JP2002516656A

JP2002516656A - アテローム性動脈硬化症の治療におけるコレステロール・エステル転移タンパク質に対するｄｎａワクチン接種

Info

Publication number: JP2002516656A
Application number: JP2000512947A
Authority: JP
Inventors: ニードルマン、フィリップ; グレン、ケビン
Original assignee: モンサントカンパニー
Priority date: 1997-09-19
Filing date: 1998-09-17
Publication date: 2002-06-11
Also published as: CA2302778A1; WO1999015655A1; EP1015584A1; AU9231798A

Abstract

(57)【要約】コレステリル・エステル転移タンパク質（ＣＥＴＰ）に結合する抗体産生を誘導する方法を開示する。その方法は（ａ）組換え型ＤＮＡ分子が溶媒に溶解または拡散している、哺乳類を（ｉ）（ｉｉ）に結合するＣＥＴＰ免疫原をコードする配列、（ｉｉ）ＣＥＴＰ免疫原の発現を制御するプロモーター配列、を含むＤＮＡ配列を含む組換え型ＤＮＡを含む接種物で免疫する段階；および（ｂ）ＣＥＴＰに結合する抗体産生を誘導するために、好ましくは哺乳類自身の血液がＣＥＴＰを含有するＨＤＬからのコレステリル・エステルの転移を弱めるために十分な期間免疫した哺乳類を維持する段階、を含む。本発明を実施するための免疫原、接種物、ＤＮＡ部分、および組換え型ＤＮＡ分子ベクターも開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明はコレステロール・エステル転移タンパク質（ＣＥＴＰ）またはその一
部をコードするＤＮＡによる免疫によって哺乳類に抗体を誘導する方法、より詳
しくは低ＨＤＬ／ＬＤＬコレステロール比を特徴とする免疫動物における血中リ
ポタンパク質異常症を、誘導された抗体と共にその方法において用いられる特異
的ＤＮＡ構築物によって改善する免疫学的方法に関する。

【０００２】（発明の背景）コレステリル・エステル転移タンパク質（ＣＥＴＰ）は、高密度リポタンパク
質（ＨＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、および超低密度リポタンパク
質（ＶＬＤＬ）コレステロールの血漿中濃度ならびに血漿中の脂質成分を確立す
る上で重要な役割を果たしている酸性血漿糖タンパク質である［ラグロスト（Ｌ
．Ｌａｇｒｏｓｔ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１２１５
：２０９〜２３６（１９９４）］。それらのいくつかを下記で述べるいくつかの
研究から、ＣＥＴＰがＨＤＬ粒子からＬＤＬおよびＶＬＤＬ粒子へのコレステリ
ル・エステルの転移を媒介するのみならず、ＬＤＬおよびＶＬＤＬからＨＤＬ粒
子へのトリグリセリド（ＴＧ）の転移を媒介することが示された。ＣＥおよびＴ
Ｇのこの相互交換は、多くの哺乳類の種においてＬＤＬおよびＶＬＤＬ粒子にＣ
Ｅを提供する主な手段となっている。このようにＣＥＴＰは、前アテローム発生
性（ＬＤＬおよびＶＬＤＬ）と抗アテローム発生性（ＨＤＬ）リポタンパク質分
画の間で、コレステリル・エステル（ＣＥ）およびトリグリセリド（ＴＧ）のバ
ランスのとれた交換を媒介する。

【０００３】その血漿がＣＥＴＰを含むヒトならびにその他の霊長類、ウサギおよびハムス
ターのような哺乳類種は、コレステロールに富む食事を与えられるとアテローム
性動脈硬化症および心疾患を発症する。マウス、ラットおよびイヌのような他の
動物種は血漿中ＣＥＴＰ（転移活性として測定）を欠損し、食事性のコレステロ
ール誘発アテローム性動脈硬化症に対する感受性が低い。

【０００４】ＣＥＴＰがヒトのアテローム性動脈硬化症の発病に関与していることは、トラ
ンスジェニックマウスの研究によって強く支持されている［メルキオール（Ｇ．
Ｍｅｌｃｈｉｏｒ）ら、ＴｒｅｎｄｓｉｎＣａｒｄ．Ｍｅｄ．、５：８３〜
８７（１９９５）］。例えば、カニクイザルのＣＥＴＰｃＤＮＡに加えてＣＥ
ＴＰプロモーターの近位領域のミニ遺伝子を有するトランスジェニックマウスは
ヒト、ハムスターおよびサルにおいて認められるものと類似のＣＥＴＰレベルの
食事によるコレステロール調節を示す。サルＣＥＴＰの高レベル（ヒト脂質異常
血症と同等のレベル）を発現するそのようなトランスジェニックマウスは：ＬＤ
Ｌ＋ＶＬＤＬコレステロールおよびａｐｏ−Ｂの増加、およびＨＤＬコレステロ
ール、ＬＤＬ−受容体、およびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼｍＲＮＡの減少を示
す。カニクイザルＣＥＴＰトランスジーンを有するトランスジェニックマウスで
は、高脂肪食によってアテロームを誘発することができる。

【０００５】哺乳類種のＣＥＴＰアミノ酸残基およびヌクレオチド配列は特徴付けがなされ
ている。例えば、配列番号：１のヒトＣＥＴＰＤＮＡ配列が決定されている［
ドレイナ（Ｄ．Ｄｒａｙｎａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ，３２７：６３２〜６３４（１
９８７）］。配列番号：２７のウサギＣＥＴＰＤＮＡ配列［ナガシマ（Ｍ．Ｎ
ａｇａｓｈｉｍａ）ら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．、２９：１６４３〜１４６９
（１９８８）；コタケ（Ｋｏｔａｋｅ）ら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．、３７：
５９９〜６０５（１９９６）およびコタケ（Ｋｏｔａｋｅ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ
．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１３４７：６９〜７４（１９９７）］もまた、
配列番号：３１のカニクイザルＣＥＴＰ配列［ペイプ（Ｍ．Ｅ．Ｐａｐｅ）ら、
ＡｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓａｎｄＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓ、１１：１７
５９〜１７７１（１９９１）］と同様に特徴付けがなされている。ヒトＣＥＴＰ
タンパク質はアミノ酸残基４７６個の長さであるが、ウサギＣＥＴＰタンパク質
はアミノ酸残基４９６個、そしてカニクイザルの配列は４７６残基を含む。

【０００６】ＣＥＴＰはアテローム性動脈硬化症または冠動脈疾患（ＣＡＤ）患者において
血漿中リポタンパク質のアテローム発生を総合的に調節する重要な因子である。
ＣＡＤは西欧社会において罹患および死亡原因の第一位である。冠動脈疾患を発
症するリスクが増加している患者は典型的に、ＣＥＴＰ活性のレベルが増加して
いる。また、ＣＥＴＰは本来のＬＤＬ分子より酸化ＬＤＬに対する親和性が高い
ことも報告されている［ラグロスト（Ｌ．Ｌａｇｒｏｓｔ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１２１５：２０９〜２３６（１９９４）］。ＬＤ
Ｌコレステロールが高レベルであること（＞１８０ｍｇ／ｄｌ）［Ｊ．Ａｍ．Ｍ
ｅｄ．Ａｓｓｏｃ．、２６９：３０１５〜３０２３（１９９３）およびグールド
（Ａ．Ｌ．Ｇｏｕｌｄ）ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、９１：２２７４〜２２８
２（１９９５）］、およびＨＤＬコレステロールが低レベルであること（＜３５
ｍｇ／ｄｌ）［アスマン（Ｇ．Ａｓｓｍａｎ）ら、ＥｘｃｅｒｐｔａＭｅｄｉ
ｃａ、４６〜５９（１９８９）およびマンニネン（Ｖ．Ｍａｎｎｉｎｅｎ）ら、
Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、８５：３７〜４５（１９９２）］は、アテローム性動
脈硬化症の発症に対する重要な寄与因子であることが報告されている。

【０００７】ＣＥＴＰタンパク質を遺伝的に欠損するヒトはＨＤＬコレステロールレベルが
上昇している。ヘテロ接合者は非罹患対照者よりＨＤＬレベルが１５〜２０％高
い。他の危険因子に対して補正した後のＨＤＬコレステロールが１ｍｇ／ｄｌ増
加する毎にＣＡＤ発生率が２〜３％減少することが示唆されている［グロドン（
Ｄ．Ｊ．Ｇｒｏｄｏｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、７９：８〜１５（１９８９）］。

【０００８】ハムスターにおけるＣＥＴＰ欠損症の実験モデルでは、マウス抗ヒトＣＥＴＰ
モノクローナル抗体（１Ｃ４）を受動移入すると、１Ｃ４の５００μｇ（約３．
７ｍｇ／ｋｇ体重）を注射後２４時間までの全ての時間においてハムスターの血
漿ＣＥＴＰＣＥ転移を７０〜８０％阻害することが示されている。インビボに
おいてハムスターＣＥＴＰによる転移の阻害によって、ハムスターＨＤＬコレス
テロールは３３％増加し、ＨＤＬ−ＣＥは３１％増加し、およびＨＤＬ−ＴＧは
４２％減少した。これらの結果は、哺乳類（ハムスター）のＣＥＴＰ媒介ＣＥ−
ＴＧ交換が異種抗ヒトＣＥＴＰモノクローナル抗体によって破壊されている例を
示し、ＣＥＴＰ阻害を調べる前臨床モデルとしてハムスターを利用できることを
さらに示している［ゲイナー（Ｇａｙｎｏｒ）ら、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓ
ｉｓ，１１０（１）：１０１〜１０９（１９９４）］。

【０００９】メルキオ（Ｇ．Ｗ．Ｍｅｌｃｈｉｏｒ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７
０（３６）：２１０６８〜７４（１９９５）によって報告されたもう一つの研究
において、カニクイザルＣＥＴＰは、２つの中性脂質結合部位を有することが示
された。ＣＭＴＰ−２と呼ばれる精製したカニクイザルＣＥＴＰに対するモノク
ローナル抗体は、トリグリセリド（ＴＧ）転移を強く阻害することができるが、
コレステリル・エステル（ＣＥ）転移に対する作用は多様であった。

【００１０】このように、モノクローナル抗体を血漿中のＴＧ転移を９０％以上阻害する用
量でカニクイザルに皮下投与すると、高密度リポタンパク質コレステロールレベ
ルには検出可能な作用を認めないが、ＨＤＬ−ＴＧレベルはＨＤＬの１３から１
モル／モルに減少した。Ｆａｂ抗体断片はＣＥ転移に対して影響を及ぼさなかっ
たが、ＴＧ転移を完全に遮断した。もう一つのタイプの阻害剤である６−塩化水
銀コレステロールは、ＣＥ転移を強く抑制したがＴＧ転移の阻害はほとんど認め
なかった。阻害性のモノクローナル抗体および６−塩化水銀コレステロールの双
方をアッセイに加えると、ＣＥおよびＴＧ転移がいずれも阻害され、このことは
阻害剤がＣＥＴＰ上の同じ結合部位で競合しないことを示した。この研究は、異
種モノクローナル抗体のインビボ投与がＣＥおよびＴＧ転移とカップリングして
いないことを示した。

【００１１】アンチセンスＲＮＡがＣＥＴＰタンパク質の発現に及ぼす阻害作用は、ワクシ
ニアウイルスを発現系として用いて報告された［リー（Ｍ．Ｈ．Ｌｅｅ）、ら、
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２８（３）：２４３〜２４８（１９
９５）］。ＣＥＴＰからのｃＤＮＡを転移ベクター（ｐＳＣ１１）にセンスおよ
びアンチセンス方向に挿入し、次にこれを用いて組換え型ワクシニアウイルスを
構築した。ノザンおよびウェスタンブロット分析において、アンチセンス発現の
用量が増加するにつれてマウス細胞における外因性ＣＥＴＰｃＤＮＡの発現の
減少は明らかに明白であった。同様にＣＥＴＰアッセイにおいても、ＣＥＴＰ活
性はセンス構築物のみに感染させた細胞抽出物から得られた活性と比較して減少
していた。

【００１２】より最近、スガノ（Ｓｕｇａｎｏ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１（
３２）：１９０８０〜１９０８３（１９９６）は、アンチセンスＣＥＴＰＲＮ
Ａをウサギに投与したインビボ作用について報告した。その報告書において、総
コレステロールおよびＣＥＴＰ活性レベルの減少は、アンチセンスＣＥＴＰ投与
の２４、４８および９６時間後に認められ、ＨＤＬコレステロールの血漿中濃度
は４８時間後に増加した。

【００１３】ＣＥＴＰ媒介転移を阻害するその他の方法は、文献に記載されている。例えば
、パーク・デービス社のデータはＰＤ１４０１９５と呼ばれる低分子化合物の
１０〜２０ｍｐｋをウサギに注入すると、３０分以内にＣＥＴＰ活性を阻害する
（エクスビボアッセイによって測定）ことを示した［ビスゲイアー（Ｃ．Ｂｉｓ
ｇａｉｅｒ）ら、Ｌｉｐｉｄｓ、８１１〜８１８（１９９４）］。シェリング・
プラウ社は海綿からのウィーデンジオール−Ａおよび−Ｂの単離に関して公表し
、このクラスの化合物がインビトロでＣＥＴＰ媒介ＣＥ転移の低μＭ阻害剤であ
ることを示した［コバル（Ｓ．Ｃｏｖａｌ）ら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ
．Ｃｌａｉｍ．Ｌｅｔｔ．、５：６０５〜６１９（１９９５）］。

【００１４】現在、ニコチン酸およびフィブレート系の薬剤は、ＨＤＬコレステロールの有
意な上昇を生じる唯一の低分子薬剤療法である。これらの薬剤は耐容性が不良で
しかも毎日服用しなければならない。これらの薬剤の治療的用量によってＨＤＬ
コレステロールが１５〜２０％増加する。

【００１５】ＣＥＴＰ上の類似のエピトープを認識するヒトＣＥＴＰに対する３つのモノク
ローナル抗体は、ヒト血漿ＣＥおよびトリグリセリド転移活性に関しては、平行
で完全なインビトロ免疫抗体価測定値を示したが、燐脂質転移活性に関しては部
分的阻害を示したに過ぎなかった［ヘスラー（Ｃ．Ｂ．Ｈｅｓｌｅｒ）ら、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３（１１）：５０２０〜５０２３（１９８８）］。
それらの３つのモノクローナル抗体は当初５Ｃ７、２Ｈ４、および７Ｅ１と命名
されたが、同じ著者らの最近の論文ではそれらのモノクローナル抗体はそれぞれ
ＴＰ２、ＴＰ１およびＴＰ３と呼ばれている。

【００１６】モノクローナル抗体ＴＰ２はＣＥＴＰの最後のアミノ酸２６個（配列番号：２
９）の中のエピトープに対して作製され［スウェンソン（Ｔ．Ｌ．Ｓｗｅｎｓｏ
ｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４：１４３１８〜１４３２６（１９８
９）］より詳しくは配列番号：２８の４６５位〜４７５位の間のエピトープに対
して作製されている［トール（Ｔａｌｌ）、Ｊ．ＬｉｐｉｄＲｅｓ．、３４：
１２５５〜１２７４（１９９３）］。そのモノクローナル抗体は、ＣＥＴＰのカ
ルボキシ末端において脂質結合部位に近づくことを制限することによって、ＣＥ
ＴＰ媒介脂質転移を遮断することが示されている。

【００１７】ＣＥＴＰに対する異種マウスモノクローナル抗体（ＴＰ１）を用いたインビボ
試験において、ウサギにＴＰ１、無関係なモノクローナル抗体または生理食塩液
（対照）を静脈内注射したところ、ＣＥＴＰ媒介ＣＥ転移活性の初回７０％阻害
を認めた。阻害はＴＰ１注射動物において４８時間後で４５％であった。ＨＤＬ
−ＣＥはＴＰ１−処置動物において増加し、４８時間では初回および対照値の２
倍のレベルに達した。ＨＤＬ−ＴＧは反比例して減少したが、ＨＤＬタンパク質
は変化せず、このことはＣＥがＴＧに交換されたことを示唆している。ＶＬＤＬ
−ＣＥ−ＴＧ比もまた減少した。ＣＥＴＰ阻害は放射活性標識ＨＤＬの初回クリ
アランスを遅らせ、このことはＣＥＴＰがウサギのＨＤＬ−ＣＥ代謝において重
要な役割を果たして、ＴＧのＣＥへの交換を促進し、血漿からのＣＥのクリアラ
ンスを促進することを示唆している［ホィットロック（Ｍ．Ｅ．Ｗｈｉｔｌｏｃ
ｋ）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、８４：１２９〜１３７（１９８９）］
。

【００１８】ハムスターを用いたさらなる動物試験において、異種抗体の受動的投与に関す
るもう一つの実例としてＴＰ２モノクローナル抗体を単回皮下注射すると、ＣＥ
ＴＰ媒介活性が５８％減少し、ＬＤＬ＋ＶＬＤＬコレステロールが３２％低下し
、ＨＤＬコレステロールは２４％増加した［エバンス（Ｇ．Ｅｖａｎｓ）ら、Ｊ
．ＬｉｐｉｄＲｅｓ．、３５：１６３４〜１６４５（１９９４）およびズッカ
ーマン（Ｓ．Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ）ら、Ｌｉｐｉｄｓ．、３０：３０７〜３１１
（１９９５）］。ＴＰ２モノクローナル抗体がＣＥＴＰ媒介ＣＥ転移の阻害に及
ぼす作用は注射後２４時間以内では明白で、４日までに最大となった。リポタン
パク質レベルはＴＰ２投与の１４日後に対照レベルに戻った。ＴＰ２モノクロー
ナル抗体投与による、ＨＤＬコレステロールレベルに対するＶＬＤＬ＋ＬＤＬコ
レステロールの比のシフトは、高コレステロール血症のハムスターではより重要
であった。

