PT89363B

PT89363B - Processo para a preparacao de sequencias de dna especificas da malaria, dos seus produtos de expressao e de meios de diagnostico que os contem

Info

Publication number: PT89363B
Application number: PT89363A
Authority: PT
Inventors: Hans Kupper; Bernhard Knapp; Erika Hundt; Burkhard Enders
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1987-12-30
Filing date: 1988-12-29
Publication date: 1993-08-31
Also published as: GR3007126T3; ES2045075T3; JPH11318475A; JPH022356A; FI886001A; EP0322712A3; EP0322712A2; YU237588A; AU625315B2; YU48126B; FI99144B; DE3876227D1; DK727688A; EP0322712B1; IL88818A; DE3831351A1; IL88818A0; FI99144C; DK727688D0; PT89363A

Description

DESCRIÇÃO

Um passo importante para o desenvolvimento de uma vacina contra a malária á a identificação de antigenespro tectores. Antigenes protectores sao, em geral, aqueles que mostraram ter um efeito protector contra uma infecçao de P. falciparum desencadeada por via intravenosa, em ensaios in vi vo em modelos animais, como por exemplo macacos Saimiri ou Aotus. Atá ao momento apenas se tem descrito testes de protec çao insuficientes em seres humanos, embora várias proteínas de P. falciparum isoladas tenham mostrado em modelos animais um efeito protector total ou parcial. Estes resultados verifi caram—se tanto para fracçoes de proteínas purificadas por ele ctroforese de gel com 75 kD e 100 kD, como para bandas de pro

teína purificadas por electroforese de gel com pesos molécula res de 200 kD, 140 kD e 41 ID (L.H. Perrin et al. (1984),Clin. Exp. Immunol. 56, 67-72} L. M. Perrin et al. (1985), J. Clin. Invest. 75, 1718—1721} W. A. Siddiqui et al. (1987), Proc.Natl. Acad. Sei., USA, 84, 3014-3018). De entre as proteínas especí ficas para merozoitos até agora preparadas por via biotecnolé gica, uma proteína de expressão recombinante da região ”5' re peat da chamada merozoitoproteína RESA 155 kD, bem como um oligopéptido sintético da proteína precursora merozoito—super ficial de 200 kD, e ainda uma combinação de oligopéptidos sin téticos de proteínas de pesos moleculares 35 kD, 55 kD e 200 kD, apresentaram um efeito protector parcial em ensaios de imunizaÇao com macacos Saimiri ou Aotus. As proteínas recombi nantes do antigepe anterior preparadas por engenharia genética, que apresentem um efeito protector em experiências in vivo com macacos, sao candidatos potenciais para uma vacina con tra a malária.

objectivo deste trabalho foi pois o de isolar sequências codificantes para as bandas de antigenes 41 kD protectores, descritas por L. Perrin (1985, vide acima), efe** Λ ctuar a expressão dessas sequências e de testar os produtos de expressão em relaçao ao seu efeito protector em modelos com macacos. Por meio de um anti-soro específico contra a banda de antigenes de 41 kD, isolaram-se quinze clonos a partir de um banco de expressão genômico e determinou-se a estrutura das suas inserções. As sequências dos clonos 41—1 a 41-10 e 41—12 a 41—15 e ainda 41-17 apresentam-se nas Tabelas 1—15· Por meio de dois clonos de reacçao imunolégica muito intensa (41-2 e 41-7), isolaram-se anticorpos monoespecíficos a partir do soro utilizado para o screening. Estes anticorpos reagem no teste Western Blot especificamente com um antigene de merozoitos de 41 kD.

Com a inserção de DNA do clono 41-2 hibridou— -se em Southern Blot um fragmento EcoRl de 3»θ kb e um fragmento Sau3A de 2,0 kb. Isolaram—se e sequenciaram—se ambos os fragmentos de DNA.

$ 9* fragmento Sau3A contem a região codificante completa do gene 41-2. Esta reglao nao contem introes e codifica para 184 aminoácidos com um peso molecular de 21512D. A proteína 41—2 possui uma sequência de sinal e dois outros extremos hidrobábicos. Nao existem componentes repetitivos da sequência. A análise Western Blot de proteínas esquizontes com antisoros de coelho, preparados contra um produto de expressão, que contém 70% da região codificante, deu origem a uma banda de 29 kD. Pode ainda identificar-se, por meio de análise Northern Blot um mRNA de 1,6 kb.

A inserção de DNA do clono 41—7 codifica, pelo contrário, para a proteína de 41 kD. Com antisoros de coelho, preparados contra uma proteína de fusão de 41—7, reconhe ce-se claramente, em Western Blot uma banda 41 kD. Por meio de selecção (Screening) de um banco de. genes grnámico lam— bda gtll EcoRI , com a inserção de DNA do clono 41—7, conseguiu identificar—se um clono que contêm uma inserção de 2,3 kD específica da malária. Isolou—se e sequenciou—se esta inserção, que contêm a região total codificante para uma proteí na 41 kD. 0 gene nao codifica qualquer sequencia de sinal nem contêm introes ou partes repetitivas. A sequência de aminoá— eidos derivada da proteína kD de P. falciparum ê altamente ho máIoga (>60%) às aldolases dos másculos e do fígado dos mamíferos e à aldolase do Trypanosoma brucei. Ao contrário do que acontece*com o genoraa dos mamíferos, apenas se pode identificar por análises Southern Blot um ánico gene de aldolase em P. falciparum.

Os clonos 41—2, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 6, 9, 10, 12, 13, ,4, 15 e 17 detectaram-se devido às suas reactivida— des cruzadas com o antisoro contra as bandas de proteína 411D.

A/

Estes clonos sao adequados para a preparaÇao de uma vacina. Efectuou-se a expressão das inserções de DNA dos clonos 41-1 a 41-5, 41-7, 41-10 e 41-14 no vector pEX-31 e purificaram-se

- 3 as proteínas de fusão resultantes. Uma combinaÇao de uma quan

A tidade imunologicamente activa de tres produtos de expressão (41—1, 41—2 e 41-3) protege macacos Aotus contra infecçoes P. falciparúm.

A invenção refere—se sucessivamente aí

a) sequência de DNA purificadas e isoladas dos clonos 41-1 a 41-10, 41—12 a 41—15 e 41—17« bem como aos genes 41—2 e 41—7 incluindo os seus produtos de transcrição,

b) estruturas de DNA e vectores que contenham total ou parcial mente essas sequências,

c) células procariáticas ou eucariáticas transformadas com esse DNA.

d) polipéptidos ou partes destes expressos por essas células por meio de transformaçao,

e) as suas sequências de aminoácidos,

f) anticorpos contra os polipéptidos referidos em (d), inclu— indo a sua utilização para imunização passiva, para diagnostico e para a purificação dos ditos polipéptidos,

g) vacinas contra a malária, que contenham as sequências de aminoácidos referidas em (e), isoladamente ou em combina— çao.

h) um processo para a preparaçao por engenhatia genética dos polipéptidos referidos em (d) ou de partes destes, e

i) emprego das referidas sequências de aminoácidos em diagnOs tico.

As restantes especificações da invenção apresentam—se nos exemplos, tabelas e reivindicações da patente, que se seguem.

Exemplos

Exemplo 1?

”Screening” de um banco de expressão lambda gt 11 com o soro anti-41 kD monoespecffico.

&

Efectuou—se o Screening de 10 PFU (plaque

forming units) de um banco de expressão genómico lambda gtll (preparado a partir do DNA da estirpe de P. falciparum T996) com um anti—soro contra a banda de antigenes 41 kD (L. H. Per rin et al· (1985)» vide acima) da estirpe de P« falciparum SGE2, de acordo com métodos conhecidos (L. S. Ozaki (1986), J. Immun. Method. 89, 213~219j Promega Biotec (1986), Proto Blot Immunoscreening System, Technical Mannual). Como sistema de detecção utilizou-se um conjunto de IgG anti-coelho/foafatase alcalina (Promega, nQ de encomenda P 3731)·

Por meio do Screening¹¹ do banco de genes lam bda gfcll genémico com o anti—soro contra a banda de proteína 41kD, puderam identificar-se dois clonos muito reactivos (41— —2 e 41—7) bem como outros treze clonos menos reactivos (41—1» 41-3, 41-4, 41-5, 41-6, 41-8, 41-9, 41-10, 41-12, 41-13, 41—14— 41—15 e 41—17) e cerca de 40 outros clonos muito pouco

A reactivos. As inserções do DNA dos quinze clonos que contem de 140 a 65O bp (pares de bases), cortaram-se com EcoRI e removeram-se, e clonaram-se na posição EcoRI do vector pUC8, pa ra posterior caracterizaÇao.

