JPH07265087A - 免疫的活性ペプチドをコードする遺伝子 - Google Patents

免疫的活性ペプチドをコードする遺伝子

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JPH07265087A
JPH07265087A JP7040692A JP4069295A JPH07265087A JP H07265087 A JPH07265087 A JP H07265087A JP 7040692 A JP7040692 A JP 7040692A JP 4069295 A JP4069295 A JP 4069295A JP H07265087 A JPH07265087 A JP H07265087A
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Abstract

(57)【要約】 【構成】アミノ酸配列式Lys-Pro-S-T-S-Lys-Leu-Lys-Gl
n-Pro-U-V-Gly-W-Pro（Ｓは Lysまたは Asn、Ｔは His
または Glu、Ｕは Glyまたは Asn、Ｖは Aspまたは Gl
u、Ｗは Asnまたは Gln）を含む免疫的活性ペプチドを
コードするＤＮＡ、このＤＮＡを含む組換えＤＮＡクロ
ーニングベクター、前記ＤＮＡが導入された単細胞微生
物。 【効果】単独でまたは担体分子と結合されたときヒトに
免疫反応を誘導し得る、マラリア病原虫と交差反応し、
マラリア病原虫による感染に対して抵抗性を示す免疫的
に活性な合成ペプチドを製造することが可能になる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、ヒトおよび他の動物
に免疫応答を誘導し、その結果マラリア病原虫による感
染を防ぐ免疫的に活性のある試薬に関し、特にはヒトの
マラリア病原虫Ｐ．ファルシパルムに対してヒトを守る
ことに関する。
【０００２】
【従来技術とその問題点】最近の全世界的なマラリアの
伝播を防ぐためにワクチンが必要なことは明らかであ
る。マラリアに対する免疫は段階的な特徴があるため、
ワクチンはマラリアの生活環の各段階に対して開発され
なければならない。すなわち生活環の各段階とは、スポ
ロゾイト（ヒトに感染を引き起こす蚊の段階）、赤血球
に侵入した無性生殖の病原虫（病気を引起こす段階）、
および生殖体（蚊に感染性を媒介する段階）である。興
味の対象の１つはスポロゾイトに対するワクチンであ
る。それは効果があれば、免疫系を刺激して蚊によって
媒介されたスポロゾイトを殺し、他人に感染して病気の
原因となる次の段階を食止めることができよう。
【０００３】以前は動物やヒトは、放射線照射したスポ
ロゾイトを注射することで病気から守られてきた。しか
しながら、放射線照射したスポロゾイトでワクチンを接
種することは、その供給が限られておりスポロゾイトが
不安定であるため、実際に向いていない。モノクローナ
ル抗体の使用がきっかけとなって、齧歯類のマラリアで
あるプラスモディウム・ベルグヘイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉ
ｕｍ ｂｅｒｇｈｅｉ）のスポロゾイト上の主要表面タ
ンパクが発見された［Ｎ．ヨシダ，Ｒ．Ｓ．ヌッセンツ
ワイク，Ｐ．ポトクニャーク等、サイエンス（Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ），２０７，７１（１９８０）］。このタンパク
はスポロゾイトの表面を覆っていて、周囲スポロゾイト
（ＣＳ）タンパクと称されている。Ｐ．ベルグヘイのＣ
Ｓタンパクに対するモノクローナル抗体を投与すれば、
感染力をもった蚊の伝播からマウスを完全に保護するこ
とができる［Ｒ．Ｓ．ヌッセンツワイク，Ｐ．ポトクニ
ャーク，Ｖ．ヌッセンツワイク，ジャーナル・オブ・エ
クスペリメンタル・メディスン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．），１５１，１５０４（１９８０）］。ヒトの主な
マラリアであるＰ．ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉ
ｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）を含めてサルおよびヒト
のマラリア種に関する同様のＣＳタンパクが同定されて
きた［Ｆ．サントロ，ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ），２５
８，３３４１（１９８３）：Ｅ．ｈ．ナルディン等、ジ
ャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン
（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．），１５６．２０（１９８
２）］。しかしながら、この発明以前に、Ｐ．ファルシ
パルムのタンパクの構造は知られていなかった。サルの
マラリアであるＰ．クリーブ（Ｋｌｅａｖｅ）のＣＳタ
ンパクに対する遺伝子は最初にクローニングされた。と
いうのは、ｃＤＮＡライブラリーを調製する際に、感染
力をもった蚊のＰ．クリーブを大量に利用できたからで
ある［Ｌ．Ｓ．オザキ，Ｒ．Ｗ．クワッツ等，ネイチャ
ー（Ｎａｔｕｒｅ）、３０２，５３６（１９８３）；
Ｇ．Ｎ．ゴードソン，Ｊ．エリス，Ｐ．スビー等、ネイ
チャー（Ｎａｔｕｒｅ），３０５，２９（１９８
３）］。この遺伝子は、感染防御のモノクローナル抗体
に結合しているエピトープを含む、アミノ酸の反復配列
をもったタンパク（１２分子のアミノ酸が１２回反復す
る）をコードしていた。モノクローナル抗体は、免疫放
射線検定において、ポリクローナル抗スポロゾイト血清
がトリトンＸ−１００で可溶化したタンパクに接近する
のを遮断したので、この繰返し構造のエピトープはその
タンパク上の主要な免疫原であった［Ｆ．ツアバラ，
Ａ．Ｈ．コクレーン，Ｅ．Ｈ．ナルディン等，ジャーナ
ル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．），１５７，１９４７（１９８３）］。し
かしながら、以前サルの病原虫からこの繰返し構造のエ
ピトープに対して調製された抗体はヒトの病原虫とは反
応しないので、ヒトマラリア病原虫のＣＳタンパクに関
連した抗原物質が必要とされている。
【０００４】
【問題点を解決する手段】従って、この発明の目的は、
ヒトにおいて、マラリアに対する防御免疫応答を誘導し
得る抗原物質を発現可能なＤＮＡ配列を提供することで
ある。
【０００５】これらの目的は以下の物質を提供すること
により達成される。すなわち、単独でまたは担体分子と
結合されたときヒトに免疫反応を誘導し得る、マラリア
病原虫と交差反応し、マラリア病原虫による感染に対し
て抵抗性を示す実質的に精製された免疫的に活性な合成
ペプチドであって、該ペプチドがＡｓｎ−Ｘ−Ｙ−Ｐｒ
ｏ（ここで、ＸはＡｌａまたはＶａｌおよびＹはＡｓｎ
またはＡｓｐ）で表わされるアミノ酸配列の少なくとも
２回の連続的繰返し単位を含むことを特徴とする免疫的
活性ペプチドである。同様の防御は、そのペプチドが以
下の配列式を含む場合も達成し得る。すなわち、アミノ
酸配列式Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｚ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ
−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−
Ｇｌｙ（ここで、ＺはＳｅｒまたはＴｈｒ）、またはア
ミノ酸配列式Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓ−Ｔ−Ｓ−Ｌｙｓ−Ｌ
ｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｕ−Ｖ−Ｇｌｙ−Ｗ−
Ｐｒｏ（ここで、ＳはＬｙｓまたはＡｓｎ、ＴはＨｉｓ
またはＧｌｕ、ＵはＧｌｙまたはＡｓｎ、ＶはＡｓｐま
たはＧｌｕ、およびＷはＡｓｎまたはＧｌｎを示す）で
ある。
【０００６】また、この発明は生体系でそのようなペプ
チドの産生に有用な遺伝物質、例えば目的のペプチドを
コードするＤＮＡ配列をも含む。
【０００７】この発明は、Ｐ．ファルシパルムからのＣ
Ｓタンパクの免疫的活性断片の特性および構造の発見か
らなされたともいえる。発明者等は、Ｐ．ファルシパル
ムのＣＳタンパクに反応するモノクローナル抗体は、タ
ンパク中に見出される反復単位を標的としていることを
確認している。これらの反復単位（およびプラスモディ
ウム属の数種に見出される不変領域と見られるＣＳタン
パクの他の領域）が同定されたので、化学的合成の手法
を取ろうと生物学的手法を取ろうと、ワクチンの基礎と
なるこれらの免疫的活性領域を含むペプチドを生産する
ことが可能となる。
【０００８】従って、この発明は単独でまたは担体分子
と結合されたときヒトに免疫反応を誘導し得る、マラリ
ア病原虫と交差反応しマラリア病原虫による感染に対し
て抵抗性を示す実質的に精製された免疫的に活性な合成
ペプチドに関連する。該ペプチドは、Ａｓｎ−Ｘ−Ｙ−
Ｐｒｏ（ここで、ＸはＡｌａまたはＶａｌおよびＹはＡ
ｓｎまたはＡｓｐ）で表わされるアミノ酸配列の少なく
とも２回の連続的繰返し単位を含むことを特徴とする免
疫的活性ペプチドである。同様にこの発明は、該ペプチ
ドがアミノ酸配列式Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｚ−Ｐｒ
ｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ
−Ａｓｎ−Ｇｌｙ（ここで、ＺはＳｅｒまたはＴｈ
ｒ）、またはアミノ酸配列式Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓ−Ｔ−
Ｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｕ−Ｖ
−Ｇｌｙ−Ｗ−Ｐｒｏ（ここで、ＳはＬｙｓまたはＡｓ
ｎ、ＴはＨｉｓまたはＧｌｕ、ＵはＧｌｙまたはＡｓ
ｎ、ＶはＡｓｐまたはＧｌｕ、およびＷはＡｓｎまたは
Ｇｌｎを示す）で示される免疫的に活性な合成ペプチド
に関連する。したがって、望ましい免疫学的特徴を有す
るペプチドには少なくとも次の３つの変形例がある。
（１）前記反復単位を含むが前記長い配列は含まないペ
プチド；（２）前記２つの長い配列（以後しばしば、領
域Ｉおよび領域IIと称する）を含むペプチド；および
（３）前記の反復単位と前記の領域Ｉおよび領域IIと同