【００１９】ＴＰ２は、コレステロールに富む西欧の食事によって飼育したハムスターでは
より有効である。ＣＥＴＰ媒介活性は、これらの動物では試料で飼育したハムス
ターの２倍増加していることが報告された。

【００２０】組換え型ＣＥＴＰ分子の調製はいくつかの研究グループによって報告されてい
る。例えば、最近報告された研究では、ＣＶ−１サル腎細胞にトランスフェクト
させたワクシニアウイルス転移ベクターを用いて、グルタチオンＳ−トランスフ
ェラーゼ−ヒトＣＥＴＰ融合タンパク質（８６ｋＤａ）を発現させた。ウェスタ
ンブロットアッセイを用いて、ＧＳＴと融合させたＣＥＴＰのカルボキシ末端活
性領域に対して作製したポリクローナル抗体によって、融合タンパク質を同定し
た。融合タンパク質のＧＳＴ部分を切断した後、精製したＣＥＴＰは、ＣＥＴＰ
インビトロアッセイにおいて生物活性を示した［ヨーン（Ｗ．Ｈ．Ｙｏｏｎ）ら
、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ、５（２）：１０７〜１１３（１９９５）およびヤン（Ｊ
ａｎｇ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２８（３）：２１６〜
２２０（１９９５）］。

【００２１】同様に、ＧＳＴ−ＣＥＴＰ融合タンパク質で免疫することによって特異的なウ
サギポリクローナル抗体を作製した。大腸菌に発現させた完全長のＣＥＴＰ分子
が不溶性であることが判明した後、ヒト心臓λｇｔ１１ライブラリから単離した
完全長のＣＥＴＰｃＤＮＡクローンを用いて、ＣＥＴＰのＣ−末端９４ｂｐを
得た。λｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリをｐＧＥＸプラスミドにサブクローニン
グしてＧＳＴ−ＣＥＴＰ融合タンパク質を大腸菌に発現させた。ＣＥＴＰ−ＧＳ
Ｔ融合タンパク質をグルタチオン−セファロース−４Ｂアフィニティクロマト
グラフィーによって精製し、ウサギポリクローナル抗体を産生するための抗原と
して用いた。抗体は、ＧＳＴ−ＣＥＴＰ融合タンパク質に対してのみならず、ヒ
トＣＥＴＰのカルボキシ末端領域からの２つの二量体の配列に相当する合成ペプ
チドの混合物に対しても良好な力価を示した。抗体はＣＥＴＰアッセイの免疫学
的ツールとして有用であると報告された［ジェオン（Ｎ．Ｗ．Ｊｅｏｎｇ）ら、
Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ、４（４）：５２９〜５３３（１９９４）］。

【００２２】今日まで、ＣＥＴＰ媒介ＣＥ転移の長期阻害に関する報告は公表されていない
。異種抗体を用いた受動免疫は、宿主動物が異種免疫グロブリンに対して抗体を
作製するために、短期間に限って利用することができる。

【００２３】異種抗体を用いる場合と比較して宿主誘導免疫応答を産生する一つの戦略は、
ＤＮＡワクチンまたは「遺伝子免疫」技術に基づく［マクドネル（Ｗ．Ｍ．Ｍｃ
Ｄｏｎｎｅｌｌ）ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３４（１）：４２０４５
（１９９６）］。典型的に、ＤＮＡワクチンは、外皮、表面、またはコアタンパ
ク質のようなウイルスの抗原性部分をコードする１つ以上の遺伝子を含むベクタ
ーを含む。宿主細胞はＤＮＡベクターを取り込んで異種遺伝子を発現し、対応す
るウイルスタンパク質を細胞内で産生する。

【００２４】このアプローチの一つの長所はウイルスタンパク質が入り、細胞の腫瘍組織
適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩ経路によるプロセシングを受けることである
。ＭＨＣクラスＩ分子は細胞表面にペプチド断片を所有して、そこでそれらはＣ
Ｄ^＋８細胞障害性Ｔ細胞を刺激することによって細胞性免疫を誘発する。標準的
なワクチン抗原は貧食またはエンドサイトーシスによって細胞内に入り、ＭＨＣ
クラスＩＩシステムによるプロセシングを受けて、抗体反応を刺激する。

【００２５】過去数年間のＤＮＡワクチン技術の迅速な開発は、インフルエンザＡウイルス
からの遺伝子を直接注射することを用いて疾患に対してマウスを免疫することが
できる［ウルマー（Ｊ．Ｂ．Ｕｌｍｅｒ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５９：１７４
５〜１７４９（１９９３）］という報告によって拍車がかけられた。それ以来、
インフルエンザＮＰ、ＨＡ、Ｍ１タンパク質；ＨＩＶＥｎｖ、Ｇａｇ、Ｒｅｖ
タンパク質；ウシヘルペスウイルスｇｐ；Ｂ型肝炎ウイルス表面およびコア抗原
；狂犬病ウイルスｇｐ、ＮＰ、マラリア原虫属ＣＳＰ；リーシュマニア主要ｇｐ
６３；結核菌ＨＳＰ６５、Ａｇ８５；Ｃ型肝炎ウイルスヌクレオカプシドタンパ
ク質；単純ヘルペスウイルスｇＢ、ｇＤ、ＩＣＰ２７；パピローマウイルスＬ１
；ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型外皮；リンパ球脈絡髄膜炎ウイルスＮＰ；バチ
ルス・スリンギエンシス・エンドトキシン；マイコプラズマ・プルモニスＮＤ；
およびチフス菌ＯｍｐＣポーリンを含む、多様な病原体由来タンパク質に関して
抗体の誘導が報告されている［ウルマー（Ｊ．Ｂ．Ｕｌｍｅｒ）ら、ＡＳＭＮ
ｅｗｓ、６２（９）：４７６〜４７９（１９９６）に引用した参考文献を参照の
こと］。これらの例のそれぞれについて、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）もし
くは保護的免疫の誘導またはその両者が報告されている。

【００２６】ＤＮＡワクチンの有効性および費用に関して、従来のアプローチによって調製
されたワクチンと比較して考えられる長所は、過去の世紀に開発されたその他の
２つの主要な進歩と同程度に重要であると見なされる。ルイ・パスツールが先駆
けとなった第一の進歩は弱毒化および死菌型の微生物を使用することであった。
第二の主要な進歩は微生物全体の明確な成分を使用すること、および精製した組
換え型タンパク質を使用することであった。ＤＮＡワクチンアプローチは「第三
の革新」と呼ばれている［ディクソン（Ｂ．Ｄｉｘｏｎ）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ、１３（５）：４２０（１９９５）］。

【００２７】ＤＮＡワクチンはその他のタイプのワクチンと比べていくつかの長所を有する
［ウルマー（Ｊ．Ｂ．Ｕｌｍｅｒ）ら、ＡＳＭＮｅｗｓ、６２（９）：４７６
〜４７９（１９９６）］。第一に、宿主細胞に導入されたベクター上でコードさ
れる抗原の発現によって、構造的に関連するタンパク質の産生が起こり、これは
適当に改変されて、細胞障害性Ｔリンパ球の誘導に至る。第二に、ＤＮＡワクチ
ンは、複雑なタンパク質製剤または弱毒化した生きた微生物に頼ることなく、Ｃ
ＴＬ反応を誘発する。細菌、またはウイルスのような弱毒化した生きた微生物も
また、本来有するより有毒型への変異能が増大している。第三に、ＤＮＡワクチ
ン接種後の抗原の発現は場合によっては、メモリー免疫細胞の誘導を促進するた
めに十分なほど数ヶ月も持続しうる。なおさらに、ＤＮＡワクチンは単純な水溶
液中で筋肉内もしくは皮内に容易に注射することができる、または遺伝子ガンに
よって細胞の中に発射される金属粒子上にコーティングすることができ、これに
よって投与およびその後の分析が容易となる［フィナン（Ｆｉｎａｎ，Ｅ．Ｆ．
）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１１４７８〜１１
４８２（１９９３）］。

【００２８】記述の本発明は以降、ＣＥＴＰに対する抗体を産生する自己原性免疫プロセス
を提供し、その血液がＣＥＴＰを含む哺乳類においてＤＮＡワクチンを利用する
ことによって、ＨＤＬ粒子からのコレステリル・エステルの転移を長期間にわた
って弱めることを提供することができる。このプロセスによって、抗アテローム
性のＨＤＬコレステロール濃度が長期間にわたって上昇する。

【００２９】（発明の簡単な概要）本発明は、ＨＤＬ粒子からのコレステリル・エステルの転移を弱めるため、お
よびその血液が同様にＣＥＴＰを含む哺乳類のＨＤＬコレステロール濃度を増加
させるための自己原性（ａｕｔｏｇｅｎｅｉｃ）免疫学的方法を企図する。企図
される方法は低ＨＤＬ／ＬＤＬコレステロール比を特徴とするヒト前アテローム
誘発性脂質異常血症（ｐｒｏ−ａｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃｄｙｓｌｉｐｏｐｒｏ
ｔｅｉｎｅｍｉａｓ）の治療に有用である。同様に、有用な免疫原をコードする
単離および精製されたＤＮＡならびにそのＤＮＡに対する発現系も本発明に含ま
れる。

【００３０】企図される１つの方法は以下の工程を含む：（ａ）ＣＥＴＰアミノ酸残基配列を有する免疫原性ポリペプチドであるＣＥＴ
Ｐ免疫原をコードするＤＮＡ分子を含み、ＤＮＡ分子が溶媒に溶解または分散し
ている接種物によって、治療すべき哺乳類を免疫する工程；および（ｂ）ＣＥＴＰに結合する抗体の産生を誘導するために、および好ましくはＨ
ＤＬからのコレステリル・エステルの転移を弱めるために、免疫するＤＮＡが免
疫原性ポリペプチドを発現するために十分な期間、免疫した哺乳類を維持する工
程。一つの態様においてＤＮＡは組換え型ヒトまたはウサギＣＥＴＰのような無
傷のＣＥＴＰ分子である免疫原性ポリペプチドをコードする。もう一つの態様に
おいて、コードされた免疫原性ポリペプチドは、融合タンパク質として外因性の
抗原性担体と共有結合したＣＥＴＰ分子の一部である。

【００３１】好ましい態様において、外因性の抗原性担体はＢ型肝炎コアタンパク質（ＨＢ
ｃＡｇ）またはジフテリアトキソイドである。ＨＢｃＡｇは、ＣＥＴＰのカルボ
キシ末端３０残基のアミノ酸残基配列を有する免疫原性ポリペプチドと融合タン
パク質を形成する、コードされた外因性抗原性担体として特に好ましい。より好
ましい融合タンパク質は、そこからアミノ酸残基約３〜約５３個が欠失し、より
好ましくはさらにＨＢｃＡｇから欠失したアミノ酸残基数とほぼ同等の長さを有
する免疫原性ポリペプチドに置換されているＢ型肝炎コア抗原のアミノ酸残基配
列を有するポリペプチドである。得られた融合タンパク質は、より好ましくはＨ
ＢｃＡｇ粒子の大きさ（約２７ｎｍ）を有する粒子として発現される。

【００３２】本発明はいくつかの利点および長所を有する。一つの顕著な利点は、本発明の
企図する方法がＨＤＬからＬＤＬまたはＶＬＤＬへのＣＥ転移を弱めるために利
用することができ、それによって抗アテローム性のＨＤＬコレステロール濃度を
増加させることができる点である。

【００３３】本発明の長所は、本発明の企図する方法が現在利用可能な低分子薬剤の短期効
果と比較して数ヶ月間持続する作用を示しうるという点である。

【００３４】企図される方法のもう一つの利点は、所望の結果を得るために宿主哺乳類自身
（自己原性）の免疫系を利用するために、それによって宿主哺乳類においてそれ
自体が免疫原となる異種抗体の繰り返し投与に関連した問題が回避されるという
点である。

【００３５】本発明に含まれるいくつかの方法のもう一つの長所は、ＨＢｃＡｇ、破傷風ト
キソイドおよびジフテリア・トキソイドのような周知のおよび容認された外因性
抗原性担体を使用して、それらの病原体に対する宿主哺乳類の免疫を強化するこ
とができるという点である。

【００３６】本発明のなおさらなる利点および長所は、以下の開示から当業者に明らかとな
るであろう。

【００３７】（定義）「組換え型」という用語は、化学的、酵素的、または生物学的手段による、欠
失、本来その鎖には存在しない配列（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質の全体も
しくは一部）のその鎖への置換もしくは挿入の結果、本来の分子とは変化してい
るＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質分子を指すために用いられる。

【００３８】「組換え型ＤＮＡ分子」という用語は、本来共存して認められないヌクレオチ
ド配列を少なくとも２個含むハイブリッドＤＮＡ配列を意味するために用いられ
る。

【００３９】本明細書において用いられる「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合し
たアミノ酸残基約１０〜約５００個の配列を指す。タンパク質全体と共に記載の
最小の長さを有するタンパク質の一部もポリペプチドである。

【００４０】「融合タンパク質」という用語は、その中で両遺伝子のアミノ酸残基配列が単
一の分子として共にペプチド結合して発現される、２つ以上の異なる遺伝子の発
現産物を指すために用いられる。融合タンパク質は必ずしも如何なるタンパク質
の完全長のアミノ酸残基配列を有する必要はないが、通常、２つ以上の切断され
た配列を含むことを意味する。したがって、この用語はいくぶん誤称であるが、
とはいえ周知であり、本明細書において定義するように当業者によって用いられ
ている。

【００４１】「融合した」という用語は、本明細書において、融合タンパク質の発現を指す
場合に、ペプチド結合していることを意味するために用いられる。

【００４２】「完全長のＣＥＴＰ」という用語は、そのまま利用できる、または組換え型タ
ンパク質として産生される、完全長のＣＥＴＰ分子（例えば、ヒトＣＥＴＰの場
合はアミノ酸残基４７６個、またはウサギＣＥＴＰの場合は４９６個）を指すた
めに用いられる。

【００４３】「ＣＥＴＰ免疫原」という用語は、ＣＥＴＰと免疫反応する（結合する）抗体
産生を誘導するために用いられる分子を指すために用いられる。

【００４４】「ＣＥＴＰアミノ酸残基配列を有する免疫原性ポリペプチド」または「免疫原
性ポリペプチド」という用語は、抗ＣＥＴＰ抗体によって誘導される「ＣＥＴＰ
免疫原」の一部、すなわち誘導された抗体が結合するＣＥＴＰ免疫原の一部を指
すために用いられる。

【００４５】「外因性抗原性担体」または「担体」という用語は、本明細書において、抗体
産生Ｂ細胞に対してシグナルを提供する、免疫した哺乳類に対して異物である分
子を指すために用いられる。そのような担体およびそれらの機能は当技術分野で
周知である。そのような担体は無傷のタンパク質の長さに対してアミノ酸残基約
１０個という少ない配列を有すると共に、合成ポリマーまたはオリゴマーである
ポリペプチドとなりうる。

【００４６】その様々な文法的表現において用いられる「接種物」という用語は、本明細書
において、記述の目的にとって十分なＣＥＴＰ免疫原（例えば、ポリペプチド結
合物、ＣＥＴＰタンパク質または組換え型タンパク質をコードするＤＮＡ）の量
を含み、水溶性の生理学的に許容される希釈剤に溶解または拡散した組成物を記
述するために用いられる。

【００４７】「発現」という用語は、ポリペプチドを産生するために構造遺伝子が受ける転
写および翻訳を含む、細胞内プロセスの組合せを意味するために用いられる。

【００４８】「機能的に結合した」または「機能的に挿入された」という用語は、２つ以上
のＤＮＡ配列が正しいリーディングフレームにおいて共有結合していることを意
味するために用いられる。

【００４９】「プロモーター」という用語は１つの遺伝子の発現制御エレメントを提供し、
それに対してＲＮＡポリメラーゼが特異的に結合して、その遺伝子のＲＮＡ合成
（転写）を開始する１つのＤＮＡ配列またはＤＮＡ配列のグループ上の認識部位
を意味する。

【００５０】「構造遺伝子」という用語はポリペプチド、すなわちアミノ酸残基配列として
発現されるＤＮＡを意味するために用いられる。

【００５１】「ベクター」という用語は、細胞において複製を可能にするＤＮＡ分子および
／または結合した部分の複製を生じるように、それに対してもう一つのＤＮＡ部
分が機能的に結合しているＤＮＡ分子を意味するために用いられる。プラスミド
は一例としてのベクターである。

【００５２】「発現ベクター」という用語は、それらの遺伝子がベクター内で機能的に結合
すれば構造遺伝子の発現を調節する制御エレメントをＤＮＡ配列が含む、ポリペ
プチドの発現を引き起こすＤＮＡ配列を意味するために用いられる。

【００５３】（発明の詳細な説明）本発明は、ＣＥＴＰに対する抗体の製造方法に関する。好ましくは、産生され
た抗体はＨＤＬからのコレステリル・エステルの転移を弱め、その血液中にＣＥ
ＴＰを有する治療すべき哺乳類の血液中のＬＤＬコレステロールに対するＨＤＬ
コレステロールの比を増加させる。ヒトにおいて、ＨＤＬ対ＬＤＬ比が増加すれ
ば、低ＨＤＬ／ＬＤＬコレステロール比を特徴とする脂質異常血症が改善されう
る。ＨＤＬ／ＬＤＬコレステロール比の望ましい上昇は、治療した哺乳類の血液
中に誘導され、循環しているＣＥＴＰを認識して結合する抗体によって免疫学的
に達成される。同様に、同方法において利用される免疫原をコードするＤＮＡな
らびに、そのＤＮＡおよび企図される免疫原をコードする単離・精製されたＤＮ
Ａ部分を利用する接種物も、本発明に含まれる。

