FI99144C - Menetelmä Plasmodium falciparum -proteiinien valmistamiseksi geeniteknisesti ja siinä käyttökelpoisia tuotteita - Google Patents

Description

, 99144

Menetelmä Plasmodium falciparum -proteiinien valmistamiseksi geeniteknisesti ja siinä käyttökelpoisia tuotteita Tärkeä askel rokotteen kehittämiseksi malariaa vas-5 taan on suojäävien antigeenien identifioiminen. Suojäävinä pidetään yleensä sellaisia antigeenejä, jotka in vivo -kokeissa eläinmallilla, kuten esim. Saimiri- tai Aotus-api-noilla, ovat tuottaneet suojan suonensisäisesti istutetulle P. falciparum -infektiolle. Tähän mennessä on kuvattu 10 vain epätyydyttäviä suojakokeita ihmisellä, mutta useat eristetyt P. falciparum -proteiinit ovat osoittaneet täydellistä tai osittaista suojavaikutusta eläinmallilla. Tämä koskee sekä geelielektroforeettisesti puhdistettuja 75 - 100 kD:n proteiinifraktioita että geelielektroforeet-15 tisesti puhdistettuja proteiinivyöhykkeitä, joiden mole-kyylipainot ovat 200 kD ja 41 kD [L. H. Perrin et ai. (1984), Clin. exp. Immunol. 56, 67 - 72; L. H. Perrin et ai. (1985), J. Clin. Invest. 75, 1718 - 1721; W. A. Sid diqui et ai. (1987), Proc. Natl. Acad. Sei., USA 84, 20 3014 - 3018]. Tähän mennessä bioteknisesti valmistetuissa merotsoiiteille spesifisistä proteiineista ovat osoitta-. neet suojavaikutusta ns. RESA 155 kD:n merotsoiitti-prote- iinin "5'-repeat-alue" kuin myös 200 kD:n merotsoiitti-pintaesiproteiinin synteettinen oligopeptidi sekä proteii-·. 25 nien, joiden molekyylipainot ovat 35 kD, 55 kD ja 200 kD, synteettisen oligopeptidien yhdistelmä immunisointikokeis- • · •SS sa Saimiri- ja Aotus-apinoilla. Edellä mainittujen anti- :V: geenien geeniteknisesti valmistetut yhdistelmäproteiinit, joilla on suojavaikutus in vivo -kokeissa apinoilla, ovat :·. 30 potentiaalisia ehdokkaita malariarokotteiksi.

Tutkimusten päämääränä oli eristää L. Perrinin • · · (1985, edellä mainitussa julkaisussa) kuvaamia suojaavia : 41 kD:n antigeenivyöhykkeitä koodittavat sekvenssit, saat- taa sekvenssit ilmentymään ja testata ekspressiotuotteet , : 35 niiden suojaavan vaikutuksen suhteen apinamallilla. Spesi- 2 99144 fisen vasta-aineen avulla 41 kD:n antigeenivyöhykkeitä vastaan eristettiin genomisesta ekspressiopankista viisitoista kloonia ja selvitettiin niiden insertioiden rakenne. Kloonien 41-1 - 41-10 ja 41-12 - 41-15 sekä 41-17 sek-5 venssit on esitetty taulukoissa 1-15. Kahden immunologi-sesti hyvin intensiivisesti reagoivan kloonin (41-2 ja 41-7) avulla eristettiin seulontaan käytetystä seerumista monospesifisiä vasta-aineita. Nämä vasta-aineet reagoivat Western Blotissa spesifisesti 41 kD:n merotsoiitti-anti-10 geenin kanssa.

Kloonin 41-2 insertti-DNA:n kanssa hybridisoitui Southern Blotissa 3,0 ke:n EcoRI-fragmentti ja 2,0 kein Sau3A-fragmentti. Molemmat DNA-fragmentit eristettiin ja sekvensoiti in.

15 Sau3A-fragmentti sisältää 41-2-geenin täydellisen koodaavan alueen. Tämä ei sisällä introneita ja koodaa 184 aminohappoa, joiden molekyyliapino on 21 512 D. 41-2-pro-teiinissa on signaalisekvenssi ja kaksi muuta hydrofobista jaksoa. Toistuvia sekvenssiosia ei ole. Skitsonttiproteii-20 nien Western Blot -analyysi kanin antiseerumeilla, jotka oli valmistettu sellaista ekspressiotuotetta vastaan, joka . sisältää 70 % koodaavasta alueesta, antoi tulokseksi 29 - ... kD:n vyöhykkeen. Edelleen voitiin osoittaa Northern Blot - analyysiä käyttäen 1,6 kein mRNA.

*. 25 Kloonin 41-7 insertti-DNA koodaa sitä vastoin 41 - kD:n proteiinia. Kanin vasta-aineet, jotka valmistettiin • · 41-7in fuusioproteiinia vastaan, tunnistavat Western Βίοι]:]: tissa yksiselitteisesti 41 kdin vyöhykkeen. Seulomalla genominen lambda gtll EcoRI*-geenipankki 41-7-kloonin in-^ 30 sertti-DNA:lla voitiin identifioida klooni, joka sisältää 2,3 kein malariaspesifisen insertin. Tämä eristettiin ja • · · sekvensoitiin. Se sisältää koko 41 kD:n proteiinia koodaa-: van alueen. Geeni ei koodaa signaalisekvenssiä eikä sisäl- lä introneita eikä toistuvia jaksoja. P. falciparumin 41 -: 35 kD:n proteiinin johdettu aminohapposekvenssi on suuressa li 99144 3 määrin homologinen (> 60 %) imeväisten lihaksen ja maksan aldolaasien kanssa ja Trypanosoma brucein aldolaasin kanssa. Toisin kuin imeväisten genomissa voitiin P. falciparu-milla todeta vain yksi aldolaasigeeni genomia kohti Sout-5 hern Blot -analyysejä käyttäen.

Kloonit 41-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 17 todettiin niiden ristireaktiviivisuuteen perustuen antiseerumilla 41 kD:n proteiinivyöhykettä vastaan.

Ne soveltuvat rokotteen valmistukseen. Kloonien 41-1 - 41-10 5 sekä 41-7, 41-10 ja 41-1 insertti-DNA:t saatettiin il mentymään vektorissa pEX-31, ja saadut fuusioproteiinit puhdistettiin. Kolmen ekspressiotuotteen (41-1, 41-2 ja 41-3) yhdistelmän immunologisesti vaikuttava määrä suojaa Aotus-apinoita P. falciparum -infektiolla.

15 Keksintö koskee siis a) kloonien 41-1, 41-2, 41-3, 41-4, 41-5, 41-6, 41-7, 41-8, 41-9, 41-10, 41-12, 41-13, 41-14, 41-15, 41-17 ja 41-2gen puhdistettuja ja eristettyjä DNA-sekvenssejä mukaan lukien niiden transkriptiotuotteet, 20 b) nämä sekvenssit sisältäviä DNA-sekvenssejä ja vektoreita, . c) sellaisella DNA:11a transformoituja bakteeriso- ... luja, d) menetelmää Plasmodium falciparum -proteiinien *. .* 25 valmistamiseksi geeniteknisesti, ja e) menetelmää rokotteiden valmistamiseksi malariaa V.· vastaan.

: : : Tarkemmin sanottuna esillä oleva keksintö koskee • · menetelmää Plasmodium falciparum -proteiinien valmistami-;\§ 30 seksi, jolloin menetelmälle on tunnusomaista, että a) bakteeri-isäntäsolusysteemejä transformoidaan jäljempänä esitettyjen taulukoiden 1-17 mukaisilla sekvensseillä, b) bakteeri-isäntäsolusysteemejä viljellään sopi- ....: 35 vissa viljelyolosuhteissa ja • « 99144 4 c) ilmentymistuotteet eristetään.

Keksintö myös koskee DNA-sekvenssiä, joka on jokin taulukoissa 1-17 esitetyistä sekvensseistä, sekä RNA-sekvenssiä, joka vastaa edellä mainittua DNA-sekvenssiä.

5 Keksintö koskee lisäksi vektoria, joka sisältää mainittua DNA:ta, sekä bakteeri-isäntäsolusysteemiä, joka on transformoitu mainitulla DNA-sekvenssillä tai mainitulla vektorilla.

Keksintö koskee vielä menetelmää malariaa vastaan 10 käyttökelpoisen rokotteen valmistamiseksi, jolloin menetelmässä a) valmistetaan Plasmodium falciparum -proteiineja transformoimalla prokaryoottisia tai eukaryoottisia isän-täsysteemejä taulukoiden 1-17 mukaisilla sekvensseillä, 15 viljelemällä isäntäsysteemejä sopivissa viljelyolosuhteis sa ja eristämällä ilmentymistuotteet, ja b) yksi tai useampia kohdassa a) saatuja ilmen-tymistuotteita yhdistetään sopivaan adjuvanttiin.

Muut keksinnölle ominaiset piirteen on esitetty 20 seuraavissa esimerkeissä, taulukoissa ja patenttivaati muksissa.

Esimerkki 1

Lambda gtll-ekspressiopankin seulonta monospesifi-sellä anti-41 kD-vasta-aineella *♦ ·' 25 Genomisen lambda gtll -ekspressiopankin (valmistet- « · # *·Σ·* tu P. falciparum -kannan T996 DNA: st a) 10 PFU:ta (pague • « 5.V forming units) seulottiin vasta-aineella 41 kd:n antigee- I 4 V.* nivyöhykettä vastaan [L. H. Perrin et ai. (1985), edellä mainitussa julkaisussa], joka oli peräisin P. falciparum -30 kannasta SGE2, tunnettujen menetelmien mukaisesti [L. S.

Ozaki (1986), J. Immun. Method. 89, 213 - 219; Promega

Biotec (1986), Proto Blot Imrauno-screening System, Techni-cal Manual]. Detektiosysteeminä oli tällöin anti-kanin-IgG/alkalinen fosfataasi -konjugaatti (Promega, tilausnu-;··;· 35 mero P 3731) .

• · 5 9P144

Seulomalla genominen lambda gtll- geenipankki anti-seerumilla 41 kD:n proteiinivyöhykettä vastaan voitiin identifioida kaksi hyvin intensiivisesti reagoivaa kloonia (41-2 ja 41-7) sekä kolmetoista muuta, heikommin reagoivaa 5 kloonia (41-1, 41-3, 41-4, 41-5, 41-6, 41-8, 41-9, 41-10, 41-12, 41-13, 41-14, 41-15 ja 41-17) ja noin 40 muuta, hyvin heikosti reagoivaa kloonia. Viidentoista kloonin in-sertti-DNA:t, jotka olivat 140 - 650 ep:n kokoisia, pilkottiin EcorRI:llä ja kloonattiin jatkokarakterisointia 10 varten vektorin pUC8 EcoRI-paikkaan.

