JPS61149093A

JPS61149093A - 免疫的活性ペプチドおよび抗マラリア免疫原性刺激剤

Info

Publication number: JPS61149093A
Application number: JP60140108A
Authority: JP
Inventors: トーマス・フランク・マクカツチヤン; ジヨン・バートン・デーム; ジヤツキー・エル・ウイリアムス; イモージン・シユナイダー
Original assignee: US Government; US Department of Commerce
Current assignee: US Government; US Department of Commerce
Priority date: 1984-06-26
Filing date: 1985-06-26
Publication date: 1986-07-07
Anticipated expiration: 2011-12-04
Also published as: JP2561238B2; AU4399085A; JP2537027B2; EP0166410A2; EP0166410B1; HK1001823A1; DK166284B; JPH06225768A; ZA854697B; DK166155B; DE3586853T2; CA1340431C; US4707357A; JPH07110876B2; DK166284C; DK191991D0; JPH07265087A; JPH07265086A; DK289185A; JP2537028B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野コこの発明は、ヒトおよび他の動物に免疫応答を誘導し、
その結果マラリア病原虫による感染を防ぐ免疫的に活性
のある試薬に関し、特にはヒトのマラリア病原虫Ｐ、フ
ァルシパルムに対してヒトを守ることに関する。

［従来技術とその問題点］最近の全世界的なマラリアの伝播を防ぐためにワクチン
が必要なことは明らかである。マラリア　、に対する免
疫は段階的な特徴があるため、ワクチンはマラリアの生
活環の各段階に対して開発されなければならない。すな
わち生活環の各段階とは、スポロゾイト（ヒトに感染を
引き起こす蚊の段階）、赤血球に侵入した無性生殖の病
原虫（病気を引起こす段階）、および生殖体く蚊に感染
性を媒介する段階）である。興味の対象の１つはスポロ
ゾイトに対するワクチンである。それは効果があれば、
免疫系を刺激して蚊によって媒介されたスポロゾイトを
殺し、他人に感染して病気の原因となる次の段階を貴重
めることができよう。

以前は動物やヒトは、放射線照射したスポロゾイトを注
射することで病気から守られてきた。しかしながら、放
射線照射したスポロゾイトでワクチンを接種することは
、その供給が限られておりスポロゾイトが不安定である
ため、実際に向いていない。モノクローナル抗体の使用
がきっかけとなって、誓歯類のマラリアであるプラスモ
デイウム・ベルブヘイ（ｐ　　Ｉａｓｍｏｄｉｕｍ　ｂ
ｅｒｇｈｅｉ）のスポロゾイト上の主要表面タンパクが
発見された［Ｎ。

ヨシダ、Ｒ，Ｓ、ヌツセンツワイク、Ｐ、ボトク二１−
り等、サイエンス（３ｃｉｅｎｃｅ　）　、　２０７゜
７１（１９８０）］。このタンパクはスポロゾイトの表
面を覆っていて、周囲スポロゾイト（Ｃ８）タンパクと
称されている。Ｐ、ベルブヘイのＣＳタンパクに対する
モノクローナル抗体を投与すれば、感染力をもった蚊の
伝播からマウスを完全に保護することができる［Ｒ，Ｓ
、ヌツセンツワイク、Ｐ、ボトクニャーク、■、ヌッセ
ンツワイク。

ジャーナル・オブ・エクスベリメンタル・メデイスン（
Ｊ、Ｅ　ｘｐ、Ｍ　ｅｄ、）、１５１．１５０４　（１
９８０）］。ヒトの主なマラリアであるＰ。

ファルシパルム（Ｐ　Ｉａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉ
ｐａｒｕｇｌ）を含めてサルおよびヒトのマラリア種に
関する同様のＣＳタンパクが同定されてきた［Ｆ、サン
トロ。

ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリーＬ１
．　Ｂ　　ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ）　、　　２５８．３３
４１（１９８３）：Ｅ、ｌ−１，ナルディン等、ジャー
ナル・オブ・エクスベリメンタル・メディスン（Ｊ。

Ｅ　ｘｐ、Ｍ　ｅｄ、）、１５６．２０（１９８２）コ
。しかしながら、この発明以前にＰ、ファルシパルムの
タンパクの構造は知られていなかった。サルのマラリア
であるＰ、クリープ（Ｋ　　１５ａｖｅ＞のＣＳタンパ
クに対する遺伝子は最初にクローニングされた。という
のは、ｃＤＮＡライブラリーを調製する際に感染力をも
った蚊のＰ、クリープを大量に利用できたからである［
Ｌ、Ｓ、オザキ。

Ｒ，Ｗ、クワッッ等、ネイチｔ　−（Ｎ　ａｔｕｒｅ）
　。

３０２．５３６　（１９８３）；Ｇ、Ｎ、ゴードソン、
Ｊ、エリス、Ｐ、スビー等、ネイチャー（’Ｎ　ａｔｔ
ｌｒｅ）　、　３０５．２９　（１９８３）　］。コの
遺伝子は、感染防御のモノクローナル抗体に結合してい
るエピトープを含む、アミノ酸の反復配列をもったタン
パク（１２分子のアミノ酸が１２回反復する）をコード
していた。モノクローナル抗体は、免疫放射線検定にお
いてポリクローナル抗スポロゾイト血清がトリトンｘ−
ｉｏｏで可溶化したタンパクに接近するのを遮断したの
で、この繰返し構造のエピトープはそのタンパク上の主
要な免疫原であった［Ｆ、ツアバラ、Ａ、Ｈ，コクレー
ン、Ｅ、Ｈ，ナルディン等、ジャーナル・オブ・エクス
ベリメンタル・メデイスン（Ｊ。

Ｅ　ｘｐ、Ｍ　ｅｄ、）、１５７．１９４７　（１９８
３）］。しかしながら、以前サルの病原虫からこの繰返
し構造のエピトープに対して調製された抗体はヒトの病
原虫とは反応しないので、ヒトマラリア病原虫のＣＳタ
ンパクに関連した抗原物質が必要とされ゛ている。

［問題点を解決する手段］従って、この発明の目的は、ヒトに対して防御免疫応答
を誘導し得る、ヒトマラリア抗原に類似のペプチド配列
を提供することである。この発明のもう１つの目的は、
そのような特性を有する抗原物質を発現し得るＤＮＡ配
列を提供することである。

これらの目的は添って以下の物質を提供することにより
達成される。すなわち、単独でまたは担体分子と結合さ
れたときヒトに免疫反応を誘導し得る、マラリア病原虫
と交差反応しマラリア病原虫による感染に対して抵抗性
を示す実質的に精製された免疫的に活性な合成ペプチド
であって、該ペプチドがＡｓｎ−Ｘ−Ｔ−Ｐｒｏ　（こ
こで、ＸはＡｒａまたはＶａｌおよびＹはＡｓｎまたは
Ａｓｐ）で表わされるアミノ酸配列の少なくとも２回の
連続的繰返し単位を含むことを特徴とする免疫的活性ペ
プチドである。同様の防御は、そのペプチドが以下の配
列式を含む場合も達成し得る。

すなわち、アミノ酸配列式Ｔｈｒ−ＧＩＬＪ−Ｔｒｌ）
−Ｚ−Ｐｒｏ−ＣＶＳ−８ｅｒ’−Ｖａ　ｌ　−Ｔｈ　
ｒ−Ｃｙｓ−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ａｓ　ｎ−Ｇ　Ｉ　ｙ　（こ
こで、Ｚは３ｅｒまたはＴｈｒ）、またはアミノ酸配列
式Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−８−Ｔ−８−Ｌｙｓ−しｅｕ−しｙ
ｓ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｐｒｏ−Ｕ−Ｖ　−Ｇ　Ｉ　Ｖ−Ｗ−
Ｐｒｏ　（ここで、ＳはＬｙＳまたはＡｓｎ、ＴはＨｌ
ＳまたはＱｌｕ、ｔＪはＧｌｙまたはＡｓｎ、■はＡｓ
ｐまたはＧＩＩＪ、およびＷはＡｓｎまたはＧｌｒｌを
示す）である。

また、この発明は生体系でそのようなペプチドの産生に
有用な遺伝物質、例えば目的のペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列をも含む。

この発明は、Ｐ、ファルシパルムからのＣＳタンパクの
免疫的活性断片の特性および構造の発見から肩されたと
もいえる。発明者等は、Ｐ、ファルシパルムのＣＳタン
パクに反応するモノクローナル抗体はタンパク中に見出
される反復単位を標的としていることを確認している。

これらの反復単位（およびプラスモディウム属の数種に
見出される不変領域と見られるＣＳタンパクの他の領域
）が同定されたので、化学的合成の手法を取ろうと生物
学的手法を取ろうと、ワクチンの基礎となるこれらの免
疫的活性領域を含むペプチドを生産することが可能とな
る。

従って、この発明は単独でまたは担体分子と結合された
ときヒトに免疫反応を誘導し得る、マラリア病原虫と交
差反応しマラリア病原虫による感染に対して抵抗性を示
す実質的に１！製された免疫的に活性な合成ペプチドを
含む。該ペプチドがＡｓｎ−Ｘ−Ｔ−Ｐｒｏ　（ここで
、ＸはＡｒａまたはＶａｌおよびＹはＡｓｎまたはＡＳ
Ｉ））で表わされるアミノ酸配列の少なくとも２回の連
続的繰返し単位を含むことを特徴とする免疫的活性ペプ
チドである。同様にこの発明は、該ペプチドがアミノ酸
配列式Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−ＴｒＤ−Ｚ　−ｐｒｏ−Ｑｙｓ
−８ｅｒ−１／ａ　Ｉ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇ　ｌ　ｙ−
Ａｓｎ−Ｇ　ｌ　ｙ　（ここで、ＺはＳｅｒまたはＴｈ
ｒ）、またはアミノ酸配列式％式％Ｐｒｏ（こコテ、ＳはＩｊ／ＳまたはＡｓｎ、Ｔは）（
ｉｓまたはＧｌｕ、ＵＧ、ｔＧｌｙまたはＡｓｎ。

■はＡｓｐまたはＱｌｕ、およびＷはＡｓｎまたはＧｌ
ｎを示す）で示される免疫的に活性な合成ペプチドを含
む。したがって、望ましい免疫学的特徴を有するペプチ
ドには少なくとも次の３つの変形例がある。（１）前記
反復単位を含むが前記長い配列は含まないペプチド；（
２）前記２つの長い配列（以後しばしば、領域工および
領域■と称する）を含むペプチド；および（３）前記の
反復単位と前記の領域■および領域■と同定された配列
の一方か両方を含むペプチド。

この明１Ｂ向で用いられる「合成」という用語は、天然
状態のこの発明のペプチドから、以前から知られている
Ｐ、ファルシパルムのＣＳタンパクを特に除去したとい
う意味である。この発明は、ＣＳタンパクのエピトープ
の構造およびこれらのエピトープに対する抗体のマラリ
アに対する免疫能の発見により肩されたともいえる。ひ
とたびエピトープの構造が解明されると、ワクチンとし
て有効な合成ペプチドを調製することが可能となった。

しかし、ここでの合成とは、例えば遺伝子工学的にヒト
が介在する生物学的方法による産生をも含む。

この発明のすべてのペプチドに関する１つの重要な特徴
は、それらのペプチドが免疫的活性を示し、単独でまた
は担体分子と結合されたときヒトにマラリア病原虫と交
差反応性の免疫応答を誘導し得るということである。従
って、上に列挙した配列の少なくとも一部が、１つ以上
のこれらの配列を含むペプチドの免疫的に利用可能な表
面に存在することが必要である。これらの特徴を有する
ペプチドを調製できるいくつかの方法がある。

まず初めに、上に述べた配列から実質的に成るペプチド
を化学的または生化学的に合成することができる。その
様なペプチドは、上に述べた配列中のアミノ酸を少なく
とも１０％、好ましくは少なくとも４０％、さらに好ま
しくは少なくとも６０％、もつとも好ましくは少なくと
も８０％含むであろう。最も好ましいペプチドは、全体
が上に述べた配列（そのペプチドの１ないし３分子の末
端アミノ酸がそのペプチドの一端または両端から欠損し
ている前記反復配列から成ると考えられるペプチドと一
緒に）から成る。

また、前記アミノ酸の配列が最終的なペプチドの表面に
見出されるように調製することも可能である。例えば、
これはペプチド結合により１つ以上の前記配列を、前も
って調製したペプチドの表面に結合させることにより行
なうことができる。

