PL212249B1

PL212249B1 - Kompleks rybosomalnych bialek P z zarodzca malarii Plasmodium falciparum jako antygen patogenu malarii oraz sposób otrzymania tego antygenu i kaseta ekspresyjna do tego sposobu

Info

Publication number: PL212249B1
Application number: PL391384A
Authority: PL
Inventors: Marek Tchórzewski; Dawid Krokowski; Agnieszka Szuster-Ciesielska; Nikodem Grankowski; Leszek Wawiórka
Original assignee: Univ M Curie Sklodowskiej
Priority date: 2010-05-31
Filing date: 2010-05-31
Publication date: 2012-09-28
Also published as: EP2409987B1; PL391384A1; PL2409987T3; EP2409987A1

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest określony pentameryczny kompleks białek P, P0(197-316)- P1-P2)2 zarodźca malarii Plasmodium falciparum, wykazujący właściwości immunostymulujące względem patogenu malarii. Przedmiotem wynalazku jest także sposób otrzymywania ww antygenu, obejmujący metody nadekspresji białek z użyciem wektora genetycznego, charakteryzujący się tym, że w wektorze używa się kasety genetycznej, zawierającej policistronowy układ genów kodujących sekwencje aminokwasowe składników kompleksu białek P zdefiniowanego według wynalazku. Przedmiotem wynalazku jest również określona kaseta ekspresyjna na jako składnik wektora używanego w według sposobu opisanego powyżej, charakteryzująca się tym, że sekwencją ulegającą ekspresji jest policistronowy układ trzech genów, z których każdy zawiera osobne sekwencje łącznikowe i regulatorowe RBS, a fragment białka P0 występuje korzystnie w N-terminalnej fuzji z białkiem GST.

Description

Przedmiotem wynalazku jest pentameryczny kompleks białek P P0(197-316)-(P1-P2)2 zarodźca malarii Plasmodium falciparum wykazujący immunogenne właściwości chroniące organizm przed objawami klinicznymi malarii oraz sposób otrzymywania tego kompleksu z zastosowaniem genetycznego układu w formie kasety ekspresyjnej zawierającej policistronowy układ trzech genów.

Malaria jest obecnie jedną z najniebezpieczniejszych i najszybciej rozprzestrzeniających się chorób zakaźnych w rejonach tropikalnych, wywoływaną przez pierwotniaki z rodzaju Plasmodium. Najcięższy przebieg choroby wywołują infekcje zarodźcem o nazwie Plasmodium falciparum wykazującym dużą oporność na znane leki. Jedyną skuteczną metodą walki z malarią jest więc zastosowanie szczepionki, zawierającej właściwy antygen, wywołujący rodzaj określonej odporności immunologicznej, chroniącej organizm przed objawami klinicznymi malarii.

Obecnie brak jest skutecznej szczepionki, która w pełni zabezpieczałaby przed infekcją tym pierwotniakiem i objawami klinicznymi choroby. Problem ten związany jest ze skomplikowanym cyklem rozwojowym zarodźca i ogromną zmiennością antygenów powierzchniowych charakterystycznych dla poszczególnych etapów rozwoju tego patogennego pierwotniaka (Waters, A. Cell 124, 687-693, 2006 r.).

Cykl życiowy zarodźca malarii Plasmodium falciparum obejmuje kilka stadiów rozwojowych w organizmie człowieka i komara, związanych z obecnością charakterystycznych antygenów indukujących specyficzną odpowiedź immunologiczną u człowieka. Ukłucie człowieka przez kilka gatunków komarów z rodzaju Anopheles powoduje „wstrzyknięcie” do krwioobiegu tzw. sporozoitów, które poprzez naczynia krwionośne dostają się do komórek wątroby, co daje początek tzw. hepatocytarnej fazie rozwoju pasożyta. W hepatocytach sporozoity przekształcają się w tzw. schizonty, a po około 7 dniach z wątroby do krwioobiegu, uwalniane są tzw. merozoity, infekujące czerwone ciałka krwi. Stadia te namnażają się w erytrocytach i dalej przekształcają się w trofozoidy, które rozwijając się dają nowe pokolenie schizontów, tzw. schizonty erytrocytarne. Te z kolei różnicują się w merozoity zakażające kolejne erytrocyty, powodując lawinowy proces infekcji.

Znane strategie opracowania potencjalnych składników szczepionki przeciw malarii oparte są właśnie na licznej grupie specyficznych antygenów pasożyta dla różnych jego stadiów rozwojowych. Dotychczas określono szereg antygenów z różnych faz rozwojowych zarodźca będących potencjalnymi składnikami szczepionki, ale jak dotąd skutecznej szczepionki nie udało się opracować.