【００５４】（Ｉ．方法）本発明の企図する方法は、本明細書において「自己原性（ａｕｔｏｇｅｎｅｉ
ｃ）」抗体を利用することを指し、有用な抗体は宿主哺乳類そのものにおいて誘
導される抗体であることを意味する。したがって、この自己原性免疫学的方法は
、マウス抗ＣＥＴＰＴＰ２または１Ｃ４モノクローナル抗体をハムスターまた
はウサギに投与する場合のように、１つの種の動物からの抗体を別の種の動物に
投与する異種の方法（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃｐｒｏｃｅｓｓ）とは区別される
。本発明に含まれる自己原性免疫学的方法はまた、ヒトが他のヒトからのガンマ
グロブリン注射を受ける場合のように、１つの動物からの抗体を同じ種の別の動
物に投与する、受動免疫のような同種（異系）（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）免疫方
法とも区別される。

【００５５】このように、本発明の方法は、哺乳類自身の免疫系が内因性または自己タンパ
ク質を攻撃する自己免疫プロセスと非常に類似している。ＣＥＴＰは、本明細書
に含まれる哺乳類宿主の中でもウサギ、ハムスター、および霊長類における内因
性タンパク質である。しかし、全てではないがほとんどの自己免疫反応の原因が
現在のところわかっておらず、本明細書に含まれる望ましい免疫応答は意図的に
誘導されるため、本明細書において得られた結果に関しては異なる名称を用いる
ほうが適当であると思われる。

【００５６】本発明に含まれる１つの方法は哺乳類においてＣＥＴＰに対する抗体を産生す
る。その方法は以下の工程を含む：（ａ）その中に、（ｉ）（ｉｉ）に結合するＣＥＴＰ免疫原をコードする配列
、（ｉｉ）哺乳類においてＣＥＴＰ免疫原ＤＮＡ配列の発現を制御するプロモー
ター配列、を含むＤＮＡ配列を含む組換え型ＤＮＡ分子がその中で溶解または分
散されている溶媒を含む接種物によって哺乳類を免疫する工程。コードされたＣ
ＥＴＰ免疫原はＣＥＴＰアミノ酸残基配列を有する免疫原性ポリペプチドである
。免疫は、発現するため、および発現された免疫原性ポリペプチドがＣＥＴＰに
対する抗体を産生するために、十分量の組換え型ＤＮＡ分子を提供する。免疫し
た哺乳類は、（ｂ）ＣＥＴＰに結合する抗体を産生するために十分な期間維持さ
れる。

【００５７】本発明のもう一つの局面には、ＨＤＬ粒子からのコレステリル・エステルの転
移を減少させる、およびその血液がコレステリル・エステル転移タンパク質（Ｃ
ＥＴＰ）を含む哺乳類；すなわち転移活性として測定した内因性ＣＥＴＰを有す
る動物、の血液中にＨＤＬコレステロール濃度を増加させる方法が含まれる。そ
の方法は以下の工程を含む：（ａ）溶媒に溶解または拡散されている、ＤＮＡに
よってコードされるＣＥＴＰ免疫原および結合した制御プロモーター配列を含む
接種物で哺乳類（宿主）を免疫する工程。ＤＮＡによってコードされるＣＥＴＰ
免疫原はＣＥＴＰアミノ酸残基配列を有する免疫原性ポリペプチドである。免疫
した動物は（ｂ）ＤＮＡが免疫原性ポリペプチドを発現するために、および発現
された免疫原性ポリペプチドがＣＥＴＰに結合する抗体の産生を誘導するために
、ならびに好ましくはＨＤＬからのコレステリル・エステル（ＣＥ）の転移を弱
めるために、十分な期間維持される。

【００５８】（Ａ．ＣＥＴＰによってコードされた免疫原）ＣＥＴＰ免疫原のＣＥＴＰアミノ酸残基配列を有する免疫原性ポリペプチドを
コードする免疫ＤＮＡは、そのアミノ酸配列がそれぞれ配列番号：２８および２
６に示され、そのＤＮＡ配列がそれぞれ配列番号：１および２７に示される、ヒ
ト（４７６残基）またはウサギ（４９６残基）タンパク質のようなＣＥＴＰ分子
全体をコードすることができる。カニクイザルＣＥＴＰのｃＤＮＡ（配列番号：
３１）および導出アミノ酸残基配列（配列番号：３０）はまた、ペイプ（Ｐａｐ
ｅ）ら、ＡｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓａｎｄＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓ、１
１：１７５９〜１７７１（１９９１）によっても報告されている。下記の配列番
号：３０のポリペプチドまたはその一部をコードするＤＮＡ、すなわちそれぞれ
、配列番号：３１に示すｃＤＮＡ配列またはその一部も、本明細書において用い
ることができる。

【００５９】ＣＥＴＰ分子全体がＣＥＴＰ免疫原の免疫原性ポリペプチドとしてＤＮＡによ
ってコードされる場合、免疫した哺乳類の種以外の動物種、すなわち、コードさ
れるＣＥＴＰが免疫した動物に関して異種であるＣＥＴＰ配列をコードするＤＮ
Ａ配列を使用することが好ましい。コードされた免疫原性ポリペプチドが無傷の
ＣＥＴＰ分子以外である場合、アミノ酸残基約１０〜約３０個の長さを有するポ
リペプチドをコードするＤＮＡを用いることが好ましく、より好ましくはアミノ
酸残基約２０〜３０個の長さである。この場合、免疫原性ポリペプチドは外因性
の抗原性担体と共有（ペプチド）結合して発現されてＣＥＴＰ免疫原を形成する
。コードされる免疫原性ポリペプチドおよび抗原性担体配列は、当然のこととし
て、抗原性担体なしで用いる場合にコードされる免疫原性ポリペプチドがプロモ
ーターに結合する場合と同様に、適切なリーディング・フレームにおいて共に結
合している。

【００６０】外因性の抗原性担体ポリペプチド分子もまた、それらの分子のアミノ酸残基お
よびヌクレオチド配列と同様に、当技術分野において周知である。一例としての
ポリペプチド担体には破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、サイログロブ
リンおよびＢ型肝炎コアタンパク質（ＨＢｃＡｇ）が含まれるが、これらに限定
しない。

【００６１】このように、外因性抗原性担体をコードする、および免疫原性ＣＥＴＰポリペ
プチドをコードするｃＤＮＡは機能的に結合して、担体および免疫原性ポリペプ
チドの双方をコードする単一の単離および精製ＤＮＡ分子を形成する。次にＤＮ
Ａ分子は、その２つのポリペプチド部分がペプチド結合によって共有結合してい
る単一の融合タンパク質として、それら２つのポリペプチドの発現を制御するプ
ロモーターと共に適当な発現ベクターにおいて機能的に結合することができる。
好ましくは、担体は融合タンパク質のアミノ末端で発現されるが、担体を免疫原
性ポリペプチドのカルボキシ末端で融合して発現することも可能である。一例と
してのタンパク質およびそれらの合成法を以降に述べる。

【００６２】好ましくは、ＣＥＴＰ分子全体を免疫原性ポリペプチドとして用いる場合、担
体ポリペプチドはタンパク質全体の配列より短いアミノ酸残基配列を有する。長
さは好ましくはアミノ酸残基約１５〜７０個である。

【００６３】ＨＢｃＡｇとも呼ばれるＢ型肝炎ヌクレオカプシドまたはコアタンパク質抗原
は、後により詳しく説明するが、特に好ましい外因性抗原性担体である。ＨＢｃ
Ａｇ分子は本明細書においてしばしば担体の例として用いられる。

【００６４】その開示が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第４，８１８，５
２７号は、その完全なアミノ酸およびｃＤＮＡ配列をそれぞれ配列番号３８およ
び３９に示す、ＨＢｃＡｇのアミノ末端から約７０位〜約１４０位に及ぶ領域が
、その領域から約１５〜約２５残基の配列と同様に、Ｔ細胞非依存的刺激剤とし
て特に有用であることを教示している。それらのより短いポリペプチドの４つの
アミノ酸残基配列をそれぞれ、配列番号：４０、４１、４２および４３に示す。
それらの４つのポリペプチドのそれぞれをコードするｃＤＮＡ配列は、配列番号
：３９から容易に得ることができ、融合タンパク質ＣＥＴＰ免疫原として発現す
るために、そのようなｃＤＮＡの３’末端は免疫原性ポリペプチドをコードする
ｃＤＮＡの５’末端に機能的に結合することができ、またはその逆も可能である
。

【００６５】このように、一つの態様において、好ましい組換え型ＤＮＡ分子（先に定義し
たが後にも説明する）は、そのアミノ末端部分の長さがアミノ酸残基約１５〜約
７０個であり、ＨＢｃＡｇアミノ末端から約７０〜約１４０位のＨＢｃＡｇ配列
を有するポリペプチドである、融合タンパク質であるＣＥＴＰ免疫原をコードす
る。その融合タンパク質のカルボキシ末端部分はＣＥＴＰ分子のアミノ酸残基配
列を有し、２つの部分はペプチド結合によって共有結合している。この態様にお
いて、ＣＥＴＰ分子は免疫した哺乳類と同じ種に由来することができる。

【００６６】もう一つの好ましい態様において、免疫ＤＮＡは、それに対してウサギＣＥＴ
Ｐの配列を有する配列番号：２〜７もしくは５０の配列のようなアミノ酸残基約
１０〜約３０個の長さを有する１つ以上の免疫原性ポリペプチド、ヒトＣＥＴＰ
の配列を有する配列番号：８〜１３もしくは２９の類似のポリペプチド、または
サルＣＥＴＰの配列を有する配列番号：３２〜３７の類似のポリペプチドが共有
結合している、外因性抗原性担体を含むＣＥＴＰ免疫原をコードする。本明細書
において、担体は上記破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、サイログロブ
リンまたはＨＢｃＡｇ分子のような無傷のタンパク質である。

【００６７】先に述べたように、ＣＥＴＰ分子またはその所望の部分に対するＤＮＡ配列は
、ペイプ（Ｐａｐｅ）ら、ＡｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓａｎｄＴｈｒ
ｏｍｂｏｓｉｓ、１１：１７５９〜１７７１（１９９１）；ジェオン（Ｎ．Ｗ．
Ｊｅｏｎｇ）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ、４（４）：５２９〜５３３（１９９４）
；およびコノリー（Ｄ．Ｔ．Ｃｏｎｎｏｌｌｙ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３
２０：３９〜４７（１９９６）が記述したように得ることができる。より短いＤ
ＮＡ配列が好ましい場合、オリゴヌクレオチドを標準的な合成技術を用いて調製
することもできる。それらのオリゴヌクレオチドもまた、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを
用いる場合のように酵素的に結合してより長い分子を形成することができる。

【００６８】外因性の抗原性担体分子のＤＮＡ配列はまたそれらの分子を発現する方法と共
に報告されている。例えば、好ましいＨＢｃＡｇ外因性抗原性担体をコードする
ＤＮＡ配列は、その開示が参照として本明細書に組み入れられる米国特許第４，
７１０，４６３号に開示されており、そのＤＮＡがＢ型肝炎ウイルスタンパク質
をコードする大腸菌含有プラスミドは、ｐＢＲ３２２−ＨＢＶＧ−Ｌとしてス
コットランド、アバジーンの国立工業細菌コレクションの培養コレクションに寄
託されている。さらに、ＨＢｃＡｇをコードするＤＮＡは米国特許第４，９４２
，１２５号に開示されており、メリーランド州２０８５２−１７７６ロックビル
、パークローンドライブ１２３０１のアメリカンタイプカルチャーコレクション
（ＡＴＣＣ）に、ＡＴＣＣ第３９６２９号、第３９６３１号および第４０１０２
号として寄託されているベクターに存在している。

【００６９】外因性の抗原性担体としてＨＢｃＡｇを使用することは、モリアーティ（Ｍｏ
ｒｉａｒｔｙ）ら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ９０、ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら編、コー
ルドスプリングハーバー研究所出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨー
ク州、２２５〜２２９（１９９０）に例証されている。そこで著者らは、ＨＩＶ
ｇａｇタンパク質の１７量体アミノ酸残基配列をコードするＤＮＡの３’末端
がＨＢｃＡｇをコードしているＤＮＡの５’末端に機能的に結合していることを
報告し、適切にトランスフェクトした大腸菌がＨＢｃＡｇのアミノ末端とペプチ
ド結合したＨＩＶｇａｇ配列を有する融合タンパク質を発現することを報告し
た。発現された融合タンパク質は特定の形で存在し、マウスにおいて優れた免疫
原であることが示された。

【００７０】シェーデル（Ｓｃｈｏｄｅｌ）ら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ９０、ブラウン（Ｂｒｏ
ｗｎ）ら編、コールドスプリングハーバー研究所出版、コールドスプリングハー
バー、ニューヨーク州、１９３〜１９８（１９９０）は、外因性担体（ＨＢｃＡ
ｇ）ＤＮＡの３’末端がプレ−Ｓ２ポリペプチド免疫原をコードするＤＮＡの５
’末端に結合するように、ＨＢｃＡｇのカルボキシ末端にペプチド結合して発現
された、Ｂ型肝炎プレＳ２（残基１３３〜１４０位）のアミノ酸残基配列を有す
るポリペプチド免疫原を含む、融合タンパク質免疫原を調製してこれを用いて成
功したことを報告した。そのように発現された融合タンパク質免疫原も特定の形
で得られた。

【００７１】本明細書において、配列番号：１４〜１９、２０〜２５のＤＮＡ分子、または
モリアーティ（Ｍｏｒｉａｒｔｙ）らもしくはシェーデル（Ｓｈｏｄｅｌ）らの
グループが用いたＤＮＡの代わりにＣＥＴＰ免疫原性ポリペプチドをコードする
配列番号：３１の対応するＤＮＡ配列を含む、ＣＥＴＰコード組換え型ＤＮＡ分
子を用いて類似の技法を利用することができる。

【００７２】さらに、類似の技法および組換えＤＮＡ技術分野の当業者に周知のその他の技
法を用いて、無傷のＣＥＴＰ分子のアミノ末端とペプチド結合する配列番号：４
０〜４３の配列のようなＨＢｃＡｇアミノ酸残基配列を有するポリペプチドを発
現する融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子を調製することができる。

【００７３】特に好ましいＤＮＡによってコードされるＣＥＴＰ免疫原は、アミノ末端隣接
アミノ酸残基配列およびカルボキシ末端隣接配列の双方に対してペプチド結合し
ている、長さがアミノ酸約１０〜約３０個の免疫原性ポリペプチドを含む融合タ
ンパク質であり、これ以降ＨＢｃＡｇ／ＣＥＴＰ／ＨＢｃＡｇと時に呼ぶ。それ
らの隣接配列は、好ましくは先に述べたように、ＨＢｃＡｇ分子のアミノ末端お
よびカルボキシ末端領域からの部分である。このように、この融合タンパク質に
おいて、免疫原性ポリペプチドのアミノ末端およびカルボキシ末端の双方に対し
てペプチド結合する外因性抗原性担体分子がコードされる。

【００７４】コードされる好ましいポリペプチド免疫原（免疫原性ポリペプチド）は、配列
番号：２〜７、８〜１３、２９、３２〜３７、または５０のアミノ酸残基配列を
有する。最も好ましくはコードされたポリペプチド免疫原は、ヘスラー（Ｈｅｓ
ｓｌｅｒ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３（１１）：５０２０〜５０２
３（１９８８）によって報告されたＴＰ１、ＴＰ２およびＴＰ３と命名されたモ
ノクローナル抗体によって結合される、またはゲイナー（Ｇａｙｎｏｒ）ら、Ａ
ｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、１１０（１）：１０１〜１０９（１９９４）に
よって１Ｃ４と命名されたアミノ酸残基配列を有する。モノクローナル抗体ＴＰ
２は、ヒトＣＥＴＰの約４６５位と４７５位の間に位置するエピトープに結合す
る。トール（Ｔａｌｌ）、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．、３４：１２５５〜１２７
４（１９９３）および本明細書における引用文献。

【００７５】特に好ましい組換え型ＤＮＡ分子は、そのコードされるアミノ酸残基配列がヒ
トＣＥＴＰの４６５位〜４７５位またはその他の起源のＣＥＴＰの類似の位置を
含む、コードされたポリペプチド免疫原配列に結合している制御プロモーター配
列を含む。コードされたポリペプチドは配列番号：４、１０、２９および３４の
ポリペプチドによって例示され、中でも配列番号：１０および２９のコードされ
たポリペプチドが最も好ましい。配列番号：１０のポリペプチドは配列番号：２
２のＤＮＡによってコードされる。

【００７６】タンパク質分子は、直鎖状のアミノ酸残基または一次配列を有するのみならず
、ポリペプチド骨格がαヘリックスにコイル化している、またはβシートに折り
畳まれている二次配列と共に、分子の直鎖上では遠位である部分が折り畳まれて
互いに隣接するようになる三次構造を含むことができる。多くの直鎖状抗原性／
免疫原性ポリペプチド配列が文献で報告されており、そのような配列はアミノ酸
残基約１０〜約３０個を有するポリペプチドによって容易に模倣することができ
る。そのような比較的短いポリペプチドは、典型的に水性培地においてαヘリッ
クスのような二次構造をとらない。