Exemplo 2:

Sequenciaçao dos fragmentos de imersão dos clonos 41-1 a 41-10, 41-12 a 41-15 e 41-17

A sequenciaçao das inserções de DNA efectuou— se de acordo com o método didesoxi por meio de um primer e de um primer reverso, directamente a partir dos pUCÔ—plasmí deos (E. Y. Chen e P.H. Seeburg (1985)» DNA 4, 165-170). As Tabelas 1 a 15 mostram as sequências de DNA específicas da ma lária e as sequências de aminoácidos delas derivadas dos donos 41-1, 41-2, 41-3, 41-4, 41-5, 41-6, 41-7, 41-8, 41-9, 41-10, 41-12, 41-13, 41-14, 41-15 e 41-1?, na última ordem de leitura aberta possível· Nestes 15 troços sequenciais nao se encontram sobreposiçoes ou homologias de qualquer espécie.Por meio do programa UWGCG (University of Wisconsin, Genetic Com— puter Group) testaram—se estas 15 sequências com vista à iden tificaÇao de troços homólogos, no âmbito do banco de dados EMBL. Nenhuma destas 15 sequências parciais ou troços homólogos maiores se encontram descritas até ao momento· Apenas a sequência do clono 41—10 possui, do nucleótido 1 ao 134, uma homologia de 74% com uma sequência parcial do nucleótido 2144 ao 2274 do gene da proteína 140 kD, de acordo com o referido no registo de patente DE-P 37 41 057· A sequência do clono 41—10 é ainda a única que contêm troços sequenciais repetitivos típicos da proteína de P« falciparum. A sequência de amoácidos deste clono possui três tetrapéptidos com a sequência Pro—Ser-Glu-Ser, em que o segundo grupo Serina da segunda repetição, causada por uma traneiçao G—A, se encontra substitui do por um grupo asparagina.

Além disso, a sequência do clono 41-7, do nucleótido 5θ ao 163» possui uma homologia de 56% com um mRNA de aldose do nu— cleótido 218 a 331» da ratazana (T. Mucai et al· (1986), J. Biol. Chem. 261, 3347-3354).

Exemplo 3^;

Identificação do antigene 41 kD por meio de anticorpos especí ficos contra os donos de expressão 41-2 e 41-7·

A partir do anti-soro contra a banda de proteína 41 kD isolaram—se anti—corpos de acordo com o método de L. S. Osaki (1986, vide acima), dirigidos especificamente con tra os produtos dos clonos de expressão 41—1, 41—2, 41—3, 41-7» 41—8 e lambda gtll (controle). Para o isolamento de esqui zontes cultivou—se P. falciparum em eritrócitos humanos (W. Trager e J.B. Jensen (1976), Science 193» 673-675) e sincroni zou-se por meio de tratamento com Sorbitol (C. Lambros e J.P. Vanderberg (1979)» J· Parasitol. 65» 418—420). Conseguiu—se um enriquecimento dos esquizontes a cerca de 90% por meio de flotaçao em Gelafundin'⁴¹' (Braun Melsungen) (de acordo com G. Pasvol et al. (1978), Ann. Trop. Med. Parasitol. 72, 87—88). Centrifugaram-se os esquizontes, lavaram-se, aqueceram-se du** ο rante 5 minutos em tampao amostra SDS a 100 C, trataram—se com ultrassons e liofilizaram-se em partes alíquotas.

Utilizaram-se as alíquotas da solução de esquizontes para a análise de Western Blot dos anticorpos específicos acima mencionados (D. A. Johnson et al. (1984) Gene Anal. Tech. 1, 3-8). Nesta análise, os anticorpos, isolados por meio dos clonos de expressão 41-2 e 41-7, magiram intensamente com uma banda de antigenes 41 kD de esquizontes.

Exemplo 4?

Clonagem de um fragmento de DNA contendo a informação genética do clono 41-2.

Digeriram-se com o enzima de restrição EcoRI de DNA genómico da estirpe P. falciparum FCBR, obtida por lisagem de culturas de esquizontes seguida por centrifuga çao com brometo de etldio CsCl (P. Oquendo et al. (1906) Mole cular and Biochemical Parasitology 18, 89—101), analisou-se de acordo com as instruções do fabricante em membranas de Screen de genes (Dupont) e hibridizou—se em seguida com a inserção de DNA radio-marcada do clono 41-2 com uma actividade θ

específica de 10^f a 10 . Após lavagem do filtro em

O, 3xSSC(lxSSCίΟ,15M NaCl, 0,015 M citrato de sódio) e 1% SDS (dodecilsulfato de sódio) a Ó5°C durante 1 hoha procedeu—se à auto-radiografia dos filtros. Poe meio desta experiência de * Southem Blot identificou—se um fragmento EcoRI genómico com o comprimento de 3kb, que hibridiza com a inserção de DNA do clono 41-2. Num gel preparativo separaram—se 60 ^ug de DNA de

P. falciparum da estirpe FCBR cortado com o enzima de restri— çao EcoRI, removendo—se e eluindo—se a região de 2,8 kb a 3,2 kb (B. Perbal (19δ4), A Pritical Guide to Molecular Bloning). Clonou—se este DNA de acordo com o método de T.V. Huynh et al. (em DNA cloning, vol. I, ed. D. M. Glover (1985), 49-88) no vector lambda gt 10. Efectuou-se a selecção (Screening) de ·*

PFU do banco de genes obtido com a imersão de DNA radio—

-marcada do clono 41-2, de acordo com métodos conhecidos (T. Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning, A Laboratory Manual). Daí resultaram vários clonos fagos que hibridizaram com a inserção de DNA do clono 41—2. Isolou—se o DNA fago de um destes clonos (R. W. Davis et al. (19θθ), A Manual For Genetic Engineering, Advanced Bacterial Genetics) e digeriu-se com o enzima de restrição EcoRI; purificou-se por electroforese de gel um fragmento de DNA com 3,0 kb e subclonou-se na posiçao de restrição EcoRI do vector pUClo (gene plasmideo pUC 41-2). Na análise Southern Blot (T. Maniatis et al. , vide aci ma) que se seguiu hibridizou—se este fragmento de EcoRI—DNA de 3,0 kb do gene pUC 41-2 com a inserção de DNA do clono 41-2.

Exemplo 5»

Análise sequencial do clono gene pUC 41—2

Sequenciou-se o DNA plasmideo gene pUC 41—2 por meio de um primer de um primer reverso a partir das posiçoes laterais EcoRI (Ε. Y. Chen e P. H. Seeburg (1985), vide acima). Deste modo conseguiram identificar—se cerca de 250 bases em cada extremo do fragmento EcoRI de 3,0 kb. A sequência de um destes extremos é idêntica à inserção de DNA do clono 41—2. Para a preparaçao de uma carta de restrição incubaram-se 0,5 Jig do fragmento isolado de EcoRI-DNA de 3,0 kb com vários enzimas de restrição, separaram—se por electrofore se de gel, absorveram—se em nitro celulose e hibridizaram—se ** com a inserção de DNA radiomarcada do clono 41—2, de acordo com métodos conhecidos (T. Maniatis, vide acima). Com base no tamanho dos fragmentos de restrição a hibridizar, pode decidir—se sobre a remoção de várias posiçoes de corte de restri— ** .

çao para a posição de corte EcoRI comum aos dois clonos 41—2 e gene pUC 41—2. A partir da carta de restrição assim obtida isolaram-se fragmentos de restrição do clono gene pUC 41—2 e subclonaram-se para sequenciaÇao nos fagovectores M13mpl8 e

M13mpl9 (F. Sanger et al. , (1977), Proc. Natl. Acad. Sei. USA,

74, 5^63-5467). Determinou—se a sequência desde a posição de restrição EcoRI do préprio gene na direcção do extremo 5’ do gene até uma posição de corte de restrição Dral-EcoRI do clono gene pUC 41-2 contendo 1230 bp. A sequência desde a posição IO36 até à posição 1222 é idêntica à da inserção de DNA de 41—2. Uma vez que a sequência do dono 41—2 e a sequência genémica do clono gene pUC41-2 derivam de estirpes P. falciparum diferentes (estirpe T996 da Tailandia e estirpe FCBR da Colombia), parece que pelo menos esta porção genética está mui to conservada. A ordem de leitura aberta desta sequência come ça na posição 784 com um codao de início ATG e termina com um codao TTC, que pertence a posição de corte de restrição EcoRI interna ao gene. Esta parte codifica para os 149 aminoácidos N-terminais da proteína. A sequencia parcial deste gene nao dispõe de quaisquer componentes sequenciais repetitivos. A se quência de aminoácidos derivada começa com uma sequência parcial de 18 aminoácidos, dos quais 4 sao ácidos e 5 sao básicos. Esta parte sequencial é continuada por uma parte hidrofé bica constituida por 11 unidades, flanqueada em ambos os lados por grupos aminoácidos ácidos. Esta região hidrofébica po de actuar como sequencia de sinal. A região com aminoácidos básicos e ácidos antes da eventual sequência de sinal é rela— tivamente comprida) descreveram—se contudo também regiões similar-mente compridas para outras proteínas de P. falciparum (T. Triglia et al. (1907), The EMBO Joumal 6, 1413-1419). Testou-se a sequência de aminoácidos derivada, por meio do programa UWGCG, em relaçao a existência de regiões hidrofíli— cas e zonas superficiais bem como de potenciais zonas epitépi cas imunogénicas. Identificaram—se assim três zonas hidrofíli cas da proteína, codificadas pelas sequências de nucleétidos das posiçoes 890 a 907, 1079 a 1093 ® H51 a 1168. A zona 5’ nao codificante do gene e extremamente rica em AT (teor em AT=88,8%), como descrito também para outros genes de P. falciparum (J. L. Weber (19β7)» Gene 52, 103-109) e dispõe em cada uma das tres ordens de leitura de mais de 15 codoes de ter minaçao. Além disso existe na posição 274 uma possível Box CAAT depois da qual, 64 nucleétidos down stream, se encon-

tra localizada uma possível Box TATA. Estas estruturas podem especificar uma possível região promotora para este gene.