しかしながら、１つ以上の前記配列が長い合成ペプチド
またはタンパクのアミノ酸配列の内部に含まれる場合で
さえ、免疫学の専門家であればこのペプチドがこの発明
の範囲に入るかどうか容易に知り得る。ＣＳタンパクを
免疫して得られる抗体と反応するペプチドのみが、この
発明の範囲に入ると考えられる。従って、当該分野の専
門家は、この発明の配列の１つを含むペプチドを容易に
合成することができるし、日常的な試験により最終生成
物がこの発明の範囲にはいるかどうか分る。

これは、そのタンパクとＣＳタンパク、好ましくはＰ、
ファルシパルムのＣＳタンパクを免疫して得られる抗体
、または前記配列の１つから実質的にまたは全体として
成立つペプチドを免疫して得られる抗体（好ましくは、
モノクローナル抗体）とを反応させることにより測定す
ることができる。

免疫反応が陽性であれば、このタンパクはこの発明の範
囲にはいる。Ｐ、ファルシパルムのＣＳタンパクと反応
する抗体は、一般的に知られており容易に入手し得る。

例えば、それは寄託されたハイブリドーマ細胞系ＡＴＣ
ＣＨＢ８５８３により産生される。その細胞は、ここで４９．２Ｆ１．１と同定された抗体を産生ずる。

この発明の分子の大きさに関して、上限はない。

ただ、長いペプチド分子を合成し得る技術力が問題であ
る。この発明の分子は、水性溶媒に溶けることも溶けな
いことも有り得る。事実、この発明の１つの好ましい態
様として、高分子長で不溶性のペプチドを合成すること
が挙げられる。そのペプチドは、免疫的防御力を誘導す
るため分解され水溶性懸濁液として投与することができ
る。とはいえ、小さな分子も同様にこの発明を実施する
ために適している。反復単位１００．２００．４００ま
たは１０００を含む分子が、この発明を実施するために
適している。しかしながら、５０を越える反復単位を含
むペプチドを合成する必要はないようである。というの
は、５０までの反復単位を含むペプチドは所望の免疫効
果を充分誘導するであろうし、合成が容易であるからで
ある。

２０ないし５ｏの反復単位の分子が特に好ましい。

反復単位がペプチド全体の少なくとも４０％、更に好ま
しくは８０％から成る５０までの反復単位を含むペプチ
ドが望ましい。可能な反復単位の中で、Ａｓｎ−Ａ　ｌ
　ａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏが最も望ましいが、Ａｓｎ−Ｖａ
　１−ＡＳり−Ｐｒｏの反復単位が次に望ましい。反復
単位の少なくとも８０％がＡｓｎ−Ａ　Ｉ　ａ−Ａｓｎ
−Ｐｒｏｔ’、残りがＡｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ
であるペプチドが特に望ましい。

反復単位を含むペプチドに関してペプチド配列が、実質
的に配列Ａ−８−Ａ−Ｂ−Ａ−８−（Ａ）１５−８−　
（Ａ）ｘ　［ここでは、ＡはＡｓｎ−Ａ　Ｉ　ａ−Ａｓ
ｎ−Ｐｒｏ、ＢはＡｓｎ−Ｖａｌ　−Ａｓｐ−ｐｒｏを
示し、およびＸはＯないし３０、好ましくは１５ないし
２５、最も好ましくは２０である１から成る１つのペプ
チドが特に好ましい。

この発明のペプチドが、要求される反復配列（もちろん
所望ならばこれらの配列が反復していてもよい）として
特に取上げない配列の１つを含むならば、ＺはＳｅｒ、
ＳはＬｙｓ、Ｔは）−１ｉｓ、ＵＧ、ｔＧ　Ｉ　Ｖ、　
ＶハＡ　Ｓ　ｌ）、およびＷはＡｓｎであるペプチドが
望ましい。列挙した２つの長い配列のうち、アミノ酸配
列式Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−丁ｒｐ−Ｚ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−８
ｅｒ−Ｖａ　１−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇ　Ｉ　Ｖ−Ａｓｎ
−Ｇ　ｌ　ｙ（すなわち領域■）を含むペプチドが好ま
しい。

前記の反復中位と前記の領域■および領域■と同定され
た配列の一方か両方を含むペプチドが合成された場合、
このましいペプチドは２ないし５０の反復単位を含む。

それらには、領域■の配列を含むペプチド配列が続き、
領域■の配列を含むペプチド配列が先行する。特に好ま
しいペプチドは次の配列式を含む。Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌ
ｙｓ−Ｈｉ　５−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇ
　ｌ　　ｎ−Ｐｒｏ−Ｇ　ｌ　　ｙ−Ａｓｐ−Ｇ　Ｉ　
　ｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−ＡＳＩ）−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａ
　ｌ　　ａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｖａ　ｌ　−Ａ
ｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａ　ｌ　　ａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ
−Ａｓｎ−ｖａ　　１−Ａｓｎ−ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａ　
ｌ　　ａ−Ａｓｎ−ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｖａ　　１−Ａｓ
ｐ−Ｐｒ’ｏ−Ａｓｎ−Ａ　　ｌ　　ａ　−Ａｓｎ−Ｐ
ｒｏ−Ａｓｎ−Ａ　　ｌ　　ａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓ
ｎ−Ａ　　Ｉ　　ａ−，６，５ｎ−Ｐｒｏ　−Ａｓｎ−
Ａ　　Ｉ　　ａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａ　　ｌ　
　ａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａ　Ｉ　　ａ　−Ａｓ
ｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａ　　ｌ　　ａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ
−Ａｓｎ−Ａ　　Ｉ　　ａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓ　ｎ
−Ａ　　Ｉ　　ａ−Ａｓ　ｎ−Ｐｒｏ−Ａｓ　ｎ　−Ａ
　　Ｉ　　ａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａ　　ｌ　　
ａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ　−Ｐｒ
ｏ−Ａｓｎ−Ａ　　ｌ　　ａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ　−Ａｓ
ｎ−Ａ　　ｌ　　ａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａ　　
ｌ　　ａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｖａ　　ｌ　　−
ＡＳ　ｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａ　Ｉ　　ａ−Ａｓｎ−Ｐ
ｒｏ−Ａｓｎ−Ａ　　ｌ　　ａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ　−△
ｓｎ−△　ｌ　　ａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ　−Ａ　
　ｌ　　ａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａ　　ｌ　　ａ
　−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａ　　ｌ　　ａ−Ａｓｎ
−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａ　　Ｉ　　ａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ　
−Ａｓｎ−Ａ　　Ｉ　　ａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−
Ａ　　Ｉ　　ａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａ　　ｌ　
　ａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａ　ｌ　　ａ−Ａｓｎ
−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａ　　ｌ　　ａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ　
−Ａｓｎ−Ａ　　ｌ　　ａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−
Ａ　Ｉ　　ａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−△ｓｎ−△　１ａ−Ａ
ｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａ　　ｌ　　ａ−Ａｓｎ−Ｐｒ
ｏ−Ａｓｎ−Ａ　　Ｉ　　ａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ　−Ａｓ
ｎ−Ａ　　Ｉ　　ａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ　−Ａ　
ｌ　　ａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌ　ｙｓ−Ａｓｎ
−Ａｓｎ−Ｇ　ｌ　　ｎ−Ｇ　Ｉ　　ｙ−Ａｓｎ　−Ｇ
　　ｌ　　ｙ−Ｇ　　ｌ　　ｎ−Ｇ　　ｌ　　”ｙ−Ｈ
ｉ　　５−Ａｓｎ　−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｐ
−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｖａ　　１−Ａ５
ｃ＋−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓ
ｎ−Ａｓｎ−Ａ　Ｉ　　ａ−Ｖａ　　ｌ−Ｌ　ｙｓ　−
Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇ　Ｉ　　Ｕ−Ｇｌ
ｕ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−ＡＳＩ）−１ｊ／Ｓ−Ｈｉ　　ｓ
−Ｉ　　Ｉ　　ｅ−Ｇ　ｌ　　ｕ−Ｇ　ｌ　　ｎ−Ｔｙ
ｒ−Ｌｅｕ−１ｙｓ−Ｌ、ｙｓ−ｒ　Ｉ　ｅ−Ｌｙｓ−
Ａｓｎ−３ｅｒ−１１ｅ−８ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｔ
ｒｏ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−ＣｙＳ−８ｅ　ｒ−Ｖａ　　１
−Ｔｈ　　ｌ　　−Ｃｙｓ−Ｇ　　Ｉ　　Ｖ−Ａｓｎ−
Ｇ　Ｉ　　Ｖ。

この発明のペプチドの合成法としては、望ましい構造を
有する１つ以上の４量体を形成することが望ましい。続
いてその４量体を重合しｍ線生成物を調製する。この方
法により非常に長いペプチドが調製できる。このような
化学合成は、長い反復配列が大きな分子の一部として存
在する場合でも同様に望ましい。この反復配列およびよ
り短い配列を独立に合成することができ、続いてそれら
を結合させてＲ終生酸物を調製する。その様な手法は、
ペプチド合成の専門家に良く知られている。

例えば、米国特許第４１３２７４６号にペプチド４量体
の合成法およびより大きな分子を形成させるためにその
４量体の重合法が記載されている。

そこで記載されている方法を、その特許に挙げられてい
るアミノ酸の代わりにこの発明で用いられるアミノ酸を
選ぶことにより、この発明に応用することができる。も
ちろん、近代的なペプチド合成装置（その多くは市販さ
れており、それにより大きな完全ペプチド分子を合成し
若しくは大きな断片を合成しそれを順次結合させること
が極めて容易になった）も出現している。

この発明の遺伝学的（生物学的）ペプチド合成法を記載
するに先立ち、この発明の好ましい態様を考慮しておく
ことが必要であろう。そこでは、この発明のペプチドの
免疫応答を誘導する能力が、この発明の１つ以上のペプ
チドを免疫担体に結合させることにより高められる。そ
の結果として得られる生成物は、高い免疫能を有してい
るので、ここでは抗マラリア免疫刺激剤と称することと
する。低分子の免疫能を高めるために、免疫担体を使用
することはよく知られている。担体は基本的に２つのク
ラス、すなわち可溶性分子および粒子に分けられる。可
溶性分子の典型例は、タンパクおよび多糖である。粒子
の典型例は、リポソームおよび細菌細胞または膜のよう
なその一部である。

完全な細胞は一般的に殺して、感染に繋がる問題を防ぐ
ために分裂しないようにしておく。

あらゆる場合、免疫応答の増幅は担体の大きさに依存し
ているため、担体の実際の構造は重要ではない。タンパ
クおよび多糖のような可溶性高分子を担体として用いる
場合ｉ　ｏｏｏｏないし１０ｏｏｏｏｏの範囲の分子長
が望ましい。それが非常に大きいと、タンパクおよび多
糖の担体は不溶性と成り、従って微粒子と考えられる。

ペプチドを担体に結合させる方法は、ペプチドの免疫的
特異性の少なくとも一部が保持される限り、余り問題で
はない。この結果を得るための方法は、次のような手段
によりペプチドを担体に結合させることが好ましい。担
体のカルボキシル基またはアミノ基とペプチドのアミノ
基またはカルボキシル基（好ましくはペプチドの遊離カ
ルボキシル基または末端アミン基）との間でアミド結合
を形成させる。もう１つの結合方法は、担体のカルボキ
シル基または水酸基とペプチドの水酸基またはカルボキ
シル基（好ましくはペプチドの末端カルボキシル基）と
の間でエステル結合を形成させる方法である。必要なら
ば、ペプチドと担体とを結合させるために例えばアミン
に結合している１ないし１０個のメチレン炭素を有する
末端ジアミンを用いてもよい。

担体が用いられる場合、多数のペプチドを担体表面に結
合させることにより免疫的応答を高めることができる。

例えば、１ないし１０００００分子のペプチドをタンパ
クまたは多糖に結合し得るが、１００ないし１００００
分子を結合させると好ましい。担体としてタンパクが用
いられる場合、両性タンパクが望ましい。その様なタン
パクは親木部分および疎水部分を有する。その様なタン
パクにおいて、この発明のペプチドを親水部分に結合さ
せることが望ましい。それによって、疎水性部分が様々
な膜に埋め込まれると、親水性部分が体液環境にさらさ
れる。