Badania prowadzone przez firmę GlaxoSmithKline Biologicals oraz Apovię Inc., San Diego, polegające na testowaniu preparatów: RTS,S/AS02A (Gordon D.M., J. Infect. Dis., 171, 1995 r.) oraz ICC-1132 CS/hepatitis B, opartych na białku CSP z P. falciparum (Birkett A., Infect. Immun. 70, 2002 r.), nie dały zadawalających rezultatów w kierunku otrzymania skutecznej szczepionki.

Aktualnie, szeroko testowanym antygenem jest białko MSP1, jednakże preparaty na bazie tego białka np. FMP-1/AS02A, opracowany przez The Walter Reed Army Institute of Research we współpracy z innymi ośrodkami naukowymi (Angov E., Mol. Biochem. Parasitol., 128, 2003 r.), czy też preparaty testowane przez University of Hawaii (Chang S.P., Infect. Immun. 64, 1996 r.) i Instytut Pasteura (Garraud O., Scand. J. Immunol., 49, 1999 r.) nie zakończyły się sukcesem.

Z podobnym skutkiem przebiegają testy na białku AMP1 w postaci preparatu FMP2.1, opracowanego przez The Walter Reed Army Institute of Research wraz z USAID i GSKBio, a także na preparacie kombinowanym PfCP-2.9, stanowiącym fuzję białek AMP1 i MSP1, i testowanym przez The Second Military Medical University in Shanghai wraz z the World Health Organization.

Kolejne badania prowadzone przez Malaria Vaccine Development Unit z National Institutes of Health USA (Ballou W. R, Am. J. Trop. Med. Hyg., 71 (Suppl2), 2004 r.) skupiają się na białku Pfs25, jednak i one nie zakończyły się opracowaniem szczepionki na bazie tego białka.

Informacje o badaniach opublikowane w Chatterjee S., Mol. Biochem. Parasitol., 107/2000 r., wskazują na immunogenne właściwości pojedynczego rybosomalnego białka P0, jednakże to pojedyncze białko w niewielkim zakresie indukuje wytwarzanie przeciwciał ochronnych na infekcję zarodźcem malarii, a ponadto w naturze występuje ono łącznie z białkami P1 i P2, co nie predysponuje go do indywidualnego zastosowania przy otrzymywaniu szczepionki przeciw malarii na szeroką skalę.

Brak danych dotyczących badań reakcji układu immunologicznego na białka P1 i P2, co niewątpliwie wynika z ich właściwości fizykochemicznych, stwarzających trudności w ich preparatyce i analizie /niewielka masa molekularna - ok. 10 kDa i kwaśny charakter - pl ok. 4/, zainspirował

PL 212 249 B1 twórców wynalazku do przeprowadzenia takich badań i uzyskania antygenu patogenu malarii o optymalnych właściwościach immunostymulacyjnych i jednocześnie immunoprotekcyjnych.

Nieoczekiwanie cel ten osiągnięto przeprowadzając badania oparte na kompleksie rybosomalnych białek P pochodzącym z zarodźca Plasmodium falciparum.

Istotą wynalazku jest antygen patogenu malarii w postaci pentamerycznego kompleksu białek P, opisywany jako P0(197-316)-(P1-P2)2, który zawiera fragment polipeptydu z rybosomalnego białka P0, obejmujący reszty aminokwasowe od 197 do 316, oraz dwa pełne rybosomalne białka P1 i P2, korzystnie występujące w układzie heterodimerycznym, przedstawiony na rysunku 1 i Sekwencji 1.

Rysunek 1. Schemat obrazujący pentametryczny kompleks białek P, P0(197-316)-(P1-P2)2.

Antygen według wynalazku, występuje w rozpuszczalnej i stabilnej formie, wykazując zarazem silne właściwości immunostymulujące. Właściwości powyższe wykazano na podstawie badań biochemicznych i immunologicznych opisanych w przykładach 2 i 3.

Istotą wynalazku jest również zastosowanie antygenu, zdefiniowanego powyżej, do otrzymywania szczepionki przeciwko malarii.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób otrzymywania antygenu będącego istotą wynalazku, obejmujący metodę nadekspresji białek z użyciem wektora genetycznego charakteryzujący się tym, że w wektorze używa się kasety genetycznej, zawierającej policistronowy układ trzech genów ułożonych w sekwencji P0-P1-P2, kodujących sekwencje aminokwasowe składników pentamerycznego kompleksu białek P.

Przedmiotem wynalazku jest również kaseta ekspresyjna do zastosowania w sposobie według wynalazku, charakteryzująca się tym, że sekwencją ulegającą ekspresji jest policistronowy układ trzech genów P0 (PF11_0313), P1 (PF11_0043) i P2 (PFC0400 w), z których każdy zawiera osobne sekwencje regulatorowe RBS i sekwencje łącznikowe, a gen dla fragmentu białka P0 występuje korzystnie w fuzji z genem dla białka GST.