Exemplo 6:

Isolamento do gene completo para 41-2

A análise sequencial do clono gene pUC41—2 re velou uma posição de corte Sau3A, afastada 947 bp da posição de corte EcoRI. Por meio de análise Southern Blot genámica identificou-se um fragmento Sau3A com 2,0 kb , que hibridiza com a inserção de DNA do clono 41-2 (vede exemplo 4). Deste modo, este fragmento Sau3A na direcção 3’ a partir da posição EcoRI, deve conter mais de 1050 bp da informação genética do gene 41—2. Num gel preparativo separaram-se 60 ug de DNA da estirpe FBCR, cortado com o enzima de restrição Sau3A, e isolaram-se fragmentos de DNA de 1,8 kb a 2,2 kb. Este DNA clonou—se, segundo as instruções do fabricante (Stratagene) na posição Xhol do vector lambda ZAP. Efectuou—se o Screening ~

de 10 PFU deste banco de genes com a inserção de DNA radiomarcada do clono 41—2 e identificaram—se cerca de 40 fagoclo— nes (vide exemplo 4). A partir destes fogoclonos isolou—se, por meio de excisao automatica de acordo com o método de stta— tagene, um vector •'Blueskript” (gene psK'^- 41-2). Por meio de restrição destes DNA plasmideos com Kpnl e EcoRI puderam isolar—se dois fragmentos de DNA de 95θ bp, dos quais o fragmento de 95θ bp hibridizou em Southern Blot” com a inserção de DNA do clono 41-2 Sequenciou-se o DNA plasmideo psK—41—2 por meio de um primer e de um primer reverso (E. Y. Chen e P. H. Seeburg (1985)» vide acima). A sequência, sequenciada por meio do primer”, e idêntica a sequencia da inserção de DNA do pias mídeo gene pUC 41—2 a partir da posição Sau3A na direcção 3’· Subclonou—se o fragmento de DNA EcoRI com 1050bp do plasmideo gene pSK 41—2 na posição EcoRI do vector pKS⁺ (T. Maniatis et al. , vide acima). A ps~tir deste fragmento de DNA preparou— —se uma carta de restrição. A partir dela subclonaram—se fra— * w . gmentos de restrição nos vectores Bluescript” e sequenciaram —se apos a preparaÇao de ssDNA (manual de intruçoes de strata gene). Determinou-se assim completamente a sequência desde a posição de restrição EcoRI do gene 41-2 na direcção 3' ate a posição Sau3A. A Tabela 17 mostra, em continuação a Tabela 16, a sequência de DNA e a sequência de aminoácidos dela derivada deste fragmento de DNA EcoRI-Sau3A do clono gene pSK-41-2, con tendo IO5O bp. Este fragmento genético codifica apenas para mais 35 aminoacidos adicionais ate ao codao de terminaÇao TAG. A região 3' nao codificante do gene e extremamente rica em AT (teor em AT=84,7%) e contém em cada uma das três ordens de leitura mais de onze codoes de terminaÇao. A técnica de ”S1— —Mapping” (I. M. Ausubel et al. (1987), Current Protocole in

M

Molecular Biology, Harvard Medicai Scool, Boston) nao revelou em caso algum qualquer indício da existência de uma constru— çao intrao-exao deste géne. Finalmente, por meio de analise Northern Blot (T. Maniatis et al., vive acima), detectou—se um mRNA do estado de esquizonte do tamanho de 1,6 kb. Deve por isso concluir—se que o gene 41—2 possui apenas uma única região codificante de 552 bp (teor em AT=73%)· Esta região codi fica para um antigene de 21512 Dalton, que possui uma sequência de sinal (vide exemplo 5) mas nao tem troços repetitivos. Este antigene, para além da sequência de sinal, dispõe de duas outras regiões hidrofébicas nas posiçoes de aminoácido 73 a θ5 . MM e 130 a 147, que possuem eventualmente a função de ligaçao a membranas.

Exemplo 7·

Expressão das inserções dos clonos 41-1 a 41-5 bem como 41-7» 41—10 e 41-14 no vector pEX31

M

Os fragmentos de inserção dos clonos 41-1 a

41-5, 41—7» 41—10 e 41—14 isolaram—se por electroforese de gel após restrição com EcoRI, ligaram—se com o vector pEX31b dige rido com o enzima de restrição EcoRI e desfosforilado (K. Stre bei et al. (1986). Journal of Virology 57, 9θ3-991), e transformaram-se em bactérias CÓOO adequadas contendo o plasmideo

PCI857 (F. Renault et al. (1581), Gene 15, 81-93). Testaram-se colónias isoladas, por meio de SDS-PAGE, em relaçao à expressão de sequências de DNA específicas de plasmídeos na for ma de proteínas de fusão MS2—polimerase. A indução efectuou— -se por meio de elevaçao de temperatura de acordo com o método de H. KUper et al. (em Y. Ikeda e T. Beppu (ed. ) Procedings of the Fourth International Symposium ou Genetics of Industrial Mikroorganisms (1982), Kyiot kodansha Ltd. , Tóquio). To dos os 8 fragmentos se conseguiram exprimir com elevado rendi mento.

Exemplo 8:

Purificação dos produtos de expressão

Agitaram—se vigorosamente culturas de bactérias transformante em 1 litro de meio LB com 5θ ^ig/ml de ampi cilina e 25 yug/ml de canamicina a 28°C durante 20 horas. Após adiçao de 4 1 de meio LB aquecido a 42°C agitou—se novamente durante 4 horas a 42°C. Centrifuraram—se as bactérias, ressus penderam—se em 200 ml de soro fisiológico (PBS) tamponizado com fosfato e abriram—se mecanicamente. Separaram—se as proteínas solúveis por centrifugação e lavaram-se os sedimentos, que continham os produtos de expressão, após duas lavagens com PBS, sucessivamente com concentrações crescentes de ureias (de 1 M até cerca de 5M), até se obter a solubilizaçao das proteí nas de fusão. Em seguida efectuou—se a dialise com concentra— çoes decrescentes de ureia ate a concentração de ureia suficiente para manter os produtos de expressão em solução. Este processo conduziu a um grau de pureza de 60 a 80%.

Exemplo 9^;

Identificação do antigene codificado pelo gene 41—2

Por meio de anti—soros de coelho, dirigidos contra o produto de expressão do clono 41—2, nao se conseguir

identificar claramente, em análise Western Blot com proteínas esquizontes, qualquer antigene de malária. Por isso teve de efectuar-se a expressão de um fragmento de DNA maior do gene 41—2. Para isso isolou-se, por meio dos enzimas de restrição Alui e EcoRI, um fragmento de 388 bp do gene 41—2, contendo 70% da região codificante. Subclonou—se este nas posiçoes Smal e EcoRI do plasmídeo pUC18. A partir deste plasmídeo iso lou-se, por meio do enzima de restrição EcoRI, um fragmento de 401 bp e clonou-se na posição EcoRI do vector pEX31b. Após transformaçao puderam identificar-se colánias de bactérias que exprimiam uma proteína de fusão de 26 KD (vide exemplo 7)· Purificou-se esta (vide exemplo 8) e aplicou-se na imunizaÇao de coelhos. Os anti-soros reconhecem na análise Western Blot com proteínas esquizontes um antigene de 29 KD codificado pelo gene 41-2. A diferença do peso molecular calculado de 22 KD para o peso molecular de 29 KD em geles de SDS-poliacril— amida, pode esclarecer—se através de modificaÇao secundária. Assim, a proteína contêm no grupo asparagina na posição 166 uma posição de glicosilaçao.

Confirma—se também por análise Northern Blot que a partir do clono 41-2 se codifica um pequeno antigene. Deste modo, no estádio de esquizonte de P. falciparum detectou-se um mRNA de 1,6 kb, que hibridiza com a inserção de DNA do clono 41—2. A análise Northern Blot efectuou—se de acordo com métodos conhecidos (T. Maniatis et al., vide acima).

Exemplo 10?

Identificação de antigenes de outros clonos

Utilizaram—se anti—soros contra as proteínas de fusão purificadas dos clonos 41-1, 41-3, 41-4, 41-5, 41-7 e 41—10 para identificar os antigenes correspondentes, por meio de análise Western Blot com proteínas esqiizontes. Neste processo, os anti—soros contra as proteínas de fusão dos cio— ···** <5* nos 41-1, 41—3 ® 41—4 nao permitiram uma identificação inequí voca. A inserção de DNA do clono 41—5 pode atribuir—se a um antigene de 96 KD. Um grupo de três antigenes de 96 KD de P« falciparum tinha sido já descrito. (H. Jouin et al. (1907), Inf. Imm. 55, 13θ7—1392). Os anti—soros dirigidos contra um produto de expressão do clono 41—10 reconhecem dois antigenes

- 9* de 113 e 140 kD. A reacçao com o antigene de 113 RD identifi— cou—se como reacçao cruzada com o antigene SERPI (vide exemplo 2), que ê idêntico a um antigene protector. Assim, 41-10 codifica uma proteína de 140 kD P. falciparum.

