KR20170044093A - 무독성 파상풍 독소 c 단편(ttc)을 사용하여 근육량을 증가시키는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 근육량 및/또는 근육 강도의 증가를 필요로 하는 대상에서 근육량 및/또는 근육 강도를 증가시키기 위한 파상풍 독소의 무독성 단백질 분해성 C 단편 및 그러한 단백질 단편을 인코딩하는 플라스미드의 용도에 관한 것이다. 또한, 근육의 양, 발달, 또는 대사 활성의 감소를 적어도 부분적으로 특징으로 하는 병리학적 질환의 중증도를 개선하는 방법이 제공된다. 개시된 조성물 및 방법은 또한, 미용 용도를 포함하여, 근육량 및 근육 강도의 증가가 바람직한 질환의 치료에 유용하다.

Description

무독성 파상풍 독소 C 단편(TTC)을 사용하여 근육량을 증가시키는 방법{METHODS OF INCREASING MUSCLE MASS USING NON-TOXIC TETANUS TOXIN C FRAGMENT (TTC)}

전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조

본 출원과 함께 제출된 ASCII 텍스트 파일로 전자적으로 제출된 서열 목록 (이름: TTC_SequenceListing_ascii.txt; 크기: 21,620 바이트; 및 작성 일자: 2015년 6월 25일)의 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

다수의 인간 및 동물 장애들은 근육 조직의 손실 또는 기능적 부전 또는 근육 소모 (wasting), 예를 들어 신경근 장애, 근이영양증, 또는 HIV-감염과 관련되어 있다. 침상 안정 중인 환자에서의 근육 소모는 거대하고 일반적인 임상적 이슈이다. 중환자실에 있는 환자는 거의 입원 (confinement) 직후에 이화성 (catabolic)이 되는 것으로, 즉, 근육 조직이 붕괴되는 것으로 알려져 있다. 단지 2주 동안 깁스 (cast)로 다리가 부동화된 (immobilized) 건강하고 젊은 지원자에서도 유의한 근육 손실이 확인되었다. 예컨대, 문헌[Hespel et al. J. Physiol. 536:625-633 (2001)]을 참조한다. 근육 조직의 극심한 손실은 암, 외상 및 화상 환자에서 종종 보이는 악액질 (cachexia)이라는 질환으로 이어진다.

근육량의 손실은 노화의 정상적인 부분으로서 일어날 수 있고 이를 늦추고 대사를 더 동화성 (anabolic)인 상태로 이동시키기 위해 특별한 조치가 필요하다. 그러한 근육 손실 및/또는 근육 긴장도의 손실은 또한 미용에 중요한 영향을 가질 수 있다.

선수들은 또한 향상된 근육 발달로부터 이익을 얻을 수 있다. 그들의 훈련에서, 특히 무산소 역치 (anaerobic threshold)에 도달하기에 충분히 강한 웨이트 트레이닝 또는 심혈관계 트레이닝에서, 그들은 끊임없이 근육 섬유를 붕괴시키고 (이화작용) 섬유를 재건한다 (동화작용).

지금까지는, 근육 성장을 촉진하고/하거나 (즉, 근육량 또는 근육 부피를 증가시키고/시키거나) 근육 강도를 증가시키기 위한 신뢰할 만하거나 효과적인 치료 방법이 거의 없다. 근육 손실과 관련된 질환을 치유하지는 못하지만, 그러한 장애를 앓고 있는 환자에서 근육 조직의 양을 증가시키는 요법은 이러한 환자의 삶의 질을 유의하게 개선할 것이고 이러한 질병의 영향 중 일부를 개선할 수 있다. 따라서, 근육 조직에서의 전반적인 증가에 기여할 수 있거나, 이러한 질환, 질병 또는 장애를 앓고 있는 환자에서 근육 손실을 예방할 수 있는 새로운 요법을 찾는 것이 당업계에 필요하다.

본 발명은 감소된 근육량 및/또는 근육 강도와 관련된 질병 또는 질환의 치료를 필요로 하는 대상에서, 감소된 근육량 및/또는 근육 강도와 관련된 질병 또는 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 본 방법은 치료적 유효량의 비독성 파상풍 독소 C 단편 (TTC)을 대상에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 투여는 (i) 대상에서 근육량을 증가시키고/시키거나, (ii) 대상에서 근육 강도를 증가시키고/시키거나, (iii) 회복 또는 치유 속도를 증가시키고/시키거나, (iv) 상기 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증을 감소시키는 데 효과적이다.

본 명세서에 개시된 방법은 또한 근육량의 손실을 치료하거나, 예방하거나, 개선할 수 있거나; 근육량의 손실 속도를 감소시킬 수 있거나; 근육량의 손실과 관련된 증상을 치료하거나, 예방하거나, 개선할 수 있거나; 근육 강도의 손실을 치료하거나, 예방하거나, 개선할 수 있거나; 근육 강도의 손실과 관련된 증상을 치료하거나, 예방하거나, 개선할 수 있거나; 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증을 치료하거나, 예방하거나, 개선할 수 있거나; 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증과 관련된 증상을 치료하거나, 예방하거나, 개선할 수 있다. 일부 태양에서, 질병 또는 질환은 소모성 장애이다. 일부 태양에서, 소모성 장애는 악액질 및 거식증 (anorexia)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 태양에서, 소모성 장애는 근이영양증 및 신경근 질병으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 태양에서, 질환은 부동화 (immobilization), 만성 질병, 암, 또는 손상의 후유증이다.

근육량의 증가를 필요로 하는 대상에서 근육량을 증가시키는 방법이 또한 제공되고, 본 방법은 TTC를 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 태양에서, 근육량의 증가는 소모성 장애, 부동화, 또는 노령으로부터 발생된 소모를 보상하기 위한 것이다. 다른 태양에서, 근육량의 증가는 미용 목적을 위한 것이다.

본 발명은 또한 근육량의 손실 및/또는 근육 강도의 손실과 관련된 질병 또는 질환을 갖는 환자를 치료하는 방법을 제공하고, 본 방법은 환자로부터 채취한 샘플에서 Col19a1 (콜라겐 알파-1(XIX) 사슬) 및/또는 Snx10 (소팅 넥신 (Sorting Nexin) 10)의 수준이 미리 정해진 Col19a1 및/또는 Snx10 역치 수준을 초과하거나, 1개 이상의 대조 샘플에서의 Col19a1 및/또는 Snx10 수준을 초과하는 경우 치료적 유효량의 TTC를 대상에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 투여는 대상에서 (i) 근육량을 증가시키고/시키거나, (ii) 근육 강도를 증가시키고/시키거나, (iii) 회복 또는 치유 속도를 증가시키고/시키거나, (iv) 상기 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증을 감소시키는 데 효과적이다.

또한, 근육량의 손실 및/또는 근육 강도의 손실과 관련된 질병 또는 질환을 갖는 환자를 치료하는 방법이 제공되고, 본 방법은 (a) Col19a1 및/또는 Snx10의 수준 측정을 위해 환자로부터 채취한 샘플을 제출하는 단계, 및 (b) 환자로부터 채취한 샘플에서 Col19a1 및/또는 Snx10의 수준이 미리 정해진 Col19a1 및/또는 Snx10 역치 수준을 초과하거나, 1개 이상의 대조 샘플에서의 Col19a1 및/또는 Snx10 수준을 초과하는 경우 치료적 유효량의 TTC를 대상에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 투여는 대상에서 (i) 근육량을 증가시키고/시키거나, (ii) 근육 강도를 증가시키고/시키거나, (iii) 회복 또는 치유 속도를 증가시키고/시키거나, (iv) 상기 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증을 감소시키는 데 효과적이다.

추가로, 본 발명은 근육량의 손실 및/또는 근육 강도의 손실과 관련된 질병 또는 질환을 갖는 환자를 치료하는 방법을 제공하고, 본 방법은 (a) 환자로부터 채취한 샘플을 제출하여 Col19a1 및/또는 Snx10의 수준을 측정하는 단계, (b) 환자의 Col19a1 및/또는 Snx10 수준이 미리 정해진 Col19a1 및/또는 Snx10 역치 수준을 초과하는지, 또는 1개 이상의 대조 샘플에서의 Col19a1 및/또는 Snx10 수준을 초과하는지를 결정하는 단계, 및 (c) 치료적 유효량의 TTC를 대상에게 투여하도록 의료 제공자 (healthcare provider)에게 권고하는 단계를 포함하고, 상기 투여는 대상에서 (i) 근육량을 증가시키고/시키거나, (ii) 근육 강도를 증가시키고/시키거나, (iii) 회복 또는 치유 속도를 증가시키고/시키거나, (iv) 상기 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증을 감소시키는 데 효과적이다.

또한, 근육량의 손실 및/또는 근육 강도의 손실과 관련된 질병 또는 질환으로 진단받은 환자를 치료할지를 결정하는 방법이 제공되고, 본 방법은 (a) 환자로부터 얻은 샘플에서 Col19a1 및/또는 Snx10의 수준을 측정하거나, 이를 측정하기 위해 임상 검사를 지시하는 단계; 및 (b) 샘플에서 환자의 Col19a1 및/또는 Snx10 수준이 미리 정해진 Col19a1 및/또는 Snx10 역치 수준을 초과하거나, 1개 이상의 대조 샘플에서의 Col19a1 및/또는 Snx10 수준을 초과하는 경우 TTC를 투여함으로써 환자를 치료하거나, 치료하도록 의료 제공자에게 지시하는 단계를 포함하고, 상기 투여는 대상에서 (i) 근육량을 증가시키고/시키거나, (ii) 근육 강도를 증가시키고/시키거나, (iii) 회복 또는 치유 속도를 증가시키고/시키거나, (iv) 상기 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증을 감소시키는 데 효과적이다.

본 발명은 또한 TTC 치료 계획 (therapeutic regimen)으로의 치료를 위한 후보자로서 근육량의 손실 및/또는 근육 강도의 손실과 관련된 질병 또는 질환으로 진단받은 환자를 선택하는 방법을 제공하고, 본 방법은 (a) 환자로부터 얻은 샘플에서 Col19a1 및/또는 Snx10의 수준을 측정하거나, 이를 측정하기 위해 임상 검사를 지시하는 단계; 및 (b) 샘플에서 환자의 Col19a1 및/또는 Snx10 수준이 미리 정해진 Col19a1 및/또는 Snx10 역치 수준을 초과하거나, 1개 이상의 대조 샘플에서의 Col19a1 및/또는 Snx10 수준을 초과하는 경우 TTC를 투여함으로써 환자를 치료하거나, 치료하도록 의료 제공자에게 지시하는 단계를 포함하고, 상기 투여는 대상에서 (i) 근육량을 증가시키고/시키거나, (ii) 근육 강도를 증가시키고/시키거나, (iii) 회복 또는 치유 속도를 증가시키고/시키거나, (iv) 상기 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증을 감소시키는 데 효과적이다.

일부 태양에서, 환자로부터 채취한 샘플은 근육 조직을 포함한다. 일부 태양에서, 대상은 인간이다. 다른 태양에서, TTC는

(a) 서열 번호 2 또는 서열 번호 5의 서열, 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하는 폴리펩티드;

(b) 서열 번호 1 또는 서열 번호 6의 서열, 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하는 폴리뉴클레오티드; 또는,

(c) 이들의 조합을 포함한다.

다른 태양에서, TTC는

(a) TTC 폴리펩티드가 유일한 치료적 모이어티 (moiety)인 융합 단백질 또는 접합체 (conjugate);

(b) 적어도 2개의 치료적 모이어티들을 포함하고, TTC 폴리펩티드가 치료적 모이어티들 중 하나인, 융합 단백질, 또는 접합체;

(c) TTC 폴리펩티드가 유일한 치료적 모이어티인 융합 단백질을 인코딩하는 핵산;

(d) 적어도 2개의 치료적 모이어티들을 포함하고, TTC 폴리펩티드가 치료적 모이어티들 중 하나인, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산; 또는,

(e) 이들의 조합을 포함한다.

일부 태양에서, TTC는 네이키드 (naked) DNA 또는 RNA로 투여된다. 일부 태양에서, DNA 또는 RNA는 인간화된다 (humanized). 일부 태양에서, 인간화 DNA는 서열 번호 8의 서열, 또는 이의 변이체, 단편, 또는 유도체를 포함한다. 일부 태양에서, RNA는 mRNA이다. 일부 태양에서, mRNA는 서열 최적화 (sequence optimized) mRNA이다. 일부 태양에서, 서열 최적화 mRNA는 슈도우리딘 (pseudouridine) (Ψ), 5-메톡시우리딘 (5moU), 2-티오우리딘 (s2U), 4-티오우리딘 (s4U), N1-메틸슈도우리딘 (1mΨ), 5-메틸시티딘, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 태양에서, mRNA는 서열 번호 9, 서열 번호10, 또는 서열 번호 11의 서열, 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함한다.

다른 태양에서, TTC는 고정된 용량으로 투여된다. 일부 태양에서, TTC는 2회 이상의 용량으로 투여된다. 일부 태양에서, TTC는 매일, 매주, 격주, 또는 매월 투여된다. 다른 태양에서, TTC는 근육내, 복막내, 피하, 정맥내, 또는 이들의 조합으로 투여된다. 일부 태양에서, 본 명세서에 개시된 방법은 포유동물의 생체내 (in vivo)에서 실시된다. 일부 태양에서, 본 명세서에 개시된 방법은 적어도 하나의 추가적인 요법을 포함한다.

일부 태양에서, 질병 또는 질환은 근육 병변 (muscle lesion)이다. 일부 태양에서, 근육 병변은 급성 또는 만성 근육 병변이다. 일부 태양에서, 근육 병변은 기계적 병변, 열적 병변, 화학적 병변, 직업적 또는 반복된 스트레스 병변, 의원성 (iatrogenic) 병변, 운동성 (athletic) 근육 병변, 또는 이들의 조합이다.

일부 태양에서, 근육 병변은 치료적 유효량의 TTC를 병변의 부위에 직접 주사함으로써 치료된다.

도 1은 무독성 파상풍 독소 단편 C (TTC)의 발현 검출을 위한 PCR 증폭을 보여준다. 플라스미드 pCMV-TTC, (n=2, 레인 (lane) 1 및 2) 및 공 (empty) 플라스미드 pCMV (n=2, 레인 3 및 4)의 근육내 주사 10일 후, 근육으로부터 RNA를 추출하여 역전사시켰다. 얻어진 cDNA를 TTC 유전자에 대해 PCR로 증폭시켰다. 레인 5는 양성 대조군 (pCMV-TTC 플라스미드)을 나타내고 반응 블랭크 (blank)는 레인 6에서 실시되었다. 레인 M은 100 bp 크기 마커에 해당한다.
도 2는 SOD1G93A 모델 마우스 (근위축증을 특징으로 하고, 근육량의 감소, 근육 무력의 증가, 및 근육 기능의 일반적 손실을 포함하는 질병인 ALS에 대한 모델 시스템)에서 신경근 증상의 시작에서 TTC를 인코딩하는 네이키드 DNA에 의한 처리의 효과를 보여준다. 증상의 발현은 대조군 (n=10)에 비해 TTC (n=10)로 처리된 군에서 유의하게 지연되었다. 카플란-마이어 생존 분석 (Kaplan-Meier survival analysis) (SPSS 13.0)을 사용하여 누적 확률을 계산하였다.
도 3은 SOD1G93A 모델 마우스의 생존에서 TTC를 인코딩하는 네이키드 DNA에 의한 처리의 효과를 보여준다. 대조군 (n=10)에 비해 TTC (n=10)로 처리된 군에서 생존이 현저히 증가하였다. 카플란-마이어 생존 분석 (SPSS 13.0)을 사용하여 누적 확률을 계산하였다.
도 4는 TTC를 인코딩하는 네이키드 DNA에 의한 처리의 효과를 보여준다. 로타로드 (Rotarod)를 사용하여 14 rpm의 일정 속도에서 180초의 최대 수행 시간 (maximum development time)으로 운동 활동을 측정하였다. 대조군 (n=10)에 비해 TTC (n=10)로 처리된 군에서 개선된 운동 활동이 관찰된다.
도 5는 SOD1G93A 마우스에서 TTC를 인코딩하는 네이키드 DNA의 근육내 주사의 효과를 나타낸다. 각 군으로부터 10 마리의 마우스 (n=10)를 사용하여 행잉-와이어 테스트 (hanging-wire test)로 마우스의 강도 및 운동 기능을 시험하였다.
도 6은 SOD1G93A 마우스에서 TTC를 인코딩하는 네이키드 DNA의 근육내 주사의 효과를 나타낸다. 각 군으로부터 10 마리의 마우스 (n=10)를 사용하여 TTC로 처리된 유전자도입 (transgenic) 마우스의 체중 측정.
도 7은 110 일령의 유증상 (symptomatic) SOD1G93A 마우스의 척수에서 세포자멸의 신호전달 경로에 관여하는 유전자 발현의 분석을 보여준다. 대조군 (흰색) 및 TTC로 처리된 마우스 (회색)에서 Casp1, Casp3, Bax 및 Bcl2 유전자의 메신저 (messenger) RNA의 평균값의 표현. 마우스의 이전 군들을 야생형 마우스 (검은색) (군당 마우스 마리수 n=5)와 비교하였다.
도 8은 110 일령의 유증상 SOD1G93A 마우스의 척수에서 세포자멸의 신호전달 경로에 관여하는 단백질의 분석을 나타낸다. 야생형 마우스 (검은색) (군당 마우스 마리수 n=5)에 대한 TTC로 처리된 마우스 (회색 선) 및 대조군 마우스 (검은색 선)의 척수 용해물에서의 단백질 프로 (pro)-Casp3, 활성 Casp3, Bax 및 Bcl2의 웨스턴-블롯 (Western-blot) 분석.
도 9는 단백질 Akt 및 Erk1/2의 인산화의 웨스턴-블롯 분석을 보여준다. 군당 5 마리의 마우스의 샘플들을 분석하였다. IDV (강도 밀도 값 (Intensity Density Value)). 웨스턴-블롯을 사용하여 분석된 양은 야생형 마우스의 값에 대한 베타-튜불린의 비로서 나타난다. (*P<0.05, **P<0.01; 에러 바 (error bar)는 SEM을 보여준다). 바는 이전 캡션에 기재된 바와 동일한 군을 나타낸다.
도 10은 SOD1G93A 모델 마우스의 생존에서 TTC 폴리펩티드의 복막내 처리의 효과를 보여준다. 대조군 (n=3, 연속선)에 비해 TTC (n=3, 점선)로 처리된 군에서 생존이 현저히 증가하였다. 카플란-마이어 생존 분석 (SPSS 13.0)을 사용하여 누적 확률을 계산하였다.
도 11은 TTC를 주사한 마우스의 근육내 처리가 유전자도입 SOD1G93A 마우스의 척수에서 칼슘의 항상성과 관련된 유전자의 발현에 영향을 미친다는 것을 보여준다. TTC (회색) 또는 공 플라스미드 (흰색)로 처리된 유전자도입 마우스에서 유전자 Ncsl 및 Rrad에 대해 발현 수준을 측정하였다. 상기 마우스군들에서 메신저 RNA 수준의 변화를 야생형 마우스 (검은색)와 비교하였다. (*P<0.05; 에러 바는 SEM을 보여줌; 군당 마우스 마리수 n=5).
도 12는 12 주령 및 16 주령의 SOD1G93A 마우스의 뒷다리 근육에서 M 웨이브의 진폭을 보여준다. 도면의 패널은 전경골근 (tibialis anterior muscle)으로부터 기록된 M 웨이브의 대표적인 기록을 보여준다. 도 12a는 16 주령의 야생형 마우스로부터의 기록을 보여준다. 도 12b는 12 주령의 SOD1G93A 마우스로부터의 기록을 보여주고, 도 12c는 16 주령의 SOD1G93A 마우스로부터의 기록을 보여준다. 시간에 따라 진행되는 비정상성 (abnormality)인, SOD1G93A 마우스에서의 진폭의 현저한 감소, 및 자극으로부터 M 웨이브의 개시까지의 잠복시간 (latency)의 약간의 증가에 주목한다 (도 12b와 도 12c를 비교한다). 기록에서의 사각형은 높이가 10 ㎷이고 폭이 1 ms이다. 도 12d는 SOD1G93A 마우스의 전경골근 및 족저근 (plantar muscle)에서의 평균 CMAP (M 웨이브) 진폭의 히스토그램이다. 진폭은 12주에서는 대조군 (비히클 (vehicle)-플라스미드 마우스)과 TTC-처리된 마우스 (SOD-TTC)에서 유사하였지만, 16주에서는 처리된 마우스에서보다 대조군에서 더 현저하게 감소하였다. 신경생리학적 결과가 표 3에 나타나있다.
도 13은 SOD1G93A 마우스에서의 운동 뉴런 생존을 보여준다. 도 13a는 크레실 바이올렛 (cresyl violet)으로 염색된 야생형 및 SOD1G93A 마우스로부터의 MN의 현미경 사진을 보여준다. SOD1G93A MN에서 Nissl 물질의 액포화 (vacuolization) 및 분해 (disintegration)에 주목한다. 바 = 40 μm. 도 13b는 16 주령의 야생형, 대조군 SOD1G93A 및 SOD1G93A-TTC (SOD-TTC) 처리된 마우스로부터의 크레실 바이올렛으로 염색된 허리 척수의 횡단면을 보여주는 대표적인 현미경 사진을 보여준다. 바 = 500 μm. 도 13c는 각 전각 (ventral horn)의 측주 (lateral column) 내 염색된 (크레실 바이올렛) MN의 수를 카운팅하여 평가된 운동 뉴런 생존을 보여준다. 결과는 야생형, 대조군 SOD1G93A (비히클-플라스미드 마우스) 및 TTC-처리된 SOD1G93A 마우스 (SOD-TTC) (군당 n=5)의 L2, L3 및 L4 척수 분절에서의 전각에서 카운팅된 MN의 평균 수를 보여준다. *P < 0.05 vs. 야생형; #P <0.05 vs. 대조군 SOD1.
도 14는 SOD1G93A 마우스에서 교세포 반응성 (glial reactivity)의 분석을 나타낸다. 도 14a는 성상세포 (GFAP) 및 소교세포 (Iba1)에 대한 마커로 면역표지된 야생형, SOD1G93A 및 SOD1G93A-TTC (SOD-TTC) 처리된 마우스로부터의 척수 전각의 대표적인 현미경 사진을 보여준다. 바 = 100 μm. 도 14b는 3개의 마우스군에서 GFAP 및 Iba1 면역반응성 (IR)의 정량화를 나타내는 히스토그램을 보여준다. *P < 0.05 vs. 야생형; #P < 0.05 vs. 대조군 SOD1.
도 15는 파상풍 독소 전구 단백질의 도메인 구조의 개략적 표현을 나타낸 것으로, 중쇄 및 경쇄의 위치 및 그들 각각의 기능적 역할을 보여준다. 또한, 파상풍 독소 중쇄의 C-말단 영역 내 서열 번호 2 (TTC 폴리펩티드) 및 서열 번호 5 (TTC 폴리펩티드 단편)의 상대적 위치가 나타나 있다.
도 16은 경련 자극 (twitch stimulus) 기록 (좌측 패널) 및 강직 자극 (tetanic stimulus) 기록 (우측 패널)에 상응하는 등척성 (isometric) 근육 긴장도 기록 추적을 나타낸다.
도 17은 대조군 (매주 pcDNA3.1Empty 및 매주 TBS) 및 TTC 처리 (단회 용량 pcDNA3.1 TCC, 매주 용량 pcDNA3.1TTC, 및 매주 TTC 단백질 10 마이크로그램) 후의 SOD1G93A 마우스에서 120일에 기록된 경련 자극에 의해 유도된 TA (도 17의 A) 및 EDL (도 17의 B)에서의 근력의 정량 분석을 나타낸다. 에러 바는 SEM을 나타내고; 군당 마우스 마리수 n = 7 내지 8이고, 각 대상으로부터 2개의 근육이 기록되었다. *p < 0.05; **p = < 0.005.
도 18은 대조군 (매주 pcDNA3.1Empty 및 매주 TBS) 및 TTC 처리 (단회 용량 pcDNA3.1 TCC, 매주 용량 pcDNA3.1TTC, 및 매주 TTC 단백질 10 마이크로그램) 후의 SOD1G93A 마우스에서 120일에 기록된 강직 자극에 의해 유도된 TA (도 18의 A) 및 EDL (도 18의 B)에서의 근력의 정량 분석을 나타낸다. 에러 바는 SEM을 나타내고; 군당 마우스 마리수 n = 7 내지 8이고, 각 대상으로부터 2개의 근육이 기록되었다. *p < 0.05; **p = < 0.005.
도 19는 대조군 (매주 pcDNA3.1Empty 및 매주 TBS) 및 TTC 처리 (단회 용량 pcDNA3.1 TCC, 매주 용량 pcDNA3.1TTC, 및 매주 TTC 단백질 10 마이크로그램) 후의 SOD1G93A 마우스에서 120일에 기록된 경련 자극에 의해 유도된 TA (도 19의 A) 및 EDL (도 19의 B)에서의 근수축의 정량 분석을 나타낸다. 에러 바는 SEM을 나타내고; 군당 마우스 마리수 n = 7 내지 8이고, 각 대상으로부터 2개의 근육이 기록되었다. *p < 0.05; **p = < 0.005.
도 20은 대조군 (매주 pcDNA3.1Empty 및 매주 TBS) 및 TTC 처리 (단회 용량 pcDNA3.1 TCC, 매주 용량 pcDNA3.1TTC, 및 매주 TTC 단백질 10 마이크로그램) 후의 SOD1G93A 마우스에서 120일에 기록된 경련 자극에 의해 유도된 TA (도 20의 A) 및 EDL (도 20의 B)에서의 근이완의 정량 분석을 나타낸다. 에러 바는 SEM을 나타내고; 군당 마우스 마리수 n = 7 내지 8이고, 각 대상으로부터 2개의 근육이 기록되었다. *p < 0.05; **p = < 0.005.
도 21은 대조군 (매주 pcDNA3.1Empty 및 매주 TBS) 및 TTC 처리 (단회 용량 pcDNA3.1 TCC, 매주 용량 pcDNA3.1TTC, 및 매주 TTC 단백질 10 마이크로그램) 후의 SOD1G93A 마우스에서 120일에 기록된 강직 자극에 의해 유도된 TA (도 21의 A) 및 EDL (도 21의 B)에서의 정규화된 강직 힘(tetanic force):질량 비의 정량 분석을 나타낸다. 에러 바는 SEM을 나타내고; 군당 마우스 마리수 n = 7 내지 8이고, 각 대상으로부터 2개의 근육이 기록되었다. *p < 0.05; **p = < 0.005.
도 22는 대조군 (매주 pcDNA3.1Empty 및 매주 TBS) 및 TTC 처리 (단회 용량 pcDNA3.1 TCC, 매주 용량 pcDNA3.1TTC, 및 매주 TTC 단백질 10 마이크로그램) 후의 SOD1G93A 마우스에서 120일의 TA (도 22의 A) 및 EDL (도 22의 B)에서의 근육 질량 비의 정량 분석을 나타낸다. 에러 바는 SEM을 나타내고; 군당 마우스 마리수 n = 7 내지 8이고, 각 대상으로부터 2개의 근육이 기록되었다. *p < 0.05; **p = < 0.005.
도 23은 TTC 단백질 처리 후 근육-특이적 효과를 보여주는 고배율 현미경 이미지를 나타낸다. 비히클 (좌측) 및 TTC (우측)로 처리된 마우스로부터 표재성 하퇴 삼두근 (superficial triceps surae muscle)이 보여진다. 파선 사각형은 하부 패널에서 더 고배율로 표시된 관심 영역의 위치를 나타낸다. 축척 막대: 100 μm.
도 24는 EDL 근육에서 80 일령의 SOD1G93A 마우스의 유전자 바이오마커 평가를 나타낸다. 그래프는 야생형에 대해 유전자도입 SOD1G93A 마우스의 EDL 근육에서 일수 80에 테스트된 선택된 유전자의 전사 수준에서의 배수 변화를 보여준다. 에러 바는 SEM을 나타내고; *p < 0.05; **p = < 0.01. wt: 야생형 마우스, tg: 비-처리된 SOD1G93A 마우스, ttc: 일수 60 및 75에서 10 ㎍/주사의 2회 i.p. 투여로 처리된 SOD1G93A 마우스.
도 25는 가자미근 (SOLEUS muscle)에서 80 일령의 SOD1G93A 마우스의 유전자 바이오마커 평가를 나타낸다. 그래프는 야생형에 대해 유전자도입 SOD1G93A 마우스의 가자미근에서 일수 80에 테스트된 선택된 유전자의 전사 수준에서의 배수 변화를 보여준다. 에러 바는 SEM을 나타내고; *p < 0.05; **p = < 0.01. wt: 야생형 마우스, tg: 비-처리된 SOD1G93A 마우스, ttc: 일수 60 및 75에서 10 ㎍/주사의 2회 i.p. 투여로 처리된 SOD1G93A 마우스.
도 26은 손상 후 15일에 경련 힘 (twitch force) (패널 A) 및 강직 힘 (패널 B)에 대한 TTC-단백질의 근육내 주사의 효과를 보여준다. 대조군: 비손상.
도 27은 TTC-처리된 군, PBS-처리된 군 및 비손상 (대조)군에서 TA 근육의 힘-진동수 곡선을 보여준다 (15일). 데이터는 평균±SEM으로 표현하였다.
도 28은 손상 후 30일에 경련 힘 (패널 A) 및 강직 힘 (패널 B)에 대한 TTC-단백질의 근육내 주사의 효과를 보여준다.
도 29는 TTC-처리된 군 또는 PBS-처리된 군에서 TA 근육의 힘-진동수 곡선을 보여준다 (30일). 데이터는 평균±SEM으로 표현하였다.
도 30은 손상 후 15일에 경련 힘 (패널 A) 및 강직 힘 (패널 B)에 대한 TTC-플라스미드의 근육내 주사의 효과를 보여준다. 대조군: 비손상.
도 31은 TTC-처리된 군, 공-플라스미드(empty-plasmid)-처리된 군 및 비손상 (대조)군에서 TA 근육의 힘-진동수 곡선을 보여준다 (15일). 데이터는 평균±SEM으로 표현하였다.
도 32는 손상 후 30일에 경련 힘 (패널 A) 및 강직 힘 (패널 B)에 대한 TTC-플라스미드의 근육내 주사의 효과를 보여준다.
도 33은 TTC-플라스미드-처리된 군 또는 공-플라스미드-처리된 군에서 TA 근육의 힘-진동수 곡선을 보여준다 (30일). 데이터는 평균±SEM으로 표현하였다.
도 34는 C2C12 근아세포 (myoblast cell) 증식 (48시간, n = 8)에서 TTC (1 내지 100 nM)의 용량-반응 효과를 보여준다. BrdU 세포 증식 ELISA 키트를 사용하여 유사분열촉진 능력 (mitogenic capacity)을 평가하였다. Co: DMEM 중에서 48시간 동안 유지된 세포. 대조군: GM [DMEM+10% FBS (v/v); 48시간] 중의 세포. 데이터는 평균±SE로 표현하였으며, * P <0.05 vs. 대조군 값.
도 35는 7일 동안 C2C12 세포 (n=3)를 분화시킬 때 미오게닌 (myogenin)의 단백질 발현에 대한 TTC (1 내지 100 nM)의 용량-반응 효과를 보여준다. 미오게닌의 수준은 GM 중에서의 각 발현 (대조군)의 배수로서 표시하였다. 데이터는 독립된 실험들의 세기 스캔으로부터 얻은 평균±SE로 표현하였다. *P<0.05 vs. DM 값.
도 36은 7일 동안 C2C12 세포 (n=3)를 분화시킬 때 MHC의 단백질 발현에 대한 TTC (1 내지 100 nM)의 용량-반응 효과를 보여준다. MHC의 수준은 GM 중에서의 각 발현 (대조군)의 배수로서 표시하였다. 데이터는 독립된 실험들의 세기 스캔으로부터 얻은 평균±SE로 표현하였다. *P<0.05 vs. DM 값.
도 37은 7일 동안 C2C12 세포를 분화시킬 때 TTC (1 내지 100 nM)의 용량-반응 효과를 보여준다. 자극 후 7일 시점에서 DM (대조군) 또는 DM +TTC 하에서 C2C12 근관 (myotube) 세포에서의 MHC 및 DAPI의 면역형광 검출. 상부 패널, 대물렌즈 배율 10x. 하부 패널, 대표 영역의 확대.
도 38은 자극 후 7일 시점에서 근관 면적 (μm²)에 대한 TTC (1 내지 100 nM)의 용량-반응 효과를 보여준다 (*, P<0.05).
도 39는 자극 후 7일 시점에서 근관 지름 (μm)에 대한 TTC (1 내지 100 nM)의 용량-반응 효과를 보여준다 (*, P<0.05).
도 40은 자극 후 7일 시점에서 융합 지수 (fusion index)에 대한 TTC (1 내지 100 nM)의 용량-반응 효과를 보여준다 (*, P<0.05).
도 41은 자극 후 7일 시점에서 MHC⁺ 세포당 근핵의 수에 대한 TTC (1 내지 100 nM)의 용량-반응 효과를 보여준다 (*, P<0.05).
도 42는 자극 후 7일 시점에서 근관 배향 (orientation)에 대한 TTC (1 내지 100 nM)의 용량-반응 효과를 보여준다 (*, P<0.05).
도 43은 근관의 응집된 배향 (패널 A) 또는 정렬된 배향 (패널 B)을 나타내는 면역형광 이미지를 보여주고, 자극 후 7일 시점에서 C2C12 근관에서의 핵 분포에 대한 TTC (1 내지 100 nM)의 용량-반응 효과를 보여준다 (*, P<0.05) (패널 C).

파상풍 독소는 강한 신경독소이다. 구조적으로, 파상풍 독소 (150 kDa)는 2개의 폴리펩티드 사슬, 중쇄 (100 kDa) 및 경쇄 (50 kDa)로 구성된다. 1개의 이황화물 다리 (disulfide bridge)가 이러한 2개의 폴리펩티드들을 연결한다. 중쇄는 독소의 결합 및 전좌 도메인을 함유하며, 한편 경쇄는 시냅토브레빈 (synaptobrevin)을 절단하는 프로테아제이다. 독소는 먼저 말초 신경 말단 상의 강글리오시드 (ganglioside)에 결합하고 수용체-매개 엔도사이토시스 (endocytosis)를 통해 내재화된다. 이어서, 독소는 축삭원형질 수송 (axoplasmic transport)에 의해 전각으로 이동한다. 이것은 거기로부터 뉴런간 공간 (interneuronal space)으로 방출되고, 이어서 운동 뉴런의 체세포에 인접한 억제성 중간뉴런에 의해 섭취된다.