Esimerkki 2

Kloonien 41-1 - 41-10, 41-12 - 41-15 ja 41-17 in-serttifragmenttien sekvensointi

Insertti-DNA:n sekvensointi tapahtui dideoksimene-15 telmän mukaisesti alukkeen ja käänteisalukkeen avulla suoraan pUC8-plasmideissa (E. Y. Chen ja P. H. Seeburg (1985-), DNA 4, 165 - 170). Taulukoissa 1 - 5 on esitetty mala-riaspesifiset DNA-sekvenssit ja niistä johdetut kloonien 41-1, 41-2, 41-3, 41-4, 41-5, 41-6, 41-7, 41-8, 41-9, 41-20 10, 41-12, 41-13, 41-14, 41-15 ja 41-17 aminohapposekvens sit ainoissa mahdollisissa avoimissa lukukehyksissä. Näis-. sä 15 sekvenssijaksossa ei havaita mitään päällekkäisyyk siä tai homologioita. UWGCG-ohjelman (University of Wis-' consin, Genetic Computer Group) avulla tutkittiin nämä 15 *· ·’ 25 sekvenssiä homologisten sekvenssi jaksojen suhteen EMBL- *.:/ tietopankissa. Mitään näistä 15 osasekvenssistä tai suu- • * V.· remmistä homologisista jaksoista ei toistaiseksi ole ku- * *. ; vattu. Yksinomaan kloonin 41-10 sekvenssillä on nukleoti- a ·

dista 1 nukleotidiin 134 74-prosenttinen homologia 140 kD-30 :n proteiinin geenin osasekvenssin kanssa nukleotidista , 2144 nukleotidiin 2274, kuten patenttihakemuksessa DE-P

37 41 057 on ehdotettu. Kloonin 41-10 sekvenssi on myös : : ainoa, jossa on P. falciparum -proteiineille tyypillisiä toistuvia sekvenssi jaksoja. Tämän kloonin aminohapposek-: 35 venssissä on kolme sekvenssin Pro-Ser-Glu-Ser mukaista » I « * 99144 6 tetrapeptidiä, jolloin toisen toistuvan jakson toinen se-riiniryhmä, joka on G-A-transition aiheuttama, on korvattu asparagiiniryhmällä. Edelleen on kloonin 41-7 sekvenssillä nukleotidista 50 nukleotidiin 163 56-prosenttinen homolo-5 gia rotan aldolaasi-mRNA:n kanssa nukleotidista 218 nukleotidiin 331 [T. Mucai et ai. (1986), J. Biol. Chem. 261, 3347 - 3354].

Esimerkki 3 41 kD:n antigeenin osoittaminen spesifisten vasta-10 aineiden avulla ekspressioklooneja 41-2 ja 41-7 vastaan

Antiseerumeista 41 kD:n proteiini vyöhykettä vastaan eristettiin L. S. Osazin (1986, edellä mainitussa julkaisussa) menetelmän mukaisesti vasta-aineita, jotka ovat suuntautuneet spesifisesti ekspressiokloonien 41-1, 41-2, 15 41-3, 41-7, 41-8 tuotteita vastaan ja lambda gtll:ta (kontrolli) vastaan. Skitsonttimuotojen saamiseksi viljeltiin P. falciparumia ihmisen erytrosyyteissä [W. Trager ja J. B. Jensen (1976), Sience 193, 673 - 675) ja synkronointiin käsittelemällä sorbitolilla [C. Lambros ja J. P. Van-20 derberg (1979), J. Parasitol. 65, 418 - 420]. Skitsonttimuotojen rikastaminen n. 79 %:iin saavutettiin käyttäen rikastusta GelafundinR:ssä (Braun Melsungen) [analogisesti • ; G. Pasvol et ai.'n (1978), Ann. Trop. Med. Parasitol. 72, : ] : 87 - 88 mukaan]. Skitsontit sentrifugoitiin pois, pestiin, 25 pidettiin 5 min SDS-koepuskurissa 100 °C:ssa, käsiteltiin • · . .1. ultraäänellä ja syväjäähdytettiin annoksina.

♦ · ·

Skitsonttiliuosannoksia käytettiin edellä mainit- • « · *·’·' tujen spesifisten vasta-aineiden Western Blot -analyysei- • · · hin [D. A. Johnson et ai. (1984) Gene Anal. Tech. 1,3-30 8]. Tällöin vasta-aineet, jotka oli eristetty ekspressio- • · :kloonien 41-2 ja 41-7 avulla, reagoivat hyvin voimakkaasti V ' skitsonttimuodoista peräisin olevan 41 kD:n antigeenivyö- hykkeen kanssa.

· • 1 7 99144

Esimerkki 4

Kloonin 41-2 geneettisen informaation sisältävän DNA-sekvenssin kloonaus 15 μg P. falciparum -kannan FCBR genomista 5 DNA:ta, joka oli saatu hajottamalla skitsonttiviljelmät ja käyttäen sen jälkeistä etidiumbromidi-CsCl-sentrifugointia [P. Oquendo et ai. (1986) Molecular and Biochemical Parasitology 18, 89 - 101), hajotettiin restriktioentsyymillä EcoRI, blotattiin valmistajan ohjeen mukaisesti Gene 10 Screen -membraaneille (Dupont) ja hybridisoitiin sen jälkeen nikkitranslatoidun kloonin 41-2 insertti-DNA:n kanssa, jonka spesifinen aktiivisuus oli 107 - 101 2 dpm/jug. Fi-lttereiden pesun jälkeen 0,3 x SCC:llä (1 x SCC: 0,15 m NaCl, 0,015 M Na-sitraatti) ja l-%:isella SDSrllä (natri-15 umdodekyylisulfaatti) 65 °C:ssa 1 h tehtiin filttereistä autoradiogrammit. Tämän Southern Blot -kokeen avulla identifioitiin n. 3 ke:n suuruinen genominen EcoRI-fragmentti, joka hybridisoituu kloonin 41-2 insertti-DNA:n kanssa. Preparatiivisella geelil-20 lä, erotettiin 60 μg restriktioentsyymillä EcoRI pilkottua kannan FCBR P. falciparum -DNA:ta, alue 2,8 -3,2 ke leikattiin irti ja elektroeluoitiin (B. Perbal (1984), A Practical Guide to Molecular Cloning]. Tämä DNA kloonat-tiin T. W. Huynh et ai.'n [teoksessa DNA cloning Voi. I, :3: 25 toim. D. M. Glover (1985), 49 - 80] menetelmän mukaisesti • · ; vektoriin lambda gtlO. 105 pfu:ta saadusta geenipankista ·· 1 seulottiin kloonin 41-2 nikkitranslatoidulla insertti-DNA- • · · ♦ · :11a tunnettujen menetelmien mukaisesti [T. Maniatis et ai. (1982), Molecular Cloning, A Laboratory Manual]. Tästä .. 30 oli tuloksena useita faagiklooneja, jotka hybridisoituivat • · 1 kloonin 41-2 insertti-DNA:n kanssa. Yhden tällaisen kloo- • ♦ · 2 • « · 3

1 nin faagi-DNA eristettiin [R. W. Davis et ai. (1980) , A

i Manual For Genetic Engineering, Advanced Bacterial Gene- ties], ja hajotettiin restriktioentsyymillä EcoRI; 3,0 ke-* . 35 :n suuruinen DNA-fragmentti puhdistettiin geelielektrofo- 99144 8 reettisesti ja jatkokloonattiin vektorin pUC18 EcoRI-rest-riktiopaikkaan (plasmidi pUC 41-2gen). Sitä seuraavassa Southern Blot -analyysissä (T. Maniatis et ai., edellä mainitussa julkaisussa) hybridisoitui tämä pUC 41-2gen:n 5 3,0 ke:n EcoRI-DNA fragmentti kloonin 41-2 insertti-DNA:n kanssa.

Esimerkki 5

Kloonin pUC 41-2gen sekvenssianalyysi Plasmidi-DNA pUC 41-2gen sekvensoitiin EcoRI-reuna-10 paikkojen alukkeen ja käänteisalukkeen avulla [E. Y. Chen and P. H. Seeburg (1985), edellä mainitussa julkaisussa]. Tästä voitiin määrittää 3,0 ke:n EcoRI-fragmentin päissä kulloinkin noin 250 emästä. Yhden tällaisen pään sekvenssi on tällöin identtinen kloonin 41-2 insertti-DNA:n kanssa.

15 Restriktiokartan valmistamiseksi inkuboitiin kulloinkin

0,5 μg eristettyä 3,0 ke:n EcoRI-DNA-fragmenttia eri rest-riktioentsyymien kanssa, erotettiin geelielektroforeetti-sesti, blotattiin nitroselluloosalle ja hybridisoitiin kloonin 41-2 nikkitranslatoidun insertti-DNA:n kanssa tun-20 nettujen menetelmien mukaisesti (T. Maniatis, edellä mainitussa julkaisussa) . Hybridisoituvien restriktiofragment-tien koon perusteella voitiin päätellä eri restriktiokat-kaisukohtien poistuminen EcoRI-katkaisukohdaksi, joka on yhteinen klooneille 41-2 ja pUC 41-2gen. Lähtien siten ai-25 kaansaadusta restriktiokartasta eristettiin kloonin pUC

• · . 41-2gen restriktiofragmentit ja jatkokloonattiin sekven- • * « sointia varten faagivektoreihin M13mpl8 ja M12mpl9 [F.