定された配列の一方が両方を含むペプチド。
【０００９】この明細書で用いられる「合成」という用
語は、天然状態のこの発明のペプチドから、以前から知
られているＰ．ファルシパルムのＣＳタンパクを特に除
去したという意味である。この発明は、ＣＳタンパクの
エピトープの構造およびこれらのエピトープに対する抗
体のマラリアに対する免疫能の発見により齎されたとも
いえる。ひとたびエピトープの構造が解明されると、ワ
クチンとして有効な合成ペプチドを調製することが可能
となった。しかし、ここでの合成とは、例えば遺伝子工
学的にヒトが介在する生物学的方法による産生をも含
む。
【００１０】この発明のすべてのペプチドに関する１つ
の重要な特徴は、それらのペプチドが免疫的活性を示
し、単独でまたは担体分子と結合されたときヒトにマラ
リア病原虫と交差反応性の免疫応答を誘導し得るという
ことである。従って、上に列挙した配列の少なくとも一
部が、１つ以上のこれらの配列を含むペプチドの免疫的
に利用可能な表面に存在することが必要である。これら
の特徴を有するペプチドを調製できるいくつかの方法が
ある。
【００１１】まず初めに、上に述べた配列から実質的に
なるペプチドを化学的または生化学的に合成することが
できる。その様なペプチドは、上に述べた配列中のアミ
ノ酸を少なくとも１０％、好ましくは少なくとも４０
％、さらに好ましくは少なくとも６０％、もっとも好ま
しくは少なくとも８０％含むであろう。最も好ましいペ
プチドは、全体が上に述べた配列（そのペプチドの１な
いし３分子の末端アミノ酸がそのペプチドの一端または
両端から欠損している前記反復配列からなると考えられ
るペプチドと一緒に）からなる。
【００１２】また、前記アミノ酸の配列が最終的なペプ
チドの表面に見出されるように調製することも可能であ
る。例えば、これはペプチド結合により１つ以上の前記
配列を、前もって調製したペプチドの表面に結合させる
ことにより行なうことができる。
【００１３】しかしながら、１つ以上の前記配列が長い
合成ペプチドまたはタンパクのアミノ酸配列の内部に含
まれる場合でさえ、免疫学の専門家であればこのペプチ
ドがこの発明の範囲に入るかどうか容易に知り得る。Ｃ
Ｓタンパクを免疫して得られる抗体と反応するペプチド
のみが、この発明の範囲に入ると考えられる。従って、
当該分野の専門家は、この発明の配列の１つを含むペプ
チドを容易に合成することができるし、日常的な試験に
より最終生成物がこの発明の範囲にはいるかどうか分
る。これは、そのタンパクとＣＳタンパク、好ましくは
Ｐ．ファルシパルムのＣＳタンパクを免疫して得られる
抗体、または前記配列の１つから実質的にまたは全体と
して成立つペプチドを免疫して得られる抗体（好ましく
は、モノクローナル抗体）とを反応させることにより測
定することができる。免疫反応が陽性であれば、このタ
ンパクはこの発明の範囲にはいる。Ｐ．フィルシパルム
のＣＳタンパクと反応する抗体は、一般的に知られてお
り容易に入手し得る。例えば、それは寄託されたハイブ
リドーマ細胞系ＡＴＣＣ ＨＢ８５８３により産生され
る。その細胞は、ここで４９．２Ｆ１．１と同定された
抗体を産生する。
【００１４】この発明の分子の大きさに関して、上限は
ない。ただ、長いペプチド分子を合成し得る技術力が問
題である。この発明の分子は、水性溶媒に溶けることも
溶けないことも有り得る。事実、この発明の１つの好ま
しい態様として、高分子量で不溶性のペプチドを合成す
ることが挙げられる。そのペプチドは、免疫的防御力を
誘導するため、分解して水溶性懸濁液として投与するこ
とができる。とはいえ、小さな分子も同様にこの発明を
実施するために適している。反復単位１００、２００、
４００または１０００を含む分子が、この発明を実施す
るために適している。しかしながら、５０を越える反復
単位を含むペプチドを合成する必要はないようである。
というのは、５０までの反復単位を含むペプチドは所望
の免疫効果を充分誘導するであろうし、合成が容易であ
るからである。２０ないし５０の反復単位の分子が特に
好ましい。反復単位がペプチド全体の少なくとも４０
％、更に好ましくは８０％からなる５０までの反復単位
を含むペプチドが望ましい。可能な反復単位の中で、Ａ
ｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏが最も望ましいが、Ａｓ
ｎ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏの反復単位が次に望まし
い。反復単位の少なくとも８０％がＡｓｎ−Ａｌａ−Ａ
ｓｎ−Ｐｒｏで、残りがＡｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒ
ｏであるペプチドが特に望ましい。
【００１５】反復単位を含むペプチドに関してペプチド
配列が、実質的に配列Ａ−Ｂ−Ａ−Ｂ−Ａ−Ｂ−（Ａ）
15−Ｂ−（Ａ）ｘ［ここでは、ＡはＡｓｎ−Ａｌａ−Ａ
ｓｎ−Ｐｒｏ、ＢはＡｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏを
示し、およびｘは０ないし３０、好ましくは１５ないし
２５、最も好ましくは２０である］からなる１つのペプ
チドが特に好ましい。
【００１６】この発明のペプチドが、要求される反復配
列（もちろん所望ならばこれらの配列が反復していても
よい）として特に取上げない配列の１つを含むならば、
ＺはＳｅｒ、ＳはＬｙｓ、ＴはＨｉｓ、ＵはＧｌｙ、Ｖ
はＡｓｐ、およびＷはＡｓｎであるペプチドが望まし
い。列挙した２つの長い配列のうち、アミノ酸配列式Ｔ
ｈｒ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｚ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−
Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ（す
なわち領域II）を含むペプチドが好ましい。
【００１７】前記の反復単位と前記の領域Ｉおよび領域
IIと同定された配列の一方か両方を含むペプチドが合成
された場合、このましいペプチドは２ないし５０の反復
単位を含む。それらには、領域IIの配列を含むペプチド
配列が続き、領域Ｉの配列を含むペプチド配列が先行す
る。特に好ましいペプチドは次の配列式を含む。
【００１８】Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ
−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−
Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａ
ｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓ
ｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ
−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−
Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａ
ｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒ
ｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ
−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−
Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａ
ｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓ
ｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ
−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−
Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐ
ｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌ
ａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ
−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−
Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａ
ｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓ
ｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ
−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−
Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａ
ｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒ
ｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ
−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−
Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａ
ｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓ
ｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ
−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−
Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａ
ｓｎ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓ
ｎ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ
−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｌａ−
Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉ
ｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ
−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−
Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃ
ｙｓ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓ
ｎ−Ｇｌｙ この発明のペプチドの合成法としては、望ましい構造を
有する１つ以上の４量体を形成することが望ましい。続
いてその４量体を重合し最終生成物を調製する。この方
法により非常に長いペプチドが調製できる。このような
化学合成は、長い反復配列が大きな分子の一部として存
在する場合でも同様に望ましい。この反復配列およびよ
り短い配列を独立に合成することができ、続いてそれら
を結合させて最終生成物を調製する。その様な手法は、
ペプチド合成の専門家に良く知られている。例えば、米
国特許第４１３２７４６号にペプチド４量体の合成法お
よびより大きな分子を形成させるためのその４量体の重
合法が記載されている。そこで記載されている方法を、
その特許に挙げられているアミノ酸の代わりにこの発明
で用いられるアミノ酸を選ぶことにより、この発明に応
用することができる。もちろん、近代的なペプチド合成
装置（その多くは市販されており、それにより大きな完
全ペプチド分子を合成し若しくは大きな断片を合成しそ
れを順次結合させることが極めて容易になった）も出現
している。
【００１９】この発明の遺伝学的（生物学的）ペプチド
合成法を記載するに先立ち、この発明の好ましい態様を
考慮しておくことが必要であろう。そこでは、この発明
のペプチドの免疫応答を誘導する能力が、この発明の１
つ以上のペプチドを免疫担体に結合させることにより高
められる。その結果として得られる生成物は、高い免疫
能を有しているので、ここでは抗マラリア免疫刺激剤と
称することとする。低分子の免疫能を高めるために、免
疫担体を使用することはよく知られている。担体は基本
的に２つのクラス、すなわち可溶性分子および粒子に分
けられる。可溶性分子の典型例は、タンパクおよび多糖
である。粒子の典型例は、リポソームおよび細菌細胞ま
たは膜のようなその一部である。完全な細胞は一般的に
殺して、感染に繋がる問題を防ぐために分裂しないよう
にしておく。
【００２０】あらゆる場合、免疫応答の増幅は担体の大
きさに依存しているため、担体の実際の構造は重要では
ない。タンパクおよび多糖のような可溶性高分子を担体
として用いる場合１００００ないし１００００００の範
囲の分子量が望ましい。それが非常に大きいと、タンパ
クおよび多糖の担体は不溶性となり、従って微粒子と考
えられる。
【００２１】ペプチドを担体に結合させる方法は、ペプ
チドの免疫的特異性の少なくとも一部が保持される限
り、余り問題ではない。この結果を得るための方法は、
次のような手段によりペプチドを担体に結合させること
が好ましい。担体のカルボキシル基またはアミノ基とペ
プチドのアミノ基またはカルボキシル基（好ましくはペ
プチドの遊離カルボキシル基または末端アミノ基）との
間でアミド結合を形成させる。もう１つの結合方法は、
担体のカルボキシル基または水酸基とペプチドの水酸基
またはカルボキシル基（好ましくはペプチドの末端カル
ボキシル基）との間でエステル結合を形成させる方法で
ある。必要ならば、ペプチドと担体とを結合させるため
に例えばアミンに結合している１ないし１０個のメチレ
ン炭素を有する末端ジアミンを用いてもよい。
【００２２】担体が用いられる場合、多数のペプチドを
担体表面に結合させることにより免疫的応答を高めるこ
とができる。例えば、１ないし１０００００分子のペプ
チドをタンパクまたは多糖に結合し得るが、１００ない
し１００００分子を結合させることが好ましい。担体と
してタンパクが用いられる場合、両性タンパクが望まし
い。その様なタンパクは親水部分および疎水部分を有す
る。その様なタンパクにおいて、この発明のペプチドを
親水部分に結合させることが望ましい。それによって、
疎水性部分が様々な膜に埋め込まれると、親水性部分が
体液環境にさらされる。
【００２３】担体として用いて好ましいタンパクの１つ
は破傷風トキソイドであり、これは免疫担体として用い
ることが以前から示唆されている物質である、ふつうに
用いられているワクチンである。
【００２４】高分子担体の使用について上記に挙げた望
ましい態様は、同様に微粒子担体の使用についても当は
まる。但し、担体当りのペプチドの上限は約１０15、好
ましくは１０10である。細菌細胞（殺されているかまた
は他の方法により分裂が妨げられている）が好ましい微
粒子として挙げられる。
【００２５】Ｐ．ファルシパルムからの天然ＣＳタンパ
クに極めて類似しているペプチドが望まれる場合、Ｐ．
ファルシパルムに関連した遺伝子またはＰ．ファルシパ
ルムのＣＳタンパク遺伝子由来の遺伝子を使って、生物
学的にそのペプチドを合成することが好ましい。続い
て、その結果得られた遺伝子産物を例えば末端アミノ基
の開裂により修飾することができる。
【００２６】組換えＤＮＡ技術が出現して、クローニン
グ遺伝子の産物を得るための手法が最近急速に増えた。
この発明に使用するに値するクローニング遺伝子を調製
するに適した方法を記載している最近の米国特許の例と
して、米国特許第４４１９４５０、４４１８１９４、４
４１４１５０、４３９９２１６、４３９４４４３、４３
５６２７０、４３５１９０１、および４３２７２２４号
が挙げられる。もちろん、そこに記載された技術を改良
して次のような手法を用いることができる。所望のペプ
チド産物を発現し得るＤＮＡ配列を合成する。米国特許
第４２７３８７５、４３０４８６３、４３３２９０１、
４４０３０３６、４３６３８７７および４３４９６２９
号に記載されている適切なクローニングベクターの中に
それらのＤＮＡを挿入させる。次に、この発明に適した
一般的な遺伝子工学的手法を述べる。
【００２７】遺伝情報は、二重鎖のデオキシリボ核酸
（ＤＮＡすなわち遺伝子）上にコードされている。それ
は、ヌクレオチド成分が繰返しているとしても、ＤＮＡ
コドンが固有の塩基を指定している順序に従っている。
コードされた遺伝情報が「発現」してポリペプチドを産
生する過程は、２段階からなっている。遺伝子中のある
調節遺伝子（「レギュロン」）の指令に従って、ＲＮＡ
ポリメラーゼがＤＮＡ鎖に沿って移動し、「転写」と呼
ばれる過程でメッセンジャーＲＮＡ（リボ核酸）が合成
される。続く「翻訳」の段階で、細胞のリボソームがト
ランスファーＲＮＡを結合させて、ｍＲＮＡの「メッセ
イジ」をポリペプチドに転換する。ＤＮＡから転写され
たｍＲＮＡの情報には、リボソームが翻訳を開始するお
よび終結するシグナルが含まれている。同様に、ポリペ
プチドを形成するアミノ酸の同定および配列のシグナル
が含まれている。ＤＮＡ鎖は「コドン」呼ばれるヌクレ
オチドからなるトリプレットの長い配列を含み、各トリ
プレットコドン中のヌクレオチドの特異的塩基により情
報の特異的断片がコードされている。例えば、ＡＴＧ
（アデニン−チミン−グアニン）と読まれる３ヌクレオ
チドは、「翻訳開始」と判断されるｍＲＮＡのシグナル
である。一方終止コドンＴＡＧ、ＴＡＡおよびＴＧＡ
は、「翻訳終止」と解釈される。開始と終止との間のコ
ドンには、いわゆる構造遺伝子が存在する。そのコドン
は、最終的に翻訳されるアミノ酸配列を規定している。
この定義は、確立している用語「遺伝子コドン」［例え
ば、Ｊ．Ｄ．ワトソン，遺伝子の分子生物学、第３版
（１９７６）、Ｗ．Ｗ．ベンジャミン出版］に従った。
その本には、様々なアミノ酸のコドンが記載されてい
る。遺伝子コドンは、様々なコドンが同一のアミノ酸を
生産するという意味において縮退している。しかし、各
アミノ酸に対して１つ以上のコドンがあるが、他のアミ
ノ酸を特定しないという点では厳密である。例えば、Ｔ
ＴＴ、ＴＴＣ、ＴＴＡ、およびＴＴＧのコドン全ては、
セリンをコードしているが、他のアミノ酸はコードしな
い。翻訳中、適切な解読フェイズすなわち解読フレイム
が保持されなければならない。例えば、リボソームが塩
基配列中の様々なコドンを開始コドン（下線部）として
読んだ場合何が起こるか考えてみよう。
【００２８】…ＧＣＴＧＧＴＴＧＴＡＡＧ…の塩基配列
において、…ＧＣＴ ＧＧＴ ＴＧＴ ＡＡＧ…は…Ａ
ｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ…、…Ｇ ＣＴＧ ＧＴ
Ｔ ＧＴＡ ＡＧ…は…Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−…、
…ＧＣ ＴＧＧ ＴＴＧ ＴＡＡ Ｇ…は…Ｔｒｐ−Ｌ
ｅｕ−（終止）となる。
【００２９】従って、最終的に生産されるポリペプチド
は、レギュロンと構造遺伝子との立体的関係に極めて依
存している。
【００３０】遺伝的発現の過程をより詳しく理解するた
めに、一度遺伝子の成分を次のように定義しておく必要
がある。
【００３１】・オペロン：ポリペプチド発現のための構
造遺伝子および発現を制御する調節領域（「レギュロ
ン」）を含む遺伝子。
【００３２】・プロモーター：転写を開始するためにＲ
ＮＡポリメラーゼが結合しなければならないレギュロン
内に存在する遺伝子。
【００３３】・オペレータ：リプレッサータンパクが結
合し得る遺伝子で、ＲＮＡポリメラーゼの結合が隣接す
るプロモーターに結合することを阻止する。
【００３４】・インデューサー：リプレッサータンパク
を不活化する物質で、オペレーターを解放しＲＮＡポリ
メラーゼをプロモーターに結合させ転写を開始させる。
【００３５】・カタボライト活性化タンパク（「ＣＡ
Ｐ」）結合部位：サイクリックアデノシン一リン酸
（「ｃＡＭＰ」）が仲介するＣＡＰに結合する遺伝子
で、通常転写の開始のためにも必要とされる。ＣＡＰ結
合部位は特別の場合不必要であることもある。例えば、
λファージのラクトースオペロン中のプロモーター突然
変異は、ｃＡＭＰおよびＣＡＰ発現を必要としない。
Ｊ．ベックウィッス等、ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー，６９，ＩＳＳ１６０（１９７２）］
参照。
【００３６】・プロモーター−オペレーター系：この明
細書で用いられているように、ＣＡＰ結合部位またはリ
プレッサータンパクをコードする能力を含むか含まない
かに係わらず、オペロンの操作可能な調節領域。
【００３７】更に、以降組換えＤＮＡについて議論する
際に使用する用語として、以下にそれを定義しておく。
【００３８】・クローニングベクター：「形質転換」の