중요한 단편인 파상풍 독소 C-단편은 독소가 파파인 (papain)에 의해 효소적으로 절단될 때 생성된다. 이러한 C-단편 (50 kDa)은 파상풍 독소 중쇄의 C-말단에서의 451개 아미노산에 상응한다. C-단편은 전체 독소의 결합, 내재화 및 트랜스-시냅스 (trans-synaptic) 수송 능력을 유지하기 때문에 유용하다. 그러나 이것은 어떠한 뉴런성 프로세스도 방해하지 않으므로 무독성이다. 파상풍 독소 중쇄의 무독성 카르복시-말단 도메인 (당업계에 TTC로 공지됨)은 신경을 통해 역행으로 수송되는 융합 단백질의 생성을 통해 치료제에 대한 담체로서 치료적으로 사용되어 왔다. 예컨대, 문헌[Ciriza et al. Cent. Eur. J. Biol. 3: 105-112 (2008a)]; 문헌[Ciriza et al. Restorative Neurology and Neuroscience 26: 459-65 (2008b)]; 문헌[Francis et al. Brain Res. 1011:7-13 (2004)]; 미국 특허 제7923216호, 제7972608호, 제8703733호, 및 제7435792호; 또는 국제특허 출원 공개 WO2005000346호, WO2011143557호, 및 WO1999009057호를 참조하고; 이들 모두는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 더욱이, 최근에 TTC는 이것의 신경보호 능력으로 인해 ALS를 치료하기 위한 치료제로 제안되었다. 국제특허 출원 공개 WO/2009/043963호 및 미국 특허 제8945586호를 참조하고, 이들은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

본 발명은 TTC (즉, TTC 폴리펩티드, 그러한 TTC 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합)의 투여가 근육에 직접적으로 영향을 준다는 것, 즉 (i) 대상에서 근육량을 증가시킨다는 것, 및/또는 (ii) 대상에서 근육 강도를 증가시킨다는 것, 및/또는 (iii) 회복 또는 치유 속도를 증가시킨다는 것, 및/또는 (iv) 상기 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증을 감소시킨다는 것을 보여주는 증거를 제공한다. 본 명세서에 개시된 방법은 또한 근육량의 손실을 치료하거나, 예방하거나, 감소시키거나, 개선할 수 있거나; 근육량의 손실 속도를 감소시킬 수 있거나; 근육량의 손실과 관련된 증상을 치료하거나, 예방하거나, 감소시키거나, 개선할 수 있거나; 근육 강도의 손실을 치료하거나, 예방하거나, 감소시키거나, 개선할 수 있거나; 근육 강도의 손실과 관련된 증상을 치료하거나, 예방하거나, 감소시키거나, 개선할 수 있거나; 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증을 치료하거나, 예방하거나, 감소시키거나, 개선할 수 있거나; 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증과 관련된 증상을 치료하거나, 예방하거나, 감소시키거나, 개선할 수 있다.

따라서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상에서 (i) 대상에서 근육량을 증가시키고/시키거나, (ii) 대상에서 근육 강도를 증가시키고/시키거나, (iii) 회복 또는 치유 속도를 증가시키고/시키거나, (iv) 상기 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증을 감소시키기 위한 방법을 제공하며, 본 방법은 TTC의 투여를 포함한다.

본 발명은 또한 근육량의 손실 및/또는 근육 강도의 손실을 예방하거나 감소시키기 위한 방법을 제공한다. 추가적으로, 본 발명은 필요로 하는 대상에서 TTC (즉, TTC 폴리펩티드, 그러한 TTC 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합)를 대상에게 투여함으로써 근육량 및/또는 근육 강도의 손실이 일어나는 질병 (예컨대, 신경근 질병, HIV) 또는 질환 (예컨대, 노화, 예를 들어 수술 후의 상처 치료, 골절 후 부동화, 근육 병변 등)의 증상을 치료하기 위한, 또는 근육량 및/또는 근육 강도의 손실을 예방하거나 감소시키기 위한 방법을 제공한다. TTC의 투여는 근육량 및/또는 근육 강도를 증가시키는 것, 근육량 및/또는 근육 강도의 손실을 예방하는 것, 회복 또는 치유 속도를 증가시키는 것, 상기 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증을 감소시키는 것, 및 이들의 조합과 관련된 치료적 용도 및/또는 미용 용도를 위한 것일 수 있다. 일반적으로, 본 명세서에 개시된 방법은 (예컨대, 노화 또는 무중력 상태 (weightlessness)로 인한 근육량의 감소에 대응하기 위해, 정상적인 건강한 대상에서 운동 능력을 개선하기 위해, 또는 비인간 동물에서 근육량을 증가시키기 위해) 근육량 또는 근육 강도의 증가가 바람직한 경우라면 언제든지 적용될 수 있다.

본 발명은 또한 근육에 대한 TTC의 효과 (예컨대, 근육량 및/또는 근육 강도에 대한 효과)를 모니터링하기 위한 방법을 제공하며, 본 방법은 처리된 대상으로부터 채취된 샘플에서 적어도 1개의 바이오마커 (예컨대, Col19a1, Snx10, Calm1, Mef2c, 또는 Col1A1)의 수준을 결정하는 단계를 포함한다. 특히, 미리 정해진 역치 수준 위 또는 아래의 바이오마커 수준의 존재는, 예컨대, (i) 근육량 및/또는 근육 강도의 손실이 일어나는 질병 또는 질환을 앓고 있는 환자가 TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합)에 의한 특이적 처리에 적합한지 적합하지 않은지를 결정하기 위해, (ii) 근육량 및/또는 근육 강도의 손실이 일어나는 질병 또는 질환의 TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합)에 의한 특이적 처리가 시작되어야 하는지, 중단되어야 하는지, 또는 변경되어야 하는지를 결정하기 위해, (iii) 근육량 및/또는 근육 강도의 손실이 일어나는 질병 또는 질환이 특이적 TTC 조성물 (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합)로 처리될 수 있는지 또는 처리될 수 없는지를 진단하기 위해, (iv) 근육량 및/또는 근육 강도의 손실이 일어나는 질병 또는 질환의 특이적 TTC 조성물 (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합)의 처리의 결과를 예상하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명이 더 용이하게 이해될 수 있기 위해, 소정 용어들이 먼저 정의된다. 추가적인 정의는 상세한 설명을 통해 제시된다.

I. 정의

본 명세서 및 첨부된 청구범위에서, 단수형 ("a", "an" 및 "the")은 그 문맥에 달리 명확히 나타나 있지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 용어 "하나의" ("a" (또는 "an"))뿐만 아니라 용어 "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본 명세서에서 상호교환 가능하게 사용될 수 있다.

더욱이, 본 명세서에 사용되는 경우 "및/또는"은 2개의 명시된 특징 또는 구성요소의 각각에 대해, 다른 하나와 함께 또는 다른 하나 없이, 이들 각각의 구체적인 개시로서 받아들여져야 한다. 따라서, 본 명세서에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에서 사용되는 바와 같이 용어 "및/또는"은 "A 및 B," "A 또는 B," "A" (단독), 및 "B" (단독)을 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 어구에서 사용되는 바와 같이 용어 "및/또는"은 다음 태양들 각각을 포함하는 것으로 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).

태양이 "포함하는"이라는 표현과 함께 본 명세서에 기재되어 있는 곳은 어디든지, "~로 이루어진" 및/또는 "~로 본질적으로 이루어진"이라는 용어로 기재된 달리 유사한 태양이 또한 제공된다.

본 명세서 및 청구범위에 걸쳐 수치와 관련되어 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 당업자에게 익숙하고 허용가능한, 정확도의 간격을 나타낸다. 일반적으로, 그러한 정확도의 간격은 ± 15%이다.

달리 정의되지 않는다면, 본 명세서에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 관련된 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌[the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press]; 문헌[The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press]; 및 문헌[the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]은 당업자에게 본 개시내용에 사용된 용어들 중 다수에 대한 일반적인 사전을 제공한다.

단위, 접두사, 및 기호는 그들의 국제단위체계 (SI) 허용 형태로 기재된다. 수치 범위는 그 범위를 한정하는 숫자를 포함한다. 달리 표시되지 않는다면, 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기재된다. 본 명세서에 제공된 표제는 다양한 태양 또는 본 발명의 태양을 제한하지 않으며, 이러한 태양은 전체로서의 본 명세서를 참조함으로써 확인될 수 있다. 따라서, 바로 아래에서 정의된 용어는 전체적으로의 본 명세서를 참조함으로써 더 완전히 정의된다.

용어 "폴리펩티드", "펩티드", 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호교환 가능하게 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 이는 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 이에는 비-아미노산이 개재될 수 있다. 또한, 이 용어는 천연적으로, 또는 개입에 의해, 예를 들어, 이황화물 결합 형성, 당화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지 성분 (예컨대, 염료), 치료제 (예컨대, 신경근 질병을 치료하기 위한 작용제), 또는 미용제와의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 예를 들어, 아미노산의 하나 이상의 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 등을 포함함)뿐만 아니라 당업계에 알려진 다른 변형체를 함유하는 폴리펩티드가 이 정의 내에 또한 포함된다.

"재조합" 폴리펩티드 또는 단백질은 재조합 DNA 기술에 의해 생성된 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 조작된 숙주 세포 내에서 발현된 재조합으로 생성된 폴리펩티드 및 단백질은 본 발명의 목적상 단리된 것으로 여겨지며, 이는 천연 또는 재조합 폴리펩티드가 임의의 적합한 기법에 의해 분리되거나, 분획화되거나, 또는 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 것인 바와 같다. 본 명세서에 개시된 폴리펩티드는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 재조합으로 생성될 수 있다. 대안적으로, 본 명세서에 개시된 단백질 및 펩티드는 화학적으로 합성될 수 있다.

본 명세서에 상호교환 가능하게 사용되는 바와 같이, "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 그들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 중합체 내로 포함될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 앞서의 설명은 RNA 및 DNA를 비롯한 본 명세서에 언급된 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.

단백질 서열, 펩티드 서열, 폴리펩티드 서열, 또는 아미노산 서열을 지칭하는 데 사용되는 바와 같이, 용어 "서열"은 폴리펩티드에서 아미노-말단에서 카르복실-말단 방향으로 아미노산 구성성분의 선형 표현을 의미하고, 이러한 표현에서 서로 이웃하는 잔기들은 폴리펩티드의 일차 구조에서 인접해 있다.

본 명세서에 개시된 "단리된" 폴리펩티드, 단백질, 봉입체, 또는 다른 조성물은 천연에서 발견되지 않는 형태의 본 명세서에 개시된 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 플라스미드, 또는 다른 조성물이다. 본 명세서에 개시된 단리된 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 플라스미드, 또는 다른 조성물은 더 이상 천연에서 발견되는 형태가 아닌 정도로 정제된 것을 포함한다. 일부 태양에서, 본 명세서에 개시된 단리된 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 플라스미드, 다른 조성물은 실질적으로 순수하다.

폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭할 때, 용어 "단편"은 참조 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 특성들 중 적어도 일부를 유지하는 임의의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, TTC의 경우, 용어 단편은, 예를 들어, 참조 폴리펩티드의 바람직한 특성, 특히 근육량 및/또는 근육 강도의 증가를 필요로 하는 대상에게 투여되었을 때 근육량 및/또는 근육 강도의 증가를 야기하는 폴리펩티드의 능력을 적어도 어느 정도로 유지하는 임의의 폴리펩티드를 말할 것이다. 폴리뉴클레오티드의 경우, 용어 단편은 근육량 및/또는 근육 강도의 증가를 야기하는 능력을 유지하는 TTC 폴리펩티드를 인코딩하는 임의의 폴리뉴클레오티드를 말할 것이다. 폴리펩티드의 단편은 (파상풍 독소의 효소적 또는 화학적 단백질 분해로부터 생성된) 무독성 단백질 분해성 단편, (예를 들어, TTC 단편을 인코딩하는 단편 폴리뉴클레오티드의 발현으로부터 생성된) 결실 발현 단편, 및 (예를 들어, 고체상 펩티드 합성을 통한) 화학적으로 합성된 단편을 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "변이체"는 적어도 1개의 변형, 예컨대, 뉴클레오티드 변형 또는 아미노산 변형에 의해 모 서열 (parent sequence)의 것과 다른 TTC 서열을 말한다. 변이체는 천연적으로 발생할 수 있거나 비천연적으로 발생할 수 있다. 비천연적으로 발생한 변이체는 당업계에 공지된 돌연변이생성 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 변이체 폴리펩티드는 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환, 결실, 또는 부가를 포함할 수 있다.

고유의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에서 발견되지 않는 추가적인 특징을 나타내도록 변경된 TTC 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 "유도체". 20개의 표준 아미노산들의 1개 이상의 천연적으로 발생한 아미노산 유도체를 함유하는 폴리펩티드가 또한 "유도체"로서 포함된다. 지정된 폴리펩티드"로부터 유도된" 폴리펩티드 또는 아미노산 서열은 폴리펩티드의 기원을 말한다.

다른 펩티드로부터 유도된 폴리펩티드는 개시 폴리펩티드에 대해 1개 이상의 돌연변이, 예컨대, 다른 아미노산 잔기로 치환된 1개 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있거나, 또는 이는 1개 이상의 아미노산 잔기의 삽입 또는 결실을 갖는다. 일부 태양에서, 폴리펩티드는 천연적으로 발생하지 않는 아미노산 서열을 포함한다. 그러한 변이체는 반드시 개시 폴리펩티드와 100% 미만의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는다. 일부 태양에서, 변이체는, 예컨대, 변이체 분자의 길이에 걸쳐, 개시 폴리펩티드의 아미노산 서열과 약 75% 내지 100% 미만, 더 바람직하게는 약 80% 내지 100% 미만, 더 바람직하게는 약 85% 내지 100% 미만, 더 바람직하게는 약 90% 내지 100% 미만 (예컨대, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 및 가장 바람직하게는 약 95% 내지 100% 미만의 아미노산 서열 동일성 또는 유사성의 아미노산 서열을 가질 것이다. 일 태양에서, 개시 폴리펩티드 서열과 이로부터 유도된 서열 사이에 1개의 아미노산 차이가 있다. 본 명세서에서 이러한 서열에 대한 동일성 또는 유사성은 개시 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기 (즉, 동일한 잔기)의 백분율로서 정의되는데, 이때 이는 서열을 정렬하고, 필요하다면 갭을 도입하여 최대 서열 동일성 백분율을 달성한 후에 행해진다.

유사하게, 다른 폴리뉴클레오티드로부터 유도된 폴리뉴클레오티드 (예컨대, 야생형 TTC 폴리뉴클레오티드의 서열로부터 유도된 인간화 TTC 폴리뉴클레오티드 또는 TTC를 인코딩하는 야생형 또는 인간화 RNA 서열로부터 유도된 최적화 mRNA)는 개시 폴리뉴클레오티드에 대해 1개 이상의 돌연변이, 예컨대, 다른 뉴클레오티드 또는 코돈으로 치환된 1개 이상의 뉴클레오티드 또는 코돈을 가질 수 있거나, 또는 이는 1개 이상의 뉴클레오티드 또는 코돈의 삽입 또는 결실을 갖는다. 일부 태양에서, 폴리뉴클레오티드는 천연적으로 발생하지 않는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 그러한 변이체는 반드시 개시 폴리뉴클레오티드와 100% 미만의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는다. 일부 태양에서, 변이체는 변이체 분자의 길이에 걸쳐, 개시 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열과 약 40% 내지 100% 미만의 뉴클레오티드 서열 동일성 또는 유사성의 뉴클레오티드 서열을 가질 것이다. 일부 태양에서, 변이체는 변이체 분자의 길이에 걸쳐 개시 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열과 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 뉴클레오티드 서열 동일성 또는 유사성을 갖는다. 일 태양에서, 개시 폴리뉴클레오티드 서열과 이로부터 유도된 서열 사이에 1개의 뉴클레오티드 차이가 있다. 본 명세서에서 이러한 서열에 대한 동일성 또는 유사성은 개시 뉴클레오티드와 동일한 후보 서열의 뉴클레오티드 (즉, 동일한 뉴클레오티드)의 백분율로서 정의되는데, 이때 이는 서열을 정렬하고, 필요하다면 갭을 도입하여 최대 서열 동일성 백분율을 달성한 후에 행해진다.

"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에서 정의되어 있고, 이는 염기성 측쇄 (예컨대, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예컨대, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄 (예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄 (예컨대, 트레오닌, 발린, 아이소류신) 및 방향족 측쇄 (예컨대, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함한다. 따라서, 폴리펩티드에서의 아미노산이 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산으로 대체되는 경우, 치환은 보존적인 것으로 간주된다. 다른 태양에서는, 아미노산의 열 (string)이 측쇄 패밀리 구성원들의 순서 및/또는 조성이 다른 구조적으로 유사한 열로 보존적으로 대체될 수 있다.

비보존적 치환은 (i) 전기양성적 측쇄를 갖는 잔기 (예컨대, Arg, His 또는 Lys)가 전기음성적 잔기 (예컨대, Glu 또는 Asp)를 대신하거나 이로 치환된 것, (ii) 친수성 잔기 (예컨대, Ser 또는 Thr)가 소수성 잔기 (예컨대, Ala, Leu, Ile, Phe 또는 Val)를 대신하거나 이로 치환된 것, (iii) 시스테인 또는 프롤린이 임의의 다른 잔기를 대신하거나, 이로 치환된 것, 또는 (iv) 부피가 큰 소수성 또는 방향족 측쇄를 갖는 잔기 (예컨대, Val, His, Ile 또는 Trp)가 더 작은 측쇄를 갖는 것 (예컨대, Ala, Ser) 또는 측쇄를 갖지 않는 것 (예컨대, Gly)을 대신하거나 이로 치환된 것을 포함한다.

다른 치환이 통상의 기술을 갖는 작업자에 의해 용이하게 확인될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 알라닌의 경우, D-알라닌, 글리신, 베타-알라닌, L-시스테인 및 D-시스테인 중 어느 하나로부터 치환이 선택될 수 있다. 리신의 경우, 대체는 D-리신, 아르기닌, D-아르기닌, 호모-아르기닌, 메티오닌, D-메티오닌, 오르니틴, 또는 D-오르니틴 중 어느 하나일 수 있다. 일반적으로, 단리된 폴리펩티드의 특성에서 변화를 유도할 것으로 예상될 수 있는 기능적으로 중요한 영역에서의 치환은 (i) 극성 잔기, 예컨대, 세린 또는 트레오닌이 소수성 잔기, 예컨대, 류신, 아이소류신, 페닐알라닌, 또는 알라닌을 대신한 (또는 이로 치환된) 것; (ii) 시스테인 잔기가 임의의 다른 잔기를 대신한 (또는 이로 치환된) 것; (iii) 전기양성적 측쇄를 갖는 잔기, 예컨대, 리신, 아르기닌 또는 히스티딘이 전기음성적 측쇄를 갖는 잔기, 예컨대, 글루탐산 또는 아스파르트산을 대신한 (또는 이로 치환된) 것; 또는 (iv) 부피가 큰 측쇄를 갖는 잔기, 예컨대, 페닐알라닌이 그러한 측쇄를 갖지 않는 것, 예컨대, 글리신을 대신한 (또는 이로 치환된) 것이다. 전술한 비보존적 치환들 중 하나가 단백질의 기능적 특성을 변경할 수 있는 가능성은 또한 단백질의 기능적으로 중요한 영역에 대해 치환의 위치와 상관된다: 따라서, 일부 비보존적 치환은 생물학적 특성에 거의 또는 전혀 영향이 없을 수 있다.

2개의 폴리펩티드들 또는 폴리뉴클레오티드 서열들 사이에서의 "서열 동일성 백분율"이라는 용어는, 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입되어야 할 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 고려하여, 비교창 (comparison window)에 걸쳐 서열들이 공유하는 동일한 매칭된 위치의 수를 말한다. 매칭된 위치는 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산이 표적 서열 및 참조 서열 둘 다에 제시되어 있는 임의의 위치이다. 표적 서열에 제시되어 있는 갭은 카운팅되지 않는데, 갭은 뉴클레오티드 또는 아미노산이 아니기 때문이다. 마찬가지로, 참조 서열에 제시되어 있는 갭도 카운팅되지 않는데, 참조 서열로부터의 뉴클레오티드 또는 아미노산이 아니라, 표적 서열 뉴클레오티드 또는 아미노산이 세어지기 때문이다.

서열 동일성의 백분율은, 동일한 아미노산 잔기 또는 핵산 염기가 양쪽 서열에 존재하는 위치들의 수를 결정하여, 매칭된 위치들의 수를 산출하고, 매칭된 위치들의 수를 비교창에서의 총 위치 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다. 2개의 서열 사이의 서열의 비교 및 서열 동일성 백분율의 결정은 용이하게 입수가능한 온라인용 및 다운로드용 둘 다의 소프트웨어를 사용하여 성취될 수 있다. 적합한 소프트웨어 프로그램은 다양한 소스로부터 입수가능하고, 단백질 및 뉴클레오티드 서열 둘 다의 정렬에 이용가능하다. 서열 동일성 백분율을 결정하기에 적합한 하나의 프로그램은 미국 정부의 미국 국립생물공학정보센터 (National Center for Biotechnology Information) BLAST 웹사이트 (blast.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 입수가능한 프로그램의 BLAST 제품군 (suite)의 일부인 bl2seq이다. Bl2seq는 BLASTN 또는 BLASTP 알고리즘을 이용하여 2개의 서열 사이의 비교를 수행한다. BLASTN은 핵산 서열을 비교하는 데 사용되고, 한편 BLASTP는 아미노산 서열을 비교하는 데 사용된다. 다른 적합한 프로그램은, 예컨대, 생물정보학 프로그램의 EMBOSS 제품군의 일부인 Needle, Stretcher, Water, 또는 Matcher이고, 이는 www.ebi.ac.uk/Tools/psa에서 유럽 생물정보학연구소 (European Bioinformatics Institute) (EBI)로부터 또한 입수가능하다.

폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 참조 서열과 정렬된 단일 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 표적 서열 내의 상이한 영역들 각각은 그들 자체의 서열 동일성 백분율을 가질 수 있다. 서열 동일성 백분율 값은 소수점 첫째 자리로 반올림된다는 것에 유의한다. 예를 들어, 80.11, 80.12, 80.13, 및 80.14는 반올림하여 80.1이 되고, 한편 80.15, 80.16, 80.17, 80.18, 및 80.19는 반올림하여 80.2가 된다. 또한, 길이 값은 항상 정수일 것이라는 것에 유의한다.

소정 태양에서, 제2 아미노산 서열에 대한 제1 아미노산 서열의 동일성 백분율 "X"는 100 x (Y/Z)로서 계산되는데, 여기서 Y는 (육안 검사 또는 특정 서열 정렬 프로그램에 의해 정렬된) 제1 서열 및 제2 서열의 정렬에서 동일한 매칭으로 스코어링된 아미노산 잔기의 수이고, Z는 제2 서열에서 잔기의 총수이다. 제1 서열의 길이가 제2 서열보다 긴 경우, 제2 서열에 대한 제1 서열의 동일성 백분율은 제1 서열에 대한 제2 서열의 동일성 백분율보다 높을 것이다.

당업자는 서열 동일성 백분율의 계산을 위하여 서열 정렬의 생성은 일차 서열 데이터에 의해 배타적으로 수행되는 이원성 서열-서열 비교에 제한되지 않음을 인지할 것이다. 서열 정렬은 다중 서열 정렬로부터 도출될 수 있다. 다중 서열 정렬을 생성하기 위한 하나의 적합한 프로그램은 www.clustal.org로부터 입수가능한 ClustalW2이다. 다른 적합한 프로그램은 www.drive5.com/muscle/로부터 입수가능한 MUSCLE이다. 대안적으로, ClustalW2 및 MUSCLE이, 예컨대 EBI로부터 입수가능하다.

서열 정렬은 이종 소스로부터의 데이터, 예컨대 구조적 데이터 (예컨대, 결정학적 단백질 구조), 기능적 데이터 (예컨대, 돌연변이의 위치), 또는 계통발생학적 데이터와 서열 데이터를 통합하여 생성될 수 있음을 또한 인지할 것이다. 이종 데이터를 통합하여 다중 서열 정렬을 생성하기에 적합한 프로그램은 www.tcoffee.org에서 입수가능한 T-Coffee이며, 대안적으로, 예컨대, EBI로부터도 입수가능하다. 서열 동일성 백분율을 계산하는 데 이용되는 최종 정렬은 자동으로 또는 수동으로 큐레이팅 (curating)될 수 있음을 또한 인지할 것이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적 조성물"은 활성 성분 (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)의 생물학적 활성이 효과적이게 될 수 있도록 하는 형태이고, 조성물이 투여될 대상에 허용 불가능할 정도로 독성인 추가적인 성분을 함유하지 않는 제제를 말한다. 그러한 조성물은 멸균 상태일 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하다," "치료," 또는 "의 치료"는 소정의 질병 또는 장애에 대한 잠재성을 감소시키는 것, 소정의 질병 또는 장애의 발생을 감소시키는 것, 및/또는 소정의 질병 또는 장애의 중증도의 감소, 바람직하게는, 대상이 불편 및/또는 그로 인한 변경된 기능으로 더 이상 고통받지 않는 정도로의 감소를 말한다. 예를 들어, '치료하는'은, 대상에게 투여되었을 때, 소정의 질병 또는 장애의 발생을 예방하고/하거나 소정의 질병의 증상, 징후, 또는 원인을 치유하거나 완화시키는 요법 (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)의 능력을 말할 수 있다. 또한, '치료하는'은, 적어도 하나의 임상적 증상을 경감시키기거나 감소시키는 것 및/또는 질환의 진행에서의 억제 또는 지연 및/또는 질병 또는 병 (illness)의 개시의 예방 또는 지연 (예컨대, 근육량 또는 근육 강도의 손실의 개시의 지연, 또는 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증의 개시의 지연)을 말한다. 따라서, 용어 "치료하다," "치료하는" 또는 "의 치료" (또는 문법적으로 동등한 용어)는 예방적 및 치료적 치료 계획 둘 다를 말한다. 일부 태양에서, 그러한 질병 또는 장애는 근육량 및/또는 근육 강도의 손실이 일어나는 질병, 질환, 또는 장애이다. 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법을 사용하여 치료될 수 있는 질병 및 질환은 하기에서 더 상세하게 설명된다.

본 발명은 일반적으로 치료적 이익을 제공하는 방법 및 시스템을 제공한다. 치료적 이익은 반드시 특정 질병 또는 장애의 치유인 것이 아니라, 오히려, 대부분 전형적으로 질병 또는 장애의 완화 또는 증가된 생존, 질병 또는 장애의 제거, 질병 또는 장애와 관련된 증상의 감소, 일차적 질병 또는 장애의 발생으로부터 생긴 이차적 질병, 장애 또는 질환의 예방 또는 완화, 및/또는 질병 또는 장애의 예방을 포함하는 결과를 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "대상" 또는 "환자"는 질병 또는 장애의 진단, 예측, 또는 요법이 필요한 임의의 대상, 특히 포유동물 대상을 말한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "대상" 또는 "환자"는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 용어 "비인간 동물"은 모든 척추동물, 예컨대, 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 곰, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 이 용어는 요법, 영상 (imaging) 또는 다른 진단적 절차의 실시, 및/또는 질병 또는 장애를 위한 예방적 치료로부터 이익을 얻을 대상, 예컨대 포유동물 대상을 포함한다. 일부 태양에서, TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)는 동물 대상, 예를 들어, 소에서 근육량을 증가시키는 데 사용될 수 있다. 달리 지시되지 않는다면, 용어 "이를 필요로 하는 대상"은 적어도 부분적으로 연령, 무활동, 질병 또는 장애, 질환, 또는 이들의 조합으로 인한 근육 손실 및/또는 근육 강도의 손실을 나타내는 인간을 포함하지만 이로 제한되지는 않는 포유동물을 말한다.

본 발명의 일부 태양에서, 대상은 나이브 (

) 대상이다. 나이브 대상은 요법, 예를 들어 근육 성장 및/또는 근육 강도를 증진하기 위한 그리고/또는 근육량의 손실을 예방하기 위한 치료제를 실시한 적이 없는 대상이다. 일부 태양에서, 나이브 대상은 TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)를 투여하기 전에 근육 성장 및/또는 근육 강도를 증진하기 위한 그리고/또는 근육량의 손실을 예방하기 위한 치료제, 예를 들어, 소분자 약물로 처리된 적이 없다. 다른 태양에서, 대상은 TTC를 투여하기 전에, 근육 성장 및/또는 근육 강도를 증진하기 위한 그리고/또는 근육량의 손실을 예방하기 위한 요법 및/또는 1회 이상의 용량의 치료제, 예를 들어, 소분자 약물을 투여받았다. 일부 태양에서, 대상은 TTC의 투여와 동시에, 근육 성장 및/또는 근육 강도를 증진하기 위한 그리고/또는 근육량의 손실을 예방하기 위한 치료제, 예컨대, 소분자 약물을 투여받을 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "요법"은 근육량 및/또는 근육 강도의 손실이 일어나는 질병, 질환, 또는 장애를 치유, 경감, 또는 예방하기 위한 임의의 수단을 포함하며, 이는, 예를 들어, 치료제, 기기, 보조 수단, 및 외과적 또는 재활 절차를 포함한다. 이러한 점에 있어서, 용어 요법은 근육량 및/또는 근육 강도의 손실이 일어나는 질병, 질환, 또는 장애의 예방, 관리, 치료, 및/또는 개선에 사용될 수 있는 임의의 프로토콜, 방법 및/또는 치료제 또는 진단제를 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "섬유증"은, 기관 또는 조직의 정상 구성성분으로서의 섬유성 조직의 형성과는 대조적으로, 수복 또는 반응 과정으로서 기관 또는 조직에서의 과도한 섬유성 결합 조직의 형성 또는 발달로 이해되어야 한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료제"는 근육량 및/또는 근육 강도의 손실이 일어나는 질병, 질환, 또는 장애를 갖는 대상에게 원하는 통상 유익한 효과를 생성하기 위해 투여되는 임의의 치료적 활성 물질을 말한다. 용어 치료제는, 예컨대, 흔히 소분자 약물로 지칭되는 고전적 저분자량 치료제, 및 항체 또는 이의 활성 단편, 펩티드, 지질, 단백질 약물, 단백질 접합 약물, 효소, 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 유전 물질, 프리온, 바이러스, 세균, 및 진핵세포를 포함하지만 이로 제한되지는 않는 생물제제를 포함한다. 치료제는 또한 대상에게 투여되었을 때 원하는 치료적 활성 물질로 대사되는 전구-약물일 수 있다. 일부 태양에서, 치료제는 예방제이다. 추가로, 치료제는 약제학적으로 제형화될 수 있다. 치료제는 또한 어떠한 다른 형태의 에너지, 예컨대 광 또는 초음파 에너지에 의해, 또는 전신 투여될 수 있는 다른 순환 분자에 의해 활성화되는 방사성 동위원소 또는 작용제일 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "치료적으로 유효한" 양은 근육량 및/또는 근육 강도의 손실이 일어나는 질병, 질환, 또는 장애를 갖는 대상에 어떠한 개선 또는 이익을 제공하는 치료제의 양이다. 따라서, "치료적으로 유효한" 양은 근육량 및/또는 근육 강도의 손실이 일어나는 질병, 질환, 또는 장애의 적어도 하나의 임상적 증상의 어떠한 완화, 경감, 및/또는 감소를 제공하는 양이다. 당업자는 어떠한 이익이 대상에게 제공되는 한, 치료적 효과가 완벽하거나 치유적일 필요는 없음을 인지할 것이다.

일부 태양에서, 용어 "치료적으로 유효한"은 (a) 근육량의 증가; (b) 근육 강도의 증가; (c) 질병 또는 질환에 의해 야기된 근육량의 손실의 감소; (d) 질병 또는 질환에 의해 야기된 근육 강도의 손실의 감소; (e) 질병 또는 질환에 의해 야기된 근육량의 손실의 예방; (f) 질병 또는 질환에 의해 야기된 근육 강도의 손실의 예방; (g) 질병 또는 질환으로부터의 회복 또는 치유 속도의 증가; (h) 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증의 예방; (i) 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증의 감소; 또는, (j) 이들의 조합을 가능하게 하는 치료제의 양을 말한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 근육량 및/또는 근육 강도의 손실이 일어나는 질병, 질환, 또는 장애를 갖는 환자에서 특정 결과를 달성하기"에 충분한 양" 또는 "충분량"은 원하는 효과 - 이는, 선택적으로 (즉, 치료적 유효량의 투여에 의한) 치료적 효과임 - 를 생성하기에 유효한 치료제 (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합)의 양을 말한다. 일부 태양에서, 그러한 특정 결과는 다음과 같다:

(a) 근육량의 증가;

(b) 근육 강도의 증가;

(c) 질병 또는 질환에 의해 야기된 근육량의 손실의 감소;

(d) 질병 또는 질환에 의해 야기된 근육 강도의 손실의 감소;

(e) 질병 또는 질환에 의해 야기된 근육량의 손실의 예방;

(f) 질병 또는 질환에 의해 야기된 근육 강도의 손실의 예방;

(g) 질병 또는 질환으로부터의 회복 또는 치유 속도의 증가;

(h) 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증의 예방;

(i) 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증의 감소; 또는,

(j) 이들의 조합.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "샘플"은 대상으로부터 얻은 임의의 생물학적 유체 또는 조직, 예컨대, 근육 조직을 포함한다. 샘플은 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 얻어질 수 있다. 일부 태양에서, 샘플은 다수의 대상으로부터의 생물학적 샘플들을 취하고, 그들을 풀링 (pooling)하거나 각 대상의 생물학적 샘플의 분취물 (aliquot)을 풀링함으로써 유도될 수 있다. 풀링된 샘플은 단일 대상으로부터의 샘플로서 처리될 수 있다. 용어 샘플은 또한 앞서의 모든 것의 실험적으로 분리된 분획들을 포함한다.

일부 태양에서, 샘플은 대상으로부터의 샘플들, 예컨대, 상이한 근육들로부터의 근육 조직 샘플들의 조합일 수 있다. 일부 태양에서, 샘플은 대상 집단으로부터의 샘플들의 조합일 수 있다. 일부 태양에서는, 예를 들어, 근육량 및/또는 근육 강도의 손실이 일어나는 질병, 질환, 또는 장애를 갖는 대상에게 TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)가 투여될 때 TTC에 의한 처리 또는 이것이 결여된 처리의 효과를 모니터링하기 위해, 그리고/또는 근육량 및/또는 근육 강도의 손실이 일어나는 질병, 질환, 또는 장애의 진행을 모니터링하기 위해, 상이한 시간 간격에서 단일 대상으로부터 다수의 샘플들이 채취될 수 있다.

본 발명의 방법 및 시스템을 적용하기 위해, 근육량 및/또는 근육 강도의 손실이 일어나는 질병 또는 장애를 치료하기 위한 요법의 실시, 예를 들어, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합의 투여 전 또는 후에 환자로부터 샘플이 얻어질 수 있다. 일부 경우에는, 요법이 시작된 후 또는 요법이 중단된 후 환자로부터 연속 샘플들이 얻어질 수 있다.

샘플은, 예를 들어, 의료 제공자 (예컨대, 의사) 또는 의료 혜택 제공자 (healthcare benefits provider)에 의해 요청될 수 있고, 동일한 또는 상이한 의료 제공자 (예컨대, 간호사, 병원) 또는 임상 검사실로부터 얻어질 수 있고/있거나 이에 의해 처리될 수 있고, 처리 후, 결과는 본래의 의료 제공자 또는 또 다른 의료 제공자, 의료 혜택 제공자 또는 환자에게 전달될 수 있다. 유사하게, 하나 이상의 스코어, 스코어들 사이의 비교, 스코어의 평가 및 치료 결정의 측정/결정은 하나 이상의 의료 제공자, 의료 혜택 제공자, 및/또는 임상 검사실에 의해 실시될 수 있다.