担体として用いて好ましいタンパクの１つは破傷風トキ
ソイドであり、これは免疫担体どして用いることが以前
から示唆されている物質であるふつうに用いられている
ワクチンである。

高分子担体の使用について上記に挙げた望ましい態様は
、同様に微粒子担体の使用についても当はまる。但し、
担体当りペプチドの上限は約１０ｔｓ、好ましくは１Ｑ
１０である。細菌細胞（殺されているかまたは他の方法
により分裂が妨げられている）が好ましい微粒子として
挙げられる。

Ｐ、ファルシパルムからの天然ＣＳタンパクに極めて類
似しているペプチドが望まれる場合、Ｐ。

ファルシパルムに関連した遺伝子またはＰ、ファルシパ
ルムのＣＳタンパク遺伝子由来の遺伝子を使って、生物
学的にそのペプチドを合成することが好ましい。続いて
、その結果得られた遺伝子産物を例えば末端アミノ基の
開裂により修飾することができる。

組換えＤＮＡ技術が出現して、クローニング遺伝子の産
物を得るための手法が最近急速に増えた。

この発明に使用するに値するクローニング遺伝子を調製
するに適した方法を記載している最近の米国特許の例と
して、米国特許第４４１９４５０．４４１８１９４．４
４１４１５０．４３９９２１６．４３９４４４３．４３
５６２７Ｇ，４３５１９０１、および４３２７２２４号
が挙げられる。

もちろん、そこに記載された技術を改良して次のような
手法を用いることができる。所望のペプチド産物を発現
し得るＤＮＡ配列を合成する。米国特許第４２７３８７
５．４３０４８６３．４３３２９０１．４４０３０３６
．４３６３８７７および４３４９６２９号に記載されて
いる適切なりローニングベクターの中にそれらのＤＮＡ
を挿入させる。次に、この発明に適した一般的な遺伝子
工学的手法を述べる。

遺伝情報は、二重鎖のデオキシリボ核酸（ＤＮＡすなわ
ち遺伝子）上にコードされている。

それは、ヌクレオチド成分が繰返しているとしても、Ｄ
ＮＡコドンが固有の塩基を指定している順序に従ってい
る。コードされた遺伝情報が「発現」してポリペプチド
を産生ずる過程は、２段階から成っている。遺伝子中の
ある調節遺伝子（「レギユロン」）の指令に従って、Ｒ
ＮＡポリメラーゼがＤＮＡ鎖に沿って移動し、「転写」
と呼ばれる過程でメツセンジャーＲＮＡ　（リボ核酸）
が合成される。続く「翻訳」の段階で、細胞のリポソー
ムがトランスファーＲＮＡを結合させて、ｍＲＮＡの「
メッセイジ」をポリペプチドに転換する。ＤＮＡから転
写されたｍＲＮＡの情報には、リポソームが翻訳を開始
するおよび終結するシグナルが含まれている。同様に、
ポリペプチドを形成するアミノ酸の同定および配列のシ
グナルが含まれている。ＤＮＡ鎖は「コドン」呼ばれる
ヌクレオチドからなるトリプレットの長い配列を含み、
各トリプレットコドン中のヌクレオチドの特異的塩基に
より情報の特異的断片がコードされている。

例えば、ＡＴＧ　（アデニン−チミン−グアニン）と読
まれる３ヌクレオチドは、「翻訳開始」と判断されるｍ
ＲＮＡのシグナルである。一方終止コトンＴＡＧ、■Ａ
ＡおよびＴＧＡは、「翻訳終止」と解釈される。開始と
終止との間のコドンには、いわゆる構造遺伝子が存在す
る。そのコドンは、最終的に翻訳されるアミノ酸配列を
規定している。

この定義は、確立している用品「遺伝子コドン」［例え
ば、Ｊ、Ｄ、ワトソン、遺伝子の分子生物学、第３版（
１９７６）、Ｗ、Ａ、ベンジャミン出版］に従った。そ
の本には、様々なアミノ酸のコドンが記載されている。

遺伝子コドンは、様々な二トンが同一のアミノ酸を生産
するという意味において縮退している。しかし、各アミ
ノ酸に対して１つ以上のコドンがあるが、他のアミノ酸
をを定しないという点では厳密である。例えば、ＴＴＴ
ｌＴＴＣ，ＴＴＡ、およびＴＴＧのコドン全ては、セリ
ンをコードしているが、他のアミノ酸はコードしない。

翻訳中、適切な解読フェイズすなわち解読フレイムが保
持されなければならない。例えば、リポソームが塩基配
列中の様々なコドンを開始コドン（下線部）として読ん
だ場合側が起こるか考えてみよう。

・・Ｇ　ＣＴ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　Ｔ　Ｇ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ｇ・
・の塩基配列において、 °°匹工住旦］〜工追］−八へ」−・・は・・Ａ　Ｉ　
ａ−Ｇ　Ｉ　Ｖ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ　−・、・・Ｇ　　Ｃ
ＴＧ　　ＧＴＴ　　ＧＴＡ　　ＡＧ・・は−−Ｌ　ｅｕ
−Ｖａ　Ｉ−Ｌｅｕ　−−１・・ＧＣＴＧＧ　　ＴＴ釘
工ＡＪ工Ｇ・・は・・Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−（終止）となる
。

従って、最終的に生産されるポリペプチドは、レギユロ
ンと構造遺伝子との立体的関係に極めて依存している。

遺伝的発現の過程をより詳しく理解するために、一度遺
伝子の成分を次のように定義しておく必要がある。

・オペロン：ポリペプチド発現のための構造遺伝子およ
び発現を制御する調節領域（「レギユロン」）を含む遺
伝子。

・プロモーター：転写を開始するためにＲＮＡボリメラ
ーゼが結合しなければならないレギユロン内に存在する
遺伝子。

・オペレータ：リプレッサータンパクが結合し得る遺伝
子で、ＲＮＡポリメラーゼの結合が隣接するプロモータ
ーに結合することを阻止する。

・インデューサー二リプレッサータンパクを不活化する
物質で、オペレーターを解放しＲＮＡポリメラーゼをプ
ロモーターに結合させ転写を開始させる。

・カタボライト活性化タンパク（ｒｃＡＰＪ　）結合部
位：サイクリックアデノシン−リン酸（ｒｃＡＭＰＪ　
）が仲介するＣＡＰに結合する遺伝子で、通常転写の開
始のためにも必要とされる。

ＣＡＰ結合部位は特別の場合不必要であることもある。

例えば、λファージのラクトースオペロン中のプロモー
ター突然変異は、ｃＡＭＰおよびＣＡＰ発現を必要とし
ない。Ｊ、ベックライラス等、ジャーナル・オブ・モレ
キュラー・バイオロジー、６９．ｌ５Ｓ１６０　（１９
７２）］参照。

・プロモーター−オペレーター系：この明細書で用いら
れているように、ＣＡＰ結合部位またはリプレッサータ
ンパクをコードする能力を含むか含まないかに係わらず
、オペロンの操作可能な調節領域。

更に、以降組換えＤＮＡについて議論する際に使用する
用語として、以下にそれを定義しておく。

・クローニングベクター：「形質転換」の過程で単細胞
生物（「微生物」）に導入されたとき、ベクターが複製
されるような完全な「レプリコン」を含む非染色体の二
重鎖ＤＮＡ、このように形質転換される生物を「トラン
スフォーマント」と呼ぶ。

・プラスミド：この発明の目的には、ウィルスまたは細
菌に由来するクローニングベクターを意味する。後者は
「細菌プラスミド」である。

・相補性二二重鎖ＤＮＡのそれぞれの鋼上で相補的塩基
間に水素結合を介して二重鎖ＤＮＡを形成させる単！１
ＤＮＡの塩基配列に付与される性質。

アデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）に相補し、グアニン（Ｇ
）はシトシン（Ｃ）に相補する。

最近の生化学の進歩により、「組換体」クローニングベ
クターを精製し得るようになった。それにおいて、例え
ばプラスミドをある外来性のＤＮＡに組み込める。特殊
な例において、その組換体は［異質Ｊ　ＤＮＡを含むこ
とがある。それは、組換体ベクターによって形質転換さ
れやすい微生物により通常生産されないポリペプチドを
コードするＤＮＡを意味する。プラスミドは開裂して、
連結反応性末端を有する直鎖ＤＮＡとなる。これを連結
反応性末端を有する外来性ＤＮＡと結合させると、完全
なレプリコンおよび所望の表現形質を有する生物学的機
能のある分子が生じる。組換体ＤＮＡは、形質転換によ
り微生物の中に導入され、そしてトランスフォーマント
は、新しい遺伝情報を発現し得る大量の細胞を得る目的
をもって単離されクローニングされる。組換体クローニ
ングベクターを形成する方法、およびそれらを有する形
質転換細胞を得る手段は、広く文献に記載されている。

例えば、Ｈ，Ｌ、ハイネッ力−等、ネイチｔ　−（Ｎ　
ａｔｕｒｅ）　、　２６３．　７４８−７５２（１９７
６）：ツーエン等。プロシーディング・オプ・ナショナ
ル・アカデミツク・サイエンス（Ｐ　ｒｏｃ、　Ｎ　ａ
ｔ、Ａ　ｃａｄ、　Ｓ　ｃｉ　、　）、米国。

江、２１１０　（１９７２）；同書、　ＬＬ、　１２９
３　（１９７３）；同書、７Ｇ．３２４０　（１９７３
）二同書、ＬＬ、１０３０　（１９７４）：モロー等、
プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミツク・
サイエンス（Ｐ　ｒｏｅ、　Ｎ　ａｔ　。

Ａ　ｃａｄ、　Ｓ　ｃｉ　、　）　、米国、７１．１７
４３　（１９７４）：およびジャクソン等、プロシーデ
ィング・オブ・ナショナル・アカデミツク・サイエンス
（Ｐ　ｒｏｃ、　Ｎ　ａｔ、　Ａ　ｃａｄ、　Ｓ　ｃｉ
　、　）、米国。

６９．１９０４　（１９７２）参照。この主題の一般的
議論は、Ｓ、コーエン、サイエンティフィック・アメリ
カン（Ｓ　ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　　Ａｍｅｒｉｃａｎ　
）　。

２３３．２４　（１９７５）に見られる。

様々な技術により、ＤＮＡの組換えが可能になった。そ
れによると、別々のＤＮＡ断片の連結を容易にするなん
らかの方法により末端を切断しておく。この連結とは（
はとんどの場合７４　　ＤＮＡリガーゼを介して）、隣
接するヌクレオチド間にホスホジエステル結合を形成さ
せることである。

このようにして平滑末端を直接連結させることができる
。また、隣接末端に相補的な単一鎖を含む断片は、各末
端に位置する水素結合により連結が容易になる。そのよ
うな単一鎖は、接着末端と呼ばれているが、ターミナル
トランスフェラーゼを使ってヌクレオチドを平滑末端に
付加えることにより形成され得る。また、しばしば単に
λエキソヌクレアーゼのような酵素を使って平滑末端の
単一鎖を切ることによっても形成され得る。更に、長さ
約４ないし６塩基対のユニーク配列近辺のフォスフオシ
エステル結合を切断する制限エンドヌクレアーゼを用い
ることがしばしば行われている。

多くの制限エンドヌクレアーゼおよびその認識部位が知
られている。いわゆるＥＣＯＲＩというエンドヌクレア
ーゼが最も広く使われている。回転対称な「パリンドロ
ーム」の二重鎖ＤＮＡを切断する制限エンドヌクレアー
ゼは接着末端を残す。

このように、プラスミドまたは他のクローニングベクタ
ーは切断され、各末端は制限エンドヌクレアーゼ認識部
位の一方を含むようになる。外来性のＤＮＡの切断産物
には、この様なプラスミド末端と相補性を示す末端が存
在する。また以下に開示するように、接着末端を含む合
成ＤＮＡは外来性ＤＮＡの挿入を妨げるので、アルカリ
フォスファターゼで末端を°切断しておくとよい。そう
すると、外来性ＤＮＡ断片を取り込めるベクターを選択
することができる。ＤＮＡ断片の末端が２つの異なった
制限エンドヌクレアーゼで切断されたＤＮＡベクターと
相補性を示せば、そしてそれ自身が２つの異なった制限
エンドヌクレアーゼが認識する配列を構成する末端をそ
れぞれ含めば、ベクターの構造に対して正しい方向を有
するＤＮＡ断片の取込みが高まるであろう。