過程で単細胞生物（「微生物」）に導入されたとき、ベ
クターが複製されるような完全な「レプリコン」を含む
非染色体の二重鎖ＤＮＡ。このように形質転換される生
物を「トランスフォーマント」と呼ぶ。
【００３９】・プラスミド：この発明の目的には、ウイ
ルスまたは細菌に由来するクローニングベクターを意味
する。後者は「細菌プラスミド」である。
【００４０】・相補性：二重鎖ＤＮＡのそれぞれの鎖上
で相補的塩基間に水素結合を介して二重鎖ＤＮＡを形成
させる単鎖ＤＮＡの塩基配列に付与される性質。アデニ
ン（Ａ）はチミン（Ｔ）に相補し、グアニン（Ｇ）はシ
トシン（Ｃ）に相補する。
【００４１】最近の生化学の進歩により、「組換体」ク
ローニングベクターを調製し得るようになった。それに
おいて、例えばプラスミドをある外来性のＤＮＡに組み
込める。特殊な例において、その組換体は「異質」ＤＮ
Ａを含むことがある。それは、組換体ベクターによって
形質転換されやすい微生物により通常生産されないポリ
ペプチドをコードするＤＮＡを意味する。プラスミドは
開裂して、連結反応性末端を有する直鎖ＤＮＡとなる。
これを連結反応性末端を有する外来性ＤＮＡと結合させ
ると、完全なレプリコンおよび所望の表現形質を有する
生物学的機能のある分子が生じる。組換体ＤＮＡは、形
質転換により微生物の中に導入され、そしてトランスフ
ォーマントは、新しい遺伝情報を発現し得る大量の細胞
を得る目的をもって単離されクローニングされる。組換
体クローニングベクターを形成する方法、およびそれら
を有する形質転換細胞を得る手段は、広く文献に記載さ
れている。例えば、Ｈ．Ｌ．ハイネッカー等，ネイチャ
ー（Ｎａｔｕｒｅ），２６３，７４８−７５２（１９７
６）；コーエン等，プロシーディング・オブ・ナショナ
ル・アカデミック・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａ
ｃａｄ・Ｓｃｉ．），米国．６９，２１１０（１９７
２）；同書，７０，１２９３（１９７３）；同書，７
０，３２４０（１９７３）；同書，７１，１０３０（１
９７４）；モロー等，プロシーディング・オブ・ナショ
ナル・アカデミック・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．），米国，７１，１７４３（１９７
４）；およびジャクソン等，プロシーディング・オブ・
ナショナル・アカデミック・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔ．Ａｃａｄ・Ｓｃｉ．），米国，６９，１９０４
（１９７２）参照。この主題の一般的議論は、Ｓ．コー
エン，サイエンティフィック・アメリカン（Ｓｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ），２３３，２４（１９
７５）に見られる。
【００４２】様々な技術により、ＤＮＡの組換えが可能
になった。それによると、別々のＤＮＡ断片の連結を容
易にするなんらかの方法により末端を切断しておく。そ
の連結とは（ほとんどの場合Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを介
して）、隣接するヌクレオチド間にホスホジエステル結
合を形成させることである。このようにして平滑末端を
直接連結させることができる。また、隣接末端に相補的
な単一鎖を含む断片は、各末端に位置する水素結合によ
り連結が容易になる。そのような単一鎖は、接着末端と
呼ばれているが、ターミナルトランスフェラーゼを使っ
てヌクレオチドを平滑末端に付加えることにより形成さ
れ得る。また、しばしば単にλエキソヌクレアーゼのよ
うな酵素を使って平滑末端の単一鎖を切ることによって
も形成され得る。更に、長さ約４ないし６塩基対のユニ
ーク配列近辺のホスホジエステル結合を切断する制限エ
ンドヌクレアーゼを用いることがしばしば行われてい
る。多くの制限エンドヌクレアーゼおよびその認識部位
が知られている。いわゆるＥｃｏＲＩというエンドヌク
レアーゼが最も広く使われている。回転対称な「パリン
ドローム」の二重鎖ＤＮＡを切断する制限エンドヌクレ
アーゼは接着末端を残す。このように、プラスミドまた
は他のクローニングベクターは切断され、各末端は制限
エンドヌクレアーゼ認識部位の一方を含むようになる。
外来性のＤＮＡの切断産物には、この様なプラスミド末
端と相補性を示す末端が存在する。また以下に開示する
ように、接着末端を含む合成ＤＮＡは外来性ＤＮＡの挿
入を妨げるので、アルカリホスホターゼで末端を切断し
ておくとよい。そうすると、外来性ＤＮＡ断片を取り込
めるベクターを選択することができる。ＤＮＡ断片の末
端が２つの異なった制限エンドヌクレアーゼで切断され
たＤＮＡベクターと相補性を示せば、そしてそれ自身が
２つの異なった制限エンドヌクレアーゼが認識する配列
を構成する末端をそれぞれ含めば、ベクターの構造に対
して正しい方向を有するＤＮＡ断片の取込みが高まるで
あろう。
【００４３】全ＣＳタンパクを産生するための１つの方
法は、以下の一般的な方法の中で記載する。この方法に
おいて、遺伝子の５′および３′末端を優先的に切断で
きるホルムアミド濃度および温度条件を調節して、ヤエ
ナリのヌクリアーゼを使用する。この様な方法で得られ
るＤＮＡ断片を、λｇｔ１１ベクターのような様々な発
現ベクターの中にクローニングできる。例えば、クロー
ニングベクターで形質転換して得られるクローンは、発
現しているかどうかを調べるために、ＣＳタンパクに対
する抗体を用いてスクリーニングに掛けられる。従っ
て、この発明は前記のペプチドをコードする実質的に純
粋なＤＮＡ配列を含む。その様なＤＮＡ配列は、今や市
販されている自動装置を使って容易に合成できる。実際
のＤＮＡ配列は、前もって得られるアミノ酸配列から容
易に算出できる。特に好ましいＤＮＡ配列は、図２ない
し図５に示されたＤＮＡ配列由来の断片を含む。図２な
いし図５に従うと、前記したアミノ酸に対応するＤＮＡ
配列が特に好ましい。
【００４４】これらのＤＮＡ配列の１つを含む組換体ク
ローニングベクターも、この発明の範囲に含まれる。こ
のクローニングベクターには、微生物若しくは酵母のプ
ラスミドまたはバクテリオファージが挙げられる。特に
好ましいクローニングベクターはλｇｔ１１である。こ
のように、ＤＮＡ配列が人工的に単細胞生物に導入され
たならば、ヒトに免疫反応を誘導し得る、マラリア病原
虫と交差反応しマラリア病原虫による感染に対して抵抗
性を示す実質的に精製された免疫的に活性なペプチドを
発現し得る上記のＤＮＡ配列を含む単細胞生物は、この
発明の範囲に含まれる。Ｅ．Ｃｏｌｉが好ましい宿主で
ある。
【００４５】この発明では、ＡＴＣＣに寄託されたいく
つかの例を挙げる。λｍＰｆ１、λｍＰｆ３、λｍＰｆ
５、λｍＰｆ８、λｎＰｆ１１、およびλｍＰｆ１３と
同定された微生物の寄託番号は、それぞれ以下の通りで
ある。すなわち、３９７３８、３９７３９、３９７４
０、３９７４１、３９７４２、３９７４３、および３９
７４４である。
【００４６】この発明を実施する上で使用する遺伝物質
は、上記の通りに合成され得るが、既知の手法を用いて
原生動物であるＰ．ファルシパルムから直接適当な遺伝
物質を取出すこともできる。一般的に入手し得る原生動
物であるＰ．ファルシパルムの中には、７Ｇ８と同定さ
れたものがある。それは、寄託番号４０１２３としてＡ
ＴＣＣに寄託されている。
【００４７】マラリアに対する免疫能を誘導するため
に、この発明のペプチドの免疫的有効量をヒトに投与す
る。治療面での有効投与量は、当該分野の専門家には容
易に決定できる。一般的には、体重に対して約０．０１
μｇ／ｋｇないし１００μｇ／ｋｇの範囲である。好ま
しくは、約０．１μｇ／ｋｇないし１．０μｇ／ｋｇの
範囲である。
【００４８】この発明のペフチドの投与形態は、免疫系
にこのペプチドを伝達できるいかなる経路もとり得る。
この発明の目的を達成するためには、このペプチドを筋
肉内、静脈内または活性成分をリンパ球に伝達でき免疫
応答を誘導できるいかなる方法によっても投与できる。
この発明のペプチドは、免疫応答を誘導するに適した形
態で、活性成分を含む薬剤組成物中に配合して調製でき
る。容易に注射できる形態で、活性成分を含む懸濁液ま
たは水溶液が好ましい。必要があれば、免疫応答を高め
るためにアジュバントを使用することができる。
【００４９】薬剤調製物の形にする場合、この発明のペ
プチドを単位投与形態にしておくことが望ましい。ヒト
に使用する場合、これらの量は、体重７０ｋｇのヒトに
予め与えた投与量から容易に計算することができる。従
って、薬剤調製物を含む好ましい単位投与量は、活性成
分約７ないし７０μｇを含むことになろう。しかし、い
かなる特定の患者に対する一定投与レベルも、使用され
る特定化合物の活性を含んだ様々な要因（例えば、年
齢、健康状態、性別、患者の摂取している食事、投与時
間、投与経路、排泄率、投与される他のいかなる薬剤と
の共働作用、および必要とされる抵抗力の度合い）に依
存することは言うまでもない。
【００５０】この明細書では、ペプチドおよびＤＮＡ配
列に関して標準的な命名法および略記法を使用してい
る。この明細書で用いた標準的な命名法を記載した出版
物の一例として、レーニンジャーの生化学（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ）［ウオース出版、ニューヨーク（１９
７０）第４章および５章（ペプチド）および第１２章
（ＤＮＡ）］が挙げられる。
【００５１】
【実施例】
ゲノムＤＮＡ発現用ベクターを用いたライブラリーから
のクローン 発現ベクターλｇｔ１１［Ｒ．Ａ．ヤングおよびＲ．
Ｗ．デイビス，プロシーディング・オブ・ナショナル・
アカデミック・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．），米国，８０，１１９４（１９８
３）］中のＰ．ファルシパルムゲノムＤＮＡライブラリ
ーは、次のように調製された。発現ライブラリーは、ブ
ラジルのＰ．ファルシパルムのＩＭＴＭ２２株から選択
された、一般的に入手し得るクローン７Ｇ８のＤＮＡか
ら調製された。Ｐ．ファルシパルム７Ｇ８クローンから
のゲノムＤＮＡのアリコート１０μｇを、３５または４
０％のホルムアミドを含む緩衝液（０．２Ｍ ＮａＣ
ｌ，１ｍＭ ＺｎＳＯ4 ，３０ｍＭ酢酸ナトリウム，ｐ
Ｈ４．６）１００μｌ中で５０℃にて３０分間ヤエナリ
のヌクレアーゼ（Ｐ−Ｌバイオケミカル）２０単位を用
いて分解した。続いて、その溶液を次の処理に移る前
に、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ溶液で４倍に希釈し、フェノ