【００７７】モノクローナル抗体ＴＰ２と免疫反応するＣＥＴＰの領域は、親水性表面が抗
体に結合した両親媒性のヘリックス二次構造を有すると予想される。ワン（Ｗａ
ｎｇ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７（２５）：１７４８７〜１７４９
０（１９９２）およびトール（Ａ．Ｒ．Ｔａｌｌ）、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．
、３４：１２５５〜１２７４（１９９３）を参照のこと。本発明に含まれるＤＮ
Ａは、そのアミノ末端およびカルボキシ末端でＨＢｃＡｇのペプチド結合領域が
隣接している免疫原性ポリペプチドを有するＣＥＴＰ免疫原性融合タンパク質、
すなわち一つの末端のみで結合している免疫原性ポリペプチドよりその分子の運
動が制限されているＨＢｃＡｇ／ＣＥＴＰ／ＨＢｃＡｇをコードする。その結果
、前記の特に好ましい免疫原性ポリペプチドがＨＢｃＡｇの領域に隣接してＨＢ
ｃＡｇ／ＣＥＴＰ／ＨＢｃＡｇ融合タンパク質を形成することによって、発現さ
れた免疫原性ポリペプチドは本来のＣＥＴＰ分子に存在する類似のヘリックス構
造を有するように、そしてそれによって先に述べたマウスモノクローナル抗体Ｔ
Ｐ１、ＴＰ２、ＴＰ３および１Ｃ４によって示された場合と類似の抗原特異性を
有する自己原性抗体を誘導するように制限されるようになると考えられる。

【００７８】さらに、発現された融合タンパク質ＨＢｃＡｇ／ＣＥＴＰ／ＨＢｃＡｇ免疫原
のＨＢｃＡｇ様粒子の形成によって、免疫原性ポリペプチドがＨＢｃＡｇ免疫原
性の多くを喪失した一次免疫原となる免疫原性ポリペプチドは、さらなる構造的
制約を受けるが、ＨＢｃＡｇのＴ−細胞非依存的抗原性担体機能は保持されると
思われる。異なる免疫原を用いた類似の結果に関してはシェーデル（Ｓｃｈｏｄ
ｅｌ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６（１）：１０６〜１１４（１９９２）を参照
のこと。

【００７９】完全長のＨＢｃＡｇ外因性抗原性担体分子または実質的に完全長の分子につい
てこれまで考察してきたが、外因性抗原性担体としての機能または粒子への集合
を消失させることなく、発現されたＨＢｃＡｇ／ＣＥＴＰ／ＨＢｃＡｇ配列（コ
ードＤＮＡ）からアミノ末端のアミノ酸残基約１０個（約３０塩基対）またはカ
ルボキシ末端のアミノ酸残基約４０個（約１２０塩基対）を欠失しうることは注
目される。例えばビルンバウム（Ｂｉｒｎｂａｕｍ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６
４（７）：３３１９〜３３３０（１９９０）を参照のこと。

【００８０】免疫原として病原体からの様々な異種ポリペプチド挿入を有する担体としてＨ
ＢｃＡｇを有する、免疫原性融合タンパク質の一例としての調製物、ならびにＨ
ＢｃＡｇアミノ酸残基配列における完全長およびカルボキシ末端欠失体の使用は
、以下の論文に見ることができる。シェーデル（Ｓｃｈｏｄｅｌ）ら、Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．、１８０：１０３７〜１０４６（１９９４）；シェーデル（Ｓｃｈ
ｏｄｅｌ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６（１）：１０６〜１１４（１９９２）；
シェーデル（Ｓｃｈｏｄｅｌ）ら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ９１、ブラウン（Ｂｒｏｗ
ｎ）ら編、コールドスプリングハーバー研究所出版、コールドスプリングハーバ
ー、ニューヨーク州、３１９〜３２５（１９９１）；クラルケ（Ｃｌａｒｋｅ）
ら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ９１、ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら編、コールドスプリング
ハーバー研究所出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、３１３〜
３１８（１９９１）；およびシェーデル（Ｓｃｈｏｄｅｌ）ら、Ｖａｃｃｉｎｅ
ｓ９０、ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら編、コールドスプリングハーバー研究所出版
、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、１９３〜１９８（１９９０）
。

【００８１】そのコア抗原について本明細書において論じているヒト肝炎ウイルス（ＨＢＶ
）は、ａｄｗおよびａｙｗと呼ばれる２つのサブタイプを有することが示されて
いる。それら２つのウイルスサブタイプのコア抗原は、ＤＮＡおよびアミノ酸残
基配列がわずかに異なっている。サブタイプ特異性はＨＢＶのＳおよびプレＳ領
域の免疫原性に関して記されているが［例えば、ミリッヒ（Ｍｉｌｉｃｈ）ら、
Ｖａｃｃｉｎｅｓ８６、ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら編、コールドスプリングハー
バー出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、３７７〜３８２（１
９８６）を参照のこと］、本明細書ではいずれかのサブタイプを外因性抗原性担
体として用いることができ、サブタイプａｙｗを本明細書において例として用い
る。

【００８２】同様に、本発明に含まれるプロセスは、最終的に発現されてＣＥＴＰに対する
自己原性抗体産生を誘導するポリペプチド免疫原に関して十分に議論されなけれ
ばならないが、その免疫原性ポリペプチドは免疫した宿主哺乳類において容易に
識別できない可能性があることにも注意しなければならない。そのような免疫原
性ポリペプチドをコードするＤＮＡはまた、β−ガラクトシダーゼのようなリポ
ーター遺伝子が、免疫する組換え型ＤＮＡ分子の一部として含まれていない場合
、または染色体外に存在してそこで機能する免疫組換え型ＤＮＡ分子が、ＣＥＴ
Ｐ免疫原の発現の後に免疫した細胞から消失する場合には、哺乳類宿主において
容易に識別できない可能性がある。しかし、ＣＥＴＰに結合する抗体は、適当な
時間宿主に存在し、それらの抗体が存在することは、本発明に含まれるプロセス
がそのようなＣＥＴＰ結合抗体が自然界に存在することがわかっていない状態で
実施されているという証拠となる。

【００８３】（Ｂ．ＤＮＡ分子および発現系）ＣＥＴＰ免疫原をコードする本発明に含まれるＤＮＡ分子（単離精製されたＤ
ＮＡ部分）は、プラスミドにおける特定の位置での塩基対の数として、２つの制
限エンドヌクレアーゼ部位によって境界を定められた制限断片として、および２
つの制限エンドヌクレアーゼ部位によって境界を定められ、多くの塩基対を含む
制限断片として呼ぶことができる。本発明に含まれるＤＮＡはまた、命名された
配列番号の配列と共に、列挙したアミノ酸残基配列をコードするそのような遺伝
子（後述する）の対立遺伝子または変種の配列、を有すると定義することができ
る。

【００８４】本発明に含まれる単離精製ＤＮＡ部分は直鎖状であり、５’末端および３’末
端を有する。本発明に含まれるＤＮＡ断片は、その３’末端が別のＤＮＡ部分の
５’末端に機能的に結合してそこで２つの部分が結合している、またはその３’
末端が、自身の３’末端はさらに別のＤＮＡ部分の５’末端に結合している別の
ＤＮＡ部分の５’末端に機能的に結合して、そこで個々の３つの部分が結合して
単一の単離精製ＤＮＡ部分を形成する、２つ以上の個々のＤＮＡ部分を含むこと
ができる。

【００８５】生きている生物において、タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸残基配列
は、タンパク質をコードする構造遺伝子のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列に対
する遺伝子コードによって直接相関する。構造遺伝子は、アミノ酸残基配列に関
して、すなわちそれがコードするタンパク質またはポリペプチドに関して定義す
ることができる。

【００８６】さらに、遺伝子コードの周知の重複性によって、同じアミノ酸残基配列をコー
ドするが、特定の配列番号を有する列挙した遺伝子配列とは異なるさらなるＤＮ
Ａ配列を調製することができる。例えば、後述するインビトロ変異誘発を用いて
、発現されたポリペプチドの同じ残基が発現されるように、ＤＮＡ配列を変化さ
せることができる。さらに、特異的制限エンドヌクレアーゼ部位を挿入または欠
失することが望ましい場合、同じ技法を用いて１つのアミノ酸残基をもう一つの
アミノ酸残基と置換することができる。この技法はまた後に説明する。

【００８７】列挙した配列番号のＣＥＴＰ免疫原をコードするが、列挙した配列番号の配列
とは異なるＤＮＡ配列を有するＤＮＡ配列は、本明細書において変種ＤＮＡ配列
と呼ぶ。そのような変種ＤＮＡ分子は、周知のように、インビトロ変異誘発によ
って容易に調製することができる。

【００８８】記述のＣＥＴＰ免疫原をコードするＤＮＡ部分は化学的方法、例えばマテウッ
チ（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０３：３１８
５（１９８１）のホスホトリエステル法によって合成することができる。当然の
ことながら、コード配列を化学的に合成することによって、如何なる所望の改変
も、単に本来のアミノ酸残基配列をコードする塩基を適当な塩基に置換すること
によって行うことができる。

【００８９】しかし、先に述べた特定の配列を含むＤＮＡ部分が特に好ましい。さらに、ポ
リペプチドをコードするＤＮＡ部分は、その部分を含む組換え型ＤＮＡ分子（プ
ラスミドまたはその他のベクター）から得ることができる。

【００９０】ＣＥＴＰ免疫原をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ部分は、周知の方法を用
いて適当なプラスミドまたはその他のＤＮＡからの適当な制限断片を切除して機
能的に結合することによって調製することができる。このようにして産生される
本明細書において有用なＤＮＡ分子は、典型的に付着末端、すなわち分子の二本
鎖部分を超えて伸びる「オーバーハング」一本鎖部分、を有する。本発明のＤＮ
Ａ分子上に付着末端が存在することが好ましいが、平滑末端を有する分子も本発
明に含まれる。

【００９１】本明細書において有用な組換え型ＤＮＡ分子は、ＣＥＴＰ免疫原をコードする
単離ＤＮＡ部分にベクターを機能的に結合させて、本明細書において記述したプ
ラスミドを形成することによって作製することができる。特に好ましい組換え型
ＤＮＡ分子は後に実施例において詳細に述べる。免疫した哺乳類においてこの遺
伝子の発現を指向することができるベクターは、本明細書において「発現ベクタ
ー」と呼ぶ。

【００９２】上記の発現ベクターは、プロモーターを含む発現制御エレメントを含む。免疫
原性ポリペプチドまたはその他の有用な配列をコードする遺伝子は、発現ベクタ
ーに機能的に結合して、それによってプロモーター配列はＲＮＡポリメラーゼ結
合および所望のポリペプチドコード遺伝子の発現を指向する。

【００９３】それに対してポリペプチドコード遺伝子が機能的に結合する発現ベクターの選
択は、所望の機能的特性、例えばタンパク質発現の位置および時期、ならびに形
質転換する宿主細胞に直接依存する。これらは組換え型ＤＮＡ分子を構築する技
術分野に独自の周知の制限である。しかし、本発明の実践において有用なベクタ
ーは、複製を指向することができ、しかもそれが機能的に結合しているＤＮＡ部
分に含まれる免疫原性ポリペプチドコード遺伝子の発現を指向させることもでき
る。

【００９４】クローニング・ベクターもまた、所望のＤＮＡを作製するために、またはその
量を増加させるために本明細書において有用であり、これを用いて免疫原性ポリ
ペプチドを発現させて合成したＤＮＡをアッセイすることができる。クローニン
グ・ベクターには、原核生物レプリコン；すなわちそれによって形質転換すべき
原核生物宿主細胞において染色体外で組換え型ＤＮＡ分子の自律性複製および維
持を指向することができるＤＮＡ配列が含まれる。そのようなレプリコンはクロ
ーニング・ベクターと同様に当技術分野で周知であり、そのいくつかは後述する
。

【００９５】原核生物レプリコンを含むそれらのベクターはまた、大腸菌のような、それに
よって形質転換すべき宿主細胞において、ＣＥＴＰ免疫原遺伝子の発現を指向す
ることができる原核生物プロモーター領域を含むことができる。細菌宿主と適合
性のプロモーター配列は、典型的に、本発明のＤＮＡ部分を挿入するために都合
のよい制限部位１つ以上を含むプラスミドベクターにおいて提供される。そのよ
うなクローニングおよび発現ベクター・プラスミドは当技術分野で周知である。
そのようなクローニングおよび発現ベクター・プラスミドの典型は、メリーラン
ド州ロックビルのライフ・テクノロコジー社から入手できるｐＵＣ１８、ｐＵＣ
１９、ｐＢＲ３２２、ｐＰｒｏＥｘ１、およびｐＦａｓｔＢａｃ１、ならびにニ
ュージャージー州ピスキャタウェイのファルマシア社から入手できるｐＰＬおよ
びｐＫＫ２３３−３である。これらのベクターは本明細書において有用なＤＮＡ
部分の合成に利用される。

【００９６】好ましい態様において、免疫原性ポリペプチドコード遺伝子を発現するために
用いられるクローニング・ベクターは、宿主細胞において有効な選択マーカー、
好ましくは薬剤抵抗姓選択マーカーを含む。好ましい一つの薬剤抵抗性マーカー
は、その発現がカナマイシン抵抗性を生じる遺伝子であり、アンピシリン抵抗性
はもう一つのそのようなマーカーである。この場合も、そのような選択マーカー
は周知である。

【００９７】相補的付着末端または平滑末端を通じてＤＮＡをベクターに機能的に結合させ
るために、多くの方法が開発されている。例えば、相補的ホモポリマー系を、挿
入すべきＤＮＡ部分およびベクターＤＮＡに加えることができる。その後ベクタ
ーおよびＤＮＡ部分を、相補的ホモポリマーのテール部間の水素結合によって結
合して、組換え型ＤＮＡ分子を形成する。

【００９８】または、制限エンドヌクレアーゼ部位１つ以上を含む合成リンカーまたはアダ
プターを用いて、組み込む発現ベクターにＤＮＡ部分を結合させることができる
。合成リンカーまたはアダプターは、バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼの
ような平滑末端ＤＮＡ分子のライゲーションを触媒することができる酵素の存在
下で、平滑末端ＤＮＡ部分を十分な過剰量の合成リンカーまたはアダプター分子
と共にインキュベートすることによって、平滑末端ＤＮＡ部分に結合する。

【００９９】このように、反応産物はその末端に合成リンカー配列を有するＤＮＡ部分であ
る。次にこれらのＤＮＡ部分を適当な制限エンドヌクレアーゼによって切断して
、合成リンカーの末端と適合性の末端を生じる酵素によって切断した発現ベクタ
ーにライゲーションする。多様な制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカ
ーは、マサチューセッツ州ビバリーのニューイングランド・バイオラブス社を含
む多くの販売元から市販されている。合成アダプター分子は典型的に、付着末端
および１つの平滑末端を有し、ライゲーション後も切断されない。

【０１００】好ましいとはいえ、その発現されたポリペプチドが、配列番号に示したポリペ
プチドの正確な末端残基を有するＤＮＡ分子をデザインすることは必ずしも実行
可能でない。これは、ＤＮＡ部分の切断および結合に用いられる制限酵素、合成
リンカーおよびアダプター分子の使用に特有の制限のためである。

【０１０１】その結果、発現されたポリペプチドは、数個（例えば、１または２個）多く、
または少ない、または異なるアミノ酸残基を、列挙した配列の１つの末端または
両方の末端に含むことがありうる。そのようなわずかな変化は、本発明に含まれ
るＣＥＴＰ免疫原にとって、特に置換が保存的でＣｙｓおよびＰｒｏのような残
基が避けられる場合には十分に容認されるものである。

【０１０２】哺乳類宿主において本発明に含まれるＣＥＴＰ免疫原を発現するために、多様
なプラスミドをＤＮＡワクチンベクターとして用いることができる。そのような
ベクターは、以下の成分を含むことが最適である：強い真核生物プロモーター、
対象遺伝子を挿入するためのクローニング部位、原核生物複製起点、および原核
生物選択マーカー。そのようなベクターの１つ、ｐＶ１Ｊは、イントロンＡを有
するサイトメガロウイルス早初期プロモーター、およびアンピシリン抵抗性遺伝
子を含む［ウルマー（Ｊ．Ｂ．Ｕｌｍｅｒ）ら、ＡＳＭＮｅｗｓ、６２（９）
：４７６〜４７９（１９９６）］。カリフォルニア州サンジエゴのインビトロゲ
ン・コーポレーションから入手できるｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐと呼ばれるもう一つ
の有用なベクターと共に、メリーランド州ロックビルのライフ・テクノロジー社
から入手できるプラスミドｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ−β−ｇａｌおよびｐＧｒｅｅ
ｎＬａｎｔｅｒｎ−１については後に詳述する。その他の真核生物プロモータ
ー、ポリ（Ａ）部位、および選択マーカーは、プロモーターから下流に挿入され
た構造遺伝子が哺乳類の細胞に発現される限り、ベクターの有用性を損なうこと
なく置換することができる。その多くが市販されている多様な一般的哺乳類ベク
ターは、ＤＮＡワクチンベクターとして本明細書において用いるために適してい
る。

【０１０３】プラスミドＤＮＡは多様な方法によって調製することができる。高品質のプラ
スミドＤＮＡは、直鎖状プラスミドおよび染色体ＤＮＡから、共有結合して閉鎖
した環状プラスミドＤＮＡを分離するためにＣｓＣｌ勾配を用いて調製すること
ができる。タンパク質、ＲＮＡ、膜、および細胞壁材料のような溶解した細菌細
胞から得られるその他の成分は、一般的に密度勾配遠心によってプラスミドＤＮ
Ａから十分に分離される。ＣｓＣｌ精製のための標準的なプロトコールは当技術
分野で周知である［サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）の「分子クローニング、
実験マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｙＭａｎｕａｌ）」、第二版、コールドスプリングハーバー出版、コールド
スプリングハーバー、ニューヨーク州、８〜２３（１９８９）を参照のこと］。

