비-선형 회귀에 의해 37.3D7 항체에 대해 KD = 0.3 nM의 값이 추정되었고 (도 11), 이는 인간 암 세포에 대한 37.3D7 항체의 결합의 KD 값과 유사하다. 37.1F5 항체에 대한 KD = 0.01 nM의 값 및 53.2H11 항체에 대한 KD = 0.06 nM의 값이 유사하게 수득되었다. 이는 37.3D7, 37.1F5 및 53.2H11 항체가 EphA2 수용체를 통해 HUVEC 세포에 특이적으로 결합한다는 것을 가리킨다.
37.3D7 항체는 VEGF-유도 HUVEC 성장 및 생존을 강하게 억제하였다. 활성이 항-VEGF 차단 항체인 아바스틴(Avastin)® (Genentech)와 유사하거나 이보다 양호하였다 (도 12). 작동제성 항-EphA2 항체는 VEGF-유도 HUVEC 성장 및 생존을 억제하지 않았다 (도 12). 도 12에서, HUVEC 세포를 EBM-2 배지에서 혈청 및 내피 세 포 (EC) 보충물 (Clonetics)과 함께 3일 동안 성장시켰다. 세포를 무혈청 배지 + VEGF가 없는 EC 성장 보충물에서 12-14시간 동안 배양하였다. 혈청 고갈 후, 지시된 항체 (100 ㎍/㎖)와 함께 또는 항체 없이 세포를 5 ng/㎖ VEGF + 0.4％ 혈청으로 자극하였다. VEGF-유도 HUVEC 세포 성장 및 생존에 대한 항체의 효과를 항체 및 VEGF를 첨가하고 나서 3일 후에 실시예 5에 기술된 바와 같은 MTT 분석법을 사용하여 결정하였다. 항체에 의한 VEGF-매개 성장 및 생존의 억제％가 도 12에 제시된다. 비히클로 처리된 샘플의 OD545 값을 0％ 억제로 설정하였고, VEGF가 없는 샘플을 사용하여 100％ 억제를 설정하였다.
37.3D7 항체로의 HUVEC 세포 처리가 세포내 EphA2 수용체 신호전달을 억제한다는 것이 이의 하류 이펙터 예컨대 Akt의 억제를 측정함으로써 나타났다.
억제는 항-VEGF 차단 항체인 아바스틴® (Genentech)과 유사하였다 (도 13). 작동제성 항-EphA2 항체는 HUVEC 세포에서 VEGF-유도 Akt 인산화를 억제하지 않았다. 도 13에서, HUVEC 세포를 무혈청 배지 + VEGF가 없는 EC 보충물에서 12-14시간 동안 고갈시켰다. 세포를 항체 (20 ㎍/㎖)로 1시간 동안 처리한 후, VEGF (100 ng/㎖)를 첨가하였다. VEGF를 첨가하고 나서 15분 후에 세포를 용해시키고, 지시된 항체로 면역블롯을 프로빙하였다.
실시예 7
37.3D7 항체에 의한 마우스에서의 인간 결장암 HT-29 이종이식편의 성장의 억제 (도 14)
2×106 개의 HT-29 세포의 피하 주사에 의해 인간 결장암 HT-29 이종이식편이 SCID 마우스에서 수립되었다. 마우스가 촉진가능한 (50 ㎣) HT-29 이종이식편 종양을 나타냈을 때, 마우스를 37.3D7 항체 또는 대조군 항체 (IgG1) (1 ㎎/마우스, 정맥내, 1주일에 2번) 또는 PBS 단독 (100 ㎕/마우스, 정맥내, 1주일에 2번)으로 처치하였다. 대조군 항체 처치 또는 PBS 단독과 비교하여 37.3D7 항체 처치에 의해 종양의 성장이 현저하게 느려졌다. 마우스의 체중 측정을 기초로, 37.3D7 항체의 독성이 관찰되지 않았다.
실시예 8
항-EphA2 항체 hu53.2H11에 의한 초기 유방 MDA-MB-231 전이의 억제
항-EphA2 항체 hu532H11의 항-종양 활성을 암컷 SCID 마우스에 피하 이식된 초기 유방 MDA-MB-231 종양에 대해 단일 용량 수준에서 평가하였다. 표면 겨드랑이 및 샅고랑 림프절에서의 MDA-MB-231 종양 침범에 대한 이러한 항체의 효과를 또한 연구하였다. 이를 위해, 종양 이식 후 제1일, 제5일, 제8일, 제12일, 제15일, 제19일, 제22일 및 제26일에 hu532H11를 40 ㎎/㎏/투여로 정맥내 경로에 의해 투여하였다. 대조군은 처치하지 않았다.
hu532H11의 항-종양 활성의 평가를 위해, 동물들을 매일 칭량하고, 종양을 캘리퍼로 매주 2-3회 측정하였다. 종양 중량을 질량 (㎎) = [길이 (㎜) × 폭 (㎜)2]/2의 식을 사용하여 계산하였다. 항-종양 활성을 3가지 기준에 따라 평가하였다: 1) 처치군의 중앙값 종양 중량 (㎎) 나누기 처치되지 않은 대조군의 중앙값 종양 중량으로 정의되는 T/C; 2) 종양 성장 지연 (T-C)의 결정 (식중, T는 처치군 종양이 750 ㎎에 도달하는데 필요한 일수에서의 중앙값 시간으로 정의되고, C는 대조군 종양이 동일한 크기에 도달하는데 필요한 중앙값 시간이다); 3) 종양 세포 사멸은 log10 세포 사멸 (전체) = [T-C 값 (일 단위)]/(Td×3.32) (식중, T-C는 상기 정의된 바와 같고, Td는 대조군 종양의 종양 부피 배가 시간 (일 단위)이고, 이는 지수 성장 (100-1,000 ㎎ 범위)에서의 대조군 종양의 로그-선형 성장 플롯으로부터의 베스트 핏(best fit) 직선으로부터 추정된다).
병행 연구에서, 동물들을 상기 기술된 바와 같이 처치하고, 종양 이식 후 제28일에, 모든 마우스를 희생시키고, 겨드랑이 및 샅고랑 림프절을 수집하였다 (대조군에서의 중앙값 종양 크기 = 1558 ㎎). 면역염색에 의해 림프절 내의 MDA-MB-231 종양 세포를 확인하기 위해 인간 Ki67 항체를 사용하였다. 림프절에서의 전이의 표면적을 S = 인간 Ki67 표면적 × 100 / 림프절 표면적으로서 계산하였다 (2개의 절편의 평균).
ㆍ 1차 종양에 대한 효과:
제27일에 체중이 +8.9％ 변하면서 40 ㎎/㎏/투여 (총 용량 320 ㎎/㎏)에서 hu532H11이 잘 허용되었다. 이러한 용량은, 종양이 치료 하에 이탈하였음에도 불구하고, 1차 종양의 종양 성장을 지연시켰다 (T/C = 27％ 및 1.0 log 세포 사멸 (전체)).
ㆍ 항-전이 활성:
hu532H11가 겨드랑이 및 샅고랑 림프절 모두에서 전이 표면의 감소 (> 50 ％)를 유도하였다.
결론적으로, 유방 종양 MDA-MB-231을 지니는 마우스에서, hu532H11는 종양 발달의 초기 단계에서 처치된 1차 종양의 성장을 지연시키고 (T/C = 27％ 및 1.0 log 세포 사멸 (전체)), 겨드랑이 및 샅고랑 림프절 모두에서 전이 표면을 감소시켰다 (> 50 ％).
또다른 연구에서, 항-EphA2 항체의 활성을 인간 결장 HT29 간 "전이" 모델에서 평가할 수 있었다. 뮤린 항-EphA2 항체 53.2H11을 HT29 세포를 SCID 암컷 마우스에 비장내 이식한 후 제4일부터 일주일에 2번 정맥내 투여하였다 (종양이 없는 동물 (NTBA), 처치군 및 대조군에 대해 n = 20마리의 마우스/군). 항-EphA2를 13번째 투여하고 나서 3일 후인 제50일에, 마우스를 부검하고, 1차 종양 부위 (비장) 또는 전이 부위 (간)에서의 종량 질량을 평가하기 위해 비장 및 간을 칭량하였다. 전이 횟수를 또한 평가하였다. 당업자에게 공지된 통계학적 도구를 사용하여 데이터를 분석하였다.
ㆍ 40 ㎎/㎏/주사 (520 ㎎/㎏의 총 용량)의 항-EphA2로의 처치가 잘 허용되었다.
ㆍ 1차 종양 중량 (비장): NTBA와 대조군이 이식된 마우스 사이에 비장 중량의 현저한 차이가 관찰되었고, 후자가 더 컸다. 대조군이 이식된 마우스와 항-EphA2로 처치된 마우스 중 하나 사이에는 현저한 차이가 없었다.