ールで抽出し、そしてエタノール沈殿させた。この処理
からＤＮＡを集め、λｇｔ１１に連結するための断片源
として用いた。そのＤＮＡを一定の条件［Ｔ．マニアチ
ス，Ｅ．Ｆ．フリッシュ，およびＪ．サングローク著、
「分子クローニング：実験室指針」コールド・スプリン
グ・ハーバー研究所刊、Ｎ．Ｙ，、１９８２年、３９４
頁に記載］の下にクレノー断片（ＢＲＬ）で処理し、そ
の平滑末端を有する処理断片にＥｃｏＲＩリンカー（Ｂ
ＲＬ）を連結した。そのＤＮＡを過剰のＥｃｏＲＩで２
回分解し、各分解後セファロース４Ｂを詰めた１．５ｃ
ｍ×２０ｃｍのカラム上で遊離リンカーから分離した。
λｇｔ１１は自己結合するが、ＥｃｏＲＩで分解した。
Ｐ．ファルシパルムＤＮＡ断片２３０ｎｇを、調製した
λｇｔ１１ＤＮＡ５００ｎｇに供給者の勧める条件下で
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＩＢＩ）を用いて４℃にて一晩
かけて連結させた。連結反応生成物の半分を、生体外の
感染ファージ（プロメガ バイオテク）にパッケイジン
グした。ＸｇａｌおよびＩＰＴＧ（イソプロピルチオガ
ラクトシド）を補ったＬＢ寒天上で成育しているＲＹ１
０９１細胞上でλｇｔ１１のβガラクトシダーゼ遺伝子
中に介在断片があるかどうか調べたところ、４００００
０個のファージが検出された。
【００５２】そのライブラリーを、１５０ｍｍのプレー
ト２７枚に１枚のプレート当りプラーク濃度２５０００
として蒔いた。プラークを移したニトロセルロースを、
Ｒ．Ａ．ヤングおよびＲ．Ｗ．デイビス，サイエンス
（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）に記
載されているように調製した。Ｐ．ファルシパルム７Ｇ
８ ＣＳタンパクに対する５種のモノクローナル抗体
（表１）のプールを、１／１０，０００の希釈で、スク
リーニングに用いた。
【００５３】 表 １ クローニングされたＣＳタンパク遺伝子を発現している細菌の 溶解物と抗ＣＳタンパクモノクローナル抗体との反応 抗 原 モノクロナール抗体 2E6.4 2F1.1 4D9.1 4D11.6 5G53 λmPf 1(2.3kb）+ 1.2++ 1.3 1.7 1.5 1.9 λmPf 3(2.3kb) 1.3 1.1 1.9 1.4 1.8 λmPf 5(1.3kb) 1.1 0.9 1.5 1.2 1.4 λmPf 8(1.3kb) 1.2 0.9 1.6 1.2 1.4 λmPf 11(2.3kb) 1.1 0.9 1.6 1.3 1.4 λmPf 13(1.3kb) 0.6 0.5 0.5 0.7 0.6 λmPf 15(1.35kb) 1.1 1.1 >2.0 1.7 >2.0 λgt 11,IPTGで誘導 0.5 0.5 0.4 0.6 0.4 λgt 11,誘導せず 0.5 0.4 0.4 0.6 0.4 Y 1089 0.4 0.5 0.3 0.6 0.3 ＋λｍＰｆは、λｇｔ１１中のＰ．ファルシパルムＣＳ
タンパク遺伝子。λｇｔ１１に挿入されたＰ．ファルシ
パルムＤＮＡの大きさを括弧内に示す。全ての細菌はＩ
ＰＴＧで誘導された。
【００５４】＋＋データは、エリザ（ＥＬＩＳＡ）法で
３回別個に測定した４１４ｎｍにおける吸光度の平均値
として示されている 表１に掲げられた細菌は、以下のスクリーニング工程に
より同定された。５つのハイブリドーマ系腹水を、０．
０５％ツイーン２０および３％ＢＳＡ（ウシ血清アルブ
ミン）を含むｐＨ７．５の０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．
０５Ｍトリス緩衝液（ＴＢＳ）で１００００倍に希釈し
た。そして、Ｅ．Ｃｏｌｉおよびラムダに対する抗体を
除くために、ニトロセルロースフィルター上で空気乾燥
したλｇｔ１１が感染したＲＹ１０９０細胞の濃縮溶解
物で何回か吸収した。Ｐ．ファシルパルムライブラリー
からのプラークを移したニトロセルロースプラークを、
０．３％ツイーン２０、３％ＢＳＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ
2 および５μ／ｍｌのＤＮＡｓｅを含むＴＢＳ ５００
ｍｌで室温にて３０分間洗った。そのプラークを移した
ニトロセルロースを、吸収したモノクローナル抗体で４
℃にて一晩インキュベートした。更に、全ての操作は室
温で実施した。これらの操作の後、移したプラークを、
ＴＢＳ＋０．０５％ツイーン２０、ＴＢＳ＋１％トリト
ンＸ−１００、およびＴＢＳ＋０．５％ツイーン２０の
各溶液で３０分間順次洗浄した。マウスモノクローナル
抗体のシグナルは、そのフィルターをウサギの抗マウス
ＩｇＧ（カペル）中で１時間インキュベートすることに
よって増幅された。その抗体は、０．０５％ツイーン２
０および３％ＢＳＡを含むＴＢＳ中に溶かしたトリトン
Ｘ−５００溶液で希釈しておき、腹水液のときのように
前もって吸収しておいた。プラークを移したニトロセル
ロースに結合した抗体を、０．０５％ツイーン２０およ
び 125Ｉで標識したタンパクＡ（アメラハム）１μＣｉ
を含むＴＢＳ ３０ｍｌ中でインキュベートした。続い
て、洗浄し、オートラジオグラフィーにかけた。
【００５５】最初のスクリーニングで４８時間のオート
ラジオグラフィー後、３５個の陽性クローンが得られ
た。１７個を８５ｍｍのプレート当り１００ないし８０
０の濃度で再スクリーニングした。そのクローンの内１
１個が、２回目のスクリーニングで陽性プラークを形成
した。これらを、５０より少ないプラークを含む８５ｍ
ｍのプレートから免疫的スクリーニングを行わずにクロ
ーニングした。１１個のクローンの内１０個が、スクリ
ーニングにより免疫的活性を示した。
【００５６】１０個のクローンに挿入された断片は、次
の大きさのクラスに属す。３個（λｍＰｆ１、λｍＰｆ
３、λｍＰｆ１１）は２．３ｋｂ。３個（λｍＰｆ５、
λｍＰｆ８、λｍＰｆ１３）は２．３ｋｂ。λｍＰｆ１
５は１．３５ｋｂ。λｍＰｆ６は１．０ｋｂ。λｍＰｆ
９は０．５ｋｂ。クローンλｍＰｆ１８は、２つの挿入
断片を含むが、それ以上調べてはいない。クローンλｍ
Ｐｆ１，３，５，８，１１，１３および１５の挿入断片
は、交差ハイブリド形成する。
【００５７】λｍＰｆ６および９は、交差ハイブリド形
成しなかった。このことは、この２つの小さな挿入断片
は、５つのモノクローナル抗体の混合物により選択され
るが、２．３ｋｂ断片以外のゲノムの一部から由来する
ことを示している。
【００５８】クローンλｍＰｆ５は、ニックトランスレ
ートされたが、サザン法［Ｅ．Ｍ．サザン、ジャーナル
・オブ、モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．），９８，５０３（１９７５）によりヒトおよ
びＰ．ファルシパルムのＨｉｎｄIII 分解物を調べるた
めに用いられた。ハイブリド形成した単一バンドは、
Ｐ．ファルシパルム帯において１４ｋｂのところに現わ
れた（データは示さない）。このプローブはヒトのＤＮ
Ａとはハイブリド形成しなかった。
【００５９】Ｅ．Ｃｏｌｉ中でのＣＳタンパクの発現 λｇｔ１１中のクローンは、Ｅ．ＣｏｌｉのＹ１０８９
株にライソゲンとして導入された。ライソゲンを生産す
るために、バクテリオファージを含む溶液（１０10／ｍ
ｌ）１０μｌを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび
０．２％のマルトースを含む培地中で生育させたＥ．Ｃ
ｏｌｉのＹ１０８９株（１０8 ／ｍｌ）１００μｌと混
合し、ペレットにし１０ｍＭ ＭｇＳＯ4 中に再懸濁さ
せた。室温にて２０分間放置した後、細胞を希釈し５０
μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むプレート上に蒔いた。
そして３２℃にて生育させた。各コロニーを、４２℃に
て生育可能かどうかによって溶原性を調べた。溶原菌
を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む培地中にて、
５５０ｎｍでの吸光度が０．４ないし０．８になるまで
生育させた。培養物を４４℃にて２０分間軽く振盪し
た。ＩＰＴＧを最終濃度２ｍＭになるように加え、更に
１時間３７℃にて振盪した。ファージを４４℃にて導入
し、βガラクトシダーゼと融合するタンパクの発現を高
めるために培地に加えた。エリザ法にて、ＤＮＡが導入
された細菌の溶解物と５種のモノクローナル抗体のそれ
ぞれとの反応性を解析した。前記の通り生育させ誘導さ
せた培養物５０ｍｌから細胞を、５５０ｎｍで吸光度
０．６となるように、０．２ｍＭフッ化フェニルメチル
スルホニルを含むｐＨ８．０の１５０ｍＭ ＮａＣｌ，
５０ｍＭトリス塩酸緩衝液１．０ｍｌに再懸濁させた。
懸濁物をドライアイスとエタノールの入った溶槽中で素
早く凍結させ、ＰＢＳで希釈する前に２回解凍した。ク
ローンの溶解物をＰＢＳ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、
１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で１００倍に希釈した。アリコ
ート５０μｌをポリ塩化ビニル製のプレート（ダイナテ
ク・ラボラトリーズ社、バージニア州、アレキサンドリ
ア）の穴にピペットで加え、室温に保った。約１８時間
後、穴をＰＢＳ中にウシ血清アルブミン０．１％を加え
た溶液（ＰＢＳ−ＢＳＡ）で洗い、続いて１％のＰＢＳ
−ＢＳＡで満たし、室温で１時間放置した。５種のモノ
クローナル抗体の１つからの腹水５０μｌをＰＢＳで５
００倍に希釈し、適当な穴に加え、室温で１時間放置し
た。これら５種のモノクローナル抗体からの腹水は、
Ｐ．ファルシパルムスポロゾイトに対する免疫蛍光抗体
検定（ＩＦＡ）および周囲スポロゾイト沈澱（ＣＳＰ）
反応が陽性であった。穴を上記の通り洗い、ＰＢＳで２
００倍に希釈したパーオキシダーゼが結合している抗マ
ウス抗体ヤギ（キルケガード＆ペリーラボラトリーズ
社、メリーランド州、ゲセルバーグ）を加え、室温で１
時間放置した。各穴をＰＢＳ−ＢＳＡで洗い、基質１５
０μｌを加えた。基質はｐＨ４の０．１Ｍクエン酸−リ
ン酸緩衝液１ｍｌ当り１ｍｇの２，２′−アジノ−ジ−
（３−エチルベンズチアゾリン スルホン酸）からなっ
ている。使用直前に０．００３％の過酸化水素を加え
る。４１４ｎｍでの吸光度を、１時間後、タイターテッ
クマルチスキャンプレイトリーダー（フローラボラトリ
ーズ社、バージナア州、マクレーン）を使って測定し
た。６種のクローンが５種のモノクローナル抗体全てに
結合した（表１）。クローンλｍＰｆ１３の吸光度は、
上記の対照ほど顕著ではなかった。クローンλｍＰｆ９
は、５種のモノクローナル抗体のうちの１種すなわち４