기능적 특징에 대해 "증가된"이라는 용어는 관련 있는 기능적 특징이, 비교할 만한 질환 하에서 결정될 때, 참조의 것에 대해 유의하게 증가됨을 나타내는 데 사용된다. 일부 태양에서, 기능적 특징의 증가 (예컨대, 증가된 근육 기능, 예컨대 전체 근육 수축력, 경련 힘, 강직 힘, 근육량, 힘:질량 비, 또는 이들의 조합의 증가)는, 비교할 만한 질환 하에서 결정될 때, 참조에 대해, 예컨대, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 더 높다.

일부 태양에서, 기능적 특징의 증가 (예컨대, 증가된 근육 기능, 예컨대 전체 근육 수축력, 경련 힘, 강직 힘, 근육량, 힘:질량 비, 또는 이들의 조합의 증가)는, 비교할 만한 질환 하에서 결정될 때, 참조에 대해, 예컨대, 적어도 약 1.1배, 적어도 약 1.2배, 적어도 약 1.3배, 적어도 약 1.4배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 1.6배, 적어도 약 1.7배, 적어도 약 1.8배, 적어도 약 1.9배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배 증가이다.

기능적 특징에 대해 "감소된"이라는 용어는 관련 있는 기능적 특징이, 비교할 만한 질환 하에서 결정될 때, 참조의 것에 대해 유의하게 감소됨을 나타내는 데 사용된다. 일부 태양에서, 기능적 특징의 감소 (예컨대, 근육 기능의 손실의 감소 또는 예방 및/또는 근육량의 손실의 감소 또는 예방)는, 비교할 만한 질환 하에서 결정될 때, 참조에 대해, 예컨대, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 더 낮다.

일부 태양에서, 기능적 특징의 감소 (예컨대, 근육 기능의 손실의 감소 또는 예방 또는 근육량의 손실의 감소 또는 예방)는, 비교할 만한 질환 하에서 결정될 때, 참조에 대해, 예컨대, 적어도 약 1.1배, 적어도 약 1.2배, 적어도 약 1.3배, 적어도 약 1.4배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 1.6배, 적어도 약 1.7배, 적어도 약 1.8배, 적어도 약 1.9배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배 감소이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "의료 제공자"는 살아있는 대상, 예컨대, 인간 환자와 직접 소통하고 그 대상에 TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)를 투여하는 개인 또는 기관을 말한다. 의료 제공자의 비제한적인 예는 의사, 간호사, 기술자, 치료사, 약사, 상담사, 대체 의학 종사자, 의료 시설, 의사 사무실, 병원, 응급실, 클리닉, 긴급 치료 센터, 대체 의학 클리닉/시설, 및 일반 의료의, 특수 의료의, 수술의, 그리고/또는 임의의 다른 타입의 치료, 평가, 유지, 요법, 약물치료 및/또는 조언을 포함하지만 이로 제한되지는 않는 일반 및/또는 특수 치료, 평가, 유지, 요법, 약물치료, 및/또는 환자의 건강 상태의 전부, 또는 임의의 부분에 관한 조언을 제공하는 임의의 다른 개체를 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "임상 검사실"은 근육량 및/또는 근육 강도의 손실이 일어나는 질병, 질환, 또는 장애의 TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)에 의한 치료로부터 이익을 얻을 수 있거나, 치료되고 있는 살아있는 대상, 예컨대, 인간으로부터 유래한 물질의 검사 또는 처리를 위한 시설을 말한다.

처리의 비제한적인 예는 정보 제공을 위한, 예컨대, 살아있는 대상, 예컨대, 인간의 임의의 질병 또는 손상의 진단, 예방, 또는 치료, 또는 그의 건강의 평가를 위한, 인체로부터 유래한 물질, 예컨대, 근육 샘플의 생물학적, 생화학적, 혈청학적, 화학적, 면역혈액학적, 혈액학적, 생물물리학적, 세포학적, 병리학적, 유전적, 또는 다른 검사를 포함한다. 이러한 검사는 또한 살아있는 대상, 예컨대, 인간의 신체 내의, 또는 살아있는 대상, 예컨대, 인간의 신체로부터 획득된 샘플 내의 다양한 물질을 수집 또는 달리 샘플의 획득, 준비, 결정, 측정, 또는 달리 그의 존재 또는 부재를 설명하는 절차를 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "의료 혜택 제공자"는 하나 이상의 의료 혜택, 복지 제도, 건강 보험, 및/또는 의료 비용 계정 프로그램을 전체로 또는 부분으로 제공하거나, 제시하거나, 제안하거나, 지불하거나, 그렇지 않다면 이것에 환자 접근을 제공하는 것과 관련된 개인, 조직, 또는 그룹을 포함한다.

일부 태양에서, 의료 제공자는 근육량 및/또는 근육 강도의 손실이 일어나는 질병, 질환, 또는 장애를 치료하기 위해 요법을 실시하도록, 예를 들어, TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합)를 투여하도록, 다른 의료 제공자를 관리하거나 그에게 지시할 수 있다.

의료 제공자는, 예를 들어, 하기 행위를 실시하도록 다른 의료 제공자 또는 환자에게 권한을 주거나 그에게 지시할 수 있다: 샘플 획득, 샘플 처리, 샘플 제출, 샘플 수령, 샘플 전달, 샘플 분석 또는 측정, 샘플 정량, 샘플을 분석/측정/정량 후 얻은 결과를 제공, 샘플을 분석/측정/정량 후 얻은 결과를 수령, 하나 이상의 샘플을 분석/측정/정량 후 얻은 결과를 비교/스코어링, 하나 이상의 샘플로부터의 비교/스코어를 제공, 하나 이상의 샘플로부터의 비교/스코어를 획득, 요법 실시, 요법 실시를 개시, 요법 실시를 중단, 요법 실시를 계속, 요법 실시를 일시적 중단, 투여된 치료제의 양을 증가, 투여된 치료제의 양을 감소, 치료제의 양의 투여를 계속, 치료제의 투여 빈도를 증가, 치료제의 투여 빈도를 감소, 치료제에 대한 동일 투약 빈도를 유지, 요법 또는 치료제를 적어도 다른 요법 또는 치료제로 대체, 요법 또는 치료제를 적어도 다른 요법 또는 추가적 치료제와 병용.

일부 태양에서, 의료 혜택 제공자는, 예를 들어, 샘플의 수집, 샘플의 처리, 샘플의 제출, 샘플의 수령, 샘플의 전달, 샘플의 분석 또는 측정, 샘플의 정량, 샘플을 분석/측정/정량 후 얻은 결과의 제공, 샘플을 분석/측정/정량 후 얻은 결과의 전달, 하나 이상의 샘플을 분석/측정/정량 후 얻은 결과의 비교/스코어링, 하나 이상의 샘플로부터의 비교/스코어의 전달, 요법의 실시 또는 치료제의 투여, 요법의 실시 또는 치료제의 투여의 개시, 요법의 실시 또는 치료제의 투여의 중단, 요법의 실시 또는 치료제의 투여의 계속, 요법의 실시 또는 치료제의 투여의 일시적 중단, 투여된 치료제의 양의 증가, 투여된 치료제의 양의 감소, 치료제의 양의 투여의 계속, 치료제의 투여 빈도의 증가, 치료제의 투여 빈도의 감소, 치료제에 대한 동일 투약 빈도의 유지, 요법 또는 치료제의 적어도 다른 요법 또는 치료제로의 대체, 또는 요법 또는 치료제의 적어도 다른 요법 또는 추가적 치료제와의 병용을 인가하거나 거부할 수 있다.

추가로, 의료 혜택 제공자는, 예컨대, 요법의 처방의 인가 또는 거부, 요법을 위한 보험의 인가 또는 거부, 요법의 비용에 대한 상환의 인가 또는 거부, 요법에 대한 적격성의 결정 또는 거부 등을 할 수 있다.

일부 태양에서, 임상 검사실은, 예를 들어, 샘플의 수집 또는 획득, 샘플의 처리, 샘플의 제출, 샘플의 수령, 샘플의 전달, 샘플의 분석 또는 측정, 샘플의 정량, 샘플을 분석/측정/정량 후 얻은 결과의 제공, 샘플을 분석/측정/정량 후 얻은 결과의 수령, 하나 이상의 샘플을 분석/측정/정량 후 얻은 결과의 비교/스코어링, 하나 이상의 샘플로부터의 비교/스코어의 제공, 하나 이상의 샘플로부터의 비교/스코어의 획득, 또는 다른 관련 활동을 할 수 있다.

II. TTC 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "TTC"는 TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 (즉, TTC 폴리펩티드를 인코딩하고 발현되었을 때 TTC 폴리펩티드를 생성하는 폴리뉴클레오티드), 및/또는 이들의 조합을 말한다. TTC 폴리펩티드는 파상풍 독소의 카르복실-말단 부분에 관한 것이고, 특히 독소가 파파인에 의해 효소적으로 절단될 때 생성되는 무독성 파상풍 독소 C-단편에 관한 것이다. 이러한 C-단편 (50 kDa)은 파상풍 독소 중쇄의 C-말단에서의, 아미노산 위치 865와 1315 사이의, 451개 아미노산에 상응한다 (서열 번호 5). 따라서, 본 발명과 관련하여, 용어 TTC는, 폴리펩티드를 지칭할 때, 파파인에 의한 고유의 단백질의 분해 (digestion)로부터 생성된 파상풍의 단편 및 다른 프로테아제에 의한 효소적 분해를 통해, 또는 단편의 재조합 발현을 통해 얻어진 동등한 단편에 상응한다. TTC의 재조합 발현은 미국 특허 제5,443,966호에 개시되어 있고, 이는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

일부 태양에서, TTC, 및 특히 TTC 폴리펩티드는 서열 번호 2의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 다른 태양에서, TTC는 서열 번호 5의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 다른 태양에서, TTC, 및 특히 TTC 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 2의 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 서열 번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 태양에서, TTC는 서열 번호 5의 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 서열 번호 6의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 서열 번호 2는 독소가 파파인에 의해 효소적으로 절단될 때 생성되는 파상풍 독소 C-단편의 아미노 말단에서의 아미노산 발린 (V)으로부터 독소가 파파인에 의해 효소적으로 절단될 때 생성되는 파상풍 독소 C-단편의 카르복시 말단에서의 아미노산 아스파르테이트 (D)까지, 즉, NCBI 수탁 번호 P04958의 파상풍 단백질 서열의 V854부터 D1315까지를 포함한다. 서열 번호 5는 N-말단 서열 VFSTPIPFSYS이 없는 서열 번호 2의 단편이다.

본 발명은, 위에 기재된 프로그램들 중 어느 하나를 사용하여 결정될 때, 본 명세서에서 서열 번호 2 및 서열 번호 5 (TTC 단편)로서 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성의 정도를 나타내는 TTC 폴리펩티드를 포함한다.

또한, 엄격한 조건 하에서 파상풍 독소 유전자로부터의 천연적 TTC 서열과 혼성화될 수 있는 TTC 폴리뉴클레오티드가 용어 TTT의 정의에 포함된다. 엄격한 조건은 예를 들어 다음과 같다: 6×SSC 완충액, 1× 덴하르트 용액 (Denhardt's Solution), 1% SDS, 및 250 ㎍/ml tRNA의 존재 하에서 42℃에서 4 내지 6시간 동안. (1×SSC는 0.15 M NaCl 및 0.05 M 소듐 시트레이트에 상응하고; 1× 덴하르트 용액은 0.02% 피콜 (Ficoll), 0.02% 폴리비닐 피롤리돈 및 0.02% 우혈청 알부민에 상응한다). 0.1×SCC 및 0.1% SDS의 존재 하에서 실온에서 2회의 세척 단계가 실시된다.

일부 태양에서, 용어 TTC는 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 및 이들의 단편을 포함하는 TTC 유전자를 말한다. 일부 태양에서, TTC 올리고뉴클레오티드는 A, T, C, G, 또는 U와 상이한 핵염기, 예를 들어, 유니버설 염기 (universal base)를 포함한다. TTC 폴리뉴클레오티드 변이체는 게놈 또는 cDNA 클로닝 방법을 사용하는 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 부위-특이적 및 영역-유도된 돌연변이생성 기술이 사용될 수 있다. 추가적으로, 링커스캐닝 (linkerscanning) 및 PCR-매개 기술이 돌연변이생성에 사용될 수 있다. 문헌[PCR TECHNOLOGY (Erlich ed., Stockton Press 1989)]을 참조한다. 위 기술들 중 어느 하나와 함께 사용하기 위한 단백질 서열분석, 구조 및 모델링 접근법이 문헌[CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY vol. 1, ch. 8 (Ausubel et al. eds., J. Wiley & Sons 1989 & Supp. 1990-93)]; 문헌[PROTEIN ENGINEERING (Oxender & Fox eds., A. Liss, Inc. 1987)]에 개시되어 있고 이를 참조한다. 원하는 경우, TTC에 대한 다른 변이가 조합 화학 (combinatorial chemistry), 바이오패닝 (biopanning) 및/또는 파지 디스플레이를 사용하여 수행될 수 있다. TTC의 펩티드 모방체가, 예를 들어, 문헌[Saragovi et al, Science 253:792-95 (1991)] 및 다른 논문에 개략적으로 설명된 접근법에 의해 생성될 수 있다. 모방체는 단백질 이차 구조의 요소를 모방하는 펩티드-함유 분자이다. 예를 들어, 문헌[Johnson et al, "Peptide Turn Mimetics" in BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY, Pezzuto et al, Eds., (Chapman and Hall, New York, 1993)]을 참조한다.

일부 태양에서, 용어 TTC는, TTC 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 변이체를 인코딩하는, 합성 폴리뉴클레오티드, 예컨대, 합성 DNA 또는 합성 RNA, 예컨대 합성 mRNA를 말한다. 합성 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 골격 변형 (예컨대, 포스포로티오에이트) 및/또는 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 일부 태양에서, 뉴클레오티드 유사체는 2'-O-메톡시에틸-RNA (2'-MOE-RNA) 단량체, 2'-플루오로-DNA 단량체, 2'-O-알킬-RNA 단량체, 2'-아미노-DNA 단량체, 잠금형 핵산 (locked nucleic acid) (LNA) 단량체, cEt 단량체, cMOE 단량체, 5'-Me-LNA 단량체, 2'-(3-하이드록시)프로필-RNA 단량체, 아라비노 핵산 (ANA) 단량체, 2'-플루오로-ANA 단량체, 안하이드로헥시톨 핵산 (HNA) 단량체, 삽입 핵산 (INA)) 단량체, 및 상기 뉴클레오티드 유사체들 중 둘 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 태양에서, 합성 mRNA 폴리뉴클레오티드는, 하나 이상의 우리딘 및/또는 시티딘을 대체하는, 예컨대, 슈도우리딘 (Ψ), 5-메톡시우리딘 (5moU), 2-티오우리딘 (s2U), 4-티오우리딘 (s4U), N1-메틸슈도우리딘 (1mΨ), 또는 5-메틸시티딘을 포함하는 "서열 최적화" mRNA이다. 일부 태양에서, 합성 mRNA 서열은, 예컨대, 우리딘의 25%, 50% 또는 100%를 4-티오우리딘 또는 2-티오우리딘 (s2U)으로 대체함으로써 최적화될 수 있다. 서열 번호 9, 서열 번호 10 및 서열 번호 11의 서열을 갖는 TTC를 인코딩하는 예시적인 RNA 분자가 본 명세서에 개시된다.

용어 TTC는 또한 야생형 TTC 폴리펩티드 또는 TTC 폴리뉴클레오티드, 및 이의 유도체 (예컨대, TTC 단백질의 당화되거나 비당화된 단백질 형태, 또는 달리 단백질의 화학적으로 변형된 형태; 뉴클레오티드 변이체를 포함하는 폴리뉴클레오티드)의 단편 및 변이체 (예컨대, 결실, 삽입, 치환, 전위 등을 포함하는 돌연변이체)를 포함한다.

당업자는 본 명세서에 개시된 방법을 실시하기 위한 TTC 단편 및 변이체의 설계는 1997년 이래 알려진 TTC의 3차원 구조에 대한 상당한 지식에 의해 안내될 수 있음을 인지할 것이다 (문헌[Umland et al., "Structure of the Receptor Binding Fragment Hc of Tetanus Toxin," Nature Structural Biology 4:788-792] 참조). TTC 단독으로의 또는 복합체의 일부로서의 추가적인 결정 구조는 그때 이래로 생성되었다 (예컨대, 문헌[Fotinou et al. "The crystal structure of tetanus toxin Hc fragment complexed with a synthetic GT1b analogue suggests cross-linking between ganglioside receptors and the toxin," Journal of Biological Chemistry 276: 32274-32281, 2001] 참조). 엄청난 양의 생화학적 데이터, 생물물리학적 데이터, 기능적 데이터와 함께, 이용가능한 3차원적 데이터는 모 TTC 분자의 특성을 보존하는 단편, 변이체, 및 유도체의 설계를 위한 상당한 안내를 제공한다. 이어서, 그러한 TTC 단편, 변이체, 및 유도체는 당업계에 공지된 방법 또는 본 발명에 개시된 방법을 사용하여 근육량 및/또는 근육 강도를 증가시키고/시키거나 근육 손실을 예방할 수 있음을 입증하기 위해 테스트될 수 있다.

치료제, 면역원, 또는 검출가능한 모이어티 (예컨대, GFP)를 위한 담체 분자로서의 TTC 폴리펩티드의 용도뿐만 아니라, TTC를 유전자 융합 또는 접합을 통해 그러한 분자에 연결하기 위한 방법도 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 화학적 접합을 통한 TTC 유도체의 생성은 문헌[Dobrenis et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 89:2297-2301 (1992)]; 문헌[Francis et al. J. Biol. Chem. 270: 15434-15442 (1995)]; 문헌[Knight et al. Eur. J. Biochem. 259:762-769 (1999)]; 또는 문헌[Schneider et al. Gene Ther. 7: 1584-1592 (2000)]에 개시되어 있다. 유사하게, 유전자 융합을 통한 TTC 유도체의 생성은, 예를 들어, 문헌[Coen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 94:9400-9405 (1997)]; 문헌[Francis et al. J. Neurochem. 74:2528-2536 (2000)]; 문헌[Matthews et al. J. Mol. Neurosci. 14: 155-166 (2000)]; 및 문헌[Kissa et al. Mol. Cell Neurosci., 20:627-637 (2002)]에 기재되어 있다. TTC의 인간화 버전의 생성은 국제특허 출원 공개 WO2011/143557호 및 미국 특허 제8703733호에 기재되어 있고, 이는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

위에 논의된 바와 같이, TTC는 파상풍 독소 중쇄의 아미노산 865 부터 1315까지를 포함한다. TTC의 야생형에 대해 뉴런막에의 결합에 있어서 차이가 없음을 보여주기 위한 당업계에 공지된 돌연변이형은 D1309A, F1305A, W1303A, R1168A, Y1170A, E1310Q, D1309N, E1310Q/D1309N, R1160K, N1292A, K1295A, 및 K1297A를 포함한다. 문헌[Sutton et al. FEBS Letter 493: 45-49 (2001)]을 참조한다. 돌연변이형 T1308A, D1309A, 및 E1310, 및 결실 ΔV1306―D1315 또는 ΔG1311―D1315를 포함하는 TTC 단편은 TTC의 야생형에서 관찰된 결합의 80%를 초과하는 결합 능력을 갖는다. TTC 결실 단편 ΔV1306―D1315는 운동뉴런에의 결합 및 뉴런 세포 결합 이외에 역행 수송을 할 수 있는 것으로 밝혀져 있다.

TTC의 아미노산 잔기 1274 내지 1279는 β-삼엽형 (trefoil) 도메인 내 2개의 β 시트들을 연결하는 루프를 형성한다. 이러한 잔기가 결여된 돌연변이체는 강글리오시드 및 뉴런 세포 둘 다에 매우 감소된 결합을 나타내고 역행 수송을 하지 않으므로 이 영역은 생물학적 활성에 있어서 필수적이다.

β-삼엽형 도메인 내 2개의 β 시트들을 역시 연결하는 제2 루프가 또한 생물학적 활성에 있어서 필수적이다. 이러한 루프에서 6개의 잔기의 결실 (ΔD1214―N1219)을 함유하는 돌연변이 단백질은 강글리오시드 및 뉴런 세포에 약하게 결합한다. 문헌[Sinha et al. Molecular Microbiology 37:1041-1051 (2000)]을 참조한다.

용어 "TTC 유도체"는 접합체 (예컨대, 화학적 또는 효소적 접합에 의해 생성되는 접합체)를 포함하고, 또한 이종 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열 (또는 이의 일부)을 TTC 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열 (또는 이의 일부)에 융합함으로써 생성될 수 있는 키메라 폴리펩티드를 포함한다. 키메라 폴리펩티드를 생성하기 위한 기술은 당업계에 잘 공지된 표준 기술이다. 그러한 기술은 서열들이 동일한 해독틀 (reading frame)에 있도록 이들을 연결시키는 것, 및 동일한 프로모터(들) 및 종결자의 제어 하에서 융합된 폴리펩티드의 발현을 통상 요구한다. 일부 태양에서, TTC 유도체는 화학적 합성, 즉, 핵산 합성 또는 펩티드 합성을 사용하여 생성될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "이종 폴리펩티드"는 임의의 비-TTC 폴리펩티드 서열을 말한다. 예시적인 이종 서열은 이종 신호 서열 (예컨대, 고유의 래트 알부민 신호 서열, 변형된 래트 신호 서열, 또는 인간 성장 호르몬 신호 서열) 또는 TTC 폴리펩티드의 정제에 사용된 서열 (예컨대, 히스티딘 태그)을 포함한다. 이종 신호 서열 펩티드는, 예를 들어, 성장 인자 신호 펩티드, 호르몬 신호 펩티드, 사이토카인 신호 펩티드 및 면역글로불린 신호 펩티드 (IgSP)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 따라서, 신호 펩티드의 예는 TGFβ 신호 펩티드, GDF 신호 펩티드, IGF 신호 펩티드, BMP 신호 펩티드, 뉴트로핀 신호 펩티드, PDGF 신호 펩티드 및 EGF 신호 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 신호 펩티드; 호르몬이 성장 호르몬, 인슐린, ADH, LH, FSH, ACTH, MSH, TSH, T3, T4, 및 DHEA로 이루어진 군으로부터 선택되는 호르몬 신호 펩티드로부터 선택되는 신호 펩티드; 또는 인터루킨 신호 펩티드이다. 일 태양에서, 신호 펩티드는 알부민 신호 펩티드, 변형된 알부민 신호 펩티드, 및 성장 호르몬 신호 펩티드, 예컨대 래트 알부민 신호 펩티드, 변형된 래트 알부민 신호 펩티드, 및 인간 성장 호르몬 신호 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 신호 펩티드, 예컨대 래트 알부민 신호 펩티드 및 인간 성장 호르몬 신호 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 태양에서, TTC는 유리한 약동학적 특성들, 예를 들어, 감소된 클리어런스 또는 연장된 혈장 반감기를 부여하는 분자, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 펩티드, 예컨대 HAP, PAS, XTEN, 알부민 등에 유전적으로 융합될 수 있거나 유전적으로 접합될 수 있다.

일부 태양에서, TTC 폴리뉴클레오티드는 추가적인 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 프로모터, 종결자, 사일렌서 서열, 염색체 또는 임의의 타입의 유전 물질의 조직적 구조에의 그것의 통합을 돕는 서열 등에 융합될 수 있다. 다른 태양에서, TTC 폴리뉴클레오티드는 (i) 적어도 하나의 5' 캡 구조 (예컨대, Cap0, Cap1, ARCA, 이노신, N1-메틸-구아노신, 2'-플루오로-구아노신, 7-데아자-구아노신, 8-옥소-구아노신, 2-아미노-구아노신, LNA-구아노신, 또는 2-아지도-구아노신); (ii) 5'-UTR; 및 (iii) 3'-UTR을 포함하는 mRNA일 수 있다. 일부 태양에서, mRNA는 또한 폴리-A 테일을 포함할 수 있다.

일부 태양에서, TTC는 벡터의 일부일 수 있다. 용어 "벡터"는 숙주 세포, 예컨대 진핵 숙주 세포 내에서 관심있는 하나 이상의 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달할 수 있고, 일부 태양에서는, 발현할 수 있는 작제물을 의미한다. 벡터의 예에는 바이러스 벡터, 네이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 관련된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포솜 내에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 효모 인공 염색체 (YAC), 세균 인공 염색체 (BAC), 인간 인공 염색체 (HAC), 아데노바이러스, 레트로바이러스 및 자가-복제가 가능한 임의의 다른 타입의 DNA 또는 RNA 분자, 및 소정의 진핵 세포, 예컨대 생성 세포가 포함되지만 이로 제한되지는 않는다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "벡터"는 단일 "벡터" 및 복수의 "벡터"를 포함하는 것으로 의도된다. "벡터"는 세포, 예컨대, 근육 세포가 원하는 재조합 TTC 폴리펩티드의 발현을 야기하도록 형질감염될 수 있다.

일부 태양에서, TTC 폴리펩티드 (또는 이를 인코딩하는 TTC 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터)는 원하는 재조합 폴리펩티드를 발현하기 위해 유전자도입 세포, 예컨대, 근육 세포를 생성하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 일부 경우에, TTC 폴리뉴클레오티드는 세포의 게놈에, 예컨대, 염색체에 통합될 수 있어서, 결과적으로 TTC 폴리펩티드를 발현할 수 있는 세포를 생성하게 된다. 이어서, 그러한 세포 (예컨대, 자가 (autologous) 세포 또는 이종 세포)는 근육량 및/또는 근육 강도의 손실이 일어나는 질병, 질환, 또는 장애를 앓고 있는 대상에 이식될 수 있다. 그러한 유전자 요법 접근법에 있어서의 세포로의 TTC 폴리뉴클레오티드의 전달은 (예컨대, 아데노바이러스를 통해 TTC 폴리뉴클레오티드를 투여함으로써) 생체내에서 또는 (예컨대, 먼저 대상으로부터 근육 세포를 추출한 후 TTC 폴리뉴클레오티드로 이를 형질감염시킴으로써) 생체외 (ex vivo)에서 일어날 수 있다.

관심 폴리펩티드를 발현하기 위해 세포 및/또는 세포주를 유전적으로 조작하기 위한 방법 및 벡터는 당업자에게 잘 공지되어 있으며; 예를 들어, 다양한 기술들이 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel at al., eds. (Wiley & Sons, New York, 1988, and quarterly updates)] 및 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Laboratory Press, 1989)]에 설명되어 있다.

III. TTC에 의한 처리의 방법

본 발명은 근육량 및/또는 근육 강도의 손실과 관련된 질병, 질환, 또는 장애를 치료하기 위한 방법을 제공하고, 본 방법은 TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)의 투여를 포함하며, 여기서 TTC의 투여는 (a) 근육량의 증가; (b) 근육 강도의 증가; (c) 질병 또는 질환에 의해 야기된 근육량의 손실의 감소; (d) 질병 또는 질환에 의해 야기된 근육 강도의 손실의 감소; (e) 질병 또는 질환에 의해 야기된 근육량의 손실의 예방; (f) 질병 또는 질환에 의해 야기된 근육 강도의 손실의 예방; (g) 질병 또는 질환으로부터의 회복 또는 치유 속도의 증가; (h) 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증의 예방; (i) 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증의 감소; 또는, (j) 이들의 조합에 효과적이다.

본 발명은 또한 근육량 및/또는 근육 강도의 손실과 관련된 질병, 질환, 또는 장애를 치료하기 위한 TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)를 함유하는 조성물을 제공한다. 또한, 근육량의 손실과 관련된 질병을 치료하기 위한 의약 제품의 제조에서의 TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)의 용도가 제공된다. 또한, TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)를 함유하는 조성물이 제공되고, 이는 (a) 근육량의 증가; (b) 근육 강도의 증가; (c) 질병 또는 질환에 의해 야기된 근육량의 손실의 감소; (d) 질병 또는 질환에 의해 야기된 근육 강도의 손실의 감소; (e) 질병 또는 질환에 의해 야기된 근육량의 손실의 예방; (f) 질병 또는 질환에 의해 야기된 근육 강도의 손실의 예방; (g) 질병 또는 질환으로부터의 회복 또는 치유 속도의 증가; (h) 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증의 예방; (i) 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증의 감소; 또는, (j) 이들의 조합에 효과적이다.

또한, (a) 근육량의 증가; (b) 근육 강도의 증가; (c) 질병 또는 질환에 의해 야기된 근육량의 손실의 감소; (d) 질병 또는 질환에 의해 야기된 근육 강도의 손실의 감소; (e) 질병 또는 질환에 의해 야기된 근육량의 손실의 예방; (f) 질병 또는 질환에 의해 야기된 근육 강도의 손실의 예방; (g) 질병 또는 질환으로부터의 회복 또는 치유 속도의 증가; (h) 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증의 예방; (i) 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증의 감소; 또는, (j) 이들의 조합을 위한 TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)의 용도가 제공된다.

일부 태양에서, 대상은 근육량 및/또는 근육 강도의 손실이 일어나는 질병, 질환, 또는 장애를 앓고 있지는 않지만, 근육량의 증가가 요구된다 (예컨대, TTC는 동물 대상에서 고기 생산을 증가시키기 위해 근육량을 증가시키는 데 사용될 수 있거나 인간 대상에서 미용 목적으로 근육량을 증가시키는 데 사용될 수 있다).

본 발명은 또한 대상에서 (a) 근육량의 증가; (b) 근육 강도의 증가; (c) 질병 또는 질환에 의해 야기된 근육량의 손실의 감소; (d) 질병 또는 질환에 의해 야기된 근육 강도의 손실의 감소; (e) 질병 또는 질환에 의해 야기된 근육량의 손실의 예방; (f) 질병 또는 질환에 의해 야기된 근육 강도의 손실의 예방; (g) 질병 또는 질환으로부터의 회복 또는 치유 속도의 증가; (h) 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증의 예방; (i) 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증의 감소; 또는, (j) 이들의 조합에 의해 치유, 완화, 또는 개선될 수 있는 질환 또는 고통을 치료하는 방법을 포함하고, 본 방법은 TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)의 투여를 포함한다.

일반적으로, 본 명세서에 개시된 방법은 하기를 필요로 하는 대상에게 1회 이상의 용량의 TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)의 투여 후, 하기의 원하는 효과를 달성한다: (i) 증가된 근육량; (b) 증가된 근육 강도; (c) 질병 또는 질환에 의해 야기된 근육량의 감소된 손실; (d) 질병 또는 질환에 의해 야기된 근육 강도의 감소된 손실; (e) 질병 또는 질환에 의해 야기된 근육량의 손실의 예방; (f) 질병 또는 질환에 의해 야기된 근육 강도의 손실의 예방; (g) 질병 또는 질환으로부터의 회복 또는 치유의 증가된 속도; (h) 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증의 예방; (i) 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증의 감소; 또는, (j) 이들의 조합. 일부 태양에서, 원하는 효과는 근육 재생이다. 일부 태양에서, 이러한 원하는 효과를 달성하는 메커니즘은 (a) 근육발생 (myogenesis)의 증가, (b) 근아세포 증식의 증가, (c) 근아세포 분화의 증가, (d) 근아세포 크기의 증가 (예컨대, 근아세포 면적 또는 근아세포 지름), 또는 (f) 이들의 조합을 포함한다. 따라서, 본 발명은 또한 근육발생을 증가시키기 위한 방법, 근아세포 증식을 증가시키기 위한 방법, 근아세포 분화를 증가시키기 위한 방법, 및 근아세포 크기 (근관 비대)를 증가시키기 위한 방법을 제공하며, 본 방법은 이를 필요로 하는 대상에게 TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)를 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명과 관련하여, "근육"은 바람직하게는 횡문근 조직 또는 횡문근 조직으로부터 유래된 근육 세포, 예컨대 골격근 세포/조직 및 심장 근육 세포 (심근세포) 및 심장 근육 조직을 의미한다.

달리 지시되지 않는다면, 용어 "근육 강도"는 근육의 힘의 양, 또는 근육 그룹의 힘의 합계량의 말하며, 이는 최대 힘의 급성 테스트에서, 또는 근지구력의 시간-의존적 테스트, 근피로의 시간 의존적 테스트, 또는 근지구력 및 근피로의 시간 의존적 테스트에서 발휘될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "근육량"은 근육 중량 및 근육 부피 둘 다를 포함한다. 달리 지시되지 않는다면, 용어 "근육 기능"은 근육량, 근육 강도, 및 근육 질 (muscle quality) 중 적어도 하나를 말한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "근육 질"은 상응하는 근육, 근육 그룹, 또는 팔 또는 다리 구획의 단위 부피, 횡단면적, 또는 질량당 근육 강도의 양을 말하며, 즉, 용어 "근육 질"은 상응하는 근육 부피당 근육 강도, 상응하는 근육 횡단면적당 근육 강도, 또는 상응하는 근육량당 근육 강도를 말한다. 예를 들어, 다리 근육 질은, 예를 들어, 다리 근육 강도/다리 근육 부피 또는 다리 근육 강도/다리 근육량을 말할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "근육 소모"는 일시적 또는 영구적인 근육량의 손실을 말한다. 근육 소모가 일어날 수 있는 질병 또는 질환 (즉, 소모성 장애 또는 질환)은, 예를 들어, 악액질, 거식증, 근이영양증, 신경근 질병, 부동화의 후유증, 만성 질병, 암, 노령 또는 손상을 포함한다.

다양한 신경근 질병은 일반적으로 근육량의 손실과 관련된다. 예를 들어, 실제 근육 섬유에 대한 손상을 수반하는 근병증은 이러한 근육병의 중요한 그룹이고, 이들 중, 진행성 근이영양증은 근육의 위축, 및 조직의 변형을 보이는 근생검에서의 이상을 특징으로 한다. 이러한 그룹은 특히 뒤시엔느 (Duchenne) 근이영양증 (또는 DMD), 베커 (Becker) 근이영양증 (또는 BMD) 및 지대근이영양증 (limb girdle muscular dystrophy)을 포함한다. 근육량의 손실이 관찰된 다른 질병 및 장애는, 제한 없이, 다발성 경색 치매, 뇌졸중, 외상, 감염, 수막염, 뇌염, 픽병, 전두엽 퇴행, 피질기저 퇴행, 다계통 위축증, 진행성 핵상 마비, 크로이츠펠트-야콥병, 루이 소체병, 신경염증 질병, 척수성 근위축증, 파킨슨병, 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증, 신경 AIDS, 크론병, 헌팅턴병, 신경아교종, 암 (뇌 전이를 포함함), HIV-1 관련 치매 (HAD), HIV 관련 신경인지적 장애 (HAND), 마비, 다발성 경화증 (MS), CNS-관련 심혈관 질병, 프리온병, 대사성 장애, 및 리소좀 저장병 (LSD)을 포함한다. 근육량의 손실은 또한 리소좀 저장병, 예컨대, 제한 없이, 고셔병, 폼페병, 니만-픽, 헌터 증후군 (MPS II), 점액다당류증 I (MPS I), GM2-강글리오시드증, 고셔병, 산필리포 증후군 (MPS IIIA), 테이-삭스병, 샌드호프병, 크라베병, 이염색성 백질이영양증, 및 파브리병에서 관찰된다.