ㆍ 전이 중량 (간): 대조군이 이식된 마우스의 간 중량은 NTBA의 간 중량보다 현저하게 더 컸고, 반면에, 대조군이 이식된 마우스에서보다 항-EphA2로 처치된 마우스에서 간 중량이 현저하게 더 작았다.
ㆍ 간 전이 횟수: 대조군이 이식된 마우스와 항-EphA2로 처치된 마우스 간에 통계적 차이가 관찰되지 않았다.
결론적으로, 인간 결장 선암종 HT-29의 비장내 이식은 전이성 종양 부하로 인한 간 중량 증가를 현저하게 유도하였다. 항-EphA2 처치는 이식된 마우스의 간 중량을 간에서 계수된 전이 횟수에 영향을 미치지 않으면서 감소시키는 것에 의해 관찰된 바와 같이 전이성 종양 부하를 현저하게 감소시킬 수 있었다.
실시예 9
37.1F5 항체의 경쇄 및 중쇄의 클로닝 및 서열분석
37.1F5 항체를 생산하는 하이브리도마 세포로부터의 RNA 제조
Qiagen의 RNeasy 미니프렙(miniprep) 키트를 사용하여 전체 RNA의 제제를 37.1F5 항체를 생산하는 5×106 개의 하이브리도마 세포로부터 수득하였다. 간략하게, 5×106 개의 세포를 펠렛화하고, 350 ㎕ RLT 완충제 (1％ β-메르캅토에탄올 함유)에 재현탁시켰다. 21.5 게이지 바늘 및 주사기에 대략 10-20번 또는 더이상 점성이 아닐 때까지 통과시킴으로써 현탁액을 균질화시켰다. 에탄올 (350 ㎕의 70％ 수성 에탄올)을 균질화물에 첨가하고, 이를 잘 혼합하였다. 용액을 스핀 컬럼으로 옮기고, 2-㎖ 수집관 내에 놓고, >8000 × g에서 15초 동안 스피닝하였다. 컬럼을 500 ㎕ RPE 완충제로 2회 세정한 후, 새로운 튜브로 옮기고, RNase가 없는 30 ㎕의 물 및 1분 스핀으로 용출시켰다. 용출액 (30 ㎕)을 다시 컬럼 상에 놓고, 2차로 1 분 스핀으로 용출시켰다. 30 ㎕ 용출액의 분취량을 물로 희석하여, RNA 정량을 위해 260 nm에서 UV 흡광도를 측정하는데 사용하였다.
역전사효소 (RT) 반응으로의 cDNA 제조
가변 영역 37.1F5 항체 cDNA를 Invitrogen의 SuperscriptII 키트를 사용하여 전체 RNA로부터 생성시켰다. Qianeasy 미니프렙으로부터의 5 ㎍까지의 전체 RNA를 사용하여, 키트 프로토콜을 충실하게 따랐다. 간략하게, RNA, 1 ㎕ 무작위 프라이머, 및 1 ㎕ dNTP 믹스를 RNase가 없는 증류수로 12 ㎕가 되게 하고, 65℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 그후, 믹스를 얼음 상에 적어도 1분 동안 놓았다. 이어서, 4 ㎕의 5× 반응 완충제, 2 ㎕의 0.1 M DTT, 및 1 ㎕의 RNaseOUT을 첨가하고, 믹스를 25℃에서 2분 동안 MJ Research의 써멀사이클러(thermalcycler)에서 인큐베이션하였다. 1 ㎕의 Superscriptll 효소가 첨가될 수 있도록 써멀사이클러를 중단시킨 후, 추가로 10분 동안 25℃에서 재가동시키고 나서, 50분 동안 55℃로 시프트시켰다. 70℃로 15분 동안 가열함으로써 반응을 열-불활성화시키고, 1 ㎕ RNase H를 첨가하고 37℃에서 20분 동안 인큐베이션함으로써 RNA를 제거하였다.
축퇴성 PCR 반응
하이브리도마 세포로부터 유래된 cDNA에 대한 축퇴성 PCR 반응의 1차 라운드를 위한 절차는 [Wang et al., 2000; J Immunol Methods.; 233(1-2): 167-77] 및 [Co et al., 1992; J Immunol.; 148(4): 1149-54]에 기술된 방법을 기초로 하였다. 이러한 라운드를 위한 프라이머 (표 2)는 pBluescriptII 플라스미드 내로의 클로닝을 용이하게 하기 위한 제한 부위를 함유한다.
PCR 반응 성분들 (표 3)을 얼음 상에서 얇은 벽의 PCR 튜브에서 혼합한 후, 예비가열되고 94℃에서 중단된 MJ research의 써말사이클러로 옮겼다. 하기와 같이 [Wang et al., 2000; J Immunol Methods.; 233(1-2): 167-77]으로부터 유래된 프로그램을 사용하여 반응을 수행하였다:
명칭: Wang45
1) 94℃ 3:00분
2) 94℃ 0:15초
3) 45℃ 1:00분
4) 72℃ 2:00분
5) 2로 돌아감 29회
6) 72℃ 6:00분
7) 4℃ 계속
8) 종결
그후, PCR 반응 혼합물을 1％ 저융점 아가로스 젤에서 러닝(running)시키고, 300 내지 400 bp 밴드를 절제하고, Zymo DNA 미니 컬럼을 사용하여 정제하고, 서열분석을 위해 Agencourt bioscience로 보냈다. 각각의 5' 및 3' PCR 프라이머를 서열분석 프라이머로 사용하여, 양쪽 방향으로부터 37.1F5 가변 영역 cDNA를 생성시켰다.
5' 말단 서열의 클로닝
37.1F5 가변 영역 경쇄 및 중쇄 cDNA 서열을 클로닝하기 위해 사용된 축퇴성 프라이머가 5' 말단 서열을 변경시키기 때문에, 완전한 서열을 해독하기 위해 추가적인 서열분석 노력이 필요하였다. 상기 기술된 방법으로부터의 예비 cDNA 서열을 사용하여 37.1F5 서열이 유래된 뮤린 생식계열 서열에 대해 NCBI IgBlast 사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 검색하였다. 새로운 PCR 반응으로 PCR 프라이머에 의해 변경되지 않은 완전한 가변 영역 cDNA가 산출될 수 있도록 뮤린 항체의 리더 서열에 어닐링시키기 위해 PCR 프라이머를 디자인하였다 (표 4). PCR 반응, 밴드 정제, 및 서열분석을 상기 기술된 바와 같이 수행하였다. mu37.1F5의 경쇄 및 중쇄가 유래되었을 생식계열 서열은 각각 Genbank 접속 번호 MUSIGKVR3 및 AF303839 하에 접근가능하다.
서열 확인을 위한 펩티드 분석
가변 영역에 대한 cDNA 서열 정보를 생식계열 불변 영역 서열과 조합하여 전장 항체 cDNA 서열을 수득하였다. 그후, 중쇄 및 경쇄의 분자량을 계산하여, 뮤린 37.1F5 항체의 LC/MS 분석에 의해 수득된 분자량과 비교하였다.
표 5는 37.1F5 LC 및 HC에 대한 cDNA 서열로부터 계산된 질량을 LC/MS에 의해 측정된 값과 함께 제공한다. 분자량 측정치는 37.1F5 경쇄 및 중쇄 모두에 대해 cDNA 서열과 일치하였다.
본질적으로 동일한 방법을 사용하여 37.3D7 및 53.2H11의 경쇄 및 중쇄를 클로닝하였다. 37.3D7의 경쇄 및 중쇄가 유래되었을 생식계열 서열의 Genbank 접속 번호는 각각 MMU231217 및 AF303868이다. 53.2H11에 대해서는 각각 MMU231196 및 AF303833이고, EphA2-N1에 대해서는, 각각 K02161 및 J00488이며; EphA2-N2에 대해 서는, 각각 AJ231222 및 J00488이다.
실시예 10
인간화-37.3D7-SPDB-DM4 및 인간화 -53.2H11-SPDB-DM4에 의한 EphA2 발현 종양 세포의 성장 억제
인간화 37.3D7 및 인간화 53.2H11 항체를 SPDB (4-[2-피리딜디티오]부탄산 N-히드록시숙신이미드 에스테르) 링커를 사용하여 L-DM4 N2'데아세틸-N2'(4-메틸-4-메르캅토-1-옥소펜틸)-메이탄신에 접합시켰다. 간략하게, 항체를 8 ㎎/㎖에서 hu53.2H11 및 hu37.3D7에 대해 각각 5.5 또는 6.5배 몰 과량의 SPDB로 변형시켰다. EtOH (5％ v/v)가 있는 완충제 A (50 mM KPi/50 mM NaCl/2 mM EDTA, pH 6.5, 95％ v/v)에서 90분 동안 실온에서 반응을 수행하였다. 그후, 변형된 항체를 완충제 A로 SephadexG25 탈염 컬럼에 의해 정제하였다. 다음으로, 변형된 항체를 1.7배 몰 과량의 DM4와 SPDB 링커 상에서 반응시켰다. DMA (디메틸아세트아미드, 3％ v/v) 및 완충제 A (97％ v/v) 내의 2.5 ㎎/㎖ 항체로 실온에서 20시간 동안 반응을 수행하였다. 접합체를 10 mM 히스티딘, 130 mM 글리신, 5％ 수크로스 (pH 5.5)로 SephadexG25 컬럼에 의해 정제하였다. 약물 대 항체 비율은 hu37.3D7-SPDB-DM4에 대해 4.0이었고, hu53.2H11-SPDB-DM4에 대해 3.1이었다.