• · ·

Sanger et ai. (1977), Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 74, 5463 - • · · 5467]. Sekvenssi määritettiin tällöin lähtien geenille .. 30 ominaisesta EcoRI-restriktiokohdasta geenin 5'-pään suun- • taan Dral-restriktiokatkaisukohtaan saakka. Taulukossa 16 ··· • · · *.* * on esitetty tämän 1230 ep:tä käsittävän Dral-EcoRI-frag- • mentin DNA-sekvenssi ja johdettu aminohapposekvenssi. Sek- ,··*. venssi paikasta 1036 paikkaan 1228 on identtinen 41-2:n •. 35 insertti-DNA:n kanssa. Koska kloonin 41-2 sekvenssi ja • · · 99144 9 kloonin pUC 41-2gen genominen sekvenssi ovat peräisin eri P. falciparum-kannoista (kanta T996 on peräisin Thaimaasta ja kanta FCBR Kolumbiasta), näyttää ainakin tämä geenijak-so olevan erittäin hyvin säilynyt. Tämän sekvenssin avoin 5 lukukehys alkaa paikasta 784 ATG-aloituskodonilla ja päättyy TTC-kodoniin, joka kuuluu geenin sisäiselle EcoRI-res-triktiokatkaisukohdalle. Tämä osa koodaa proteiinin 149 N-terminaalista aminohappoa. Tämän geenin osasekvenssissä ei ole toistuvia sekvenssiosia. Johdettu aminohapposekvenssi 10 alkaa sekvenssijaksolla, jossa on 18 aminohappoa, joista 4 on happamia ja 5 emäksisiä. Tätä sekvenssijaksoa seuraa 11 ryhmästä muodostuva hydrofobinen osa, jota suojaavat molemmin puolin happamet aminohapporyhmät. Tämä hydrofobinen alue voisi toimia signaalisekvenssinä. Emäksisiä ja happa-15 mia aminohappoja käsittävä alue ennen tätä oletettua sig-naalisekvenssiä on suhteellisen pitkä; yhtä pitkiä alueita on kuvattu myös muille P. falciparum -proteiineille [T. Triglia et ai. (1987), The EMBO Journal 6, 1413 - 1419]. Johdettu aminohapposekvenssi tutkittiin UWGCG-ohjelman 20 avulla hydrofobisilta alueilta ja pinta-alueilta sekä mahdollisilta immunogeenisilta epitooppialueilta. Tällöin havaittiin proteiinin kolme hydrofiilistä aluetta, joita koodaavat paikkojen 890 - 907, 1079 - 1093 ja 1151 - 1168 : : nukleotidisekvenssit. Geenin 5'-ei-koodaavalla alueella on 25 erittäin runsaasti AT:tä (AT-pitoisuus = 88,8 %) , kuten on • · ; kuvattu myös muille P. falciparum -geeneille [J. L. Weber «· « (1987) Gene 52, 103 -109] ja sillä on jokaisessa kolmessa lukukehyksessä kulloinkin yli 15 lopetuskodonia. Edelleen • · m on paikassa 274 mahdollinen CAAT-lokero, 64 nukleotidia .. 30 eteenpäin myötäsuuntaan sijaitsee mahdollinen TATA-lokero.

« · Nämä rakenteet voisivat spesifioida mahdollisen promootto- • · · '·’ * rialueen tälle geenille.

i : 10 $S';44

Esimerkki 6 41-2:n täydellisen geenin eristäminen Kloonin 41-2 sekvenssianalyysi antoi tulokseksi Sau3A-katkaisukohdan, joka on 947 ep:n etäisyydellä 5 EcoRI-katkaisukohdasta. Käyttäen genomista Southern

Blot -analyysiä identifioitiin 2,0 ke:n suuruinen Sau3A-fragmentti, joka hybridisoituu kloonin 41-2 insertti-DNA:n kanssa (vrt. esimerkki 4) . Siten tuli tällä Sau3A-fragmen-tilla olla 3'-suunnassa EcoRI-paikasta noin yli 1050 ep:tä 10 41-2 geenin geneettistä informaatiota. Preparatiivisella geelillä erotettiin 60 μg restriktioentsyymillä Sau3A pilkottua kannan FBCR DNA:ta ja eristettiin 1,8 - 2,2 ke:n DNA-fragmentteja. Tämä DNA kloonattiin valmistajan (Stra-tagene) antamien ohjeiden mukaisesti vektorin lambda ZAP 15 Xhol-paikkaan. 105 pfu:ta tätä geenipankkia seulottiin kloonin 41-2 nikkitranslatoidulla insertti-DNA:11a ja noin 40 faagikloonia identifioitiin (vrt. esimerkki 4). Yhdestä näistä faagiklooneista eristettiin käyttäen automaattista eksisiota Stratagenen menetelmän mukaisesti Blueskript-20 vektori (pSK'41-2gen). Käyttäen tämän plasmidi-DNA:n rest-riktiota Kpnl:llä ja EcoRI:llä voitiin eristää kaksi DNA-fragmenttia, 905 ep:n ja 1050 ep:n fragmentit, joista 950 ep:n fragmentti hybridisoitui Southern Blotissa kloonin 41-2 insertti-DNA:n kanssa. Plasmidi-DNA pSK'41-2 sekven-25 soitiin alukkeen ja käänteisalukkeen avulla (E. Y. Chen ja • · . P. H. Seeburg (1985) edellä mainitussa julkaisussa]. Sek- • ·· venssi, joka sekvensoitiin alukkeen avulla, oli identtinen • · « plasmidin pUC 41-2gen insertti-DNA: n sekvenssin kanssa • · «

Sau3A-paikasta lähtien 3'-suuntaan. Plasmidin pSK‘41-2gen .. 30 EcoRI-DNA-fragmentti jatkokloonattiin vektorin pSK+ EcoRI- • · paikkaan (T. Maniatis et ai., edellä mainitussa julkaisus- • · · * * ’ sa). Tästä DNA-fragmentista tehtiin restriktiokartta. Läh tien tästä jatkokloonattiin restriktiofragmentit Bluesc-ript-vektoreihin ja sekvensoitiin ssDNA:n valmistuksen 35 jälkeen. (Käyttöohje, Stratagene.) Sekvenssi määritettiin X1 99'44 tällöin geenin 41-2 EcoRI-restriktiopaikasta 3'-suuntaan Sau3A-kohtaan saakka täydellisesti. Taulukossa 17 on esitetty jatkona taulukolle 16 tämän 1050 ep:tä käsittävän kloonin pSK'41-2gen EcoRI-Sau3A-DNA-fragmentin DNA-sekvens-5 si ja johdettu aminohapposekvenssi. Tämä geenijakso koodaa lisäksi ainoastaan 35 muuta aminohappoa, kunnes TAG-lope-tuskodoni tulee vastaan. Geenin 3'-ei-koodaava alue sisältää erittäin runsaasti AT:tä (AT-pitoisuus = 84,7 %) ja sisältää jokaisessa kolmessa lukukehyksessä kulloinkin yli 10 11 lopetuskodonia. Sl-Mapping-menetelmä [F. M. Ausubel et ai. (1987), Current Protocols in Molecular Biology, Harvard Medical School, Boston] ei antanut tulokseksi mitään viitteitä tämän geenin introni-eksoni-rakenteesta. Sen jälkeen havaittiin käyttäen Northern Blot -analyysiä (T.

15 Maniatis et ai., edellä mainitussa julkaisussa) 1,6 ke:n suuruinen skitsonttivaiheen mRNA. Täten täytyy olettaa, että 41-2 geenillä on vain yksi ainoa koodaava 552 ep:n jakso (AT-pitoisuus +73 %). Tämä koodittaa 21 512 dalto-nin antigeeniä, jossa on signaalisekvenssi (vrt. esimerkki 20 5), mutta ei toistuvia jaksoja. Tällä antigeenillä on sig- naalisekvenssin ohella kaksi muuta hydrofobista jaksoa aminohappopositioissa 73-85 ja 130-147, joilla on mahdol-lisesti funktio membraanikiinnitymisessä.

:Esimerkki 7 25 Kloonien 41-1 - 41-5 sekä 41-7, 41-10 ja 41-12 in- • · . serttien ilmentyminen vektorissa pEX31 .·.·. Kloonien 41-1 - 41-5, 41-7, 71-10 ja 41-14 insert- • · « tifragmetit eristettiin restriktion jälkeen EcoRI:llä gee- • · · lielektroforeettisesti, liitettiin defosforyloituihin, .. 30 restriktioentsyymillä EcoRI pilkottuihin vektoreihin • · pEX31b [K. Strebel et ai. (1986) Journal of Virology 57, * * ’ 983 - 991] ja transformoitiin kompetentteihin, plasmidin pCI857 sisältäviin [F. Remaut et ai. (1981), Gene 15, 81 -i"; 93] C600-bakteereihin. Yksittäiset pesäkkeet tutkittiin • 35 SDS-PAGE:n avulla plasmideille spesifisten DNA-sekvenssien i2 99144 ilmentymisen suhteen MS2-polymeraasifuusioproteiineina. Induktio tapahtui kohottamalla lämpötilaa H. Kupper et ai.'n menetelmän mukaan [teoksesssa Y. Ideda and T. Beppu (toim.) Proceedings of the Fourth International Symposium 5 on Genetics of Industrial Mikroorganisms (1982), Kyoto Kodansha Ltd., Tokio). Kaikki kahdeksan fragmenttia voitiin saattaa ilmentymään saannon ollessa hyvä.

Esimerkki 8

Ekspressiotuotteiden puhdistus 10 Transformoituja bakteeriviljelmiä ravisteltiin voi makkaasti kulloinkin 1 l:ssa LB-alustaa, jossa oli 50 -Mg/ml ampisilliinia ja 25 Mg/ml kanamysiiniä, 28 °C:ssa 20 h. Kun oli lisätty neljä litraa 42 °C:seen lämmitettyä LB-alustaa, ravisteltiin uudelleen 4 h 42 °C:ssa. Baktee-15 rit sentrifugoitiin pois, suspendoitiin uudelleen 200 ml:-aan fosfaattipuskuroitua keittosuolaliuosta (PBS) ja liuotettiin mekaanisesti. Liukoiset proteiinit erotettiin sen-trifugoimalla, ja sedimentit, jotka sisälsivät ekspressio-tuotteet, pestiin sen jälkeen, kun ne oli pesty kaksi ker-20 taa peräkkäin PBS:llä, nousevia virtsa-ainepitoisuuksia käyttäen (1 M - noin 5 M), kunnes fuusioproteiinit menivät liuokseen. Sen jälkeen dialysoitiin käyttäen laskevia virtsa-ainepitoisuuksia siihen virtsa-ainepitoisuuteen : : saakka, joka riitti pitämään ekspressiotuotteet liuokses- 25 sa. Tällä menetelmällä päästiin 60 - 80 %:n puhtausastee- • # . ·*· seen.

• · · ··♦ .*.·. Esimerkki 9 • * · • ·

Antigeenin, jota koodittaa 41-2gen, osoittaminen • · · Käyttäen kanin antiseerumia, joka oli suunnattu .. 30 kloonin 41-2 ekspressiotuotetta vastaan, Western Blotilla • e • '* ei ollut osoitettavissa malaria-antigeenia skitsonttipro- • t · • * * telineillä yksiselitteisesti. Sen vuoksi oli ilmennettävä suurempi geenin 41-2 DNA-fragmentti. Sitä varten eristet-tiin restriktioentsyymien AluI ja EcoRI avulla 41-2 geenin • . 35 388 ep:n fragmentti, joka sisältää 70 % koodaavasta alu- • · » „ 99144 eesta. Tämä jatkokloonattiin plasmidin pUC18 Sma-I ja Eco-RI-paikkoihin. Tästä plasmidista eristettiin restriktio-entsyymin EcoRI-avulla 401 ep:n fragmentti ja kloonattiin vektorin pEX31b EcoRI-paikkaan. Transformaation jälkeen 5 voitiin identifioida bakteeripesäkkeet, jotka ilmentävät 26 kD:n fuusioproteiinia (vrt. esimerkki 7). Tämä puhdistettiin (vrt. esimerkki 8) ja käytettiin kanin immunisoi-miseen. Vasta-aineet tunnistavat Western Blotissa skit-sonttiproteiineilla 29 kD:n antigeenin, jota geeni 41-2 10 koodaa. Lasketun 22 kD:n molekyylipainon ja SDS-polyaktyy-liamidigeeleillä saadun 29 kD:n molekyylipainon ero voidaan selittää sekundaarimodifikaation avulla. Siten proteiinissa on asparagiiniryhmässä paikkassa 166 N-glykosy-lointipaikka. Se, että klooni 41-2 koodittaa erittäin 15 pientä antigeeniä, vahvistettiin myös käyttäen Northern Blot -analyysiä. Siten havaittiin P. falciparumin skit-sonttivaiheessa 1,6 ke:n mRNA, joka hybridisoitui kloonin 41-2 insertti-DNA:n kanssa. Northern Blot -analyysi suoritettiin tunnettujen menetelmien mukaisesti (T. Maniatis 20 et ai., edellä mainitussa julkaisussa).