全ＣＳタンパクを産生ずるための１つの方法は、以下の
一般的な方法の中で記載する。この方法において、遺伝
子の５′および３′末端を優先的に切断できるホルムア
ミド濃度および温度条件を調節して、ヤエナリのヌクレ
アーゼを使用する。この様な方法で得られるＤＮＡ断片
を、λＱｔ１１ベクターのような様々な発現ベクターの
中にクローニングできる。例えば、クローニングベクタ
ーで形質転換して得られるクローンは、ＣＳタンパクに
対する抗体を発現しているかどうかを調べるためにスク
リーニングに掛けられる。従って、この発明は前記のペ
プチドをコードする実質的に純粋なＤＮＡ配列を含む。

その櫟なＤＮＡ配列は、今や市販されている自動装置を
使って容易に合成できる。実際のＤＮＡ配列は、前もっ
て得られるアミノ酸配列から容易に算出できる。特に好
ましいＤＮＡ配列は、第２図に示されたＤＮＡ配列由来
の断片を含む。第２図に従うと、前記したアミノ酸に対
応するＤＮＡ配列が特に好ましい。

これらのＤＮＡ配列の１つを含む組換体クローニングベ
クターも、この発明の範囲に含まれる。

このクローニングベクターには、微生物若しくは酵母の
プラスミドまたはバクテリオファージが挙げられる。特
に好ましいクローニングベクターはλｃ＋ｔ１１である
。従って、ＤＮＡ配列が人工的に単細胞生物に導入され
たならば、ヒトに免疫反応を誘導し得る、マラリア病原
虫と交差反応しマラリア病原虫による感染に対して抵抗
性を示す実質的に精製された免疫的に活性なペプチドを
発現し得る上記のＤＮＡ配列を含む単細胞生物は、この
発明の発明の範囲に含まれる。Ｅ、Ｃｏ　ｌ　ｉが好ま
しい宿主である。

この発明では、ＡＴＣＣに寄託されたいくつかの例を挙
げる。λｍＰｆ１、λｍＰｆ３、λｍＰｆ５、λｍＰｆ
８、λｍＰｆ１１．およびλｍＰｆ１３と同定された微
生物の寄託番号は、それぞれ以下の通りである。すなわ
ち、３９７３８．３９７３９．３９７４０．３９７４１
．３９７４２．３９７４３、および３９７４４である。

この発明を実施する上で使用する遺伝物質は、上記の通
りに合成され得るが、既知の手法を用いて原生動物であ
るＰ、フフルシパルムから直接適当な遺伝物質を取出す
こともできる。一般的に入手し得る原生動物であるＰ、
フフルシパルムの中には、７Ｇ８と同定されたものがあ
る。それは、寄託番号４０１２３としてＡ　Ｔ、　ＣＣ
に寄託されている。

マラリアに対する免疫能をＭ導するために、この発明の
ペプチドの免疫的有効量をヒトに投与する。治療面での
有効投与量は、当該分野の専門家には容易に決定できる
。一般的には、体重に対して約０．０１μ’Ｊ／Ｋｇな
いし１００μ’Ｊ／ＫＨの範囲である。好ましくは、約
０．１μ９／に９ないし１．０μ’Ｊ／Ｋｇの範囲であ
る。

この発明のペプチドの投与形態は、免疫系にこのペプチ
ドを伝達できるいかなる経路もとり得る。

この発明の目的を達成するためには、このペプチドを筋
肉内、静脈内または活性成分をリンパ球に伝達でき免疫
応答を誘導できるいかなる方法によっても投与できる。

　この発明のペプチドは、免疫応答を誘導するに適した
形態で、活性成分を含む薬剤組成物中に配合して調製で
きる。容易に注射できる形態で、活性成分を含む懸濁液
または水溶液が好ましい。必要があれば、免疫応答を高
めるためにアジュバントを使用することができる。

薬剤調製物の形にする場合、この発明のペプチドを単位
投与形態にしておくことが望ましい。ヒトに使用する場
合、これらの量は、体７４７Ｇ　Ｋｇのヒトに予め与え
た投与量から容易に計算することができる。従って、薬
剤調製物を含む好ましい単位投与量は、活性成分約７な
いし７Ｇμ９を含むことになろう。しかし、いかなる特
定の患者に対する一定投与レベルは、使用される特定化
合物の活性を含んだ様々な要因（例えば、年齢、ｉｌｌ
ｌｌ前状態、患者の摂取している食事、投与時間、投与
経路、排泄率、投与される他のいかなる薬剤との共働作
用、および必要とされる抵抗力の度合い）に依存するこ
とは言うまでもない。

この明細書願では、ペプチドおよびＤＮＡ配列に関して
標準的な命名法および略記法を使用している。この明ｍ
ｓで用いた標準的な命名法を記載した出版物の一例とし
て、レーニンジャーの生化学＜　　１ｏｃｈｅ１５ｔｒ
ｙ）　　［ウオース出版、ニュー９−り（１９７Ｇ）第
４章および５章（ペプチド）および第１２章（ＤＮＡ）
］が挙げられる。

［実施例］発現ベクターλｇｔｌｌ　［Ｒ，Ａ。ヤングおよびＲ，
Ｗ、ディビス、プロシーディング・オブ・ナショナル・
アカデミツク・サイエンス（ｐｒｏｃ。

Ｎ　ａｔｌ、　Ａ　ｃａｄ、　Ｓ　ｃｉ　、　）’、米
国、８０．１１９４　（１９８３）］中のＰ、フフルシ
バルムグノムＤＮＡライブラリーは、次のように５ｌｉ
１１された。

発現ライブラリーは、ブラジルのＰ、ファルシパルムの
ＩＭＴＭ２２株から選択された一般的に入手し得るクロ
ーン７Ｇ８のＤＮＡから調製された。

Ｐ、ファルシパアルム７Ｇ８クローンからのゲノムＤＮ
Ａのアリコート１０μ９を、３５または４０％のホルム
アミドを含むａｍ液（０，２ＭＮａＣｌ、１ｍＺｎ５Ｏ＋、３０ｍ酢酸ナト
リウム、ｐＨ４，６）１００μ℃中で５０℃にて３０分
間ヤエナリのヌクレアーゼ（Ｐ−Ｌバイオケミカル）２
０単位を用いて分解した。続いて、その溶液を次の処理
に移る前に、０．０１Ｍ　　ＥＤＴＡ溶液で４倍に希釈
し、フェノールで抽出し、そしてエタノール沈澱させた
。この処理からＤＮＡを集め、λｑｔ１１に連結するた
めの断片源として用いた。そのＤＮＡを一定の条件［Ｔ
、マニアチス、Ｅ、Ｆ、フリツシュ、およびＪ。サンブ
ローク著、「分子クローニング：実験室指針」コールド
・スプリング・ハーバ−研究所刊、Ｎ、Ｙ、　、１９８
２年、３９４頁に記載］の下にクレノー断片（ＢＲＬ）
で処理し、その平滑末端を有する処理断片にＥｃｏＲＩ
リンカ−（ＢＲＬ）を連結した。そのＤＮＡを過剰のＥ
ｃｏＲＩで２回分解し、各分解後セファロース４　Ｂ　
ＪＥ：詰めた１、５ｃＩＲ×２０ＣｒＲのカラム上で遊
離リンカ−から分離した。λＱｔ１１は自己結合するが
、ＥＣ０ＲＩで分解した。Ｐ、ファルシパルムＤＮＡ断
片２３Ｏｎ９を、調製したλＱｔ１１ＤＮＡ５００ｎｇ
に供給者の肋める条件下でＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＩＢＩ
）を用いて４℃にて一晩かけて連結させた。連結反応生
成物の半分を、生体外の感染ファージ（プロメガ　バイ
オチク）にパッケイジングした。ＸＱａ　ＩおよびＩ　
ＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を補ったＬＢ
寒天上で生育しているＲＹ１０９１細胞上でλＱｔｌ　
１のβガラクトシダーゼ遺伝子中に介在断片があるかど
うか調べたところ、４０００００個のファージが検出さ
れた。

そのライブラリーを、１５０ｓ＋のプレート２７枚に１
枚のプレート当りプラーク濃度２５０００として蒔いた
。プラークを移したニトロセル０−スを、Ｒ，Ａ、ヤン
グおよびＲ，Ｗ、ディビス。

＋ｊイエンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ　＞、　２２２．７７
８　（１９８３）に記載されているように調製した。

第１表クローニングされたＣＳタンパク遺伝子を発現している
細菌の溶解物と抗ＣＳタンパクモノクローナル抗体との
反応抗　原　　　　　　　モノクローナル抗体２Ｅ　６．４
２Ｆ１．１　４Ｄ９．１４Ｄ１１．６５Ｇ　５３λｍＰ
ｆ　１　（２，３ｋｉ）”　１．２＋＋１．３　　１．
７　１．５　１．９λｍＰｆ３（２，３ｋｙ’）　　１
．３　　１．１　　１．９　１．４　１．８λｍＰｆ５
（１，３ｋｂ）　　１．１　　０．９　　１．５　１．
２　１．４λｍＰｆ８（１，３ｋｂ）　　１．２　　０
．９　　１．６　１．２　１．４λｍＰｆｌｌ（２，３
ｋｂ）　　１．１　　０．９　　１．６　１．３　１．
４λｍＰｆ１３（１，３ｋｂ）　　０．６　　０．５　
　０．５　０．７　０．６λｍＰｆ１５（１，３５ｋｂ
）　　１．１　　１．１　　〉２．０　１．７　　）２
．０λｇ　ｔ　１１．　ＩＰｒＧツ博０．５　　０．５
　　０．４　０．６　０．４λｇｔｌｌ、誘導せず　０
．５　　０．４　　０．４　　０．６　　０．４Ｙ　１
０８９　　　　　０．４　　０．５　　０．３　０．６
　０．３＋λｍＰｆは、λ（Ｊｔｌ　１中ｆ）　Ｐ　、
　７　ｐ　／Ｌ／　シｔ＜　シムＣＳタンパク遺伝子。

λｇｔ１１に挿入されたＰ、ファルシパルムＤＮＡの大
きさを括弧内に示す。全ての細菌はＩＰＴＧで誘導され
た。

＋＋データは、エリザ（ＥＬＩＳＡ＞法で３回別個に測
定した４１４ｎｉにおける吸光度の平均値として示され
ている。

第１表に掲げられた細菌は、以下のスクリーニング工程
により同定された。５つのハイプリドーマ系腹水を、０
．０５％ツイーン２０および３％ＢＳＡ　（ウシ血清ア
ルブミン）を含むｐＨ７，５の０．１５Ｍ　　ＮａＣ１
，０，０５Ｍトリス緩衝液（ＴＢＳ＞で１００００倍に
希釈した。そして、Ｅ、Ｃｏ　ｌ　ｉおよびラムダに対
する抗体を除（ために、ニトロセルロースフィルター上
で空気乾燥したλ９ｔ１１が感染したＲＹ１０９０＠胞
の濃縮溶解物で何回か吸収した。Ｐ、７？ルシバルムラ
イブラリーからのプラークを移したニトロセルロースプ
ラークを、０．３％ツイーン２０．３％ＢＳＡ、５ｎ＋
　ＭＯＣＩ２および５／ｅのＤＮＡ５ｅを含むＴＢ８５
００ｄで９１にて３０分間洗った。そのプラークを移し
たニトロセルロースを、吸収したモノクローナル抗体で
４℃にて一晩インキユベートした。更に、全ての操作は
室温で実施した。これらの操作の後、移したプラークを
、ＴＢＳ＋０．０５％ツイーン２０゜ＴＢＳ＋１％トリ
トンｘ−ｉｏｏ、およびＴＢＳ＋０．５％ツイーン２０
の各溶液で３０分分間法洗浄した。マウスモノクローナ
ル抗体のシグナルは、そのフィルターをウサギの抗マウ
ス■ｇＧ（カベル）中で１時間インキュベートすること
によって増幅された。その抗体は、０．０５％ツイーン
２０および３％ＢＳＡを含むＴＢＳ中に溶かしたトリト
ンＸ−５００溶液で希釈しておき、腹水液のときのよう
に前もって吸収しておいた。