Ｄ１１．６のみに結合した（データは示さない）。クロ
ーンλｍＰｆ９はＣＳタンパクを含むλｍＰｆ１とハイ
ブリド形成しなかった（以下参照）ので、このモノクロ
ーナル抗体は、ＣＳタンパクの遺伝子とは無関係な遺伝
子と同定された。λｍＰｆ９によって発現されるタンパ
クは、この１種のモノクローナル抗体とエピトープ交差
反応をする。ホープ等は、Ｐ．ファルシパルムの表面抗
原と交差反応する、Ｐ．ファルシファルムの侵入した性
に関係しない赤血球抗原に対するモノクローナル抗体を
同定した。Ｉ．Ａ．ホープ，Ｒ．ハル，Ｄ．Ｚ．シモン
ズ等，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３０８，１９１
（１９８４）参照。λｍＰｆ９が、ホープ等の記載する
タンパクまたは他の交差反応をするタンパクをコードす
る遺伝子を含んでいるとしても、タンパクはまだ決定さ
れていない。
【００６０】また、エリザ法に使われる溶解物を、ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で
電気泳動に掛け、ニトロセルロース上に電気泳動作で染
みこませた。各ライソゲン培養物１ｍｌからのペレット
化した細胞を、ＳＤＳゲル試料用緩衝液（３％ＳＤＳ、
１０％グリセロール、１０ｍＭジチオスレイトール、６
２ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ６．８）２００μｌに溶解
し、９５℃にて５分間加熱した。Ｐ．ファルシパルムの
スポロゾイトをＡｎ．フリーボルニ（ｆｒｅｅｂｏｒｎ
ｉ）蚊の唾液腺から単離し、ペレットとして０．２％卵
白アルブミンを含むＰＢＳ中にて−８０℃で保存した。
抗原抽出においては、新規に調製した抽出緩衝液（０．
５％Ｎｐ４０、２ｍＭ ＰＭＳＦ、３３μｇ／ｍｌロイ
ペプシン、３３μｇ／ｍｌアンチパイン、２μｇ／ｍｌ
ＢＳＡを含むＰＢＳ）４５０μｌを４．５×１０5 ス
ポロゾイトのペレットに加えた。その混合物を、１０分
毎に１５ないし３０秒間激しく振りながら室温にて１時
間インキュベートした。抽出したスポロゾイトを２分間
１３０００ｇで遠心してペレット化した。その上清を、
電気泳動に掛けるためＳＤＳゲル試料用緩衝液に入れ
た。
【００６１】トウビン等の方法［プロシーディング・オ
ブ・ナショナル・アカデミック・サイエンス（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．），米国，７９，４
３５０（１９７９）］を改良してウエスターン法による
解析を実施した。タンパクをレムリーの方法［ネイチャ
ー（Ｎａｔｕｒｅ），２７７，６８０（１９７０）］に
基づいてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。その際、
４．５％重層ゲルおよび８ないし１２％の勾配ゲルを用
いた。ゲルをトウビンの緩衝液２００ｍｌで３０分間２
回洗った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したタンパクを、４
℃にて電場８ボルト／ｃｍで１４ないし１６時間かけて
０．２２μｍのニトロセルロースフィルター上に移動さ
せた。ニトロセルロースフィルター上で未反応結合部位
は、０．０５％ツイーン２０を含むＰＢＳに溶かした５
％ＢＳＡでフィルターを処理して遮断した。続いてその
ニトロセルロースフィルターを、０．０５％ツイーン２
０を含むＰＢＳ１００ｍｌで４回洗った。そのニトロセ
ルロースフィルターを、５つのモノクローナル抗体のプ
ール（２Ｅ６．４、２Ｆ１．１、４Ｄ９．１、４Ｄ１
１．６および５Ｇ５．３）で９０分間反応させた。モノ
クローナル抗体のプールは、各抗体の腹水を０．０５％
ツイーン２０および２０％ウシ胎児血清を含むＰＢＳで
１：１００００００に希釈して調製した（総腹水の希釈
率１：２００００）。そのニトロセルロースフィルター
を前の通り４回洗い、続いてマウス抗体に対して調製し
た 125Ｉで標識したヒツジ抗血清で処理した。 125Ｉで
標識したヒツジ抗血清を、０．０５％ツイーン２０およ
び２０％ウシ胎児血清を含むＰＢＳで２×１０5 ｃｐｍ
／ｍｌとなるように希釈した。そのニトロセルロースフ
ィルターを前の通り４回洗い、乾燥させた。コダックＸ
ＡＲ−２フィルムを用いて−８０℃にてオートラジオグ
ラフィーを実施した。そのニトロセルロースフィルター
上のタンパクを、抗スポロゾイトモノクロナール抗体に
より同定した。λｍＰｆ１，３，５，８，１１、および
１３のタンパクに対する抗スポロゾイトモノクローナル
抗体は、λｍＰｆ１３に対する強度は非常に減少してい
たものの、分子量Ｍr ６００００／５７０００および５
３０００／５１０００の２つの二重線に結合した（デー
ターは示さない）。挿入ＤＮＡをもたないλｇｔ１１ベ
クターには結合しなかった。モノクローナル抗体は、分
子量Ｍr ６００００，５３０００および５１０００の位
置でスポロゾイトからのタンパクに結合した。このよう
にλｇｔ１１中でＣＳタンパクをコードしている全ての
スポロゾイト遺伝子は、スポロゾイト自身により合成さ
れる操作されていないＣＳタンパク（分子量Ｍr ６００
００）に対して移動度の小さいタンパクを産生した。Ｉ
ＰＴＧで誘導すると、λｇｔ１１の場合注目すべきこと
であるが、分子量Ｍr １１６０００のβガラクトシダー
ゼが著しく発現した。λｍＰｆ９の場合注目すべきこと
は、βガラクトシダーゼに結合した分子量Ｍr １３１０
００の融合タンパクが発現した（データは示さない）。
ＣＳタンパク遺伝子をもったクローンは、弱いβガラク
トシダーゼ帯だけを示したが、融合タンパクは見られな
かった（データは示さない）。更に、βガラクトシダー
ゼに対する抗体は、分子量Ｍr ６００００のＣＳタンパ
クに結合しなかった。このことは、このタンパクがβガ
ラクトシダーゼの断片を含んでいないことを示唆してい
る（データは示さない）。
【００６２】λｇｔ１１ベクターは、ＩＰＴＧを用いた
誘導によりβガラクトシダーゼに融合したタンパクとし
てのＤＮＡ挿入断片を発現できるように設計されたもの
である。従って、ＣＳタンパクを発現するどのクローン
も融合タンパクではないとは予期されていなかった。こ
のことは、λｍＰｆ１，５，８および１５に関して当は
まる。というのもこれらのＤＮＡ挿入断片が、それらの
転写の方向がβガラクトシダーゼのそれと反対になるよ
うに配向されているからである。ＳｔｕＩ、ＫｐｎＩ、
およびＳｔｕＩ＋ＫｐｎＩを使って決定されたファージ
ＤＮＡの制限酵素切断地図によれば、挿入部分の非対称
ＳｔｕＩ部位（図１）は、それぞれの場合左端から１
８．５８ｋｂのλｇｔ１１中のＫｐｎＩ部位から約１．
１ｋｂに位置していることが示された。λｍＰｆ１およ
びλｍＰｆ１５クローン中のコード配列に対してＰ．フ
ァルシパルムＤＮＡの５′末端が、Ｅ．ＣｏｌｉＲＮＡ
ポリメラーゼによりプロモーターとして認識される配列
を含むかどうか疑問ではあるが、細菌のリボゾームに対
する結合部位は存在していないことは明らかである（図
２ないし図５）。λｍＰｆ５およびλｍＰｆ８クローン
は、その遺伝子に先行する１１ｂｐから始まる。従っ
て、これらのクローン中のＣＳタンパクは、終わりに近
いラムダのプロモーターから発現される可能性がある。
同じような現象は、酵母ＤＮＡ挿入断片に関してλｇｔ
１１系で観察された。Ｔ．ゴローおよびＪ．Ｃ．ワン
グ，セル（Ｃｅｌｌ），３６，１０７３（１９８４）参
照。
【００６３】制限酵素切断地図によれば、λｍＰｆ１３
に挿入されたＤＮＡ断片はβガラクトシダーゼ遺伝子に
対して正しい方向を向いていることが示唆される。しか
し、それはβガラクトシダーゼと融合したタンパクを産
生するフレーム中の１つの塩基である（図２ないし図
５）。ウエスターン法で検出されるように、このクロー
ンにより産生されるＣＳタンパクのレベルが低くかつエ
リザ法により著しい違いのあるデータが得られなかった
（表１）のは、その構造的観点から理解できる。逆向き
接続またはフレイム挿入の性質をもったクローンから示
唆し得ることは、恐らくＥｃｏＲＩのＣＳタンパクの毒
性効果の為に、発現する融合タンパクの選択が行われて
いる（例えば、正しい方向にあるλｍＰｆ５および８）
ということである。
【００６４】ＣＳタンパクをコードしているＰ．ファル
シパルム遺伝子の構造 Ｐ．ファルシパルムをコードしている遺伝子を含むβｍ
Ｐｆ１中にクローニングされた２．３ｋｂのＤＮＡ断片
のヌクレチオド配列を図２ないし図５に示す。λｍＰｆ
１クローンの制限酵素切断地図および配列決定の手法を
図１に示す。この配列は、７８番目のＡＴＧ開始コドン
で始まり１３１６番目のＴＡＧ終止コドンで終わる大き
な塩基の読み取り枠を含んでいる。複数の終止コドン
は、他の５つの読み取り枠の中に見出される。塩基の読
み取り枠が図１に示されるようなものであれば、分子量
約４４０００ダルトンで４２１分子のアミノ酸からなる
ポリペプチドもコードし得るであろう。Ｐ．ノウレシの
ＣＳタンパクで観察されたように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに
よるＰ．ファルシパルムのＣＳタンパクの分子量（約６
００００）は、推定分子量（４４０００）とは異なって
いた。
【００６５】このタンパクの最も重要な構造上の特徴
は、４つのペプチドからなる４１回の直列反復が存在す
ることである。最初の繰返し単位はＡｓｎ−Ａｌａ−Ａ
ｓｎ−Ｐｒｏであり、３７回繰返す。もう一方はＡｓｎ
−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏであり２，４，６および２２
番目に現われる。Ａｌａ−ＡｓｎがＶａｌ−Ａｓｐに変
わっているのは、アラニンコドンの２番目の塩基がＣか
らＴに置き代わり、アスパラギンコドンの１番目の塩基
がＡからＧに置き代わっている理由による。これらの繰
返しをコードしている核酸の塩基配列は、アミノ酸配列
をただ単に一定に保っている訳ではない。４１単位を有
する繰返し領域は、１１の異なったヌクレチオド配列か
ら成り立っている。その単位の内１８配列はＡＡＴＧＣ
ＡＡＡＣＣＣＡである。反復単位の７配列はこの配列の
１つの位置だけが異なっており、１２配列は２つの位置
が、２配列は３つの位置が、１配列は４つの位置が、そ
して１配列は５つの位置が異なっている。この様な配列
の異なりは、ゲノムＤＮＡ内の反復を組換えによる塩基
の切断や入替えから守り安定化させている。タンパクの
アミノ末端では、１６分子のアミノ酸の鎖が恐らくシグ
ナル配列を構成している（図２ないし図５）。シグナル
配列と反復領域との間には、塩基性および酸性アミノ酸
が存在するために非常に電荷を帯びた領域が生じる。例