【０１０４】高品質のプラスミドＤＮＡの調製に適したもう一つの方法は、陰イオン交換ク
ロマトグラフィーである。陰イオン交換クロマトグラフィーによって調製された
ＤＮＡと、ＣｓＣｌ勾配上で２回分離されたＤＮＡを直接比較したところ、リポ
ータープラスミドの直接遺伝子移入および遺伝子免疫の効率に差を認めなかった
ことが報告された［デービス（Ｄａｖｉｓ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、
２１：９９〜９９（１９９６）］。ＣｓＣｌ勾配上での分離が１回であるＤＮＡ
は、二本鎖閉鎖環状ＤＮＡを含むことがより少なく、これらの勾配上で２回分離
したＤＮＡよりＲＮＡの混入がより多いことが報告された。しかし、陰イオン交
換クロマトグラフィーによって精製したＤＮＡはＣｓＣｌ精製よりエンドトキシ
ンレベルがより大きいと報告された［デービス（Ｄａｖｉｓ）ら、Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ、２１：９９〜９９（１９９６）］。

【０１０５】治療的に応用される超コイル化プラスミドＤＮＡの精製に関する調製法もまた
用いることができる［グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら、Ｂｉｏｐｈａｒｍ、１０（５
）：５２〜６２、（１９９７）］。この方法は、混入するＤＮＡ、ＲＮＡ、タン
パク質、およびエンドトキシンを含まないプラスミドＤＮＡを調製するためにイ
オン対逆相カラムクロマトグラフィーを用いる。

【０１０６】ヒト遺伝子療法において用いることが適しているバルク・プラスミドＤＮＡベ
クターの特徴を調べる一般的方法および技法は記述されている［マルケット（Ｍ
ａｒｑｕｅｔ）ら、ＢｉｏＰｈａｒｍ、１０（５）：４２〜５０（１９９７）］
。プラスミド同一性、プラスミド収率、プラスミド安定性を調べることによるマ
スター細胞バンクの特徴を調べる方法、ならびに宿主株の遺伝子型を確認して宿
主株の変動および微生物混入を測定する方法は記述されている。滅菌性および発
熱物質の有無に関してバルク産物の特徴を調べる方法についても記述されている
。

【０１０７】エンドトキシンはプラスミドＤＮＡを回収するために細胞を溶解する際に放出
されるグラム陰性菌の細胞壁のリポポリ多糖類成分である。エンドトキシンはイ
ンビトロまたはインビボにおいて哺乳類細胞に細胞障害作用を及ぼしうる［ウィ
ックス（Ｗｉｃｋｓ）ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．、６：３１７〜３２３
（１９９５）］。エンドトキシンレベルは、色素を発生するリムルス・アメーバ
凝集アッセイによって測定することができる［ＳＣＬ−１００キット；バイオウ
ィッタッカー、ウォーカービル、メリーランド州；モスマン（Ｔ．Ｍｏｓｓｍａ
ｎ）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、６５：５５〜６３（１９８３）］。陰
イオン交換クロマトグラフィーによって調製したエンドトキシン不含プラスミド
ＤＮＡの精製法も現在では利用できる［ショール（Ｓｃｈｏｒｒ）ら、Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．、１：Ｓ７（１９９４）］。この方法は、ＤＮＡを陰イオン交換カ
ラム上で溶解物から精製する前に特殊なエンドトキシン除去緩衝液によって細菌
溶解液を透明にする。

【０１０８】本発明に含まれるＣＥＴＰ免疫原をコードして、および正しいリーディング・
フレームにおいて免疫原コードＤＮＡ配列の発現を制御する上記のプロモーター
配列を含むプラスミドまたはその他のベクターＤＮＡは、宿主哺乳類を免疫する
ために利用される組換え型ＤＮＡ分子を含む。溶媒に溶解または拡散した組換え
型ＤＮＡ分子は、哺乳類を免疫するために用いられ、さらに下記に記述される接
種物を含む。

【０１０９】（Ｃ．接種）正しいリーディング・フレームにおいてＣＥＴＰ免疫原（組換え型ＤＮＡ分子
）をコードし、および免疫原性ポリペプチドの発現を制御するプロモーター配列
を含むＤＮＡワクチン・ベクターは、好ましくは水性である薬学的に許容される
溶媒組成物に溶解または拡散され、哺乳類を免疫するために用いると、ＣＥＴＰ
と免疫反応する（結合する）抗体の産生を誘導する接種物を形成する。組換え型
ＤＮＡ分子の有効量をその血中にＣＥＴＰを含む哺乳類に投与すると、それらの
抗体は好ましくはＨＤＬ粒子からのコレステリル・エステルの転移も弱める。

【０１１０】有効な組換え型ＤＮＡ分子の用量は典型的に約０．０５μｇ／ｋｇ〜約５０ｍ
ｇ／ｋｇであり、通常約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇである。その用
量がＤＮＡによってコードされるポリペプチドの活性に依存して変化しうる有効
な全身投与量を決定する方法は、当業者に明らかな方法で決定することができる
。その開示が本明細書に参照として組み入れられる米国特許第５，５８０，８５
９号は、ＤＮＡワクチンの有効量を決定するいくつかの方法を開示する。

【０１１１】「単位用量」という用語はそれが本発明の接種物に関する限り、動物の単位用
量として適した物理的に明確な単位を指し、それぞれの単位は必要な希釈剤；す
なわち担体または溶媒に関連して所望の免疫原性作用を生じるように個々にまた
は集合的に計算された活性材料の規定量を含む。

【０１１２】接種物は典型的に、水、または燐酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）等のような生理
学的に忍容される（許容される）希釈溶媒にＤＮＡを拡散することによってＣＥ
ＴＰ免疫原をコードする組換え型ＤＮＡ分子から調製され、水性組成物を形成す
る。それぞれの免疫に用いられるＤＮＡコードＣＥＴＰ免疫原の量は、多様に変
化することが可能で、これらは有効量と呼ばれる。そのような有効量はＣＥＴＰ
に結合するＣＥＴＰに対する抗体を誘導するために十分であり、好ましくはＨＤ
Ｌ粒子からのコレステリル・エステルの転移を弱めるために、および免疫した哺
乳類の血液中のＨＤＬ／ＬＤＬ比を増加させるために十分である。ＤＮＡによっ
てコードされるＣＥＴＰ免疫原の一例としての有効量は、とりわけコードされる
ＣＥＴＰ免疫原の配列、免疫される哺乳類、ならびに接種物中の塩、安定化剤、
および細胞透過物質の存在に応じて約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇで
ある。一例としての単位用量は投与部位あたり約１０μｌ〜約１ｍｌとなること
ができ、組換え型ＤＮＡ分子の濃度は約０．０５μｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ
、好ましくは約０．１μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌである。このように、単
一の単位用量または複数の単位用量を、発現されたＣＥＴＰ免疫原の有効量を提
供するために用いることができる。適当な濃度または量は容易に決定することが
できることを当業者は知っている。

【０１１３】接種物は典型的に、非経口投与のために製剤化される。一例としての免疫は皮
下（ｓ．ｃ．）または皮内（ｉ．ｄ．）によって行われる。米国特許第５，５８
０，８５９号は、ＤＮＡワクチンと共に用いることが適しているいくつかの製剤
を開示している。これらの中には、塩、希釈剤、安定化剤、および細胞透過物質
を含む水性溶媒に溶解または拡散した組換え型ＤＮＡ分子を含む接種物が含まれ
る。

【０１１４】典型的な製剤には、燐酸緩衝生理食塩液または等張蔗糖液に懸濁した組換え型
ＤＮＡ分子が含まれる。ＤＮＡはリポソームのような、細胞へのＤＮＡの取り込
みを促進するような細胞透過物質と組み合わせることができる。ＤＮＡワクチン
製剤において用いられるリポソームの一例は、メリーランド州ロックビルのライ
フ・テクノロジー社から販売されているリポフェクチン（登録商標）である。取
り込みおよび発現は、ＤＮＡを促進剤である塩酸ブピバカイン（麻酔剤）と共に
投与するとしばしば有意に増強される［コネイ（Ｃｏｎｅｙ，Ｌ．）ら、Ｖａｃ
ｃｉｎｅ，１２：１５４５〜１５５０（１９９４）］。当業者はその他の類似の
細胞透過促進剤をこれらの目的のために用いることができることおよびこれらの
物質の適当な濃度または量を容易に決定することができることを認識するであろ
う。

【０１１５】一度免疫すると、哺乳類はコードされたＣＥＴＰ免疫原が発現されるために、
およびその後発現されたＣＥＴＰ免疫原がＣＥＴＰに結合する抗体産生を誘導し
、およびＨＤＬ粒子からのコレステリル・エステルの転移を弱めるために、十分
な期間維持される。この維持期間は典型的に約３週間から約８週間持続し、追加
免疫、接種物の２回目の免疫投与を含むことができる。

【０１１６】ＣＥＴＰに結合する抗体の産生は、免疫した動物から血漿または血清試料を得
ることによって、および後述するＥＬＩＳＡアッセイにおいて、そこに記述され
た抗体の抗原としてのＣＥＴＰとの結合能をアッセイすることによって、または
当技術分野で周知のウェスタンブロットのような別のイムノアッセイによって、
容易に確認することができる。

【０１１７】ＨＤＬからのコレステリル・エステルの転移を弱めることは、いくつかの技法
の１つ以上によってアッセイすることができる。一つのアッセイにおいて、転移
速度は、グレン（Ｇｌｅｎｎ）ら、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ、２６３：３３９〜３５０（１９９６）に報告された示差沈殿アッセイ後にＨ
ＤＬからＬＤＬへの［^３Ｈ］−コレステリル・エステル（［^３Ｈ］ＣＥ）の使用
によって測定することができる。簡単に説明すると、ＣＥＴＰ、［^３Ｈ］ＣＥ−
標識ＨＤＬ、ＬＤＬ、およびＴＥＳアッセイ緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．
４；１５０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡ；１％ウシ血清アルブミン）を、
９６ウェルフィルター・プレート中で容量２００μｌとして３７℃で２時間イン
キュベートする。次に１％（ｗ／ｖ）硫酸デキストラン／０．５ＭＭｇＣｌ_２
の５０μｌを加えることによってＬＤＬを示差的に沈殿させる。濾過した後、沈
殿したＬＤＬ中に存在する放射活性を液体シンチレーション計数によって測定す
る。非特異的転移または沈殿の補正は、ＣＥＴＰを含まない試料を含むことによ
って行う。［^３Ｈ］ＣＥ転移速度は時間およびＣＥＴＰ濃度に関してアッセイの
直線範囲において決定する。抗体がアッセイに含まれる試験の場合、試料ウェル
に加える順序は、緩衝液、［^３Ｈ］−標識ＨＤＬ、ＬＤＬ、抗体、ＣＥＴＰの順
である。

【０１１８】ＣＥＴＰ活性はまた、示差沈殿を含まない２つの方法によって測定することが
できる。第一のアッセイにおいて、インキュベーション条件は上記の条件と同一
であるが、［^３Ｈ］−ＣＥ標識ＨＤＬドナー粒子からのＬＤＬアクセプター粒子
の分離は、ＬＤＬおよびＨＤＬに関連した［^３Ｈ］ＣＥ量を決定するために、ス
ペロース（登録商標）６（シグマ・ケミカル・カンパニー）の直列カラムによる
サイズ排除クロマトグラフィー、その後分画の液体シンチレーション計数を行う
。この方法によって測定された転移量は典型的に沈殿アッセイと優れた一致を示
す。

【０１１９】ＣＥＴＰ活性のもう一つのアッセイは、卵のホスファチジル・コリン乳液から
ＶＬＤＬへの蛍光類似体ＮＢＤ−リノレン酸コレステリル（ＮＢＤ−ＣＥ）のＣ
ＥＴＰ媒介転移速度を測定する。このアッセイはＮＢＤ−ＣＥが乳剤では自然消
光すること、およびＶＬＤＬに転移されると蛍光を発するという事実を利用して
いる。アッセイは、製造元の指示に従って実施される（ディアグネッセント・テ
クノロジーズ・インク、ヨンカース、ニューヨーク州）。蛍光測定は、励起およ
び吸収波長それぞれ４６５ｎｍおよび５３５ｎｍを用いてＳＬＭ８０００Ｃ分
光蛍光光度計のような標準的な装置を用いて行うことができる。

【０１２０】所望の抗体が哺乳類に誘導されると、哺乳類の血液中のＨＤＬコレステロール
値が最初の免疫段階前の哺乳類のＨＤＬコレステロール値と比較して約１０％以
上増加するまで、約３〜６ヶ月の間隔で繰り返すことが特に本発明に含まれる。
好ましくはＨＤＬコレステロール値は約２５％増加する。その後哺乳類は好まし
くは約６〜約１８ヶ月の間隔で行われた定期的な追加免疫によってその増加した
ＨＤＬコレステロールレベルに維持される。ＨＤＬコレステロールの増加は信頼
できる如何なるアッセイによっても測定することができ、その多くは当技術分野
において周知で、その一つについて後述する。

【０１２１】そのように誘導された前記抗ＣＥＴＰ抗体は、周知の技法を用いて宿主哺乳類
の血液から単離することができ、その後これも周知である受動免疫のために第二
の接種物に再構築することができる。類似の技法はヒトのガンマグロブリン免疫
に関して用いられる。例えば、１つまたは多くの免疫した宿主からの抗血清は硫
酸アンモニウム水溶液中で沈殿させることができ（典型的に４０〜５０％飽和）
、およびＣＥＴＰまたはその免疫原性ポリペプチド部分をクロマトグラフィーカ
ラム上に固定した抗原として利用するアフィニティクロマトグラフィーを利用す
ることによって、沈殿した抗体はクロマトグラフィーによって精製した。

【０１２２】（発明を実施するにあたっての最善の様式）下記の比較実施例１および２は、免疫した哺乳類に対して外因性に調製したＣ
ＥＴＰ免疫原を用いて得られた結果を説明する。

【０１２３】（比較実施例１：ウサギＣＥＴＰペプチドによるウサギの免疫）ウサギとヒトＣＥＴＰのアミノ酸残基レベルでの相同性は８８％である。ウサ
ギは血中に高レベルのＣＥＴＰを発現することから、自己原性抗ＣＥＴＰ抗体の
産生を説明するモデルとして選択された。

【０１２４】配列番号：２〜７のウサギＣＥＴＰポリペプチド６個をこの試験のために選択
して、下記の標準的な固相合成法によって調製した。抗ポリペプチド特異的抗体
反応を増強するために、上記のウサギＣＥＴＰポリペプチド６個に関して異なる
２つの免疫法を用いた。

【０１２５】（Ａ．免疫法１（ＭＡＰ結合物））ウサギポリペプチドは多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）構築物として合成した［ポ
スネット（Ｄ．Ｎ．Ｐｏｓｎｅｔｔ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１
７１９〜１７２５（１９８８）］。それらのポリペプチドはそれ自身が樹脂粒子
に共有結合した「オリゴリジン・コア」分子に個々に共有結合していた［バッツ
（Ｓ．Ｂｕｔｚ）ら、Ｐｅｐ．Ｒｅｓ．１：２０〜２２３（１９９４）］。

【０１２６】開始物質であるレジン粒子の置換は０．３７μｍサイト／ｍｇレジンであり、
それによってレジン１．１ｍｇ当たり約５００μｇのイムノゲンポリペプチドが
生成した。免疫のためのＣＥＴＰイムノゲンの調製のため、３．０ｍｇの乾燥レ
ジンを計量し、１．３ｍｌのフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ；Ｓｉｇｍａ
ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ．，Ｆ−５８８１）をア
ジュバントとして添加した滅菌リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）１．３ｍ
ｌ中で水和物を形成させた。ＣＥＴＰイムノゲンとアジュバントを、３ｍｌの注
射器２本に接続したメス−メスｌｕｅｒｌｏｃｋ注射器アダプターによって乳
化した。最終乳濁液のそれぞれを注射用に１．０ｍｌずつに分割し（１ｍｌ／ウ
サギ）、ウサギ１匹当たり１つのイムノゲンを使用した。免疫を行う前に免疫前
のウサギ血清を採取し、イムノアッセイ時まで−７０℃において保存した。第１
日に、ニュージーランド白ウサギの背部の１０箇所の注射部位に皮下（ｓ．ｃ．
）注射することにより、それぞれのイムノゲンで各ウサギを個別に免疫した。

【０１２７】３週間後（第２２日）に、同様の手順を用いてウサギのブースター免疫を行っ
たが、この時点ではＣＥＴＰイムノゲンをフロイントの不完全アジュバント（Ｉ
ＦＡ；Ｓｉｇｍａ）中に乳化させた。ブースター免疫を行う前日に、前回と同様
にしてレジンに結合したＣＥＴＰイムノゲンを計量し、滅菌ＰＢＳによって水和
させた。得られたＣＥＴＰイムノゲン懸濁液をマイクロチップにより最大設定で
５分間超音波処理し、４℃において一晩（約１８時間）放置した。水和したＣＥ
ＴＰイムノゲン懸濁液をＩＦＡと混合する前に、ブースター免疫の直前に懸濁液
を室温に戻し、１．５ｍｌのＩＦＡを添加した後、上述のようにして乳化させ、
ＣＥＴＰイムノゲンが分散している接種溶液を調製した。ウサギ１匹当たり最低
１０箇所の注射部位に、それぞれ１ｍｌの乳濁液を皮下注射することにより免疫
を行った。