Ê comum a todos estes genes, que os antigenes por eles codificados ou partes deles, reagem com um soro diri gido contra uma banda de proteína de 41kD de acçao protectora

Apenas o clono 41—7, que Juntamente com o cio no 41-2 tem a mais baixa reactividade com o anti—soro contra a banda de proteína de 41 kD, pode atribuir—se claramente a uma proteína de 41 kD.

Os anti—soros dirigidos contra a proteína de fusão do clono 41-7 reconhecem, na análise Western Blot, com proteínas esqui zontes, a banda de proteína de 41 kD, reconhecida também pelo soro de partida. Este clono parece assim codificar um segmento parcial do antigene de 41 kD. Confirmou—se também por meio de análises Southem Blot que os clonos investigados possuem sequências parciais de vários genes, no caso dos clonos 41—1, 41-2, 41-3, 41-7, 41-10, 41-14 e 41-15.

Exemplo 11:

Preparaçao de um banco de genes lambda gtll genámico

Incubaram-se 2 yug de DNA da estirpe de P. fal— ciparum FCBR durante a noite a 37°C com 14 unidades do enzima de restrição EcoRI em 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM Mg Cl , mM ditiotreitol e 40% de glicerina e separaram—se por elec— troforese de gel. Nestas condiçoes, o enzima de restrição

EcoRI apresenta actividade Stern”, formando—se fragmentos de

DNA de cerca de 5θ bp a 10 kb. Electroeluiu—se a região de DNA entre 5θ0 bp e 7 kb e, de acordo com o método de T.V. Huynh et al. (19θ5 i em DNA Cloning, vol. I, a praticai appro ach, ed. D.M. Clover), clonou-se no vector lambda gtll. Prepa rou—se um banco de genes de 5^χ10^ fagoclonos recombinantes, que se amplificou.

Exemplo 12í

Isolamento e sequenciaçao do gene 41—7

Uma vez que o clono 41-7 codifica de facto pa ra um fragmento parcial de uma proteína 41 kD (vide exemplo 10), teve de isolar-se o gene completo. Para isso efectuou-se o Screening do banco de genes genámico lambda gtll EcoRI* (vide exemplo 11), de acordo com métodos conhecidos (T. Mania tis et al., vide acima) com a inserção de DNA radiomarcada do clono 41-7· Daí resultaram três clonos lambda gtll, a partir dos quais, a partir dos enzimas de restrição EcoRI e Sal I,

M se conseguiu isolar em cada caso uma inserção com 3,3 kb. A componente específica da malária da inserção tem a dimensão de 2,3 kb. A partir deste fragmento de DNA preparou—se uma carta de restrição. A partir desta clonaram-se subfragmentos, para sequenciaçao, nos vectores Bluescript ’’ (Stratagene). Conseguiu—se esclarecer a sequência de DNA total deste fragmento específico da malária com 2,3 kb. A Tabela 18 mostra a sequência de DNA do gene 41—7 com a sequência de aminoácidos dela derivada. 0 gene nao possui introes. Identificaram—se 525 pares de bases (teor em AT=84,2%) da região 5* nao codifi cante e 772 pares de bases (teor em AT=84,2%) da região 3’ nao codificante. 0 troço intermédio ê constituído por 1086 pa res de bases (teor em AT=64,4%) e codifica para 3^2 aminoácidos. 0 peso molecular calculado deste gene de 39314D está em boa concordância com o peso molecular de 41 kD calculado por electroforese de gel. Efectuou-se a transcrição deste gene num mRNA com 2,4 kb, determinado por análise Northern Blot de acordo com métodos conhecidos (T. Maniatis et al. , vide acima).

Por análise Northern Blot (vide exemplo 4) verificou-se que existe apenas uma cópia deste gene por genoma de P. falciparum» Descobriu-se ainda que este gene existe em várias estirpes de P. falciparum (FCBR da Colotnbia, Paio Alto do Uganda, SGE2 do Zaire, ItG^G^ do Brasil e FVOR do Vietname). Além dis so, a sequência de DNA específica da malária do clono 41-7 é idêntica à sequência parcial do gene isolado a partir da estirpe FCBR, da posição 464 à 729. 0 clono 41—7 codifica por isso para os 88 aminoácidosN-terminais da proteína 41 kD.

A partir da sequências de aminoácidos derivada ê evidente que a proteína 41 kD nao contêm qualquer sequên cia de sinal nem qualquer troço repetitivo. Por meio do programa UWGCG (University of Wisconsin, Genetic Computer Group) testou-se esta sequencia de aminoácidos em relaçao a presença de proteínas homólogas com base no banco de dados de proteínas NBRF. Descobriu—se assim que a proteína 41 kD é homóloga em 66% à aldolase do fígado humano (M. Mukai et al., (1985), Nucleic-Acid Res. 13, 5θ55-5θ69), em 66% à aldolase do fígado do rato (K. Tsutsami et al. (1984), J. Biol. Chem. 259, 14572 -14575), em 68% à aldolase do másculo do coelho (D. R. Tolan et al. (19θ4)« Ji Biol. Chem. 259, 1127-H31) e em 61% à aldolase do Trypanosoma brucei (C.E. Clayton (1985), EMBO-J. 4, 2997—3θθ3)· A proteína 41 kD parece assim ser a aldolase de P. falciparum.

Exemplo 13?

«V **

Teste de protecção em modelo animal! ImunizaÇao de Aotus le— murinus griseimembra (cariotipo VI)

Efectuou—se esta experiência para testar a ·* % eficácia dos produtos de expressão descritos em relaçao a indução de imunidade protectora em macacos sensíveis a P. falei— parum. Como inoculador utilizou—se uma combinaÇao dos produtos de expressão dos clonos 41—1, 41-2, e 41—3 de forte reac• Çao imanológica.

1. OrganizaÇao das experiências

Distribuiram-se ao acaso 6 macacos Aotus da espécie acima mencionada (1000—1500 g de peso corporal, animais machos e fêmeas da criaçao da Behringwerke AG) por dois grupos de 3 animais cada.

Dissolveram-se proteínas de fusão dos clonos 41—1, 41-2 e 41-3 em PBS com ureia 3M e misturaram-se na proporção 1:1:1, (concentração final: 300 de proteína/ml). Imunizaram-se 3 animais com intervalos de 3 semanas três vezes com 1 ml de cada vez das proteínas de fusão combinadas, por via subcutânea. Como adjuvante utilizou-se uma mistura a 10% de 50% de Al(OH)^/45% de lecitina/5% de saponina com o an tigene.

Administrou-se a 3 animais do grupo de contro le de infecçao, também segundo o esquema indicado acima, uma injecção de PBS com ureia 3M+adjuvante sem componente antigê— ni ca.

De modo a garantir uma infecçao experimental ** .

por P. falciparum tao igual quanto possível em todos os animais, removeu-se o baço a todos os macacos oito dias depois da última imunizaÇao (susceptibilidade aumentada).

Ao 67° dia apús a primeira vacinaÇao infectaram—se todos os 6 macacos com 5^10 eritrúcitos parasitados. Escolheu—se a estirpe P. falciparum-Palo Alto (Uganda) que, adaptada in vitro a eritrúcitos de Aotus, se aplicou directa— mente aos animais a testar a partir de um animal dador ao qual se tinha removido o baço (4% de parasitemia). Esta estirpe «w distingue—se por uma elevada infecciosidade em comparaçao com outros isolados de P. falciparum. Ê além disso interessante referir que esta estirpe é heterúloga à estirpe Τ99θ (Tailan— dia) utilizada para o isolamento dos antigenes de imunizaÇao, no que respeita à proveniência e ao serotipo.

No decorrer da experiência total (antes e depois da imunização, bem como após a infecçao) determinaram-se regularmente parâmetros fisiológicos, parasitológicos, seroló gicos e clínicos.

2. Resultados

Durante a fase de imunização nao se verificaram alterações patológicas de todos os parâmetros fisiológicos (estado clínico, temperatura, peso) e clinico-químicos (eritrócitos, hematócrito, sedimentação, enzimas do soro GPT e GOT) investigados. Testes adicionais de segurança farmacoló gica (toxicidade subcutânea aguda no rato, assimilibilidade local em macacos, segundo as indicações da farmacopeia euro— peia) confirmaram para as preparações inoculantes utilizadas uma segurança e uma assimilibilidade suficientes.

2. 1. Parasitemia

A ** parametro principal para a medição de uma protecção induzida é a identificação microscópica de eritróci tos parasitados no sangue periférico do animal testado.

Logo após o 7^Q - 100 dia após a infecçao se conseguiram identificar eritrócitos parasitados isolados (menos de 1 por mil) em esfregaços sanguíneos corados por Giemsa dos animais nao imunizados. Os animais imunizados apresentavam uma maior ocorrência de parasitas do 10Q ao 15^c dia após infecçao, atingiram parasitemias máximas de 1 a 2% e controla ram expontaneamente a infecçao. Um animal morreu de pneumonia durante a experiência.