EphA2 발현 종양 세포에 대한 hu37.3D7-SPDB-DM4 및 hu53.2H11-SPDB-DM4의 효과를 시험관내 세포 증식 WST-8 ((2-(2-메톡시-4-니트로페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨, 모노소듐 염) 분석법 (카탈로그# CK04-11, Dojindo Molecular Technogies, Inc)을 사용하여 먼저 테스트하였다. 여러 인간 종양 세포주를 테스트하였다. 약 2000개의 세포/웰을 96-웰 플레이트에 다양한 농도의 hu37.3D7-SPDB-DM4 또는 hu53.2H11-SPDB-DM4의 존재 하에 10％ 혈청과 함께 정규 배지 (각각의 세포주에 대해 ATCC로부터 제안된 바와 같음) 내에 플레이팅하였다. 그후, 세포를 5일 동안 성장시켰다. 그후, WST-8의 용액 [20 ㎕ 용액]을 첨가하고, 세포를 2-3시간 동안 인큐베이터로 돌려보냈다. 플레이트의 흡광도를 450 nm 및 650 nm에서 측정하였다. 실험에서 2개의 대조군을 사용하였다. 0％ 생존은 배지만 있는 대조군이었다. 100％ 생존은 세포만 있는 대조군이었다. 데이터 분석을 위해, 먼저 A650 nm (기준 파장) 값을 상응하는 A450 nm 값으로부터 차감하였다. 그후, 각각의 샘플의 A450 nm 값을 배경 대조군 (배지만 있는 대조군)의 A450 nm 값의 차감에 의해 표준화하였다. 샘플의 표준화된 A450 값을 세포만 있는 대조군으로부터의 표준화된 A450 값 (100％ 생존 - 0％ 생존)으로 나눔으로써 생존 분율을 계산하였다. 로그 [Ab-DM4] 값을 x-축에 플롯팅하고, 생존 분율을 y-축에 플롯팅하였다.
Hu37.3D7-SPDB-DM4 및 hu53.2H11-SPDB-DM4는 PC3 전립선 종양 세포, MDA-MDA-MB-231 유방 종양 세포, WM-115 흑색종 세포, A375 흑색종 세포 및 LoVo 결장 종양 세포가 포함되는 EphA2 발현 인간 종양 세포의 성장을 현저하게 억제하였다. 예로서, PC3 전립선 종양 세포를 사용한 발견이 제시된다. hu37.3D7-SPDB-DM4 또는 hu53.2H11-SPDB-DM4는 0.02 nM의 유사한 IC50 값으로 용량-의존적 방식으로 PC3 세포의 성장을 강하게 억제하였다 (도 15A ＆ 15B). 접합체의 효능은 EphA2 발현 수준과 상호관련되었다. 50배를 초과하여 더 높은 농도의 hu37.3D7-SPDB-DM4 또는 hu53.2H11-SPDB-DM4가 SK-Mel28 세포의 성장을 억제하는데 필요하였고 (IC50 값: 각각 1.3 nM 및 >5 nM; 도 15A ＆ 15B), 상기 세포는 거의 검출가능하지 않은 수준의 EphA2를 세포 표면 상에 발현하였다 (FACS에 의해 측정됨; 데이터는 제시되지 않음) (도 15A ＆ 15B). 따라서, 시험관내 성장 억제 분석법의 결과는 EphA2 발현 종양 세포주의 성장을 특이적으로 억제하는 길항제 항-EphA2 항체-접합체의 능력을 나타낸다.
EphA2 발현 종양 이종이식편의 성장에 대한 hu37.3D7-SPDB-DM4 및 hu53.2H11-SPDB-DM4의 효과를 테스트하였다. MDA-MB-231 유방 종양 이종이식편 모델을 사용한 연구가 한 예로서 제시된다. 1×107개의 MDA-MB-231 세포의 피하 주사에 의해 5주령의 암컷 CB17 SCID 마우스에서 인간 유방암 MDA-MB-231 이종이식편이 수립되었다. MDA-MB-231 이종이식편 종양이 수립되었을 때 (83 ㎣의 평균 크기), 마우스를 hu3D7-SPDB-DM4 또는 hu2H11-SPDB-DM4 또는 PBS의 단일 정맥내 주사로 처치하였다. 항체의 용량은 마우스 체중 1 ㎏ 당 15㎎, 마우스 체중 1 ㎏ 당 7.5㎎ 및 마우스 체중 1 ㎏ 당 3.25 ㎎이었다. PBS 대조군에 비해 종양 세포 성장의 두드러진 지연을 나타낸 3.25 ㎎/㎏의 hu2H11-SPDB-DM4를 제외하고는, 테스트된 모든 농도에서 hu3D7-SPDB-DM4 또는 hu2H11-SPDB-DM4 항체 접합체에 의해 MDA-MB-231 종양의 성장이 완전히 억제되었다 (도 16A ＆ 16B). 각각의 군 (6마리의 마우스/군) 에서의 중앙값 종양 부피가 도 16A ＆ B에서 제시된다. 요약하면, hu3D7-SPDB-DM4 및 hu2H11-SPDB-DM4 모두 생체 내에서 EphA2 발현 종양에 대한 강력한 성장 억제 활성이 있었다. 체중 측정을 기초로, 양쪽 항체-접합체 모두 독성이 관찰되지 않았다.
표
Figure 112009009678261-PCT00028
Figure 112009009678261-PCT00029
Figure 112009009678261-PCT00030
Figure 112009009678261-PCT00031
Figure 112009009678261-PCT00032
Figure 112009009678261-PCT00033
SEQUENCE LISTING <110> SANOFI-AVENTIS <120> Antagonist antibody for the treatment of cancer. <130> FR2006030 PCT <150> EP 06291160.7 <151> 2006-07-18 <160> 80 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 1 Ser Tyr Trp Met His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 2 Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe Met 1 5 10 15 Asn <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 3 Trp Gly Leu Val Arg Tyr Phe Phe Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 4 Thr Val Ser Ser Ser Val Asn Ser Ser Tyr Leu His 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 5 Ser Thr Ser Asn Leu Pro Ser 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 6 His Gln Tyr His Arg Ser Pro Gln Phe Thr 1 5 10 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 7 Gly Tyr Thr Met Asn 1 5 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 8 Leu Ile Asn Pro His Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Leu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 9 Trp Gly Asp Tyr Gly Ser Phe Ala Tyr 1 5 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 10 Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe Gly Tyr Ser Phe Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 11 Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 12 Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Pro Thr 1 5 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 13 Ala Tyr Tyr Met His 1 5 <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 14 Leu Val Asn Pro Tyr Asn Gly Phe Ser Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Glu 1 5 10 15 Asp <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 15 Glu Phe Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 16 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Ile His Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 17 Leu Val Ser Arg Leu Asp Ser 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 18 Trp Gln Gly Ser His Phe Pro Arg Thr 1 5 <210> 19 <211> 363 <212> DNA <213> Mus sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 19 cag gtc caa ctg caa caa cct ggg tct gaa ctg gtg agg cct gga gct 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg cag ctg tcc tgt aag gct tct ggc tac tca ttc acc agc tac 96 Ser Val Gln Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 tgg atg cac tgg gtg aga cag agg cct gga caa ggc ctt caa tgg att 144 Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile 35 40 45 gga aat att tat cct ggt act ggt aat act aat tac gat gag aaa ttc 192 Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60 atg aac aag gcc aca ctg act gta gac aca tat tcc agc aca acc tac 240 Met Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Tyr Ser Ser Thr Thr Tyr 65 70 75 80 atg cag ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gcg gtc tat tac tgt 288 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga tgg ggg tta gta cgg tat ttc ttt gca atg gac tac tgg ggt 336 Ala Arg Trp Gly Leu Val Arg Tyr Phe Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 caa gga acc tca gtc acc gtc tcc tca 363 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 20 <211> 121 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 20 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Gln Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60 Met Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Tyr Ser Ser Thr Thr Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Gly Leu Val Arg Tyr Phe Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 21 <211> 354 <212> DNA <213> Mus sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(354) <400> 21 gag gtc cag ctg caa cag tct gga cct gag ctg gtg aag cct gga gct 48 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca atg aag att tcc tgc agg gct tct ggt tac tca ttc act ggc tac 96 Ser Met Lys Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 acc atg aac tgg gtg agg cag agc cat gga aag aac ctt gag tgg att 144 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga ctt att aat cct cac aat ggt ggt tct agc tac aac ctg aag ttc 192 Gly Leu Ile Asn Pro His Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Leu Lys Phe 50 55 60 aag ggc aag gcc aca tta act gta gac aag tca tcc agc aca gcc tac 240 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ctc ctc agt ctg aca tct gaa gac tct gca gtc tat tac tgt 288 Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gta aga tgg ggt gac tac ggc tct ttt gct tac tgg ggc caa ggg act 336 Val Arg Trp Gly Asp Tyr Gly Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 ctg gtc act gtc tct gca 354 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 22 <211> 118 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 22 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Met Lys Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro His Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Leu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Trp Gly Asp Tyr Gly Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 23 <211> 357 <212> DNA <213> Mus sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(357) <400> 23 gag gtc cag ctg caa cag tct gga cct gag ctg gtg aag cct ggg gct 48 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag att tcc tgc aag gct tct ggt tac tca ttc act gcc tac 96 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ala Tyr 20 25 30 tac atg cac tgg gtg aag caa agt cat gta aag agt ctt gag tgg att 144 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Val Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga ctt gtt aat cct tac aat ggt ttt agt agc tac aac cag aat ttc 192 Gly Leu Val Asn Pro Tyr Asn Gly Phe Ser Ser Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 gag gac aag gcc agc ttg act gta gat aag ttc tcc agc acc gcc tac 240 Glu Asp Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Lys Phe Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gaa ctc cac agc ctg aca tct gag gac tct gca gtc tat tac tgt 288 Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga gaa ttc tac ggc tac cgg tac ttc gat gtc tgg ggc gca ggg 336 Ala Arg Glu Phe Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly 100 105 110 acc gcg gtc acc gtc tcc tca 357 Thr Ala Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 24 <211> 119 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 24 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ala Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Val Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Val Asn Pro Tyr Asn Gly Phe Ser Ser Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Glu Asp Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Lys Phe Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Phe Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly 100 105 110 Thr Ala Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 25 <211> 333 <212> DNA <213> Mus sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(333) <400> 25 caa att gtt ctc acc cag tct cca gca atc atg tct gca tct cta ggg 48 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gaa cgg gtc acc atg acc tgc act gtc agc tca agt gtg aat tcc agt 96 Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Val Ser Ser Ser Val Asn Ser Ser 20 25 30 tac ttg cac tgg tac cag cag aag cca gga tcc tcc ccc aaa ctc tgg 144 