プラークを移したニトロセルロースに結合した抗体を、
０．０５％ツイーン２０および１２８１で標識したタン
パクＡ（アメラハム）１μＣ１を含むＴＢＳ３０−中で
インキュベートした。続いて、洗浄し、オートラジオグ
ラフィーにかけた。

最初のスクリーニングで４８時間のオートラジオグラフ
ィー侵、３５個の陽性クローンが得られた。１７個を８
５ａｍのプレート当り１００ないし８００の濃度で再ス
クリーニングした。そのクローンの内１１個が、２回目
のスクリーニングで陽性プラークを形成した。これらを
、５０より少ないのプラークを含む８５ｍのプレートか
ら免疫的スクリーニングを行わずにクローニングした。

１１個のクローンの内１０個が、スクリーニングにより
免疫的活性を示した。

１０個のクローンに挿入された断片は、次の大きさのク
ラスに属す。３個（λｍＰｆ１、λｍＰｆ３、λｍＰｆ
１１）は２．３ｋｂ、３個（λｍＰｆ５、λｍＰｆ８、
λｍＰｆ１３）は２．３ｋｂ、λｍＰｆ’１５は１．３
５ｋｂ。

λｍＰｆ６は１．Ｏｋｂ、λｍＰｆ９は０．５ｋｂ、ク
ローンλｍＰｆ１８は、２つの挿入断片を含むが、それ
以上調べてはいない。クローンλｍＰｆ１．３．５．８
．１１．１３および１５の挿入断片は、交差バイブリド
形成する。

λｍＰｆ６および９は、交差バイブリド形成しなかった
。このことは、この２つの小さな挿入断片は、５つのモ
ノクローナル抗体の混合物により選択されるが、２．３
ｋｂ断片以外のゲノムの一部から由来することを示して
いる。

クローンλｍＰｆ５は、ニックトランスレートされたが
、サザン法［Ｅ、Ｍ、サザン、ジャーナル・オプ・モレ
キュラー・バイオロジー（Ｊ。

Ｍ　ｏｆ　、　Ｂ　　ｉｏｌ、　）、　９８．５０３　
（１９７５）］によりヒトおよびＰ、ファルシパルムの
Ｈｉｎｄ　　・■分解物を調べるために用いられた。バ
イブリド形成した単一バンドは、Ｐ、ファルシパルム帯
において１４ｋｂのところに現われた（データは示さな
い）。このプローブはヒトのＤＮＡとはバイブリド形成
しなかった。

１：、Ｃ０１ｉ中でのＣＳタンパクの発λｇｔ１１中の
クローンは、Ｅ、Ｃｏ　Ｉ　ｉのＹｌ　０８９株にライ
ソゲンとしてして導入された。

ライソゲンを生産するために、バクテリオファージを含
む溶液（１０／ｄ）１０μ℃を、５０μ９７ｄのアンピ
シリンおよび０．２％のマルトースを含む培地中で生育
させたＥ、　（：、ｏ　ｌ　’＋のＹｌ　０８９株（１
０１１／１１）　１００ｔｔ（ｌと混合し、ペレットに
し１０ｍＭＱＳＯｓ中に再懸濁させた。

室温にて２０分間放置した後、細胞を希釈し５０μｇ／
−のアンピシリンを含むプレート上に蒔いた。そして３
２℃にて生育させた。各コロニーを、４２℃にて生育可
能かどうかによって溶原性を調べた。溶原菌を、５０μ
ｇ／ｒｄのアンピシリンを゛　　含む培地中にて、５５
０ｎｌでの吸光度が０．４ないし０．８になるまで生育
させた。培養物を４４℃にて２０分間軽く振盪した。Ｉ
　ＰＴＧを最終濃度２ｍになるように加え、更に１時間
３７℃にてｆｆｌ！した。）１−ジを４４℃にて導入し
、βガラクトシダーゼと融合するタンパクの発現を高め
るために培地に加えた。エリザ法にて、ＤＮＡが導入さ
れた細菌の溶解物と５種のモノクローナル抗体のそれぞ
れとの反応性を解析した。前記の通り生育させ誘導させ
た培養物５０＃！ｉ！から細胞を、５５０　ｒｖで吸光
度０．６となるように、０．２＋Ｉｌフツ化フエニルメ
チルスルフオニルを含むｐＨ８，０の１５０ｉ　ＮａＣ
ｌ　、５０ｍ　トリス塩酸緩衝液１．０ｄに再懸濁させ
た。懸濁物をドライアイスとエタノールの入った浴槽中
で素早く凍結させ、ＰＢＳで希釈する前に２回解凍した
。クローンの溶解物をＰＢＳ（１０ＩＩリン酸ナトリウ
ム、１５０ｓ　ＮａＣｌ　）ｒｌ　００倍に希釈した。

７１Ｊコート５０μ２をポリ塩化ビニル製のプレート（
ダイナチク・ラボラトリーズ社、バージニア州。

アレキサンドリア）の穴にピペットで加え、室温に保っ
た。約１８時間後、穴をＰＢＳ中にウシ血清アルブミン
０．１％を加えた溶液（ＰＢＳ−ＢＳＡ）で洗い、続い
て１％ＰＢＳ−ＢＳＡで満たし、室温で１時間放置した
。５種のモノクローナル抗体の１つからの腹水５０μ２
をＰＢＳで５００倍に希釈し、適当な穴に加え、室温で
１時間放置した。これら５種のモノクローナル抗体から
の腹水は、Ｐ、ファルシパルムスポロゾイトに対する免
疫蛍光抗体検定（ＩＦＡ）および周囲スポロゾイト沈１
２　（Ｃ８Ｐ）反応が陽性であった。

穴を上記の通り洗い、ＰＢＳで２００倍に希釈したパー
オキシダーゼが結合している抗マウス抗体ヤギ（キルケ
ガ−ドルベリーラボラトリーズ社。

メリーランド州、ゲセルバーグ）を加え、室温で１時間
放置した。各穴をＰＢＳ−ＢＳ△で洗い、基質１５０ｕ
夕を加えた。基質は１）Ｈ４の０．１Ｍクエン酸−リン
酸緩衝液１ｄ当り１Ｒｇの２．２−−アジノージ−（３
−エチルベンズチアゾリン　スルホン酸）からなってい
る。使用直前に０．００３％の過酸化水素を加える。４
１４　ＴＩｍでの吸光度を１時間後タイターチックマル
チスキャンプレイドリーダー（フローラボラトリーズ社
、バージナア州、マクレーン）を使って測定した。

６種のクローンが５種のモノクローナル抗体全てに結合
した（第１表）。クローンλｍＰｆ１３の吸光度は、上
記の対照はど顕著ではなかった。クローンλｍＰｆ９は
、５種のモノクローナル抗体のうちの１種すなわち４Ｄ
１１．６のみに結合した（データは示さない）。クロー
ンλｍＰｆ９は、ＣＳタンパクを含むλｍＰｆｌとバイ
ブリド形成しなかったく以下参照）ので、このモノクロ
ーナル抗体は、ＣＳタンパクの遺伝子とは無関係な遺伝
子と同定された。λｍｐｆ９によって発現されるタンパ
クは、この１種のモノクローナル抗体とエピトープ交差
反応をする。ホープ等は、Ｐ、ファルシパルムの表面抗
原と交差反応するＰ、ファルシパルムの侵入した性に関
係しない赤血球抗原に対するモノクローナル抗体を同定
した。Ｉ。

Ａ。ホープ、Ｒ，ハル、Ｄ、Ｚ、シモンズ等、ネイチｔ
−（Ｎ　ａｔｕｒｅ）　、　３０８．１’９１　（１９
８４）参照。λｍＰｆ９が、ホープ等の記載するタンパ
クまたは他の交差反応をするタンパクをコードする遺伝
子を含んでいるとしても、タンパクはまだ決定されてい
ない。

また、エリザ法に使われる溶解物を、５ＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で電気泳動に掛
け、ニトロセルロース上に電気泳動で染みこませた。各
ライソゲン培養物１１ｄからのベレト化した細胞を、Ｓ
ＤＳゲル試料用緩衝液（３％ＳＯ８，１０％グリセロー
ル、１０＋ｎジチオスレイトール、６２ｍトリス−塩酸
、ｐＨ６゜８）２００μ２に溶解し、９５℃にて５分間
加熱した。Ｐ、ファルシパルムのスポロゾイトをＡｎ、
フリーボルニ（ｆｒｅｅｂｏｒｎｉ　）蚊の唾液腺から
単離し、ペレットとして０．２％卵白アルブミンを含む
ＰＢＳ中にて一８０℃で保存した。抗原抽出においては
、新規に調製した抽出Ｍｉｌｌｉ液（０，５％Ｎ１）４
０．２ｍ　ＰＭＳＦ、３３μｇ／−ロイペプシン、３３
μｇ／ｒｄアンチパイン、２μ！？／ｄＢｓＡを含むＰ
ＢＳ）４５０μ２を４．５ｘ１０５スポロゾイトのベレ
ットに加えた。

その混合物を、１０分毎に１５ないし３０秒間激しく振
りながら室温にて１時間インキュベートした。抽出した
スポロゾイトを２分間１３００Ｃ１で遠心してペレット
化した。その上清を、電気泳動に掛けるためＳＤＳゲル
試料用緩衝液に入れた。

トウビン等の方法［プロシーディング・オブ・ナショナ
ル・アカデミツク・サイエンス（Ｐｒｏｃ。

Ｎ　　ａｔｌ、　Ａ　ｃａｄ、　３　ｃｉ　、　）　、
米国、７９．４３５０（１９７９）］を改良してウェス
ターン法による解析を実施した。タンパクをレムリーの
方法［ネイチャー　（Ｎ　　ａｔｕｒｅ＞　、　　２７
７．６８０　（１９７Ｇ）］に基づいて５ＤＳ−ＰＡＧ
により分離した。その際、４．５％重層ゲルおよび８な
いし１２％の勾配ゲルを用いた。ゲルをトウビンの緩衝
液２００ｍで３０分間２回洗った。５ＯＳ＝ＰＡＧＥで
分離したタンパクを、４℃にてＮ場８ボルト／ａｎで１
４ないし１６時間かけて０．２２μｍのニトロセルロー
スフィルター上に移動させた。ニトロセルロースフィル
ター上で未反応結合部位は、０．０５％ツイーン２０を
含むＰＢＳに溶かした５％ＢＳＡでフィルターを処理し
て遮断した。続いてそのニトロセルロースフィルターを
、０．０５％ツイーン２０を含むＰＢＳｌｏｏｍで４回
洗った。そのニトロセルロースフィルターを、５つのモ
ノクローナル抗体のプール（２Ｅ６．４．２Ｆ１．１．
４Ｄ９．１，４Ｄ１１．６および５Ｇ５．３）で９ｏ分
間反応させた。モノクローナル抗体のプールは、各抗体
の腹水を０．０５％ツイーン２０および２０％ウシ胎児
血清を含むＰＢＳで１　：　１００００００に希釈して
調製した（総腹水の希釈率１　：　２００００）。その
ニトロセルロースフィルターを前の通り４回洗い、続い
てマウス抗体に対して調製した１２５　Ｉで標識したヒ
ツジ抗血清で処理した。１２５１で標識したヒツジ抗血
清を、０．０５％ツイーン２０および２０％ウシ胎児血
清を含むＰＢＳで２Ｘ１０Ｓｃｐｍ／ｆｉとなるように
希釈した。そのニトロセルロースフィルターを前の通り
４回洗い、乾燥させた。コダックＸＡＲ−２フィルムを
用いて一８０℃にてオートラジオグラフィーを実施した
。

