JP5519477B2 - Ｔ１免疫応答とｔ２免疫応答との間で調節するためのワクチン - Google Patents

Description

本出願は、２００１年３月２７日提出の「Ｔ１免疫応答とＴ２免疫応答との間で調節す
るためのワクチン」と題する、米国仮出願第６０/２７８，６９８号（引用することによ
り本明細書の一部をなすものとする）への優先権を主張する。

［発明の分野］
本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏ免疫応答、特に体液性免疫応答及び細胞性免疫応答を調節す
ることができるリポソームワクチンを提供する。

［発明の背景］
疾患と効果的に戦うためには、ワクチンは、抗体産生（体液性免疫）及び免疫細胞動員
（細胞性免疫）等の幾つかの免疫反応を理想的に刺激しなければならない。

細胞性免疫応答は、細胞障害性（ＣＴＬ）Ｔ細胞及び遅延型過敏症（ＤＴＨ）Ｔ細胞等
の、Ｔリンパ球の増殖及び刺激を引き起こし、これが次にはマクロファージを活性化し、
病原体の増殖を妨げる。体液性応答の誘導により、体内のＢ細胞は、加害病原体に対する
抗体を産生する。しかし、一部の細胞内病原体及びレトロウイルスは生き残り、また、体
液性免疫応答に極めて抵抗力があり、このような生物学的侵入者を破壊するためには、細
胞障害性Ｔ細胞の刺激が必要である。

合成ペプチドは、しばしば抗原性エピトープとして使用され、標準的なペプチド合成技
術を使用して、最小限の副作用しか誘導しないように、個別につくることができる。しか
し、このようなペプチドは、一般に、比較的弱い免疫原性応答を生じさせる。

しかし、免疫原性は、この合成ペプチドに脂質を付着させることによって増強すること
ができる。たとえば、合成ペプチド抗原に脂質を加えることにより、免疫化したマウス、
チンパンジー、又はヒトで、強力なＴ細胞増殖、ＣＴＬ、及び抗体応答が誘導されること
が明らかにされている（ＢｅｎＭｏｈａｍｅｄら、Ｖａｃｃｉｎ，１８，２８４３−２８
５５（２０００年）；Ｇａｈｅｒｙ−Ｓｅｇａｒｄら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．，７４，
１６９４−１７０３（２０００年）；Ｓｅｔｈら、ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒ
ｏｖｉｒｕｓｅｓ，１６，３３７−３４３（２０００年）；Ｔｓｕｎｏｄａら、Ｖａｃｃ
ｉｎｅ，１７，６７５−６８５（１９９９年）；ＢｅｎＭｏｈａｍｅｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，１２４２−１２５３（１９９７年）；Ｖｉｔｉｅｌｌｏら、Ｊ
．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９５，３４１−３４９（１９９５年））。

このような抗原の調製品は、ワクチン「担体」を使用してｉｎ ｖｉｖｏ送達すること
が可能であるが、この担体自体が宿主の体液性免疫応答の標的になる可能性がある。従っ
て、宿主の抗体がワクチン担体に対して作用し、抗原性エピトープに作用せず、この結果
、抗担体抗体によるワクチンの急速なクリアランスを招き、実際のワクチンの有用性を打
ち消す。

一方、リポペプチドの脂質部分をリポソームに組み入れることは、担体に対する免疫応
答を引き起こさずに、ｉｎ ｖｉｖｏで抗原を送達する極めて有用な方法である。しかし
、こうした改善はどれも、一方の、他方に対する免疫応答の調節の役に立たない。すなわ
ち、ペプチド１個に付着させる脂質の数を変えることによって、リポペプチドが、細胞性
免疫応答及び体液性免疫応答を生じさせることは、これまで、明らかにされていない。

しかし、本発明は、一つの抗原性ペプチド、及び担体それ自体に対する体液性応答を刺
激しない担体を使用することによって、細胞性免疫応答及び体液性免疫応答を生じさせ、
両者の間で調節する、新規な方法を提供する。

［発明の概要］
本発明は、免疫原性リポペプチドを含有するリポソームの製剤に関する。本発明はさら
に、個体において免疫応答を引き起こしかつ調節することができる製剤の形態での、この
ようなリポソームの投与に関する。