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 att tat agc aca tcc aac ctg cct tct gga gtc cca gct cgc ttc agt 192 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Pro Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 ggc agt gga tct ggg acc tct tac tct ctc aca atc agc acc ata gag 240 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Thr Ile Glu 65 70 75 80 tct gaa gat gct gcc act tat tac tgt cac cag tat cat cgt tcc cca 288 Ser Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 caa ttc acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gag ata aaa cgg gct 333 Gln Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala 100 105 110 <210> 26 <211> 111 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 26 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Val Ser Ser Ser Val Asn Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Pro Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Thr Ile Glu 65 70 75 80 Ser Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 Gln Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala 100 105 110 <210> 27 <211> 336 <212> DNA <213> Mus sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <400> 27 gac att gtg ctg acc caa tct cca gct tct ttg gct gtg tct cta ggg 48 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 cag agg gcc acc ata tcc tgc aga gcc agt gaa agt gtt gat act ttt 96 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe 20 25 30 ggc tat agt ttt ata tac tgg tac cag cag aag cca gga cag cca ccc 144 Gly Tyr Ser Phe Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 aga ctc ctc atc tat cgt gca tcc aac cta gaa tct ggg atc cct gcc 192 Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 agg ttc agt ggc agt ggg tct agg aca gac ttc acc ctc acc att aat 240 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80 cct gtg gag gct gat gat gtt gca acc tat tac tgt cag caa agt aat 288 Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 gag gat cct ccg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa cgg 336 Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 28 <211> 112 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 28 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe 20 25 30 Gly Tyr Ser Phe Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 29 <211> 339 <212> DNA <213> Mus sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(339) <400> 29 gat gtt gtg atg tcc cag att cca ctc act ttg tcg gtc acc att gga 48 Asp Val Val Met Ser Gln Ile Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 caa cca gcc tcc atc tct tgc aag tca agt cag agc ctc ata cat agt 96 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Ile His Ser 20 25 30 gat gga aag aca tat ttg aat tgg ttg tta cag agg cca ggc cag tct 144 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 cca aag cgc cta att tat ctg gtg tct aga ctg gac tct gga gtc cct 192 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Arg Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 gac agg ttc act ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca ctg aaa atc 240 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 agc aga gtg gag gct gag gat ttg gga gtt tat tat tgc tgg caa ggt 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 tca cat ttt cct cgg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa 336 Ser His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 cgg 339 Arg <210> 30 <211> 113 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 30 Asp Val Val Met Ser Gln Ile Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Ile His Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Arg Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Ser His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 31 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Humanized antibody <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <220> <221> source <222> (1)..(90) <223> homo sapiens <220> <221> source <222> (91)..(105) <223> Mus sp. <220> <221> source <222> (106)..(147) <223> homo sapiens <220> <221> source <222> (148)..(192) <223> Mus sp. <220> <221> source <222> (193)..(294) <223> homo sapiens <220> <221> source <222> (295)..(330) <223> Mus sp. <220> <221> source <222> (331)..(363) <223> homo sapiens <400> 31 cag gtt cag ctt gtc cag cct gga gct gaa gtg gta aag cca gga gcc 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tct gtg aag ctc tct tgt aaa gca agc ggc tac aac ttc acc agc tat 96 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 tgg atg cac tgg gtg cgt cag cgt ccc ggc cag gga ctc cag tgg ata 144 Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile 35 40 45 ggc aac atc tac ccc ggc acc ggt aat aca aac tat gac cag aag ttc 192 Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Asp Gln Lys Phe 50 55 60 caa ggc aag gct acc ctt aca gtt gac acc tct acc agc act act tat 240 Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Thr Tyr 65 70 75 80 atg caa ttg tcc agc ctg act agc gag gat tcc gcc gtg tat tat tgt 288 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcc agg tgg ggc ctt gtt agg tac ttc ttc gct atg gat tac tgg ggg 336 Ala Arg Trp Gly Leu Val Arg Tyr Phe Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 cag ggt act agc gtt aca gtt tcc agt 363 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 32 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 32 Gln Val Gln Leu Val Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Asp Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Thr Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Gly Leu Val Arg Tyr Phe Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 33 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Humanized antibody <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <220> <221> source <222> (1)..(90) <223> homo sapiens <220> <221> source <222> (91)..(105) <223> Mus sp. <220> <221> source <222> (106)..(147) <223> homo sapiens <220> <221> source <222> (148)..(192) <223> Mus sp. <220> <221> source <222> (193)..(294) <223> homo sapiens <220> <221> source <222> (295)..(330) <223> Mus sp. <220> <221> source <222> (331)..(363) <223> homo sapiens <400> 33 cag gtg cag ctc gtc cag ccc ggt gcc gaa gtg gtg aaa ccc ggt gct 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tct gtg aag ctg tca tgc aag gcc tca ggc tat agt ttc acc tca tat 96 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 tgg atg cat tgg gtc cgc cag agg cca ggc cag ggc ctc caa tgg atc 144 Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile 35 40 45 gga aac atc tac cct ggc aca gga aat acc aat tat gac cag aaa ttc 192 Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Asp Gln Lys Phe 50 55 60 caa ggt aag gcc act ctg acc gtg gac act agc aca tca acc aca tac 240 Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Thr Tyr 65 70 75 80 atg cag ctg tct tct ctc act tca gaa gac agt gct gtc tac tac tgc 288 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca cga tgg ggc ctc gtt cgt tat ttc ttc gca atg gat tat tgg ggt 336 Ala Arg Trp Gly Leu Val Arg Tyr Phe Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 caa ggc aca tca gtt acc gtg tcc tct 363 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 34 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 34 Gln Val Gln Leu Val Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Asp Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Thr Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Gly Leu Val Arg Tyr Phe Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 35 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Humanized antibody <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <220> <221> source <222> (1)..(90) <223> homo sapiens <220> <221> source <222> (91)..(105) <223> Mus sp. <220> <221> source <222> (106)..(147) <223> homo sapiens <220> <221> source <222> (148)..(192) <223> Mus sp. <220> <221> source <222> (193)..(294) <223> homo sapiens <220> <221> source <222> (295)..(330) <223> Mus sp. <220> <221> source <222> (331)..(363) <223> homo sapiens <400> 35 cag gtg cag ctg gtg cag ccc ggg gct gag gtg gta aag cca gga gcc 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 agt gtg aag ttg tcc tgc aag gcc tcc ggg tac aat ttc acc tct tac 96 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 tgg atg cat tgg gtg cgt cag cgg cct ggg caa gga ctt caa tgg atc 144 Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile 35 40 45 ggg aat att tac ccc ggt acc ggc aat aca aat tat gat cag aag ttc 192 Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Asp Gln Lys Phe 50 55 60 cag ggc aag gct aca ttg acc gtg gat acc tac act tct act act tac 240 Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Tyr Thr Ser Thr Thr Tyr 65 70 75 80 atg caa ctg agc tca ctg acc tcc gag gac tca gcc gtg tac tat tgc 288 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca cgc tgg gga ctc gtc agg tat ttc ttt gcc atg gat tac tgg gga 336 Ala Arg Trp Gly Leu Val Arg Tyr Phe Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 cag ggg acc tct gtc acc gtg agc agt 363 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 36 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 36 Gln Val Gln Leu Val Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Asp Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Tyr Thr Ser Thr Thr Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Gly Leu Val Arg Tyr Phe Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 37 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized antibody <400> 37 Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Gly Glu Leu Val Gln Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Met Arg Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro His Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Asp Ser Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ala Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Trp Gly Asp Tyr Gly Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 38 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized antibody <400> 38 Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Gly Glu Leu Val Gln Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Met Arg Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro His Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Asp Ser Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ala Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Trp Gly Asp Tyr Gly Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 39 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Humanized antibody <220> <221> CDS <222> (1)..