Enquanto que um animal do grupo nao imunizado conseguia controlar por si próprio uma parasitemia máxima de 4,5%, os outros dois animais, após atingirem uma parasitemia de >10%, tiveram de ser tratados com Mefloquin' (Hofflnann . «w

La Roche), para impedir uma evolução mortal da infecçao. A es

tirpe Paio—Alto utilizada revelou—se resistente à cloroquina em testes de infecçao previamente efectuados.

A figura 1 mostra, a esquerda, a evolução da parasitemia em macacos Aotus apés imunização com uma vacina combinada constituída por proteínas de fusão dcs clonos 41-1, 41-2 e 41-3, e à direita a mesma coisa para o grupo de contro le (animais nao·imunizados).

Claims

REIVINDICAÇÕES

- ia Processo para a preparaÇao de proteínas de

Plasmodium falciparum, caracterizado por se exprimirem as sequências de DNA que codificam para as sequências de aminoácidos ou para partes de acçao antigênica destas, descritas nas Tabelas 1 a 18

TABELA 1

Sequencia de nucleotidos da inserção de DNA do clono 41—1, es pecífico da malária, e sequência de aminoácidos dela derivada

10 30 50

TAAAATCTTTATGTATTTTTAAACAAAGAAATAAAAAGGTAAGGTCATCAAATAATTCAT

LysSerLeuCysIlePheLysGlnArgAsnLysLysValArgSerSerAsnAsnSerS

70 90 110 CTTTCTTAATTGATTTTAGAAACTCACATACGAATAATATCAATATGTTAACAGAAAATC erPheLeuIleAspPheArgAsnSerHi sThrAsnAsnlleAsnMetLeuThrGluAsnG

130 I50 170

AAAAGTTTAATAATGTATTATTGAATAAAGAAATTCAGATGGATGAAAATCAGGAACGTG lnLysPheAsnAsnValLeuLeuAsnLysGluIleGlnMetAspGluAsnGlnGluArgG

TABELA 1 (continuação)

190 21023O

AATTTTCAATTGATGATTGTTTAATGAACTGCCTGAAACATAATGCATCTAATTTAAAAA luPheSerlleAspAspCysLeúMetAsnCysLeuLysHisAsnAlaSerAsnLeuLysT

250 27O290

CCAATGAAGATTATGAAAGATATTGTAATGAAGACAAAATATTGAATCCAGATTATAAGC hrAsnGluAspTyrGluArgTyrCysAsnGluAspLysIleLeuAsnProAspTyrLysP

310 33035O

CTTCAGAATCTAGAAAACTGGGAGAAAAATTTTTGCAAAAAAGTCAAAAGGAATTATATT roSerGluSerArgLysLeuGlyGluLysPheLeuGlnLysSerGlnLysGluLeuTyrT

370

ATTCTTATGC yrSerTyr

TABELA 2

Sequência de nucleótidos da inserção de DNA do clono 41-2, es pecifico da malária, e sequência de aminoácidos dela derivada.

10 3050

AACATGTGTGGAAATATTTATTTCAGCATTCATCTGATTTACTTAAATCTCAAGATAGTA

Hi sValTrpLysTyrLeuPheGlnHi sSerSerAspLeuLeuLysSerGlnAspSerl

70 90110

TTTATGAGTATATGATATGTGATAAAAATATTTTATTAAATAAATTTATAAATGTACCAA leTyrGluTyrMetlleCysAspLysAsnlleLeuLeuAsnLysPhelleAsnValProL

I30 150170

AAGATTATGGAAATATAAATTGTGCTGCCTTTGCAGCAGGTATTGTTGAAGGCTTCCTCT ysAspTyrGlyAsnlleAsnCysAlaAlaPheAlaAlaGlylleValGluGlyPheLeuC

190

GTAGTTCTGAATTC ysSerSerGluPhe

TABELA 3

Sequência de nucleótidos da inserção de DNA do clono 41-3, es pecifico da malária, e sequência de aminoácidos dela derivada.

1Ó 30 50

CAGTAAAAATTTTAAAAAAAAAGAAAAATTTAAGAAAAATAAAGGAAACCACTGATGAAG

ValLysIleLeuLysLysLysLysAsnLeuArgLysIleLysGluThrThrAspGluG

TABELA 3 (continuação)

70 90 110

AGAAAACTTCAGATAATGTTTCTCAAATGTATGAAAGAAAAGGTGGACCATTACCACCAC luLysThrSerAspAsnValSerGlnMerTyrGluArgLysGlyGlyProLeuProProP

130

CCGAACTTAGAAAACA roGluLeuArgLys

TABELA 4

Sequência de nucleátidos da inserção de DNA do clono 41—4, es pecífico da malária, e sequência de aminoácidos dela derivada

10 30 50

GTATACCTGAATTTTTAGGACAATATCATAATGTTCCCCATGTATTCAAAGATTATATGA

IleProGluPheLeuGlyGlnTyrHisAsnValProHi sValPheLysAspTyrMetS

70 90 110

GTTCCAATGATTTTATAAGTGGTATAAATAATATAAATGAATCAGATGCTCTTTTTAATA erSerAsnAspPhelleSerGlylleAsnAsnlleAsnGluSerAspAlaLeuPheAsnA

130 150

ACATACAATATATAAACCAAGCGAATGACCAAGAAGAAAACAAATT snlleGlnTyrlleAsnGlnAlaAsnAspGlnGluGluAsnLys

TABELA 5

Sequencia de nucleotidos de inserÇao de DNA do clono 41—5, es pecífico da malária e sequência de aminoácidos dela derivada.

10 3050

TGTTTGATAATAGTGATTTTATTAAATCAATAATGGATTCTAATAAACAATTAAAAAAGT

PheAspAsnSerAspPhelleLysSerlleMetAspSerAsnLysGlnLeuLysLysL

70 90110

TAAGAGAACAAAATTCTGATTTAAATCATATTTTAAATGATTCTCAGACTTTAAAACAAT euArgGluGlnAsnSerAspLeuAsnHi sileLeuAsnAspSerGlnThrLeuLysGlnS

I30 150170

CTTTTGAAATGATTAAGAATCCATCTTTGATGAAAGAATTAATGAAAAATACTGATAGAG erPheGluMetIleLysAsnProSerLeuMet LysGluLeuMetLysAsnThrAspArgA

I90

CTATTAGTAATATTGAAGCCATACC lalleSerAsnlleGluAlalle

TABELA 6

Sequencia de nucleotidos da inserção de DNA do clono 41-6, es pecifico da malária, e sequência de aminoácidos dela derivada.

10 30 50

TCGTTGTCCTTTCCTTTGGTGATAAACGCAATGAGATAAAACAAAAAATTGACACGTTTT

ValValLeuSerPheGlyAspLysArgAsnGluIleLysGlnLysIleAspThrPheC

70 90 110

GTGGTGTAAGTAATGAAGAAAAGGAGAAACTAAAGGAACAATGGAAATGCTATGAAGCTA ysGlyValSerAsnGluGluLysGluLysLeuLysGluGlnTrpLysCysTyrGluAlaL

130 I50

AATATGTAAAGGAAGATAATAAAAGTAAAG ysTyrValLysGluAspAsnLysSerLys

TABELA 7

Sequência de nucleátidos da inserção de DNA do clono 41-7, es pecifico da malária, e sequência de aminoácidos dela derivada.

10 3050

TGAATGCCCCAAAÀAAATTACCAGCAGATGTTGCCGAAGAATTAGCAACCACCGCCCAAA AsnAlaProLysLysLeuProAlaAspValAlaGluGluLeuAlaThrThrAlaGlnL

70 90110

AGCTTGTTCAAGCTGGAAAGGGAATTTTAGCTGCTGATGAATCAACACAAACCATTAAGA ysLeuValGlnAlaGlyLysGlylleLeuAlaAlaAspGluSerThrGlnThrlleLysL

I30 150170

AAAGATTCGACAACATCAAATTAGAGAACACAATAGAAAACAGAGCTAGCTACAGAGATT ysArgPheAspAsnlleLysLeuGluAsnThrlleGluAsnArgAlaSerTyrArgAspL

190 21023O

TATTATTTGGAACTAAAGGATTAGGAAAATTCATTTCAGGAGCAATTTTATTTGAAGAAA euLeuPheGlyThrLysGlyLeuGlyLysPhelleSerGlyAlalleLeuPheGluGluT

25O

CATTATTTCAAAAGAATGAAGCCGGT hrLeuPheGlnLysAsnGluAlaGly

TABELA 8

Sequência de nucleátidos da inserção do DNA do clono 41-8, especifico da malária, e sequência de aminoácidos dela derivada.