一実施形態において、本発明は、免疫原性ペプチドの脂質誘導体を包含する、自己組織
化脂質を含む免疫原性リポソームを製造する方法を提供する。本発明のリポソーム製剤は
、モノリポペプチド類、ジリポペプチド類又は各々の混合物のいずれかを含み、かつこれ
（ら）送達して、細胞性、体液性、又は細胞性及び体液性の免疫応答を惹起し、さらに、
それによって、それらの免疫応答をそれぞれ、調節することができる。このペプチドは、
エピトープ、又は本質的に抗原性である類似した特長を呈する免疫原性のアミノ酸配列で
ある。

本発明の別の実施形態は、免疫応答を刺激し、かつ調節することができる組成物を提供
する。このような組成物は、リポソーム小胞の脂質二重層が少なくとも１種の免疫原性モ
ノリポペプチド及び少なくとも１種のジリポペプチドを含み、モノリポペプチドの比率は
、約０％以上から約１００％未満まで変化し、ジリポペプチドの比率は、約０％以上であ
って約１００％未満まで変化する、リポソーム小胞を含む。

本発明のまた別の実施形態は、モノリポペプチドとジリポペプチドとが同じリポソーム
小胞又は異なるリポソーム小胞と関連している、少なくとも１種のモノリポペプチドと少
なくとも１種のジリポペプチドとの有効量を患者に投与するステップを含む、細胞性免疫
応答を刺激する方法を提供する。一実施形態では、投与されるモノリポペプチドの比率は
約５０％以上であって、モノリポペプチドの比率は、約７０％以上であって又は約９０％
以上であってもよい。

本発明のまた別の態様は、モノリポペプチドとジリポペプチドとが同じリポソーム小胞
又は異なるリポソーム小胞と関連している、少なくとも１種のモノリポペプチドと少なく
とも１種のジリポペプチドとの有効量を患者に投与するステップを含む、体液性免疫応答
を刺激する方法を提供する。一実施形態では、投与されるモノリポペプチドの比率は約５
０％より多く、モノリポペプチドの比率は、約７０％以上又は約９０％以上であってもよ
い。

本発明は、モノリポペプチド又はジリポペプチドのペプチド部分が、結核、Ｂ型肝炎、
マラリア、及び癌からなる群より選択される疾患関連のタンパク質に由来する組成物も含
む。好ましい実施形態において、このペプチドは、タンパク質の免疫原性領域の少なくと
も５個の連続したアミノ酸を含む。より好ましい実施形態では、モノリポペプチド又はジ
リポペプチドは、ＭＵＣ Ｉタンパク質配列からデザインされる。さらに好ましい実施形
態では、ＭＵＣ Ｉリポペプチドは、配列ＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡを含む。別
の好ましい実施形態では、モノリポペプチド又はジリポペプチドは、配列ＤＱＶＨＦＱＰ
ＬＰＰＡＶＶＫＬＳＤＡＬＩＫを含む、結核リポペプチドからデザインされる。別の好ま
しい実施形態では、本発明の抗原性ＭＵＣ Ｉペプチドは、配列ＳＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰ
ＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧＶＳＳＬ（配列番号
１）の任意の部分から選択することができる。

別の実施形態では、モノリポペプチド又はジリポペプチドは、結核ペプチドからデザイ
ンされる。より好ましい実施形態では、この結核ペプチドは、配列、ＤＱＶＨＦＱＰＬＰ
ＰＡＶＶＫＬＳＤＡＬＩＫ（配列番号２）を有する。

また別の実施形態では、本発明は、脂質付加された抗原性Ｂ型肝炎ペプチドを使用する
。好ましい実施形態では、このＢ型肝炎ペプチドは、配列、ＩＲＴＰＰＡＹＲＰＰＮＡＰ
ＩＬＫ（配列番号３）を有する。別の好ましい実施形態では、マラリアペプチドは、脂質
を含むように修飾されていてもよい。好ましい一実施形態では、このマラリアペプチドは
、配列、ＶＴＨＥＳＹＱＥＬＶＫＫＬＥＡＬＥＤＡＶＫ（配列番号４）を有する。

従って、本発明の一態様は、少なくとも１種のモノリポペプチドと少なくとも１種のジ
リポペプチドとを含む少なくとも１種のリポソームを含むリポソーム組成物を提供する。

好ましい実施形態では、モノリポペプチドとジリポペプチドとは、ＭＵＣ Ｉペプチド
、結核ペプチド、マラリアペプチド、及びＢ型肝炎ペプチドからなる群より選択される。
より好ましい実施形態では、モノリポペプチドとジリポペプチドペプチドとは、配列番号
１〜４より選択される任意の配列の全部又は一部であってもよい。別の好ましい実施形態
では、モノリポペプチドとジリポペプチドとは、異なるアミノ酸配列を有する。