Esimerkki 10

Muiden kloonien antigeenien määritys

Vasta-aineita kloonien 41-1, 41-3, 41-4, 41-5, 41-7 : : ja 41-10 puhdistettuja fuusioproteiineja vastaan käytet- 25 tiin vastaavien antigeenien identifioimiseksi skitsontti- m m ; proteiineilla Western Blot -analyysiä käyttäen. Tällöin ei ·« · ollut mahdollista identifioida yksiselitteisesti vasta-aineita kloonien 41-1, 41-3 ja 41-4 fuusioproteiineja vas- • · · taan. Kloonin 41-5 insertti-DNA voidaan rinnastaa 96 kD:n 1 antigeeniin. P. falciparumin 96 kD:n kolmoisryhmä on ku- e · ·* " vattu [H. Jouin et ai. (1987) Inf. Imm. 55, 1387 - 1392].

: : * Vasta-aineet, jotka ovat suuntautuneet kloonin 41-10 eks- pressiotuotetta vastaan, tunnistavat kaksi 113 ja 140 kD:n antigeeniä. Reaktio 113 kD:n antigeenin kanssa identifioi-• 35 tiin ristireaktiona SERPI-antigeenin kanssa (vrt. esimerk- 99144 14 ki 2), joka on identtinen suojaavan antigeenin kanssa. 41-10 koodaa siten P. falciparumin 140 kD:n proteiinia.

Yhteistä kaikille näille geeneille on, että niiden koodaamat antigeenit ja niiden osat reagoivat seerumin 5 kanssa, joka on suunnattu suojaavasti vaikuttavaa 41 kD:n proteiiniviivaa vastaan. Ainoastaan klooni 41-7, joka reagoi kloonin 41-2 ohella voimakkaammin 41 kD:n proteiini-viivaa vastaan suunnatun antiseerumin kanssa, voidaan osoittaa yksiselitteisesti 41 kD:n proteiiniksi.

10 Vasta-aineet, jotka on suunnattu kloonin 41-7 fuu- sioproteiinia vastaan, tunnistavat Western Blotissa skit-sonttiproteiinilla yksiselitteisesti 41 kD:n proteiinivii-van, joka tunnetaan myös lähtöseerumista. Tämä klooni näyttää siten koodittavan 41 kD:n antigeenin osafragment-15 tia. Se, että tutkituissa klooneissa on eri geenien osasekvenssejä, varmistettiin klooneilla 41-1, 41-2, 41-3, 41-7, 41-10, 41-14 ja 41-15 myös käyttäen Southern Blot -analyysejä.

Esimerkki 11 20 Genomisen lambda gtll geenipankin valmistus 2 Mg:aa P. falciparum -kannan FCBR DNA:ta inkuboi- tiin yli yön 37 °C:ssa 14 yksikön kanssa restriktioentsyy- miä EcoRI liuoksessa, jossa oli 10 mM Tris-HCl:ää (pH - 7,5), 10 mM MgCl2:ta, 1 mM ditiotreitolia ja 40 % glyse- ·'"· 25 riiniä, ja erotettiin geelielektroforeettisesti. Näissä « « .olosuhteissa restriktioentsyymillä EcoRI on "tähti”-aktii-« · · *·. visuus, mitä kautta muodostuu DNA-fragmentteja 50 ep:stä ♦ · * ! * 10 kep:hen. DNA-alue 500 ep:n ja 7 kep:n välillä elektro- • · - eluoitiin ja kloonattiin T. V. Huynh et ai.'n (1985; DNA 30 Cloning, Voi. I, a practical approach, toim. D. M. Glover) m * ' *” menetelmän mukaan vektoriin lambda gtll. Valmistettiin 5 x ‘ :ί 105 yhdistelmäfaagikloonin geenipankki, joka monistettiin.

i : • · „ 99144

Esimerkki 12

Geenin 41-7 eristäminen ja sekvensointi

Koska klooni 41-7 koodaa tosiasiassa 41 kD:n proteiinin osafragmenttia (vrt. esimerkki 10), piti eristää 5 täydellinen geeni. Sitä varten seulottiin genominen lambda gtll EcoRI -geenipankki (vrt. esimerkki 11) tunnettujen menetelmien mukaisesti (T. Maniatis et ai., edellä mainitussa julkaisussa) kloonin 41-7 nikkitranslatoidulla in-sertti-DNA:11a. siitä saatiin tulokseksi kolme lambda gtll 10 kloonia, joista voitiin eristää restriktioentyymien EcoRI ja Sali avulla 3,3 ke:n suuruinen insertti. Insertin mala-riaspesifinen osa oli 2,3 ke:tä. Tästä DNA-fragmentista valmistettiin restriktiokartta. Lähtien tästä kloonattiin alafragmentteja sekvenssointia varten Bluescript-vektorei-15 hin (Stratagene). Tämän 2,3 ke:n suuruinen malariaspesifi-sen fragmentin täydellinen DNA-sekvenssi voitiin selvittää. Taulukossa 18 on esitetty geenin 41-7 DNA-sekvenssi ja siitä johdettu aminohapposekvenssi. Geenissä ei ole intronia. 5'-ei-koodittavalta alueelta havaittiin 525 20 emäsparia (AT-pitoisuus = 84,2 %) ja 3'-ei-koodittavalta alueelta 772 emäsparia (AT-pitoisuus = 84,2 %). Keskinäinen jakso muodostuu 1086 emäsparista (AT-pitoisuus = 64,4 %) ja koodittaa 362 aminohappoa. Tämän geenin lasket-tu molekyylipaino 39 314 D sopii hyvin yhteen geelielekt-25 roforeettisesti havaitun 41 kD:n molekyylipainon kanssa.

• · . .·. Tämä geeni kopioituu 2,4 ke:n kokoiseksi mRNA:ksi, mikä ·.·. havaittiin käyttäen Northern Blot -analyysiä tunnettujen * · « !! menetelmien mukaisesti (T. Maniatis et ai., edellä maini- : ;: * * tussa julkaisussa). Käyttäen Southern Blot -analyysiä 1 2 3 4 5 6 (vrt. esimerkki 4) voitiin todeta, että on olemassa vain • · « ** yksi tämän geenin kopio P. falciparum -genomia kohti. Sitä 2 • · · 3 V : paitsi havaittiin, että tämä geeni on säilynyt eri P. fal- 4 • ciparum -kannoissa (FCBR Kolumbiasta, Palo Aito Ugandasta, 5 SGE2 Zairesta, ItG2G, Brasiliasta ja FVOR Vietnamista). Sen 6 lisäksi on kloonin malariaspesifinen DNA-sekvnessi (kanta 16 - 99144 T996 Thaimaasta) identtinen FCBR-kannasta eristetyn geenin osasekvenssin kanssa paikasta 464 paikkaan 729. Klooni 41-7 koodaa siten 41 kD:n proteiinin 88 N-terminaalista aminohappoa .

5 Johdettujen aminohapposekvenssien perusteella on ilmeistä, että 41 kD:n proteiinilla ei ole signaalisek-venssiä eikä repetitiivisiä jaksoja. UWGCG-ohjelman (University of Wisconsin, Genetic Computer Group) avulla tutkittiin tämä aminohapposekvenssi homologisten proteii-10 nien suhteen NBRF-proteiinitietopankissa. Tällöin havaittiin, että 41 kD:n proteiini on 66-%:isesti homologinen ihmisen maksan aldolaasin suhteen [M. Mukai et ai., (1985), Nucleic Acid Res, 13, 5055 - 5069], 66-%:isesti rotan maksan aldolaasin kanssa [K. Tsutsami et ai. (1984) 15 j. Biol. Chem. 259, 14 572 - 14 575], 68-%:isesti homologinen kanista peräisin olevan lihaksen aldolaasin kanssa (D. R. Tolan et ai. (1984), J. Biol. Chem. 259, 1127 - 1131] ja 61-%:isesti homologinen Trypanosoma bruceista peräisin olevan aldolaasin kanssa [C. E. Clayton (1985) 20 EMBO J. 4, 2997 - 3003]. 41 kD:n proteiini näyttää siten olevan P. falciparum -aldolaasi.

Esimerkki 13

Suojakoe eläinmallia käyttäen: Aotus lemurinus :griseimembran (karyotyyppi VI) immunisoiminen « « < 25 Tämä koe suoritettiin kuvattujen ekspressiotuottei- « · . den tehon testaamiseksi koskien suojaavan immuniteetin • · · • ·· ·.·. indusoitumista P. falciparumille herkillä apinoilla. Koe- S « i X rokotteena oli immunologisesti voimakkaasti reagoivien $ · · * * kloonien 41-1, 41-2 ja 41-3 ekspressiotuotteiden yhdistel- 1 2 3 4 5 6 li mä.

2 ·« • · 3 • *" 1. Koejärjestely 4 ··· 5 ; : : Kuusi edellä mainittuun lajiin kuuluvaa Aotus-api- naa (ruumiinpaino 1000 - 1500 g, urospuolisia ja naaras-·. puolisia eläimiä, jotka olivat peräisin Behringwerke AG:n 6 eläintallista) valittiin sattumanvaraisesti ja jaettiin 99144 17 kahteen ryhmään, kuhunkin 3 eläintä.

Kloonien 41-1, 41-2 ja 41-3 fuusioproteiineja liuotettiin PBS:ssä 3 M virtsa-aineeseen PBS:ssä ja sekoitettiin 1:1:1 (loppukonsentraatio: 300 μg proteiinia/ml). 3 5 eläintä immunisoitiin 3 viikon välein 3 x kulloinkin 1 ml:11a kombinoituja fuusioproteiineja ihonalaisesti. Ad-juvanttina antigeenille oli 10-%:inen seos, jossa oli 50 % AI(OH)3/45 % lesitiiniä/5 % saponiinia.