【０１２８】２回目の免疫から２週間後に、各動物から１回目の免疫後血清を採取した。抗
血清試料はすべて、ＥＬＩＳＡを実施するまで−７０℃において保存した。

【０１２９】このＭＡＰ法を用いた場合、配列番号２および７のポリペプチドはウサギにお
いて中等度の免疫原性を示し、自原性抗体の最大力価はそれぞれ１：１０００お
よび１：３００であった。力価とは、当該ポリペプチドでコーティングしたＥＬ
ＩＳＡプレート上で最大吸収の半分を示す血清の希釈度のことである。２匹のウ
サギから血清をプールしたため、上記の力価は平均値を表す。配列番号７に対す
る抗血清のみが、組み換え型ヒトＣＥＴＰとの交差反応性を示した。これらの抗
血清とウサギＣＥＴＰとの反応性については、各種の免疫アッセイを用いて検討
中である。免疫後の血清から抗ポリペプチド特異的ＩｇＧを精製し、ヒト組み換
え型ＣＥＴＰに対する阻害作用に関するアッセイを実施しているところである。

【０１３０】Ｂ．免疫手順２（精製蛋白質誘導体結合体）上記の６種類のウサギＣＥＴＰ−ポリペプチドイムノゲンのうち５種類（配列
番号２，３，４，６および７）を、Ｐ．Ｊ．Ｌａｃｈｍａｎｎらの「１９８６年
抗原としての合成ペプチド」、（ＣｉｂａＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＳｙｍｐｏ
ｓｉｕｍ１１９）、２５〜４０（１９８６）およびＰ．Ｄａｗｓｏｎら、Ｊ．
Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１６７９８〜１６８０３（１９８９）の方法に従
って、ツベルクリン精製蛋白質誘導体（ＰＰＤ）に結合させ、コンジュゲートを
作成した。ウサギＣＥＴＰ由来ポリペプチドの免疫原性を増強するための外因性
抗原担体としてツベルクリンＰＰＤ（ＳｔａｔｅｎｓＳｅｒｕｍＩｎｓｔ．
，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、デンマーク）を使用した。ＰＢＳ中のポリペプチド−
ＰＰＤコンジュゲートを、免疫手順１に記載した方法により乳化した。ＰＰＤに
結合させたポリペプチド０．５ｍｇ／ｍｌを１ｍｌとり、約１ｍｌのＣＦＡと乳
化させた。別の１ｍｌのＰＰＤ−コンジュゲートを凍結保存し、次回のブースタ
ー免疫に使用した。

【０１３１】第１日に、ウサギの背部の最低１０箇所の注射部位に最終乳濁液１ｍｌを皮下
注射することにより、ウサギの免疫を行った。投与したポリペプチド−ＰＰＤ
ＣＥＴＰポリペプチドイムノゲン中には、ウサギ１匹当たり０．２５ｍｇのポリ
ペプチドが含まれていた。３週間後（第２１日）に、前述の方法に従い、解凍し
てＩＦＡと乳化させた残りのコンジュゲート１ｍｌによってウサギにブースター
免疫を行った。２回目の免疫から２週間後に、ウサギから採血し免疫後血清を採
取した。

【０１３２】ＰＰＤ結合法によって、配列番号２および６のイムノゲンポリペプチドに対す
る抗体が産生され、抗体の力価はそれぞれ１：３２００と１：４００であった。
力価とは、当該ポリペプチドでコーティングしたＥＬＩＳＡプレート上で最大吸
収の半分を示す血清の希釈度のことである。２匹のウサギから血清をプールした
ため、上記の力価は平均値を表す。配列番号２のイムノゲンポリペプチドに対す
る抗体のみが、組み換え型ヒトＣＥＴＰとの交差反応性を示した。これらの結果
は、前述のＰ．Ｊ．Ｌａｃｈｍａｎｎらが我々のウサギと同様のＢＣＧに対する
免疫をもたない宿主において抗ポリペプチド抗体をほとんど産生させることがで
きなかったという事実を考慮に入れると、予想外によいものであった。抗ＰＰＤ
抗体は、予想通りすべてのグループのウサギにおいて検出された。

【０１３３】ＥＬＩＳＡにより、抗イムノゲンポリペプチド血清を用いて、天然ウサギＣＥ
ＴＰとの免疫反応性について評価している。配列番号２、６、および７のポリペ
プチドは免疫原性を有しており、配列番号２および７に対する２種類の抗ポリペ
プチド抗体は組み換え型ヒトＣＥＴＰとの交差反応性を示したため、それぞれの
ウサギをＩＦＡと共に乳化させたＭＡＰ構造あるいはＰＰＤ構造のいずれかの免
疫物質によってさらにブースター免疫した。

【０１３４】例２：ＣＥＴＰ抗原による異種交配ウサギの免疫本試験ではニュージーランド白ウサギ３０匹を使用し、１群１０匹ずつ３つの
群に分けた。本試験では３種類のイムノゲンを使用した：（１）組み換え型ヒト
ＣＥＴＰ、（２）ウサギＣＥＴＰのカルボキシ末端の２６個のアミノ酸残基（配
列番号：５０）、および（３）アミノ酸残基の配列がＣＥＴＰとはまったく異な
る対照イムノゲン。

【０１３５】それぞれのイムノゲンで免疫する前に、免疫前の血清を採取した。本試験の目
的は、上記のＣＥＴＰイムノゲンがウサギにおいて抗ＣＥＴＰ特異的（自原性抗
ＣＥＴＰ）抗体を誘導し得るかどうか、そしてＣＥＴＰに対して産生された自原
性抗体が内在性のウサギＣＥＴＰと結合し（免疫反応を起こし）それによってＨ
ＤＬ粒子からのコレステリルエステルの移動が減少して宿主内のＨＤＬ量が増加
するかどうか、について検討することであった。

【０１３６】上記のイムノゲンをＣＦＡ中に乳化させた。各ウサギに対して、ＣＦＡ中に乳
化させたイムノゲンのうちの１種を５００μｇの用量で皮下注射することにより
、免疫した。７週間後に、初回採血により免疫後の血清を採取した。

【０１３７】抗体の力価測定のため、ＥＬＩＳＡを行った。ＥＬＩＳＡプレートを組み換え
型ヒトＣＥＴＰでコーティングした（４０ｎｇ／ウエル）。

【０１３８】組み換え型ヒトＣＥＴＰで免疫したウサギは、ヒトＣＥＴＰに対して一次免疫
反応を示した。１０匹のウサギすべてが、組み換え型ヒトＣＥＴＰ（ｒｈＣＥＴ
Ｐ）に対して十分な反応を示した。特異的ＩｇＧ抗体の力価は＞１：１０００以
上であった。しかし、ウサギＣＥＴＰのカルボキシ末端−ポリペプチド−サイロ
グロブリンコンジュゲート（ＣＥＴＰ−ＴＨ）で免疫した群の１０匹のウサギは
、一次抗体反応を示さなかった。対照ウサギの血清中には、検出可能量の抗ＣＥ
ＴＰ抗体は存在しなかった。それぞれの抗原を用いてウサギにブースター免疫を
行い、免疫原性についてさらに検討した。

【０１３９】宿主動物の血液（血漿）中ＨＤＬ粒子濃度の上昇に関する本試験の結果（平均
値±Ｓ．Ｄ．）を、初回免疫血清について以下の表１に示す。

【０１４０】

【表１】１ｒｈＣＥＴＰ＝組み換え型ヒトＣＥＴＰ。２ＣＥＴＰ−ＴＨ＝ウサギＣＥＴＰの末端の２６個のアミノ酸残基をサイログ
ロブリンに結合させたもの。３平均ＨＤＬ＝免疫後、あるいは対照の場合には偽免疫後の平均ＨＤＬ濃度。４Ｓ．Ｄ．＝標準偏差。５Ｐ＝ステューデントのＴ検定分析から求めたｐ値。

【０１４１】これらの結果から示されるように、それぞれのＣＥＴＰイムノゲンを投与した
後、ＨＤＬ粒子濃度の上昇が認められた。データには比較的大きなばらつきがあ
った。しかし、各ＣＥＴＰイムノゲンにより、対照と比較してＨＤＬコレステロ
ール濃度が約１０％上昇し、結果分析のためにステューデントのＴ検定を用いた
ところ、組み換え型ヒトＣＥＴＰイムノゲンでは８０％以上の信頼度（ｐ＝０．
１７）で上昇が認められた。

【０１４２】例３：ＨＢｃＡｇ／ＣＥＴＰ／ＨＢｃＡｇ融合蛋白質をコードするＥ．ｃｏｌｉ
発現ベクターの構築Ａ．ＨＢｃＡｇのＰＣＲ増幅発現ベクターｐｋｋ２３３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の誘導体であるプラスミド
ｐＦＳ１４は、ＨＢｃＡｇ（サブタイプａｙｗ）をコードしている［Ｓｃｈｏｄ
ｅｌら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５７：１３４７（１９８９）］。以下に示
すＰＣＲプライマーＡは、ＨＢｃＡｇの５’末端を増幅し、ＮｃｏＩ（Ｃ’Ｃ
ＡＴＧ，Ｇ）部位を天然型ＡＴＧ開始コドンの正しい読み取り枠内に配置するた
めに設計されている。以下に示す各配列にはコーディング鎖のみを示し、制限酵
素による切断後に除去される塩基は小文字で示す。

【化１】

【０１４３】以下に示すプライマーＺは、ＨＢｃＡｇの３’末端を増幅し、ＴＡＡ停止コド
ンおよびＨｉｎｄＩＩＩ（Ａ’ＡＧＣＴ，Ｔ）部位を１８３番のアミノ酸（Ｃ
ｙｓ）の後に配置するために設計されている。

【化２】

【０１４４】修飾された５’および３’末端をもつ完全長のＨＢｃＡｇをコードするＤＮＡ
断片を、ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲ試薬キットの製造者（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅ
ｒＣｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．）が推奨する標準ポリメラーゼ連
鎖反応条件の下で、プライマーＡおよびプライマーＺの存在下でプラスミドｐＦ
Ｓ１４をテンプレートとして用い、増幅させる。

【０１４５】次に、増幅させたＤＮＡをＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって切断し
、アガロースゲル上で大きさにより分画する。ＱＩＡＱＵＩＣＫＴＭゲル抽出
キット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を使用して、完全長のＨ
ＢｃＡｇＤＮＡをゲルスライスから精製する。

【０１４６】Ｂ．ｐＰｒｏＥｘ１中へのＨＢｃＡｇの挿入ｃｏｌｉの発現ベクター（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉ
ｌｌｅ，ＭＤ）であるｐＰｒｏＥｘ１もまた、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩ
Ｉで切断し、ゲルにより精製する。増幅したＤＮＡおよびｐＰｒｏＥｘ１のＤＮ
Ａを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて標準条件の下で連結させ、販売者が提供する
プラスミドＰｒｏＥｘ１−ＡＺ形成のための手順を用いて化学的適応性を有する
Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ１０Ｂ細胞（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に組
み入れて形質転換させる。形質転換のための混合液を、１００μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上に広げ、３７℃において一晩（約１８時
間）インキュベートする。アンピシリンを含有する新しいＬＢ寒天プレート上で
再び画線培養することにより、アンピシリン耐性プラスミドをもつコロニーを精
製し、ＷＩＺＡＲＤＴＭ３７３ＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎ
ｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製する。制限酵素
マッピングおよび挿入領域における配列分析によって、ｐＰｒｏＥｘ１のＮｃｏ
ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入したＨｂｃＡｇ断片を含有するプラスミ
ドの特徴を確認する。

【０１４７】次に、プラスミドｐＰｒｏＥｘ１−ＡＺを修飾し、ＨＢｃＡｇのアミノ酸残基
７０番から７５番をコードするヌクレオチドの間にポリリンカーを挿入する。

【０１４８】プライマーＢは、配列番号３９の第２０６位の後にＸｈｏＩ部位（Ｃ’ＴＣ
ＧＡ）およびＥｃｏＲＩ部位（Ｇ’ＡＡＴＴ，Ｃ）を挿入するために設計され
ている。プライマーＹは、配列番号３９の第２２６位の前にＥｃｏＲＩ部位（
Ｇ’ＡＡＴＴ，Ｃ）、その後ろにＳｐｅＩ部位（Ａ’ＣＴＡＧ，Ｔ）を挿入す
るために設計されている。

【化３】

【化４】

【０１４９】次に、プライマーＡおよびＢと共にｐＰｒｏＥｘ１−ＡＺをテンプレートとし
て使用し、ＨＢｃＡｇの１番から６９番のアミノ酸残基をコードするＤＮＡ画分
（ＨＢｃＡｇ−ＡＢと命名）を増幅し、５’末端にＮｃｏＩ部位を、そして３
’末端にＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩ部位をもつ断片を産生させる。また、同
一のプラスミドをプライマーＹおよびＺと共に用いてＨＢｃＡｇの７６番から１
８３番のアミノ酸残基をコードするＤＮＡ画分（ＨＢｃＡｇ−ＹＺと命名）を増
幅し、５’末端にＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩ部位を、そして３’末端にＨｉ
ｎｄＩＩＩ部位をもつ断片を産生させる。

【０１５０】プラスミドＨＢｃＡｇ−ＡＢを産生させるために設計した反応から得られるＰ
ＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、アガロースゲル電気泳動の
後、精製する。プラスミドＨＢｃ−ＹＺを産生させるために設計した第２の反応
から得られるＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、アガ
ロースゲル電気泳動の後、精製する。次に、ゲルにより精製したこれら２種類の
断片を、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理しアガロースゲル電気泳動の
後精製したプラスミドｐＰｒｏＥｘ１と連結させるためにトリプル連結反応を行
う。制限酵素分析により予想される構造をもつプラスミドを検出するためにアン
ピシリン耐性コロニーのスクリーニングを行い、希望する連結プラスミドである
ｐＰｒｏＥｘ１−ＡＢ−ＹＺを得た後、ＨＢｃＡｇ領域全体、特にＡ、ＢＹ、お
よびＺ連結部におけるＤＮＡ配列分析を行うことにより確認する。

【０１５１】Ｃ．配列番号２９をコードするＣＥＴＰ画分のクローニングヒトＣＥＴＰのｃＤＮＡをトランスフェクトした形質転換安定ＣＨＯ細胞［Ｗ
ａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：６１２〜６１８（１９９５）；
Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１７４８７〜１７４９０（１
９９２）］によって、抗体ＴＰ２；Ｔ．Ｌ．Ｓｗｅｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，２６４：１４１３８〜１４３２６（１９８９）が結合するヒトのペ
プチド

【化５】をコードするＣＥＴＰコード配列（配列番号：１）の画分（ヌ
クレオチド１３４６〜１４３１）を増幅するためのテンプレートとして使用する
ＣＥＴＰｃＤＮＡが得られる。

【０１５２】以下に示すプライマーＣは、第１３４６位の天然ＸｈｏＩ部位のすぐ上流の
位置から始まる領域を増幅するために設計されている。以下に示すプライマーＸ
は、ＴＡＧコドンを除去しこれをＥｃｏＲＩ部位（Ｇ’ＡＡＴＴ，Ｃ）の前の
Ｅｃｏ４７ＩＩＩ部位（ＡＧＣ｜ＧＣＴ）に置き換えることにより、ＣＥＴＰ
遺伝子の３’末端の領域を増幅するために設計されている。

【化６】

【化７】

【０１５３】次に、ＣＥＴＰｃＤＮＡをプライマーＣおよびＸと共にテンプレートとして
使用して、ＣＥＴＰのアミノ酸残基４６１〜４７６番をコードし、５’末端近く
にＸｈｏＩ部位を、そして３’末端にＥｃｏ４７ＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ
部位を含有するＤＮＡ画分（ｐＣＥＴＰ−ＣＸと命名）を増幅する。次に、この
ＣＥＴＰ−ＣＸという画分をＸｈｏＩおよびＥｃｏＲ４７ＩＩＩによって切
断し、ゲル上で精製する。プラスミドｐＰｒｏＥｘ１−ＡＢ−ＹＺをＳｐｅＩ
で分解し、４塩基の５’オーバーハングを除去しブラントエンドを作成するため
にＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理する。［Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
Ｐｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＮ．Ｙ．，８−２３（１
９８９）を参照。］

【０１５４】次に、このようにして得られるプラスミドをＸｈｏＩで処理し、ゲル上で精
製した後、一方の端にＺｈｏＩ部位をもちもう一方はＥｃｏ４７ＩＩＩで切
断したことによりブラントエンドになっているＣＥＴＰ−ＣＸ画分に連結する。
このようにして得られるプラスミドはｐＰｒｏＥｘ１−ＡＢＣ−ＸＹＺと命名さ
れ、制限酵素分析および配列分析によってベクトルｐＰｒｏＥｘ１−ＡＺの中で
ＨＢｃＡｇの７０〜７５番のアミノ酸残基をコードする配列の代わりにＣＥＴＰ
の４６１〜４７６番のアミノ酸残基をコードする配列を含有することを確認する
。

【０１５５】例４：Ｅ．ｃｏｌｉ中でのＨＢｃＡｇ／ＣＥＴＰ／ＨＢｃＡｇの発現ｐＰｒｏＥｘ１ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ中で外因性の蛋白質を発現させるた
めに設計されている。このベクターには、アンピシリン耐性を示す遺伝子と、Ｅ
．ｃｏｌｉ中で増殖するためのｐＢＲ３２２由来の複製遺伝子が含まれる。また
、６ヒスチジン配列（６ＸＨｉｓ）に並んで複数のクローニング部位があり、
ｒＴＥＶプロテアーゼのための認識配列も存在する。この部位は、融合蛋白質を
精製した後、そこから６ＸＨｉｓタグを除去するために有用である。このベク
トルはまた、ＴｒｃプロモーターとｌａｃＩｑ遺伝子をもっており、イソプロピ
ル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって遺伝子発現を誘導す
ることができる。原核生物のリボソームの結合部位は、６ＸＨｉｓタグの翻訳
開始部位よりも上流に位置している。唯一のＮｃｏＩ部位は、６ＸＨｉｓタ
グの最初のコドンの部位に位置する。プラスミドｐＰｒｏＥｘ１および対照プラ
スミドは、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手する。