(357) <220> <221> source <222> (1)..(90) <223> homo sapiens <220> <221> source <222> (91)..(105) <223> Mus sp. <220> <221> source <222> (106)..(147) <223> homo sapiens <220> <221> source <222> (148)..(195) <223> Mus sp. <220> <221> source <222> (196)..(294) <223> homo sapiens <220> <221> source <222> (295)..(324) <223> Mus sp. <220> <221> source <222> (325)..(357) <223> homo sapiens <400> 39 cag gtg caa ctg gtg caa tcc ggt gcc gag gtc gtc aaa ccc gga gca 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tct gtg aag ata tcc tgt aag gcc tcc ggc tac act ttt aca gcc tac 96 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr 20 25 30 tat atg cat tgg gtt aaa cag agt ccc gtg cag tcc ctg gaa tgg atc 144 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Val Gln Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 ggc ttg gtg aac cct tat aac gga ttc tca agt tac aat caa aag ttt 192 Gly Leu Val Asn Pro Tyr Asn Gly Phe Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 cag ggc aag gct tcc ctg act gta gac aag agc agt tcc aca gcc tac 240 Gln Gly Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ctc cat tca ctg aca tca gaa gac agc gcc gta tac tat tgc 288 Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca cgt gag ttc tac ggc tat aga tac ttt gac gtc tgg ggc caa ggc 336 Ala Arg Glu Phe Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110 aca gcc gtc aca gtg agc tct 357 Thr Ala Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 40 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 40 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Val Gln Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Val Asn Pro Tyr Asn Gly Phe Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Phe Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ala Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 41 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Humanized antibody <220> <221> CDS <222> (1)..(357) <220> <221> source <222> (1)..(90) <223> homo sapiens <220> <221> source <222> (91)..(105) <223> Mus sp. <220> <221> source <222> (106)..(147) <223> homo sapiens <220> <221> source <222> (148)..(195) <223> Mus sp. <220> <221> source <222> (196)..(294) <223> homo sapiens <220> <221> source <222> (295)..(324) <223> Mus sp. <220> <221> source <222> (325)..(357) <223> homo sapiens <400> 41 cag gtc cag ttg gtg cag tct gga gca gag gtt gtg aaa cca ggc gca 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 agt gtc aaa atc agc tgt aag gct agc gga tac tcc ttt aca gca tat 96 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ala Tyr 20 25 30 tat atg cac tgg gtg aag cag agc cct gtt cag agc ctg gaa tgg atc 144 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Val Gln Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 ggt ctc gtc aac cct tat aat gga ttt tct tct tat aac caa aag ttc 192 Gly Leu Val Asn Pro Tyr Asn Gly Phe Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 cag ggc aaa gcc agc ctg aca gtg gat aag agt agc agc act gcc tat 240 Gln Gly Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gaa ctg cat tct ctc acc tct gaa gat agt gca gtg tac tat tgt 288 Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gct cgc gag ttc tac ggt tat cga tat ttc gac gtg tgg ggc cag ggt 336 Ala Arg Glu Phe Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110 act gcc gtg aca gta agc agt 357 Thr Ala Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 42 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 42 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ala Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Val Gln Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Val Asn Pro Tyr Asn Gly Phe Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Phe Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ala Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 43 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized antibody <400> 43 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Val Asn Pro Tyr Asn Gly Phe Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Phe Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ala Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 44 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Humanized antibody <220> <221> CDS <222> (1)..(357) <220> <221> source <222> (1)..(90) <223> homo sapiens <220> <221> source <222> (91)..(105) <223> Mus sp. <220> <221> source <222> (106)..(147) <223> homo sapiens <220> <221> source <222> (148)..(195) <223> Mus sp. <220> <221> source <222> (196)..(294) <223> homo sapiens <220> <221> source <222> (295)..(324) <223> Mus sp. <220> <221> source <222> (325)..(357) <223> homo sapiens <400> 44 cag gtt caa ctg gtt cag agt ggg gca gaa gtc gta aag ccc gga gct 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tcc gtt aag att agc tgt aaa gcc tcc ggc tat agc ttt aca gct tac 96 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ala Tyr 20 25 30 tat atg cac tgg gtc aag caa tct cct ggg cag agc ctg gag tgg atc 144 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 ggc ctg gtc aat cca tac aat ggc ttc tct agt tac aac caa aaa ttt 192 Gly Leu Val Asn Pro Tyr Asn Gly Phe Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 cag gga aaa gcc tcc ctt aca gta gac aag tca tct tcc act gcc tac 240 Gln Gly Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gaa ctt cac tcc ctt aca agc gag gat agc gcc gtt tat tat tgt 288 Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcc aga gaa ttt tac gga tat cgg tat ttc gat gtc tgg ggg cag ggg 336 Ala Arg Glu Phe Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110 act gcc gtg acc gtc agt tct 357 Thr Ala Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 45 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 45 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ala Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Val Asn Pro Tyr Asn Gly Phe Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Phe Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ala Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 46 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Humanized antibody <220> <221> CDS <222> (1)..(330) <220> <221> source <222> (1)..(71) <223> homo sapiens <220> <221> source <222> (72)..(105) <223> Mus sp. <220> <221> source <222> (106)..(150) <223> homo sapiens <220> <221> source <222> (151)..(171) <223> Mus sp. <220> <221> source <222> (172)..(269) <223> homo sapiens <220> <221> source <222> (270)..(299) <223> Mus sp. <220> <221> source <222> (300)..(330) <223> homo sapiens <400> 46 gag atc gtt ctc aca cag tca cca gcc acc atg agc gcc tct ccc ggg 48 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 gaa cga gtg acc atg act tgt aca gta tcc tcc tct gtg aac tct tct 96 Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Val Ser Ser Ser Val Asn Ser Ser 20 25 30 tac ctg cat tgg tac cag cag aag cct ggt tcc agc ccc aaa ctc tgg 144 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 atc tac agt aca agc aat ctg ccc tca ggc gtt ccc gct agg ttc tcc 192 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Pro Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 ggt tca ggt tct ggc act agt tac tct ctg acc atc agc acc atc gaa 240 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Thr Ile Glu 65 70 75 80 tcc gaa gat gct gca aca tac tac tgt cac cag tat cac agg tcc ccc 288 Ser Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 cag ttt aca ttc ggt ggc ggc acc aaa ctt gag att aag cgt 330 Gln Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 47 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 47 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Val Ser Ser Ser Val Asn Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Pro Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Thr Ile Glu 65 70 75 80 Ser Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 Gln Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 48 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized antibody <400> 48 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe 20 25 30 Gly Tyr Ser Phe Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 49 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized antibody <400> 49 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe 20 25 30 Gly Tyr Ser Phe Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 50 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized antibody <400> 50 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe 20 25 30 Gly Tyr Ser Phe Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 51 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Humanized antibody <220> <221> CDS <222> (1)..(339) <220> <221> source <222> (1)..(69) <223> homo sapiens <220> <221> source <222> (70)..(117) <223> Mus sp. <220> <221> source <222> (118)..(162) <223> homo sapiens <220> <221> source <222> (163)..(183) <223> Mus sp. <220> <221> source <222> (184)..