Kaseta ekspresyjna według wynalazku została przedstawiona jako Sekwencja 2, opisana poniżej w przykładzie 4 i uwidoczniona schematycznie na rysunku 2.

Rysunek 2. Kaseta ekspresyjna.

Kaseta zawiera gen dla białka GST w fuzji z genem dla fragmentu białka P0(197-316) oraz geny dla białek P1 i P2; RBS - sekwencja regulatorowa odpowiedzialna za wydajną inicjację translacji; 5' i 3' orientacja DNA.

Całość wynalazku przedstawiono w poniższych przykładach.

P r z y k ł a d 1.

Otrzymanie pentamerycznego kompleksu białek P Plasmodium falciparum

1.1 Otrzymanie kompleksu białek P.

Ekspresję kompleksu białek P według wynalazku, przeprowadzono w heterologicznym układzie bakteryjnym Escherichia coli. Ekspresję prowadzono w kolbach hodowlanych zawierających pożywki LB

PL 212 249 B1 (o składzie: 0,5% ekstrakt drożdżowy, 1% pepton, 1% NaCl) w temperaturze 37°C. Pożywkę suplemetowano dodatkiem antybiotyku, ampiciliny o stężeniu 100 μg/ml. Każda kolba z pożywką szczepiona była odpowiednią ilością całonocnej hodowli komórek E. coli szczepu BL21(DE3) zawierających wektor niosący kasetę ekspresyjną według wynalazku zdefiniowaną powyżej. Hodowlę prowadzono w temp. 37°C z intensywnym napowietrzaniem kontrolując gęstość optyczną hodowli przy długości fali 600 nm (OD600). Po godzinie hodowli od zaszczepienia pożywki, dodano ponownie ampicylinę w ilości 100 μg/ml. Gdy hodowla osiągnęła gęstość optyczną OD₆₀₀=0,8 dodano induktora ekspresji, Isopropyl β-D-l-thiogalactopyranoside (TPTG) do końcowego stężenia 0,5 mM. Hodowlę prowadzono przez kolejne cztery godziny. Po tym czasie, komórki odwirowywano (10 min, 3000 rpm na wirówce preparatywnej firmy Beckman), płukano zimnym buforem PBS i ponownie odwirowywano jw. Dezintegrację komórek prowadzono poprzez sonifikację w cyklach 45 sek. z 60 sek. przerwami, wykorzystując sonifikator firmy MSE z trzpieniem tytanowym o grubości 2 cm. Dezintegrację prowadzono przez 20 cykli. W czasie dezintegracji monitorowano temperaturę (+4°C) i utrzymywano pH o wartości około 7. Otrzymany dezintegrat komórek bakteryjnych był poddawany frakcjonowaniu na drodze wirowania: 20 min, 12000 rpm w temp 4°C. Po wirowaniu, otrzymano rozpuszczalną frakcję białek cytoplazmatycznych wraz z frakcją białek rybosomalnych. Frakcję tę traktowano detergentem Triton X-100, do jego końcowego stężenia 1% i mieszano na mieszadle magnetycznym przez 60 min w temperaturze 4°C. Następnie, całość mieszaniny poddano ultrawirowaniu przez 90 minut przy 38000 rpm stosując rotor TY50.2Ti firmy Beckman w celu osadzenia rybosomów. Uzyskany w ten sposób supernatant, nazywany frakcją S-100, zawierał frakcję rozpuszczalnych białek cytoplazmatycznych zawierającą m.in. pentameryczny kompleks białek P. W celu izolacji i oczyszczania białek P, frakcję S-100 zmieszano ze złożem GST-trap, i poddano chromatografii powinowactwa. Wiązanie pentametrycznego kompleksu do nośnika prowadzono przez 60 min w temperaturze 4°C. Po tym czasie, białka frakcji S-100 niewiążące się do złoża zostały odseparowane na drodze wirowania (10 min, 3000 rpm na wirówce preparatywnej firmy Beckman). Odwirowane złoże poddano najpierw płukaniu buforem PBS w objętości 10-krotnie większej od jego objętości a następnie, przeprowadzono drugie płukanie złoża taką samą objętością buforu PBST (bufor PBS z dodatkiem detergentu Tween 20 w stężeniu 0,1%). Trzecie płukanie przeprowadzono ponownie samym buforem PBS o objętości dwukrotnie większej od objętości złoża, co miało na celu usunięcia resztek białek frakcji S-100, które niespecyficznie mogły związać się do złoża GST-trap. W celu uwolnienia pentamerycznego kompleksu białek P, złoże GST-trap inkubowano przez 60 minut w temperaturze 37°C z roztworem trombiny ludzkiej (22 jednostki/ml złoża). Po tym czasie, do zebranego supernatantu zawierającego kompleks białek P zdefiniowany zgodnie z wynalazkiem, dodawano inhibitora trombiny - fluorku fenylometylosulfonowego (phenylmethanesulphonylfluoride, PMSF) do końcowego stężenia 1 mM. Opisana procedura pozwoliła na otrzymanie homogennego pentametrycznego kompleksu białek P.