【０１５６】それぞれｐＰｒｏＥｘ１、ｐＰｒｏＥｘ１−ＣＡＴ、ｐＰｒｏＥｘ１−ＡＺ、
あるいはｐＰｒｏＥｘ１−ＡＢＣ−ＸＹＺをもつＥ．ｃｏｌｉＤＨ１０Ｂ菌株
を一晩（約１８時間）培養し、販売者が推奨する条件下でＩＰＴＧにより誘導さ
れる培養のための接種液として使用する。プラスミドｐＰｒｏＥｘ１−ＡＺを含
む培養細胞はＨＢｃＡｇを産生し、ｐＰｒｏＥｘ１−ＡＢＣ−ＸＹＺを含む細胞
は目的とするＨＢｃＡｇ／ＣＥＴＰ／ＨＢｃＡｇ融合蛋白質を粒子として産生す
る。これらの蛋白質には、本来のｐＰｒｏＥｘ１ベクター中に存在する６ＸＨ
ｉｓタグがない。何故ならば、６Ｘタグの開始位置にあるＮｃｏＩ部位にＨＢ
ｃＡｇ配列が挿入されているからである。ｐＰｒｏＥｘ１−ＣＡＴをもつ培養細
胞は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でＨｉｓタグ付きＣＡＴ融合蛋白質の場合に予想
されるのと同様の移動特性を示す。

【０１５７】例５：バキュロウイルスに感染した昆虫細胞中でのＨＢｃＡｇ／ＣＥＴＰ／ＨＢ
ｃＡｇ融合蛋白質の発現バキュロウイルスに感染した昆虫細胞は、各種の組み換え型蛋白質を発現する
ことが示されている（Ｖ．Ａ．Ｌｕｃｋｏｗ、昆虫細胞発現技術、１８３〜２１
８ページ、「蛋白質エンジニアリング：原理と実践」、Ｊ．Ｌ．Ｃｌｅｌａｎｄ
ら編、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ、１９９６）。感染の後期の段階において
、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多面性ウイルス（ＡｃＮＰ
Ｖ）のポリヘドリンプロモーターの制御下に置かれた異種遺伝子が多量に発現さ
れることが多い。ほとんどの場合、組み換え型蛋白質は適切に加工されており、
機能的にも天然型の蛋白質と同様である。

【０１５８】Ｂａｃ−Ｔｏ−ＢａｃＴＭバキュロウイルス発現システム（ＬｉｆｅＴｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）として市販されているバキュロウイルスシャトルベクタ
ーシステム（Ｌｕｃｋｏｗら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：４５６６−４５７９、
１９９３）を使用して、キメラＨＢｃＡｇ／ＣＥＴＰ／ＨＢｃＡｇ遺伝子を含有
する組み換え型バキュロウイルスを構築する。

【０１５９】簡単に説明すると、ｐＰｒｏＥｘ１−ＡＢＣ−ＸＹＺをＮｃｏＩで切断し、
末端を埋めるためにクレノウ酵素で処理した後、ＨｉｎｄＩＩＩで切断してＨ
ＢｃＡｇ／ＣＥＴＰ／ＨＢｃＡｇ融合蛋白質をコードする断片全体を得る。この
断片をバキュロウイルスのドナープラスミドであるｐＦａｓｔＢａｃ１の中に挿
入し、ＢａｍＨＩで切断しクレノウ酵素で処理した後、ＨｉｎｄＩＩＩで切
断する。このようにして得られたプラスミドは、ＡｃＮＰＶのポリヘドリンプロ
モーターより下流に挿入されたハイブリッドＨＢｃＡｇ／ＣＥＴＰ／ＨＢｃＡｇ
遺伝子をコードする配列をもつ。次に、ポリヘドリンＨＢｃＡｇ／ＣＥＴＰ／Ｈ
ＢｃＡｇ発現カセットを含むミニ−Ｔｎ７画分をＥ．ｃｏｌｉ中で増殖させたバ
キュロウイルスシャトルベクター中に転移させ、合成（組み換え型）ベクターを
含むコロニーを色および薬剤耐性パターンの変化によって識別する。Ｍｉｎｉｐ
ｒｅｐＤＮＡを作成し、培養Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（
アキアワヨトウ）Ｓｆ９細胞中にトランスフェクトする。

【０１６０】保存用組み換え型ウイルスを調製し、標準的な手法によって組み換え型蛋白質
の発現のモニターを行う（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、「バキュロウイルス発現ベクタ
ー：実験室マニュアル」、Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ、
ＮｅｗＹｏｒｋ、１９９２；Ｋｉｎｇ，Ｌ．Ａ．，ａｎｄＰｏｓｓｅｅ，Ｒ
．Ｄ．「バキュロウイルス発現システム：実験室ガイド」、Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈ
ａｌｌ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９９２）。

【０１６１】例６：哺乳類細胞中でのＨＢｃＡｇ／ＣＥＴＰ／ＨＢｃＡｇ融合蛋白質の発現ＢＨＫ／ＶＰ１６’発現システム（Ｈｉｐｐｅｎｍｅｙｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１：１０３７〜１０４１、１９９３）を用いて、ＨＢｃＡ
ｇ／ＣＥＴＰ／ＨＢｃＡｇ融合蛋白質を哺乳類の培養細胞中で発現させる。簡単
に説明すると、例３のプラスミドｐＰｒｏＥｘ１−ＡＢＣ−ＸＹＺからのＮｃｏ
Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片のＨＢｃＡｇ／ＣＥＴＰ／ＨＢｃＡｇコード配列を
ゲル電気泳動によって分離し、前述の方法によって精製する。断片をクレノウポ
リメラーゼおよび４種類すべてのヌクレオチド三リン酸で処理し、５’オーバー
ハンギング末端をブラントにする。

【０１６２】哺乳類発現ベクターｐＭＯＮ３３２７は、プラスミドｐＵＣ１８のＢａｍＨ
Ｉ部位にＳＶ４０のポリアデニル化シグナル配列をもっており、以後のプラスミ
ド構築の基盤として使用する。ベクターｐＭＯＮ３３２７中のＳＶ４０ポリアデ
ニル化シグナル配列の上流に単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）のＩＥ１７５
プロモーターを連結することにより、哺乳類での発現ベクターｐＭＯＮ３３６０
Ｂが得られる。ＩＥ１７５プロモーターはＨＳＶ−１ＶＰ−１６トランスアク
チベータに反応する。

【０１６３】発現ベクターｐＭＯＮ３３６０ＢをＢａｍＨＩで切断し、唯一のＢａｍＨ
Ｉ部位にある５’オーバーハンギング末端をクレノウポリメラーゼを用いて埋め
る。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、ベクター配列とＨＢｃＡｇ／ＣＥＴＰ／Ｈ
ＢｃＡｇ配列を１５℃において一晩（約１８時間）連結させる。連結混合物を増
殖能のあるＥ．ｃｏｌｉにトランスフェクトし、アンピシリン耐性を利用して選
択する。プラスミドＤＮＡをコロニーから分離し、ｐＭＯＮ３３６０Ｂベクター
の中にＨＢｃＡｇ／ＣＥＴＰ／ＨＢｃＡｇ配列が正しい方向で入っていることを
制限酵素分析によって確認する。正しい方向のプラスミドをｐＭＯＮ３３６０Ｂ
−ＨＢｃＡｇ−ＣＥＴＰと命名する。ＰｒｏｍｅｇａＭａｘｉｐｒｅｐＴＭ
法を用いて４００ｍｌの培養液からプラスミドｐＭＯＮ３３６０Ｂ−ＨＢｃＡｇ
−ＣＥＴＰを精製する。

【０１６４】ＢＨＫ／ＶＰ１６ハムスター腎細胞を６０ｍｍ培養皿に１枚当たり約３×１０５細胞となるように接種し、２４時間後にＤＭＥＭ／５％ウシ胎児血清（Ｌｉ
ｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する培養液中でトランスフェクション
を行う。ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅＴＭ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ）を使用し製造者の推奨事項に従って、１０μｇのプラスミドｐＭＯＮ３３
６０Ｂ−ＨＢｃＡｇ−ＣＥＴＰと１μｇのプラスミドｐＭＯＮ１１１８を細胞中
にトランスフェクトする。トランスフェクションから２日後に、細胞をトリプシ
ン／ＥＤＴＡ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理し、ヒグロマイシ
ン（Ｓｉｇｍａ）を含有する培養液中で１００ｍｍ培養皿１０枚に接種する。約
２週間後にろ紙を用いて生細胞コロニーを分離し展開した後、ＨＢｃＡｇ／ＣＥ
ＴＰ／ＨＢｃＡｇ融合蛋白質の発現についてアッセイを行う。

【０１６５】例７：ＨＢｃＡｇ／ＣＥＴＰ／ＨＢｃＡｇ融合蛋白質をｉｎｖｉｔｒｏで発現
し得るＤＮＡワクチンベクターの構築Ａ．ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ−ＨＢｃＡｇ／ＣＥＴＰ／ＨＢｃＡｇ−１および
ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ−ＨＢｃＡｇ／ＣＥＴＰ／ＨＢｃＡｇ−２の構築ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ．，Ｓａ
ｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）は、ベクターｐｃＤＮＡＩおよびその親ベクターであ
るｐＣＤＭ８の誘導体である。これら３種類のベクターはすべて次のような特徴
をもっている：多量の構成発現のためのヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の
ごく早期の遺伝子からのエンハンサー−プロモーター配列；ｍＲＮＡの安定性を
促進するためのＳＶ４０ポリ（Ａ）転写終了シグナルおよびＲＮＡプロセシング
シグナル；挿入配列の単一方向あるいは双方向クローニングを可能にする万能複
数クローニング部位；およびＥ．ｃｏｌｉ中での増殖のためのＣｏｌＥ１複製起
点。ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐにはまた、展開した複数のクローニング部
位に並んでバクテリオファージＴ７およびＳＰ６と、アンピシリン耐性遺伝子も
含まれており、ほとんどのＥ．ｃｏｌｉ菌株中での増殖および選択が容易になっ
ている。これらのベクターを利用して、各種の哺乳類細胞において細胞質蛋白質
、転写因子、ウイルス蛋白質、細胞表面受容体、および分泌蛋白質を含めた組み
換え型蛋白質を多量に構成発現させることができる。

【０１６６】ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐは、異種遺伝子挿入のためのｐＣＭＶプロモ
ーターより下流の複数のクローニング部位のどの位置においても線形にすること
が可能である。例５に記載したように、ｐＰｒｏＥｘ−１−ＡＢＣ−ＸＹＺをＮ
ｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、４種類すべてのヌクレオチド三リン
酸の存在下でクレノウ酵素で処理することによって５’オーバーハンギング末端
をブラントにし、ＨＢｃＡｇ／ＣＥＴＰ／ＨＢｃＡｇをコードするブラントエン
ドのＤＮＡ画分を調製する。この断片をアガロースゲルから精製する。ベクター
ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐをＥｃｏＲＶで切断することによってブラントエンド
を切り離し、エビアルカリ性ホスファターゼで処理して５’末端のリン酸を除去
した後、ＨＢｃＡｇ／ＣＥＴＰ／ＨＢｃＡｇをコードする精製した断片に連結す
る。このようにして得られたＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉＤＨ１０Ｂ中にトランスフ
ォームし、得られたコロニーについてＣＭＶプロモーターより下流に正しい方向
で挿入されたＨＢｃＡｇ／ＣＥＴＰ／ＨＢｃＡｇを含むプラスミドをスクリーニ
ングする。目的とするプラスミドをｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ−ＨｂｃＡｇ／ＣＥ
ＴＰ／ＨｂｃＡｇ−１と命名する。

【０１６７】ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよび末端を埋めるためにクレノウ酵素で処理した
ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐの中にブラントエンドのＨＢｃＡｇ／ＣＥＴＰ／ＨＢｃ
Ａｇを挿入することによって類似のプラスミドも調製し、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍ
ｐ−ＨｂｃＡｇ／ＣＥＴＰ／ＨｂｃＡｇ−２を産生させる。このプラスミドがｐ
ｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ−ＨｂｃＡｇ／ＣＥＴＰ／ＨｂｃＡｇ−１と異なる点は、
ＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０ポリ（Ａ）領域に並ぶ複数のクローニング部
位の中央部分を大きく除去してあることである。

【０１６８】Ｂ．ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ−ＨＢｃＡｇ／ＣＥＴＰ／ＨｂｃＡｇの構築プラスミドｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ−β−ｇａｌ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）は、ＮｏｔＩ断片としてｐＣＭＶ−ＳＰ
ＯＲＴ１中にクローニングされたＥ．ｃｏｌｉのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を
含む。これらのベクターはＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０のポリ（Ａ）部位、ア
ンピシリン耐性遺伝子、およびＥ．ｃｏｌｉプラスミドの複製起点を含有してい
る。プラスミドｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ−β−ｇａｌは一般に、トランスフェクシ
ョン効率をモニターするためのリポーターベクターとして使用される。プラスミ
ドｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ−ＨＢｃＡｇ／ＣＥＴＰ／ＨｂｃＡｇは、前記のサブセ
クションＡに記載したのと同様の手順によって調製する。プラスミドｐＣＭＶ−
ＳＰＯＲＴ−β−ｇａｌをＮｏｔＩによって線状にし、クレノウ酵素で処理し
て末端を埋め、エビアルカリ性ホスファターゼによって５’末端のリン酸を除去
する。次に、線状にしホスファターゼ処理したベクターを、ＨＢｃＡｇ／ＣＥＴ
Ｐ／ＨＢｃＡｇをコードする上述の配列からのブラントエンド線状断片に連結す
る。連結混合物をＥ．ｃｏｌｉＤＨ１０Ｂ中にトランスフォームし、得られた
プラスミドについてベクター中に正しい方向で挿入されたかどうかスクリーニン
グする。

【０１６９】プラスミドｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ−β−ｇａｌおよびｐＧｒｅｅｎＬａｎｔ
ｅｒｎ−１（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ
）は共に、ＣＭＶプロモーターの制御下にあるリポーター遺伝子を含んでおり、
哺乳類でのトランスフェクションの研究において対照ベクターとして使用するの
に適している。β−ガラクトシダーゼ活性が発現したかどうかは、色素性基質で
あるＸ−ｇａｌを用いて原核生物または有核生物の細胞をｉｎｓｉｔｕで染色
することによって容易にモニターすることができる。プラスミドｐＧｒｅｅｎ
Ｌａｎｔｅｒｎ−１は、Ａｅｑｕｏｒｅａｖｉｃｔｏｒｉａクラゲからの緑色
蛍光蛋白質（ＧＦＰ）の遺伝子の突然変異型を含有する。ＧＦＰは基質を必要と
せずに肉眼で観察できるため、ＦＩＴＣフィルターを付けた蛍光顕微鏡によって
固定した細胞だけでなく生細胞においても、また動物の生体においてもモニター
することが可能である。

【０１７０】例８：精製ＤＮＡテンプレートの調製簡単に説明すると、プラスミドをもつＥ．ｃｏｌｉ培養をＴＢまたはＬＢ培地
中で増殖させる。［Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング、第２版、Ｃｏ
ｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨ
ａｒｂｏｒＮ．Ｙ．，８〜２３（１９８９）を参照。］市販の陰イオン交換精
製キット（ＱｉａｇｅｎＧｍｂＨ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）に入っている試薬
を使用し、アルカリ溶解法によって細胞沈渣からプラスミドＤＮＡを遊離させる
。回収した溶解液をＰ−２５００カラム（Ｑｉａｇｅｎ）上で精製し、イソプロ
パノールで沈殿させ、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ中に溶解した後、ＮａＣｌエタノール
で再沈殿させ、最後にエンドトキシン不在の滅菌リン酸緩衝液（ＰＢＳ；Ｓｉｇ
ｍａＣｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中に再懸濁する。プラスミ
ドＤＮＡは−２０℃において保存する。確立された手法に従って、粗生成物の無
菌性と、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、およびエンドトキシンの混入とについてテス
トする［Ｍ．Ｍａｒｑｕｅｔら、ＢｉｏＰｈａｒｍ，１０（５）：４２〜５０（
１９９７）に総説されている。］

【０１７１】例９：マウスの筋肉中に直接注射したＨＢｃＡｇ／ＣＥＴＰ／ＨＢｃＡｇ融合蛋
白質をコードするＤＮＡのｉｎｖｉｖｏでの発現前述の例に記載した方法に従い、エンドトキシン不在のプラスミドｐｃＤＮＡ
Ｉ／Ａｍｐ−ＨＢｃＡｇ／ＣＥＴＰ／ＨｂｃＡｇ−１および−２、ｐＣＭＶ−
ＳＰＯＲＴ−ＨＢｃＡｇ／ＣＥＴＰ／ＨＢｃＡｇ、ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ−β−
ｇａｌ、そしてｐＧｒｅｅｎＬａｎｔｅｒｎ−１の試料を調製する。マウスの
四頭筋に上述のプラスミドのうちの１種を１００μｇ注射し、適切な維持期間が
経過した後、注射部位の筋肉組織についてβ−ｇａｌまたはＧＦＰリポーター遺
伝子の活性、もしくはＨＢｃＡｇ／ＣＥＴＰ／ＨＢｃＡｇ融合蛋白質の発現のア
ッセイを行う。