そのニトロセルロースフィルター上のタンパクを、抗ス
ポロゾイトモノクローナル抗体により同定した。λｍＰ
ｆ１．３．５．８．１１、および１３のタンパクに対す
る抗スポロゾイトモノクローナル抗体は、λｍＰｆ１３
に対する強度は非常に減少していたものの、分子ｍＭｒ
　　６００００１５７Ｇ００および５３０００１５１０
００の２つの二重線に結合した（データーは示さない）
。挿入ＤＮＡをもたないλＱｔ１１ベクターには結合し
なかった。モノクローナル抗体は、分子長Ｍ、６０００
０．５３０００および５１０００の位置でスポロゾイト
からのタンパクに結合した。このようにλｇｔｌｌ中で
ＣＳタンパクをコードしている全てのスポロゾイト遺伝
子は、スポロゾイト自身により合成される操作されてい
ないＣＳタンパク（分子ＩＭ、６００００）に対して移
動度の小さいタンパクを産生じた。ＩＰＴＧで誘導する
と、λｑｔｌ　１の場合注目すべきことであるが、分子
長Ｍ　　１１６０００のβガラクトシダーゼが著しく発
現した。λｍＰｆ９の場合注目すべきことは、βガラク
トシダーゼに結合した分子ＩＭｒ１３１０００の融合タ
ンパクが発現した（データーは示さない）。ＣＳタンパ
クタンパク遺伝子をもったクローンは、弱いβガラクト
シダーゼ帯だけを示したが、融合タンパクは見られなか
った（データーは示さない）。更に、βガラクトシダー
ゼに対する抗体は、分子長Ｍｒ６００００のＣＳタンパ
クに結合しなかった。このことは、このタンパクがβガ
ラクトシダーゼの断片を含んでいないことを示唆してい
る（データーは示さない）。

λＱｔ１１ゲクターは、ＩＰＴＧを用いた誘導によりβ
ガラクトシダーゼに融合したタンパクとしてのＤＮＡ挿
入断片を発現できるように設計されたものである。従っ
て、ＣＳタンパクを発現するどのクローンも融合タンパ
クではないとは予期されていなかった。このことは、λ
ｍＰｆ１．５．８および１５に関して当はまる。という
のもこれらのＤＮＡ挿入断片が、それらの転写の方向が
βガラクトシダーゼのそれと反対になるように配向され
ているからであるｅＳｔｕＩ、Ｋｐｎｌ、および５ｔｕ
Ｉ＋ＫｐｎＩを使って決定されたファージＤＮＡの制限
酵素切断地図によれば、挿入部分の非対称３ｔｕ工部位
（第１図）は、それぞれの場合左端から１８．５８ｋｂ
のλＱｔ１１中のＫｏｎＩ部位から約１，１ｋｂに位置
していることが示された。λｍＰｆ１およびλｍＰｆ−
１５クローン中のコード配列に対してＰ、ファルシパル
ムＤＮＡの５′末端が、Ｅ、Ｃｏ　ｌ　ｉ　ＲＮＡポリ
メラーゼによりプロモーターとして認識される配列を含
むかどうか疑問ではあるが、細菌のリポソームに対する
結合部位は存在していないことは明らかである（第２図
）。λｍＰｆ５およびλｍｐｆ８クローンは、その遺伝
子に先行する１１ｂＤから始まる。従って、これらのク
ローン中のＣＳタンパクは、終わりに近いラムダのプロ
モーターから発現される可能性がある。同じような現象
は、酵母ＤＮＡ挿入断片に関してλｇｔ１１系で観察さ
れた。■、ゴローおよびＪ、Ｃ，ワング、セル（Ｃｅ　
ｌ　ｌ　）　、　１１．　１０７３　＜１９８４）参照
。

制限酵素切断地図によれば、λｍＰｆ１３に挿入された
ＤＮＡ１片はβガラクトシダーゼ遺伝子に対して正しい
方向を向いていることが示唆される。しかし、それはβ
ガラクトシダーゼと融合したタンパクを産生ずるフレー
ム中の１つの３３１である（第２図）。ウェスターン法
で検出されるようにこのクローンにより産生されるＣＳ
タンパクのレベルが低くかつエリザ法により著しい違い
のあるデーターが得られなかった（第１表）のは、その
構造的観点から理解できる。逆向き接続またはフレイム
挿入の性質をもったクローンから示唆し得ることは、恐
ら＜ＥｃｏＲＩのＣＳタンパクの毒性効果の為に、発現
する融合タンパクの選択が行われている（例えば、正し
い方向にあるλｍＰｆ５および８）ということである。

Ｐ、フフルシパルムをコードしている遺伝子を含むβｍ
Ｐｆ１中にクローニングされた２、３ｋｂのＤＮＡ断片
のヌクレオチド配列を第２図に示す。λｍＰｆ１クロー
ンの制限酵素切断地図および配列決定の手法を第１図に
示す。この配列は、７８番目のＡＴＧ開始コドンで始ま
り１３１６番目のＴＡＧ終止コドンで終わる大きな塩基
の読み取り枠を含んでいる。複数の終止コドンは、他の
５つの読み取り枠の中に見出だされる。塩基の読み取り
枠が第７図に示されるようなものであれば、分子１約４
４０００ダルトンで４２１分子のアミノ酸からなるポリ
ペプチドもコードし得るであろう。Ｐ、ノウレジのＯＳ
タンパクで観察されたように、５Ｏ８−ＰＡＧＥによる
Ｐ、フフルシパルムのＯＳタンパクの分子長（約６００
００）は、推定分子！（４４０００）とは異なっていた
。

このタンパクの最も重要な構造上の特徴は、４つのペプ
チドからなる４１回の直列反復が存在することである。

最初の繰返し単位はＡｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏで
あり、３７回繰返す。

もう一方はＡｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ｐｒｏであり２．
４．６および２２番目に現われる。Ａｌａ−ＡｓｎがＶ
ａｌ−Ａｓｐに変わっているのは、アラニンコドンの２
番目の塩基がＣからＴに置き代わり、アスパラギンコド
ンの１番目の塩基がＡからＧに置き代わっている理由に
よる。これらの繰返しをコードしている核酸の塩基配列
は、アミノ酸配列をただ単に一定に保っている訳ではな
い。

４１単位を有する繰返し領域は、１１の異なったヌクレ
オチド配列から成り立っている。その単位の内１８配列
はＡＡＴＧＣＡＡＡＣＣＣＡである。

反復単位の７配列はこの配列の１つの位置だけが異なっ
ており、１２配列は２つの位置が、２配列は３つの位置
が、１配列は４つの位置が、そして１配列は５つの位置
が異なっている。この様な配列の異なりは、ゲノムＤＮ
Ａ内の反復を組換えによる塩基の切断や入替えから守り
安定化させている。タンパクのアミノ末端では、１６分
子のアミノ醒の鎖が恐らくシグナル配列を構成している
（第２図）。シグナル配列と反復領域との間には、塩基
性および酸性アミノ酸が存在するために非常に電荷を帯
びた領域が生じる。例えば、６６番目から１１８番目の
アミノ酸の内２７分子が電荷を帯びたアミノ酸である。

その繰返し領域に続いて、他の２つの断片が電荷を帯び
たアミノ酸を非常に多く含んでいる。これらの領域は、
３２４番目から３３９番目のアミノ酸領域および３６０
番目から３８８番目のアミノ酸領域に存在する。それら
の領域は、それぞれ５０％および４８％の電荷を帯びた
アミノ酸を含む。このタンパクのカルボキシ末端には、
膜内在住タンパクのアンカー配列を表わす２１分子の疎
水性アミノ酸が存在する。

ム成ペプチドと抗体との　痴情性Ｐ、ファルシパルムスポロゾイト遺伝子のヌクレオチド
単位が正しい配列であるかどうか最終的な証明をするた
めに、ペプチドを合成した。そのペプチドは、ベックマ
ン９９０アミノ酸合成機を使って固相法［Ｒ，Ｂ、メリ
フィールドおよびＡ。

マーグリン、アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミ
ストリー（Ａ　　ｎｎｕ、Ｒｅｖ　、Ｂ　　１ｏｃｈｅ
ａ＋　、）、３９，８４１−８６６　（１９７Ｇ）］に
より調製した。合成ペプチドを、液体ＨＦにより固体の
支持体から遊離させた［Ｊ、Ｐ、タム、Ｗ、Ｆ。

ヒースおよびＲ，８，メリフィールド、ジャーナル・オ
ブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアテイ−（Ｊ、　Ａ
　ｒ＊、　Ｃｈｅｍ、　Ｓ　ｏｃｉ、）　、工１５−．
６４４２　（１９７Ｇ）］。遊離ペプチドを、バイオゲ
ルＰ−２またはＰ−４上でゲル濾過により脱塩した。単
離したペプチドの純度を、逆相ＨＰＬＣおよびアミノ酸
分析機により確めた。また、１５残基のペプチドに関し
てはアミノ酸配列を決定した。

続いて、上記のエリザ法を改良して、これらのペプチド
がモノクローナル抗体２Ｆ１．１のλｍＰｆ１への結合
を阻害するかどうかを調べた。

合成ペプチドに関して、次のような試賎を実施した。ｐ
Ｈ７，４（７）０．０１Ｍ！Ｊン酸塩、０．１５ＭＮａ
Ｃ１の！Ｉ衝液（ＰＢＳ）で１００倍に希釈したλｍＰ
ｆ１の溶解物のアリコート５０μβをポリ塩化ビニル製
のプレート（ダイナチク・ラボラトリーズ社、バージニ
ア州、アレキサンドリア）の穴にとベットで加え、−晩
室温で放置した。約１８時間後、穴をＰＢＳ−０，０５
％ツイーン２０　（ＰＢＳ−ＹＷ）で４回洗い、ＰＢＳ
−ＴＷ中にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）０．１％を加
えた溶液で満たし、室温で１時間放置した。蒸溜水に溶
かした合成ペプチドの貯蔵液（５ｘ１０−２Ｍ＞を、Ｐ
ＢＳ中にＢ５Ａ１％を溶かした液で１０倍に希釈した。

そしてアリコート１００μ２を、１．５−の小遠心管中
でセイヨウワサビのペルオキシダーゼに結合させたモノ
クローナル抗体３０μ℃と混合し、室温で１時間放置し
た。プレートの穴を空にし、各穴にペプチド−モノクロ
ーナル抗体混合物を入れ、室温で１時間放置し−た。

穴を再び上記の通り洗い、前記のように基質１５０μ２
を加えた［Ｐ、に、ナカネおよびＡ、カウザオイ、ジャ
ーナル・オブ・ヒストロジカル・サイトケミストリー（
Ｊ、　）（ｉｓｔ、　Ｃｙｔｏｃｈｅｎ＋、　）　。

１１、−１０８４　　（１９７４）］　　。

第３図に示された結果から、７，１１および１５の残基
を有するペプチドは、２Ｆ１．１のλｍＰｆｌへの結合
を著しく阻害することが分る。

１５残基のペプチドでは、５ｘ１０−’Ｍの濃度で結合
が明らかに阻害された。７残基のペプチドも、モノクロ
ーナル抗体２Ｆ１．１のλｍＰｆｌと置き変わったスポ
ロゾイト抗原への結合を阻害した。更に、合成ペプチド
は他の４つのモノクローナル抗体のλｍＰｆ１への結合
を阻害した。このデーターは、反復単位の配列が正しい
ことを示している。１１および１５残基を有するペプチ
ドに関して結合の阻害が高まっていることが観察された
が、このことは２次構造の変化に起因すると思われる。

Ｐ　ファルシパルム　　び　、ノ　レジのタンパク８の
　同　域Ｐ、ファルシパルムのＣＳタンパクおよびサルのマラリ
ア病原虫であるＰ、ノウレジのＣＳタンパクは、全体的
には同じような構造を有しているが、相同性のある２箇
所だけの短い領域を有している。両タンパクは、次の点
で主要な特徴が同じようである。すなわち、それらはタ
ンパクの中央部分に繰返し領域を有し、アミノ末端にシ
グナル配列として電荷を帯びたアミノ酸がたくさん存在
する多重領域を有し、およびカルボキシル末端に疎水性
のアンカー配列を有する点である。アミノ酸配列の相同
性をコンピューターで解析した＜２５．にタラプルサイ
ズ１．ウインドウサイズ２０、ギャップペナルティ１）
ところ、タンパクのほとんどに渡って配列の相同性が限
定されていることが分った。反復配列から断片における
２種のタンパク間の平均的な相、同性は３７％である。

すなわち、１０２分子のアミノ酸の内３７分子が一致し
ていた。１２分子のアミノ酸毎にｐｒｏ１分子およびＡ
ｌａ１分子が入っているので、反復配列の相同性は１６
％である。反復配列から後の断片における２種のタンパ
ク間の平均的な相同性は４２％である。すなわち、１１
９分子のアミノ酸の内５０分子が一致していた。これら
のタンパクの２次および３次構造は明らかでないが、１
次構造に差があるにもかかわらずこれらのタンパクには
構造上および機能上の類似性がある。ＣＳタンパクの反
復配列により、免疫活性のあるスポロゾイトのワクチン
を生産することが可能になる。