1.2 Analiza oczyszczania kompleksu białek P.

Do analizy przygotowano próbki zawierające kolejno: 30 μg białka ekstraktu komórkowego bakterii E. coli transformowanych wektorem zawierającym kasetę ekspresyjną przed i po indukcji (-IPTG; +IPTG); 30 μg białka tzw. ciałek inkluzyjnych będących frakcją białek nierozpuszczalnych; 30 μg białka frakcji S-100, która zawiera białka rozpuszczalne; 5 μg białka kompleksu białek P, w którym etykieta GST pozostaje związana z białkiem P0; 5 μg białka oczyszczonego preparatu kompleksu białek P po odcięciu białka GST.

PL 212 249 B1

markery - białka markerowe o znanych masach molekularnych; ekstrakt komórkowy -IPTG, - brak indukcji ekspresji; ekstrakt komórkowy +IPTG, - indukcja ekspresji kompleksu białek P; ciałka inkluzyjne - frakcja białek nierozpuszczalnych; frakcja S-100 - frakcja białek rozpuszczalnych;

GST- P0(197-316)-(P1-P2)2 - frakcja zawierająca kompleks białek P w fuzji z białkiem GST;

P0(197-316)-(P1-P2)2, - produkt końcowy, oczyszczony kompleks białek P pozbawiony białka GST.

P r z y k ł a d 2.

Badanie właściwości kompleksu białek P, P0(_197-316)-(P1-P2)7.

Preparat otrzymany według przykładu 1 poddano następującym analizom biochemicznym.

2.1 Analiza na sicie molekularnym.

Otrzymany kompleks białek P poddano analitycznemu sączeniu molekularnemu na sicie molekularnym Superose 12 HR 10/30, zrównoważonym buforem o składzie 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, wykorzystując system Akta Purifier FPLC.

Rysunek 4. Analiza z wykorzystaniem sita molekularnego.

PL 212 249 B1

Kompleks białek P wypływa jako symetryczny pojedynczy pik, wskazując tym samym że kompleks ten występuje w jednorodnej formie. Pojedynczy pik odpowiada oczyszczonemu pentametrycznemu kompleksowi białek: P0(197-316)-(P1-P2)2.

2.2 Spektrometria mas.

W celu określenia dokładnej stechiometrii kompleksu białek P otrzymanego według przykładu 1.1, przeprowadzono analizę z wykorzystaniem spektrometrii mas w warunkach niedenaturujących.

Rysunek 5. Analiza kompleksu białek P z wykorzystaniem spektrometrii mas w warunkach niedenaturujących.

Oszacowana eksperymentalnie masa molekularna kompleksu wynosi 63.286 Da, co odpowiada wyliczonej teoretycznej masie 63.118 Da kompleksu białek P według wynalazku.

Analiza wykazała, że kompleks białek P zawiera pięć polipeptydów, z których jeden to fragment białka P0(197-316) (13196 Da) oraz dwa dimery P1-P2 (13013 i 11948 Da).

P r z y k ł a d 3:

Analiza immunologiczna pentametrycznego kompleksu białek P, P0(_197-31q)-(P1-P2).

3.1. Immunizacja zwierząt laboratoryjnych.

Do oceny immunostymulujących właściwości pentametrycznego kompleksu białek P wykorzystano 6-7 tygodniowe myszy płci żeńskiej o wadze 18 g ± 2, zakupionych w Instytucie Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej w Warszawie. W każdej grupie badanej i kontrolnej znajdowało się 18 zwierząt. Badany kompleks łączono z kompletnym (I immunizacja) lub niekompletnym (II i III immunizacja) adiuwantem Freunda w stosunku objętościowym 1:1. Myszom podawano domięśniowo (mięsień udowy) 100 pl jałowej zawiesiny zawierającej 50 pg białka w dniu: 0, 21 i 42 (co trzy tygodnie). Próby krwi do analiz bieżących pobierano po upływie 2 tygodni od każdego szczepienia, tj. w 14, 35 i 56 dniu (grupy badane oraz kontrolne). Grupą kontrolną były zwierzęta, którym podawano jedynie kompletny lub niekompletny adiuwant Freunda (grupa I) lub PBS (grupa II). Materiał do analiz pobierany był także od mysz nie szczepionych, po tygodniu od momentu dostawy (okres adaptacji). Do badań przeznaczano surowicę (określenie klasy produkowanych przeciwciał) oraz limfocyty izolowane z krwi i śledziony (badanie toksyczności białek, proliferacji komórek, oznaczanie powierzchniowych receptorów komórek).