TAACATTTTCTGTAGATACAAAACAAAATTTAAATGCATCTTATTCTAGTGGACAAGAAA ThrPheSerValAspThrLysGlnAsnLeuAsnAlaSerTyrSerSerGlyGlnGluA

70 90 110

ATAAACAAAATGAATCTGATGGAAAAGAAAATGAAGAAGATGAAGAAAATAAGGTATATG snLysGlnAsnGluSerAspGlyLysGluAsnGluGluAspGluGluAsnLysValTyrA

130 I50 I70

ATTTAATACTGGAAAATATAGAACCTAACAAAAAAATACCCATCATAAAAATCGTTAAAG spLeuIleLeuGluAsnlleGluProAsnLysLysIleProIlelleLysIleValLysG

I90 210 230

AAATAAAAAAAGATCTTAATTTAAAACAAGCAAAGGATTTAGTTGATAATTTGCCACA luIleLysLysAspLeuAsnLeuLysGlnAlaLysAspLeuValAspAsnLeuPro

TABELA 9

Sequencia de nucleótidos e sequência de aminoácidos dela deri vada, da inserção de DNA do clono 41-9, específico da malária.

10 3050

AAAATAAAAATTATACAGGTAATTCTCCAAGTGAAAATAATAAGAAAGTTAACGAAGCTT

AsnLysAsnTyrThrGlyAsnSerProSerGluAsnAsnLysLysValAsnGluAlaL

70 90110

TAAAATCTTACGAAAATTTTCTCCCAGAAGCAAAAGTTACAACAGTTGTAACTCCACCTC euLysSerTyrGluAsnPheLeuProGluAlaLysValThrThrVaIValThrProProG

I30 I50170

AACCAGATGTAACTCCATCTCCATTATCTGTAAGGGTAAGTGGTAGTTCAGGATCCACAA LnProAspValThrProSerProLeuSerValArgValSerGlySerSerGlySerThrL

190 21023O

AAGAAGAAACACAAATACCAACTTCAGGCTCTTTATTAACAGAATTACAACAAGTAGTAC ysGluGluThrGlnlleProThrSerGlySerLeuLeuThrGluLeuGlnGlnValValG

25O 270290

AATCACAAAATTATGACGAAGAAGATGATTCCTTAGTTGTATTACCCATTTTTGGAGAAT InSerGInAsnTyrAspGluGluAspAspSerLeuValValLeuProIlePheGlyGluS

310 330350

CCGAAGATAATGACGAATATTTAGATCAAGTAGTAACTGGAGAAGCAATATCTGTCACAA erGluAspAsnAspGluTyrLeuAspGlnVaIValThrGIyGluAlalleSerValThrM

370390

TGGATAATATCCTCTCAGGATTTGAAAATGAATATGA etAspAsnlleLeuSérGlyPheGluAsnGluTyr

TABELA 10

23 Sequência de nucleótidos e sequência de aminoácidos dela deri vada, da inserção do DNA do clono 41-10 específico da malária.

10 3050

AATCTCATTCTGACGAAAATATTGTAACTTTACAAGGAAAACTTAGAAATACAGCTATCT SerHi sSerAspGluAsnlleValThrLeuGlnGlyLysLeuArgAsnThrAlalleC

70 90110

GTATAAAGAATGTTGATGAATGGATATTAAATAAAAGAGGTCTAACATTACCTAGTGAAT ysIleLysAsnValAspGluTrpIleLeuAsnLysArgGlyLeuThrLeuProSerGluS

I30I50

CACCTAATGAATCACCTAGTGAATCAGATAGTTATCTTAA erProAsnGluSerProSerGluSerAspSerTyrLeu

TABELA 11

Sequência de nucleótidos da inserção de DNA do clono 41-12, específico da malária, e sequência de aminoácidos dela derivada.

10 , 3050

ATGAAGGAGAAGAATTAATATTAAATGATGATCAAAATAAATTACATATTGATACATTTG GluGlyGluGluLeuIleLeuAsnAspAspGlnAsnLysLeuHi slleAspThrPheG

70 90110

AAAAATACAAATATCTCATTTGTGAAAATATTAATAATGACAAATTTGTTATAAAAAATA luLysTyrLysTyrLeuIleCysGluAsnlleAsnAsnAspLysPheValIleLysAsnA

I3O I50170

ATCAAATTACAACATTTGAAAACTTTTTGAAAAACCAACAAAATTTTGAAATAA snGlnlleThrThrPheGluAsnPheLeuLysAsnGlnGlnAsnPheGluIle

TABELA 12

Sequência de nucleótidos e sequência de aminoácidos dela deri vada, da inserção do clono 41-13 específica da malária·

20 40 60

TAAATAATGAAAATATGGATAAACAAAATGTTAATATTCAAAATGAAGGTAATGGTTTTA

AsnAsnGluAsnMet AspLysGlnAsnValAsnlleGlnAsnGluGlyAsnGlyPheA

80 100 120

ATAATAATAAAAATAATAATGATCTTTTAAATGTTTATATATCACCTAATATGATTAATC snAsnAsnLysAsnAsnAsnAepLeuLeuAsnValTyrlleSerProAsnMetIleAsnH

ATTCTTTATCTTCAACTTGTGAAAAAAAAAATAAAGAAGATAACAAAATGAATGACAATA i sSerLeuSerSerThrCysGluLysLysAsnLysGluAspAsnLysMet AsnAspAsnL

200 220 240

AATTTCTTAATAGCAGTAGTAAAATGAAAATTCCAGAGATAAGTACGAACAACTCAAATG ysPheLeuAsnSerSerSerLysMetLysIleProGluIleSerThrAsnAsnSerAsnG

260 280 300

AAAAGATTGTTAATGTGTCAAATGATGAAATGTTAGTATATCATAATTTAACCGTATTAA luLysIleValAsnValSerAsnAspGluMetLeuValTyrHisAsnLeuThrValLeuA

320 34036O

ATGTAAAGGAACAAGGAGGTGTAACAGAAGAATCGAGCTGTATAAAACGCACATATTTTG snValLysGluGlnGlyGlyValThrGluGluSerSerCysIleLysArgThrTyrPheV

380 400420

TGGATCAATTTTATGATTCATATAATATGAGAAATGAAAAAATAACAGATGATAATATGC alAspGlnPheTyrAspSerTyrAsnMetArgAsnGluLysIleThrAspAspAsnMetG

44o 46o48o

AAGTAGAAGATATATATAATGTAAAGGAAAATATAAAAAGAACTCTAAAAGGTGATGGTC

InVaIGluAspIleTyrAsnValLysGluAsnlleLysArgThrLeuLysGlyAspGlyP

500 520540

CTGATGATGTCAAAACGAATATGCTGAGTGAAGATAATAGTTATGCAAGTGGTTTATGGG roAspAspValLysThrAsnMetLeuSerGluAspAsnSerTyrAlaSerGlyLeuTrpG

56O 58O600

GTAACGAAATAAACTTTATTAGTAATAATGAAAATTGTTTAAATAGCTATGATATATCAT lyAsnGluIleAsnPhelleSerAsnAsnGluAsnCysLeuAsnSerTyrAspIleSerC

620640

GTGATGAGAAATATATCCCAAATGAAGAGGAACAGGA ysAspGluLyeTyrlleProAsnGluGluGluGln

TABELA 13

Sequência de nucleótidos e sequência de aminoácidos dela deri vada, da inserÇao do clono 41-14, específico da malária.

1050

ACAACAATATGAACAGAATAAATAGTTTAAACAATAAAAATAATATTAACCCTATAAATC AsnAsnMetAsnArglleAsnSerLeuAsnAsnLysAsnAsnlleAsnProIleAsnG

70 90110

AATACAATGATGAAAAACAAAACTTACTTAACGNCCATCTTCAGTYCAATCAAGTAAATT InTyrAsnAspGluLysGlnAsnLeuLeuAsnXxxHisLeuGlnXxxAsnGlnValAsnT

I30 150170 . ATNATAATAACCTTGTGAATGGCYTTCATANAANNAAATTTTTAAGCAATAATAATTATA • yrXxxAsnAsnLeuValAsnGlyXxxHi sXxxXxxLysPheLeuSerAsnAsnAsnTyrl

TTAATACTACAGATATTAATGGÀAATAATATGATTAGTCATAATGATê^ATGAATAATA leAsnThrThrAspIleAsnGlyAsnAsnMetIleSerHi sAsnAspHi sMetAsnAsnL

250 27029O

AATTATACAGTAATATAAACAATAATTATTATTATAATAGGGCTAACAATGAAATTCCTA ysLeuTyrSerAsnlleAsnAsnAsnTyrTyrTyrAsnArgAlaAsnAsnGluIleProA

310 330350

ATAATAATAGTAACAATCATAATAATAATTTCAATATATATGAATCCAAATACCAAACCA snAsnAsnSerAsnAsnHisAsnAsnAsnPheAsnlleTyrGluSerLysTyrGlnThrM

370 390410

TGATTCATAACAACAACATAGGACAAGATCTAAAACAACAAATAAATAATTATAATGAAA etIleHi sAsnAsnAsnlleGlyGlnAspLeuLysGlnGlnlleAsnAsnTyrAsnGluA

430 45047O

ATACATCTTCTAATAATAATTTAAGTATATCTCAATTACTTGAGGGAAATACAAATTTTA snThrSerSerAsnAsnAsnLeuSerlleSerGlnLeuLeuGluGlyAsnThrAsnPhel

490 51053O

TAAATATTTCTAATACATTTATTAATACGAATTATTCTAATGATTTTCATCA leAsnlleSerAsnThrPhelleAsnThrAsnTyrSerAsnAspPheHi s

TABELA 14

Sequência de nucleótidos e sequência de aminoácidos dela deri vada, da inserção do clono 41—15 específico da malaria.