えば、６６番目から１１８番目のアミノ酸の内２７分子
が電荷を帯びたアミノ酸である。
【００６６】その繰返し領域に続いて、他の２つの断片
が電荷を帯びたアミノ酸を非常に多く含んでいる。これ
らの領域は、３２４番目から３３９番目のアミノ酸領域
および３６０番目から３８８番目のアミノ酸領域に存在
する。それらの領域は、それぞれ５０％および４８％の
電荷を帯びたアミノ酸を含む。このタンパクのカルボキ
シ末端には、膜内在性タンパクのアンカー配列を表わす
２１分子の疎水性アミノ酸が存在する。
【００６７】合成ペプチドと抵抗との免疫活性 Ｐ．ファルシパルムスポロゾイト遺伝子のヌクレオチド
単位が正しい配列であるかどうか最終的な証明をするた
めに、ペプチドを合成した。そのペプチドは、ベックマ
ン９９０アミノ酸合成機を使って固相法［Ｒ．Ｂ．メリ
フィールドおよびＡ．マーグリン，アニュアル・レビュ
ー・オブ・バイオケミストリー（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．），３９，８４１−８６６（１９７
０）］により調製した。合成ペプチドを、液体ＨＦによ
り固体の支持体から遊離させた［Ｊ．Ｐ．タム，Ｗ．
Ｆ．ヒースおよびＲ．Ｂ．メリフィールド，ジャーナル
・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティー（Ｊ．
Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃｉ），１０５，６４４２（１９
７０）］。遊離ペプチドを、バイオゲルＰ−２またはＰ
−４上でゲル濾過により脱塩した。単離したペプチドの
純度を、逆相ＨＰＬＣおよびアミノ酸分析機により確め
た。また、１５残基のペプチドに関してはアミノ酸配列
を決定した。
【００６８】続いて、上記のエリザ法を改良して、これ
らのペプチドがモノクローナル抗体２Ｆ１．１のλｍＰ
ｔ１への結合を阻害するかどうかを調べた。合成ペプチ
ドに関して、次のような試験を実施した。ｐＨ７．４の
０．０１Ｍリン酸塩、０．１５Ｍ ＮａＣｌの緩衝液
（ＰＢＳ）で１００倍に希釈したλｍＰｆ１の溶解物の
アリコート５０μｌをポリ塩化ビニル製のプレート（ダ
イナテク・ラボラトリーズ社，バージニア州、アレキサ
ンドリア）の穴にピペットで加え、一晩室温で放置し
た。約１８時間後、穴をＰＢＳ−０．０５％ツイーン２
０（ＰＢＳ−ＴＷ）で４回洗い、ＰＢＳ−ＴＷ中にウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）０．１％を加えた溶液で満た
し、室温で１時間放置した。蒸溜水に溶かした合成ペプ
チドの貯蔵液（５×１０-2Ｍ）を、ＰＢＳ中にＢＳＡ１
％を溶かした液で１０倍に希釈した。そしてアリコート
１００μｌを、１．５ｍｌの小遠心管中でセイヨウワサ
ビペルオシダーゼに結合させたモノクローナル抗体３０
μｌと混合し、室温で１時間放置した。プレートの穴を
空にし、各穴にペプチド−モノクローナル抗体混合物を
入れ、室温で１時間放置した。穴を再び上記の通り洗
い、前記のように基質１５０μｌを加えた［Ｐ．Ｋ．ナ
カネおよびＡ．カウザオイ，ジャーナル・オブ・ヒスト
ロジカル・サイトケミカトリー（Ｊ．Ｈｉｓｔ．Ｃｙｔ
ｏｃｈｅｍ．），１１，１０８４（１９７４）］。
【００６９】図６に示された結果から７，１１および１
５の残基を有するペプチドは、２Ｆ１．１のλｍＰｆ１
への結合を著しく阻害することが分る。１５残基のペプ
チドでは、５×１０-7Ｍの濃度で結合が明らかに阻害さ
れた。７残基のペプチドも、モノクローナル抗体２Ｆ
１．１のλｍＰｆ１と置き変わったスポロゾイト抗原へ
の結合を阻害した。更に、合成ペプチドは他の４つのモ
ノクローナル抗体のλｍＰｆ１への結合を阻害した。こ
のデータは、反復単位の配列が正しいことを示してい
る。１１および１５残基を有するペプチドに関して結合
の阻害が高まっていることが観察されたが、このことは
２次構造の変化に起因すると思われる。
【００７０】Ｐ．ファルシパルムおよびＰ．ノウレシの
ＣＳタンパク間の相同領域 Ｐ．ファルシパルムのＣＳタンパクおよびサルのマラリ
ア病原中であるＰ．ノウレシのＣＳタンパクは、全体的
には同じような構造を有しているが、相同性のある２箇
所だけの短い領域を有している。両タンパクは、次の点
で主要な特徴が同じようである。すなわち、それらはタ
ンパクの中央部分に繰返し領域を有し、アミノ末端にシ
グナル配列として電荷を帯びたアミノ酸がたくさん存在
する多重領域を有し、およびカルボキシル末端に疎水性
のアンカー配列を有する点である。アミノ酸配列の相同
性コンピューターで解析した（２５，ｋタップルサイズ
１，ウインドウサイズ２０，ギャップペナルティ１）と
ころ、タンパクのほとんどに亘って配列の相同性が限定
されていることが分った。反復配列から断片における２
種のタンパク間の平均的な相同性は３７％である。すな
わち、１０２分子のアミノ酸の内３７分子が一致してい
た。１２分子のアミノ酸毎にＰｒｏ １分子およびＡｌ
ａ １分子が入っているので、反復配列の相同性は１６
％である。反復配列から後の断片における２種のタンパ
ク間の平均的な相同性は４２％である。すなわち、１１
９分子のアミノ酸の内５０分子が一致していた。これら
のタンパクの２次および３次構造は明らかでないが、１
次構造に差があるにもかかわらずこれらのタンパクには
構造上および機能上の類似性がある。ＣＳタンパクの反
復配列により、免疫活性のあるスポロゾイトのワクチン
を生産することが可能になる。
【００７１】非常に相同性のある２箇所の領域は、反復
領域のどちらかに見出された。２２分子のペプチドに相
同領域が入っている場合、３分子のプロリンが入ってい
る箇所は明らかであり、および５つの連続したアミノ酸
（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ）は一致す
る（図２および図７の領域Ｉ）。
【００７２】相同性のある第２の領域（図４および図７
の領域II）は、１３分子のアミノ酸を含み、そのうち１
２分子は一致している。一致していない只１分子のアミ
ノ酸は、Ｐ．ノウレシのアミノ酸配列中の第４番目でセ
リンがスレオニンに置き変わっている。この領域には、
分子内ループ形成に関してオザキ等［Ｌ．Ｓ．オザキ，
Ｐ．スベク，Ｒ．Ｓ．ヌッセンツワイク等，セル（Ｃｅ
ｌｌ），３４，８１５（１９８３）］が初期の頃主張し
た２つのシステイン残基を含む。
【００７３】Ｐ．ファルシパルムのＣＳタンパクをコー
ドしている核酸の配列の、領域IIを除いたＰ．ノウレシ
の遺伝子との相同性にも制限がある。タンパクの領域II
をコードしている遺伝子の特定の部分において、２箇所
だけＰ．ノウレシに相当する配列とは異なる２７塩基配
列が存在する。この一定配列は、他のプラスモディウム
種のＣＳタンパクをコードしている遺伝子をクローニン
グするためのプローブとして有益となろう。
【００７４】Ｐ．ファルシパルムとＰ．ノウレシとの間
のアミノ酸の２つの領域の相同性を考慮してみると、進
化の過程で大きく分離した微生物の塩基配列が保存され
ているということが言える。以前、霊長類のマラリアは
霊長類と並行して進化してきたとする仮説があった。し
かし最近では、Ｐ．ファルシパルムのＤＮＡは鳥および
齧歯類のマラリアのＤＮＡと類似しているという報告、
およびこれらのＤＮＡ構造は霊長類のマラリア［Ｐ．ノ
ウレシ、Ｐ．フラジレ（ｆｒａｇｉｌｅ）、Ｐ．ビバッ
クス（ｖｉｖａｘ）、およびＰ．シノモルジ（ｃｙｎｏ
ｍｏｌｇｉ）］のそれとは異なるという報告がなされて
きた。Ｐ．ファルシパルム、Ｐ．ロフラエ（ｌｏｐｈｕ
ｒａｅ）およびＰ．ベルグヘイ（ｂｅｒｇｈｅｉ）のＤ
ＮＡ塩基のＧ＋Ｃの含量は、Ｐ．ノウレシを含めた霊長
類のマラリアのそれよりも低かった。更に、Ｐ．ファル
シパルム、Ｐ．ロフラエ（ｌｏｐｈｕｒａｅ）および
Ｐ．ベルグヘイ（ｂｅｒｇｈｅｉ）のＤＮＡとハイブリ
ドを形成する遺伝子プローブは、霊長類のマラリアとハ
イブリドを形成しなかった。また、霊長類のマラリアと
ハイブリドを形成するプローブは、Ｐ．ファルシパル
ム、Ｐ．ロフラエ（ｌｏｐｈｒａｅ）およびＰ．ベルグ
ヘイ（ｂｅｒｇｈｅｉ）のＤＮＡとハイブリドを形成し
なかった。Ｐ．ファルシパルムとＰ．ノウレシ間のこの
相同領域は、細胞へ侵入するための受容体のようなタン
パクの重要な機能として保存されているのかもしれな
い。Ｐ．ファルシパルムとＰ．ノウレシ病原虫双方は、
ヒトの肝臓に感染し得るということに注目すべきであ
る。
【００７５】タンパク間でエピトープを共有してしまう
という潜在的な問題があるにも係わらず、かなりの数の
事実がスポロゾイト遺伝子がクローニングされてきたと
いうことを示している。先ず初めＰ．ファルシパルムの
ＣＳタンパクとＰ．ノウレシのＣＳタンパク間には甚だ
しい類似性がある。双方の大きさは、Ｐ．ファルシパル
ムおよびＰ．ノウレシの計算分子量がそれぞれ４４４２
６および３６７９２であるようにほぼ同じである。また
双方には、シグナル配列、電荷を帯びた領域、タンパク
の中央に存在する反復ペプチドの領域、およびアンカー
配列を含む類似した領域がある。第２には、２種のタン
パク間にはアミノ酸の配列の相同領域が２つある（図
７）。第３にはＰ．ファルシパルム病原虫の表面抗原と
反応する５種のモノクローナル抗体は、細菌の中で合成
されたタンパクを認識する。λｍＰｆ９クローンからの
交差反応性タンパクのみが、これらのモノクローナル抗
体の１種と反応する。第４には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
ると、細菌の中で合成されたタンパクの大きさはＰ．フ
ァルシパルム病原中から得られるタンパクのそれとほぼ
同じであった。第５には、反復配列を有する合成ペプチ
ドは、エリザ法においてモノクローナル抗体のスポロゾ
イトタンパクへの結合を阻害した。
【００７６】この遺伝子は、シグナル配列、電荷を帯び
た領域、４分子のアミノ酸からなる単位（反復）が４１
箇所現われる中央の領域、シスチンのループ、およびア
ンカー配列から成立つ４１２分子のアミノ酸からなるタ
ンパクをコードしている。中央領域の反復配列の３７箇
所は同一であり（Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ）、
４箇所の配列はＡｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏであ
る。
【００７７】ＣＳタンパクに類似している一連の抗原
は、今日まで研究されてきたプラスモディウムの全ての
種のスポロゾイト上に見出される。ＣＳタンパクのモノ
クロナール抗体は、生体に防御力を付与し、生体外では
スポロゾイトの感染力を中和する。Ａ．Ｈ．コクレー