Jako punkt odniesienia w analizie immunologicznej wykorzystano znany antygen patogenu

- białko MSP-1 P. faciparum. Do analizy kontrolnej użyte zostało białko MSP-119 (96 aminokwasów, pozycja aminokwasów w pełnym białku 1526-1622; SWISS-PROT, MSP1 PLAFW, accession number P04933). Białko to zostało wyklonowane i poddane heterologicznej ekspresji w szczepie E. coli a następnie oczyszczeniu do stanu homogenności. Tak przygotowany antygen referencyjny wykorzystano do analiz immunologicznych.

3.2 Badanie toksyczności białek P.

Limfocyty śledziony myszy inkubowano 24-48 godz. z badanym kompleksem białek P, w zakresie jego stężeń 10-1000 pg/ml. Po wyznaczonym czasie 24 h i 48 h żywotność komórek oznaczano metodą redukcji MTT.

Wyniki badań uwidoczniono na rysunku 6, przedstawiając zależność procentu przeżywalności komórek od stężenia badanego białka.

PL 212 249 B1

Rysunek 6.

Żywotność limfocytów śledziony myszy inkubowanych przez 24 i 48 godzin w obecności różnych stężeń kompleksu białek P i białka MSP1.

*różnice statystycznie istotne (p<0,05) w porównaniu z 24-godzinnym czasem inkubacji.

Badany kompleks białek nie wykazywał toksycznego wpływu na limfocyty w zakresie stężeń

10-200 ąg/ml. W przypadku białka MSP-1, zachowanie było podobne, ale wydłużenie czasu inkubacji do 48 h z tym antygenem powodowało obniżenie żywotności komórek o blisko 35%.

3.3 Badanie proliferacji limfocytów ze śledziony mysz kontrolnych i immunizowanych (po IIl immunizacji) w obecności kompleksu białek P i MSP-1.

Badanie proliferacji limfocytów prowadzone było według standardowych procedur, a wyniki uzyskane przy zastosowaniu dwóch metod MTT i testu ELISA BrdU były porównywalne.

Rysunek 7. Zależność proliferacji limfocytów izolowanych ze śledziony mysz kontrolnych i immunizowanych białkami kompleks P i MSP-1 z P. faciparum, gdzie.

K1 - proliferacja limfocytów izolowanych z mysz, którym podawano tylko adiuwant Freunda; P0(197-316)-(P1-P2)2 proliferacja limfocytów mysz immunizowanych kompleksem białek P;

PL 212 249 B1

+ różnice statystycznie istotne w porównaniu do immunizacji I ++ różnice statystycznie istotne w porównaniu do immunizacji II

Rysunek 8. Poziom przeciwciał IgM i IgG2a w surowicy mysz immunizowanych kompleksem białek P i białkiem MSP-1.

Porównanie danych zamieszczonych na rysunku 8 pozwala na stwierdzenie, że badane białka pobudzały odpowiedź humoralną, której poziom istotnie wzrastał po kolejnych immunizacjach (z wyjątkiem IgM). Indukcja przeciwciał klasy IgM z największą wydajnością odbywała się w obecności wzorcowego białka MSP-1, zwłaszcza po I immunizacji, po czym obserwowano spadek miana przeciwciał. W przeciwieństwie do białka MSP-1, kompleks białek P indukował wytwarzanie immunoglobulin klasy IgM na niskim poziomie, który nie zmieniał się lub nieco obniżał po kolejnych immunizacjach. Wzrost miana przeciwciał klasy IgG2a był najbardziej zauważalny po II immunizacji. Białko MSP-1 i kompleks białek P działały podobnie (obecność IgG2a wykrywano w rozcieńczeniu surowicy -odpowiednio 1:4800 i 1:10000). Po IIl immunizacji poziom IgG2a był bardziej wyrównany zarówno dla kompleksu białek P jak i MSP-1, mieszcząc się w granicach rozcieńczeń 1:13000 - 1:20000.

3.4.2 Porównanie miana przeciwciał klasy IgG oraz podklasy IgG1 powstających w odpowiedzi na immunizację mysz preparatem białkowym kompleksu białek P lub białka MSP-1.

Przeciwciała IgG są najważniejszymi immunoglobulinami odpowiedzi wtórnej, cechującymi się wysokim powinowactwem do antygenu, zdolnością do jego opsonizacji (uruchamianie mechanizmów bójczych), aktywacji dopełniacza i przenikaniem przez łożysko. Obecność IgG wykrywa się dopiero po upływie pewnego czasu od momentu kontaktu z antygenem, stąd w badaniach obserwowano bardzo niskie miana tych przeciwciał po pierwszej immunizacji, zaś ich miano radykalnie wzrastało po drugiej i trzeciej immunizacji.