(279) <223> homo sapiens <220> <221> source <222> (280)..(306) <223> Mus sp. <220> <221> source <222> (307)..(339) <223> homo sapiens <400> 51 gac gtc gtg atg aca caa acc cct ctg tcc ctg agc gtc act ctg gga 48 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 caa ccc gct tcc att agc tgc aaa tca tca caa tct ctc atc cac tca 96 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Ile His Ser 20 25 30 gac ggc aaa aca tac ctc aat tgg ctg ctg cag aga cca gga cag tcc 144 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 cct aaa agg ctt atc tac ctg gtc tct cgt ttg gac tct ggt gta cca 192 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Arg Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 gac cgg ttt act ggt tcc ggg gcc gga acc gat ttc act ctg aag att 240 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 tcc agg gtg gaa gct gaa gat ctc gga gtg tat tat tgc tgg cag ggc 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 agc cat ttc ccc cgt act ttt ggt ggg ggt acc aaa ttg gaa att aag 336 Ser His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 cgt 339 Arg <210> 52 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 52 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Ile His Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Arg Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Ser His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 53 <211> 36 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 53 ggaggatcca tagacagatg ggggtgtcgt tttggc 36 <210> 54 <211> 32 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 54 ggaggatccc ttgaccaggc atcctagagt ca 32 <210> 55 <211> 32 <212> DNA <213> Mus sp. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(32) <223> mixed bases are defined as follows: H=A+T+C, S=G+C, Y=C+T, K= G+T, M=A+C, R=A+G, W=A+T, V = A+C+G, N = A+C+G+T <400> 55 cttccggaat tcsargtnma gctgsagsag tc 32 <210> 56 <211> 35 <212> DNA <213> Mus sp. <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 56 cttccggaat tcsargtnma gctgsagsag tcwgg 35 <210> 57 <211> 31 <212> DNA <213> Mus sp. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(31) <223> mixed bases are defined as follows: H=A+T+C, S=G+C, Y=C+T, K= G+T, M=A+C, R=A+G, W=A+T, V = A+C+G, N = A+C+G+T <400> 57 ggagctcgay attgtgmtsa cmcarwctmc a 31 <210> 58 <211> 46 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 58 tatagagctc aagcttggat ggtgggaaga tggatacagt tggtgc 46 <210> 59 <211> 23 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 59 gacagacaca ctcctgctat ggg 23 <210> 60 <211> 32 <212> DNA <213> Mus sp. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(32) <223> mixed bases are defined as follows: H=A+T+C, S=G+C, Y=C+T, K= G+T, M=A+C, R=A+G, W=A+T, V = A+C+G, N = A+C+G+T <400> 60 gcagaattca tgggatggag cyggatcttt ct 32 <210> 61 <211> 5 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 61 Glu Tyr Asn Met His 1 5 <210> 62 <211> 17 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 62 Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Gly Tyr Arg Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asn <210> 63 <211> 11 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 63 Trp Gly Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Phe Thr Tyr 1 5 10 <210> 64 <211> 15 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 64 Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr Gly Asn Ser Phe Met His 1 5 10 15 <210> 65 <211> 7 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 65 Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 66 <211> 9 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 66 Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Leu Thr 1 5 <210> 67 <211> 5 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 67 Asp Tyr Asn Met His 1 5 <210> 68 <211> 17 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 68 Phe Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Arg Phe Lys 1 5 10 15 Asn <210> 69 <211> 10 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 69 Gly Tyr Tyr Tyr Gly Arg His Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 70 <211> 10 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 70 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr 1 5 10 <210> 71 <211> 7 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 71 Ile Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 72 <211> 9 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 72 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr 1 5 <210> 73 <211> 360 <212> DNA <213> Mus sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <400> 73 gag gtc cag ctt cag cag tca gga cct gac ctg gtg aaa cct ggg gcc 48 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag ata tcc tgc aag gct tct gga tac aga ttc act gaa tac 96 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 aat atg cac tgg atg aag cag agc cat gga gag agc ctt gag tgg att 144 Asn Met His Trp Met Lys Gln Ser His Gly Glu Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga tat att tat cct tac aat ggt gat act ggc tac agg cag aaa ttc 192 Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Gly Tyr Arg Gln Lys Phe 50 55 60 aag aac atg gcc aca ttg act gca gac att tcc tcc aat aca gcc tac 240 Lys Asn Met Ala Thr Leu Thr Ala Asp Ile Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gaa ctc cgc agc ctg aca tct gac gac tct gca gtc tat ttc tgt 288 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 gca aga tgg ggc tac ggt agt ggc ggg ggg ttt act tac tgg ggc caa 336 Ala Arg Trp Gly Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Phe Thr Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 ggg act ctg gtc act gtc tct gca 360 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 74 <211> 120 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 74 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Met Lys Gln Ser His Gly Glu Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Gly Tyr Arg Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asn Met Ala Thr Leu Thr Ala Asp Ile Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Gly Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Phe Thr Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 75 <211> 357 <212> DNA <213> Mus sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(357) <400> 75 gag gtc cag ctt cag cag tca gga cct gag ctg gtg aaa cct ggg gcc 48 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag ata tcc tgc aag gct tct gga tac aca ttc act gac tac 96 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 aac atg cac tgg gtg aaa cag agc cat gga aag agc ctt gag tgg att 144 Asn Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga ttt att tat cct tac aat ggt ggt act ggc tac aac cag agg ttc 192 Gly Phe Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 aag aac aag gcc aca ttg act gta gac act tcc tcc agc aca gcc tac 240 Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag gtc cgc agc ctg aca tct gag gac tct gca gtc tat ttc tgt 288 Met Glu Val Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 gca agg gga tat tac tac ggt agg cac ttt gac tac tgg ggc caa ggc 336 Ala Arg Gly Tyr Tyr Tyr Gly Arg His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 acc act ctc aca gtc tcc tca 357 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 76 <211> 119 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 76 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Phe Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Val Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Tyr Tyr Gly Arg His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 77 <211> 336 <212> DNA <213> Mus sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <400> 77 gac att gtg ctg acc caa tct cca ggt tct ttg gct gtg tct cta ggg 48 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 cag agg gcc acc ata tcc tgc aga gcc agt gaa agt gtt gac act tat 96 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr 20 25 30 ggc aat agt ttc atg cac tgg tac cag cag aaa gca gga cag ccg ccc 144 Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Pro Pro 35 40 45 aga ctc ctc atc tat cgt gca tcc aac cta gaa tct ggg atc cct gcc 192 Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 agg ttc agt ggc agt ggg tct agg aca gac ttc acc ctc acc att aat 240 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80 cct gtg gag gct gat gat gtt gca acc tat tac tgt cag caa agt aat 288 Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 gag gat cct ctc acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg aaa cgg 336 Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 110 <210> 78 <211> 112 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 78 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 110 <210> 79 <211> 321 <212> DNA <213> Mus sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 79 caa att gtt ctc acc cag tct cca gca ctc atg tct gca tct cca ggg 48 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 gag aag gtc acc atg acc tgc agt gcc agc tca agt gtg agt tac atg 96 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 tac tgg tac cag cag aag cca aga tcc tcc ccc aaa ccc tgg att tat 144 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 atc aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cct gct cgc ttc agt ggc agt 192 Ile Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 ggg tct ggg acc tct tac tct ctc aca atc agc agc atg gag gct gaa 240 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 gat gct gcc act tat tac tgc cag cag tgg agt agt aac cca ccc acg 288 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa cgg 321 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 80 <211> 107 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 80 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ile Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105