추가로, 악액질 또는 소모증 (marasmus)이 또한 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물이 표적으로 하는 의학적 질환이다. 이러한 상태는 지속된 병 또는 불충분한 칼로리 또는 단백질 섭취에 의해 야기된, 특히 근육 손실에 의해 야기된, 극도의 야윔을 특징으로 한다. 이러한 질환은 특히, 만성 질병, 예컨대 암 또는 AIDS의 경우에 또는 환자의 60%에서 골격근의 위축이 있는 심부전, 또는 요실금이 있는 개인에서 보여진다. 실제로 병리학적인 것으로 간주되지는 않지만, 일부 상황은 근육량의 손실, 예컨대 노화, 지속된 부동화 등과 관련된다. 그러므로, 여기서 다시, 근육량을 증가시킬 이유가 있다. 본 발명의 방법은 또한 동물 고기 생산을 증가시키는 데 사용되거나, 또는 근육량 및/또는 근육 강도 및/또는 근육 기능의 증가가 요구되는 미용 응용에 사용될 수 있다.

본 명세서에 개시된 방법은 치유 및/또는 가속된 치유를 필요로 하는 조직 상처를 치료하는 데 적용될 수 있다. 명시되지 않는다면, 용어 "상처"는 본 명세서에서 그의 포괄적 의미로 사용되어, 이는 모든 타입의 상처 및 손상을 포함함을 의미한다. 용어 "상처"는 화상, 궤양, 열상, 절개 등을 포함한다. 본 명세서에서 "상처"와 "병변"은 상호교환 가능하게 사용될 수 있고, 그 문맥이 달리 구체적으로 나타내지 않는다면, 차이가 의도되지 않는다. 병변/상처는 급성 또는 만성일 수 있다. 급성 상처의 예는 수술 상처 (즉, 절개), 관통 상처, 견열 손상, 압궤 손상, 전단 손상, 화상, 열상, 및 교상을 포함하지만 이로 제한되지는 않는다. 만성 상처의 예는 궤양, 예컨대 동맥 궤양, 정맥 궤양, 압박 궤양, 및 당뇨병성 궤양을 포함하지만 이로 제한되지는 않는다. 물론, 급성 상처는 만성 상처가 될 수 있다.

본 명세서에 개시된 TTC 조성물 (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)은 열린 상처 또는 닫힌 상처에 적용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 조성물은 상처 치유를 증진하는 것이 바람직한 경우에는 어느 경우이든 어떠한 상처에도 투여될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 조성물은 회복 또는 치유 속도를 증가시키는 데 적용될 수 있다. 조성물은 또한 상처가 아물고/아물거나 치유된 후 흉터를 감소시키는 데 유용하다.

근육량 및/또는 근육 강도 및/또는 근육 기능을 증가시키기 위한 조성물, 예컨대 TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)는, 예컨대, 관절 대체 또는 수복 등을 위한 수술을 받은 (또는 수술을 받을) 환자에서의 세팅에 사용될 수 있다. 그렇기 때문에, 근육량의 구제를 증진하기 위해 투여되는 TTC 조성물은 이상적으로는 수술 회복의 다른 양상, 예컨대 상처 치유를 방해하지 않을 것이다.

본 명세서에 개시된 방법은 치유 및/또는 가속된 치유를 필요로 하는 근육 병변을 치료하는 데 적용될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "근육 병변"은 조직 근육 구조의 정상적인 완전성을 파괴하고/하거나 조직 근육 구조의 정상적인 기능을 파괴하고/하거나 근육에서의 병리학적 변화를 야기하는 신체적 손상을 말한다. 일부 태양에서, 근육 병변은 급성 또는 만성일 수 있다. 기능적 근육 병변은 일반적으로 (예를 들어, MRI 또는 초음파로 측정되는) 근육 파열의 거시적 증거를 보여주지 않는다. 한편, 구조적 근육 병변은 근육 파열의 거시적 증거를 보여준다.

용어 근육 병변은 기계적 병변, 예컨대 절상, 자상, 교상, 총상, 찰과상, 타박상, 또는 열상을 포함한다. 용어 근육 병변은 또한 저온 노출에 의해 야기된 열적 병변 (예컨대, 동상) 또는 고온 노출에 의해 야기된 열적 병변 (예컨대, 화상)을 포함한다. 또한 용어 근육 병변은, 예를 들어, 산 또는 알칼리 노출에 의해 야기된 화학적 병변을 포함한다.

용어 근육 병변은 또한 의원성 근육 병변을 포함한다. 용어 "의원성 근육 병변"은 의사의 또는 다른 의료 간병인의 활동, 방식, 또는 요법에 의해 환자에서 유도되는 근육 병변, 예컨대, 의료 절차 (예컨대, 주사, 절개, 천자, 골절술, 적출 등)에 의해 유도되는, 또는 이로부터 기인하는 병변을 말한다.

용어 근육 병변은 또한 반복적 활동 (예를 들어, 직업적 또는 반복적 스트레스 손상으로, 예컨대, 기계 또는 사무실용 설비의 작동에 의해 야기된 것) 및 운동성 근육 병변 (예컨대, 좌상, 근육 파열, 또는 타박상)과 관련된 근육 손상을 포함한다. 일부 태양에서, 용어 근육 병변은 운동성 근육 손상, 예컨대 피로-유도 근육 장애 (타입 1A 근육 손상), 지연-개시 근육 쓰라림 (delayed-onset muscle soreness) (DOMS) (타입 1B 근육 손상), 척추-관련 신경근 근육 장애 (타입 2A 근육 손상), 근육-관련 신경근 근육 장애 (타입 2B 근육 손상), 가벼운 부분적 근육 파열 (타입 3A 근육 손상), 중간 정도의 부분적 근육 파열 (타입 3B 근육 손상), (아)전 ((sub)total) 근육 파열/건 견열 (tendinous avulsion) (타입 4 근육 손상), 또는 직접 근육 손상 (타박상)을 말한다. 근육 병변의 정의에 포함된 일부 운동성 근육 손상은 또한 일반적으로 "좌상", "근육 결림", "경화", "근육긴장항진" 등으로 알려져 있다. 문헌[de Souza et al. (2013) Journal of Electromyography and Kinesology 23: 1253-1260]; 문헌[Mueller-Wollhfahrt et al. (2012) Br. J. Sports Med. 47(6):342-50]을 참조하고, 이들은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

본 명세서에 개시된 TTC 조성물 (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)은 근육 병변 (예컨대, 스포츠-관련 좌상, 의원성 근육 병변, 외상성 근육 병변 등)을 치료하는 데 적용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 조성물은 병변을 치유하거나 이의 치유를 가속화하는 것이 바람직한 경우에는 어느 경우이든 어떠한 근육 병변에도 투여될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 조성물은 근육 병변을 치유하고/하거나, 근육 병변의 회복 또는 치유 속도를 증가시키는 데 적용될 수 있다. 일부 태양에서, 근육 병변은 치료적 유효량의 TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)를, 예를 들어 주사에 의해, 병변의 부위, 또는 병변의 부위에 인접한 위치에 직접 투여함으로써 치료될 수 있다. 다른 태양에서, 근육 병변은 TTC를, 예컨대 주사에 의해, 원위 위치에 투여함으로써 치료될 수 있다.

일부 태양에서, TTC 투여는 TCC 폴리펩티드 (예컨대, 야생형 TTC 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체), TTC 폴리뉴클레오티드 (예컨대, 야생형 TTC, 인간화 TTC, 서열 최적화 TTC, 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체), 또는 이들의 조합의 투여를 포함한다. 일부 태양에서, TTC는 서열 번호 2 또는 서열 번호 5의 서열, 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 태양에서, TTC는 서열 번호 2 또는 서열 번호 5의 서열로 이루어지는 폴리펩티드이다. 일부 태양에서, TTC는 서열 번호 2 또는 서열 번호 5의 서열로 본질적으로 이루어지는 폴리펩티드이다.

다른 태양에서, TTC는 서열 번호 1 또는 서열 번호 6의 서열, 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 다른 태양에서, TTC는 서열 번호 1 또는 서열 번호 6의 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드이다. 다른 태양에서, TTC는 서열 번호 1 또는 서열 번호 6의 서열로 본질적으로 이루어지는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 태양에서, TTC는 재조합 단백질, 융합 단백질, 또는 접합체의 일부이다. 다른 태양에서, TTC는 재조합 단백질 또는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산의 일부이다.

일부 태양에서, TTC는, 예컨대, 서열 번호 7의 서열 (클로닝을 용이하게 하는 Xho I 부위를 포함하는 2개의 플랭킹 서열들을 포함하는 인간화 TTC 뉴클레오티드 서열) 또는 서열 번호 8의 서열, 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하는 인간화 폴리뉴클레오티드이다. 일부 태양에서, TTC는 서열 번호 8의 서열 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 이것으로 이루어지거나, 이것으로 본질적으로 이루어진다.

일부 태양에서, TTC는, 예컨대, 서열 번호 9, 10, 또는 11의 서열을 포함하는 mRNA 폴리뉴클레오티드 서열이다.

일부 태양에서, TTC는

(a) 서열 번호 2 또는 서열 번호 5의 서열, 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하는 폴리펩티드;

(b) 서열 번호 2 또는 서열 번호 5의 서열, 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체로 이루어지는 폴리펩티드;

(c) 서열 번호 1 또는 서열 번호 6의 서열, 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하는 폴리뉴클레오티드;

(d) 서열 번호 1 또는 서열 번호 6의 서열, 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는,

(e) 이들의 조합을 포함한다.

다른 태양에서, TTC는

(a) TTC 폴리펩티드가 유일한 치료적 모이어티인 융합 단백질 또는 접합체;

(b) 적어도 2개의 치료적 모이어티들을 포함하고, TTC 폴리펩티드가 치료적 모이어티들 중 하나인, 융합 단백질, 또는 접합체;

(c) TTC 폴리펩티드가 유일한 치료적 모이어티인 융합 단백질을 인코딩하는 핵산;

(d) 적어도 2개의 치료적 모이어티들을 포함하고, TTC 폴리펩티드가 치료적 모이어티들 중 하나인, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산; 또는,

(e) 이들의 조합을 포함한다.

일부 태양에서, TCC는 네이키드 DNA로 투여되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 태양에서, TCC는 경구, 비경구, 근육내, 또는 비강 투여될 수 있다. 일부 태양에서, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 TTC 폴리펩티드는 근육 내로 투여될 수 있다. 특정 태양에서, 그러한 TTC 폴리뉴클레오티드는 상기 근육에서 TTC 폴리펩티드를 생체내 발현할 수 있다. 일부 태양에서, TTC 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 일부 태양에서, 그러한 벡터는 생체내 발현이 가능하다. 일부 태양에서, 벡터는 상기 벡터에 의해 인코딩된 TTC 폴리펩티드를 발현할 수 있는 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 태양에서, 발현 벡터는 pcDNA3.1 발현 벡터이다. 일부 구체적 태양에서, 프로모터는 pCMV이다. 일부 태양에서, 방법은 포유동물 대상의 생체내에서 실시된다. 일부 태양에서, 그러한 포유동물 대상은 인간이다. 일부 태양에서, 그러한 포유동물 대상은 비-인간이다. 일부 태양에서, 방법은 적합한 벡터 내로 TTC 폴리뉴클레오티드를 삽입하는 단계 및 근육 세포를 형질감염시켜 근육 세포가 TTC 폴리펩티드를 발현하도록 하는 단계를 포함한다. 일부 태양에서, 세포는 일시적으로 형질감염된다. 다른 태양에서, 세포는 안정적으로 형질감염된다. 일부 태양에서, 형질감염된 세포는 자가 세포이다. 다른 태양에서, 형질감염된 세포는 이종 세포이다. 또 다른 태양에서, 형질감염된 세포는 줄기 세포이다. 일부 태양에서, 형질감염은 대상의 생체내에서 실시될 수 있다. 다른 태양에서, 형질감염은 생체외에서 실시될 수 있다.

대상에게 투여될 수 있는 TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)의 양은, 일반적으로, 치료적 유효량이다. TTC의 그러한 치료적 유효량은 하기 파라미터들 중 하나 이상에서 검출가능한 증가를 야기할 수 있다: 체중, 근육량 (예컨대, 전경골 (TA) 질량, 비복근 (gastrocnemius) (GA) 질량, 사두근 (quadriceps) 근육량 등), 근육 강도/힘, 근육 기능, 또는 이들의 임의의 조합. 예를 들어, 이를 필요로 하는 대상 (예컨대, 근육량 및/또는 근육 강도의 손실이 일어나는 질병, 질환, 또는 장애를 앓고 있는 대상)에게 투여될 때, TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)의 치료적 유효량은, 대조 처리된 대상과 비교하여, 예를 들어 TA 또는 GA에서, 위에 기재된 파라미터들의 임의의 조합의 적어도 약 2%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75% 또는 그 이상의 증가를 야기할 수 있다.

일부 태양에서, TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)는 본 명세서에 개시된 방법에 따라, TCC가 TTC 폴리펩티드일 경우에는 약 0.04 mg/㎏의 용량으로; 또는 TCC가 TCC 폴리뉴클레오티드 (예컨대, 플라스미드 형태의 TTC, 예컨대 실시예 부분에 개시된 pCMV-TTC 플라스미드)일 경우에는 약 1.22 mg/㎏의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 태양에서, TTC 폴리펩티드는 약 0.010 mg/㎏, 약 0.015 mg/㎏, 약 0.020 mg/㎏, 약 0.025 mg/㎏, 약 0.030 mg/㎏, 약 0.035 mg/㎏, 약 0.040 mg/㎏, 약 0.050 mg/㎏, 약 0.055 mg/㎏, 약 0.060 mg/㎏, 약 0.065 mg/㎏, 약 0.070 mg/㎏, 또는 약 0.075 mg/㎏의 용량으로 투여될 수 있다. 다른 태양에서, TTC 폴리뉴클레오티드 (예컨대, 실시예에 개시된 바와 같은 TTC 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드)는 약 0.10 mg/㎏, 약 0.15 mg/㎏, 약 0.20 mg/㎏, 약 0.25 mg/㎏, 약 0.30 mg/㎏, 약 0.35 mg/㎏, 약 0.40 mg/㎏, 약 0.45 mg/㎏, 약 0.50 mg/㎏, 약 0.55 mg/㎏, 약 0.60 mg/㎏, 약 0.65 mg/㎏, 약 0.70 mg/㎏, 약 0.75 mg/㎏, 약 0.80 mg/㎏, 약 0.85 mg/㎏, 약 0.90 mg/㎏, 약 0.95 mg/㎏, 약 1.00 mg/㎏, 약 1.05 mg/㎏, 약 1.10 mg/㎏, 약 1.15 mg/㎏, 약 1.20 mg/㎏, 약 1.25 mg/㎏, 약 1.30 mg/㎏, 약 1.35 mg/㎏, 약 1.40 mg/㎏, 약 1.45 mg/㎏, 약 1.50 mg/㎏, 약 1.55 mg/㎏, 약 1.60 mg/㎏, 약 1.65 mg/㎏, 약 1.70 mg/㎏, 약 1.75 mg/㎏, 약 1.80 mg/㎏, 약 1.85 mg/㎏, 약 1.90 mg/㎏, 약 1.95 mg/㎏, 약 2.00 mg/㎏, 약 2.05 mg/㎏, 약 2.10 mg/㎏, 약 2.15 mg/㎏, 약 2.20 mg/㎏, 약 2.20 mg/㎏, 약 2.25 mg/㎏, 약 2.30 mg/㎏, 약 2.35 mg/㎏, 약 2.40 mg/㎏, 약 2.45 mg/㎏, 또는 약 2.50 mg/㎏의 용량으로 투여될 수 있다.

일부 태양에서, TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)는 고정된 용량으로 투여될 수 있다. 다른 태양에서, TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)는 가변 용량으로 투여될 수 있다. 일부 태양에서, TTC는 단회 용량으로 투여될 수 있다. 다른 태양에서, TTC는 다회 용량으로 투여될 수 있으며, 예를 들어 2회 이상의 용량이 매일, 매주, 격주, 또는 매월 투여될 수 있다.

TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)는, 예컨대 성장 인자 억제제, 면역억제제, 항염증제, 대사 억제제, 효소 억제제, 및 세포독성제/세포정지제 (cytostatic agent)를 포함하는 하나 이상의 추가적인 치료제와 함께 본 발명의 방법에 따라 투여될 수 있다. 추가적인 치료제(들)는 TTC의 투여 전, 투여와 동시에, 또는 투여 후에 투여될 수 있다.

IV. TTC 효과를 검출하기 위한 바이오마커

본 발명은 또한, 예를 들어, TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)의 효과를 평가하기 위한, 대상이 TTC에 의한 치료에 대한 후보자인지를 결정하기 위한, TCC에 의한 치료 전, 치료 동안, 또는 치료 후의 질병 또는 장애의 진행을 모니터링하기 위한 바이오마커를 제공한다. 일부 태양에서, 본 명세서에 개시된 방법은 Col19a1 (콜라겐 알파-1(XIX) 사슬; UniProtKB: Q14993), Snx10 (소팅 넥신 10; UniProtKB: Q9Y5X0), Calm1 (칼모듈린 (Calmodulin) 1 (포스포릴라제 키나제, 델타); UniProtKB: P62158), Mef2C (근세포 증강 인자 (Myocyte Enhancer Factor 2C); UniProtKB: Q06413), 및 Col1A1 (콜라겐, 타입 I, 알파 1; UniProtKB: P02452)로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이오마커의 수준의 측정을 요구한다.

용어 "바이오마커 수준"은, 예를 들어 생물학적 샘플에서, 본 명세서에 개시된 바이오마커 (예컨대, Col19a1, Snx10, Calm1, Mef2c, 또는 Col1A1)의 존재 또는 발현 (단백질 발현 또는 유전자 발현)을 검출하기 위한 임의의 분석적 방법을 사용하여 행해지고, 생물학적 샘플에서 바이오마커의, 바이오마커에 대한, 또는 바이오마커에 상응하는 존재, 부재, 절대량 또는 절대 농도, 상대량 또는 상대 농도, 역가, 발현 수준, 측정된 수준의 비 등을 나타내는 측정치를 말한다. "값" 또는 "수준"의 정확한 본질은 바이오마커를 검출하기 위해 사용되는 특정 분석 방법 (예컨대, 면역검정법, 질량 분석법, 생체내 분자 영상, 유전자 발현 프로파일링, 앱타머-기반 검정법 등)의 구체적 설계 및 성분에 의존한다.

본 명세서에 개시된 바이오마커 (예컨대, Col19a1, Snx10, Calm1, Mef2c, 또는 Col1A1)와 관련하여 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "상승된", "상승된 수준", 또는 "높은 수준"은 정상 수준 또는 범위보다 높은 생물학적 샘플 (예컨대, 근육 조직 샘플)에서의 수준을 말한다. 본 명세서에 개시된 바이오마커 (예컨대, Col19a1, Snx10, Calm1, Mef2c, 또는 Col1A1)에 대한 정상 수준 또는 범위는 표준 실무에 따라 정의된다. 따라서, 특정 생물학적 샘플에서 측정된 수준은 유사한 정상 샘플에서 결정된 수준 또는 범위와 비교될 수 있다. 이러한 문맥에서, 정상 샘플은 TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)로 처리되지 않은 개인으로부터 얻어진 샘플일 것이다. 바이오마커의 수준은 바이오마커가 테스트 샘플에서 정상 샘플에서보다 높은 수준 또는 범위로 존재하는 경우에 상승되었다고 한다.

바이오마커 수준 (발현된 단백질 수준, 또는 핵산 수준, 예컨대 mRNA 수준)은 당업자에게 잘 공지된 다수의 방법들 중 어느 하나에 의해 검출되고 정량될 수 있다. 이러한 방법은 분석적 생화학적 방법, 예컨대 전기영동, 모세관 전기영동, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 박층 크로마토그래피 (TLC), 고확산 크로마토그래피, 질량 분석법 등, 또는 다양한 면역학적 방법, 예컨대 유체 또는 겔 침전 반응, 면역확산 (단일 또는 이중), 면역조직화학, 친화성 크로마토그래피, 면역전기영동, 방사면역검정법 (RIA), 효소-결합 면역흡착 검정법 (ELISA), 면역형광 검정법, 웨스턴 블롯팅 등을 포함한다.

일 태양에서, 바이오마커는 전기영동 폴리펩티드 분리 (예컨대, 1- 또는 2-차원 전기영동)에서 검출되고/되거나 정량될 수 있다. 전기영동 기술을 사용하여 폴리펩티드를 검출하는 수단은 당업자에게 잘 공지되어 있다 (전반적으로, 문헌[R. Scopes (1982) Polypeptide Purification, Springer-Verlag, N.Y.]; 문헌[Deutscher, (1990) Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Polypeptide Purification, Academic Press, Inc., N.Y.] 참조). 이러한 태양의 변형은 샘플 내 바이오마커의 존재를 검출하고 정량하기 위해 웨스턴 블롯 (면역블롯) 분석을 사용한다. 일반적으로 이러한 기술은 분자량을 기초로 하여 겔 전기영동에 의해 샘플 폴리펩티드를 분리하는 단계, 분리된 폴리펩티드를 적합한 고체 지지체 (예컨대, 니트로셀룰로스 필터, 나일론 필터, 또는 유도체화된 나일론 필터)로 전달하는 단계, 및 샘플을 피분석물과 특이적으로 결합하는 항체와 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 피분석물과 특이적으로 결합하는 항체는 직접 표지될 수 있거나, 또는 대안적으로, 일차 항체의 도메인에 특이적으로 결합하는 표지된 항체 (예컨대, 표지된 양 항-마우스 항체)를 사용하여 후속으로 검출될 수 있다.

일부 태양에서, 샘플 및/또는 바이오마커는 검출 및/또는 정량 검정 과정에서 어떠한 방식으로 변형된다. 예를 들어, 샘플은 바이오마커가 적어도 하나의 다른 샘플 성분으로부터 분리되도록 분획화될 수 있다. 일부 태양에서, 바이오마커는 액체 분획에서 회수될 수 있거나 분리 매질, 예컨대 겔에 봉입되어 있는 동안 검출될 수 있다.

구체적 태양에서, 바이오마커는 면역검정법을 사용하여 생물학적 샘플에서 검출되고/되거나 정량된다. 면역검정법의 전반적인 리뷰를 위해, 또한 문헌[Methods in Cell Biology Volume 37: Antibodies in Cell Biology, Asai, ed. Academic Press, Inc. New York (1993)]; 문헌[Basic and Clinical Immunology 7th Edition, Stites & Terr, eds. (1991)]을 참조한다. 일부 태양에서, 면역검정법은 특이적 바이오마커를 인식하는 하나 이상의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용할 수 있다.

소정 태양에서, 면역검정법은 샌드위치 면역검정법, 예컨대, 효소-결합 면역흡착 검정법 (ELISA) 또는 샌드위치 전기화학발광 (ECL) 검정법을 포함하는데, 여기서는 제1 "포획" 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 고체 지지체에 부착하고, 샘플 또는 표준으로부터의 항원을 포획 항체에 결합되게 하고, 이어서 제2 "검출" 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 첨가하고 효소적 반응, ECL 반응, 방사능, 또는 다른 검출 방법에 의해 검출한다.

공지된 대조 샘플과의 비교에 기초하여, "바이오마커 역치 수준"이 결정될 수 있고, 바이오마커 역치 수준 (예컨대, Snx10 단백질 발현 및/또는 유전자 발현 역치 수준)을 초과하는 테스트 샘플은 샘플을 채취한 환자가 TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)에 의한 처리로부터 이익을 얻을 수 있다는 것을 나타낼 수 있다. 바이오마커 역치 수준 (예컨대, 단백질 발현 수준 또는 유전자 발현 수준)은 미리 정해져야 하고, 샘플의 타입, 질병의 타입, 및 경우에 따라서는, 사용되는 검정법에 대해 매칭되어야 한다. 예를 들어, Col10a1 또는 Snx10에 대한 역치 수준은 본 명세서에 제공된 실험 데이터로부터 결정될 수 있다.

특정 태양에서, 본 명세서에 개시된 방법은 적어도 부분적으로 바이오마커 수준 (예컨대, Col19a1, Snx10, Calm1, Mef2c, Col1A1, 또는 이들의 임의의 조합의 수준)을 기초로 하여 바이오마커 검정법 및/또는 진단의 결과를 대상에게 알리는 단계를 포함한다. 환자에게는 구두로, 서면으로, 그리고/또는 전자적으로 통지될 수 있다. 이러한 진단은 또한 환자 의료 기록에 기록될 수 있다.

본 명세서에 개시된 방법은 또한, 예컨대, 근육량의 손실 및/또는 근육 강도의 손실이 일어나는 질병 또는 장애에 대한 예방 및/또는 요법을 처방, 개시, 및/또는 변경하는 단계를 포함한다. 소정 태양에서, 방법은 하나 이상의 추가적인 검정법을 지시하고/하거나 실시하는 단계를 수반할 수 있다.

V. 바이오마커를 사용한 진단 및 치료의 방법

본 발명은 근육량의 손실 및/또는 근육 강도의 손실과 관련된 질병 또는 질환을 갖는 환자를 치료하는 방법을 제공하고, 본 방법은 환자로부터 채취한 샘플에서 Col19a1 (콜라겐 알파-1(XIX) 사슬) 및/또는 Snx10 (소팅 넥신 10)의 수준이 미리 정해진 Col19a1 및/또는 Snx10 역치 수준을 초과하거나, 1개 이상의 대조 샘플에서의 Col19a1 및/또는 Snx10 수준을 초과하는 경우 치료적 유효량의 TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)를 대상에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 투여는 대상에서 (i) 근육량을 증가시키고/시키거나, (ii) 근육 강도를 증가시키고/시키거나, (iii) 회복 또는 치유 속도를 증가시키고/시키거나, (iv) 상기 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증을 감소시키는 데 효과적이다.

또한, 근육량의 손실 및/또는 근육 강도의 손실과 관련된 질병 또는 질환을 갖는 환자를 치료하는 방법이 제공되고, 본 방법은 (a) Col19a1 및/또는 Snx10의 수준 측정을 위해 환자로부터 채취한 샘플을 제출하는 단계, 및 (b) 환자로부터 채취한 샘플에서 Col19a1 및/또는 Snx10의 수준이 미리 정해진 Col19a1 및/또는 Snx10 역치 수준을 초과하거나, 1개 이상의 대조 샘플에서의 Col19a1 및/또는 Snx10 수준을 초과하는 경우 치료적 유효량의 TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)를 대상에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 투여는 대상에서 (i) 근육량을 증가시키고/시키거나, (ii) 근육 강도를 증가시키고/시키거나, (iii) 회복 또는 치유 속도를 증가시키고/시키거나, (iv) 상기 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증을 감소시키는 데 효과적이다.

본 발명은 또한, 근육량의 손실 및/또는 근육 강도의 손실과 관련된 질병 또는 질환을 갖는 환자를 치료하는 방법을 제공하고, 본 방법은 (a) 환자로부터 채취한 샘플을 제출하여 Col19a1 및/또는 Snx10의 수준을 측정하는 단계, (b) 환자의 Col19a1 및/또는 Snx10 수준이 미리 정해진 Col19a1 및/또는 Snx10 역치 수준을 초과하는지, 또는 1개 이상의 대조 샘플에서의 Col19a1 및/또는 Snx10 수준을 초과하는지를 결정하는 단계, 및 (c) 치료적 유효량의 TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)를 대상에게 투여하도록 의료 제공자에게 권고하는 단계를 포함하고, 상기 투여는 대상에서 (i) 근육량을 증가시키고/시키거나, (ii) 근육 강도를 증가시키고/시키거나, (iii) 회복 또는 치유 속도를 증가시키고/시키거나, (iv) 상기 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증을 감소시키는 데 효과적이다.

또한, 근육량의 손실 및/또는 근육 강도의 손실과 관련된 질병 또는 질환으로 진단받은 환자를 치료할지를 결정하는 방법이 제공되고, 본 방법은 (a) 환자로부터 얻은 샘플에서 Col19a1 및/또는 Snx10의 수준을 측정하거나, 이를 측정하기 위해 임상 검사를 지시하는 단계; 및 (b) 샘플에서 환자의 Col19a1 및/또는 Snx10 수준이 미리 정해진 Col19a1 및/또는 Snx10 역치 수준을 초과하거나, 1개 이상의 대조 샘플에서의 Col19a1 및/또는 Snx10 수준을 초과하는 경우 TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)를 투여함으로써 환자를 치료하거나, 치료하도록 의료 제공자에게 지시하는 단계를 포함하고, 상기 투여는 대상에서 (i) 근육량을 증가시키고/시키거나, (ii) 근육 강도를 증가시키고/시키거나, (iii) 회복 또는 치유 속도를 증가시키고/시키거나, (iv) 상기 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증을 감소시키는 데 효과적이다.

또한, TTC 치료 계획 (therapeutic regimen)으로의 치료를 위한 후보자로서 근육량의 손실 및/또는 근육 강도의 손실과 관련된 질병 또는 질환으로 진단받은 환자를 선택하는 방법이 제공되고, 본 방법은 (a) 환자로부터 얻은 샘플에서 Col19a1 및/또는 Snx10의 수준을 측정하거나, 이를 측정하기 위해 임상 검사를 지시하는 단계; 및 (b) 샘플에서 환자의 Col19a1 및/또는 Snx10 수준이 미리 정해진 Col19a1 및/또는 Snx10 역치 수준을 초과하거나, 1개 이상의 대조 샘플에서의 Col19a1 및/또는 Snx10 수준을 초과하는 경우 TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)를 투여함으로써 환자를 치료하거나, 치료하도록 의료 제공자에게 지시하는 단계를 포함하고, 상기 투여는 대상에서 (i) 근육량을 증가시키고/시키거나, (ii) 근육 강도를 증가시키고/시키거나, (iii) 회복 또는 치유 속도를 증가시키고/시키거나, (iv) 상기 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증을 감소시키는 데 효과적이다.

일부 태양에서, 위에 개시된 바이오마커를 사용한 진단 및 치료 방법은 또한 적어도 추가적인 바이오마커, 예를 들어, Calm1 (칼모듈린 1 (포스포릴라제 키나제, 델타); UniProtKB: P62158), Mef2C (근세포 증강 인자 2C; UniProtKB: Q06413), 또는 Col1A1 (콜라겐, 타입 I, 알파 1; UniProtKB: P02452)의 수준을 결정하는 단계를 포함한다.

일부 태양에서, 환자의 바이오마커 수준 (예컨대, Col19a1, Snx10, Calm1, Mef2c, Col1A1, 또는 이들의 임의의 조합의 수준)은 소정의 바이오마커를 인식하는 하나 이상의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하는 면역검정법에서 측정될 수 있다. 다른 태양에서, 환자의 바이오마커 수준 (예컨대, DNA 및/또는 RNA 수준)은 소정의 바이오마커 유전자에 특이적으로 혼성화될 수 있는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 검정법에서 측정된다.

소정 태양에서, 검출 검정법 (예컨대, 면역검정법)은 환자를 치료하는 의료 전문가에 의해 (예컨대, 본 명세서에 기재되고 "현장 (point of care)" 진단 키트로서 체계화된 바와 같은 면역검정법을 사용하여) 환자로부터 얻은 샘플 (예컨대, 근육 조직 샘플)에 대해 실시될 수 있다. 일부 태양에서는, 샘플이 환자로부터 얻어지고, 의료 전문가의 지시에 따라 (예컨대, 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역검정법을 사용하여) 샘플 내 바이오마커 수준의 측정을 위해, 예컨대, 임상 검사실에 제출된다. 소정 태양에서, 검정법을 실시하는 임상 검사실은 환자의 바이오마커 수준이 미리 정해진 바이오마커 역치값을 초과하거나 하나 이상의 대조 샘플에 비해 상승되는지를 기초로 하여 환자가 TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)의 처리로부터 이익을 얻을 수 있는지에 대해 의료 제공자에게 조언할 것이다.

본 명세서에 제공된 모든 치료 방법의 태양들 중 소정 태양에서, TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)의 "부하 (loading)" 용량이 환자에서 원하는 치료적 수준을 달성하도록 투여된다. 부하 용량이 환자의 바이오마커 수준 (예컨대, 단백질 발현 수준 또는 유전자 발현 수준)에 유의하게 영향을 미치지 않거나 환자의 바이오마커 수준이 감소하는 경우, 치료를 중단하도록 결정될 수 있다. 부하 용량이 환자에서 일정한 또는 증가된 바이오마커 수준을 가져오는 경우, 용량 크기 또는 빈도를 "유지" 용량으로 감소시키도록 결정될 수 있다. 본 명세서에 제공된 방법은 치료를 실시하는 의료 제공자를 위한 가이드라인이고, 궁극적인 치료 결정은 의료 제공자의 올바른 판단에 기초할 것임을 아는 것이 중요하다.

소정 태양에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 면역검정법의 결과는 환자의 보험이 TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)에 의한 치료를 보장할 것인지의 결정을 위해 의료 혜택 제공자에게 제출될 수 있다.

유사하게, 본 발명은 대상에서 TTC 치료 계획의 치료적 효능을 모니터링하는 방법을 제공하고, 본 방법은 환자로부터 얻은 제1 샘플에서 바이오마커 수준 (예컨대, 단백질 발현 수준 또는 유전자 발현 수준)을 측정하거나, 이를 측정하도록 임상 검사실에 지시하는 단계; 제1 샘플에서의 환자의 바이오마커 수준 (예컨대, Col19a1, Snx10, Calm1, Mef2c, Col1A1, 또는 이들의 임의의 조합의 수준)이 미리 정해진 역치 바이오마커 수준 미만이거나, 또는 하나 이상의 대조 샘플에서의 바이오마커 수준 (예컨대, Col19a1, Snx10, Calm1, Mef2c, Col1A1, 또는 이들의 임의의 조합의 수준)에 비해 상승되는 경우, TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)를 환자에게 투여하거나, 이를 투여하도록 의료 전문가에게 조언하는 단계; 환자로부터 얻은 제2 샘플에서 바이오마커 수준을 측정하고 - 여기서, 환자의 바이오마커 수준이 다시 측정됨 -, 제2 샘플에서 환자의 바이오마커 수준이 제1 샘플에서 측정된 바이오마커 수준보다 높은지, 거의 동일한지, 또는 낮은지를 결정하거나, 이를 나타내는 결과를 얻는 단계를 포함하고; 여기서, 제2 샘플에서 환자의 바이오마커 수준이 제1 샘플에서의 바이오마커 수준보다 높거나 거의 동일한 경우, TTC 치료 계획은 효과적이다.

일부 태양에서, 역치는 대조 상태에 대해 단백질 또는 유전자 발현의 증가가 약 1배, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 또는 약 10배이다. 일부 태양에서, 역치는 대조 상태에 대해 단백질 또는 유전자 발현의 감소가 약 1배, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 또는 약 10배이다.

일부 태양에서, 역치는 환자 집단의 중앙값에 대해 단백질 또는 유전자 발현의 증가가 약 1배, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 또는 약 10배이다. 일부 태양에서, 역치는 환자 집단의 중앙값에 대해 단백질 또는 유전자 발현의 감소가 약 1배, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 또는 약 10배이다.

소정 태양에서, TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)에 의한 처리를 위한 후보자로서의 환자를 확인하는 데 사용되는 1개 이상의 대조 샘플은 정상적인 건강한 개인으로부터 얻어진다. 다른 태양에서, TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)에 의한 처리를 위한 후보자로서의 환자를 확인하는 데 사용되는 1개 이상의 대조 샘플은 환자와 동일한 질병 또는 질환을 갖는 대상들의 집단의 평균값으로부터 얻어진다.