Wyniki przedstawiono poniżej jako odwrotność najwyższego rozcieńczenia badanej surowicy, przy którym OD405nm wynosiło 0,1. Cyfry rzymskie I, II i III oznaczają poszczególne immunizację.

PL 212 249 B1

197-316 2 + różnice statystycznie istotne w porównaniu do immunizacji I ++ różnice statystycznie istotne w porównaniu do immunizacji II

Rysunek 9.

Poziom przeciwciał IgG i IgG1 w surowicy myszy immunizowanych kompleksem białek P i białkiem MSP-1.

Najlepszym induktorem syntezy przeciwciał okazało się białko MSP-1 i kompleks białek P (obecność IgG wykrywano w rozcieńczeniu surowicy, odpowiednio - 1:118000 i 1:100000). Po trzeciej immunizacji poziom IgG był bardziej wyrównany dla kompleksu białek P i MSP-1 i mieścił się w granicach rozcieńczeń 1:100000 - 1:118000. W podklasie przeciwciał IgGl, najsilniejszymi induktorami syntezy IgG1 po drugiej immunizacji okazało się białko MSP-1 (rozcieńczenie surowicy 1:104000) oraz kompleks białek P (1:78000). Po trzeciej immunizacji poziom IgG1 wzrósł jeszcze i był bardziej wyrównany dla obu badanych antygenów.

3.5 Porównanie ilości limfocytów cytotoksycznych (Tc) i regulatorowych (Treg) powstających w odpowiedzi na immunizację mysz preparatem białkowym kompleksu białek P i MSP-1.

Limfocyty Tc są najważniejszymi komórkami odpowiedzi immunologicznej w stadium preerytrocytarnym Plasmodium falciparum, które niszczą zakażone pierwotniakiem hepatocyty. Limfocyty Treg hamują odpowiedź zapalną, ale ich pojawienie się jest korzystne dla gospodarza w późniejszym etapie infekcji, co zapobiega dalszym patologicznym powikłaniom. Jeśli supresyjna aktywność tych komórek ujawni się zbyt wcześnie to pozwoli na niekontrolowany wzrost liczby pasożytów, a w efekcie, zwiększy prawdopodobieństwo wystąpienia ciężkiej postaci malarii. Liczebność (przedstawioną w %) populacji limfocytów krwi Tc i Treg określano po upływie 2 tygodni od każdej immunizacji, oznaczając charakterystyczne dla tych komórek markery powierzchniowe (odpowiednio CD4-CD8+ oraz CD4+CD25+) metodą cytometrii przepływowej. Wyniki tych badań przedstawia poniższa tabela.

T a b e l a 1.

immunizacja	K1	P0(197-316)-(P1 -P2)2	MSP-1
% Tc	% T reg	% Tc	% T reg	% Tc	% T reg
I	6,33 ± 0,5	24,4 ± 0,9	6,97 ± 0,4	21,2 ± 2,3	7,03 ± 0,9	23,0 ± 2,6
II	6,79 ± 1,2	24,0 ± 2,8	10,9 ± 0,02+	20,1 ± 02	12,3 ± 1,2+	23,4 ± 1,1
IIl	8,19 ± 0,5	23,4 ± 0,5	5,9 ± 1,3	35,7 ± 3,3++	6,56 ± 0,7	33,8 ± 6,2++

Porównanie danych przedstawionych w Tabeli 1 pozwala na stwierdzenie, że badane białka w porównywalnym stopniu indukowały powstawanie populacji limfocytów Tc (zauważalne zwłaszcza

PL 212 249 B1 po II immunizacji) oraz limfocytów Treg (po III immunizacji). Na podkreślenie zasługuje, korzystne dla rozwoju odporności, późne pojawienie się limfocytów Treg.

Podsumowując, na podstawie przeprowadzonych badań immunologicznych można wysnuć wniosek, iż rekombinacyjny kompleks białek P P0(197-316)-(P1-P2)2 dobrze indukuje odpowiedź immunologiczną. Ponadto przebieg i wygaszanie reakcji zapalnych jest w pełni porównywalny z wzorcowym białkiem MSP-1. Daje to więc racjonalne podstawy by sądzić, że kompleks białek P P0(197-316)-(P1-P2)2 może mieć zastosowanie do otrzymywania szczepionki przeciw malarii.

P r z y k ł a d 4.

Konstrukcja kasety ekspresyjnej

Do otrzymania kasety ekspresyjnej wykorzystano sekwencje nukleotydowe zdeponowane w bazie danych genomu Plasmodium falciparum 3D7, www: http://www.genedb.org/Homepage/Pfalciparum.