Claims (74)

  1. EphA2 수용체에 특이적으로 결합하고 상기 수용체의 길항제인 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 모노클로날(monoclonal) 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 Fab, Fab', F(ab')2 또는 Fv 단편인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 암 세포의 성장을 억제할 수 있는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 암 세포의 이동을 억제할 수 있는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 암 세포가 유방암, 결장암, 자궁내막암, 난소 암종, 골육종, 자궁경부암, 전립선암, 폐암, 활막 암종, 췌장암, 육종, 신경아교종, 두경부암, 위암, 간암, 및 기타 암종으로 구성된 군으로부터 선택된 암의 세포인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 혈관생성을 억제할 수 있는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편에 작동제 활성이 없는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 EphA2 티로신 인산화를 자극하지 않는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 상기 수용체에 대한 리간드의 결합을 억제할 수 있는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  11. 제10항에 있어서, 상기 리간드가 에프린A1인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 EphA2 티로신 인산화를 억제할 수 있는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  13. 제12항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 에프린A1의 존재 하에 EphA2 티로신 인산화를 억제할 수 있는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 EphA2-매개 신호전달을 억제할 수 있는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  15. 제14항에 있어서, EphA2-매개 신호전달이 Akt 인산화에서의 증가인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 에피토프- 결합 단편이 3×10-10 M 이하의 KD로 EphA2와 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EphA2 수용체가 인간의 수용체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 및 72로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 상보성-결정 영역을 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 서열 26, 28, 30, 78, 및 80으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 서열 20, 22, 24, 74, 및 76으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 하나 이상의 중쇄 및 하나 이상의 경쇄를 포함하고, 이때 상기 중쇄는 서열 1, 2, 및 3으로 표시되는 아미노산 서열의 3개의 순차적인 상보성-결정 영역을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 4, 5, 및 6으로 표시되는 아미노산 서열의 3개의 순차적인 상보성-결정 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  22. 제21항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 서열 26으로 구성된 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  23. 제21항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 서열 20으로 구성된 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역을 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  24. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 하나 이상의 중쇄 및 하나 이상의 경쇄를 포함하고, 이때 상기 중쇄는 서열 7, 8, 및 9로 표시되는 아미노산 서열의 3개의 순차적인 상보성-결정 영역을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 10, 11, 및 12로 표시되는 아미노산 서열의 3개의 순차적인 상보성-결정 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  25. 제24항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 서열 28로 구성된 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  26. 제24항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 서열 22로 구성된 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역을 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  27. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 하나 이상의 중쇄 및 하나 이상의 경쇄를 포함하고, 이때 상기 중쇄는 서열 13, 14, 및 15로 표시되는 아미노산 서열의 3개의 순차적인 상보성-결정 영역을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 16, 17, 및 18로 표시되는 아미노산 서열의 3개의 순차적인 상보성-결정 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  28. 제27항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 서열 30으로 구성된 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  29. 제27항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 서열 24로 구성된 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역을 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  30. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 하나 이상의 중쇄 및 하나 이상의 경쇄를 포함하고, 이때 상기 중쇄는 서열 61, 62, 및 63으로 표시되는 아미노산 서열의 3개의 순차적인 상보성-결정 영역을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 64, 65, 및 66으로 표시되는 아미노산 서열의 3개의 순차적인 상보성-결정 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  31. 제30항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 서열 78로 구성된 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  32. 제30항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 서열 74로 구 성된 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역을 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  33. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 하나 이상의 중쇄 및 하나 이상의 경쇄를 포함하고, 이때 상기 중쇄는 서열 67, 68, 및 69로 표시되는 아미노산 서열의 3개의 순차적인 상보성-결정 영역을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 70, 71, 및 72로 표시되는 아미노산 서열의 3개의 순차적인 상보성-결정 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  34. 제33항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 서열 80으로 구성된 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  35. 제33항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 서열 76으로 구성된 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역을 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 뮤린(murine) 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이고, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)에 수탁 번호 PTA-7660 하에 기탁된, 37.3D7로 지정된 하이브리도마; 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션에 수탁 번호 PTA-7661 하에 기탁된, 37.1F5로 지정된 하이브리도마; 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션에 수탁 번호 PTA-7662 하에 기탁된, 53.2H11로 지정된 하이브리도마; 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션에 수탁 번호 PTM-8407 하에 기탁된, EphA2-N1으로 지정된 하이브리도마; 또는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션에 수탁 번호 PTM-8408 하에 기탁된, EphA2-N2로 지정된 하이브리도마에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편과 동일한 에피토프에 결합하는, 인간화 또는 재포장(resurfaced) 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 또는 재포장 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 및 72로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 상보성-결정 영역을 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 또는 재포장 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 또는 재포장 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 서열 47, 48, 49, 50, 및 52로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 또는 재포장 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 또는 재포장 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 서열 32, 34, 36, 37, 38, 40, 42, 43, 및 45로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 또는 재포장 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 또는 재포장 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 하나 이상의 중쇄 및 하나 이상의 경쇄를 포함하고, 이때 상기 중쇄는 서열 1, 2, 및 3으로 표시되는 아미노산 서열의 3개의 순차적인 상보성-결정 영역을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 4, 5, 및 6으로 표시되는 아미노산 서열의 3개의 순차적인 상보성-결정 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 또는 재포장 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  42. 제41항에 있어서, 상기 인간화 또는 재포장 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 서열 47로 표시되는 서열의 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 또는 재포장 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  43. 제41항에 있어서, 상기 인간화 또는 재포장 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 서열 32, 34 및 36으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역을 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 또는 재포장 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  44. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 또는 재포장 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 하나 이상의 중쇄 및 하나 이상의 경쇄를 포함하고, 이때 상기 중쇄는 서열 7, 8, 및 9로 표시되는 아미노산 서열의 3개의 순차적인 상보성-결정 영역을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 10, 11, 및 12로 표시되는 아미노산 서열의 3개의 순차적인 상보성-결정 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 또는 재포장 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  45. 제44항에 있어서, 상기 인간화 또는 재포장 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 서열 48, 49 및 50으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 또는 재포장 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  46. 제44항에 있어서, 상기 인간화 또는 재포장 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 서열 37 및 38로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역을 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 또는 재포장 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  47. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 또는 재포장 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 하나 이상의 중쇄 및 하나 이상의 경쇄를 포함하고, 이때 상기 중쇄는 서열 13, 14, 및 15로 표시되는 아미노산 서열의 3개의 순차적인 상보성-결정 영역을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 16, 17, 및 18로 표시되는 아미노산 서열의 3개의 순차적인 상보성-결정 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 또는 재포장 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  48. 제47항에 있어서, 상기 인간화 또는 재포장 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 서열 52로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 또는 재포장 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  49. 제47항에 있어서, 상기 인간화 또는 재포장 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 서열 40, 42, 43 및 45로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역을 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 또는 재포장 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  50. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 또는 재포장 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 하나 이상의 중쇄 및 하나 이상의 경쇄를 포함하 고, 상기 중쇄는 서열 61, 62, 및 63으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 3개의 순차적인 상보성-결정 영역을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 64, 65, 및 66으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 3개의 순차적인 상보성-결정 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 또는 재포장 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  51. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 또는 재포장 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 하나 이상의 중쇄 및 하나 이상의 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄는 서열 67, 68, 및 69로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 3개의 순차적인 상보성-결정 영역을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 70, 71, 및 72로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 3개의 순차적인 상보성-결정 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 또는 재포장 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 또는 재포장 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 hu37.3D7, hu37.1F5, hu53.2H11, huEphA2-N1, 및 huEphA2-N2로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 인간화 또는 재포장 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  53. 세포독성제에 연결된 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이 의 에피토프-결합 단편을 포함하는 접합체.