非常に相同性のある２箇所の領域は、反復領域のどちら
かに見出された。２２分子のペプチドに相同領域が入っ
ている場合、３分子のプロリンが入っている箇所は明ら
かであり、および５つの連続したアミノｉｌ　（Ｌｙｓ
−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ）は一致する（第２
図および第４図の領域■）。

相同性のある第２の領域（第２図および第４図の領域■
）は、１３分子のアミノ酸を含み、そのうち１２分子は
一致している。一致していない只１分子のアミノ酸は、
Ｐ、ノウレジのアミノ酸配列中の第４番目でセリンがス
レオニンに置き変わっている。この領域には、分子内ル
ープ形成に関してオザキ等ｃＬ、ｓ、オザキ、Ｐ、スベ
ク、ＲｏＳ、ヌツセンツワイク等、セル（Ｃｅｌｆ）　
、　３４゜８１５　（１９８３）］が初期の頃主張した
２つのシスティン残基を含む。

Ｐ、ファルシパルムのＣＳタンパクをコードしている核
酸の配列の、領域■を除いたＰ、ノウレジの遺伝子との
相同性にも制限がある。タンパクの領域■をコードして
いる遺伝子の特定の部分において、２箇所だけＰ、ノウ
レジに相当する配列とは異なる２７塩基配列が存在する
。これの一定配列は、他のプラスモディウム種のＣＳタ
ンパクをコードしている遺伝子をクローニングするため
のプローブとして有益となろう。

Ｐ、ファルシパルムとＰ、ノウレジとの間のアミノ酸の
２つの領域の相同性を考慮してみると、進化の過程で大
きく分離した微生物の塩基配列が保存されているという
ことが言える。以前、霊長類のマラリアは霊長類と並行
して進化してきたとする仮説があった。しかし最近では
、Ｐ、ファルシパルムのＤＮＡは鳥および冒歯類のマラ
リアのＤＮＡと類似しているという報告、およびこれら
のＤＮＡ構造は霊長類のマラリア［Ｐ、ノウレジ、Ｐ、
フラツジ（ｆｒａｏｉｌｅ　）　、Ｐ、ビバックス（ｖ
ｉｖａｘ　）　、およびＰ、シノモルジ（ｃｙｎｏｍｏ
ｌｇｉ　）　］のそれとは異なるという報告がなされて
きた。Ｐ。

ファルシパルム、Ｐ、ロフラエ（Ｉｏｐｈｕｒａｅ）お
よびＰ、ベルブヘイ（ｂｅｒｇｈｅｉ　）のＤＮＡ塩基
のＧ＋Ｃ含量は、Ｐ、ノウレジを含めた霊長類のマラリ
アのそれよりも低かった。更に、Ｐ、ファルシパルム、
Ｐ、０７ラエ（ｌ０ｐｈＵｒａｅ）およびＰ。

ベルブヘイ＜　ｂｅｒｇｈｅｉ　＞のＤＮＡとバイブリ
ドを形成する遺伝子プローブは、霊長類のマラリアとバ
イブリドを形成しなかった。また、霊長類のマラリアと
バイブリドを形成するプローブは、Ｐ。

ファルシパルム、Ｐ、ロフラエ（１ｏｐｈｕｒａｅ）お
よびｐ、べ／ｌｚｌベグ（ｂｅｒｇｈｅｉ　）のＤＮＡ
とバイブリドを形成しなかった。Ｐ、ファルシパルムと
Ｐ。

ノウレジ間のこの相同領域は、細胞へ侵入するための受
容体のようなタンパクの重要な機能として保存されてい
るのかもしれない。Ｐ、ファルシパルムとＰ、ノウレジ
病原虫双方は、ヒトの肝臓に感染し得るということに注
目すべきである。

タンパク間でエピトープを共有してしまうという潜在的
な問題があるにも係わらず、かなりの数の事実がスポロ
ゾイト遺伝子がクローニングされてきたということを示
している。先ず初めにＰ。

ファルシパルムのＣＳタンパクとＰ、ノウレジのＣＳタ
ンパク間には甚だしい類似性がある。双方の大きさは、
Ｐ、ファルシパルムおよびＰ、ノウレジの計算分子号が
それぞれ４４４２６および３６７９２であるようにほぼ
同じである。また双方には、シグナル配列、電荷を帯び
た領域、タンパクの中央に存在する反復ペプチドの領域
、およびアンカー配列を含む類似した領域がある。第２
には、２種のタンパク間にはアミノ酸の配列の相同領域
が２つある（第４図）。第３には、Ｐ、ファルシパルム
病原虫の表面抗原と反応する５種のモノクローナル抗体
は、細菌の中で合成されたタンパクを認識する。λｍＰ
ｆ９クローンからの交差反応性タンパクのみが、これら
のモノクローナル抗体の１種と反応する。第４には、５
ＤＳ−ＰＡＧＥによると、細菌の中で合成されたタンパ
クの大きさはＰ。ファルシパルム病原虫から得られるタ
ンパクのそれとほぼ同じであった。第５には、反復配列
を有する合成ペプチドは、エリザ法においてモノクロー
ナル抗体のスポロゾイトタンパクへの結合を阻害した。

この遺伝子は、シグナル配列、電荷を帯びた領域、４分
子のアミノ酸からなる単位（反復）が４１箇所現われる
中央の領域、シスチンのループ、およびアンカー配列か
ら成立つ４１２分子のアミノ酸からなるタンパクをコー
ドしている。中央領域の反復配列の３７箇所は同一であ
り（Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ）、４箇所の配列
はＡｓｎ−Ｖａ　Ｉ−Ａｓｐ−Ｐｒｏである。

ＣＳタンパクに類似している一連の抗原は、今日まで研
究されてきたプラスモデイウムの全ての種のスポロゾイ
ト上に見出だされる。ＣＳタンパりのモノクローナル抗
体は、生体に防御力を付与し、生体外ではスポロゾイト
の感染力を中和する。

Ａ、Ｈ，コクレーン、Ｆ、サントロ、■、ヌツセンワイ
ツ等、ブＯシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ
ツク・サイエンス（Ｐ　ｒｏｃ、　Ｎ　ａｔｌ。

Ａ　ｃａｄ、　３　ｃｉ　、　）米国、７９．５６５１
　（１９８２）参照。

モノクローナル抗体は、霊長類のマラリアの種間で交差
反応を引起こすことがあるが、免疫能を仲介する抗体は
種特異性を有するようであり、Ｐ。

ノウレジの場合防御力をもったモノクローナル抗体は反
復構造のエピトープを標的としている。１つ以上のエピ
トープを必要とする検定においてモノクローナル抗体は
スポロゾイトと反応するというデータや知見から、ザバ
ラ等によりＣＳタンパクに対するモノクローナル抗体を
反復エピトープを有する免疫活性領域と反応させる方法
が開発された。この仮説は、Ｐ、ファルシパルムのＣＳ
タンパクに対する５種のモノクローナル抗体がタンパク
中の反復単位（Ａｓｎ−Ａ　ｌ　ａ−Ａｓｎ−ｐｒｏ）
を標的としている点から確固としたものになった。

進化の途上２つの異なった様式で分離していったマラリ
ア病原虫（Ｐ、）１ルシバルムおとびＰ。

ノウレジ）のＤＮＡ配列の領域■が実に良く相同してい
ることが暗示するものは、スポロゾイトが病原虫の肝臓
への侵入に対して受容体としての濃能もっためにその塩
基配列が保存されてきたということである。この領域が
ヒトマラリアの中で保存され、免疫系にざらされるなら
ば、Ｐ、ファルシパルムのこの領域で免疫することはヒ
トマラリアの他の種に対しても抵抗力を付与し得るであ
ろう。もしこの相同領域が病原虫の肝臓への侵入に対し
て受容体としての意味をもつならば、マラリア病原虫の
この領域の塩基配列は極端な変化をし得ないであろう。

以上、この発明を図面を参照しつつ説明したが。

第１図に示される制限酵素による切断部位は、塩基配列
から決定され、次の制限酵素の分解により確められた。

ＡはＡＶａ■、ＡＣはＡＣＣＩ、Ｂは３ｓｔｎ工、Ｄは
［）ｒａ■、ＤｄはＤｄｅＩ、ＦはＦｏｋＩ、ＮはＮｄ
ｅＩ、ＲはＲｓａＩ、Ｓは５ｔｕＩ、ＴはＴｔｈｌ［、
ＴｑはＴａｑ　Ｉ、ＸはＸｈＯ■を示す。矢印は、決定
された塩基配列の開始点、方向および範囲を示す。ＣＳ
タンパクをコードしている領域は、太い線で示されてい
る。

第２図には、λｍＰｆＩ中におけるＣＳタンパクの遺伝
子に対するヌクレオチド配列が示されている。λｍＰｆ
１ｋｍ挿入したＥｃｏＲＩのＤＮＡ断片は、ｐｕｃｓ中
にサブクローニングされ、塩基配列が決定された。二重
鎖ＤＮＡ配列に関して、ＣＳタンパクをコードしている
領域の１００％が決定され、近接領域の７Ｇ％が決定さ
れた。クローンλｍＰｆ５、λｍｐｆ８、λｍＰｆ１３
およびλｍＰｆ１５の挿入部分もまたｐＵｃＢ中にサブ
クローニングされ、末端の配列が決定された。

ＣＳタンパクをコードしている領域の５′末端の最初の
塩基を、矢印の右側に示す。挿入断片の両末端に結合し
ているＥＣ０ＲＩリンカ−（ＧＧＡＡＴＴＣＣ）は、配
列の一部として示していない。ＣＳタンパクの推定され
たアミノ酸配列を、ヌクレオチド配列の下に示す。Ｐ、
ノウレジのＣＳタンパクに相同のタンパク領域を、領域
ＩＪ５よび領域■と記した。反復単位に下線を敷き、変
異したアミノ酸を線で囲った。配列中のアンバー末端コ
ドンに星印を付した。また、第３図には。

最もよくみられる反復アミノ酸配列の伸長している長さ
を含む合成ペプチドが調製され、Ｙ１０８９中で増殖し
ているλｍＰｆ１の溶解物に対する、２Ｆ１．１の結合
を阻害するために利用された。

データは、３回の平均上ＳＥとして表わされている。試
験に用いられた合成配列は、Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−
Ａ　Ｉ　ａ　（）、Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａ　ｌ　ａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ
−Ａ　ｌ　ａ　（０−０）　、Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａ　ｌ
　ａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａ　ｌ　ａ−Ａｓｎ−
Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａ　ｌ　ａ（△□Δ）　、　Ｐｒｏ−
Ａｓｎ−Ａ　Ｉ　ａ　−八５ｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａ　
Ｉ　ａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａ　Ｉ　ａ−Ａｓｎ
−Ｐｒｏ−Ａ　Ｓ　ｎ　−Ａ　ｌ　ａ　（Ｘ　−Ｘ　）
　、および１０分子のアミノ酸からなる無関係のペプチ
ド（・□・）であった。

また、第４図において、領域工は、Ｐ、ファルシパルム
のタンパクの反復部分にアミノ酸２分子が付いて終わっ
ている。Ｐ、ノウレジにおいては、この領域の最後の３
分子のアミノ酸は、タンパクの反復配列部分の一部であ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、制限醪素切断図およびクローンλｍＰｆ１の
塩基配列決定における手法を示す図、第２図はＰ、ファ
ルシパルムのＣＳタンパクの遺伝子に対するヌクレオチ
ド配列を示す図、第３図は、最もよくみられる反復アミ
ノ酸配列の合成ペプチドによる、抗ＯＳタンパクモノク
ローナル抗体（２Ｆ１．１）結合の阻害を表わすデータ
を示すグラフ図、第４図は、Ｐ、ファルシパルムおよび
Ｐ、ノウレジのＣＳタンパク間の相同ｆＲｔｊＩｔを表
わす式を示す図。出願人代理人　弁理士　鈴江武彦図ココ°の１、−０．、−二一−１ご二乙）−γ Ａ４為ｉ市！　：無　　為、。　　　４Ｓｉａ　　３　　　　　　　　　　　値　　繻−り　　　　
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Claims