10 3050

ACAGCAACAACAATAATAATAATAATAATAATATTAGTAATAATATTAGTAATAATAAAG

SerAsnAsnAsnAsnAsnAsnAsnAsnAsnIleSerAsnAsnlleSerAsnAsnLysA

70 90110

ATTGTGATGAATACGATTATCAGGAAGAATATTTGAAAGATAAAGCATTATACGATTCAG spCysAspGluTyrAspTyrGlnGluGluTyrLeuLysAspLysAlaLeuTyrAspSerA

I3O I50I7O

ATATGGACGAAAATACAAATCAACTTCACAATAATGAACATCATACAAATCAACATCACG spMetAspGluAsnThrAsnGlnLeuHi sAsnAsnGluHi sHi sThrAsnGlnHi sHi sA

190 21023O

CAAATTGGCATCATCACAAACATCAAAAGCAACATTTCAAACAACTTATTGATCATAACA laAsnTrpHisHi sHi sLysHi sGlnLysGlnHisPheLysGlnLeuIleAspHi sAsnA

25O270

ATATGATAAATAATAATGATAATAATATTATCAATAA snMetlleAsnAsnAsnAspAsnAsnllelleAsn

TABELA 15

26 Sequência de nucleétidos e sequência de aminoácidos dela deri vada, da inserção do clono 41-17 específico da malária.

20 40 60

GCACTGCCACCCTTGTTGCGGAAGAATTGCACCAGCTCGGCTATTCACTGGCGCTGGGTC ThrAlaThrLeuValAlaGluGiuLeuHisGlnLeuGlyTyrSerLeuAlaLeuGlyA

80 100 GCGAAGTAGTTAATGAAAGTAGCCGGATGGGATTACCTGATGAATTC rgGluValValAsnGluSerSerArgMetGlyLeuProAspGluPhe

TABELA 16

Sequência de nucleétidos e sequência de aminoácidos dela deri vadoí do extremo 5' do gene de P. falciparum (isolado FCBR) , especificado através da inserção do clono 41-2.

10 30 50

TTTAAAAATTTTATAAATAATTTTTCTCTTTTATATTTAATACATCTATAAGTATATATG

70 90110

TAATAATTTGATACACAAGAAATGTGTATTTTTAATATATATATATATATATATATATAT

130 150170

ATATATATATATATATATATATATATATATATGATATATATAAATATATACATTTATTTA

190 21023O

TTCCATAATTTATTAAAAATAAATTTATATATTTTATTTTATTTTTTATTTATTTATTTG

250 27O290

TATATATTAAATCTTTTCAATGGAATAAAATTCAATCGGATCGTTATATAAACTTTATTA

310 330350

TATCAAATAAAACACTTTTTATAATAATACGAAAAATATATTTCCTTATTTTTATGTTTT

370 390410

CAAAATTTTAGTAGACTTATAATATTATTATGGATAACATTAACAAATAAAAATATTATG

430 450470

AGTATAATATGTAAATTATTTTTTTTTTTTTACAGTTTATATGTTTATGAACATATAATG

490 510530

TGATAAATAAAATTGATTAATTATTATTATATATAATTACTCTTGTAATTTATTAAAATG

550 570590

GTATATTATATATATATATATAATTTTTTTTATATTATTTGAATAAAAATATTAAATAAA

610 63065O

AATTTTGTGTTTGGGTAAATCATAATAAGTGCTAACGTTCATAATTTATCTCATTAAAAA

670 690 710 atagaaatgaaatataatatttacgacagtacatatatatatatgtatattattaaaaaa

730 750.770

AAATAAAAATAACACATATATATATATATATATATATATATTGATAATATATATGTTTTA

790 81083O

AGTATGGATAAATCAAAAAGTTCCATAGAGAAAGAATTAAATAGGATAAAACAGGATGTG

MetAspLysSerLysSerSerlleGluLysGluLeuAsnArglleLysGlnAspVal

850 87O89O

AGCTTAAGCGCATTTAGTATCCTCTTTAGTGAAATGGTACAATATTGTTTATATAAAAGT

SerLeuSerAlaPheSerlleLeuPheSerGluMetValGlnTyrCysLeuTyrLysSer

910 930950

AAAAGAGGATATCGAATAGAAGATTGTTTACATGAAATGGGTTTACGTGTAGGTTATAAA LysArgGlyTyrArglleGluAspCysLeuHi sGluMetGlyLeuArgValGlyTyrLys

970 9901010

TTAAATGAATATTTAACATATAAGAATAAAGTGAAAAGAAGCATAAATATTATTAATATT

LeuAsnGluTyrLeuThrTyrLysAsnLysValLysArgSerlleAsnllelleAsnlle

IO3O IO5O1070

TTAACATTCATATCTAAACATGTGTGGAAATATTTATTTCAGCATTCATCTGATTTACTT

LeuThrPhelleSerLysHi sValTrpLysTyrLeuPheGlnHisSerSerAspLeuLeu

1090 11101130

AAATCTCAAGATAGTATTTATGAGTATATGATATGTGATAAAAATATTTTATTAAATAAA

LysSerGlnAspSerlleTyrGluTyrMetIleCysAspLysAsnlleLeuLeuAsnLys

II50 11701190

TTTATAAATGTACCAAAAGATTATGGAAATATAAATTGTGCTGCCTTTGCAGCAGGTATT

PhelleAsnValProLysAspTyrGlyAsnlleAsnCysAlaAlaPheAlaAlaGlylle

1210I23O

GTTGAAGGCTTCCTCTGTAGTTCTGAATTC

ValGluGlyPheLeuCysSerSerGluPhe

TABELA 17

Sequência de nucleótidos e sequência de aminoácidos dela deri vada, do extremo 3' 80 gene de P. falciparum (Isolado FCBR) , especificado através da inserção do clono 41-2

124o 1260 1280

GAATTCCAAGCAGATGTTACAGCGCACACTATTCATGAAGGCGATGATAATTATAACACT GluPheGlnAlaAspValThrAlaHisThrlleHi sGluGlyAspAspAsnTyrAsnThr

I3OO I32O 1340

ACTATTTTTATTAAATTTTATCCGGAAGTAGTGGAAAGAGAAAAAAACCACTAGATATTC ThrllePhelleLysPheTyrProGluVaIVaIGluArgGluLysAsnHi s

TABELA 17 (continuação)

1360 13801400

ATATAAGGGTCACACAATAAATATATATATATAATACATGTTGTATAAGTTGTCAAAAAA

1420 14401460

TTTATATGCAAAAAAATAAATTAAATATGTAAATATATATATATATATATATATATATAT

1480 I5OO1520

TCTTTCTTTCTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTGTTATTATTAATGTATTATTTATCCTTATG

1540 I56OI58O

CATGGGATTATTTAACAAATTTATTGATAAAATAAATGTACCCCTTTTTTTTTTTTCTTT

1600 16201640

TTTTTCTTTTTTTTTTTTTTGTATAAACATATTTATATATATTTATATTTAATTAAACCT

1660 I68O1700

TTTTTAACATTTTAAATCTATATGAAATAATAAATGAAGACATGACTATTTTAATACAAG

1720 17401760

GAAATTAATGGTTCCTTAAATTTCACATAAAAAAAAAAATAAAACATATAATATATATAT

I78O 18001820

ATATATATATAAAACACTTGGTTCTAATITTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAA

1840 18601880

TTTGTATGGAGATATTATAATATTTAAACAATATATATGACATATATAGAGGACATACAG

19OO 19201940

TTACCAATATTTTCAATACATTGTTGGAATTTTTTATTTTTTCATATATCATACATAAGA

1960 I98O2000

CCTTCTGGAAAAGAAAAAAGTAATAAAGTGTCTTATATACTATTAATTTTGAATATAGAT

2020 20402060

TTTTTTTCTTTTCTTTCAAAATTAAAAAGTATTCTATCAATGTATGTAAAATATATAATT
2O8O 21002120

TTACTTTTTTTTTGTTCTTTTTTCTATTTTTAAATACGTATGTCCTCGTTTTTTTTTTTT

2140 21602180 _{CTTTTTATAACATTATTTTGCATATTCCAAATTTTTTCTATGTGTCCAAAAAAAAAAAAA}

2200 22202240

AAAAAAATAAAGTGTTAATAAAAAAATTAAATAATATATGTGAAGATACTTTTTTTAATA

2260

TGCATATGTATATATATTTATATATATAGATC

TABELA 18

Sequência de nucleôtidos e sequência de aminoácidos dela de- rivada da proteína 41 KD de P. falciparum