Infektiokontrolliryhmän 3 eläintä saivat samoin 10 edellä esitetyn suunnitelman mukaan injektion 3 M virtsa-ainetta PBS:ssä + ajduvanttia ilman antigeenikomponenttia.

Mahdollisimman samanvahvuisen kokeellisen P. Falciparum -infektion tuottamiseksi eläimille, poistettiin kaikilta apinoilta perna kahdeksan päivää viimeisen immu-15 nisaation jälkeen (kohonnut herkkyys).

67. päivänä 1. rokotuksen jälkeen infektoitiin kaikki 6 eläintä 5 x 106 parasitoidulla lymfosyytillä suonen sisäisesti. Altistuskannaksi valittiin P. falciparum Palo Aito (Uganda), joka adaptoituu in vitro Aotus-erytro-20 syytteihin, siirrettiin luovuttajaeläimeltä (4-%:inen parasitemia) , jolta oli poistettu perna, suoraan koe-eläi-mille. Tälle kannalle on ominaista korkea infektiokyky . ’· verrattuna muihin P. falciparum -isolaatteihin. Sitä pait- si on mielenkiintoista todeta, että tämä kanta on hetero-25 loginen verrattuna immunosointiantigeenin saamiseksi käy- « · . tettyyn kantaan T996 (Thaimaa) alkuperän ja serotyypin suhteen.

V.7 ! 1. Koko tutkimuksen ajan [ennen ja jälkeen immunisoin- S · t nin sekä testiannoksen (altistus) jälkeen] tutkittiin fy-30 siologiset, parasitologiset, serologiset ja kliinis-ke- • 1 ; 2 mialliset parametrit säännöllisesti.

·1· V7 2. Tulokset ; . ' Koko immunisointivaiheen kestäessä mitkään tutkitut ·· fysiologiset (kliininen kuva, lämpötila, paino) ja klii- * 35 nis-kemialliset parametrit (erytrosyytit, hematokriitti, 2 « · ' - 99144 18 lasko, seerumin entsyymit GPT ja GOT) eivät osoittaneet patologisia muutoksia. Muut farmakologiset tutkimukset (akuutti subkutaaninen toksisuus hiirellä, paikallinen siedettävyys apinalla eurooppalaisen farmakopean mukaises-5 ti) osoittavat käytetyn rokotevalmisteen olevan riittävän varma ja siedetty.

2.1. Loisverisyys Pääparametri indusoidun suojan arvioimiseksi on parasittejä sisältävien erytrosyyttien mikroskooppinen 10 osoittaminen koe-eläimen perifeerisessä veressä.

Jo 7-10. päivänä infektion jälkeen voitiin immu-nisoimattomien eläinten Giemsa-värjätyssä veren sivelyval-misteessa osoittaa yksittäisiä parasiitteja sisältäviä erytrosyyttejä (vähemmän kuin 1 promille). Immunisoiduilla 15 eläimillä ilmeni hidastunut parasiittien esiintyminen 10 - 15. päivänä p.i., ne saavuttivat maksimaalisen 1 - 2 %:n loisverisyyden ja infektio pysyi hallinnassa spontaanisti. Yksi eläin kuoli väliintulevaan keuhkokuumeeseen.

Kun yhdellä immunisoimattomaan ryhmään kuuluvista 20 eläimistä 4,5 %:n maksimaalinen loisverisyys pysyi hallinnassa itsestään, täytyi molempia muita eläimiä hoitaa > 10 %:n parasitemian saavuttamisen jälkeen MefloquinR: llä (Hoffmann La Roche) tappavan infektion kulun estämiseksi. Altistuskanta Palo Aito osoittautui edeltävissä infektio- ; ; 25 kokeissa klorokiinille resistentiksi.

• « . ·'« Kuvio 1 esittää vasemmalla loisverisyyden kulun vf * jV. Aotus-apinoilla immunisoinnin jälkeen yhdistelmärokotteel- la, joka muodostui kloonien 41-1, 41-2 ja 41-3 fuusiopro- t ♦ # telineistä, oikealla kontrolleilla (immunisoimattomat , 30 eläimet).

s ·..

«4f « · · ♦ Ψ ·

• i I

I

4 • t I i • « · i · t i, . 99144

Kloonin 41-1 malariaspesifisen DNA-insertin nukleotidi- sekvenssi ja johdettu aminohapposekvenssi TAULUKKO 1 19 5 10 30 50

T AAAATCTTT ATGT ATTTTT AAACAAAGAAAT AAAAAGGTAAGGTCATCAAAT AATTCAT LvsSerLeuCysI lePheLysGlnArgAsnLysLysVal AroSerSerAsnAsnSerS

70 90 110

CTTTCTT AATTGATTTT A6AAACTCACAT ACGAAT AATATCAAT ATGTTAACAGAAAATC erPheLeuI leAspPheAraAsr.SerHisThrAsnAsnl leAsnhetLeuThrGluAsnG

10 130 150 170

AAAAGTTT AAT AATGT ATTATTGAATAAAGAAftTTCAGATGGATGAAAATCAGGAACGTG lnLyEPheAsnAsnValLeuLeuAsnLysGluI leGlnMetAspGluAsnGlnGluArgG

190 210 230 AATTTTCAATTGATGATTGTTTAATGAACTGCCTGAAACATAATGCATCTAATTTAAAAA 1 uPheSerl1eAspAspCvsLeuMetAsnCysLeuLvsHisAsnAlsSerAsnteuLvsT 15 250 . 270 290

CCAATGAAGATTATGAAA6AT ATTGTAATGAAGACAAAATATTGAATCCAGATT AT AAGC hrAsnGluAspTyrGluArgTyrCysAsnGluAspLvsl leLeuAsr.ProAspTyrLveP

310 330 350

CTTCAGAATCTAGAAAACTGGGAGAAAAATTTTTGCAAAAAAGTCAAAAGGAATTATATT 2 q roSerG1uSerArgLvsLeuG1yG1uLysPheLeuG1nLysSerG1nLysG1uLeuTvrT

370

ATTCTTATGC

yrSerTyr • » • · ··· • · · ♦ · « · • · « · · « · · ·· · • · • · « • · « • m • «

• I I

• · · • · ·« • · • · · • * 20 - 99144 TAULUKKO 2

Kloonin 41-2 malariaspesifisen DNA-insertin nukleotidi-sekvenssi ja johdettu aminohapposekvenssi 10 30 50

5 AACATGTGTGGAAATATTTATTTCAGCATTCATCTGATTTACTTAAATCTCAAGATAGTA HisValTrpLysTyrLeuPheGlnHisSerSerAspLeuLeuLysSerGlnAspSerT

70 90 110

TTTATGAGTATATGATATGTGATAAAAATATTTTATTAAATAAATTTATAAATGTACCAA leTyrGluTyrrtetlleCysAspLysAsnlleLeuLeuAsnLysPhelleAsnValProL

130 150 170

10 AAGATTATGGAAATATAAATTGTGCTGCCTTTGCAGCAGGTATTGTTGAAGGCTTCCTCT ysAspTyrGlyAsnlleAsnCysAlaAlaPheAlaAlaGlylleValGluGlyPheLeuC

190 GTAGTT CTGAATTC ysSerSerGluPhe 15 TAULUKKO 3

Kloonin 41-3 malariaspesifisen DNA-insertin nukleotidi-sekvenssi ja johdettu aminohapposekvenssi 10 30 50

CAGTAAAAATTTTAAAAAAAAAGAAAAATTTAAGAAAAATAAAGGAAACCACTGATGAAG 20 ValLyslleLeuLysLysLysLysAsnLeuArgLysIleLysGluThrTh rAspGluG

70 90 110

AGAAAACTTCÄGATAATGTTTCTCAAATGTATGAAAGAAAAGGTGGACCATTACCACCAC luLysThrSerAspAsnValSerGlnrtetTyrGluArgLysGlyGlyProLeuProProP

130 CCGAACTTAGAAAACA roGluLeuArgLys ' ·· · £ «3 * · · TAULUKKO 4

Kloonin 41-4 malariaspesif isen DNA-insertin nukleotidi- • · 's/· sekvenssi ja johdettu aminohapposekvenssi • · · ***· 30 10 30 50

GTATAC CTGAATTTTTAGGACAATATCATAATGTT CCC CATGTATTCAAAGATTATATGA

;·. HeProGluPheLeuGlyGlnTyrHisAsnValProHisValPheLysAspTyrMetS

• ·· 1 90 110

GTTCCAATGATTTTATAAGTGGTATAAATAATATAAATGAATCAGATGCTCTTTTTAATA

: ’erSerAsnAspPhelleSerGlylleAsnAsnlleAsnGluSerAspAlaLeuPheAsnA • · · .*·. 35 130 150 .

ACATACAATATATAAAC CAAGCGAATGAC CAAGAAGAAAACAAATT snlleGlnTyrlleAsnGlnAlaAsnAspGlnGluGluAsnLys 2i - 99144 TAULUKKO 5

Kloonin 41-5 malariaspesifisen DNA-insertin nukleotidi-sekvenssi ja johdetut aminohapposekvenssit 5 10 30 50

TGTTTGATAATAGTGATTTTATTAAATCAATAATGGATTCTAATAAACAATTAAAAAAGT PheAspAsnSe rAspPhe 11 eLysSe r 11 erte tAspSe rAsnLysGlnLeuLysLysL

70 90 110 TAAGAGAACAAAATTCTGATTTAAATCATATTTTAAATGATTCTCAGACTTTAAAACAAT euArgGluGlnAsnSerAspLeuAsnHisIleLeuAsnAspSerGlnThrLeuLysGlnS

10 130 150 170

CTTTTGAAATGATTAAGAATCCATCTTTGATGAAAGAATTAATGAAAAATACTGATAGAG

erPheGluMetlleLysAsnProSerLeurtetLysGluLeuMetLysAsnThrAspArgA

190 CTATTAGTAATATTGAAGC CATAC C lalleSerAsnlleGluAlalle 15 TAULUKKO 6

Kloonin 41-6 malariaspesifisen DNA-insertin nukleotidi-sekvenssi ja johdettu aminohapposekvenssi 20 10 30 50

TCGTTGTCCTTTCCTTTGGTGATAAACGCAATGAGATAAAACAAAAAATTGACACGTTTT ValValLeuSerPheGlyAspLysArgAsnGluIleLysGlnLysIleAspThrPheC

70 90 110

GTGGTGTAAGTAATGAAGAAAAGGAGAAACTAAAGGAACAATGGAAATGCTATGAAGCTA __ ysGlyValSerAsnGluGluLysGluLysLeuLysGluGlnTrpLysCysTyrGluAlaL

O 130 150

. AATATGTAAAGGAAGATAATAAAAGTAAAG

ysTyrValLysGluAspAsnLysSerLys * 1 • 1 • « • · • · · • · · • · • · · 22 - 99 1 44 TAULUKKO 7