ン，Ｆ．サントロ，Ｖ．ヌッセンワイツ等，プロシーデ
ィング・オブ・ナショナル・アカデミック・サイエンス
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）米国，７
９，５６５１（１９８２）参照。
【００７８】モノクローナル抗体は、霊長類のマラリア
の種間で交差反応を引起こすことがあるが、免疫能を仲
介する抗体は種特異性を有するようであり、Ｐ．ノウレ
シの場合防御力をもったモノクローナル抗体は反復構造
のエピトープを標的としている。１つ以上のエピトープ
を必要とする検定においてモノクローナル抗体はスポロ
ゾイトと反応するというデータや知見から、ザバラ等に
よりＣＳタンパクに対するモノクローナル抗体を反復エ
ピトープを有する免疫活性領域と反応させる方法が開発
された。この仮説は、Ｐ．ファルシパルムのＣＳタンパ
クに対する５種のモノクローナル抗体がタンパク中の反
復単位（Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ）を標的とし
ている点から確固としたものになった。
【００７９】進化の途上２つの異なった様式で分離して
いったマラリア病原虫（Ｐ．ファルシパルムおよびＰ．
ノウレシ）のＤＮＡ配列の領域IIが実に良く相同してい
ることが暗示するものは、スポロゾイトが病原虫の肝臓
への侵入に対して受容体としての機能をもつためにその
塩基配列が保存されてきたということである。この領域
がヒトマラリアの中で保存され、免疫系にさらされるな
らば、Ｐ．ファルシパルムのこの領域で免疫することは
ヒトマラリアの他の種に対しても抵抗力を付与し得るで
あろう。もしこの相同領域が病原虫の肝臓への侵入に対
して受容体としての意味をもつならば、マラリア病原虫
のこの領域の塩基配列は極端な変化をし得ないであろ
う。
【００８０】以上、この発明を図面を参照しつつ説明し
たが、図１に示される制限酵素による切断部位は、塩基
配列から決定され、次の制限酵素の分解により確められ
た。ＡはＡｖａII、ＡｃはＡｃｃＩ、ＢはＢｓｔｎＩ、
ＤはＤｒａＩ、ＤｄはＤｄｅＩ、ＦはＦｏｋＩ、ＮはＮ
ｄｅＩ、ＲはＲｓａＩ、ＳはＳｔｕＩ、ＴはＴｔｈIII
、ＴｑはＴａｑＩ、ＸはＸｈｏIIを示す。矢印は、決
定された塩基配列の開始点、方向および範囲を示す。Ｃ
Ｓタンパクをコードしている領域は、太い線で示されて
いる。図２ないし図５には、λｍＰｆ１中におけるＣＳ
タンパクの遺伝子に対するヌクレチオド配列が示されて
いる。λｍＰｆ１に挿入したＥｃｏＲＩのＤＮＡ断片
は、ｐＵＣ８中にサブクローニングされ、塩基配列が決
定された。二重鎖ＤＮＡ配列に関して、ＣＳタンパクを
コードしている領域の１００％が決定され、近接領域の
７０％が決定された。クローンλｍＰｆ５、λｍＰｆ
８、λｍＰｆ１３およびλｍＰｆ１５の挿入部分もまた
ｐＵＣ８中にサブクローニングされ、末端の配列が決定
された。ＣＳタンパクをコードしている領域の５′末端
の最初の塩基を、矢印の右側に示す。挿入断片の両末端
に結合しているＥｃｏＲＩリンカー（ＧＧＡＡＴＴＣ
Ｃ）は、配列の一部として示していない。ＣＳタンパク
の推定されたアミノ酸配列を、ヌクレオチド配列の下に
示す。Ｐ．ノウレシのＣＳタンパクに相同のタンパク領
域を、領域Ｉおよび領域IIと記した。反復単位に下線を
敷き、変異したアミノ酸を線で囲った。配列中のアンバ
ー末端コドンに星印を付した。また、図６は、最もよく
みられる反復アミノ酸配列の合成ペプチドによる抗ＣＳ
タンパクモノクローナル抗体、２Ｆ１．１の結合の阻害
を示すデータを提示する。長さが伸張した、最もよくみ
られる反復配列を含む合成ペプチドが調製され、Ｙ１０
８９中で増殖しているλｍＰｆ１の溶解物に対する、２
Ｆ１．１の結合を阻害するために利用された。データ
は、３回の平均±ＳＥとして表わされている。試験に用
いられた合成配列は、Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ
（−）、Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａ
ｓｎ−Ａｌａ（白丸、−）、Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−
Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａ
ｓｎ−Ａｌａ（白三角、−）、Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ
−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−
Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ
（×、−）、および１０分子のアミノ酸からなる無関係
のペプチド（黒丸、−）であった。
【００８１】また、図７において、領域Ｉは、Ｐ．ファ
ルシパルムのタンパクの反復部分にアミノ酸２分子が付
いて終わっている。Ｐ．ノウレシにおいては、この領域
の最後の３分子のアミノ酸は、タンパクの反復配列部分
の一部である。
【図面の簡単な説明】
【図１】制限酵素切断図およびクローンλｍＰｆ１の塩
基配列決定における手法を示す図。
【図２】Ｐ．ファルシパルムのＣＳタンパクの遺伝子に
対するヌクレチオド配列の一部を示す図。
【図３】Ｐ．ファルシパルムのＣＳタンパクの遺伝子に
対するヌクレチオド配列の一部であって、図２に続く部
分を示す図。
【図４】Ｐ．ファルシパルムのＣＳタンパクの遺伝子に
対するヌクレチオド配列の一部であって、図３に続く部
分を示す図。
【図５】Ｐ．ファルシパルムのＣＳタンパクの遺伝子に
対するヌクレチオド配列の一部であって、図４に続く部
分を示す図。
【図６】最もよくみられる反復アミノ酸配列の合成ペプ
チドによる、抗ＣＳタンパクモノクローナル抗体（２Ｆ
１．１）結合の阻害を表わすデータを示すグラフ図。
【図７】Ｐ．ファルシパルムおよびＰ．ノウレシのＣＳ
タンパク間の相同領域を表わす式を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ // Ｃ０７Ｋ 7/08 8318−4Ｈ 14/445 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:90） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:90） (72)発明者 ジャッキー・エル・ウイリアムス アメリカ合衆国、テキサス州 78234、エ フテイー・サム・ヒューストン、バークヘ ッド 171 (72)発明者 イモージン・シュナイダー アメリカ合衆国、メリーランド州 20879、 ゲイザースバーグ、ケイプハート・ドライ ブ 19046

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 マラリア病原虫と交差反応し、マラリア
    病原虫による感染に対して抵抗性を示す実質的に精製さ
    れた免疫的に活性な合成ペプチドであって、アミノ酸配
    列式Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓ−Ｔ−Ｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌ
    ｙｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｕ−Ｖ−Ｇｌｙ−Ｗ−Ｐｒｏ
    （ここで、ＳはＬｙｓまたはＡｓｎ、ＴはＨｉｓまたは
    Ｇｌｕ、ＵはＧｌｙまたはＡｓｎ、ＶはＡｓｐまたはＧ
    ｌｕ、およびＷはＡｓｎまたはＧｌｎを示す）を含む免
    疫的活性ペプチドをコードする実質的に純粋なＤＮＡ。
  2. 【請求項２】 マラリア病原虫と交差反応し、マラリア
    病原虫による感染に対して抵抗性を示す実質的に精製さ
    れた免疫的に活性な合成ペプチドであって、アミノ酸配
    列式Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓ−Ｔ−Ｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌ
    ｙｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｕ−Ｖ−Ｇｌｙ−Ｗ−Ｐｒｏ
    （ここで、ＳはＬｙｓまたはＡｓｎ、ＴはＨｉｓまたは
    Ｇｌｕ、ＵはＧｌｙまたはＡｓｎ、ＶはＡｓｐまたはＧ
    ｌｕ、およびＷはＡｓｎまたはＧｌｎを示す）を含む免
    疫的活性ペプチドをコードする実質的に純粋なＤＮＡ配
    列を含む組換えＤＮＡクローニングベクター。
  3. 【請求項３】 前記ベクターが、細菌若しくは酵母のプ
    ラスミドまたはバクテリオファージである請求項２記載
    のクローニングベクター。
  4. 【請求項４】 前記ベクターが、λｇｔ１１である請求
    項３記載のクローニングベクター。
  5. 【請求項５】 マラリア病原虫と交差反応し、マラリア
    病原虫による感染に対して抵抗性を示す実質的に精製さ
    れた免疫的に活性な合成ペプチドであって、アミノ酸配
    列式Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓ−Ｔ−Ｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌ
    ｙｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｕ−Ｖ−Ｇｌｙ−Ｗ−Ｐｒｏ
    （ここで、ＳはＬｙｓまたはＡｓｎ、ＴはＨｉｓまたは
    Ｇｌｕ、ＵはＧｌｙまたはＡｓｎ、ＶはＡｓｐまたはＧ
    ｌｕ、およびＷはＡｓｎまたはＧｌｎを示す）を含む免
    疫的活性ペプチドをコードする実質的に純粋なＤＮＡ配
    列を含む微生物であり、該ＤＮＡ配列が人工的に該微生
    物に取込まれ、該微生物は、マラリア病原虫と交差反応
    しマラリア病原虫による感染に対して抵抗性を示す免疫
    的に活性な合成ペプチドを発現し得るものである単細胞
    微生物。
  6. 【請求項６】 前記微生物が、ＡＴＣＣ ３９７３８、
    ＡＴＣＣ ３９７３９、ＡＴＣＣ ３９７４０、ＡＴＣ
    Ｃ ３９７４１、ＡＴＣＣ ３９７４２、ＡＴＣＣ ３
    ９７４３、またはＡＴＣＣ ３９７４４由来の微生物で
    ある請求項５記載の微生物。
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