【０１７２】Ａ．光学顕微鏡検査プラスミドＤＮＡの注射によって免疫したマウスの四頭筋を完全な形で摘出し
、横断面で切断した後、Ｘ−ｇａｌによって組織化学的染色を行いβ−ｇａｌ活
性について調べる［Ｗｏｌｆｆら、Ｓｉｃｅｎｃｅ、２４７：１４６５〜１４６
８、１９９０］。ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ−β−ｇａｌに曝露した組織のみが不溶
性の沈渣を形成する。これは発現したβ−ガラクトシダーゼ蛋白質によってＸ−
ｇａｌが切断された結果生じるインディゴブルーの産物である。同様に、ＧＦＰ
を発現している試料は、ＦＩＴＣフィルターを付けた光学顕微鏡で観察すると劇
的な蛍光シグナルを示し、最大励起波長は４９０ｎｍである。［Ｒ．Ｈｅｉｍら
、Ｎａｔｕｒｅ、３７３：６６３（１９９５）。］融合蛋白質を発現している試
料は、これらの条件下では蛍光を発せず、またＸ−ｇａｌとも反応しない。

【０１７３】Ｂ．免疫蛍光検査ＨＢｃＡｇ／ＣＥＴＰ／ＨＢｃＡｇ融合蛋白質を発現している筋肉試料は、Ｈ
ＢｃＡｇまたはＣＥＴＰに対する第１抗体と、よく知られたいくつかの第２抗体
（例えば、ＦＩＴＣ−またはローダミンに結合させた第２抗体）のいずれかとを
用いる免疫蛍光検査によって検出する。確立された免疫蛍光検査法は本専門分野
において幅広く知られており、試薬および方法の多くは市販されている。

【０１７４】Ｃ．免疫ブロット法筋肉抽出物は、溶解緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、２ｍＭＭ
ｇＣｌ_２、および０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）の入った微小遠心用試験
管中で四頭筋組織を細かく刻み、均一になるまでプラスチック製乳棒ですりつぶ
す。標準的手法を用いて、蛋白質試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析し、電気泳動
によりＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐまたはニトロセルロース膜に移す。［Ｊ．Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら、分子クローニング、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒＰｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＮ．Ｙ．，８〜２
３（１９８９）を参照。］β−ガラクトシダーゼ、ＧＦＰ、ＨＢｃＡｇ、および
ＣＥＴＰに対する市販の第１抗体を用いて、筋肉組織中にプラスミドＤＮＡを注
射した結果得られる発現産物を検出する。多くの第２抗体が、リポーター酵素に
化学的に結合させた形で各種市販されている。市販品の例として、アルカリ性ホ
スファターゼに結合させた抗ウサギ、抗マウス、あるいは抗ヒトＩｇＧが挙げら
れる。セイヨウワサビペルオキシダーゼまたはβ−ガラクトシダーゼに化学的に
結合させた第２抗体もまた、広く市販されている。ＧＦＰを発現している筋肉抽
出物は抗ＧＦＰ抗体によって検出され、β−ｇａｌを発現しているものは抗β−
ｇａｌ抗体により、またＨＢｃＡｇ／ＣＥＴＰ／ＨＢｃＡｇ融合蛋白質を発現し
ているものはＨＢｃＡｇもしくはＣＥＴＰに対する抗体により検出される。

【０１７５】Ｄ．ＰＣＲ分析また、ポリメラーゼ連鎖反応の手法を用いて注射したプラスミドＤＮＡの存在
を検出するためにも、筋肉抽出物の分析を行う。簡単に説明すると、注射部位か
ら採取した筋肉組織を溶解緩衝液中で均一化し、テンプレートＤＮＡを調製した
後、適切なプライマー金剛物および熱安定性ポリメラーゼの入った反応液の中で
反応させる。アンピシリン耐性遺伝子の中にあるプライマーは、すべてのベクタ
ーに共通であるが、注射したプラスミドＤＮＡを取り込み維持しているすべての
組織中にあるＤＮＡ断片を増幅する。挿入したプラスミドが細胞内で維持されて
いるプラスミドの中で完全な状態を保っていれば、各遺伝子、ＧＦＰ、β−ｇａ
ｌ、ＨＢｃＡｇ、およびＣＥＴＰに特異的なプライマーセットは一定の大きさの
断片を増幅する。ＰＣＲは筋肉組織内でのプラスミドの長期安定性をモニターす
るために利用することができ、免疫ブロットあるいは顕微鏡を用いる手法によっ
てモニターされる発現レベルが低かったり存在しなかったりする場合には転写お
よび発現の実験において有用である。またＰＣＲは、プラスミドが宿主の染色体
中に組みこまれたか、もしくは受動拡散によって消失したかを確認するためにも
利用できる。

【０１７６】Ｅ．抗体産生上述のようにして免疫したマウスは、前述のＥＬＩＳＡアッセイにおいてＣＥ
ＴＰとの免疫反応性を有する抗体を産生する。同様に免疫したウサギもまた抗Ｃ
ＥＴＰ抗体を産生し、この抗体はＨＤＬからのコレステリルエステルの輸送を低
下させ、血漿中のＨＤＬ粒子の濃度を上昇させる。

【０１７７】例１０：マウスの筋肉中に直接注射したウサギＣＥＴＰをコードするＤＮＡのｉ
ｎｖｉｖｏでの発現Ａ．ウサギＣＥＴＰのＰＣＲ増幅ウサギＣＥＴＰｃＤＮＡ（配列番号：２７）［Ｎａｇａｓｈｉｍａら、Ｊ．
ＬｉｐｉｄＲｅｓ．，２９：１６４３〜１６４９（１９８８）またはＫｏｔａ
ｋｅら、Ｉｂｉｄ，３７：５９９〜６０５（１９９６）］を上述のようにして入
手する。以下に示すＰＣＲプライマーＮは、ウサギＣＥＴＰの５’末端を増幅し
、配列番号：２７の＋１位にあるＧＣＣコドンのすぐ前の天然のＡＴＧ開始コド
ンの正しい読み取り枠の中にＮｏｔＩ（ＧＣ’ＧＧＣＣ，ＧＣ）部位およびＮ
ｃｏＩ（Ｃ’ＣＡＴＧ，Ｇ）部位を作るために設計されている。以下に示す各
配列は、コード鎖のみを示してあり、制限酵素によって切断した後除去された塩
基は示さず、合成配列は小文字で表す。

【化８】

【０１７８】以下に示すプライマーＭは、ウサギＣＥＴＰの３’末端を増幅し、配列番号：
２７の＋１４９４位にあるＴＡＧ停止コドンの最後部のすぐ前のアミノ酸残基４
９７番（Ｓｅｒ）の後ろにＴＡＡ停止コドン、ＨｉｎｄＩＩＩ（Ａ’ＡＣＧＴ
，Ｔ）部位およびＮｏｔＩ（ＧＣ’ＧＧＣＣ，ＧＣ）部位を作るために設計さ
れている。

【化９】

【０１７９】ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲ試薬キット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ
、Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．）の製造者が推奨する標準ポリメラーゼ連鎖反応
条件に従い、プライマーＭおよびプライマーＮの存在下で上述のｃＤＮＡをテン
プレートとして使用し、修飾された５’および３’末端をもつ完全長のウサギＣ
ＥＴＰをコードするＤＮＡ断片を増幅する。次に、増幅したＤＮＡをＮｏｔＩ
で切断し、アガロースゲル上で大きさにより分画する。前述の方法に従い、完全
長のウサギＣＥＴＰＤＮＡを精製する。

【０１８０】Ｂ．ｐＧＥＭ−５ｚｆ（＋）、ｐＣＲＩＩ、およびｐＰｒｏＥｘ１へのウ
サギＣＥＴＰＤＮＡの挿入ＮｏｔＩに適合する末端をもつ完全長のウサギＣＥＴＰを、ｌａｃＺａｌｐ
ｈａペプチド領域内のポリリンカー領域に唯一のＮｏｔＩ部位をもつｐＧＥＭ
ＴＭ−５Ｚｆ（＋）（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓ
ｏｎ、ＷＩ）のようなプラスミドクローニングベクター中に挿入する。販売者の
推奨する方法に基づき、青色／白色スクリーニングによって組み換え体を選別す
る。もう１つの方法として、完全長のウサギＣＥＴＰを含むＰＣＲ産物をｐＣＲ
ＴＭＩＩ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＳａｎＤｉ
ｅｇｏ、ＣＡ）のようなＴＡクローニングベクターに直接クローニングするとい
う手段がある。ウサギＣＥＴＰをコードするヌクレオチド配列の正体を確認する
ために、ＤＮＡ配列分析を行う。どちらの場合にも、完全長のウサギＣＥＴＰ
ＤＮＡをＮｏｔＩに適合する末端をもつ断片として、あるいはＮｃｏＩ−Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ断片として、ベクターから遊離させることができる。

【０１８１】Ｃ．Ｅ．ｃｏｌｉ、昆虫細胞、および哺乳類細胞におけるウサギＣＥＴＰの発
現ＨＢｃＡｇ／ＣＥＴＰ／ＨＢｃＡｇキメラ融合蛋白質をコードするＤＮＡを
作成するための上記の例３Ｂおよび３Ｃで述べたように、ウサギＣＥＴＰをＮｃ
ｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片としてｐＰｒｏＥｘ１中に挿入する。ウサギＣＥ
ＴＰ蛋白質をＥ．ｃｏｌｉ中で発現させるために、例４に記載した方法も利用で
きる。その後、ウサギＣＥＴＰ蛋白質をＥ．ｃｏｌｉから精製し、分離した蛋白
質の生物学的活性について確認する。

【０１８２】ウサギＣＥＴＰをコードするＤＮＡを精製し、例５の記載に従ってプラスミド
ｐＦａｓｔＢａｃ１中に挿入する。組み換え型バキュロウイルスを作成し、感染
した昆虫細胞中でウサギＣＥＴＰを発現させるために用いる。

【０１８３】ウサギＣＥＴＰをコードするＤＮＡを精製し、例６の記載に従ってｐＭＯＮ３
３２７中に挿入する。得られたプラスミドを用いてＢＨＫ／ＶＰ１６細胞をトラ
ンスフェクトし、生細胞コロニーを展開してウサギＣＥＴＰの発現についてアッ
セイする。

【０１８４】Ｄ．ＤＮＡワクチンベクター中へのウサギＣＥＴＰ遺伝子の挿入例７Ａの説明に従い、ウサギＣＥＴＰ遺伝子（ｒＣＥＴＰ）をブラントエンド
の断片としてベクターｐｃＤＮＡ１／Ａｍｐ中に挿入する。また、例７Ｂの説
明に従い、ウサギＣＥＴＰ遺伝子をＮｏｔＩ断片としてｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ
中に挿入する。両プラスミドは、ＣＭＶプロモーターの制御下で、哺乳類細胞中
においてウサギＣＥＴＰを発現させる。

【０１８５】哺乳類細胞をｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ−ｒＣＥＴＰまたはｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ
−ｒＣＥＴＰでトランスフェクトする。例９Ｂに記載した免疫蛍光検査法により
、また例９Ｃに記載した免疫ブロット法により、ウサギＣＥＴＰの発現について
アッセイする。

【０１８６】トランスフェクトした哺乳類細胞系においてウサギＣＥＴＰが検出され、発現
量が十分に高くて発現が保証できることが確認されたら、血液中にＣＥＴＰが含
まれる動物−例えばモルモットなど−の筋肉組織中にｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ−ｒ
ＣＥＴＰまたはｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ−ｒＣＥＴＰを注射し、例９Ａ−Ｅの記載
に従ってモニターする。

【０１８７】これまでの説明および例は実例を示す目的で記載したものであり、これに限定
されるわけではない。本発明の意図および範囲の中でまだ他にも多くの応用が可
能であり、本専門分野に精通した者にとって自明のことである。

【０１８８】

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 BA31 CA04 GA13 HA01 HA15 4C084 AA13 MA66 NA14 ZA452

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の工程を含む、哺乳類においてコレステリル・エステル
転移タンパク質（ＣＥＴＰ）に対する抗体の製造方法：（ａ）ＣＥＴＰ免疫原がＣＥＴＰアミノ酸残基配列を有する免疫原性ポリペプチ
ドであり、ＣＥＴＰに対する抗体を誘導するために十分量の組換え型ＤＮＡ分子
が免疫によって得られる、（ｉ）（ｉｉ）に結合するＣＥＴＰ免疫原をコードす
る配列、（ｉｉ）該哺乳類において該ＣＥＴＰ免疫原ＤＮＡ配列の発現を制御す
るプロモーター配列、を含むＤＮＡ配列を含む組換え型ＤＮＡ分子がその中に溶
解または分散されている溶媒を含む接種物によって該哺乳類を免疫する工程；お
よび（ｂ）ＣＥＴＰに結合する抗体を産生するために十分な期間、免疫した該哺乳類
を維持する工程。
【請求項２】哺乳類の血液がＣＥＴＰを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】以下の工程を含む、その血液がコレステリル・エステル転移
タンパク質（ＣＥＴＰ）を含む、哺乳類の血液中のＨＤＬコレステロール濃度を
増加させる方法：（ａ）ＣＥＴＰ免疫原がＣＥＴＰアミノ酸残基配列を有する免疫原性ポリペプチ
ドであり、ＣＥＴＰに対する抗体を誘導するために十分量の組換え型ＤＮＡ分子
が免疫によって得られる、（ｉ）（ｉｉ）に結合するＣＥＴＰ免疫原をコードす
る配列、（ｉｉ）該哺乳類において該ＣＥＴＰ免疫原ＤＮＡ配列の発現を制御す
るプロモーター配列、を含むＤＮＡ配列を含む組換え型ＤＮＡ分子がその中に溶
解または分散されている溶媒を含む接種物によって該哺乳類を免疫する工程；お
よび（ｂ）該ＣＥＴＰ免疫原が発現されるために、ＣＥＴＰに結合する抗体が産生さ
れるために、およびＨＤＬからのコレステリル・エステルの転移を弱めるために
十分な期間、免疫した該哺乳類を維持する工程。
【請求項４】免疫工程が繰り返される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】哺乳類の血液中のＨＤＬコレステロール値が第一の免疫工程
前のＨＤＬコレステロール値と比較して約１０％以上増加するまで、免疫工程が
約３〜約６ヶ月間隔で繰り返される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】組換え型ＤＮＡ分子が、免疫原性ポリペプチドとしてヒトＣ
ＥＴＰをコードする、請求項３に記載の方法。
【請求項７】組換え型ＤＮＡ分子が、免疫原性ポリペプチドとしてウサギ
ＣＥＴＰをコードする、請求項３に記載の方法。
【請求項８】コードされたＣＥＴＰ免疫原が外因性の抗原性担体ポリペプ
チドと融合した免疫原性ポリペプチドを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項９】外因性抗原性担体ポリペプチドが、Ｂ型肝炎コアタンパク質
、破傷風トキソイド、およびジフテリアトキソイドからなる群より選択される、
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】組換え型ＤＮＡ分子が、外因性抗原性担体が免疫原性ポリ
ペプチドのカルボキシ末端と融合している融合タンパク質をコードする、請求項
９に記載の方法。
【請求項１１】コードされた外因性抗原性担体のカルボキシ末端がコード
された免疫原性ポリペプチドのアミノ末端と融合している、請求項８に記載の方
法。
【請求項１２】コードされた外因性抗原性担体がコードされた免疫原性ポ
リペプチドのアミノ末端およびカルボキシ末端の双方と融合している、請求項８
に記載の方法。
【請求項１３】コードされた融合タンパク質がアミノ末端隣接配列および
カルボキシ末端隣接配列と融合している、長さがアミノ酸残基約１０〜約３０個
である免疫原性ポリペプチドを含み、（ａ）該アミノ末端隣接配列が、本質的に、Ｂ型肝炎コアタンパク質（ＨＢｃＡ
ｇ）の約１位〜約３５位のアミノ酸残基配列を有するアミノ酸残基約１０〜約２
０個を含み、該カルボキシ末端隣接配列がＨＢｃＡｇの約１０位〜約１８３位の
アミノ酸残基配列を有するアミノ酸残基約１２０〜約１６０個を本質的に含み；
または（ｂ）該アミノ末端隣接配列が、本質的に、ＨＢｃＡｇの約１位〜約９０位のア
ミノ酸残基配列を有するアミノ酸残基約７０〜約９０個を含み、該カルボキシ末
端隣接配列がＨＢｃＡｇの約８０位〜約１８３位のアミノ酸残基配列を有するア
ミノ酸残基約６５〜約８５個を本質的に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】コードされた免疫原ポリペプチドに存在するアミノ酸残基
の数が、アミノ末端隣接配列のカルボキシ末端残基の位置とカルボキシ末端隣接
配列のアミノ末端残基の位置の間のＨＢｃＡｇアミノ酸残基配列から欠損してい
るアミノ酸残基の数とほぼ同数である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】コードされた免疫原性ポリペプチドが配列番号：２９また
は５０のアミノ酸残基配列を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項１６】免疫が、接種物を哺乳類の筋肉または皮膚に注射すること
によって行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項１７】組換え型ＤＮＡ分子の有効量が溶媒に溶解または分散され
ており、（ｉ）（ｉｉ）に結合するＣＥＴＰ免疫原をコードする配列、（ｉｉ）
哺乳類においてＣＥＴＰ免疫原ＤＮＡ配列の発現を調節するプロモーター配列、
を含むＤＮＡ配列を含む組換え型ＤＮＡ分子を含む接種物。
【請求項１８】ＣＥＴＰ免疫原をコードするＤＮＡの濃度が約０．０５μ
ｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌである、請求項１７に記載の接種物。
【請求項１９】溶媒が燐酸緩衝生理食塩液である、請求項１７に記載の接
種物。
【請求項２０】溶媒が等張蔗糖溶液である、請求項１７に記載の接種物。
【請求項２１】ＤＮＡがリポソームと複合体を形成している、請求項１７
に記載の接種物。