【特許請求の範囲】

（１）単独でまたは担体分子と結合されたときヒトに免
疫反応を誘導し得る、マラリア病原虫と交差反応しマラ
リア病原虫による感染に対して抵抗性を示す実質的に精
製された免疫的に活性な合成ペプチドであって、該ペプ
チドがＡｓｎ−Ｘ−Ｔ−Ｐｒｏ（ＸはＡｒａまたはＶａ
ｌおよびＹはＡｓｎまたはＡｓｐ）で表わされるアミノ
酸配列の少なくとも２回の連続的繰返し単位を含むこと
を特徴とする免疫的活性ペプチド。
（２）前記繰返し単位が前記ペプチドの少なくとも１０
％を構成する特許請求の範囲第１項記載のペプチド。
（３）前記ペプチドが前記配列の１０００回以下の繰返
し単位を含む特許請求の範囲第２項記載のペプチド。
（４）前記繰返し単位が前記ペプチドの少なくとも４０
％を構成する特許請求の範囲第３項記載のペプチド。
（５）前記ペプチドがアミノ酸配列Ａ−Ｂ−Ａ−Ｂ−Ａ
−Ｂ−（Ａ）＿１＿５−Ｂ−（Ａ）＿２＿０（ＡはＡｓ
ｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏを示し、およびＢはＡｓｎ
−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏを示す）特許請求の範囲第４
項記載のペプチド。
（６）前記アミノ酸配列に、アミノ酸配列式Ｔｈｒ−Ｇ
ｌｕ−Ｔｒｐ−Ｚ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−
Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ（ここで、Ｚ
はＳｅｒまたはＴｈｒ）を含むペプチド断片が続き、ま
たはアミノ酸配列式Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓ−Ｔ−Ｓ−Ｌｙ
ｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｕ−Ｖ−Ｇｌｙ
−Ｗ−Ｐｒｏ（ここで、ＳはＬｙｓまたはＡｓｎ、Ｔは
ＨｉｓまたはＧｌｕ、ＵはＧｌｙまたはＡｓｎ）ＶはＡ
ｓｐまたはＧｌｕ、およびＷはＡｓｎまたはＧｌｎを示
す）を含むペプチド断片が先行する特許請求の範囲第５
項記載のペプチド。
（７）前記ペプチドが、アミノ酸配列【アミノ酸配列があります】の範囲第６項記載のペプチド。
（８）マラリア病原虫と交差反応しマラリア病原虫によ
る感染に対して抵抗性を示す実質的に精製された免疫的
に活性な合成ペプチドであって、アミノ酸配列式【アミ
ノ酸配列があります】（ここで、ＺはＳｅｒまたはＴｈ
ｒ）、またはアミノ酸配列式【アミノ酸配列があります
】（ここで、ＳはＬｙｓまたはＡｓｎ、ＴはＨｉｓまた
はＧｌｕ、ＵはＧｌｙまたはＡｓｎ、ＶはＡｓｐまたは
Ｇｌｕ、およびＷはＡｓｎまたはＧｌｎを示す）を含む
ことを特徴とする免疫的活性ペプチド。
（９）前記アミノ酸配列が、前記ペプチドの少なくとも
１０％を構成する特許請求の範囲第８項記載のペプチド
。
（１０）前記ペプチドが、前記２つのアミノ酸配列の一
方かまたは両方から実質的に成る特許請求の範囲第９項
記載のペプチド。
（１１）前記アミノ酸配列式が【アミノ酸配列があります】である特許請求の範囲第９項記載のペプチド。
（１２）ＺがＳｅｒである許請求の範囲第１１項記載の
ペプチド。
（１３）単独でまたは担体分子と結合されたときヒトに
免疫反応を誘導し得る、マラリア病原虫と交差反応しマ
ラリア病原虫による感染に対して抵抗性を示す実質的に
精製された免疫的に活性な合成ペプチドであって、前記
ペプチドがＡｓｎ−Ｘ−Ｔ−Ｐｒｏ（ここで、ＸはＡｒ
ａまたはＶａｌおよびＹはＡｓｎまたはＡｓｐ）で表わ
されるアミノ酸配列の少なくとも２回の連続的繰返し単
位を含む免疫的活性ペプチドと、これを結合した免疫原
性を有する担体とこらなる抗マラリア免疫原性刺激剤。
（１４）前記担体が、該担体のカルボキシル基またはア
ミノ基と前記ペプチドのアミノ基またはカルボキシル基
との間で形成されるアミド結合により、または該担体の
カルボキシル基または水酸基と前記ペプチドの水酸基ま
たはカルボキシル基間で形成されるエステル結合により
、前記ペプチドに結合されている特許請求の範囲第１３
項記載の刺激剤。
（１５）前記担体が、タンパクまたは多糖である特許請
求の範囲第１３項記載の刺激剤。
（１６）前記担体の分子長が、１００００ないし１００
００００である特許請求の範囲第１５項記載の刺激剤。
（１７）前記担体が、１ないし１０００００分子の前記
ペプチドを結合している特許請求の範囲第１５項記載の
刺激剤。
（１８）前記担体が、両性タンパクであり、前記ペプチ
ドが該タンパクの親水性部分に結合している特許請求の
範囲第１５項記載の刺激剤。
（１９）前記担体が、細菌細胞またはリポソームである
特許請求の範囲第１３項記載の刺激剤。
（２０）前記担体が、１０＾５ないし１０＾１＾５分子
の前記ペプチドを結合している特許請求の範囲第１９項
記載の刺激剤。
（２１）マラリア病原虫と交差反応しマラリア病原虫に
よる感染に対して抵抗性を示す実質的に精製された免疫
的に活性な合成ペプチドであって、アミノ酸配列式【ア
ミノ酸配列があります】（ここで、ＺはＳｅｒまたはＴ
ｈｒ）、またはアミノ酸配列式【アミノ酸配列がありま
す】（ここで、ＳはＬｙＳまたはＡｓｎ、ＴはＨｉｓま
たはＧｌｕ、ＵはＧｌｙまたはＡｓｎ、ＶはＡｓｐまた
はＧｌｕ、およびＷはＡｓｎまたはＧｌｎを示す）を含
む免疫的活性ペプチドとこれと結合した免疫原性を有す
る担体とからなる抗マラリア免疫原性刺激剤。
（２２）単独でまたは担体分子と結合されたときヒトに
免疫反応を誘導し得る、マラリア病原虫と交差反応しマ
ラリア病原虫による感染に対して抵抗性を示す実質的に
精製された免疫的に活性な合成ペプチドであって、該ペ
プチドがＡｓｎ−Ｘ−Ｔ−Ｐｒｏ（ここで、ＸはＡｒａ
またはＶａｌおよびＹはＡｓｎまたはＡｓｐ）で表わさ
れるアミノ酸配列の少なくとも２回の連続的繰返し単位
を含む免疫的活性ペプチドをコードする実質的に純粋な
ＤＮＡ配列。
（２３）単独でまたは担体分子と結合されたときヒトに
免疫反応を誘導し得る、マラリア病原虫と交差反応しマ
ラリア病原虫による感染に対して抵抗性を示す実質的に
精製された免疫的に活性な合成ペプチドであって、該ペ
プチドがＡｓｎ−Ｘ−Ｔ−Ｐｒｏ（ＸはＡｒａまたはＶ
ａｌおよびＹはＡｓｎまたはＡｓｐ）で表わされるアミ
ノ酸配列の少なくとも２回の連続的繰返し単位を含む免
疫的活性ペプチドをコードする実質的に純粋なＤＮＡ配
列を含む組換えＤＮＡクローニングベクター。
（２４）前記ベクターが、細菌の若しくは酵母のプラス
ミドまたはバクテリオファージである特許請求の範囲第
２３項記載クローニングベクター。
（２５）前記ベクタ−が、λｇｔ１１である特許請求の
範囲第２４項記載クローニングベクター。
（２６）単独でまたは担体分子と結合されたときヒトに
免疫反応を誘導し得る、マラリア病原虫と交差反応しマ
ラリア病原虫による感染に対して抵抗性を示す実質的に
精製された免疫的に活性な合成ペプチドであり、該ペプ
チドがＡｓｎ−Ｘ−Ｔ−Ｐｒｏ（ここで、ＸはＡｒａま
たはＶａｌおよびＹはＡｓｎまたはＡｓｐ）で表わされ
るアミノ酸配列の少なくとも２回の連続的繰返し単位を
含む免疫的活性ペプチドをコードする実質的に純粋なＤ
ＮＡ配列を有する単細胞微生物であって、該ＤＮＡ配列
が人工的に該微生物に取込まれ、該微生物はマラリア病
原虫と交差反応しマラリア病原虫による感染に対して抵
抗性を示す免疫的に活性な合成ペプチドを発現し得るも
のである単細胞微生物。
（２７）前記微生物が、ＡＴＣＣ　３９７３８、ＡＴＣ
Ｃ　３９７３９、ＡＴＣＣ　３９７４０、ＡＴＣＣ　３
９７４１、ＡＴＣＣ　３９７４２、ＡＴＣＣ　３９７４
３、またはＡＴＣＣ３９７４４由来の特許請求の範囲第
２６項記載の微生物。
（２８）マラリア病原虫と交差反応しマラリア病原虫に
よる感染に対して抵抗性を示す実質的に精製された免疫
的に活性な合成ペプチドであって、アミノ酸配列式【ア
ミノ酸配列があります】（ここで、ＺはＳｅｒまたはＴ
ｈｒ）、またはアミノ酸配列式【アミノ酸配列がありま
す】（ここで、ＳはＬｙｓまたはＡｓｎ、ＴはＨｉｓま
たはＧｌｕ、ＵはＧｌｙまたはＡｓｎ、ＶはＡｓｐまた
はＧｌｕ、およびＷはＡｓｎまたはＧｌｎを示す）を含
む免疫的活性ペプチドをコードする実質的に純粋なＤＮ
Ａ配列。
（２９）マラリア病原虫と交差反応しマラリア病原虫に
よる感染に対して抵抗性を示す実質的に精製された免疫
的に活性な合成ペプチドであって、アミノ酸配列式【ア
ミノ酸配列があります】（ここで、ＺはＳｅｒまたはＴ
ｈｒ）、またはアミノ酸配列式【アミノ酸配列がありま
す】（ここで、ＳはＬｙｓまたはＡｓｎ、ＴはＨｉｓま
たはＧｌｕ、ＵはＧｌｙまたはＡｓｎ、ＶはＡｓｐまた
はＧｌｕ、およびＷはＡｓｎまたはＧｌｎを示す）を含
む免疫的活性ペプチドをコードする実質的に純粋なＤＮ
Ａ配列を含む組換えＤＮＡクローニングベクター。
（３０）前記ベクターが、細菌の若しくは酵母のプラス
ミドまたはバクテリオファージである特許請求の範囲第
２９項記載クローニングベクター。
（３１）前記ベクターが、λｇｔ１１である特許請求の
範囲第３０項記載クローニングベクター。
（３２）マラリア病原虫と交差反応しマラリア病原虫に
よる感染に対して抵抗性を示す実質的に精製された免疫
的に活性な合成ペプチドであって、アミノ酸配列式【ア
ミノ酸配列があります】（ここで、ＺはＳｅｒまたはＴ
ｈｒ）、またはアミノ酸配列式【アミノ酸配列がありま
す】（ここで、ＳはＬｙｓまたはＡｓｎ、ＴはＨｉｓま
たはＧｌｕ、ＵはＧｌｙまたはＡｓｎ、ＶはＡＳＰまた
はＧｌｕ、およびＷはＡｓｎまたはＧｌｎを示す）を含
む免疫的活性ペプチドをコードする実質的に純粋なＤＮ
Ａ配列を含む微生物であり、該ＤＮＡ配列が人工的に該
微生物に取込まれ、該微生物はマラリア病原虫と交差反
応しマラリア病原虫による感染に対して抵抗性を示す免
疫的に活性な合成ペプチドを発現し得るものである単細
胞微生物。
（３３）前記微生物が、ＡＴＣＣ　３９７３８、ＡＴＣ
Ｃ　３９７３９、ＡＴＣＣ　３９７４０、ＡＴＣＣ　３
９７４１、ＡＴＣＣ　３９７４２、ＡＴＣＣ　３９７４
３、またはＡＴＣＣ　３９７４４由来の特許請求の範囲
第３２項記載の微生物。
（３４）４９．２Ｆ１．１と同定された特徴を有するハ
イブリドーマ細胞系。
（３５）４９．２Ｆ１．１と同定された特徴を有するハ
イブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗
体。
（３６）プラスモディウム　ファルシバルム株７Ｇ８の
生物学的に純粋な培養物。