VI. 약제학적 조성물

본 발명은 희석제, 담체, 또는 부형제와 함께 제형화되는, TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)를 포함하는 제형을 제공한다. 본 발명은 또한 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체, 또는 부형제와 함께 제형화되는, TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 그러한 제형 또는 약제학적 조성물은, 예를 들어, 제한 없이, 둘 이상의 상이한 TTC 화합물들, 예컨대, TTC 폴리펩티드 및 TTC 폴리뉴클레오티드 중 하나 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 제형 또는 약제학적 조성물은 상이한 작용 기전을 갖는 TTC 화합물들 (예컨대, 투여 직후 효과적이게 될 TTC 폴리펩티드 및 제자리에서 (in situ) 발현되어야 할 TTC 폴리뉴클레오티드), 또는 상보적 활성들을 갖는 TTC 화합물들 (예컨대, 짧은 혈장 반감기를 갖는 TTC 폴리펩티드, 및 장시간-작용 TTC 폴리펩티드 접합체)의 조합을 포함할 수 있다.

TTC를 포함하는 약제학적 또는 멸균 조성물을 제조하기 위해, TTC는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합될 수 있다. 치료제 및 진단제의 제형은, 예컨대 동결건조 분말, 슬러리, 수용액, 로션, 또는 현탁액의 형태로, 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제와 혼합됨으로써 제조될 수 있다.

TTC (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합)를 포함하는 약제학적 조성물은 또한 병용 요법으로 투여될 수 있는데, 예컨대, 다른 작용제와 병용될 수 있다. 예를 들어, 병용 요법은 TTC를 적어도 하나의 다른 요법과 병용된 상태로 포함할 수 있는데, 여기서 요법은 수술, 면역요법, 화학요법, 방사선 치료, 또는 약물 요법일 수 있다.

약제학적 화합물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 염을 포함할 수 있다. 그러한 염의 예는 산 부가 염 및 염기 부가 염을 포함한다. 산 부가 염은 무독성 무기산, 예컨대 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아인산 등으로부터 유도된 것, 및 무독성 유기산, 예컨대 지방족 모노- 및 다이카르복실산, 페닐-치환된 알칸산, 하이드록시 알칸산, 방향족산, 지방족 및 방향족 설폰산 등으로부터 유도된 것을 포함한다. 염기 부가 염은 알칼리 토금속, 예컨대 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등으로부터 유도된 것, 및 무독성 유기 아민, 예컨대 Ν,Ν'-다이벤질에틸렌다이아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 프로카인, 다이에탄올아민, 에틸렌다이아민 등으로부터 유도된 것을 포함한다.

약제학적 조성물은 또한 약제학적으로 허용되는 항산화제를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 항산화제의 예는 (i) 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 중황산나트륨, 메타아황산나트륨, 아황산나트륨 등; (ii) 지용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시아니솔 (BHA), 부틸화 하이드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (iii) 금속 킬레이트제, 예컨대 시트르산, 에틸렌다이아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을 포함한다.

본 명세서에 개시된 약제학적 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수용성 및 비수용성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브유, 및 주사용 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올리에이트를 포함한다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅 물질, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산물의 경우에는 필요 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.

이러한 약제학적 조성물은 또한 애쥬번트 (adjuvant), 예컨대 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수 있다. 미생물의 존재의 방지는 멸균 절차에 의해 그리고 또한 다양한 항세균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등의 포함에 의해서도 보장될 수 있다. 또한, 조성물 내에 등장제, 예컨대 당, 염화나트륨 등을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 추가로, 주사용 약제학적 형태의 지속된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 포함에 의해 실현될 수 있다.

약제학적 조성물은 제조 및 저장의 조건 하에서 멸균 상태이고 안정한 상태일 수 있다. 조성물은 높은 약물 농도에 적합한 용액, 마이크로에멀젼, 리포솜, 또는 다른 체계적인 구조로 제형화될 수 있다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산물의 경우에는 필요 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우, 조성물 내에 등장제, 예를 들어, 당, 폴리-알코올, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 적합할 수 있다. 주사용 조성물의 지속된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 실현될 수 있다.

멸균 주사 용액은 위에 열거된 성분들 중 하나 또는 이들의 조합과 함께 적절한 용매 내에 필요량의 활성 화합물을 포함시킨 후, 필요에 따라, 멸균 미세여과를 행함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산물은 염기성 분산매 및 위에 열거된 것들로부터 필요한 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클 내로 활성 화합물을 포함시킴으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 적절한 제조 방법은 진공 건조 및 냉동-건조 (동결건조) 단계를 포함하는데, 이들 단계는 미리 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분 및 임의의 추가적인 원하는 성분의 분말을 산출한다.

일 태양에서, 본 명세서의 조성물에는 엔도톡신 및/또는 관련 발열성 물질이 실질적으로 없는 발열물질-무함유 제형이다. 엔도톡신은, 미생물 내에 포획되어 미생물이 파괴되거나 죽을 때 방출되는 독소를 포함한다. 발열성 물질은 또한 세균 및 다른 미생물의 외막으로부터의 열 유발성의 열안정성 물질 (당단백질)을 포함한다. 이들 물질 둘 모두는 인간에게 투여되는 경우 열, 저혈압 및 쇼크를 야기할 수 있다. 잠재적인 유해 효과로 인해, 정맥내 투여되는 약제학적 약물 용액으로부터 소량의 엔도톡신이라도 적절하게 제거될 수 있다. 미국 식품의약국 (Food & Drug Administration) ("FDA")은 정맥내 약물 적용에 대하여 단일 1시간 기간에 체중 킬로그램당 용량당 5 엔도톡신 단위 (EU)의 상한치를 설정하였다. 치료적 단백질이 체중 킬로그램당 수백 또는 수천 밀리그램의 양으로 투여될 때 미량의 엔도톡신이라도 적절하게 제거될 수 있다.

일 태양에서, 조성물 내 엔도톡신 및 발열물질 수준은 10 EU/mg 미만, 5 EU/mg 미만, 1 EU/mg 미만, 0.1 EU/mg 미만, 0.01 EU/mg 미만, 또는 0.001 EU/mg 미만이다. 소정 실시 형태에서, 조성물 내 엔도톡신 및 발열물질 수준은 약 10 EU/mg 미만, 약 5 EU/mg 미만, 약 1 EU/mg 미만, 또는 약 0.1 EU/mg 미만, 약 0.01 EU/mg 미만, 또는 약 0.001 EU/mg 미만이다.

다양한 전달 시스템이 공지되어 있고 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 데 사용될 수 있는데, 예컨대, 리소좀 내로의 캡슐화, 마이크로입자, 마이크로캡슐, TTC를 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개 엔도사이토시스 (예컨대, 문헌[Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432] 참조) 등이다. 투여의 방법은 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외, 및 경구 경로를 포함하지만 이로 제한되지는 않는다. 조성물은 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들어 주입 (infusion) 또는 볼루스 (bolus) 주사에 의해, 상피 또는 점막피부 내벽을 통한 흡수에 의해 (예컨대, 구강 점막, 직장 및 장내 점막 등) 투여될 수 있고, 다른 생물학적으로 활성인 작용제와 함께 투여될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 표준 바늘 및 주사기로 피하 또는 정맥내 전달될 수 있다. 추가로, 피하 전달에 대해서는, 펜 전달 장치 (pen delivery device)가 본 발명의 약제학적 조성물을 전달하는 데 용이하게 응용된다. 그러한 펜 전달 장치는 재사용가능하거나 일회용일 수 있다. 재사용가능한 펜 전달 장치는 일반적으로 약제학적 조성물을 함유하는 교체식 카트리지를 이용한다. 일단 카트리지 내의 모든 약제학적 조성물이 투여되고 카트리지가 비게 되면, 빈 카트리지는 용이하게 폐기되고 약제학적 조성물을 함유하는 새로운 카트리지로 교체될 수 있다. 이어서, 펜 전달 장치는 재사용될 수 있다. 일회용 펜 전달 장치에는, 교체식 카트리지가 없다. 오히려, 일회용 펜 전달 장치는 장치 내의 저장소 내에 보유된 약제학적 조성물로 사전 충전된다. 일단 저장소에서 약제학적 조성물이 없어지면, 전체 장치는 폐기된다.

많은 재사용가능한 펜 및 자기주사기 (autoinjector) 전달 장치는 본 발명의 약제학적 조성물의 피하 전달에 응용된다. 예는, 몇 개만 언급하자면, 오토펜 (AUTOPEN)™ (영국 우드스톡 소재의 오웬 멈포드, 인크. (Owen Mumford, Inc.)), 디세트로닉 (DISETRONIC)™ 펜 (스위스 베르그도르프 소재의 디세트로닉 메디칼 시스템즈 (Disetronic Medical Systems), 휴마로그 믹스 (HUMALOG MIX) 75/25™ 펜, 휴마로그™ 펜, 휴마린 (HUMALIN) 70/30™ 펜 (미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재의 엘리 릴리 앤 컴퍼니 (Eli Lilly and Co.)), 노보펜 (NOVOPEN)™ I, II 및 III (덴마크 코펜하겐 소재의 노보 노르디스크 (Novo Nordisk)), 노보펜 주니어 (NOVOPEN JUNIOR)™ (덴마크 코펜하겐 소재의 노보 노르디스크), BD™ 펜 (미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재의 벡톤 디킨슨 (Becton Dickinson)), 옵티펜 (OPTIPEN)™, 옵티펜 프로 (OPTIPEN PRO)™, 옵티펜 스타렛 (OPTIPEN STARLET)™, 및 옵티클릭 (OPTICLIK)™ (독일 프랑크푸르트 소재의 사노피-아벤티스 (Sanofi-Aventis)))을 포함하지만 이로 제한되지는 않는다. 본 발명의 약제학적 조성물의 피하 전달에 응용되는 일회용 펜 전달 장치의 예는, 몇 개만 언급하자면, 솔로스타 (SOLOSTAR)™ 펜 (사노피-아벤티스), 플렉스펜 (FLEXPEN)™ (노보 노르디스크), 및 퀵펜 (KWIKPEN)™ (엘리 릴리), 슈어클릭 (SURECLICK)™ 자기주사기 (미국 캘리포니아주 사우전드 오크스 소재의 암젠 (Amgen)), 펜렛 (PENLET)™ (독일 슈투트가르트 소재의 하셀마이어 (Haselmeier)), 에피펜 (EPIPEN) (데이, 엘.피. (Dey, L.P.)), 및 휴미라 (HUMIRA)™ 펜 (미국 일리노이주 애보트 파크 소재의 애보트 랩스 (Abbott Labs))을 포함하지만 이로 제한되지는 않는다.

소정의 상황에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 제어된 방출 시스템에서 전달될 수 있다. 일 실시 형태에서, 펌프가 사용될 수 있다 (문헌[Langer, supra: Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201] 참조). 다른 실시 형태에서, 고분자 물질이 사용될 수 있고, 문헌[Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Fla]을 참조한다. 또 다른 실시 형태에서, 제어된 방출 시스템은 조성물의 표적 부근에 위치될 수 있으며, 이에 따라 전신 용량의 극히 일부분만을 필요로 한다 (예컨대, 문헌[Goodson, 1984, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138] 참조). 다른 제어된 방출 시스템은 문헌[Langer, 1990, Science 249:1527-1533]에 의한 리뷰에 논의되어 있다.

VII. 제조품 및 키트

본 발명은 또한 하나 이상의 용기에 본 명세서에 개시된 조성물, 예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드, 및 이들의 조합, 및 TTC를 포함하는 약제학적 조성물 중 어느 하나를 포함하는 제조품을 제공한다. 일부 태양에서, 제조품은, 예를 들어, 필요로 하는 대상체에서 근육 성장을 증진하고/하거나 근육 강도를 증가시키고/시키거나 근육량의 손실을 예방하고/하거나 근육 강도의 손실을 예방하기 위하여 제조품의 조성물들을 배합하고/하거나 사용하도록 사용자 (예컨대, 배포자 또는 최종 사용자)를 안내하는, 브로셔, 인쇄된 설명서, 라벨, 또는 포장 삽지 (package insert)를 포함한다. 일부 태양에서, 제조품은, 예를 들어, 미용 목적을 위하여 제조품의 조성물들을 배합하고/하거나 사용하도록, 또는 동물에서 근육 성장을 증진하도록 사용자 (예컨대, 배포자 또는 최종 사용자)를 안내하는, 브로셔, 인쇄된 설명서, 라벨, 또는 포장 삽지를 포함한다.

일부 태양에서, 제조품은, 예를 들어, 병(들), 바이알(들), 카트리지(들), 상자(들), 주사기(들), 주입기(들), 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 태양에서, 라벨은 본 명세서에 개시된 방법에 따라 제조품 내의 조성물 (예컨대, TTC 폴리펩티드, TTC 폴리뉴클레오티드, 및 이들의 조합, 및 TTC를 포함하는 약제학적 조성물)의 사용 또는 투여에 대해 언급한다. 일부 태양에서, 라벨은, 예를 들어, 사용 계획, 근육량 및/또는 근육 강도의 손실이 일어나는 질병, 질환, 또는 장애를 치료, 예방, 또는 개선하기 위한 계획을 제시한다.

본 발명은 또한, 예를 들어, 면역검정법 또는 핵산 검출 방법을 통해 (예컨대, 하나 이상의 바이오마커에서의 단백질 발현 수준 또는 유전자 발현 수준을 결정하기 위해) TTC의 유효성을 검출하기 위한 키트를 제공한다. 그러한 키트는 용기들을 포함할 수 있는데, 이들 용기 각각은 본 방법에서 사용되는 (예컨대, 농축된 형태의) 하나 이상의 다양한 시약을 가지며, 이러한 시약은, 예를 들어, 적어도 하나의 바이오마커 (예컨대, Col19a1, Snx10, Calm1, Mef2c, Col1A1, 또는 이들의 임의의 조합)에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 항체, 또는 적어도 하나의 바이오마커에 대한 cDNA 또는 mRNA에 특이적으로 혼성화될 수 있는 핵산 프로브를 포함한다. 적어도 하나의 바이오마커에 대한 하나 이상의 항체, 예컨대, 포획 항체, 또는 올리고뉴클레오티드 프로브는 고체 지지체에 이미 부착된 채로 제공될 수 있다. 적어도 하나의 바이오마커에 대한 하나 이상의 항체, 예컨대, 검출 항체, 또는 올리고뉴클레오티드 프로브는 검출가능한 표지, 예컨대, 비오틴 또는 루테늄 킬레이트에 이미 접합된 채로 제공될 수 있다.

키트는 또한 본 명세서에 제공된 검정법의 실시를 지원하기 위한 시약 및 기기를 제공할 수 있다. 소정 태양에서는, 표지된 이차 항체가 제공될 수 있는데, 이는 검출 항체에 결합된다. 본 발명에 따라 제공되는 키트는 본 명세서에 제공된 검정법을 실시하는 데 필요한 적합한 용기, 플레이트, 및 임의의 다른 시약 또는 물질을 추가로 포함할 수 있다.

일부 태양에서, 키트는 높은 엄격성 조건으로 바이오마커 (예컨대, Col19a1, Snx10, Calm1, Mef2c, Col1A1, 또는 이들의 임의의 조합 모두 또는 이의 일부를 인코딩하는 핵산)의 하위서열 (subsequence)에 혼성화될 수 있는 하나 이상의 핵산 프로브 (예컨대, 천연적으로 발생한 그리고/또는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 단위를 포함하는 올리고뉴클레오티드)를 포함한다. 일부 태양에서, 높은 엄격성 조건 하에서 바이오마커의 하위서열에 혼성화될 수 있는 하나 이상의 핵산 프로브 (예컨대, 천연적으로 발생한 그리고/또는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 단위를 포함하는 올리고뉴클레오티드)는 마이크로어레이 칩에 부착된다.

본 발명에 따라 제공되는 키트는 또한 과정을 설명하는 브로셔 또는 설명서를 포함할 수 있다. 테스트 키트는 하나 이상의 바이오마커 검출 검정법, 예컨대, 면역검정법 또는 핵산 검출 검정법을 수행하기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 키트에 포함되는 설명서는 포장 재료에 부착될 수 있거나 포장 삽지로서 포함될 수 있다. 설명서는 전형적으로 서면으로 된 자료 또는 인쇄물이지만, 이는 그러한 것에 제한되지는 않는다. 그러한 설명서를 저장할 수 있고 이를 최종 사용자에게 전달할 수 있는 임의의 매체가 고려된다. 그러한 매체는 전자식 저장 매체 (예컨대, 자기 디스크, 테이프, 카트리지, 칩), 광학 매체 (예컨대, CD ROM) 등을 포함하지만 이로 제한되지는 않는다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "설명서"는 설명서를 제공하는 인터넷 사이트의 주소를 포함할 수 있다.

VIII. 실시 형태

E1. 감소된 근육량 및/또는 근육 강도와 관련된 질병 또는 질환의 치료를 필요로 하는 대상에서, 감소된 근육량 및/또는 근육 강도와 관련된 질병 또는 질환을 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 TTC를 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 투여는 상기 대상에서 근육량 및/또는 근육 강도를 증가시키고/시키거나, 회복 또는 치유 속도를 증가시키고/시키거나, 상기 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증을 감소시키는 데 효과적인, 방법.

E2. 실시 형태 E1에 있어서, 질병 또는 질환은 소모성 장애인, 방법.

E3. 실시 형태 E2에 있어서, 소모성 장애는 악액질 및 거식증으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.

E4. 실시 형태 E2에 있어서, 소모성 장애는 근위축증 및 신경근 질병으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.

E5. 실시 형태 E1에 있어서, 질환은 부동화, 만성 질병, 암, 또는 손상의 후유증인, 방법.

E6. 근육량의 증가를 필요로 하는 대상에서 근육량을 증가시키는 방법으로서, TTC를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.

E7. 실시 형태 E6에 있어서, 근육량의 증가는 소모성 장애, 부동화, 또는 노령으로부터 발생된 소모를 보상하기 위한 것인, 방법.

E8. 실시 형태 E6에 있어서, 근육량의 증가는 미용 목적을 위한 것인, 방법.

E9. 근육량의 손실 및/또는 근육 강도의 손실과 관련된 질병 또는 질환을 갖는 환자를 치료하는 방법으로서, 환자로부터 채취한 샘플에서 Col19a1 (콜라겐 알파-1(XIX) 사슬) 및/또는 Snx10 (소팅 넥신 10)의 수준이 미리 정해진 Col19a1 및/또는 Snx10 역치 수준을 초과하거나, 1개 이상의 대조 샘플에서의 Col19a1 및/또는 Snx10 수준을 초과하는 경우 치료적 유효량의 TTC를 대상에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 투여는 대상에서 (i) 근육량을 증가시키고/시키거나, (ii) 근육 강도를 증가시키고/시키거나, (iii) 회복 또는 치유 속도를 증가시키고/시키거나, (iv) 상기 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증을 감소시키는 데 효과적인, 방법.

E10. 근육량의 손실 및/또는 근육 강도의 손실과 관련된 질병 또는 질환을 갖는 환자를 치료하는 방법으로서, (a) Col19a1 및/또는 Snx10의 수준 측정을 위해 환자로부터 채취한 샘플을 제출하는 단계, 및 (b) 환자로부터 채취한 샘플에서 Col19a1 및/또는 Snx10의 수준이 미리 정해진 Col19a1 및/또는 Snx10 역치 수준을 초과하거나, 1개 이상의 대조 샘플에서의 Col19a1 및/또는 Snx10 수준을 초과하는 경우 치료적 유효량의 TTC를 대상에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 투여는 대상에서 (i) 근육량을 증가시키고/시키거나, (ii) 근육 강도를 증가시키고/시키거나, (iii) 회복 또는 치유 속도를 증가시키고/시키거나, (iv) 상기 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증을 감소시키는 데 효과적인, 방법.

E11. 근육량의 손실 및/또는 근육 강도의 손실과 관련된 질병 또는 질환을 갖는 환자를 치료하는 방법으로서, (a) 환자로부터 채취한 샘플을 제출하여 Col19a1 및/또는 Snx10의 수준을 측정하는 단계, (b) 환자의 Col19a1 및/또는 Snx10 수준이 미리 정해진 Col19a1 및/또는 Snx10 역치 수준을 초과하는지, 또는 1개 이상의 대조 샘플에서의 Col19a1 및/또는 Snx10 수준을 초과하는지를 결정하는 단계, 및 (c) 치료적 유효량의 TTC를 대상에게 투여하도록 의료 제공자에게 권고하는 단계를 포함하고, 상기 투여는 대상에서 (i) 근육량을 증가시키고/시키거나, (ii) 근육 강도를 증가시키고/시키거나, (iii) 회복 또는 치유 속도를 증가시키고/시키거나, (iv) 상기 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증을 감소시키는 데 효과적인, 방법.

E12. 근육량의 손실 및/또는 근육 강도의 손실과 관련된 질병 또는 질환으로 진단받은 환자를 치료할지를 결정하는 방법으로서, (a) 환자로부터 얻은 샘플에서 Col19a1 및/또는 Snx10의 수준을 측정하거나, 이를 측정하기 위해 임상 검사를 지시하는 단계; 및 (b) 샘플에서 환자의 Col19a1 및/또는 Snx10 수준이 미리 정해진 Col19a1 및/또는 Snx10 역치 수준을 초과하거나, 1개 이상의 대조 샘플에서의 Col19a1 및/또는 Snx10 수준을 초과하는 경우 TTC를 투여함으로써 환자를 치료하거나, 치료하도록 의료 제공자에게 지시하는 단계를 포함하고, 상기 투여는 대상에서 (i) 근육량을 증가시키고/시키거나, (ii) 근육 강도를 증가시키고/시키거나, (iii) 회복 또는 치유 속도를 증가시키고/시키거나, (iv) 상기 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증을 감소시키는 데 효과적인, 방법.

E13. TTC 치료 계획으로의 치료를 위한 후보자로서 근육량의 손실 및/또는 근육 강도의 손실과 관련된 질병 또는 질환으로 진단받은 환자를 선택하는 방법으로서, (a) 환자로부터 얻은 샘플에서 Col19a1 및/또는 Snx10의 수준을 측정하거나, 이를 측정하기 위해 임상 검사를 지시하는 단계; 및 (b) 샘플에서 환자의 Col19a1 및/또는 Snx10 수준이 미리 정해진 Col19a1 및/또는 Snx10 역치 수준을 초과하거나, 1개 이상의 대조 샘플에서의 Col19a1 및/또는 Snx10 수준을 초과하는 경우 TTC를 투여함으로써 환자를 치료하거나, 치료하도록 의료 제공자에게 지시하는 단계를 포함하고, 상기 투여는 대상에서 (i) 근육량을 증가시키고/시키거나, (ii) 근육 강도를 증가시키고/시키거나, (iii) 회복 또는 치유 속도를 증가시키고/시키거나, (iv) 상기 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증을 감소시키는 데 효과적인, 방법.

E14. 실시 형태 E9 내지 E13 중 어느 하나에 있어서, 환자로부터 채취한 샘플은 근육 조직을 포함하는, 방법.

E15. 실시 형태 E1 내지 E14 중 어느 하나에 있어서, 대상은 인간인, 방법.

E16. 실시 형태 E1 내지 E15 중 어느 하나에 있어서, TTC는

(a) 서열 번호 2 또는 서열 번호 5의 서열, 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하는 폴리펩티드;

(b) 서열 번호 1 또는 서열 번호 6의 서열, 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하는 폴리뉴클레오티드; 또는,

(c) 이들의 조합을 포함하는, 방법.

E17. 실시 형태 E1 내지 E16 중 어느 하나에 있어서, TTC는

(a) TTC 폴리펩티드가 유일한 치료적 모이어티인 융합 단백질 또는 접합체;

(b) 적어도 2개의 치료적 모이어티들을 포함하고, TTC 폴리펩티드가 치료적 모이어티들 중 하나인, 융합 단백질, 또는 접합체;

(c) TTC 폴리펩티드가 유일한 치료적 모이어티인 융합 단백질을 인코딩하는 핵산;

(d) 적어도 2개의 치료적 모이어티들을 포함하고, TTC 폴리펩티드가 치료적 모이어티들 중 하나인, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산; 또는,

(e) 이들의 조합을 포함하는, 방법.

E18. 실시 형태 E1 내지 E17 중 어느 하나에 있어서, TTC는 네이키드 DNA로 투여되는, 방법.

E19. 실시 형태 E1 내지 E8 중 어느 하나에 있어서, TTC는 고정된 용량으로 투여되는, 방법.

E20. 실시 형태 E1 내지 E19 중 어느 하나에 있어서, TTC는 2회 이상의 용량으로 투여되는, 방법.

E21. 실시 형태 E1 내지 E20 중 어느 하나에 있어서, TTC는 매일, 매주, 격주, 또는 매월 투여되는, 방법.

E22. 실시 형태 E1 내지 E21 중 어느 하나에 있어서, TTC는 근육내, 복막내, 피하, 정맥내, 또는 이들의 조합으로 투여되는, 방법.

E23. 실시 형태 E1 또는 E22에 있어서, 상기 방법은 포유동물의 생체내에서 실시되는, 방법.

E24. 실시 형태 E1 내지 E23 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 요법을 추가로 포함하는, 방법.

***

본 명세서에서 언급된 모든 특허 및 간행물은 전체적으로 명확하게 참고로 포함된다.

본 발명의 태양은 하기의 비제한적 실시예를 참조하여 추가로 정의될 수 있는데, 하기의 비제한적 실시예는 본 발명의 소정의 항체의 제조 및 본 발명의 항체를 사용하기 위한 방법을 상세하게 기재한다. 본 발명의 범주를 벗어남이 없이 재료 및 방법 둘 다에 대한 많은 변형이 실시될 수 있다는 것이 당업자에게 자명할 것이다.

실시예

실시예 1

네이키드 DNA의 근육내 주사에 의한 TTC의 투여

상이한 돌연변이를 갖는 수퍼옥사이드 디스뮤타제-1 (Superoxide Dismutase-1) (SOD-1)에 대한 인간 유전자를 과발현하는 유전자도입 동물의 생성은, 다른 증상들 중, 근육 기능의 감소를 특징으로 하는 질병인, ALS의 연구를 위한 동물 모델을 제공해 왔다. 이러한 모델 동물은 ALS 환자와 동일한 임상적 및 병리학적 특징들을 보여준다.

재료 및 방법

1.1 TTC를 인코딩하는 네이키드 DNA

TTC (파상풍 독소 중쇄의 C-말단 도메인 - 462개 아미노산의 서열 번호 2)를 인코딩하는 유전자를 거대세포 바이러스 (cytomegalovirus) (CMV)의 프로모터의 제어 하에서 진핵세포 발현 플라스미드 pcDNA3.1 (인비트로젠 (Invitrogen))에 클로닝하였다. 화학적으로 컴피턴트 (competent)한 대장균 (Escherichia coli) 세균 (DH5α)에서 벡터를 생산하고 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich)의 젠일루트 맥시프렙 키트 (GenElute maxiprep kit)를 사용하여 정제하였다.

1.2 유전자도입 마우스

더 잭슨 래보러토리 (The Jackson Laboratory) (미국 메인주 바 하버 소재)로부터 돌연변이 G93A (B6SJL-TgN[SOD1-G93A]1Gur)를 갖는 인간 SOD1을 과발현하는 SOD1-G93A 유전자도입 마우스를 얻었다. 반접합체 돌연변이체를 모든 실험에 사용하였다 (비-유전자도입 암컷과 교미된 돌연변이 수컷). 문헌[Gurney et al. Science 264: 1772-5 (1994)]에 기재된 바와 같이, 꼬리로부터 추출된 DNA의 PCR 증폭으로 유전자도입 마우스를 확인하였다. 자라고자 (Zaragoza) 대학교의 믹스드 리서치 유닛 (Mixed Research Unit)에 동물을 수용하였다. 이들에 먹이 및 물을 임의로 제공하였다. 실험 동물의 관리 및 사용에 관한 자라고자 대학교 및 국제 가이드의 규칙에 따라 모든 실험 및 동물 관리를 수행하였다.

1.3 네이키드 DNA의 근육내 주사, 및 근육 추출

8 주령에서, 유전자도입 SOD1G93A 마우스의 사두근 (근육당 50 ㎍의 2회 주사) 및 삼두근 (근육당 50 ㎍의 단회 주사)에 300 ㎍의 pCMV-TTC를 근육내 주사하였다. 동일량의 공 플라스미드를 마우스의 대조군에 주사하였다. 플라스미드의 근육내 주사 10일 후, 접종된 근육을 추출하고, 액체 질소에서 예비-동결시키고 이어서 -70℃에서 저장하였다.

1.4 RNA의 추출, cDNA의 합성 및 PCR에 의한 증폭

근육에서 전사된 TTC 산물의 존재를 확인하기 위해, 근육 조직 샘플을 액체 질소에서 동결시킨 후 차가운 막자사발과 막자로 분쇄하였다. 트리졸 (TRIzol) 시약 프로토콜 (인비트로젠)에 따라 근육의 총 RNA를 추출하였다. cDNA의 합성을 위해, 키트 수퍼스크립트 (SuperScript)™ 퍼스트-스트랜드 신테시스 시스템 (First-Strand Synthesis System) (인비트로젠)을 사용하였고, 20 μL의 최종 부피에서 1 ㎍의 RNA로 시작하였다. 20 μL의 최종 부피에서, 각 프라이머 150 nM, dNTP 150 μM, MgCl₂ 1X 완충액 2 mM, 태크 폴 (Taq pol) 0.2 U, 및 반응당 TTC 유전자의 단편의 증폭을 위해 10배 희석된 cDNA 2 μL를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 진앰프 (GeneAmp)? 서멀 사이클러 (Thermal Cycler) 2720 (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems))에서 모든 PCR 반응을 수행하였다. 열 사이클 파라미터는 다음과 같았다: 94℃에서 3분 동안 인큐베이션, 및 94℃에서 30초 동안, 61℃에서 30초 동안 그리고 72℃에서 30초 동안 35회 사이클. 에티듐 브로마이드로 염색된 2%의 아가로스 겔에서 TTC 유전자의 증폭의 존재가 관찰되었다. 사용된 정방향 및 역방향 프라이머의 서열은 각각 서열 번호 3 및 서열 번호 4였다. 증폭의 크기는 355 bp에 상응한다.

1.5 로타로드, 그리드 테스트

이 실험을 8 주령부터 주 1회 동물에게 실시하였다. 종래의 케이지의 뚜껑 역할을 하는 그리드 위에 각 마우스를 놓았다. 이어서, 그리드를 180° 뒤집고, 손상을 피하기 위해 부드러운 표면으로부터 대략 60 cm의 거리에 유지하였다. 각 마우스가 떨어지기까지의 잠복시간을 측정하였다. 각 마우스는 최대 180초 동안 뒤집힌 그리드에 매달리기 위한 시도를 최대 3회 가졌고 최장 시간을 기록하였다.

운동 협응 및 균형을 평가하기 위해 로타로드 테스트를 사용하였다. 장치 (로타로드/RS, LE8200, 엘에스아이-레티카 사이언티픽 인스트루먼츠 (LSI-LETICA Scientific Instruments)의 회전하는 로드 위에 동물을 놓았다. 14 rpm의 일정 속도의 상기 바 위에서 동물이 스스로를 유지할 수 있는 동안의 시간을 기록하였다. 각 마우스는 3회의 기회를 가졌고, 시간 제한을 임의로 180초로 하여, 동물들이 바로부터 떨어지는 않는 상태의 최장 시간을 기록하였다. 동물이 바로 누운 자세 (supine position)로 놓여 있고 스스로 몸을 돌릴 수 없었을 때를 마우스의 생애에 있어서의 종점 (end point)으로 간주하였다.

결과

2.1 근육에서의 TTC 플라스미드의 발현의 검출

작제된 벡터 pCMV-TTC가 유전자도입 SOD1G93A 마우스의 근육 세포에서 인코딩 유전자를 발현하는 능력을 확인하였다. 이러한 마우스에서는 TTC 유전자의 내인성 발현이 없으므로, 상기 분자의 mRNA의 발현을 검출하기 위해 이 유전자의 단편의 PCR 증폭을 주사된 근육에 적용하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, 공 플라스미드가 주사된 대조군에서는 TTC 유전자의 발현이 관찰되지 않는다. 그러나, PCR은 TTC를 인코딩하는 벡터로 접종된 근육에서 TTC 유전자의 증폭의 존재를 보여주는데, 이는 벡터가 성공적으로 근육 세포에 도달하여 상기 유전자의 전사의 과정이 수행됨을 나타낸다.

2.2 유전자도입 SOD1G93A 마우스에서의 TTC의 효과

TTC를 인코딩하는 네이키드 DNA에 의한 근육내 처리는 신경근 증상의 시작을 지연시키고 모델 마우스에서 생존을 증가시킨다. 마우스가 3분 동안 뒤집힌 그리드에의 매달림을 유지할 수 없게 된 날을 제1 일로 하여 증상의 징후를 기록하였다. 대조군에 비하여, TTC를 주사한 동물군에서는 증상의 시작이 대략 8일로 매우 유의하게 감소되었다 (도 2, 및 표 1). 도 3 및 표 1에 나타난 바와 같이, 최대 생존은 TTC로 처리된 마우스군에서 검출되었는데, 이는 평균 136일에 도달하여 대조군보다 16일 더 길었다. 주수 12와 주수 13 사이에, 대조군의 로타로드 활동의 전개에 있어서 현저한 감소가 관찰되었으며, 한편 처리된 동물군에서는 주수 16까지 이러한 결핍이 관찰되지 않았다 (도 4).

[표 1]

또한, 마우스에서 처리를 평가하였는데, 이는 근육 기능을 모니터링 하기 위한 다른 테스트인 "행잉-와이어" 테스트를 사용하여 8 주령에서 시작하였다 (도 5). 14 주령에서, SOD1G93A 마우스는 쇠약의 첫 번째 징후를 보였으며, 한편 TTC로 처리된 마우스군은 주수 14 내지 16에서 더 저항적이게 된 것으로 판명되었다. 또한, 대조군의 마우스는 질병과 관련하여 14 주령부터 체중 감소가 시작되었다. 그러나, TTC에 의한 처리는 유의하게 체중 감소에 대응하였고, 이는 15주에서 최대 체중을 보였다 (도 6).

실시예 2

TTC를 인코딩하는 네이키드 DNA의 주사에 의한 척수에서 세포자멸의 억제

재료 및 방법

1.1 TTC를 인코딩하는 네이키드 DNA

TTC (파상풍 독소 중쇄의 C-말단 도메인, 서열 번호 1)를 인코딩하는 유전자를 거대세포바이러스 (CMV)의 프로모터의 제어 하에서 진핵세포 발현 플라스미드 pcDNA3.1 (인비트로젠)에 클로닝하였다. 화학적으로 컴피턴트한 대장균 세균 (DH5α)에서 벡터를 생산하고 시그마-알드리치의 젠일루트 맥시프렙 키트를 사용하여 정제하였다.