Kloonin 41-7 malariaspesifisen DNA-insertin nukleotidi-sekvenssi ja johdettu aminohapposekvenssi _ 10 30 50

3 TGAATGCCCCAAAAAAATTACCAGCAGATGTTGCCGAAGAATTAGCAACCACCGCCCAAA AsnAlaProLysLysLeuProAlaAspvalAlaGluGluLeuAlaThrTh rAlaGlnL

70 90 110

AGCTTGTTCAAGCTGGAAAGGGAATTTTAGCTGCTGATGAATCAACACAAACCATTAAGA ysLeuValGlnAlaGlyLysGlylleLeuAlaAlaAspGluSerThrGlnThrlleLysL

10 130 150 170

AAAGATTCGACAACATCAAATTAGAGAACACAATAGAAAACAGAGCTAGCTACAGAGATT

ysArgPheAspAsnlleLysLeuGluAsnThrlleGluAsnArgAlaSerTyrArgAspL

190 210 230

TATTATTTGGAACTAAAGGATTAGGAAAATTCATTTCAGGAGCAATTTTATTTGAAGAAA euLeuPheGlyThrLysGlyLeuGlyLysPhelleSerGlyAlalleLeuPheGluGluT

15 250

CATTATTTCAAAAGAATGAAGCCGGT

hrLeuPheGlnLysAsnGluAlaGly TAULUKKO 8

Kloonin 41-8 malariaspesifisen DNA-insertin nukleotidi-20 sekvenssi ja johdettu aminohapposekvenssi 10 30 50

TAACATTTTCTGTAGATACAAAACAAAATTTAAATGCATCTTATTCTAGTGGACAAGAAA ·; ThrPheSerValAspThrLysGlnAsnLeuAsnAlaSerTyrSerSerGlyGlnGluA

C: 25 70 90 110

. ATAAACAAAATGAATCTGATGGAAAAGAAAATGAAGAAGATGAAGAAAATAAGGTATATG

*· ·1 snLysGlnAsnGluSerAspGlyLysGluAsnGluGluAspGluGluAsnLysValTyrA

• % « « · 130 150 170

i·. ATTTAATACTGGAAAATATAGAACCTAACAAAAAAATACCCATCATAAAAATCGTTAAAG

’ 1 spLeuIleLeuGluAsnlleGluProAsnLysLyslleProIlelleLyslleValLysG

• · 30 190 210 230

AAATAAAAAAAGATCTTAATTTAAAACAAGCAAAGGATTTAGTTGATAATTTGCCACA

luIleLysLysAspLeuAsnLeuLysGlnAlaLysAspLeuValAspAsnLeuPro ·

Kloonin 41-9 malariasepsifisen DNA-insertin nukleotidisek- venssi ja johdettu aminohapposekvenssi TAULUKKO 9 23 99144 - 10 30 50

AAAATAAAAATTATACAGGTAATTCTCCAAGTGAAAATAATAAGAAAGTTAACGAAGCTT

AsnLysAsnTyrThrGlyAsnSerProSerGluAsnAsnLysLysValAsnGluAlaL

70 90 110

TAAAATCTTACGAAAATTTTCTCCCAGAAGCAAAAGTTACAACAGTTGTAACTCCACCTC euLysSerTyrGluAsnPheLeuProGluAlaLysValThrThrValValThrProProG

,0 130 150 170

AACCAGATGTAACTCCATCTCCATTATCTGTAAGGGTAAGTGGTAGTTCAGGATCCACAA

InProAspValThrProSerProLeuSerValArgValSerGlySerSerGlySerThrL

190 210 230

AAGAAGAAACACAAATACCAACTTCAGGCTCTTTATTAACAGAATTACAACAAGTAGTAC ysGluGluThrGlnlleProThrSerGlySerLeuLeuThrGluLeuGlnGlnValValG

15 250 270 290

AATCACAAAATTATGACGAAGAAGATGATTCCTTAGTTGTATTACCCATTTTTGGAGAAT

InSerGinAsnTyrAspGluGluAspAspSerLeuValValLeuProIlePheGiyGiuS

310 330 350

CCGAAGATAATGACGAATATTTAGATCAAGTAGTAACTGGAGAAGCAATATCTGTCACAA erGluAspAsnAspGluTyrLeuAspGlnValValThrGlyGluAlalleSerValThrM

20 370 390

TGGATAATATCCTCTCAGGATTTGAAAATGAATATGA

etAspAsnlleLeuSerGlyPheGluAsnGluTyr TAULUKKO 10

Kloonin 41-10 malariaspesifisen DNA-insertin nukleotidi- 25 sekvenssi ja johdettu aminohapposekvenssi : 10 30 50

; AATCTCATTCTGACGAAAATATTGTAACTTTACAAGGAAAACTTAGAAATACAGCTATCT

SerHisSerAspGluAsnlleValThrLeuGlnGlyLysLeuArgAsnThrAlalleC 1 90 110

GTATAAAGAATGTTGATGAATGGATATTAAATAAAAGAGGTCTAACATTACCTAGTGAAT ysIleLysAsnValAspGluTrpIleLeuAsnLysArgGlyLeuThrLeuProSerGluS

• · 130 150 CAC CTAATGAATCAC CTAGTGAATCAGATAGTTAT C TTAA erProAsnGluSerProSerGluSerAspSerTyrLeu TAULUKKO 11

Kloonin 41-12 malariaspeisifisen DNA-insertin nukleotidi- sekvenssi ja johdettu aminohapposekvenssi 24 99144 5 10 30 50

ATGAAGGAGAAGAATTAATATTAAATGATGATCAAAATAAATTACATATTGATACATTTG

GluGlyGluGluLeuXleLeuAsnAspAspGlnAsnLysLeuHislleAspThrPheG

70 90 110

AAAAATACAAATATCTCATTTGTGAAAATATTAATAATGACAAATTTGTTATAAAAAATA luLysTyrLysTyrLeuileCysGluAsnlleAsnAsnAspLysPheVallleLysAsnA

10 130 150 170 ATCAAATTACAACATTTGAAAACTTTTTGAAAAAC CAACAAAATTTTGAAATAA snGlnlleThrThrPheGluAsnPheLeuLysAsnGlnGlnAsnPheGluIle i

« I

« • 4 ««« t«« e « c t « r • · · • ♦ ♦ M · « ♦ • « » « « 4 • · • r « 4 * » f · • * * · • · 4 ·· e f « « • · 4 « 4 « · * # # - 99144 25 TAULUKKO 12

Kloonin 41-13 malariaspesifisen insertin nukleotidi-sekvenssi ja johdettu aminohapposekvenssi 5 20 40 60

TAAATAATGAAAATATGGATAAACAAAATGTTAATATTCAAAATGAAGGTAATGGTTTTA

AsnAsnGluAsnrtetAspLysGlnAsnValAsnlleGlnAsnGluGlyAsnGlyPheA

80 100 120

ATAATAATAAAAATAATAATGATCTTTTAAATGTTTATATATCAC CTAATATGATTAAT C snAsziAsnLysAsnAsnAsnAspLeuLeuAsnValTyrlleSerProAsnMetlleAsnH

10 140 160 180

ATTCTTTATCTTCAACTTGTGAAAAAAAAAATAAAGAAGATAACAAAATGAATGACAATA

isSerLeuSerSerThrCysGluLysLysAsnLysGluAspAsnLysMetAsnAspAsnL

200 220 240

AATTTCTTAATAGCAGTAGTAAAATGAAAATTCCAGAGATAAGTACGAACAACTCAAATG ysPheLeuAsnSerSerSerLysMetLysIleProGluIleSerThrAsnAsnSerAsnG

15 260 280 300

AAAAGATTGTTAATGTGTCAAATGATGAAATGTTAGTATATCATAATTTAACCGTATTAA

luLysIleValAsnValSerAsnAspGluMetLeuValTyrHisAsnLeuThrValLeuA

320 340 360

ATGTAAAGGAACAAGGAGGTGTAACAGAAGAATCGAGCTGTATAAAACGCACATATTTTG snValLysGluGlnGlyGlyValThrGluGluSerSerCysIleLysArgThrTyrPheV

20 380 400 420

TGGATCAATTTTATGATTCATATAATATGAGAAATGAAAAAATAACAGATGATAATATGC

alAspGlnPheTyrAspSerTyrAsnrtetArgAsnGluLysIleThrAspAspAsnMetG

440 460 480

1 AAGTAGAAGATATATATAATGTAAAGGAAAATATAAAAAGAACTCTAAAAGGTGATGGTC

InValGluAspIleTyrAsnValLysGluAsnXieLysArgThrLeuLysGlyAspGlyP 1 2 3 4 5 6 500 520 540 2

CTGATGATGTCAAAACGAATATGCTGAGTGAAGATAATAGTTATGCAAGTGGTTTATGGG

3

. roAspAspValLysThrAsnhetLeuSerGluAspAsnSerTyrAlaSerGlyLeuTrpG

4 * · · 560 580 600 5

GTAACGAAATAAACTTTATTAGTAATAATGAAAATTGTTTAAATAGCTATGATATATCAT lyAsnGluIleAsnPhelleSerAsnAsnGluAsnCysLeuAsnSerTyrAspIleSerC

6 620 640 GTGATGAGAAATATATCCCAAATGAAGAGGAACAGGA *..** ysAspGluLysTyrlleProAsnGluGluGluGln 26 99144 TAULUKKO 13

Kloonin 41-14 malariaspesifisen insertin nukleotidi-sekvenssi ja johdettu aminohapposekvenssi 5 10 30 50

ACAACAATATGAACAGAATAAATAGTTTAAACAATAAAAATAATATTAAC C CTATAAATC AsnAsnMetAsnArglleAsnSerLeuAsnAsnLysAsnAsnlleAsnProIleAsnG

. 70 90 110

AATACAATGATGAAAAACAAAACTTACTTAACGNCCATCTTCAGTYCAATCAAGTAAATT InTyrAsnAspGluLysGinAsnLeuLeuAsnXxxHisLeuGinXxxAsnGinValAsnT

10 130 150 170 ATNATAATAACCTTGTGAATGGCYTTCATANAANNAAATTTTTAAGCAATAATAATTATA yrXxxAsnAsnLeuValAsnGlyXxxHisXxxXxxLysPheLeuSerAsnAsnAsnTyrl 190 210 230

TTAATACTACAGATATTAATGGAAATAATATGATTAGTCATAATGATCATATGAATAATA leAsnThrThrAspIleAsnGlyAsnAsnMetlleSerHisAsnAspHisMe tAsnAsnL

15 250 270 290

AATTATACAGTAATATAAACAATAATTATTATTATAATAGGGCTAACAATGAAATTCCTA ysLeuTyrSerAsnlleAsnAsnAsnTyrTyrTyrAsnArgAlaAsnAsnGluIleProA