また別の好ましい実施形態では、リポソーム中のモノリポペプチドの比率は、リポソー
ムに組み入れられているリポペプチドの総量を基準にして、０％以上から約１００％未満
まで変化し、ジリポペプチドの比率は、０％以上から約１００％未満まで変化する。

一実施形態では、リポソームに組み入れられているモノリポペプチドの比率とジリポペ
プチドの比率とは、それぞれ約５０％である。

別の実施形態では、モノリポペプチドの比率は、約５０〜約９９％である。

もう一つの実施形態では、リポソームに組み入れられているジリポペプチドの比率は、
約５０〜約９９％である。

別の好ましい実施形態では、モノリポペプチドとジリポペプチドとは、異なる抗原性エ
ピトープである。

本発明は、第１のリポソーム組成物と第２のリポソーム組成物とを含み、第１のリポソ
ーム組成物がモノリポペプチドを含み、かつ第２のリポソーム組成物がジリポペプチドを
含むリポソーム製剤も提供する。

一実施形態では、本発明のリポソーム製剤は、ＭＵＣ Ｉペプチド、結核ペプチド、マ
ラリアペプチド、及びＢ型肝炎ペプチドからなる群より選択される少なくとも１種のモノ
リポペプチドと少なくとも１種のジリポペプチドとを含む。より好ましい実施形態では、
モノリポペプチドとジリポペプチドペプチドとは、配列番号１〜４のいずれか一つより選
択される任意の配列の全部又は一部である。別の実施形態では、リポソーム製剤中のモノ
リポペプチドとジリポペプチドとは、異なるアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、
モノリポペプチドとジリポペプチドとは、同一のアミノ酸配列を有する。

本発明は、少なくとも１種のモノリポペプチドと少なくとも１種のジリポペプチドとの
有効量を患者に投与するステップを含む、免疫応答を調節する方法も提供する。また別の
態様では、前述の個体に少なくとも１種のモノリポペプチドと少なくとも１種のジリポペ
プチドとの有効量を投与するステップを含む、免疫原性ペプチに対する個体の免疫応答を
調節するために個体を治療する方法も提供する。モノリポペプチドとジリポペプチドとは
、ＭＵＣ Ｉペプチド、結核ペプチド、マラリアペプチド、及びＢ型肝炎ペプチドからな
る群より選択される。より好ましい実施形態では、モノリポペプチドとジリポペプチドペ
プチドとは、配列番号１〜４より選択される、任意の配列の全部又は一部である。

好ましい実施形態では、モノリポペプチドとジリポペプチドとがリポソームに組み入れ
られており、リポソームに組み入れられているリポペプチドの総量を基準にして、モノリ
ポペプチドの比率は０％以上から約１００％未満まで変化し、ジリポペプチドの比率は０
％以上から約１００％未満まで変化する。別の実施形態では、リポソームに組み入れられ
ているモノリポペプチドの比率とジリポペプチドの比率とは、それぞれ約５０％である。
また別の実施形態では、モノリポペプチドの比率は、約５０〜約９９％である。さらにも
う一つの実施形態では、ジリポペプチドの比率は、約５０〜約９９％である。

好ましい実施形態では、免疫応答を調節する方法は、結果として体液性応答を刺激する
。別の実施形態では、調節は、結果として細胞性応答を刺激する。また別の好ましい実施
形態では、調節の結果として、体液性応答又は細胞性応答の少なくとも一方の強度が増す
。

免疫応答を調節する方法は、モノリポペプチドとジリポペプチドとともにアジュバント
を同時投与するステップをさらに含んでもよい。好ましい実施形態では、このアジュバン
トはリピドＡである。

本発明は、リポソーム的に結合したモノリポペプチドを含む製剤を先ず投与するステッ
プと、その後、リポソーム的に結合したジリポペプチドを含む製剤を次に投与するステッ
プとを含む、細胞性免疫応答と体液性免疫応答との間で調節する方法も提供する。あるい
は、別の実施形態は、リポソーム的に結合したジリポペプチドを含む製剤を先ず投与する
ステップと、その後、リポソーム的に結合したモノリポペプチドを含む製剤を次に投与す
るステップとを含む。