1.2 유전자도입 마우스

더 잭슨 래보러토리 (미국 메인주 바 하버 소재)로부터 돌연변이 G93A (B6SJL-TgN[SOD1-G93A]1Gur)를 갖는 인간 SOD1을 과발현하는 유전자도입 마우스를 얻었다. 반접합체 돌연변이체를 모든 실험에 사용하였다 (비-유전자도입 암컷과 교미된 돌연변이 수컷). 문헌[Gurney et al. (1994)]에 기재된 바와 같이, 꼬리로부터 추출된 DNA의 PCR 증폭으로 유전자도입 마우스를 확인하였다. 자라고자 대학교의 믹스드 리서치 유닛에 동물을 수용하였다. 이들에 먹이 및 물을 임의로 제공하였다. 실험 동물의 관리 및 사용에 관한 자라고자 대학교 및 국제 가이드의 규칙에 따라 모든 실험 및 동물 관리를 수행하였다. 총 12 마리 동물을 사용하였다: 야생형 (n=5), pcDNA3.1을 주사한 SOD1G93A 마우스 (대조군, n=5) 및 TTC로 처리된 SOD1G93A 마우스 (n=5).

1.3 네이키드 DNA의 근육내 주사, 및 척수 추출

8 주령에서, 유전자도입 SOD1G93A 마우스의 사두근 (근육당 50 ㎍의 2회 주사) 및 삼두근 (근육당 50 ㎍의 단회 주사)에 300 ㎍의 pCMV-TTC를 근육내 주사하였다. 동일량의 공 플라스미드를 마우스의 대조군에 주사하였다.

플라스미드의 근육내 주사 110일 후에 척수를 추출하고, 액체 질소에서 예비-동결시키고, 이어서 -70℃에서 저장하였다. 조직을 액체 질소에서 동결시킨 후 차가운 막자사발 및 막자로 분쇄하였다. 샘플의 절반은 RNA 추출에 사용하고 나머지 절반은 단백질 추출에 사용하였다.

1.4 척수로부터의 RNA 추출 및 cDNA의 합성

알앤이지 (RNeasy)? 리피드 티슈 미니 키트 (Lipid Tissue Mini Kit) 프로토콜 (퀴아젠 (Qiagen))에 따라 척수의 총 RNA를 추출하였다. cDNA의 합성을 위해, 수퍼스크립트™ 퍼스트-스트랜드 신테시스 시스템 키트 (인비트로젠)를 사용하였고, 20 μL의 최종 부피에서 20 ㎍의 RNA로 시작하였다.

1.5 실시간 PCR

10 μL의 최종 부피에서, 1X 태크만 (TaqMan)? 유니버설 PCR 마스터 믹스 (Universal PCR Master Mix), 노 앰프이레이즈 (No AmpErase)? UNG (어플라이드 바이오시스템즈), 연구 중인 각 유전자에 대한, 표시가 없는 프라이머와 태크만? MGB 프로브 (어플라이드 바이오시스템즈)의 1X 혼합물, 및 반응당 10배 희석된 cDNA 1 μL를 사용하여 실시간 PCR 반응을 수행하였다. 정규화를 위해, 3개의 내인성 유전자들을 사용하였다 (18s rRNA, GAPDH 및 β-액틴). 연구 중인 유전자들 각각을 증폭시키는 데 사용된, 프라이머와 프로브의 혼합물의 참조는 다음과 같았다: 카스파제-3 (Mm01195085_m1), 카스파제-1 (Mm00438023_m1), NCS-1 (Mm00490552_m1), Rrad (Mm00451053_m1), 18s rRNA (Hs99999901), GAPDH (4352932E) 및 β-액틴 (4352933E), 여기서 괄호 안의 숫자는 측정되는 유전자의 태크만? 검정 확인 번호에 해당한다.

에이비아이 프리즘 (ABI Prism) 7000 시퀀스 디텍션 시스템 서모사이클러 (Sequence Detection System thermocycler) (어플라이드 바이오시스템즈)에서 모든 PCR 반응을 수행하였다. 열 사이클 파라미터는 다음과 같았다: 95℃에서 10분 동안 인큐베이션, 및 95℃에서 15초 동안 그리고 60℃에서 1분 동안 40회 사이클. 3개의 내인성 유전자들의 기하 평균값을 적용하여 카스파제-3, 카스파제-1, NCS-1, 및 Rrad의 상대 발현을 정규화하였다.

1.6 척수 단백질 추출 및 웨스턴 블롯 분석

야생형 마우스 및 TTC로 처리된 SOD1G93A 마우스의 척수 샘플을 액체 질소에서 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1% 데스옥시콜레이트 (desoxycholate), 0.1% SDS, 1% 트리톤 (Triton) X-100, 1 mM NaOVa, 1 mM PMSF, 10 ㎍/mL 류펩틴 (leupeptin) 및 아프로티닌 (aprotinin) 및 1 ㎍/mL 펩스타틴 (pepstatin)으로 이루어진 추출 완충액으로 균질화하였다. 이를 4℃에서, 10분 동안 29 N (3,000xg)으로 원심분리하였다. BCA 방법 (9643 시그마)을 사용하여 각 샘플의 상청액에서 단백질의 농도를 정량한 후, 25 ㎍의 단백질을 10% 아크릴아미드 겔에 로딩하였다. 5% 탈지유 (20 mM Tris 염기, 0.15 M NaCl, pH=7.5, 0.1% 트윈 (Tween))의 TTBS 용액으로 1시간 동안 블로킹된 PVDF 막을 전달을 위해 사용하였다. 이후, 이들을 4℃에서 일차 항체와 함께 밤새 인큐베이션하였다 (항-GAPDH (sc-25778, 산타 크루즈 (Sta. Cruz))).

일차 항체와의 인큐베이션 후, TTBS로 막을 세척하고 이차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, 화학발광으로 발현하였다 (revelation) (웨스턴 블롯팅 루미놀 시약, sc-2048 산타 크루즈). 필름을 스캐닝하고 알파이즈 에프씨 (AlphaEase FC) (본사이 테크놀로지즈 (Bonsai Technologies))를 사용하여 분석하였다. ANOVA 검정 및 스튜던트-뉴만-쿨스 (Student-Neuman-Keuls) 검정을 사용하여 통계적 분석을 수행하였다.

결과

ALS의 영향들 중 하나는 운동 뉴런, 즉, 근육을 자극하고 근육 기능을 부분적으로 담당하는 뉴런의 퇴행이다. 유증상 일령의, 이들 마우스의 척수 수준에서의 전사 연구가 유전자 카스파제-1 (P<0.05), 카스파제-3 (P<0.05), 및 Bcl2 (P<0.01)의 전사 조절을 비교하는 도 7에 나타나 있지만, 야생형과 비교할 때 대조 SOD1G93A 마우스에서의 유전자 Bax의 발현 프로파일에서는 유의한 차이가 발견되지 않았다 (P>0.05) (도 7).

TTC에 의한 처리를 받은 마우스군에서는, 카스파제-1 및 카스파제-3의 발현 수준이 야생형에서와 같이 유지되었고, 유의한 차이는 이들을 비처리된 마우스군과 비교하였을 때에만 발견되었다 (각각 P<0.05 및 P<0.01). 그러나, 이들 유전자도입 마우스의 척수에서의 유전자 Bax 및 Bcl2의 발현은 TTC의 처리에 의해 영향을 받지 않았다 (P>0.05) (도 7).

SOD1G93A 마우스의 척수에서 세포사를 유도할 수 있는 세포자멸을 반전시키는 기전에 대한 TTC의 효과를 평가하기 위해, 단백질 연구를 또한 수행하였다. 데이터는, 대조군에 비하여 TTC로 처리된 마우스에서 카스파제-3 유전자의 활성화 (P<0.05)가 상당히 감소하여, 야생형 마우스의 것과 유사한 수준에 도달하였으며, 한편 프로-카스파제-3 단백질의 수준은 유전자도입 동물에서 영향을 받지 않았음을 보여주었다. 발현 분석으로부터 얻은 결과와는 대조적으로, 웨스턴 블롯에서는 단백질 Bax 및 Bcl2가 TTC로 처리된 마우스에서 더 적은 양으로 존재하는 것으로 관찰되었다 (도 8).

TTC의 작용 기전은 포스파티딜이노시톨 3-키나제에 의해 매개되는 경로를 차단하는 데 관여된 다양한 성장 인자에 의해 활성화되는 키나제 단백질인 Akt의 인산화이다. 문헌[Gil et al. Biochem. J. 373: 613-620 (2003)]. 덴시토메트리 정량화 (densitometric quantification)는, 포스포(phospho)-특이적 항체의 사용을 통한 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정될 때, TTC로 처리된 동물이 공 벡터의 대조군과 비교할 때 Ser473에서 인산화된 Akt 수준이 2배 더 많았음 (P<0.05)을 나타내었다 (도 9).

항-튜불린 항체에 의한 검출에 의해 단백질의 등몰 전하를 확인하였다. 배양된 피질 뉴런에서의 TTC에 의한 ERK1/2의 인산화는 이전에 기재되어 왔다. 문헌[Gil et al. Biochem. J. 373: 613-620 (2003)]. MAP 키나제 경로에서의 TTC의 영향을 확인하기 위해, 처리된 및 비처리된 110 일령의 SOD1G93A 마우스의 척수 추출물에서 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 결과는, TTC로 처리된 군과 비교할 때, 대조군 마우스에서 ERK1/2의 증가하는 활성화를 보여주었지만 (도 9), 발현 수준은 야생형 마우스의 것과 유사하였다.

실시예 3

복막내 주사를 통한 TTC 폴리펩티드의 투여

재료 및 방법

1.1 TTC 폴리펩티드의 추출

사용된 TTC 폴리펩티드는 파상풍 독소 중쇄의 C-말단 도메인에 해당하고 451개의 아미노산 (서열 번호 2)을 포함하였다. 문헌[Gil et al., 2003]에 기재된 방법에 따라 TTC를 얻었다.

1.2 유전자도입 마우스

더 잭슨 래보러토리 (미국 메인주 바 하버 소재)로부터 돌연변이 G93A (B6SJL-TgN[SOD1-G93A]1Gur)를 갖는 인간 SOD1을 과발현하는 유전자도입 마우스를 얻었다. 반접합체 돌연변이체를 모든 실험에 사용하였다 (비-유전자도입 암컷과 교미된 돌연변이 수컷). 문헌[Gurney et al. (1994)]에 기재된 바와 같이, 꼬리로부터 추출된 DNA의 PCR 증폭으로 유전자도입 마우스를 확인하였다. 자라고자 대학교의 믹스드 리서치 유닛에 동물을 수용하였다. 이들에 먹이 및 물을 임의로 제공하였다. 실험 동물의 관리 및 사용에 관한 자라고자 대학교 및 국제 가이드의 규칙에 따라 모든 실험 및 동물 관리를 수행하였다.

1.3 동물에서 TTC 폴리펩티드의 복막내 주사

12 주령에서, 유전자도입 SOD1G93A 마우스에 0.5 μM 농도의 TTC 폴리펩티드 250 μL를 복막내 주사하였다. 생애에 걸쳐 주사를 매주 반복하였다.

1.4 동물의 생존의 측정.

바로 누운 자세로 놓여진 동물이 스스로 몸을 돌릴 수 없을 때를 마우스의 생애에 있어서의 종점으로 간주하였다.

결과

2.1 TTC는 유전자도입 SOD1G93A 마우스의 생존을 연장한다

도 10 및 표 2로부터 알 수 있는 바와 같이, 최대 생존은 TTC로 처리된 군으로부터의 마우스에서 검출되었는데, 이는 평균 135일에 도달하여 대조군보다 9일 더 길었다.

[표 2]

실시예 4

TTC의 투여는 척수에서 칼슘과 관련된 유전자의 발현에 있어서의 변화를 야기한다

뉴런 단백질 NCS1은 칼슘-의존적 방식으로 신경분비를 조절하고 (문헌[McFerran et al. J. Biol. Chem. 273:22768-22772 (1998)]), 이는 또한 뉴런 신호 전달에 관여하는 칼슘/칼모듈린 의존적 효소의 조절과 관련되어 있다 (문헌[Schaad et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9253-9258 (1996)]). TTC에 의한 처리 50일 후에, SOD1G93A 마우스의 척수로부터의 조직을 사용하여 NCS1의 발현을 테스트하였다.

RT-PCR 실험에서, 동일 일령의 야생형 마우스에 비하여, NCS1 유전자의 발현이 후기 증상을 갖는 유전자도입 마우스에서 억제된 것 (P<0.05)으로 밝혀졌다. 동시에, TTC에 의한 근육내 처리를 받은 마우스는 야생형의 것에 근접하는 더 높은 수준의 NCSI (P<0.05)를 가졌다. 동일 샘플을 사용하여, Ras와 관련되고 당뇨병 유전자 (Rrad)와 관련된 유전자의 메신저 RNA의 수준을 측정하였다. 이 실시예는, Rrad의 수준이, 유사한 일령의 야생형 마우스와 비교할 때 대조 유전자도입 마우스의 척수에서 거의 2배 증가되었음을 보여준다. 그러나, 대조군 마우스와 비교하여, SOD1G93A 마우스에서의 TTC에 의한 처리는 Rrad의 발현을 상당히 감소시켜 (P<0.05), 야생형 마우스에서 얻어진 것과 유사한 값에 도달하였다 (도 11).

실시예 5

신경근 기능에 대한 TTC의 보호 효과

재료 및 방법

1.1 TTC DNA를 운반하는 재조합 플라스미드의 작제.

TTC-인코딩 유전자를 거대세포바이러스 (CMV) 극초기 (immediate-early) 프로모터의 제어 하에서 pcDNA3.1 (스페인 프라트 데 로브레가트 소재의 인비트로젠 에쎄.아. (Invitrogen S.A.)) 진핵세포 발현 플라스미드 내로 클로닝하였다. BamHI 및 NotI 제한 효소로 pGex-TTC 플라스미드로부터 TTC 유전자를 제거하고 (문헌[Ciriza et al., 2008a]), pCMV에 삽입하여 pCMV-TTC 플라스미드를 만들었다. 서열분석 후, 화학적으로 컴피턴트한 대장균 (DH5α)에서 벡터를 증폭시키고 진일루트? 맥시프렙-키트 (스페인 마드리드 소재의 시그마-알드리치 퀴미카, 에쎄.아. (

))를 사용하여 정제하였다.

1.2 유전자도입 마우스.

G93A 인간 SOD1 돌연변이 (B6SJL-Tg[SOD1-G93A]1Gur)를 갖는 유전자도입 마우스를 더 잭슨 래보러토리 (미국 메인주 바 하버 소재)로부터 구입하였다. SOD1G93A 수컷을 암컷 한배 새끼 (littermate)와 교배시켜 반접합체를 유지하였다. hSOD1 유전자도입 마우스의 유전자형 결정 (genotyping)을 위한 더 잭슨 래버러토리 프로토콜 (jaxmice.jax.org/pub-cgi/protocols.sh?objtype=protocol,protocol_id=523에서 입수가능함)에 기재된 바와 같이, 꼬리 조직으로부터 추출된 DNA의 PCR 증폭에 의해 자손을 확인하였다. 자라고자 대학교의 공동연구단위 (

)에 마우스를 수용하였다. 먹이 및 물은 임의로 이용가능하였다. 모든 실험 절차는 기관들의 윤리위원회 (Ethics Committee)에 의해 승인되었고 ALS/MND에 대한 약리학적 활성 약물의 전임상 생체내 평가를 위한 가이드라인에 기초한 실험실 동물의 사용에 관한 국제 가이드라인을 따랐다.

1.3 전기생리학적 테스트.

2개 군의 수컷 SOD1G93A 마우스의 뒷발에 재조합 플라스미드 pCMV-TTC 또는 공 플라스미드를 주사하였다. 신경근 기능을 평가하기 위해, 12 주령 및 16 주령에서 신경 전도 테스트를 실시하였다. 또한, 비교를 위해, 동일 일령의 야생형 마우스의 제3 군 (n=8)을 테스트하였다. 운동 신경 전도 테스트를 위해, 좌골 신경 (sciatic nerve)을 좌골 절흔 (sciatic notch) 근처에 놓인 한 쌍의 바늘 전극으로 경피적으로 자극하고, 미세바늘 전극으로 전경골근 및 족저근으로부터 복합 근육 활동 전위 (compound muscle action potential) (CMAP, M 웨이브)를 기록하였다.

감각 신경 전도 테스트를 위해, 기록 전극을 네 번째 발가락의 족지 신경 (digital nerve) 근처에 놓고 복합 감각 신경 활동 전위 (compound sensory nerve action potential) (CNAP)를 기록하였다. 기준선 (baseline)부터 최대 음성 피크까지의 진폭 및 자극으로부터 제1 음성 편향 (negative deflection)의 개시까지의 잠복시간을 측정하도록 적절하게 세팅된 디지털 오실로스코프 (테크트로닉스 (Tektronix) 450S)에서, 유발된 전위를 증폭시키고 거기에 표시하였다 (문헌[Navarro et al. Exp. Neurol. 129:217-224 (1994)]; 문헌[Verdu et al. Exp Neurol 129:217-224 (1994)]; 문헌[Udina et al. Glia 47:120-129 (2004)]). 7회의 전기생리학적 테스트 동안, 체온을 유지하기 위해 물 순환 펌프에 의해 제어되는 따뜻한 편평한 스티머 (steamer) 위에 동물을 놓았다.

결과

SOD1G93A 마우스의 신경근 기능을 다음의 2개의 시점에서 평가하였다: 질병 개시의 대략적인 시간 직전인 12 주령에서, 그리고 질병이 후기 유증상 단계에 있을 때인 16 주령에서. 12 주령까지, 운동 신경 전도 테스터에서 뚜렷한 이상이 있었는데, 이러한 이상은 TTC-처리된 유전자도입 마우스 및 비히클-플라스미드 유전자도입 마우스 둘 다의 전경골근 및 족저근에서 M 웨이브의 진폭에 있어서의 40% 내지 50% 감소에 의해 입증되었다 (도 12, 표 3).

[표 3]

또한, 동일 일령의 야생형 마우스와 비교하여, 잠복시간에서 경미하지만 유의한 증가 (약 14% 더 김)가 있었다 (표 3). 16주에서는, 비히클-처리된 SOD1G93A 마우스에서 M 웨이브 진폭에 있어서 정상 값의 약 20% 내지 25%로 분명한 감소가 있었다 (도 12). 이러한 감소는 TTC-처리된 마우스에서는 (30% 내지 38%로) 덜 확연하였지만, 이러한 차이는 유의성을 획득하지 못하였다. 이 일령 동안 정상 마우스에서 일어나는 경미한 단축 및 그에 따른 전도 속도의 증가와는 대조적으로, M 웨이브 개시의 잠복시간은 비히클-처리된 SOD1G93A 마우스에서 12주와 16주 사이에 약간 증가하였다 (표 3) (문헌[Verdu et al. Neurobiol. Aging 17:73-77 (1996)]).

섬유자발 전위 (fibrillation potential)가 테스트된 근육에서 12주에서 보통의 존재량으로 검출되었으며; 이것은 16주에서 증가하였다. 운동 신경 이상과는 대조적으로, 감각 신경 전도 테스트는 군들 사이의 발가락에서의 족지 신경으로부터 기록된 CNAP의 진폭에 있어서 유의한 차이를 나타내지 않았다 (표 3). 동일 일령의 야생형 동물과 비교하여, 비히클-플라스미드 SOD1G93A 마우스에서 감각 CNAP의 잠복 시간은 약간 지연되었다. 이러한 결과는 TTC의 유전자 전달이 신경근 기능에 대하여 G93A 돌연변이 인간 SOD1 유전자를 발현하는 ALS 뮤린 (murine) 모델에서 보호 효과를 갖는다는 것을 나타낸다.

실시예 6

TTC는 척수 운동 뉴런 손실을 보호하고 소교세포증의 감소를 증진한다.

재료 및 방법

1.1 TTC DNA를 운반하는 재조합 플라스미드의 작제.

TTC-인코딩 유전자를 거대세포바이러스 (CMV) 극초기 프로모터의 제어 하에서 pcDNA3.1 (스페인 프라트 데 로브레가트 소재의 인비트로젠 에쎄.아.) 진핵세포 발현 플라스미드 내로 클로닝하였다. BamHI 및 NotI 제한 효소로 pGex-TTC 플라스미드로부터 TTC 유전자를 제거하고 (문헌[Ciriza et al., 2008a]), pCMV에 삽입하여 pCMV-TTC 플라스미드를 만들었다. 서열분석 후, 화학적으로 컴피턴트한 대장균 (DH5α)에서 벡터를 증폭시키고 진일루트 맥시프렙-키트 (스페인 마드리드 소재의 시그마-알드리치 퀴미카, 에쎄.아.)를 사용하여 정제하였다.

1.2 유전자도입 마우스.

G93A 인간 SOD1 돌연변이 (B6SJL-Tg[SOD1-G93A]1Gur)를 갖는 유전자도입 마우스를 더 잭슨 래보러토리 (미국 메인주 바 하버 소재)로부터 구입하였다. SOD1G93A 수컷을 암컷 한배 새끼와 교배시켜 반접합체를 유지하였다. hSOD1 유전자도입 마우스의 유전자형 결정을 위한 더 잭슨 래버러토리 프로토콜 (jaxmice.jax.org/pub-cgi/protocols.sh?objtype=protocol,protocol_id=523에서 입수가능함)에 기재된 바와 같이, 꼬리 조직으로부터 추출된 DNA의 PCR 증폭에 의해 자손을 확인하였다. 자라고자 대학교의 공동연구단위에 마우스를 수용하였다. 먹이 및 물은 임의로 이용가능하였다. 모든 실험 절차는 기관들의 윤리위원회에 의해 승인되었고 ALS/MND에 대한 약리학적 활성 약물의 전임상 생체내 평가를 위한 가이드라인에 기초한 실험실 동물의 사용에 관한 국제 가이드라인을 따랐다.

1.3 조직학적 및 면역조직화학적 처리.

수컷 SOD1G93A 마우스의 뒷발에 재조합 플라스미드 pCMV-TTC 또는 공 플라스미드를 주사하였다. 신경근 기능을 평가하기 위해, 16 주령에서 신경 전도 테스트를 실시하였다. 전기생리학적 테스트 후, 동물 (n=5)을 PBS 중의 4% 파라포름알데하이드로 관류시켰다. 척수의 허리 분절을 제거하고, 24시간 동안 후-고정 (post-fix)하고, 30% 수크로스 중에 동결보존하였다. L2, L3 및 L4 분절 수준에서, 40 μm 두께 횡절편을 동결박편기 (cryotome) (영국 체셔 소재의 서모 일렉트론 (Thermo Electron))로 연속적으로 절단하였다.

각 분절에 대해, 일련의 10개의 단편들 각각을 별개의 젤라틴-코팅 슬라이드들 위에 순차적으로 수집하였다. 하나의 슬라이드를 1분 동안 수돗물로 재수화하고 1시간 동안 3.1 mM 크레실 바이올렛의 산성화된 용액으로 염색하였다. 이어서, 슬라이드를 1분 동안 증류수로 세척하고, 탈수하고, DPX (플루카 (Fluka))로 마운팅 (mounting) 하였다. 염색된 척수 절편의 측삭 전각에서의 운동 뉴런의 위치로 운동 뉴런을 확인하고 엄격한 크기 및 형태학적 기준에 따라 카운팅하였다.

전체 측삭 전각을 커버하는 중첩 이미지들을 40X로 촬영하고, 20 μm 사각형 그리드를 각 현미경 사진 위에 겹쳐 놓았다. 지름이 20 μm보다 크고 다각형 모양이고 두드러진 핵소체를 갖는 운동 뉴런만을 카운팅하였다. 각각 L2, L3 및 L4 분절의 4개의 연속적인 절편에서 양쪽 전각에 존재하는 운동 뉴런의 수를 카운팅하였다. 다른 일련의 절편들을 TBS-트리톤-FBS로 블로킹하고 2일 동안 4℃에서 일차 항체 항-교세포 섬유성 산성 단백질 (GFAP, 1:1000, 다코 (Dako)) 또는 토끼 항-이온화 칼슘 결합 어댑터 분자 1 (Iba1, 1:2000, 와코 (Wako))과 함께 인큐베이션하여 각각 성상세포 및 소교세포를 표지하였다.

세척 후, 절편을 1일 동안 4℃에서 Cy3-접합 이차 항체 (1:200; 잭슨 이뮤노리서치 (Jackson Immunoresearch))와 인큐베이션하였다. 면역조직화학을 위해 3개의 마우스군으로부터의 절편들을 병렬로 처리하였다. 전각의 회백질의 현미경 사진을 400X로 촬영하고, 백그라운드 보정을 위해 역치를 정의한 후, 이미지제이 (ImageJ) 소프트웨어를 사용하여 GFAP 또는 Iba1 표지의 적분 밀도를 측정하였다 (문헌[Penas et al. J. Neurotraum 26:763-779 (2009)]). 적분 밀도는 평균 밀도에서 백그라운드를 뺀 값에 대한 역치 위의 면적이다.

결과

SOD1G93A 마우스 운동 뉴런에 일어나는 퇴행성 사건을 광학 현미경법으로 관찰하였다. SOD1G93A 마우스에서 운동 뉴런의 두드러진 특징은 활발한 퇴행을 나타내는 세포질의 액포화였다 (도 13a). 이러한 액포 (vacuole)는 상이한 크기 및 투명한 내용물을 가졌다. SOD1G93A 마우스 운동 뉴런은 또한 Nissl 물질의 고갈을 보여서, 옅어지고 눈에 잘 띄지 않게 되었다. 대조적으로, 야생형 마우스에서 운동 뉴런은 어둡게 염색된 Nissl 물질의 응집체를 가졌고 세포질 액포는 없었다 (도 13a). 16 주령의 야생형 및 SOD1G93A 마우스의 허리 척수 절편의 측삭 전각에서 염색된 운동 뉴런의 수를 카운팅하여 운동 뉴런 퇴행의 정도를 결정하였다.

절편된 3개의 허리 분절들은 뒷다리의 상이한 근육들의 운동 핵을 함유하고; 8주에 플라스미드가 주사된 대퇴 사두근의 핵은 주로 L2에 주로 위치하며, 한편 전기생리학적으로 테스트된 전경골근 및 족저근의 운동 핵은 대부분 각각 L3 및 L4 수준에서 나타난다 (문헌[McHanwell et al. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 293:477-508 (1981)]). 도 13b는 야생형, 대조군 SOD1G93A 마우스, 및 SOD1G93A―TTC 처리된 마우스로부터의 대표적인 척수 단면을 보여준다. 운동 뉴런의 기준을 만족하는 뉴런만을 카운팅에 포함시켰다. 작은 뉴런들은 카운팅에서 배제하였으며; 비록, 이들 뉴런이 실제로 위축성 운동 뉴런이라고 할지라도 이들은 기능적 운동 뉴런일 것 같지는 않았다. 야생형 동일 일령 대조군들과 비교하여, 생존하는 운동 뉴런의 수는 두 SOD1G93A 군 모두의 허리 척수에서 유의하게 감소하였다 (도 13c).

그럼에도 불구하고, 운동 뉴런 손실의 정도는 TTC-처리된 SOD1G93A 마우스 (야생형 마우스에 대해 약 60%의 생존 운동 뉴런)에서보다 비히클-플라스미드 주사된 마우스 (약 43%)에서 유의하게 더 높았다. 결과는, TTC의 신경보호 효과는 척수 분절들을 따라 확장되어서 사두근 운동 뉴런성 풀 (pool)을 함유하는 분절에만 영향을 미친 것은 아니었음을 나타낸다. 그러나, SOD1G93A 대조군 마우스와 비교하여, 운동 뉴런의 비율이 TTC로 처리된 마우스에서 L2에서 약 22%, L3에서 16%, 그리고 L4에서 12%로 증가하였기 때문에, TTC에 의해 유도된 운동 뉴런 생존에서의 개선은 약간의 구배를 보여주었다 (도 13c).

허리 운동 뉴런의 상태 및 반응성 교세포 반응을 간접적으로 조사하기 위해, 척수 절편을 성상세포에 대한 마커 (GFAP) 또는 소교세포에 대한 마커 (Iba1)로 염색하였다. 교세포 반응성을 L2 절편에서 측정하였는데, 이 분절이 운동 뉴런 생존의 최고 증가 비율을 가졌기 때문이다. 반응성 성상세포증 (astrocytosis) 및 소교세포증 (microgliosis)은 두 SOD1G93A 군 모두에서 야생형 마우스에서보다 유의하게 높은 수준으로 분명하게 드러났는데, 이때 야생형 마우스는 이들 마커에 대해 더 낮은 기저 라벨링을 가졌다 (도 14a). 면역반응성의 정량 분석은, TTC 처리가 성상세포 반응성에는 효과가 없는 반면, SOD1G93A 마우스에서 증가된 소교세포 반응성의 유의한 감소를 증진시킬 수 있음을 보여주었다 (도 14b).

실시예 7

수축력에 대한 TTC 효과

재조합 단백질로서 근육내 전달되었든지 또는 플라스미드 (네이키드 DNA)에 의해 발현되었든지 어느 것이든 간에, TTC는 모델 마우스에서 근육 수축력을 개선시키는 것으로 관찰되었다.

재료 및 방법

1. TTC를 인코딩하는 네이키드 DNA

TTC (파상풍 독소 중쇄의 C-말단 도메인; 서열 번호 2)를 인코딩하는 유전자를 거대세포바이러스 (CMV) 극초기 프로모터의 제어 하에서 pcDNA3.1 (인비트로젠) 진핵세포 발현 플라스미드 내로 클로닝하였다. BamHI 및 NotI 제한 효소로 pGex-TTC 플라스미드로부터 TTC 유전자를 제거하고, pCMV에 삽입하여 pCMV-TTC 플라스미드를 만들었다. 서열분석 후, 화학적으로 컴피턴트한 대장균 (DH5)에서 벡터를 증폭시키고 엔도프리 플라스미드 메가키트 (Endofree Plasmid MEGAkit) (퀴아젠)를 사용하여 정제하였다.

모든 테스트된 파라미터들은 약물 물질에 대한 허용 기준의 범위 내에 있었다 (외관, 농도, 순도, 플라스미드 및 pDNA 서열의 동일성 및 크기).

2. TTC 단백질

TTC (파상풍 독소 중쇄의 C-말단 도메인; 서열 번호 2)로서 코딩된 단백질을 높은 세포 밀도 구성으로 유가 (fed-batch) 공정으로 대장균 균주 BL21 (DE3)을 사용하여 생물반응기에서 생산하였다. 아이소프로필 β-D-티오갈락토시드 (IPTG)의 첨가에 의해 TTC 단백질을 발현하도록 대장균 BL21 세포를 유도하였다. 리소자임 및 DNAase-I의 존재 하에서 세포를 용해시키고, 황산암모늄을 사용한 염석 (salting-out) 과정 후, 액체 크로마토그래피로 단백질을 단리하고 정제하였다 (금속-친화성, 소수성 상호작용 및 이온 교환). 또한, 순도 및 세균성 엔도톡신 수준 (Lal 테스트)을 결정하였다.

미리, 대장균의 코돈 사용빈도 (codon usage)를 조정하여 유전자 서열을 합성하고, NdeI 및 XhoI (퍼멘타스 (Fermentas)) 효소에 의한 제한에 의해 발현 플라스미드 pET24b (노바젠 (Novagen)) 내로 클로닝하였다. 발현 벡터를 생산 균주 BL21 DE3로 변형시켰으며, 이때 이러한 생산은 생물 반응기에서 수행되었다.

3. 유전자도입 마우스

더 잭슨 래보러토리 (JAX)로부터 G93A 돌연변이를 갖는 인간 SOD1을 과발현하는 유전자도입 마우스를 얻었다. 성차 (gender difference)를 없애고 연구에 요구되는 동물의 마리수를 최소화하기 위해, 모든 분석에 대해 암컷 B6SJL-Tg (SOD1G93A) 1Gur/J 마우스를 독점적으로 사용하였다. 모든 실험용 암컷 유전자도입 마우스를 만들기 위해 수컷 B6SJL-Tg (SOD1G93A) 1Gur/J 마우스 (JAX로부터 구입함)를 C57Bl6/J × SJL 교배의 암컷 F1 자손과 교배하였다. 도입유전자 (transgene) 발현이, 이유 (weaning) 후 채취한 귀 생검 조직의 PCR 분석에 의해 확인되었다. 이들에 물 및 먹이를 임의로 제공하였다. 모든 실험들을 실험실 동물의 사용에 대한 국제 가이드라인에 따라 진행하였다.

4. 화합물의 근육내 투여

모든 화합물을 생후 일수 70 (유증상 단계)에서 시작하여, 지정된 부피 (60 μL의 총 주사 부피)로 하기 뒷다리 근육 내로 양쪽 근육내 (i.m.) 주사에 의해 전달하였다:

전경골 (TA) = 4 μl × 2

대퇴 사두근 = 14 μl × 2

하퇴 삼두근 (비복근) = 12 μl × 2

장지신근 (extensor digitorum longus) (EDL) 근육에는 직접 주사하지 않았지만, 이것은 TA 근육에 바로 근접해 있기 때문에, 확산에 의한 주입에 노출됨을 보장한다. 표적 근육으로의 정확한 전달을 보장하기 위해 그리고 깨어있는/반응성인 마우스에서 바늘-유도성 손상을 줄이고 불필요한 통증을 피하기 위해, 모든 근육내 주사는 아이소플루란 (isoflurane) 마취 하에서 수행되었다. 압력 관련 근육 손상의 유도, 즉 구획 증후군 (compartment syndrome)을 피하기 위한 노력으로, 주사 부피는 총 근육 부피의 15% 미만으로 유지하였다.

연구에 사용된 용량은, 플라스미드에 대해서는 300 ㎍ (단회 또는 매주 투여됨), 그리고 단백질에 대해서는 10 ㎍ (매주 투여됨)이었다.

5. 근육 수축력 (경련 힘 및 강직 힘)의 측정

중간-넓적다리 영역에서 좌골 신경을 노출시키고 근위방향으로 절편화한 후 전극 위에 놓았다. 근육 길이를 최대 경련 힘에 따라 조절하였다. 이어서, 좌골 신경을 0.02 ms 구형파 (square wave) 펄스로 자극하여 최대 단일 경련 힘을 기록하였다. 40, 80 및 100 ㎐에서 일련의 자극으로 좌골 신경을 자극하여 최대 강직 힘을 결정하였다. 기록된 최대 경련 힘으로부터, 피크 수축에 도달하는 데 걸리는 시간 (피크 도달 시간 (time-to-peak); TTP) 및 절반 이완에 도달하기까지의 시간 (1/2RT)의 측정에 의해 근육 수축 특징을 결정하였다. 도 16을 참조한다.

결과

1. 근육 수축력

경련 힘 데이터 (도 17) 및 파상풍성 수축력 데이터 (도 18)는, 그들 각각의 대조군과 비교하여, 근육 수축력이 pcDNA3.1TTC 플라스미드 및 TTC 단백질로 처리된 120 일 SOD1G93A 마우스에서 TA (도 17의 A, 도 18의 A) 및 EDL 근육 (도 17의 B, 도 18의 B) 둘 다에서 유의하게 상승하였음을 보여주었다. 강직 힘 값은 최대 근력을 생성하는 능력을 나타내며, 한편 경련 값은 수축 속도 특징에 대해 주로 사용된다. 근육 수축력의 최대 개선은 TTC 단백질 (10 ㎍) 처리된 마우스에서 관찰되었는데, 이 마우스는 TBS (비히클) 처리된 마우스와 비교하여, TA 및 EDL 근육에서 각각 2.07배 및 2.09배의 강직 힘 증가를 가져왔다. 최대 TA 및 EDL 수축력 또한, pcDNA3.1Empty 플라스미드 처리된 마우스와 비교하여, pcDNA3.1TTC 플라스미드 (매주 근육내 주사) 처리된 마우스에서 2.15배 및 1.88배 증가하였다. 흥미롭게도, pcDNA3.1TTC 플라스미드의 매주 근육내 주사는 단회 주사만을 투여받은 마우스와 비교하여 TA 강직 힘에 있어서 유의한 증가를 가져오지 않았지만, EDL 근육 강직 힘에 있어서는 보통이지만 유의한 차이 (p = <0.04)가 관찰되었다.