310 330 350 ATAATAATAGTAACAATCATAATAATAATTTCAATATATATGAATCCAAATACCAAACCA snAsnAsnSerAsnAsnHisAsnAsnAsnPheAsnlleTyrGluSerLysTyrGlnThrh 20 370 390 410

TGATTCATAACAACAACATAGGACAAGATCTAAAACAACAAATAAATAATTATAATGAAA etlleHisAsnAsnAsnlleGlyGlnAspLeuLysGlnGlnlleAsnAsnTyrAsnGluA

. 430 450 470

ATACATCTTCTAATAATAATTTAAGTATATCTCAATTACTTGAGGGAAATACAAATTTTA

snThrSerSerAsnAsnAsnLeuSerlleSerGlnLeuLeuGluGlyAsnThrAsnPhel ··· 2 5 :***: 490 510 530 '

'1 TAAATATTTCTAATACATTTATTAATACGAATTATTCTAATGATTTTCATCA

leAsnlleSerAsnThrPhelleAsnThrAsnTyrSerAsnAspPheHis « ♦ · · • ♦ « • « ♦ · • · · ♦ · · « · 1 ♦ « ♦ • · ♦ 27 99144 TAULUKKO 14

Kloonin 41-15 malariaspesifisen insertin nukleotidi-sekvenssi ja johdettu aminohapposekvenssi 5 10 30 50

ACAGCAACAACAATAATAATAATAATAATAATATTAGTAATAATATTAGTAATAATAAAG

SerAsnAsnAsnAsnAsnAsnAsnAsnAsnlleSerAsnAsnlleSerAsnAsnLysA

.70 90 110

ATTGTGATGAATACGATTATCAGGAAGAATATTTGAAAGATAAAGCATTATACGATTCAG spCysAspGluTyrAspTyrGlnGluGluTyrLeuLysAspLysAlaLeuTyrAspSerA

10 130 150 170

ATATGGACGAAAATACAAATCAACTTCACAATAATGAACATCATACAAATCAACATCACG spMe tAspGluAsnThrAsnGlnLeuHi sAsnAsnGluHi sHi sThrAsnGlnHi sHi sA

190 210 230

CAAATTGGCATCATCACAAACATCAAAAGCAACATTTCAAACAACTTATTGATCATAACA laAsnTrpHisHisHisLysHisGlnLysGlnHisPheLysGlnLeuIleAspHisAsnA

15 250 270

ATATGATAAATAATAATGATAATAATATTATCAATAA

snrtetlleAsnAsnAsnAspAsnAsnllelleAsn TAULUKKO 15

Kloonin 41-17 malariaspesifisen insertin nukleotidi- 20 sekvenssi ja johdettu aminohapposekvenssi 20 40 60

. GCACTGCCACCCTTGTTGCGGAAGAATTGCACCAGCTCGGCTATTCACTGGCGCTGGGTC

• ThrAlaThrLeuValAlaGluGluLeuHisGlnLeuGlyTyrSerLeuAlaLeuGlyA

25 80 100 : gcgaagtagttaatGaaagtagccggatgggattacctgatgaattc '1 rgGluValValAsnGluSerSerArgMetGlyLeuProAspGluPhe m 1 m « · · • · · • « · m 9 • 1 • · « • · · • « 2 * * 2 · « · • · · 28 . 99 1 44 TAULUKKO 16 P. falciparum -geenin (isolaatti FCBR), joka määritellään kloonin 41-2 insertin avulla, 5'-pään nukleotidisekvenssi ja johdettu aminohapposekvenssi 5 10 30 50

TTTAAAAATTTTATAAATAATTTTTCTCTTTTATATTTAATACATCTATAAGTATATATG

70 90 110

TAATAATTTGATACACAAGAAATGTGTATTTTTAATATATATATATATATATATATATAT

130 150 170

1 o ATATATATATATATATATATATATATATATATGATATATATAAATATATACATTTATTTA

190 210 230

TTCCATAATTTATTAAAAATAAATTTATATATTTTATTTTATTTTTTATTTATTTATTTG

250 270 290

TATATATTAAATCTTTTCAATGGAATAAAATTCAATCGGATCGTTATATAAACTTTATTA

15 310 - 330 350

TATCAAATAAAACACTTTTTATAATAATACGAAAAATATATTTCCTTATTTTTATGTTTT

370 390 410

CAAAATTTTAGTAGACTTATAATATTATTATGGATAACATTAACAAATAAAAATATTATG

430 450 470

AGTATAATATGTAAATTATTTTTTTTTTTTTACAGTTTATATGTTTATGAACATATAATG

20 490 510 530

TGATAAATAAAATTGATTAATTATTATTATATATAATTACTCTTGTAATTTATTAAAATG

550 570 590

GTATATTATATATATATATATAATTTTTTTTATATTATTTGAATAAAAATATTAAATAAA

610 630 650

25 AATTTTGTGTTTGGGTAAATCATAATAAGTGCTAACGTTCATAATTTATCTCATTAAAAA

··· • ♦ * *· 670 690 710

ATAGAAATGAAATATAATATTTACGACAGTACATATATATATATGTATATTATTAAAAAA

• · :.V 730 750 770

. AAATAAAAATAACACATATATATATATATATATATATATATTGATAATATATATGTTTTA

• · * 30 790 810 830

AGTATGGATAAATCAAAAAGTTCCATAGAGAAAGAATTAAATAGGATAAAACAGGATGTG

: *·* MetAspLysSerLysSerSerlleGluLysGluLeuAsnArglleLysGlnAspVal 850 870 890 AGCTTAAGCGCATTTAGTATCCTCTTTAGTGAAATGGTACAATATTGTTTATATAAAAGT : : SerLeuSerAlaPheSerlleLeuPheSerGluMetValGlnTyrCysLeuTyrLysSer '* ·’* 35 910 930 950

AAAAGAGGATATCGAATAGAAGATTGTTTACATGAAATGGGTTTACGTGTAGGTTATAAA

LysArgGlyTyrArglleGluAspCysLeuHisGluMetGlyLeuArgValGlyTyrLys I; TAULUKKO 16 (jatkuu) 29 99144 970 990 1010 TTAAATGAATATTTAACATATAAGAATAAAGTGAAAAGAAGCATAAATATTATTAATATT 5 LeuAsnGluTyrLeuThrTyrLysAsnLysValLysArgSerlleAsnIlelleAsnIle 1030 1050 1070 TTAACATTCATATCTAAACATGTGTGGAAATATTTATTTCAGCATTCATCTGATTTACTT LeuThrPhelleSerLysHisValTrpLysTyrLeuPheGlnHisSerSerAspLeuLeu 1090 1110 1130 AAATCTCAAGATAGTATTTATGAGTATATGATATGTGATAAAAATATTTTATTAAATAAA 10 LysSerGlnAspSerlleTyrGluTyrMetlleCysAspLysAsnlleLeuLeuAsnLys 1150 1170 1190 TTTATAAATGTACCAAAAGATTATGGAAATATAAATTGTGCTGCCTTTGCAGCAGGTATT PhelleAsnValProLysAspTyrGlyAsnlleAsnCysAlaAlaPheAlaAlaGlylle 1210 1230 GTTGAAGGCTTCCTCTGTAGTTCTGAATTC 15 ValGluGlyPheLeuCysSerSerGluPhe • · • · ··· ··· • · • · • · « • · * • · « ·· · m · • · · * · · • · • m « · · » w * • · • · « · • ·· » · · * · 30 99144 TAULUKKO 17 P. falciparum -geenin (isolaatti FCBR), joka määritellään kloonin 41-2 insertin avulla), 3'-pään nukleotidisekvenssi ja johdettu aminohapposekvenssi 5 1240 1260 12Θ0 GAATTCCAAGCAGATGTTACAGCGCACACTATTCATGAAGGCGATGATAATTATAACACT GluPheGlnAlaAspValThrAlaHisThrlleHisGluGlyAspAspAsnTyrAsnThr 1300 1320 1340

ACTATTTTTATTAAATTTTATCCGGAAGTAGTGGAAAGAGAAAAAAACCACTAGATATTC

10 ThrllePhelleLysPheTyrProGluValValGluArgGluLysAsnHis 1360 1380 1400

ATATAAGGGTCACACAATAAATATATATATATAATACATGTTGTATAAGTTGTCAAAAAA

1420 1440 1460

TTTATATGGAAAAAAATAAATTAAATATGTAAATATATATATATATATATATATATATAT

15 1480 1500 1520

TCTTTCTTTCTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTGTTATTATTAATGTATTATTTATCCTTATG

1540 1560 1580

CATGGGATTATTTAACAAATTTATTGATAAAATAAATGTACCCCTTTTTTTTTTTTCTTT

1600 1620 1640

TTTTT CTTTTTTTTTTTTTTGTATAAACATATTTATATATATTTATATTTAATTAAAC CT

1660 1680 1700

TTTTTAACATTTTAAATCTATATGAAATAATAAATGAAGACATGACTATTTTAATACAAG

1720 1740 1760

GAAATTAATGG TT C CTTAAATTTCACATAAAAAAAAAAATAAAACATATAATATATATAT

25 1780 1800 1820

ATATATATATAAAACACTTGGTTCTAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAA

4 « ^ 1840 1860 . 1880

TTTGTATGGAGATATTATAATATTTAAACAATATATATGACATATATAGAGGACATACTG

1900 1920 1940

TTACCAATATTTTCAATACATTGTTGGAATTTTTTATTTTTTCATATATCATACATAAGA

30 1960 1980 2000

CCTTCTGGAAAAGAAAAAAGTAATAAAGTGTCTTATATACTATTAATTTTGAATATAGAT

i * 2020 2040 2060

TTTTTTTCTTTTCTTTCAAAATTAAAAAGTATTCTATCAATGTATGTAAAATATATAATT

« · 2080 . 2100 2120

35 TTACTTTTTTTTTGTTCTTTTTTCTATTTTTAAATACGTATGTCCTCGTTTTTTTTTTTT

« · « · * I * TAULUKKO 17 (j atkuu) 31 99144 2140 2160 2180 ctttttataacattattttgcatattccaaattttttctatgtgtccaaaaaaaaaaaaa 5 2200 2220 22-40

AAAAAAATAAAGTGTTAATAAAAAAATTAAATAATATATGTGAAGATACTTTTTTTAATA

2260

TG CATATGTATATATATTTATATATATAGAT C

• · * * · φ * • · · • · · m m i · « * • · · • · · * iV: « · * * • · * * · · • · * · 9 · « · · Φ ·. 9 *

I » I

* · » » * I · « # · 99144 32 TAULUKKO 18 P. falciparumin 41 kD:n proteiinin nukleotidisekvenssi ja johdettu aminohapposekvenssi 10 30 50 5 aattttttttttgaatattctttttagcatttgatataatattattttgaaaatggtaag 70 90 110 aatataaaacatttaagaaataaataaaagtacagtgtttatatataccgtataaatgäa 130 150 170