一実施形態では、モノリポペプチドとジリポペプチドとは、ＭＵＣ Ｉペプチド、結核
ペプチド、マラリアペプチド、及びＢ型肝炎ペプチドからなる群より選択される。別の実
施形態では、このモノリポペプチドとジリポペプチドペプチドとは、配列番号１〜４より
選択される、任意の配列の全部又は一部である。

本発明の別の態様は、実質的にジリポペプチドからなる少なくとも一つのリポソームを
個体に投与するステップを含む、免疫応答を調節する方法を含む。本発明のまた別の態様
は、ジリポペプチドからなる少なくとも一つのリポソームを個体に投与するステップを含
む、免疫応答を調節する方法を含む。本発明のさらに他の一態様は、ジリポペプチドを含
む少なくとも一つのリポソームを個体に投与するステップを含む、免疫応答を調節する方
法を含む。好ましい実施形態では、この免疫応答を調節する方法は、アジュバントを同時
投与するステップをさらに含む。より好ましい実施形態では、このアジュバントはリピド
Ａである。

好ましい実施形態では、ジリポペプチドは、ＭＵＣ Ｉペプチド、結核ペプチド、マラ
リアペプチド、及びＢ型肝炎ペプチドからなる群より選択される。別の実施形態では、ジ
リポペプチドペプチドは、配列番号１〜４より選択される任意の配列の全部又は一部であ
る。

本発明は、脂質付加された（lipidated）抗原性ペプチドも提供する。一実施形態にお
いて、本発明は、ＭＵＣ Ｉペプチドのアミノ酸に付着した一つの脂質を含む、ＭＵＣ
Ｉペプチド組成物を提供する。好ましい実施形態では、このＭＵＣ Ｉペプチドは、配列
番号１の配列の全部又は一部を含む。また別の好ましい実施形態では、このＭＵＣ Ｉペ
プチドは、配列ＳＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡ又はＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤ
ＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰを含む。

別の実施形態では、本ＭＵＣ Ｉペプチド組成物は、やはりＭＵＣ Ｉペプチドのアミ
ノ酸に付着した第２の脂質をさらに含む。一実施形態では、各脂質は、異なるアミノ酸に
付着している。別の実施形態では、脂質は、ＭＵＣ ＩペプチドのＮ末端又はＣ末端のい
ずれかに配置されている。

本発明は、結核ペプチドのアミノ酸に付着した一つの脂質を含む結核ペプチド組成物も
提供する。好ましい実施形態では、この結核ペプチドは、配列ＤＱＶＨＦＱＰＬＰＰＡＶ
ＶＫＬＳＤＡＬＩＫを含む。別の実施形態では、この結核ペプチド組成物は、結核ペプチ
ドの少なくとも一つのアミノ酸に付着した脂質二つを含む。別の実施形態では、各脂質は
、異なるアミノ酸に付着している。別の実施形態では、この脂質は、結核ペプチドのＮ末
端又はＣ末端のいずれかに配置されている。

本発明は、Ｂ型肝炎ペプチドのアミノ酸に付着した一つの脂質を含むＢ型肝炎ペプチド
組成物も提供する。好ましい実施形態では、このＢ型肝炎ペプチドは、配列ＩＲＴＰＰＡ
ＹＲＰＰＮＡＰＩＬＫを含む。別の実施形態では、このＢ型肝炎ペプチド組成物は、Ｂ型
肝炎ペプチドの少なくとも一つのアミノ酸に付着した脂質二つを含む。別の実施形態では
、各脂質は、異なるアミノ酸に付着している。別の実施形態では、この脂質は、Ｂ型肝炎
ペプチドのＮ末端又はＣ末端のいずれかに配置されている。

本発明は、マラリアペプチドのアミノ酸に付着した一つの脂質を含むマラリアペプチド
組成物も提供する。好ましい実施形態では、このマラリアペプチドは、配列ＶＴＨＥＳＹ
ＱＥＬＶＫＫＬＥＡＬＥＤＡＶＫを含む。別の実施形態では、このマラリアペプチド組成
物は、マラリアペプチドの少なくとも一つのアミノ酸に付着した脂質二つを含む。別の実
施形態では、各脂質は、異なるアミノ酸に付着している。別の実施形態では、この脂質は
、マラリアペプチドのＮ末端又はＣ末端のいずれかに配置されている。