2. 근육 수축 특징

근육 수축 특징 데이터는, pcDNA3.1TTC 플라스미드에 의한 처리 (매주 근육내 주사)가, pcDNA3.1Empty 플라스미드 (매주 근육내 주사) 처리된 대조군과 비교하여, TA 근육 (도 19의 A, 도 20의 A) 및 EDL 근육 (도 19의 B, 도 20의 B) 둘 다에 대해 TTP 값 (도 19) 및 1/2RT 값 (도 20)에 있어서 유의한 개선을 가져온다는 것을 나타내었다. 추가적으로, 근육 수축 특징 데이터는, pcDNA3.1TTC 플라스미드의 매주 투여가, SOD1G93A 마우스에서 70일에서의 단회 투여와 비교하여, 더 큰 효과를 발휘하였음을 보여주었다. 또한, 유사하거나 심지어 더 큰 개선이 TTC 단백질 (10 ㎍, 매주 근육내 주사) 처리된 마우스에서 관찰되었지만, TBS (비히클) 처리된 대조군은 예측된 근육 수축 특징보다 더 빨리 나타내었다.

실시예 8

TTC 투여 후 힘:근육량 비의 증가

본 명세서에 제공된 실험 데이터는, 재조합 단백질로서 근육내 전달되었든지 플라스미드 (네이키드 DNA)에 의해 발현되었든지 어느 것이든 간에 TTC가 모델 마우스에서 근육량 및 근력:질량 비에서 개선을 가져옴을 보여준다.

재료 및 방법

1. TTC를 인코딩하는 네이키드 DNA

TTC (파상풍 독소 중쇄의 C-말단 도메인; 서열 번호 2)를 인코딩하는 유전자를 거대세포바이러스 (CMV) 극초기 프로모터의 제어 하에서 pcDNA3.1 (인비트로젠) 진핵세포 발현 플라스미드 내로 클로닝하였다. BamHI 및 NotI 제한 효소로 pGex-TTC 플라스미드로부터 TTC 유전자를 제거하고, pCMV에 삽입하여 pCMV-TTC 플라스미드를 만들었다. 서열분석 후, 화학적으로 컴피턴트한 대장균 (DH5)에서 벡터를 증폭시키고 엔도프리 플라스미드 메가키트(퀴아젠)를 사용하여 정제하였다.

모든 테스트된 파라미터들은 약물 물질에 대한 허용 기준의 범위 내에 있었다 (외관, 농도, 순도, 플라스미드 및 pDNA 서열의 동일성 및 크기).

2. TTC 단백질

TTC (파상풍 독소 중쇄의 C-말단 도메인; 서열 번호 2)로서 코딩된 단백질을 높은 세포 밀도 구성으로 유가 공정으로 대장균 균주 BL21 (DE3)을 사용하여 생물반응기에서 생산하였다. 아이소프로필 β-D-티오갈락토시드 (IPTG)의 첨가에 의해 TTC 단백질을 발현하도록 대장균 BL21 세포를 유도하였다. 리소자임 및 DNAase-I의 존재 하에서 세포를 용해시키고, 황산암모늄을 사용한 염석 과정 후, 액체 크로마토그래피로 단백질을 단리하고 정제하였다 (금속-친화성, 소수성 상호작용 및 이온 교환). 또한, 순도 및 세균성 엔도톡신 수준 (Lal 테스트)을 결정하였다.

미리, 대장균의 코돈 사용빈도를 조정하여 유전자 서열을 합성하고, NdeI 및 XhoI (퍼멘타스) 효소에 의한 제한에 의해 발현 플라스미드 pET24b (노바젠) 내로 클로닝하였다. 발현 벡터를 생산 균주 BL21 DE3로 변형시켰으며, 이때 이러한 생산은 생물 반응기에서 수행되었다.

3. 유전자도입 마우스

더 잭슨 래보러토리 (JAX)로부터 G93A 돌연변이를 갖는 인간 SOD1을 과발현하는 유전자도입 마우스를 얻었다. 성차를 없애고 연구에 요구되는 동물의 마리수를 최소화하기 위해, 모든 분석에 대해 암컷 B6SJL-Tg (SOD1G93A) 1Gur/J 마우스를 독점적으로 사용하였다. 모든 실험용 암컷 유전자도입 마우스를 만들기 위해 수컷 B6SJL-Tg (SOD1G93A) 1Gur/J 마우스 (JAX로부터 구입함)를 C57Bl6/J x SJL 교배의 암컷 F1 자손과 교배하였다. 도입유전자 발현이, 이유 후 채취한 귀 생검 조직의 PCR 분석에 의해 확인되었다. 동물을 UCL 신경학 연구소 (UCL Institute of Neurology)의 시설에 보존하였다. 이들에 물 및 먹이를 임의로 제공하였다. 모든 실험들을 실험실 동물의 사용에 대한 국제 가이드에 따라 진행하였다.

4. 화합물의 근육내 투여

모든 화합물을 생후 일수 70 (유증상 단계)에서 시작하여, 지정된 부피 (60 μL의 총 주사 부피)로 하기 뒷다리 근육 내로 양쪽 근육내 (i.m.) 주사에 의해 전달하였다:

전경골 (TA) = 4 μl × 2

대퇴 사두근 = 14 μl × 2

하퇴 삼두근 (비복근) = 12 μl × 2

장지신근 (EDL) 근육에는 직접 주사하지 않았지만, 이것은 TA 근육에 바로 근접해 있기 때문에, 확산에 의한 주입에 노출됨을 보장한다. 표적 근육으로의 정확한 전달을 보장하기 위해 그리고 깨어있는/반응성인 마우스에서 바늘-유도성 손상을 줄이고 불필요한 통증을 피하기 위해, 모든 근육내 주사는 아이소플루란 마취 하에서 수행되었다. 압력 관련 근육 손상의 유도, 즉 구획 증후군을 피하기 위한 노력으로, 주사 부피는 총 근육 부피의 15% 미만으로 유지하였다.

연구에 사용된 용량은, 플라스미드에 대해서는 300 ㎍ (단회 또는 매주 투여됨), 그리고 단백질에 대해서는 10 ㎍ (매주 투여됨)이었다.

5. 근육 수축력 (경련 힘 및 강직 힘)의 측정

중간-넓적다리 영역에서 좌골 신경을 노출시키고 근위방향으로 절편화한 후 전극 위에 놓았다. 근육 길이를 최대 경련 힘에 따라 조절하였다. 이어서, 좌골 신경을 0.02 ms 구형파 펄스로 자극하여 최대 단일 경련 힘을 기록하였다. 40, 80 및 100 ㎐에서 일련의 자극으로 좌골 신경을 자극하여 최대 강직 힘을 결정하였다. 기록된 최대 경련 힘으로부터, 피크 수축에 도달하는 데 걸리는 시간 (피크 도달 시간; TTP) 및 절반 이완에 도달하기까지의 시간 (1/2RT)의 측정에 의해 근육 수축 특징을 결정하였다. 도 17 및 도 18을 참조한다.

결과

TA 근육량이, pcDNA3.1TTC 플라스미드 (단회 및 매주 근육내 주사 둘 다) 및 TTC 단백질 (10 ㎍, 매주 근육내 주사) 처리된 마우스에서, 그들 각각의 대조군과 비교하여 유의하게 증가된 것으로 확인되었다 (도 22의 A). EDL 근육량 또한 pcDNA3.1TTC 플라스미드 (매주 근육내 주사) 처리된 마우스에서 유의하게 증가되었지만, TTC 단백질 처리의 효과는 더 작았다 (도 22의 B). 이는, SOD1G93A 마우스에서 TA 근육이 전형적으로 EDL 근육보다 더 초기 단계에서 더 심하게 영향을 받고, EDL 근육의 작은 크기로 인해, 이로써 질량의 임의의 변화가 TA에서 관찰되는 것보다 대체로 더 감지하기 힘들다는 사실을 반영할 수 있다.

현미경법 데이터 또한 TTC 주사 후의 근육량의 증가를 보여준다 (도 23). 120일 SOF1G93A 마우스로부터의 표재성 하퇴 삼두근을 비히클 또는 TTC 단백질로 처리하였다 (10 ㎍, 매주 근육내 주사). 현미경 사진은 TTC-처리된 근육에서 매우 비대한 근육 섬유를 보여주었는데, 이러한 근육 섬유는 하퇴 삼두근 내의 동일한 위치로부터의 비히클 처리된 근육에는 부재하였다.

힘:질량 비 데이터는 pcDNA3.1TTC 플라스미드 (매주 근육내 주사) 및 TTC 단백질 (10 ㎍, 매주 근육내 주사) 처리 둘 다가 그들 각각의 대조군과 비교하여 TA 및 EDL 근육 기능에 있어서 유의한 개선을 가져왔음을 입증하였다 (도 21의 A 및 도 21의 B 참조). pcDNA3.1TTC 플라스미드의 단회 용량 근육내 투여는 TA 근력:질량 비를 유의하게 증가시켰지만, EDL 근육에서는 pcDNA3.1TTC 플라스미드의 매주 투여만이 힘: 질량 비를 유의하게 증가시켰다. 추가적으로, TTC 단백질 (10 ㎍)의 매주 투여는 EDL 근육에서의 매주 pcDNA3.1TTC 플라스미드 전달과 비교하여 힘:질량 비에서 유의하게 더 높은 효과를 발휘하였지만, TA 근육에 대해서는 그렇지 않았다.

실시예 9

근육 바이오마커 평가

손상된/소모된 근육 (EDL)에서의 TTC 단백질의 복막내 처리는 ALS 질병 진행의 마커의 발현 수준을 건강한 동물의 값에 더 가까워지게 하고 산화적 스트레스를 줄이는 것으로 나타났다. 한편, TTC 처리는 질병에 대해 더 높은 저항성을 갖는 근육에서 근육 완전성과 관련된 유전자의 발현을 상승시켰다.

골격근 생검에 기초하여, Mef2c, Gsr, Col19a1, Calm1 및 Snx10은 유전자도입 SOD1G93A 마우스에서 장수의 잠재적인 유전적 바이오마커인 것으로 제안되어 왔다. 문헌[Calvo et al. PLoS ONE 7(3): e32632 (2012)]을 참조하고, 이는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 전사 수준의 유의한 상향조절이, 초기 무증상 단계에서부터 말기까지 Calm1을 제외한 모든 유전자에서 확인되었다.

TTC에 의한 처리 후 SOD1G93A 마우스에서 유전자 바이오마커의 발현을 연구하기 위해, 빠른 장지신근 (EDL) 및 느린 가자미근을 사용하였다. 이들 조직의 선택은, 증상 전 (presymptomatic) SOD1G93A 마우스에서는, 검출가능한 말초 기능장애가 없어서, 근육 병리가 운동 뉴런성 기능장애에 속발한다는 증거를 제공하였지만, 질병의 말기에는, 단일 근육 섬유 수축 분석이, 빠른-경련 근육 섬유 및 신경근 접합부가 ALS-유도 탈신경 (denervation)에 의해 우선적으로 영향을 받아서, 칼슘으로 활성화될 때 그들의 동일 일령의 대조군으로부터의 근육 섬유와 동일한 수준의 힘을 생성할 수 없었다는 것을 입증하는 이전의 관찰에 기초하였다. 문헌[Atkin et al. Neuromuscular Disorders 15: 377-388 (2005)]을 참조한다.

재료 및 방법

1. 유전자도입 마우스

G93A 인간 SOD1 돌연변이 (B6SJL-Tg[SOD1-G93A]1Gur)를 갖는 유전자도입 마우스를 더 잭슨 래보러토리 (미국 메인주 바 하버 소재)로부터 구입하였다. SOD1G93A 수컷을 암컷 한배 새끼와 교배시켜 반접합체를 유지하였다. hSOD1 유전자도입 마우스의 유전자형 결정을 위한 더 잭슨 래버러토리 프로토콜에 기재된 바와 같이, 꼬리 조직으로부터 추출된 DNA의 PCR 증폭에 의해 자손을 확인하였다. 국제적 절차에 따라 마우스를 수용하였고 물과 먹이는 임의로 이용가능하였다. 모든 실험 절차는 윤리위원회에 의해 승인되었고 근위축성 측삭 경화증 (ALS) /운동 뉴런 질병 (MND)에 대한 약리학적 활성 약물의 전임상 생체내 평가를 위한 가이드라인에 기초한 실험실 동물의 사용에 관한 국제 가이드라인을 따랐다.

2. TTC 단백질

문헌[Herrando-Grabulosa et al. J Neurochem. 124(1):36-44 (2013)]에 기재된 바와 같이, (6xHis)-태깅된 (tagged) TCC를 인코딩하는 벡터로 미리 형질감염된 대장균 BL21 세포로부터 His-태깅된 TTC를 얻었으며, 이 문헌은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

대장균 BL21 세포를 (6xHis)-태깅된 TTC를 인코딩하는 pQE3 (미국 캘리포니아주 채스워스 소재의 퀴아젠) 벡터로 형질전환시키고, 이전에 보고된 바와 같은 100 mg/mL 암피실린을 함유하는 루리아 베르타니 (Luria Bertani) 배지에서 성장시켰다. 0.4 mM 아이소프로필 b-D-티오갈락토시드 (IPTG)를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 3시간 후, 39 N (4000 g)에서 20분 동안 4℃에서 원심분리하여 세포를 펠릿화하고, 용해 완충액 (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 및 1% 트리톤-X-100; pH 8)에서 재현탁하고 얼음 위에서 30초씩 6회 초음파처리하였다. 현탁액을 294 N (30,000 g)에서 30분 동안 4℃에서 원심분리하였다. His-태깅된 단백질을 함유하는 투명한 상청액을 코발트 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 혼합된 단백질을, 미리 평형화된 (50 mM NaH₂-PO₄.H₂O 및 300 mM NaCl; pH 7) 코발트아가로스 수지 (탈론 (TALON) 금속 친화성 수지; 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 클론테크 래버러토리즈 (Clontech Laboratories))를 함유하는 급속 단백질 액체 크로마토그래피 (Fast Protein Liquid Chromatography) (FPLC)로 주입하였다. 수지를 용출 완충액 (50 mM NaH₂PO₄.H₂O 및 300 mM NaCl; pH 7)으로 세척하여 His-태그가 없는 단백질을 용출하였다. TTC는 6개의 히스티딘을 함유하였고, 수지 중에 보유되어 Co-복합체를 형성하였다. 용출 완충액 (50 mM NaH₂PO₄.H₂O, 300 mM NaCl 및 150 mM 이미다졸; pH 7)으로 TTC를 용출하였다. 수집된 분획들의 부피는 0.5 mL였다. 용출 과정은, 일정하게 280 nm에서의 흡광도를 측정하는 FPLC 시스템으로 추적될 수 있다.

12%의 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)으로 단백질을 분리하였다. 겔코드 블루 염색 시약 (GelCode Blue Stain Reagent) (미국 일리노이주 록포드 소재의 피어스 케미칼 컴퍼니 (Pierce Chemical Co.))으로 겔을 염색하고, 정제된 TTC 단백질을 함유하는 분획을 4℃에서 밤새 투석하고 (40 mM Na₂HPO₄, 10 mM NaH₂PO₄ 및 150 mM NaCl; pH 7.4), 새로운 완충액으로 2시간 동안 투석하였다. 바이신코닌산 검정법 (BCA; 피어스 케미칼 컴퍼니)을 사용하여 단백질 농도를 결정하고 동결건조하였다. TTC를 분취물로 해서 -20℃에서 저장하였다.

3. 복막내 투여

SOD1G93A 유전자도입 마우스에 10 ㎍의 TTC/주사 (주사된 부피는 200 μL임)를 인슐린 주사기 (25GA 5/8 스페인 마드리드 소재의 벡톤 디킨슨 에쎄아)를 사용하여 60 일령 및 75 일령에 복막내 주사하였다. 야생형 마우스 (대조군으로 사용됨)를 또한 동일한 프로토콜로 처리하였다.

4. 생물학적 샘플의 추출

마우스 (수컷 및 암컷에 대해 균형을 맞춤)를 80 일령에 CO₂ 챔버에서 질식시켜 안락사시켰다. 이어서, 조직 (가자미근 및 장지신근)을 회수하고, 액체 질소에서 스냅-동결 (snap-freezing)시킨 후 벡터 발현 검출을 위해 ―80℃에서 저장하였다. 야생형 동일 일령 마우스로부터의 조직을 또한 추출하였다.

5. 유전자 발현의 분석

조직을 액체 질소에서 동결시키고 차가운 막자사발에서 분쇄하였다. 근육 섬유에서의 바이오마커 유전자의 발현을 결정하기 위해, 트리졸 시약 프로토콜 (인비트로젠 에쎄.아.)에 따라 균질화된 근육으로부터 총 RNA를 추출하였다. 클로로포름, 차가운 아이소프로판올 및 차가운 에탄올에 의한 분획화 후에 RNA를 얻었다. 일단 터보-DNA 프리 (Turbo-DNA free) 키트 (암비온 (Ambion))로 남아 있는 DNA를 제거하면, 수퍼스크립트™ 퍼스트-스트랜드 신테시스 시스템 키트 (인비트로젠)를 사용하여 RNA의 역전사로 상보적 DNA (cDNA)를 얻었다.

TTC 처리로 인한 조직에서의 유전자 발현 변동을 실시간 PCR로 검정하였다. 정규화를 위해 2개의 내인성 유전자들 (GAPDH 및 β-액틴)을 사용하였다. 각 관심 유전자에 대한 프라이머 및 프로브 혼합물은 어플라이드 바이오시스템즈에 의해 공급되었다 (표 4). 에이비아이 프리즘 7000 시퀀스 디텍션 시스템 (어플라이드 바이오시스템즈)에서 PCR 반응을 수행하였다.

[표 4]

결과

(질병에 가장 많이 영향을 받고 이 단계에서 재생력이 없는) EDL 근육에서, 복막내 TTC 처리 후, Gsr, Col19a1 및 Snx10의 mRNA 발현은 야생형 값에 가깝게 감소하였는데, 이러한 감소는 유전자도입 SOD1G93A 마우스에서 장수의 예측인자로서 주장되어 왔기 때문에 근육에 유익할 것으로 기대될 것이다 (문헌[Calvo et al. 2012]) (도 24 참조).

가자미근에서, TTC의 복막내 주사는 야생형 마우스에 비해 SOD1G93 마우스에서 Col19a1 및 Snx10의 발현에 있어서 증가를 유도하였다 (도 25 참조). 이러한 결과는 TTC가 질병 진행에 의해 가장 많이 영향을 받는 근육 (EDL)과 아직 완전히 영향을 받지 않은 근육 (가자미근)에서 상이한 보호 효과를 발휘할 수 있다는 것을 제시한다. 따라서, EDL에서, TTC의 투여는 근육량의 손실의 예방과 연관될 바이오마커의 수준의 감소를 야기하였으며, 그 결과 개선된 생존을 가져왔다. 가자미근에서, TTC 투여는 근육량 증가와 연관되는 바이오마커 단백질의 발현을 유도하는 것으로 관찰되었다.

Gsr 바이오마커 결과는 유전자도입 SO1G93A에서 근육의 산화적 스트레스의 조절에서의 TTC의 개입과 관련될 수 있을 것이다.

실시예 10

근력에 대한 TTC-단백질 및 TTC-플라스미드 투여의 효과

방법

1. 실험 설계.

모든 동물에서, 하나의 전경골 (TA) 근육에 저온병변 (cryolesion)을 발생시켰다. 동물 (10 주령)들을 상이한 군들 (n=5)에 배정하고, 이들에 저온병변을 발생시키고, 손상 직후, 손상 후 일수 7 및 일수 14에 (단백질) 또는 손상 직후 및 손상 후 일수 15에 (플라스미드) 처리하였다. 일수 15 및 30에서 측정을 실시하였다.

시험용 생성물 (investigational product)을 근육내 주사 (0.67 ㎍의 단백질/주사 또는 20 ㎍의 플라스미드/주사)로 투여하였다. 각각의 음성 대조로 인산염 완충 식염수 및 공 (체계화 (codifying)하지 않은) 플라스미드를 사용하였다. 비손상 동물도 모니터링하였다.

마취 하에서, 마우스의 뒷다리를 면도하고 양쪽 전경골근 (TA)을, 근육 위를 덮고 있는 무균적으로 준비된 피부에서 1 cm 길이의 절개를 통해 노출시켰다. 드라이 아이스의 온도 (-79℃)로 예비-냉각된 120 mm 지름의 강철 프로브를 TA 근육의 볼록한 부분 (belly)에 10초 동안 적용하여 외상성 동결 손상을 유도하였다. 손상 절차 후, 피부 절개부를 6-0 실크 봉합사를 사용하여 닫았다. 이러한 절차는, 경골의 돌기 (spike)로부터 원위방향으로 확장되고 대략 근육의 3분의 1에 걸쳐 퍼지는 소상성 (focal) 손상을 유도하였다. 에반스 블루 (Evans Blue) 표지화로 평가된, 병변 부위의 평균 길이 및 최대 횡단면적은 각각 3202±14 μm 및 3875789±27501 μm² (평균±SEM)이었다. 그 후에, 저체온증을 막기 위해, 동물을 따뜻한 플레이트 (37℃) 위에서 1 시간 동안 유지하였다.

2. 힘 측정.

동물 체중 10 g당 2.2 mg 케타민/0.4 mg 자일라진/0.22 mg 아세프로마진을 복막내 주사하여 스위스 (Swiss) 마우스를 마취하였다. 몸 및 근육을 37℃에서 유지하기 위해 동물을 가열 패드 (heating pad) 위에 놓았다. TA 근육의 원위부 건 (distal tendon)을 그라스 피지오그래프 (Grass physiograph) (모델 79D, 미국 워릭 소재의 그라스 테크놀로지즈 (Grass Technologies))에 연결된 FT03 그라스 인스트루먼츠 (Grass Instruments) 힘 변환기에 부착하였다. 또한, 이 폴리그래프 (polygraph)의 출력을 디지털 데이터 획득 시스템 (KCPI3104, 키슬리, 유에스에이 (Keithley, USA))에 연결하여 5 ㎑의 샘플링 속도로 힘을 획득하였다. pH=7.4를 유지하기 위해 O₂:CO₂ (95:5)의 혼합물로 연속적으로 기체 공급되는 (gassed), 118.5 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.3 mM CaCl₂, 3.1 mM MgCl₂, 25 mM NaHCO₃, 2 mM NaH₂PO₄, 및 5.5 mM D-글루코스를 함유하는 생리 용액으로 TA를 촉촉하게 유지하였다. 비골 신경의 짧은 부분에서 0.6 cm 떨어진 2개의 백금 와이어를 사용하여 필드 자극에 의해 100초마다 수축을 유발시켰다. 백금 전극을 그라스 S88X 자극기 및 그라스 SIUV 격리 유닛 (미국 워릭 소재의 그라스 테크놀로지즈)에 연결하였다. 10 V에서 1회의 0.3 ms 구형 펄스로 단일 경련을 유발시켰다. 200 ㎐에서 일련의 200 ms 펄스로 파상풍성 수축 동안의 최대 힘을 측정하였다.

결과

1. 근력에 대한 TTC 투여의 효과.

동결-손상된 TA 근육에 TTC 또는 PBS (비히클)를 근육내 주사를 통해 투여하였다 (15일 동안 33.5 ㎍/㎏ 체중/7일). TTC-단백질의 근육내 주사는 손상 후 15일에 경련 힘 및 강직 힘의 증가를 야기하였다 (도 26). 손상 후 30일에, 동결-손상된 TA 근육 및 TTC-단백질로 처리된 근육 사이에 경련 힘은 유의하게 상이하지 않았지만 (도 28, 패널 A), 강직 힘은 증가하였다 (도 28, 패널 B).

손상 후 15일에, TTC-처리된 군 및 대조군 (손상군 및 PBS 처리된 군, 및 비손상군)들에서의 TA 근육의 힘-진동수 곡선은 PBS로 처리된 손상된 군에 대해 TTC-단백질 군에서 지속적으로 더 높은 힘 값을 보여주었다 (도 27). 손상 후 30일에, 힘-진동수 곡선은 PBS-처리된 군에 대해 TTC-단백질 처리된 군이 더 낮은 진동수 (대략 100 ㎐ 미만)에서는 더 낮은 힘 값을 제시하였지만 더 높은 진동수 (대략 100 ㎐ 초과)에서는 더 높은 힘 값을 제시하였음을 보여주었다 (도 29).

2. 근력에 대한 플라스미드-TTC 투여의 효과.

TTC를 인코딩하는 플라스미드 또는 공 플라스미드를 동결-손상된 TA 근육에 근육내 주사를 통해 투여하였다 (손상 후 15일 동안 1 ng/㎏ 체중의 단회 주사). 도 30 및 도 32는 각각 손상 후 15일 및 30일에 경련 힘 및 강직 힘에 대한 TTC-플라스미드의 근육내 주사의 효과를 보여준다. 양쪽 시나리오에서, TTC를 인코딩하는 플라스미드의 투여는 PBS로 처리된 손상군에 대해 경련 힘 및 강직 힘을 유의하게 증가시켰다.

도 31 및 도 33은 TTC-처리된 군, 공-플라스미드 처리된 군, 및 비손상 (대조)군들에서의 각각 손상 후 15일 및 30일에서의 TA 근육의 힘-진동수 곡선을 보여준다. 양쪽 시나리오에서, TTC를 인코딩하는 플라스미드의 투여는 공-플라스미드 처리된 군에 대해 TTC-플라스미드 처리된 군에서 힘을 유의하게 증가시켰다.

실시예 11

TTC의 근원성 (myogenic) 효과: C2C12 근아세포에서의 시험관내 연구

재료 및 방법

1. 재료

항-MHC 및 항-미오게닌 항체는 발달 연구 하이브리도마 은행 (Developmental Studies Hybridoma Bank) (미국 아이오와주 소재)으로부터 입수하였다. 항-GADPH는 압캠 (Abcam) (영국 케임브리지 소재)으로부터 입수하였다. 이차 항체는 지이-아머샴 (GE-Amersham) (영국 버킹엄셔 소재)에서 구입하였다. 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle Medium) (DMEM), 우태아 혈청 (FBS) 및 말 혈청 (HS)은 론자 (Lonza) (스페인 폰테베드라 소재)로부터 입수하였다. 모든 다른 화학 시약은 시그마 케미칼 컴퍼니 (Sigma Chemical Co.) (미국 미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 입수하였다.

2. 세포 배양 및 분화

마우스 C2C12 근아세포를 시그마 케미칼 컴퍼니를 통해 공급자 (영국 윌트셔 소재의 ECACC)에 의해 설명된 바와 같이 배양하였다. 간략히 말하면, C2C12 근아세포를 10% (v/v) 우태아 혈청 (FBS), 100 U/mL 페니실린, 및 100 U/mL 스트렙토마이신으로 보충된 DMEM (4.5 g/L 글루코스, L-글루타민)을 함유하는 성장 배지 (GM) 중에 유지하였다. 일상적인 분화를 위해, 세포를 80% 융합도 (confluence)로 성장시키고, 달리 명시되지 않는다면, GM을 7일 동안 분화 배지 (DM; 2% FBS, 100 U/mL 페니실린, 및 100 U/mL 스트렙토마이신으로 보충된 DMEM)로 대체하였다. 이 기간 동안, 24시간마다 DM에 TTC를 1, 10 및 100 nM로 투여하였다.

3. BrdU 기술을 이용한 증식 검정.

ELISA BdrU 세포 증식 키트 (미국 인디애나주 소재의 로슈 (Roche))를 사용하여 증식 검정을 진행하였다. 세포를 96 웰 플레이트 [10.000개 세포/웰]에서 GM 또는 TTC (1, 10 및 100 nM)로 보충된 GM 중에서 48시간 동안 배양하였다. 제조사의 설명서에 따라 샘플을 처리하였다. 베르사맥스플러스 (VersaMaxPLUS) 판독기 (λ=370 nm; 21분)를 사용하여 BrdU 혼입을 측정하였다.

4. 면역블롯 분석.

37℃에서 지시된 시간 동안 상이한 처리로 세포를 자극하였다. 얼음처럼 차가운 RIPA 완충액 [50 mM Tris-HCl (pH 7.2), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% (v/v) NP-40, 0.25% (w/v) Na-데옥시콜레이트, 프로테아제 억제제 칵테일 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마 케미칼 컴퍼니), 포스파타제 억제제 칵테일 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마 케미칼 컴퍼니)] 중에 세포 샘플을 직접 용해시켰다. 원심분리 (4℃에서 15 분 동안 137 N (14,000xg))로 용해물을 청징화하고, 퀀티프로 (QuantiPro)TM BCA 검정 키트 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마 케미칼 컴퍼니)를 사용하여 단백질 농도를 정량하였다. 면역블롯팅을 위해, SDS-PAGE를 사용하여 등량의 단백질을 분리하고 니트로셀룰로스 막으로 전달하였다. 면역반응성 밴드를 향상된 화학발광 (피어스 이씨엘 웨스턴 블롯팅 기질 (Pierce ECL Western Blotting Substrate); 미국 일리노이주 록포드 소재의 서모 피셔 사이언티픽 (Thermo Fisher Scientific), 피어스)으로 검출하였다. 이미지제이64 분석 소프트웨어를 사용하여 정량화를 수행하였다.

5. 면역세포화학.

수퍼프로스트 플러스 커버슬립 (Superfrost Plus coverslip) (독일 브라운슈바이크 소재의 서모 사이언티픽) 상에서 C2C12 세포를 배양하고 분화시켰다. 온전한 세포를 4% 완충된 파라포름알데하이드-PBS로 고정하고, 세척하고, 투과화시키고, PBS/트리톤 X-100으로 30분 동안 블로킹하였다. 세포를 PBT 중에 희석된 일차 항체 (항-MHC 항체)로 밤새 4℃에서 염색하였다. 이어서, 세포를 세척하고, PBS/트리톤 X-100 중에서 이차 항체와 함께 45분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. DAPI를 사용하여 세포 핵을 대조 염색하였다 (미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재의 라이프 테크놀로지즈 (Life Technologies), 인비트로젠). 라이카 (Leica) TCS-SP5 분광형 공초점 현미경 (독일 하이델베르크 소재의 라이카 마이크로시스템즈 (Leica Microsystems))로 세포 배양물의 디지털 이미지를 획득하였다. 각 처리에 대해, 3개의 독립적 실험들로부터 5개의 필드를 랜덤하게 선택하였다. 이미지제이64 분석 소프트웨어를 사용하여 면적, 지름 및 근핵 응집의 정량화를 수행하였다.

6. 데이터 분석.

데이터 분석. 모든 값은 평균 ± 평균의 표준 오차 (SEM)로 제시되어 있다. 스튜던트 t 검정을 수행하여 2-원 분석 (2-way analysis)의 통계적 유의성을 평가하였다. * P<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

결과 및 토의

1. 근아세포 C2C12 세포에서 TTC의 유사분열촉진 능력.

근육발생, 근아세포 증식, 및/또는 분화의 상이한 단계에서의 TTC의 역할을 결정하기 위해, 증식 조건 (GM)에서 용량-효과 실험 (1 내지 100 nM)으로 TTC의 유사분열촉진 활성을 분석하였다.

도 34에 나타난 바와 같이, 테스트된 용량에 대해 유의한 증가가 있었지만, 테스트된 용량 사이에 유의한 차이는 관찰되지 않았다 (1 내지 100 nM). TTC 처리는 대조군 (GM) 대비 1, 10 및 100 nM에 대해 각각 37.7±0.7, 38.8±0.7 및 36.8±0.6의 증가로 이어졌다. 대조군 대비 통계적으로 유의한 이러한 증가 (P<0.05)는 1 nM에서 최대인 것으로 나타났다.

2. C2C12 세포에서 TTC의 근원성 능력.

근원성 동일성의 한계를 정하는 유전자 및 마이크로RNA 발현 프로그램을 설명하는 일련의 전사 및 염색질 리모델링 인자에 집중되는 세포내 경로에 의해 근원성 프로그램을 결정한다. 근원성 전사 인자는 계통 진행 (lineage progression) 동안 시공간적으로 활성화되거나 억제되는 계층적 (hierarchical) 유전자 발현 네트워크에서 조직화된다 (문헌[Yin et al. (2013) Physiol Rev 93: 23-67]; 문헌[Tidball et al. (2010) Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 298: R1173-R1187]). 특히, 미오게닌은 근아세포 계통 실행 (lineage commitment)에 필수적이다.

TTC가 근육발생을 자극하는지를 조사하기 위해, C2C12 근아세포를 DM+TTC (1 내지 100 nM)로 7일의 분화 기간 동안 처리하였다. 도 35에 나타난 바와 같이, 면역블롯에 의해 검출된 바와 같이, 미오게닌의 단백질 수준은 DM에서의 대조 세포에 비해 용량-의존적 증가를 나타내지 않았다. 이러한 사실은 근원성 과정 동안 미오게닌 발현에서의 TTC의 역할을 제외시켰다. 이러한 조건 하에서, 분화 과정의 초기 단계 동안 미오게닌의 단백질 수준은 대조 세포 (DM)와 비교하여 TTC-처리된 C2C12 세포 (10 및 100 nM)에서 하향-조절되었다.

다른 전사 조절자와 함께, 근원성 조절 인자는 말기 근원성 분화를 결정하는 근육-특이적 유전자, 예컨대 미오신 중쇄 (MHC)의 발현을 유도한다 (문헌[Yin et al. (2013) Physiol Rev 93: 23-67]; 문헌[Braun et al. (2011) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 12: 349―361]).

MHC 발현의 프로모터로서의 TTC의 활성을 평가하기 위해, C2C12 세포를 7일 동안 일정 농도 범위 (1 내지 100 nM)의 TTC로 보충된 DM으로 옮겨두었다. 도 36에 나타난 바와 같이, 면역블롯에 의해 검출된 바와 같이, MHC의 단백질 수준은 대조 분화된 세포 (DM)와 비교하여 1 nM에서 상향-조절되었다. 면역블롯 분석은 대조 세포와 비교하여 10 nM에서 MHC의 정상적인 단백질 발현을 보여주었다. 주목할 만한 것은, MHC의 단백질 발현에서의 억제 작용은 분화 과정을 따라 100 nM의 TTC 농도에서 나타났다는 것이다.

3. 분화 등급에 대한 TTC 효과의 평가.

또한, 근관 비대에서의 TTC의 활성을 평가하였다. 이 테스트에서는, C2C12 세포를 7일 동안 일정 농도 범위 (1 내지 100 nM)의 TTC로 보충된 DM으로 옮겨두고, 공초점 현미경법을 사용하는 면역형광법 (MHC/DAPI)으로 분화 등급을 조사하여, 분화 및 융합 지수, 및 근관 면적 및 배향을 결정하였다 (도 37).

7일 후, TTC-처리된 세포의 근관 면적 (μm²)은 대조 세포 (DM)와 비교하여, 1, 10 및 100 nM TTC에 대해, 각각 268.7±6, 310.0±5 및 56.4±2로 유의하게 증가하였다 (DM: 9895.6±47.5 μm²; DM+1 nM TTC: 36488.1±550 μm²; DM+10 nM TTC: 39696.0±448 μm²; DM+110 nM: 15472.8±180 μm²) (도 38).