TAAGTGTATATATATATATATATATTAAATACATTTATATTATTAATTTATACCAATGCA

10 190 210 230

TAGTTATATATATATATACTATTATATATGTATTCATTTTATTCTGCTCACATTATTTAT

250 270 290

GCATATGCTTCCTTTATAATAAATATATTCGTATTAACATTCAAGAAATGAGGACGAAAT

310 330 350

ATTCCTTAATTTACATATGTATTTTTTTATTAATTGAAAAAAAAAAAAAAATAGTAAAAA

15 370 390 410

TAAGTATAGGCATATATTGAATAATGTGCTGTTGAATTGATTTATATATATATATATATA

430 450 470

TATATGTATATTTATTTATATTTATACATATGGGAATATTATATATTTTCCTTTTTTCTT

490 510 530

2 0 ATTTTTATATTTTTATATTTTTTTTTAGGCTCATTGCACTGATATATGAATGCCCCAAAA

MetAsnAlaProLys 550 570 590 AAATTACCAGCAGATGTTGCCGAAGAATTAGCAACCACCGCCCAAAAGCTTGTTCAAGCT LysLeuProAlaAspValAlaGluGluLeuAlaThrThrAlaGlnLysLeuValGlnAla 610 630 650 -

25 GGAAAGGGAATTTTAGCTGCTGATGAATCAACACAAACCATTAAGAAAAGATTCGACAAC

GlyLysGlylleLeuAlaAlaAspGluSerThrGlnThrlleLysLysÄrgPheAspAsn 670 690 710 ATCAAATTAGAGAACACAATAGAAAACAGAGCTAGCTACAGAGATTTATTATTTGGAACT IleLysLeuGluAsnThrlleGluAsnArgAlaSerTyrArgAspLeuLeuPheGlyThr _n 730 750 770

υ AAAGGATTAG GAAAATT CATTT CAGGAG CAATTTTATTTG AAGAAA CATTATTT CAAAAG

LysGlyLeuGlyLysPhelleSerGlyAlalleLeuFheGluGluThrLeuPheGlnLys ' I t 790 810. 830

AATGAAGCCGGTGTACCAATGGTTAATTTATTACACAATGAAAATATAATTCCAGGTATT

, AsnGluAlaGlyValProMetValAsnLeuLeuHisAsnGluAsnllelleProGlylle

, I I

!·! 35 850 870 890

1 AAGGTTGATAAAGGTTTGGTTAACATTCCATGCACAGATGAAGAAAAATCAACTCAAGGT

‘ . LysValAspLysGlyLeuValAsnlleProCysThrAspGluGluLysSerThrGlnGly t 1 « « « · TAULUKKO 18 (jatkuu) 33 99144 910 930 950

TTAGATGGATTAGCAGAAAGATGCAAAGAGTATTATAAAGCTGGTGCAAGGTTTGCTAAA

5 LeuAspGlyLeuAlaGluArgCysLysGluTyrTyrLysAlaGlyAlaArgPheAlaLys 970 990 1010 TGGAGAACAGTTTTAGTTATTGACACAGCCAAAGGAAAACCAACTGATTTATCAATTCAC TrpArgThrValLeuVallleAspThrAlaLysGlyLysProThrAspLeuSerlleHis 1030 1050 1070 GAAACTGCATGGGGATTGGCTAGATATGCATCTATTTGTCAACAAAATAGATTAGTTCCA 10 GluThrAlaTrpGlyLeuAlaArgTyrAlaSerlleCysGlnGlnAsnArgLeuValPro 1090 1110 1130 ATTGTTGAACCTGAAATTTTAGCTGATGGACCACACTCAATTGAAGTTTGTGCAGTTGTA IleValGluProGluIleLeuAlaAspGlyProHisSer IleGluValCysAlaValVal 1150 1170 1190 ACTCAAAAAGTTTTATCATGTGTATTTAAAGCTTTACAAGAAAATGGTGTATTATTAGAA 15 ThrGlnLysValLeuSerCysValPheLysAlaLeuGlnGluAsnGlyValLeuLeuGlu 1210 1230 1250 GGTGCATTGTTAAAACCAAACATGGTTACTGCTGGTTATGAATGTACTGCTAAAACCACT GlyAlaLeuLeuLysProAsnMetValThrAlaGlyTyrGluCysThrAlaLysThrThr 1270 1290 1310 ACTCAAGATGTTGGTTTCTTAACTGTCAGAACCTTAAGGAGAACTGTACCACCAGCCTTA 20 ThrGlnAspValGlyPheLeuThrValArgThrLeuArgArgThrValProProAlaLeu 1330 1350 1370 CCAGGTGTTGTATTTTTATCTGGAGGACAATCAGAAGAAGAGGCTTCTGTTAATTTAAAT ·"· ProGlyValValPheLeuSerGlyGlyGlnSerGluGluGluAlaSerValAsnLeuAsn 1390 1410 1430 TCAATCAATGCTTTGGGTCCACACCCATGGGCTTTAACCTTCTCTTACGGTAGAGCTTTA *. .1 25 SerlleAsnAlaLeuGlyProHisProTrpAlaLeuThrPheSerTyrGlyArgAlaLeu « · · 1450 1470 1490

'· .v CAAGCTTCAGTATTGAACACATGGCAAGGAAAGAAAGAAAATGTTGCAAAGGCAAGAGAA

GlnAlaSerValLeuAsnThrTrpGlnGlyLysLysGluAsnValAlaLysAlaArgGlu • · · 1510 1530 1550

. 30 GTTTTATTACAAAGAGCTGAAGCCAACTCCTTAGCAACTTATGGTAAATACAAAGGAGGT

ValLeuLeuGlnArgAlaGluAlaAsnSerLeuAlaThrTyrGlyLysTyrLysGlyGly 0: 1570 1590 1610

GCAGGTGGTGAAAATGCAGGTGCTTCATTATATGAAAAGAAATATGTCTATTAAAAACTT

AlaGlyGlyGluAsnAlaGlyAlaSerLeuTyrGluLysLysTyrValTyr 1630 1650 1670

35 CACCAACCAAAAATGAATAATAATAATAATAAATAAATTACTAAATGAATGGTACTATAT

! . 1690 1710 1730

TTTTAAAAATAAGGGTAATATATTTCTGTATGTATATATATATATATATATATACAAATA

TAULUKKO 18 (jatkuu) 34 99144 1750 1770 1790

TGTGAATATAAAAAAAAAAAAAAAATGTAATATATATCGATCAATGTATATCTACGATAT

5 1810 1830 1850

ATAAATATATATTTATT CATAT CTC C CTTTTTTAGATGATATATTATAATAC CTAAAATT

1870 1890 1910

ATATATATTTATTTATTATTATTTTATTTATTTAATAATTTTTTTTTATTAGTAAATGAT

1930 1950 1970

10 AATAAATTTTTTAAACGTTTTTTCAACGTTTTATTAAATGTGTAAATATAAATATAAATA

1990 2010 2030

TTATATATATATATATATATATATGTATGTATTTATTTATTTATTTATATATACATACAT

2050 2070 2090

ACCTGTTGACATTCATGTAATATAATAAAGGAACACATGCTTATTTTGTATTATATATCT

15 2110 2130 2150

TACCTTCTACTTTTTAATAAAAAATGTCAAAGCAGGAAATAAAAACTTTTTAATTTAACC

2170 2190 2210

AAAAAAATATAATTAATGATGTACACTTATAGATATTGATACAAGAAAAACATTATATAT

2230 -2250 2270

2 q GTTTTTTTTTTCTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAATTATAACAAAAAATATTTATTA

2290 2310 2330

TAATATATAATTTTAAATGAATGATG CAAATTTAATGAG C CATTTTATTTATATTTTAAA

2350 2370

TAATTATAATAATAACGTACATATATAAAATGGTGATTGAATT

• · · «· · • · • « • · • · • « · 1 · · • · · • · ·

Claims (10)

99144 Patentt ivaat imukset

1. Menetelmä Plasmodium falciparum -proteiinien valmistamiseksi, tunnettu siitä, että 5 a) bakteeri-isäntäsolusysteemejä transformoidaan taulukoiden 1-17 mukaisilla sekvensseillä, b) bakteeri-isäntäsolusysteemejä viljellään sopivissa viljelyolosuhteissa ja c) ilmentymistuotteet eristetään.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään kloonien 41-1, 41-2, 41-3, 41-4, 41-5, 41-6, 41-7, 41-8, 41-9, 41-10, 41-12, 41-13, 41-14, 41-15, 41-17 ja 41-2gen sekvenssejä.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että käytetään kloonien 41-1, 41-2 tai 41-3 sekvenssejä.

4. DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se on jokin taulukoissa 1-17 esitetyistä sekvensseistä.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen DNA-sekvenssi, 20 tunnettu siitä, että se on kloonin 41-1, 41-2, 41-3, 41-4, 41-5, 41-6, 41-7, 41-8, 41-9, 41-10, 41-12, 41-13, 41-14, 41-15, 41-17 tai 41-2gen sekvenssi.

• ’’ 6. RNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se vastaa DNA-sekvenssiä, joka on jokin taulukoissa 1-17 : 25 esitetyistä sekvensseistä.

• 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen RNA-sekvenssi, ··· tunnettu siitä, että se vastaa DNA-sekvenssiä, « · · joka on kloonin 41-1, 41-2, 41-3, 41-4, 41-5, 41-6, 41-7, • · · 41-8, 41-9, 41-10, 41-12, 41-13, 41-14, 41-15, 41-17 tai • .. 30 41-2gen sekvenssi.

• · • 8. Vektori, tunnettu siitä, että se sisäl- ·«« ' 9 m · · tää patenttivaatimuksen 4 tai 5 mukaista DNA:ta.

9. Bakteeri-isäntäsolusysteemi, tunnettu siitä, että se on transformoitu patenttivaatimuksen 4 tai « · « • . 35 5 mukaisella DNA-sekvenssillä tai patenttivaatimuksen 8 mukaisella vektorilla. 99144

10. Menetelmä malariaa vastaan käyttökelpoisen rokotteen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) valmistetaan Plasmodium falciparum -proteiineja transformoimalla prokaryoottisia tai eukaryoottisia isän- 5 täsysteemejä taulukoiden 1-17 mukaisilla sekvensseillä, viljelemällä isäntäsysteemejä sopivissa viljelyolosuhteissa ja eristämällä ilmentymistuotteet, b) yksi tai useampia kohdassa a) saatuja ilmen-tymistuotteita yhdistetään sopivaan adjuvanttiin. • · • · • · · • · · ·« · • · • · · • · · • · • · • · · • · · • · • ♦ ♦ · • · · • · · • · · 37 99144