Geny dla białek: P0 (PF11_0313), P1 (PF11_0043) i P2 (PFC0400 w) zostały zsyntetyzowane w firmie GenScript, a następnie poddane amplifikacji metodą PCR i wklonowane do bakteryjnego wektora pGEX4T-1. Pierwszym genem wprowadzonym do wektora pGEX4T-1 był gen dla fragmentu białka P0 (obejmujący kodony dla aminokwasów 197-316). Wykorzystano tu unikalne dla wektora pGEX4T-1 miejsca restrykcyjne BamHI i EcoRI. Fragment genu dla białka P0197-316 wklonowano zgodnie z ramką odczytu z genem reporterowym GST. Następnie wprowadzono kolejno geny dla rybosomalnych białek P1 i P2 wykorzystując kolejne unikalne pary miejsc restrykcyjnych dla enzymów EcoRI/Sall i Sall/Notl. Wymienione wyżej manipulacje genetyczne przeprowadzono zgodnie ze standardowymi procedurami. Sekwencje regulatorowe RBS i sekwencje łącznikowe oddzielających poszczególne geny zostały wprowadzone w procesie klonowania w starterach nukleotydowych użytych do amplifikacji DNA metodą PCR. Kaseta ekspresyjna jest przedstawiona jako Sekwencja 2.

Kaseta zawiera:

- sekwencję nukleotydową kodującą fragment białka GST będącego w fuzji z DNA kodującym fragment białka P0 (reszty 197-316) Plasmodium falciparum, w której między sekwencją DNA kodującą białko GST a fragmentem DNA dla polipeptydu P0 wprowadzona jest sekwencja nukleotydową kodująca aminokwasy stanowiące miejsce cięcia dla proteolitycznego enzymu trombiny,

- sekwencję łącznikową wraz z sekwencję wiązania rybosomu (RBS),

- sekwencję nukleotydową kodującą pełne białko P1 Plasmodium falciparum,

- sekwencję łącznikową wraz z sekwencję wiązania rybosomu (RBS),

- sekwencję nukleotydową kodującą pełne białko P2 Plasmodium falciparum,

PL 212 249 B1

Wykaz sekwencji

Sekwencja 1

Sekwencja aminokwasowa pentametrycznego kompleksu białek P Płasmodium fałciparum P0_1V7 3i<-(P 1 -P2)₂

- POj97-3)6

GSMVIYDAKVLDITDEDILEKFSKGVSNVAALSRATGVITEASYPHVFVEAFK ΝIVALIΐ DS DYT FPLMENIKKMVEKPEAFAAVAAPASAAEUWEPKKEEAKRVE EEEEEEEDGFMGFGMFD

-PI

MASIPASELPECEKQELLCTYAALILHEEKMSITSDNILKLIKNSNNTVLPYL

PMLFERALKGKDIQSLLSNLSVGSAPAAAAQVTTEKPSEDKKEAKKEEKVEEE

EEEDDLGFSLFG

- P2

MAMKYVAAYLMCVLGGNENPSTKEVKNVLGAVNADVEDEVLNNFIDSLKGKSC HELITDGLKKLGNIGGGVAAAPAGAAAVETA£AKKEDKKEEKKEEEEEEEDDL GFSLFG

Sekwencja 2 . Sekwencja nukleotydowa kasety ekspresyjnej.

Ramki odczytu kodujące GST, P0j97-3ifi, PI i P2 zostały podkreślone podwójną linią; pojedynczą linią podkreślona jest sekwencja DNA kodująca aminokwasy stanowiące miejsce cięcia dla enzymu proteolitycznego trombiny; linią przerywaną zaznaczono miejsca restrykcyjne dla enzymu EcoRI, Sali i Notl; sekwencje łącznikowe zostały wy cieniowane, w tym sekwencja wiązania do rybosomy RBS jest podkreślona.