이러한 검정에 대해, TTC-처리된 세포의 근관 지름 (μm)은 대조 세포 (DM)와 비교하여, 1, 10 및 100 nM TTC에 대해, 각각 150.2±1.2, 179.0±1.4 및 33.7±0.3으로 유의하게 증가하였다 (DM: 18.83±0.1 μm; DM+1 nM TTC: 47.1±0.2 μm; DM+10 nM TTC: 52.5±0.3 μm; DM+110 nM: 25.2±0.2 μm; 도 39). 더욱이, 융합 지수는 대조 세포와 비교하여, 10 및 100 nM TTC에 대해 유의한 증가를 나타내었다 (DM: 69±5; DM+1 nM: 81±4; DM+10 nM: 86±1; DM+110 nM: 90±1; 도 40).

TTC-처리된 세포의 근관당 핵의 수 (MHC 양성 세포: MHC+; 도 41)는 대조 세포에 비해 유의하게 증가하였다 (DM: 4.5±0.1; DM+1 nM TTC: 13.7±2.6; DM+10 nM TTC: 15.8±0.9; DM+1 nM TTC: 11.8±1.4). 종합하면, 이들 데이터는 TTC가 1 및 10 nM에서 근관 성장 부피를 제어한다는 것을 보여주었다. 이는 면적, 지름, 융합 지수 및 근관과 관련된 근핵의 수에서의 효과적인 작용에 의해 뒷받침된다. 주목할 만한 것은, 비록 근관에 대해 소정의 작용을 보였지만, 100 nM TTC는 1 및 10 nM TTC-처리된 세포와 비교하여 근관 면적 및 지름을 감소시키는 것으로 나타났다는 것이다. 그러나, 이 용량은 융합 지수 및/또는 근관과 관련된 근핵의 수에서 유의한 증가를 나타내었다.

이러한 조건 하에서는, 근관 신장에 대한 명확한 효과가 관찰되었다 (도 42). 사실, 수직축에 대한 각도의 측정에 의한 근관 배향의 평가는 근관의 분산에 있어서 유의한 감소를 나타내었다 (도 43). 더욱이, 100 nM TTC 하에서의 83.6±1.2%의 근관은 근관 도처에서의 핵 분포 또는 핵 정렬을 나타내었으며, 단지 10.0±1.0%만이 응집된 핵 분포를 보였는데, 이는 근관 기능성의 증가와 상관될 수 있다 (문헌[Metzger et al. (2012) Nature 484:120-124]) (핵 정렬을 갖는 총 근관의 백분율: DM: 21.8±1.0; DM+1 nM TTC: 56.3±1.4; DM+10 nM TTC: 55.8±0.8). 올바른 근핵 정렬 및 근관 배향은 근육 기능적 출력에 대한 구조적 효과 및 근원성 효과 둘 다를 발휘한다 (문헌[Bian et al. (2012) Tissue Eng. 18:957-967]).

핵 응집을 나타내는 근관 집단은 1 및 10 nM TTC에서 각각 34.2±1.5 및 34.8±0.8%였는데, 이는 비대에 대한 더 큰 효과를 나타낸다. 종합하면, 실험 데이터는 낮은 용량의 TTC가 근관에 대한 비대 효과를 갖는다는 것을 나타낸다.

결론

TTC는 C2C12 근아세포 증식에 대한 효과를 나타낸다. 또한, TTC는 낮은 용량에서 비대 효과를 나타내는데, 이는 근관 면적 및 융합 지수의 증가와 연관된다. 더욱이, 높은 용량에서, TTC는 적절한 근핵 위치 및 근관 배향에 역할을 발휘한다.

***

상세한 설명 부분 - 그러나 발명의 내용 및 요약서 부분은 아님 - 은 청구범위를 해석하기 위해 사용하고자 한다는 것이 이해되어야 한다. 발명의 내용 및 요약서 부분은 본 발명자(들)에 의해 고려되는 바와 같은 본 발명의 하나 이상의 그러나 전부는 아닌 예시적인 실시 형태를 기술할 수 있으며, 이에 따라, 본 발명 및 첨부된 청구범위를 어떠한 식으로도 제한하고자 하지 않는다.

본 발명은 지정된 기능 및 그의 관계의 구현을 예시하는 기능적인 구성 요소를 이용하여 전술하였다. 이들 기능적 구성 요소의 경계는 설명의 편의상 본 명세서에서 임의대로 규정하였다. 지정된 기능 및 그의 관계가 적절히 수행되는 한 대안적인 경계가 규정될 수 있다.

구체적 실시 형태의 전술된 설명은 다른 사람이 당업계의 기술 내에서 지식을 적용함으로써, 본 발명의 일반적 개념으로부터 벗어나지 않고서, 과도한 실험 없이, 그러한 구체적 실시 형태를 다양한 적용에 대해 용이하게 수정 및/또는 변형시킬 수 있도록 본 발명의 전반적 성질을 완전히 보여줄 것이다. 따라서, 그러한 변형 및 수정은 본 명세서에 제시된 교시 및 지침에 기초하여, 개시된 실시 형태의 등가물의 의미 및 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 본 명세서에서의 표현 또는 용어는, 본 명세서의 용어 또는 표현이 교시 및 지침에 비추어 당업자에 의해 해석되어야 하도록, 제한이 아니라 설명이 목적임이 이해되어야 한다.

본 발명의 범위 및 범주는 전술된 예시적인 실시 형태들 중 임의의 것에 의해 제한되어야 하는 것이 아니라 단지 하기의 청구범위 및 그의 등가물에 따라서만 한정되어야 한다.

본 출원에 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원, 및/또는 기타 문서는 마치 각 개별 간행물, 특허, 특허 출원, 및/또는 기타 문서가 모든 목적을 위하여 참고로 포함되는 것으로 개별적으로 지시된 것처럼 그와 동일한 정도로 모든 목적을 위하여 전체적으로 참고로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> SPHERIUM BIOMED UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA <120> METHODS OF INCREASING MUSCLE MASS USING NON-TOXIC TETANUS TOXIN C FRAGMENT (TTC) <130> 2908.005PC00 <150> 62/020,237 <151> 2014-07-02 <160> 11 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1392 <212> DNA <213> Clostridium tetani <400> 1 atggtttttt caacaccaat tccattttct tattctaaaa atctggattg ttgggttgat 60 aatgaagaag atatagatgt tatattaaaa aagagtacaa ttttaaattt agatattaat 120 aatgatatta tatcagatat atctgggttt aattcatctg taataacata tccagatgct 180 caattggtgc ccggaataaa tggcaaagca atacatttag taaacaatga atcttctgaa 240 gttatagtgc ataaagctat ggatattgaa tataatgata tgtttaataa ttttaccgtt 300 agcttttggt tgagggttcc taaagtatct gctagtcatt tagaacaata tggcacaaat 360 gagtattcaa taattagctc tatgaaaaaa catagtctat caataggatc tggttggagt 420 gtatcactta aaggtaataa cttaatatgg actttaaaag attccgcggg agaagttaga 480 caaataactt ttagggattt acctgataaa tttaatgctt atttagcaaa taaatgggtt 540 tttataacta ttactaatga tagattatct tctgctaatt tgtatataaa tggagtactt 600 atgggaagtg cagaaattac tggtttagga gctattagag aggataataa tataacatta 660 aaactagata gatgtaataa taataatcaa tacgtttcta ttgataaatt taggatattt 720 tgcaaagcat taaatccaaa agagattgaa aaattataca caagttattt atctataacc 780 tttttaagag acttctgggg aaacccttta cgatatgata cagaatatta tttaatacca 840 gtagcttcta gttctaaaga tgttcaattg aaaaatataa cagattatat gtatttgaca 900 aatgcgccat cgtatactaa cggaaaattg aatatatatt atagaaggtt atataatgga 960 ctaaaattta ttataaaaag atatacacct aataatgaaa tagattcttt tgttaaatca 1020 ggtgatttta ttaaattata tgtatcatat aacaataatg agcacattgt aggttatccg 1080 aaagatggaa atgcctttaa taatcttgat agaattctaa gagtaggtta taatgcccca 1140 ggtatccctc tttataaaaa aatggaagca gtaaaattgc gtgatttaaa aacctattct 1200 gtacaactta aattatatga tgataaaaat gcatctttag gactagtagg tacccataat 1260 ggtcaaatag gcaacgatcc aaatagggat atattaattg caagcaactg gtactttaat 1320 catttaaaag ataaaatttt aggatgtgat tggtactttg tacctacaga tgaaggatgg 1380 acaaatgatt aa 1392 <210> 2 <211> 462 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 2 Val Phe Ser Thr Pro Ile Pro Phe Ser Tyr Ser Lys Asn Leu Asp Cys 1 5 10 15 Trp Val Asp Asn Glu Glu Asp Ile Asp Val Ile Leu Lys Lys Ser Thr 20 25 30 Ile Leu Asn Leu Asp Ile Asn Asn Asp Ile Ile Ser Asp Ile Ser Gly 35 40 45 Phe Asn Ser Ser Val Ile Thr Tyr Pro Asp Ala Gln Leu Val Pro Gly 50 55 60 Ile Asn Gly Lys Ala Ile His Leu Val Asn Asn Glu Ser Ser Glu Val 65 70 75 80 Ile Val His Lys Ala Met Asp Ile Glu Tyr Asn Asp Met Phe Asn Asn 85 90 95 Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His 100 105 110 Leu Glu Gln Tyr Gly Thr Asn Glu Tyr Ser Ile Ile Ser Ser Met Lys 115 120 125 Lys His Ser Leu Ser Ile Gly Ser Gly Trp Ser Val Ser Leu Lys Gly 130 135 140 Asn Asn Leu Ile Trp Thr Leu Lys Asp Ser Ala Gly Glu Val Arg Gln 145 150 155 160 Ile Thr Phe Arg Asp Leu Pro Asp Lys Phe Asn Ala Tyr Leu Ala Asn 165 170 175 Lys Trp Val Phe Ile Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu Ser Ser Ala Asn 180 185 190 Leu Tyr Ile Asn Gly Val Leu Met Gly Ser Ala Glu Ile Thr Gly Leu 195 200 205 Gly Ala Ile Arg Glu Asp Asn Asn Ile Thr Leu Lys Leu Asp Arg Cys 210 215 220 Asn Asn Asn Asn Gln Tyr Val Ser Ile Asp Lys Phe Arg Ile Phe Cys 225 230 235 240 Lys Ala Leu Asn Pro Lys Glu Ile Glu Lys Leu Tyr Thr Ser Tyr Leu 245 250 255 Ser Ile Thr Phe Leu Arg Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Arg Tyr Asp 260 265 270 Thr Glu Tyr Tyr Leu Ile Pro Val Ala Ser Ser Ser Lys Asp Val Gln 275 280 285 Leu Lys Asn Ile Thr Asp Tyr Met Tyr Leu Thr Asn Ala Pro Ser Tyr 290 295 300 Thr Asn Gly Lys Leu Asn Ile Tyr Tyr Arg Arg Leu Tyr Asn Gly Leu 305 310 315 320 Lys Phe Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn Glu Ile Asp Ser Phe 325 330 335 Val Lys Ser Gly Asp Phe Ile Lys Leu Tyr Val Ser Tyr Asn Asn Asn 340 345 350 Glu His Ile Val Gly Tyr Pro Lys Asp Gly Asn Ala Phe Asn Asn Leu 355 360 365 Asp Arg Ile Leu Arg Val Gly Tyr Asn Ala Pro Gly Ile Pro Leu Tyr 370 375 380 Lys Lys Met Glu Ala Val Lys Leu Arg Asp Leu Lys Thr Tyr Ser Val 385 390 395 400 Gln Leu Lys Leu Tyr Asp Asp Lys Asn Ala Ser Leu Gly Leu Val Gly 405 410 415 Thr His Asn Gly Gln Ile Gly Asn Asp Pro Asn Arg Asp Ile Leu Ile 420 425 430 Ala Ser Asn Trp Tyr Phe Asn His Leu Lys Asp Lys Ile Leu Gly Cys 435 440 445 Asp Trp Tyr Phe Val Pro Thr Asp Glu Gly Trp Thr Asn Asp 450 455 460 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> (Primer) <400> 3 agattccgcg ggagaagtta g 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> (Primer) <400> 4 tcgtaaaggg tttccccaga a 21 <210> 5 <211> 451 <212> PRT <213> Clostridium tetani <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)...(451) <223> Fragment of SEQ ID NO:2 <400> 5 Lys Asn Leu Asp Cys Trp Val Asp Asn Glu Glu Asp Ile Asp Val Ile 1 5 10 15 Leu Lys Lys Ser Thr Ile Leu Asn Leu Asp Ile Asn Asn Asp Ile Ile 20 25 30 Ser Asp Ile Ser Gly Phe Asn Ser Ser Val Ile Thr Tyr Pro Asp Ala 35 40 45 Gln Leu Val Pro Gly Ile Asn Gly Lys Ala Ile His Leu Val Asn Asn 50 55 60 Glu Ser Ser Glu Val Ile Val His Lys Ala Met Asp Ile Glu Tyr Asn 65 70 75 80 Asp Met Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys 85 90 95 Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gln Tyr Gly Thr Asn Glu Tyr Ser Ile 100 105 110 Ile Ser Ser Met Lys Lys His Ser Leu Ser Ile Gly Ser Gly Trp Ser 115 120 125 Val Ser Leu Lys Gly Asn Asn Leu Ile Trp Thr Leu Lys Asp Ser Ala 130 135 140 Gly Glu Val Arg Gln Ile Thr Phe Arg Asp Leu Pro Asp Lys Phe Asn 145 150 155 160 Ala Tyr Leu Ala Asn Lys Trp Val Phe Ile Thr Ile Thr Asn Asp Arg 165 170 175 Leu Ser Ser Ala Asn Leu Tyr Ile Asn Gly Val Leu Met Gly Ser Ala 180 185 190 Glu Ile Thr Gly Leu Gly Ala Ile Arg Glu Asp Asn Asn Ile Thr Leu 195 200 205 Lys Leu Asp Arg Cys Asn Asn Asn Asn Gln Tyr Val Ser Ile Asp Lys 210 215 220 Phe Arg Ile Phe Cys Lys Ala Leu Asn Pro Lys Glu Ile Glu Lys Leu 225 230 235 240 Tyr Thr Ser Tyr Leu Ser Ile Thr Phe Leu Arg Asp Phe Trp Gly Asn 245 250 255 Pro Leu Arg Tyr Asp Thr Glu Tyr Tyr Leu Ile Pro Val Ala Ser Ser 260 265 270 Ser Lys Asp Val Gln Leu Lys Asn Ile Thr Asp Tyr Met Tyr Leu Thr 275 280 285 Asn Ala Pro Ser Tyr Thr Asn Gly Lys Leu Asn Ile Tyr Tyr Arg Arg 290 295 300 Leu Tyr Asn Gly Leu Lys Phe Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn 305 310 315 320 Glu Ile Asp Ser Phe Val Lys Ser Gly Asp Phe Ile Lys Leu Tyr Val 325 330 335 Ser Tyr Asn Asn Asn Glu His Ile Val Gly Tyr Pro Lys Asp Gly Asn 340 345 350 Ala Phe Asn Asn Leu Asp Arg Ile Leu Arg Val Gly Tyr Asn Ala Pro 355 360 365 Gly Ile Pro Leu Tyr Lys Lys Met Glu Ala Val Lys Leu Arg Asp Leu 370 375 380 Lys Thr Tyr Ser Val Gln Leu Lys Leu Tyr Asp Asp Lys Asn Ala Ser 385 390 395 400 Leu Gly Leu Val Gly Thr His Asn Gly Gln Ile Gly Asn Asp Pro Asn 405 410 415 Arg Asp Ile Leu Ile Ala Ser Asn Trp Tyr Phe Asn His Leu Lys Asp 420 425 430 Lys Ile Leu Gly Cys Asp Trp Tyr Phe Val Pro Thr Asp Glu Gly Trp 435 440 445 Thr Asn Asp 450 <210> 6 <211> 1359 <212> DNA <213> Clostridium tetani <400> 6 atgaaaaatc tggattgttg ggttgataat gaagaagata tagatgttat attaaaaaag 60 agtacaattt taaatttaga tattaataat gatattatat cagatatatc tgggtttaat 120 tcatctgtaa taacatatcc agatgctcaa ttggtgcccg gaataaatgg caaagcaata 180 catttagtaa acaatgaatc ttctgaagtt atagtgcata aagctatgga tattgaatat 240 aatgatatgt ttaataattt taccgttagc ttttggttga gggttcctaa agtatctgct 300 agtcatttag aacaatatgg cacaaatgag tattcaataa ttagctctat gaaaaaacat 360 agtctatcaa taggatctgg ttggagtgta tcacttaaag gtaataactt aatatggact 420 ttaaaagatt ccgcgggaga agttagacaa ataactttta gggatttacc tgataaattt 480 aatgcttatt tagcaaataa atgggttttt ataactatta ctaatgatag attatcttct 540 gctaatttgt atataaatgg agtacttatg ggaagtgcag aaattactgg tttaggagct 600 attagagagg ataataatat aacattaaaa ctagatagat gtaataataa taatcaatac 660 gtttctattg ataaatttag gatattttgc aaagcattaa atccaaaaga gattgaaaaa 720 ttatacacaa gttatttatc tataaccttt ttaagagact tctggggaaa ccctttacga 780 tatgatacag aatattattt aataccagta gcttctagtt ctaaagatgt tcaattgaaa 840 aatataacag attatatgta tttgacaaat gcgccatcgt atactaacgg aaaattgaat 900 atatattata gaaggttata taatggacta aaatttatta taaaaagata tacacctaat 960 aatgaaatag attcttttgt taaatcaggt gattttatta aattatatgt atcatataac 1020 aataatgagc acattgtagg ttatccgaaa gatggaaatg cctttaataa tcttgataga 1080 attctaagag taggttataa tgccccaggt atccctcttt ataaaaaaat ggaagcagta 1140 aaattgcgtg atttaaaaac ctattctgta caacttaaat tatatgatga taaaaatgca 1200 tctttaggac tagtaggtac ccataatggt caaataggca acgatccaaa tagggatata 1260 ttaattgcaa gcaactggta ctttaatcat ttaaaagata aaattttagg atgtgattgg 1320 tactttgtac ctacagatga aggatggaca aatgattaa 1359 <210> 7 <211> 1402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized tetanus toxin C fragment <400> 7 ggcggaggta ccgtcgacct cgaggaaaga acctggactg ctgggtggac aacgaggagg 60 acatcgacgt gatcctgaag aagagcacca tcctgaacct ggacatcaac aacgacatca 120 tcagcgacat cagcggcttc aacagcagcg tgatcaccta ccccgacgcc cagctggtgc 180 ccggcatcaa cggcaaggcc atccacctgg tgaacaacga gagcagcgag gtgatcgtgc 240 acaaggccat ggacatcgag tacaacgaca tgttcaacaa cttcaccgtg agcttctggc 300 tgagagtgcc caaggtgagc gccagccacc tggagcagta cgacaccaac gagtacagca 360 tcatcagcag catgaagaag tacagcctga gcatcggcag cggctggagc gtgagcctga 420 agggcaacaa cctgatctgg accctgaagg acagcgccgg cgaggtgaga cagatcacct 480 tcagagacct gagcgacaag ttcaacgcct acctggccaa caagtgggtg ttcatcacca 540 tcaccaacga cagactgagc agcgccaacc tgtacatcaa cggcgtgctg atgggcagcg 600 ccgagatcac cggcctgggc gccatcagag aggacaacaa catcaccctg aagctggaca 660 gatgcaacaa caacaaccag tacgtgagca tcgacaagtt cagaatcttc tgcaaggccc 720 tgaaccccaa ggagatcgag aagctgtaca ccagctacct gagcatcacc ttcctgagag 780 acttctgggg caaccccctg agatacgaca ccgagtacta cctgatcccc gtggcctaca 840 gcagcaagga cgtgcagctg aagaacatca ccgactacat gtacctgacc aacgccccca 900 gctacaccaa cggcaagctg aacatctact acagaagact gtacagcggc ctgaagttca 960 tcatcaagag atacaccccc aacaacgaga tcgacagctt cgtgagaagc ggcgacttca 1020 tcaagctgta cgtgagctac aacaacaacg agcacatcgt gggctacccc aaggacggca 1080 acgccttcaa caacctggac agaatcctga gagtgggcta caacgccccc ggcatccccc 1140 tgtacaagaa gatggaggcc gtgaagctga gagacctgaa gacctacagc gtgcagctga 1200 agctgtacga cgacaaggac gccagcctgg gcctggtggg cacccacaac ggccagatcg 1260 gcaacgaccc caacagagac atcctgatcg ccagcaactg gtacttcaac cacctgaagg 1320 acaagaccct gacctgcgac tggtacttcg tgcccaccga cgagggctgg accaacgact 1380 gactcgaggg aggcgccggc gg 1402 <210> 8 <211> 1356 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized tetanus toxin C fragment <400> 8 aagaacctgg actgctgggt ggacaacgag gaggacatcg acgtgatcct gaagaagagc 60 accatcctga acctggacat caacaacgac atcatcagcg acatcagcgg cttcaacagc 120 agcgtgatca cctaccccga cgcccagctg gtgcccggca tcaacggcaa ggccatccac 180 ctggtgaaca acgagagcag cgaggtgatc gtgcacaagg ccatggacat cgagtacaac 240 gacatgttca acaacttcac cgtgagcttc tggctgagag tgcccaaggt gagcgccagc 300 cacctggagc agtacgacac caacgagtac agcatcatca gcagcatgaa gaagtacagc 360 ctgagcatcg gcagcggctg gagcgtgagc ctgaagggca acaacctgat ctggaccctg 420 aaggacagcg ccggcgaggt gagacagatc accttcagag acctgagcga caagttcaac 480 gcctacctgg ccaacaagtg ggtgttcatc accatcacca acgacagact gagcagcgcc 540 aacctgtaca tcaacggcgt gctgatgggc agcgccgaga tcaccggcct gggcgccatc 600 agagaggaca acaacatcac cctgaagctg gacagatgca acaacaacaa ccagtacgtg 660 agcatcgaca agttcagaat cttctgcaag gccctgaacc ccaaggagat cgagaagctg 720 tacaccagct acctgagcat caccttcctg agagacttct ggggcaaccc cctgagatac 780 gacaccgagt actacctgat ccccgtggcc tacagcagca aggacgtgca gctgaagaac 840 atcaccgact acatgtacct gaccaacgcc cccagctaca ccaacggcaa gctgaacatc 900 tactacagaa gactgtacag cggcctgaag ttcatcatca agagatacac ccccaacaac 960 gagatcgaca gcttcgtgag aagcggcgac ttcatcaagc tgtacgtgag ctacaacaac 1020 aacgagcaca tcgtgggcta ccccaaggac ggcaacgcct tcaacaacct ggacagaatc 1080 ctgagagtgg gctacaacgc ccccggcatc cccctgtaca agaagatgga ggccgtgaag 1140 ctgagagacc tgaagaccta cagcgtgcag ctgaagctgt acgacgacaa ggacgccagc 1200 ctgggcctgg tgggcaccca caacggccag atcggcaacg accccaacag agacatcctg 1260 atcgccagca actggtactt caaccacctg aaggacaaga ccctgacctg cgactggtac 1320 ttcgtgccca ccgacgaggg ctggaccaac gactga 1356 <210> 9 <211> 1392 <212> RNA <213> Clostridium tetani <400> 9 augguuuuuu caacaccaau uccauuuucu uauucuaaaa aucuggauug uuggguugau 60 aaugaagaag auauagaugu uauauuaaaa aagaguacaa uuuuaaauuu agauauuaau 120 aaugauauua uaucagauau aucuggguuu aauucaucug uaauaacaua uccagaugcu 180 caauuggugc ccggaauaaa uggcaaagca auacauuuag uaaacaauga aucuucugaa 240 guuauagugc auaaagcuau ggauauugaa uauaaugaua uguuuaauaa uuuuaccguu 300 agcuuuuggu ugaggguucc uaaaguaucu gcuagucauu uagaacaaua uggcacaaau 360 gaguauucaa uaauuagcuc uaugaaaaaa cauagucuau caauaggauc ugguuggagu 420 guaucacuua aagguaauaa cuuaauaugg acuuuaaaag auuccgcggg agaaguuaga 480 caaauaacuu uuagggauuu accugauaaa uuuaaugcuu auuuagcaaa uaaauggguu 540 uuuauaacua uuacuaauga uagauuaucu ucugcuaauu uguauauaaa uggaguacuu 600 augggaagug cagaaauuac ugguuuagga gcuauuagag aggauaauaa uauaacauua 660 aaacuagaua gauguaauaa uaauaaucaa uacguuucua uugauaaauu uaggauauuu 720 ugcaaagcau uaaauccaaa agagauugaa aaauuauaca caaguuauuu aucuauaacc 780 uuuuuaagag acuucugggg aaacccuuua cgauaugaua cagaauauua uuuaauacca 840 guagcuucua guucuaaaga uguucaauug aaaaauauaa cagauuauau guauuugaca 900 aaugcgccau cguauacuaa cggaaaauug aauauauauu auagaagguu auauaaugga 960 cuaaaauuua uuauaaaaag auauacaccu aauaaugaaa uagauucuuu uguuaaauca 1020 ggugauuuua uuaaauuaua uguaucauau aacaauaaug agcacauugu agguuauccg 1080 aaagauggaa augccuuuaa uaaucuugau agaauucuaa gaguagguua uaaugcccca 1140 gguaucccuc uuuauaaaaa aauggaagca guaaaauugc gugauuuaaa aaccuauucu 1200 guacaacuua aauuauauga ugauaaaaau gcaucuuuag gacuaguagg uacccauaau 1260 ggucaaauag gcaacgaucc aaauagggau auauuaauug caagcaacug guacuuuaau 1320 cauuuaaaag auaaaauuuu aggaugugau ugguacuuug uaccuacaga ugaaggaugg 1380 acaaaugauu aa 1392 <210> 10 <211> 1359 <212> RNA <213> Clostridium tetani <400> 10 augaaaaauc uggauuguug gguugauaau gaagaagaua uagauguuau auuaaaaaag 60 aguacaauuu uaaauuuaga uauuaauaau gauauuauau cagauauauc uggguuuaau 120 ucaucuguaa uaacauaucc agaugcucaa uuggugcccg gaauaaaugg caaagcaaua 180 cauuuaguaa acaaugaauc uucugaaguu auagugcaua aagcuaugga uauugaauau 240 aaugauaugu uuaauaauuu uaccguuagc uuuugguuga ggguuccuaa aguaucugcu 300 agucauuuag aacaauaugg cacaaaugag uauucaauaa uuagcucuau gaaaaaacau 360 agucuaucaa uaggaucugg uuggagugua ucacuuaaag guaauaacuu aauauggacu 420 uuaaaagauu ccgcgggaga aguuagacaa auaacuuuua gggauuuacc ugauaaauuu 480 aaugcuuauu uagcaaauaa auggguuuuu auaacuauua cuaaugauag auuaucuucu 540 gcuaauuugu auauaaaugg aguacuuaug ggaagugcag aaauuacugg uuuaggagcu 600 auuagagagg auaauaauau aacauuaaaa cuagauagau guaauaauaa uaaucaauac 660 guuucuauug auaaauuuag gauauuuugc aaagcauuaa auccaaaaga gauugaaaaa 720 uuauacacaa guuauuuauc uauaaccuuu uuaagagacu ucuggggaaa cccuuuacga 780 uaugauacag aauauuauuu aauaccagua gcuucuaguu cuaaagaugu ucaauugaaa 840 aauauaacag auuauaugua uuugacaaau gcgccaucgu auacuaacgg aaaauugaau 900 auauauuaua gaagguuaua uaauggacua aaauuuauua uaaaaagaua uacaccuaau 960 aaugaaauag auucuuuugu uaaaucaggu gauuuuauua aauuauaugu aucauauaac 1020 aauaaugagc acauuguagg uuauccgaaa gauggaaaug ccuuuaauaa ucuugauaga 1080 auucuaagag uagguuauaa ugccccaggu aucccucuuu auaaaaaaau ggaagcagua 1140 aaauugcgug auuuaaaaac cuauucugua caacuuaaau uauaugauga uaaaaaugca 1200 ucuuuaggac uaguagguac ccauaauggu caaauaggca acgauccaaa uagggauaua 1260 uuaauugcaa gcaacuggua cuuuaaucau uuaaaagaua aaauuuuagg augugauugg 1320 uacuuuguac cuacagauga aggauggaca aaugauuaa 1359 <210> 11 <211> 1356 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized tetanus toxin C fragment <400> 11 aagaaccugg acugcugggu ggacaacgag gaggacaucg acgugauccu gaagaagagc 60 accauccuga accuggacau caacaacgac aucaucagcg acaucagcgg cuucaacagc 120 agcgugauca ccuaccccga cgcccagcug gugcccggca ucaacggcaa ggccauccac 180 cuggugaaca acgagagcag cgaggugauc gugcacaagg ccauggacau cgaguacaac 240 gacauguuca acaacuucac cgugagcuuc uggcugagag ugcccaaggu gagcgccagc 300 caccuggagc aguacgacac caacgaguac agcaucauca gcagcaugaa gaaguacagc 360 cugagcaucg gcagcggcug gagcgugagc cugaagggca acaaccugau cuggacccug 420 aaggacagcg ccggcgaggu gagacagauc accuucagag accugagcga caaguucaac 480 gccuaccugg ccaacaagug gguguucauc accaucacca acgacagacu gagcagcgcc 540 aaccuguaca ucaacggcgu gcugaugggc agcgccgaga ucaccggccu gggcgccauc 600 agagaggaca acaacaucac ccugaagcug gacagaugca acaacaacaa ccaguacgug 660 agcaucgaca aguucagaau cuucugcaag gcccugaacc ccaaggagau cgagaagcug 720 uacaccagcu accugagcau caccuuccug agagacuucu ggggcaaccc ccugagauac 780 gacaccgagu acuaccugau ccccguggcc uacagcagca aggacgugca gcugaagaac 840 aucaccgacu acauguaccu gaccaacgcc cccagcuaca ccaacggcaa gcugaacauc 900 uacuacagaa gacuguacag cggccugaag uucaucauca agagauacac ccccaacaac 960 gagaucgaca gcuucgugag aagcggcgac uucaucaagc uguacgugag cuacaacaac 1020 aacgagcaca ucgugggcua ccccaaggac ggcaacgccu ucaacaaccu ggacagaauc 1080 cugagagugg gcuacaacgc ccccggcauc ccccuguaca agaagaugga ggccgugaag 1140 cugagagacc ugaagaccua cagcgugcag cugaagcugu acgacgacaa ggacgccagc 1200 cugggccugg ugggcaccca caacggccag aucggcaacg accccaacag agacauccug 1260 aucgccagca acugguacuu caaccaccug aaggacaaga cccugaccug cgacugguac 1320 uucgugccca ccgacgaggg cuggaccaac gacuga 1356

Claims (23)

1. 감소된 근육량 및/또는 근육 강도와 관련된 질병 또는 질환의 치료를 필요로 하는 대상에서, 감소된 근육량 및/또는 근육 강도와 관련된 질병 또는 질환을 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 TTC를 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 투여는 상기 대상에서 (i) 근육량을 증가시키고/시키거나, (ii) 근육 강도를 증가시키고/시키거나, (iii) 회복 또는 치유 속도를 증가시키고/시키거나, (iv) 상기 질병 또는 질환에 의해 야기된 섬유증을 감소시키는 데 효과적인, 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 질병 또는 질환은 (i) 악액질 (cachexia), 거식증 (anorexia), 근이영양증, 또는 신경근 질병으로부터 선택되는 소모성 장애; 또는, (ii) 부동화 (immobilization), 만성 질병, 암, 또는 손상의 후유증인, 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 근육량 증가는 (i) 소모성 장애, 부동화, 또는 노령으로부터 발생된 소모를 보상하기 위한 것이거나, (ii) 미용 목적을 위한 것인, 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 대상은 인간인, 방법.
5. 제1항에 있어서, TTC는
   (a) 서열 번호 2 또는 서열 번호 5의 서열, 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하는 폴리펩티드;
   (b) 서열 번호 1 또는 서열 번호 6의 서열, 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하는 폴리뉴클레오티드; 또는,
   (c) 이들의 조합을 포함하는, 방법.
6. 제1항에 있어서, TTC는
   (a) TTC 폴리펩티드가 유일한 치료적 모이어티 (moiety)인 융합 단백질 또는 접합체 (conjugate);
   (b) 적어도 2개의 치료적 모이어티들을 포함하고, TTC 폴리펩티드가 상기 치료적 모이어티들 중 하나인, 융합 단백질, 또는 접합체;
   (c) TTC 폴리펩티드가 유일한 치료적 모이어티인 융합 단백질을 인코딩하는 핵산;
   (d) 적어도 2개의 치료적 모이어티들을 포함하고, TTC 폴리펩티드가 상기 치료적 모이어티들 중 하나인, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산; 또는,
   (e) 이들의 조합을 포함하는, 방법.
7. 제1항에 있어서, TTC는 네이키드 (naked) DNA 또는 RNA로 투여되는, 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 DNA 또는 RNA는 인간화되는 (humanized), 방법.
9. 제7항에 있어서, 상기 인간화 DNA는 서열 번호 8의 서열, 또는 이의 변이체, 단편, 또는 유도체를 포함하는, 방법.
10. 제7항에 있어서, 상기 RNA는 mRNA인, 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 mRNA는 서열 최적화 (sequence optimized) mRNA인, 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 서열 최적화 mRNA는 슈도우리딘 (pseudouridine) (Ψ), 5-메톡시우리딘 (5moU), 2-티오우리딘 (s2U), 4-티오우리딘 (s4U), N1-메틸슈도우리딘 (1mΨ), 5-메틸시티딘, 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
13. 제10항에 있어서, 상기 mRNA는 서열 번호 9, 서열 번호 10, 또는 서열 번호 11의 서열, 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하는, 방법.
14. 제1항에 있어서, TTC는 고정된 용량으로 투여되는, 방법.
15. 제1항에 있어서, TTC는 2회 이상의 용량으로 투여되는, 방법.
16. 제1항에 있어서, TTC는 매일, 매주, 격주, 또는 매월 투여되는, 방법.
17. 제1항에 있어서, TTC는 근육내, 복막내, 피하, 정맥내, 또는 이들의 조합으로 투여되는, 방법.
18. 제1항에 있어서, 상기 방법은 포유동물의 생체내 (in vivo)에서 실시되는, 방법.
19. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 요법을 추가로 포함하는, 방법.
20. 제1항에 있어서, 상기 질병 또는 질환은 근육 병변 (muscle lesion)인, 방법.
21. 제1항에 있어서, 상기 근육 병변은 급성 또는 만성 근육 병변인, 방법.
22. 제22항에 있어서, 상기 근육 병변은 기계적 병변, 열적 병변, 화학적 병변, 직업적 또는 반복된 스트레스 병변, 의원성 (iatrogenic) 병변, 운동성 (athletic) 근육 병변, 또는 이들의 조합인, 방법.
23. 제20항에 있어서, 상기 근육 병변은 치료적 유효량의 TTC를 상기 병변의 부위에 직접 주사함으로써 치료되는, 방법.

Images