  54. 제53항에 있어서, 상기 세포독성제가 메이탄시노이드, 소형 약물, 토메이마이신 유도체, 렙토마이신 유도체, 전구약물, 탁소이드, CC-1065 및 CC-1065 유사체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 접합체.
  55. 제53항에 있어서, 상기 세포독성제가 하기 화학식 I의 메이탄신 DM1인 것을 특징으로 하는 접합체:
    [화학식 I]
    Figure 112009009678261-PCT00034
  56. 제53항에 있어서, 상기 세포독성제가 하기 화학식 II의 메이탄신 DM4인 것을 특징으로 하는 접합체:
    [화학식 II]
    Figure 112009009678261-PCT00035
  57. 제53항에 있어서, 상기 세포독성제가 하기로 구성된 군으로부터 선택된 토메이마이신 유도체인 것을 특징으로 하는 접합체:
    ㆍ 8,8'-[1,3-벤젠디일비스(메틸렌옥시)]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
    ㆍ 8,8'-[5-메톡시-1,3-벤젠디일비스(메틸렌옥시)]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
    ㆍ 8,8'-[1,5-펜탄디일비스(옥시)]-비스[(S)-에트-(E)-일리덴-7-메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
    ㆍ 8,8'-[1,4-부탄디일비스(옥시)]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
    ㆍ 8,8'-[3-메틸-1,5-펜탄디일비스(옥시)]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
    ㆍ 8,8'-[2,6-피리딘디일비스(옥시)]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-메톡시- 1,2,3,11a-테트라히드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
    ㆍ 8,8'-[4-(3-tert-부톡시카르보닐아미노프로필옥시)-2,6-피리딘디일비스-(메틸렌옥시)]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
    ㆍ 8,8'-[5-(3-아미노프로필옥시)-1,3-벤젠디일비스(메틸렌옥시)]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
    ㆍ 8,8'-[5-(N-메틸-3-tert-부톡시카르보닐아미노프로필)-1,3-벤젠디일비스-(메틸렌옥시)]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
    ㆍ 8,8'-{5-[3-(4-메틸-4-메틸디술파닐-펜타노일아미노)프로필옥시]-1,3-벤젠디일비스(메틸렌옥시)}-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
    ㆍ 8,8'-[5-아세틸티오메틸-1,3-벤젠디일비스(메틸렌옥시)]-비스[(S)-2-메틸렌-7-메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
    ㆍ 비스-{2-[(S)-2-메틸렌-7-메톡시-5-옥소-1,3,,11a-테트라히드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일옥시]-에틸}-카르밤산 tert-부틸 에스테르
    ㆍ 8,8'-[3-(2-아세틸티오에틸)-1,5-펜탄디일비스(옥시)]-비스[(S)-2-메틸렌-7-메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
    ㆍ 8,8'-[5-(N-4-메르캅토-4,4-디메틸부타노일)아미노-1,3-벤젠디일비스(메틸렌옥 시)]-비스[7-메톡시-2-메틸렌-1,2,3,11a-테트라히드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
    ㆍ 8,8'-[5-(N-4-메틸디티오-4,4-디메틸부타노일)-아미노-1,3-벤젠디일비스(메틸렌옥시)]-비스[7-메톡시-2-메틸렌-1,2,3,11a-테트라히드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
    ㆍ 8,8'-[5-(N-메틸-N-(2-메르캅토-2,2-디메틸에틸)아미노-1,3-벤젠디일(메틸렌옥시)]-비스[7-메톡시-2-메틸렌-1,2,3,11a-테트라히드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
    ㆍ 8,8'-[5-(N-메틸-N-(2-메틸디티오-2,2-디메틸에틸)아미노-1,3-벤젠디일(메틸렌옥시)]-비스[7-메톡시-2-메틸렌-1,2,3,11a-테트라히드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
    ㆍ 8,8'-[(4-(2-(4-메르캅토-4-메틸)-펜탄아미도-에톡시)-피리딘-2,6-디메틸)-디옥시]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-디메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
    ㆍ 8,8'-[(1-(2-(4-메틸-4-메틸디술파닐)-펜탄아미도-에톡시)-벤젠-3,5-디메틸)-디옥시]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-디메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
    ㆍ 8,8'-[(4-(3-(4-메틸-4-메틸디술파닐)-펜탄아미도-프로폭시)-피리딘-2,6-디메틸)-디옥시]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-디메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
    ㆍ 8,8'-[(4-(4-(4-메틸-4-메틸디술파닐)-펜탄아미도-부톡시)-피리딘-2,6-디메틸)-디옥시]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-디메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
    ㆍ 8,8'-[(4-(3-[4-(4-메틸-4-메틸디술파닐-펜타노일)-피페라진-1-일]-프로필)-피리딘-2,6-디메틸)-디옥시]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-디메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
    ㆍ 8,8'-[(1-(3-[4-(4-메틸-4-메틸디술파닐-펜타노일)-피페라진-1-일]-프로필)-벤젠-3,5-디메틸)-디옥시]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-디메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
    ㆍ 8,8'-[(4-(2-{2-[2-(4-메틸-4-메틸디술파닐-펜타노일아미노)-에톡시]-에톡시}-에톡시)-피리딘-2,6-디메틸)-디옥시]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-디메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
    ㆍ 8,8'-[(1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-메틸-4-메틸디술파닐-펜타노일아미노)-에톡시]-에톡시}-에톡시)-에톡시]-에톡시}-에톡시)-벤젠-3,5-디메틸)-디옥시]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-디메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
    ㆍ 8,8'-[(1-(2-{2-[2-(4-메틸-4-메틸디술파닐-펜타노일아미노)-에톡시]-에톡시}-에톡시)-벤젠-3,5-디메틸)-디옥시]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-디메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
    ㆍ 8,8'-[(4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(4-메틸-4-메틸디술파닐-펜타노일아미노)-에톡시]- 에톡시}-에톡시)-에톡시]-에톡시}-에톡시)-피리딘-2,6-디메틸)-디옥시]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-디메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
    ㆍ 8,8'-[(1-(2-[메틸-(2-메틸-2-메틸디술파닐-프로필)-아미노]-에톡시)-벤젠-3,5-디메틸)-디옥시]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-디메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
    ㆍ 8,8'-[(4-(3-[메틸-(4-메틸-4-메틸디술파닐-펜타노일)-아미노]-프로필)-피리딘-2,6-디메틸)-디옥시]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-디메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
    ㆍ 8,8'-[(4-(3-[메틸-(2-메틸-2-메틸디술파닐-프로필)-아미노]-프로필)-피리딘-2,6-디메틸)-디옥시]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-디메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온]
    ㆍ 8,8'-[(1-(4-메틸-4-메틸디술파닐)-펜탄아미도)-벤젠-3,5-디메틸)-디옥시]-비스[(S)-2-에트-(E)-일리덴-7-디메톡시-1,2,3,11a-테트라히드로-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온].
  58. 제53항에 있어서, 세포독성제가 하기로 구성된 군으로부터 선택된 렙토마이신 유도체인 것을 특징으로 하는 접합체:
    ㆍ (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-히드록시-3,5,7,9,11,15,17-헵타메틸-19-((2S,3S)-3-메틸-6-옥소-3,6-디히드로-2H-피란-2-일)-8-옥소-노나데카-2,10,12,16,18-펜타엔 산의 (2-메틸술파닐-에틸)-아미드
    ㆍ 비스-[(2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-히드록시-3,5,7,9,11,15,17-헵타메틸-19-((2S,3S)-3-메틸-6-옥소-3,6-디히드로-2H-피란-2-일)-8-옥소-노나데카-2,10,12,16,18-펜타엔산의 (2-메르캅토에틸)-아미드]
    ㆍ (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-히드록시-3,5,7,9,11,15,17-헵타메틸-19-((2S,3S)-3-메틸-6-옥소-3,6-디히드로-2H-피란-2-일)-8-옥소-노나데카-2,10,12,16,18-펜타엔산의 (2-메르캅토-에틸)-아미드
    ㆍ (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-히드록시-3,5,7,9,11,15,17-헵타메틸-19-((2S,3S)-3-메틸-6-옥소-3,6-디히드로-2H-피란-2-일)-8-옥소-노나데카-2,10,12,16,18-펜타엔산의 (2-메틸디술파닐-에틸)-아미드
    ㆍ (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-히드록시-3,5,7,9,11,15,17-헵타메틸-19-((2S,3S)-3-메틸-6-옥소-3,6-디히드로-2H-피란-2-일)-8-옥소-노나데카-2,10,12,16,18-펜타엔산의 (2-메틸-2-메틸디술파닐-프로필)-아미드
    ㆍ (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-히드록시-3,5,7,9,11,15,17-헵타메틸-19-((2S,3S)-3-메틸-6-옥소-3,6-디히드로-2H-피란-2-일)-8-옥소-노나데카-2,10,12,16,18-펜타엔산의 (2-메르캅토-2-메틸-프로필)-아미드.
  59. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편, 또는 제53항 내지 제58항 중 어느 한 항에 따른 접합체, 및 제약상 허용가능한 담체 또는 부형제를 함유하는 제약 조성물.
  60. 의약으로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편, 또는 제53항 내지 제58항 중 어느 한 항에 따른 접합체.
  61. 암을 치료하기 위한 의약을 제조하기 위한, 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편, 또는 제53항 내지 제58항 중 어느 한 항에 따른 접합체의 용도.
  62. 제61항에 있어서, 상기 암이 전이성 암인 것을 특징으로 하는 용도.
  63. 제61항 또는 제62항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편, 또는 상기 접합체가 종양 신생혈관증식을 억제하는 것을 특징으로 하는 용도.
  64. 제61항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 유방암, 결장암, 자궁내막암, 난소 암종, 골육종, 자궁경부암, 신장암, 전립선암, 폐암, 활막 암종, 췌장암, 육종, 신경아교종, 두경부암, 위암, 간암, 및 기타 암종으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
  65. 제61항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 동일한 또는 상이한 조성물의 제작에서 추가적인 치료제를 사용하는 것을 추가로 포함하는 용도.
  66. 제65항에 있어서, 추가적인 치료제가 섬유모세포-성장 인자 (FGF), 간세포 성장 인자 (HGF), 조직 인자 (TF), 단백질 C, 단백질 S, 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 또는 HER2 수용체의 길항제인 것을 특징으로 하는 용도.
  67. 하기의 단계를 포함하는, 암에 걸린 것으로 알려졌거나 암에 걸린 것으로 추측되는 대상에서 암을 진단하는 방법:
    a) 상기 환자의 세포를 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편과 접촉시키는 단계,
    b) 상기 세포에 대한 상기 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편의 결합을 측정하는 단계, 및
    c) (b) 단계에서의 표현을 정상적인 기준 대상 또는 표준과 비교하는 단계.
  68. 제67항에 있어서, 상기 암이 유방암, 결장암, 자궁내막암, 난소 암종, 골육종, 자궁경부암, 신장암, 전립선암, 폐암, 활막 암종, 췌장암, 육종, 신경아교종, 두경부암, 위암, 간암, 및 기타 암종으로 구성된 군으로부터 선택된 암의 세포인 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 세포가 상기 환자로부터의 동결된 또는 고정된 조직 또는 세포 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 37, 38, 40, 42, 43, 45, 47, 48, 49, 50, 52, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 74, 76, 78 및 80으로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  71. 제70항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드의 서열이 서열 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 39, 41, 44, 46, 51, 73, 75, 77, 및 79로 구성된 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드와 80％ 이상의 상동성을 공유하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  72. 제70항 또는 제71항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 벡터.
  73. 제72항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  74. 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션에 수탁 번호 PTA-7660 하에 기탁된, 37.3D7로 지정된 하이브리도마 세포주; 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션에 수탁 번호 PTA-7661 하에 기탁된, 37.1F5로 지정된 하이브리도마 세포주; 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션에 수탁 번호 PTA-7662 하에 기탁된, 53.2H11로 지정된 하이브리도마 세포주; 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션에 수탁 번호 PTM-8407 하에 기탁된, EphA2-N1으로 지정된 하이브리 도마 세포주; 또는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션에 수탁 번호 PTM-8408 하에 기탁된, EphA2-N2로 지정된 하이브리도마 세포주로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 하이브리도마 세포주.
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