10 3050

AATTTTTTTTTTGAATATTCTTTTTAGCATTTGATATAATATTATTTTGAAAATGGTAAG

70 90110

AATATAAAACATTTAAGAAATAAATAAAAGTACAGTGTTTATATATACCGTATAAATGAA

130 I5017O

TAAGTGTATATATATATATATATATTAAATACATTTATATTATTAATTTATACCAATGCA

190 21023O

TAGTTATATATATATATACTATTATATATGTATTCATTTTATTCTGCTCACATTATTTAT

25O 270290

GCATATGCTTCCTTTATAATAAATATATTCGTATTAACATTCAAGAAATGAGGACGAAAT

310 330350

ATTCCTTAATTTACATATGTATTTTTTTATTAATTGAAAAAAAAAAAAAAATAGTAAAAA

370 390410

TAAGTATAGGCATATATTGAATAATGTGCTGTTGAATTGATTTATATATATATATATATA

430 450470

TATATGTATATTTATTTATATTTATACATATGGGAATATTATATAITTTCCTTTTTTCTT

490 51Θ53O _{ATTTTTATATTTTTATATTTTTTTTTAG6CTCATTGCACTGATATATGAATGCCCCAAAA}

MetAsnAlaProLys

550 570590

AAATTACCAGCAGATGTTGCCGAAGAATTAGCAACCACCGCCCAAAAGCTTGTTCAAGCT LysLeuProAlaAspValAlaGluGluLeuAlaThrThrAlaGlnLysLeuValGlnAla

610 630650

GGAAAGGGAATTTTAGCTGCTGATGAATCAACACAAACCATTAAGAAAAGATTCGACAAC GlyLysGlylleLeuAlaAlaAspGluSerThrGlnThrlleLysLyeArgPheAspAsn

670 690710

ATCAAATTAGAGAACACAATAGAAAACAGAGCTAGCTACAGAGATTTATTATTTGGAACT

IleLysLeuGluAsnThrlleGluAsnArgAlaSerTyrArgAspLeuLeuPheGlyThr

730 750770

AAAGGATTAGGAAAATTCATTTCAGGAGCAATTTTATTTGAAGAAACATTATTTCAAAAG LysGlyLeuGlyLysPhelleSerGlyAlalleLeuPheGluGluThrLeuPheGlnLys

790 810830 aatgaagccggtgtaccaatggttaatttattacacaatgaaaatataattccaggtatt

AsnGluAlaGlyValProMetValAsnLeuLeuHi sAsnGluAsnllelleProGlylle

850 87089O

AAGGTTGATAAAGGTTTGGTTAACATTCCATGCACAGATGAAGAAAAATCAACTCAAGGT

LysValAspLysGlyLeuValAsnlleProCysThrAspGluGluLysSerThrGlnGly

TABELA 18 (continuação)

910 930 95O

TTAGATGGATTAGCAGAAAGATGCAAAGAGTATTATAAAGCTGGTGCAAGGTTTGCTAAA

LeuAspGlyLeuAlaGluArgCysLysGluTyrTyrLysAlaGlyAlaArgPheAlaLys

970 990 1010

TGGAGAACAGTTTTAGTTATTGACACAGCCAAAGGAAAACCAACTGATTTATCAATTCAC

TrpArgThrVaILeuValIleAspThrAlaLysGlyLysProThrAspLeuSerlleHi s

IO3O IO5O1070

GAAACTGCATGGGGATTGGCTAGATATGCATCTATTTGTCAACAAAATAGATTAGTTCCA

GluThrAlaTrpGlyLeuAlaArgTyrAlaSerlleCysGlnGlnAsnArgLeuValPro

1090 11101130

ATTGTTGAACCTGAAATTTTAGCTGATGGACCACACTCAATTGAAGTTTGTGCAGTTGTA IleValGluProGluIleLeuAlaAspGlyProHi sSerlleGluValCysAlaVaIVal

II5O 11701190

ACTCAAAAAGTTTTATCATGTGTATTTAAAGCTTTACAAGAAAATGGTGTATTATTAGAA ThrGlnLysValLeuSerCysValPheLysAlaLeuGlnGluAsnGlyValLeuLeuGlu

1210 I23O1250

GGTGCATTGTTAAAACCAAACATGGTTACTGCTGGTTATGAATGTACTGCTAAAACCACT

GlyAlaLeuLeuLysProAsnMetValThrAlaGlyTyrGluCysThrAlaLysThrThr

1270 1290I3IO

ACTCAAGATGTTGGTTTCTTAACTGTCAGAACCTTAAGGAGAACTGTACCACCAGCCTTA

ThrGlnAspVaIGlyPheLeuThrValArgThrLeuArgArgThrValProProAla Leu

I33O 13501370

CCAGGTGTTGTATTTTTATCTGGAGGACAATCAGAAGAAGAGGCTTCTGTTAATTTAAAT

ProGlyValValPheLeuSerGlyGlyGlnSerGluGluGluAlaSerValAsnLeuAsn

1390 14101430

TCAATCAATGCTTTGGGTCCACACCCATGGGCTrTAACCTTCTCTTACGGTAGAGCTTTA

SerlleAsnAlaLeuGlyProHi sProTrpAlaLeuTh^PheSerTyrGlyArgAlaLeu

1450 14701490

CAAGCTTCAGTATTGAACACATGGCAAGGAAAGAAAGAAAATGTTGCAAAGGCAAGAGAA

GlnAlaSerValLeuAsnThrTrpGlnGlyLysLysGluAsnValAlaLysAlaArgGlu

I5IO 15301550

GTTTTATTACAAAGAGCTGAAGCCAACTCCTTAGCAACTTATGGTAAATACAAAGGAGGT

ValLeuLeuGlnArgAlaGluAlaAsnSerLeuAlaThrTyrGlyLysTyrLysGlyGly

1570 1590 1610

GCAGGTGGTGAAAATGCAGGTGCTTCATTATATGAAAAGAAATATGTCTATTAAAAACTT AlaGlyGlyGluAsnAlaGlyAlaSerLeuTyrGluLysLysTyrValTyr

I63O I65O I67O

CACCAACCAAAAATGAATAATAATAATAATAAATAAATTACTAAATGAATGGTACTATAT

TABELA 18 (continuação)

1690 1710I73O

TTTTAAAAATAAGGGTAATATATTTCTGTATGTATATATATATATATATATATACAAATA

1750 17701790

TGTGAATATAAAAAAAAAAAAAAAATGTAATATATATCGATCAATGTATATCTACGATAT

1810 18301850

ATAAATATATATTTATTCATATCTCCCTTTTTTAGATGATATATTATAATACCTAAAATT

I87O I89O1910

ATATATATTTATTTATTATTATTTTATTTATTTAATAATTTTTTTTTATTAGTAAATGAT

1930 19501970

AATAAATTTrTTAAACGTTTTTTCAACGTTTTATTAAATGTGTAAATATAAATATAAATA

1990 20102O3O

TTATATATATATATATATATATATGTATGTATTTATTTATTTATTTATATATACATACAT

2050 20702090

ACCTGTTGACATTCATGTAATATAATAAAGGAACACATGCTTATTTTGTATTATATATCT

2110 213O2150

TACCTTCTACTTTTTAATAAAAAATGTCAAAGCAGGAAATAAAAACTTTTTAATTTAACC

2170 219O2210

AAAAAAATATAATTAATGATGTACACTTATAGATATTGATACAAGAAAAACATTATATAT

2230 22502270

GTTTTTTTTTT CTTT ΟΊΜ?ΊΜΜ?ΤΤΤΤΤΤΤΊΤΤΤΤΤΤΤ A ATT AT A A C A A A A A ATATTT ATT A

2290 23IO233O

TAATATATAATTTTAAATGAATGATGCAAATTTAATGAGCCATTTTATTTATATTTTAAA

235O2370

TAATTATAATAATAACGTACATATATAAAATGGTGATTGAATT em sistemas hospedeiros procarióticos ou eucarióticos.

- 2^a Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se utilizarem as sequências dos clonos 41—1, 41-2, 41-3, 41-4, 41-5, 41-6, 41-7, 41-8, 41-9, 41-10, 41-12, . 41-13, 41-14, 41-15, 41-17, 41-2 gene e 41-7 gene.
3^a Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por se prepararem proteínas de fusão por ligaçao , as sequências dos clonos, de acordo com a reivindicação 2, de outras proteínas ou partes delas.

- 4a Processo para a preparaçao de anticorpos poli clonais ou monoclonais, caracterizado por se utilizarem para a imunização as proteínas de Plasmodium falciparum preparadas de acordo com as reivindicações 1 ou 2.

Processo para a preparaçao de uma vacina, caracterizado por se empregarem um ou mais dos antigenes preparados de acordo com as reivindicações 1 ou 2.

-6a -

Processo para o isolamento de proteínas de

Plasmodium falciparum, caracterizado por se empregarem os an**I ticorpos preparados de acordo com a reivindicação 4.

Processo para a preparaçao de meios de diagnái tico, caracterizado por se empregarem anticorpos preparados de ** .

acordo com a reivindicação 4.

- 8a _

Processo para a preparaçao de meios de diagnás tico, caracterizado por se empregarem proteínas de Plasmodium falciparum preparados de acordo com as reivindicações 1 ou 2.

_ ₉a Processo para a preparaçao de meios de diagnás tico, caracterizado por se empregarem os ácidos nucleicos que codificam para as sequências de aminoácidos indicadas nas tabelas 1 a 18.

A requerente declara que os primeiros pedidos desta patente foram apresentados na República Federal Alemã em 30 de Dezembro de 1987 e 15 de Setembro de 1988, sob os n^as. P 37 44 495.6 e P 38 31 351-Oj respectivamente.