AT GTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAGGGCCTTGTGCAACCCACTCG

ACTTCTTTTGGAATATCTTGAAGAAAAATATGAAGAGCATTTGTATGAGCGCG

ATGAAGGTGATAAATGGCGAAACAAAAAGTTTGAATTGGGTTTGGAGTTTCCC

ΛΆ'~ CTTCCT TAT TATAT TGATGGTGATGTTAAATTAACACAGTCTAT GGCCAT CATACGTTĄTATAGCTGACAAGCACAACATGTTGGGTGGTTG_TCCAAAAGAGC

GTGCAGAGATTTCAATGCTTGAAGGĄGCGGTTTTGGATATTAGATACGGTGTT TCGAGAATTGCATATAGTAAAGACTTTGAAACTCTCAAAGTTGATTTTCT TAG

CAAGCTACCTGAAATGCTGAAAATGTTCGAAGATCGTTTATGTCATAAftAęAT

ATTTAAATGGTGĄTCĄTGEAACCCATCCTGACT.TCATGTTGTATGACGCTCTT _{GATGTTGTTTTATAGATGGACCCAATGTGC:CTGGATGCGTT}g_CCAAAATTAGT

TTGTTTTAAAAAACGTATTGAAGCTATCCCACAAA.TTGATAAGTACTTGAAAT

CCAGCAAGTATATAGCAT GGCC TT TGCAGGGCTGGCAAGCCACGT T TGGTGGT

GGCGACCATCCTCCAAAATCGGATCTGGTTCCGCGTGGATCCATGGTAATTTA

TGATGCAAAAGTTTTAGATATTACCG

PL 212 249 B1

ATGAAGATATCTTAGAAAAATTTTCAAAAGGTGTATCTAATGTęGCTGCTTTA

TCTAGAGCTACAGGTGTTATTACAGAGGCTTCTTATCCACATGTATTTGTCGA

AGCATTCAAGAATATTGTTGCTTTAATTATAGATTCAGATTATACTTTCCCAT jjĄTGGAAAAYAYTAAAAAAATGGTTGAAAATCCAGAAGCATTTGCCGCAGTT

GCTGCACCTGCATCTGCAGCCAAAGCTGATGAftGCCAAAAAAGAAGAAGCCAA

AAAAGTAGAAGAGGAGGAAGTKAGAAGZtAGAAGATGGĄTTCATGGGATTTGGAA

TGT T T GAT TAAGAATTCAGGAGTACAAAAATGGCATCAAT TCCAGCATCAGAA TTACCAGAATGTGAAAAGCAGGAACTTTTATGTACCTATGCTGCTTTAATATT ACATGAAGAAAAAATGAGTATAACAAGTGACAATATTTTAAAGCTTATTAAAA attctaacaatactgttttgccatacttaccaatgcttttcgaaagggcttta

AAGGGAAAAGATATTCAGAGCTTATTAAGTAACTTAAGTGTAGGAAGTGCCCC

TGCAGCTGCTGCCCAAGTTACAACTGAGAAACCAAGTGAAGACAAAAAGGAAG CCAAAAAAGAAGAGAAAGT TGAGGAAGAAGAAGTkAGAAGATGATT TAGGTT TC

TCCTTATTTGGTTMGTCGACAGGAGTACAAAAATGGCTATGAAATACGTTGC

TGCATATCTTATGTGTGTATTGGGAGGAAATGAAAACCCAAGCACAAAAGAAG

TTAAGAATGTGTTAGGAGCCGT.AAATGCTGATGTAGAAGATGAAGTTTTTyiAC

AATTTTATTGATTCATTAAAAGGAAAGAGTTGCCATGAATTAATTACTGATGG

ATTAAAAAAATTACAAAATATTGGAGGTGGTGTAGCTGCCGCACCAGCTGGTG

CCGCTGCAGTAGAAACTGCTGAAGCTAAGAAAGAAGATAAGAAAGAAGAAAAG

AAAGAAGAAGAAGAGGAAGAAGAAGACGACTTAGGATTTTCCTTATTTGGTTA

AGCGGCCGC ~~~............................ ~ ~

Claims

1. Antygen patogenu malarii, znamienny tym, że występuje w postaci pentamerycznego kompleksu białek P, zawierającego sekwencję aminokwasową pochodzącą z sekwencji fragmentu białka P0, obejmującego reszty aminokwasowe od 197 do 316 oraz sekwencji aminokwasowych dwóch pełnych białek P1 i P2, określony jako Sekwencja 1.

2. Antygen według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencje aminokwasowe białek P1 i P2, występują korzystnie w układzie heterodimerycznym.

3. Sposób otrzymywania antygenu określonego w zastrz. 1, obejmujący metody nadekspresji białek z użyciem wektora ekspresyjnego, znamienny tym, że w wektorze ekspresyjnym używa się kasety genetycznej, zawierającej policistronowy układ trzech genów ułożonych w sekwencji P0-P1-P2 kodujących sekwencje aminokwasowe składników kompleksu białek P.

4. Kaseta ekspresyjna jako składnik wektora ekspresyjnego używanego według sposobu zdefiniowanego w zastrz. 3, znamienna tym, że sekwencją ulegającą ekspresji jest policistronowy układ trzech genów P0 (PF11_0313), P1 (PF11_0043) i P2 (PFC0400 w), z których każdy zawiera osobne sekwencje łącznikowe i regulatorowe RBS, przedstawiona jako Sekwencja 2.

5. Kaseta ekspresyjna według zastrz. 4, znamienna tym, że gen dla fragmentu białka P0 występuje korzystnie w N-terminalnej fuzji z genem dla białka GST.

6. Zastosowanie antygenu patogenu malarii określonego w zastrz. 1 i 2, do otrzymywania szczepionki przeciwko malarii.