本発明は、二以上の脂質を含む、配列番号１〜４からなる群から選択されるペプチドも
提供する。

好ましい実施形態では、脂質は、ミリスチル、パルミトイル及びラウリルからなる群よ
り選択される。

本発明の別の態様は、抗原性ペプチドのモノリポペプチド又はジリポペプチドの一方又
はそれらの両方が中に組み入れられている少なくとも一つのリポソームを含む組成物の、
前述のペプチドに対する免疫応答を調節するためのワクチンとしての使用であって、モノ
リポペプチドとジリポペプチドの相対的な量が、Ｔ細胞増殖及び抗体産生の相対的強度を
調節することを特徴とする。

前述の概説及び以下の図面の簡単な説明は、代表的かつ例示的なものであり、また請求
の範囲のとおりに、本発明のさらなる説明を提供する。他の目的、利点及び新規な特徴は
、以下の本発明の詳細な説明から、当業者に容易に明白になるであろう。

リポソーム中のＭＵＣ１ジリポペプチド又はモノリポペプチドで２回免疫化したＣ５７Ｂ１/６マウスにおけるＴ細胞増殖及びＩＦＮ−γのレベルを示す図である。

［好ましい実施形態の詳細な説明］
本発明の予期せぬ驚くべき発見は、一つの脂質鎖を含むリポソーム的に結合したペプチ
ドと少なくとも二つの脂質鎖を含むリポソーム的に結合したペプチドとを、連続的に、又
は組合せて、投与することにより、ｉｎ ｖｉｖｏ免疫応答の誘導を調節できることであ
る。

用語「調節する（modulate）」は、ある正しい均衡への多少の変化、調整、又は適応を
意味する。従って、免疫応答は、免疫学的活性の変化を起こす因子を刺激することによっ
て調節することが可能である。免疫応答の強度も、調節することが可能である。たとえば
、調節を遂行する因子の投与後、Ｔ細胞増殖の強度又はレベルを高く又は低くすることが
できる。本発明では、それらの因子はリポソーム的に結合したリポペプチドであってもよ
い。

意外なことに、一つの脂質鎖を有するペプチドは、リポソーム製剤に組み入れられたと
き、大きい細胞性免疫応答（すなわち、「Ｔ１」免疫応答）を生じさせることができるが
、体液性応答は最小限にすぎないか又は全く生じさせないことが発見された。しかし、二
つの脂質がその表面に付着しており、同一のペプチドがリポソームに組み入れられたとき
、大きい体液性応答（すなわち、「Ｔ２」応答）を誘導し、最小限の細胞性応答又は甚大
な細胞性応答のいずれかを伴うように作ることができる。リポペプチドで認められる細胞
性応答の範囲は、そのリポペプチドの個性によって異なる。Ｔ１、２、又は２より多い脂
質が抗原性ペプチド上に存在することも、免疫応答が活性化される強度を上昇又は低減す
る。刺激される免疫応答の強度及び免疫応答のタイプも、抗原性ペプチド上の、二つの脂
質間のアミノ酸残基の数を変えることによって調節することができる。

本発明は、リポソーム二重層に結合したペプチドに、一以上の脂質鎖を付着させること
により、最小限から甚大までの範囲の可変細胞活性とともに、主として体液性免疫応答が
、刺激されることを示す。本発明は、第２の脂質を抗原性ペプチドに付着させることによ
り、モノ脂質誘導体と比して、Ｔ細胞増殖ならびに抗体産生誘導のレベルが上昇すること
も示す。用語「誘導体」は、親物質の必須要素を含む別のものから誘導される又は得られ
る化合物を意味する。従って、抗原の脂質誘導体は、少なくとも一つの脂質が付着してい
るペプチドを指す。従って、ジリポペプチドのみを含むリポソーム製剤の有効量を投与し
て、抗体産生及び細胞性活性を生じさせることが可能である。リポソーム的に結合したリ
ポペプチド製剤の「有効量」は、免疫応答を調節するそのリポペプチドの、実験的に導き
出された量を指す。

一部の抗原では、ジリポペプチドリポソーム製剤が、大きな体液性応答に加えて、大き
な細胞性応答を誘発することも発見された。

具体的には、ＭＵＣ−１ペプチド、結核ペプチド、及びＢ型肝炎ペプチドでは、モノリ
ポペプチドを有するリポソーム製剤は、主として細胞性応答及び最小限の体液性応答を誘
導し、ジリポペプチドを有するリポソーム製剤は、主として体液性応答及び最小限の細胞
性応答を誘導したことを、実施例が示している。ジリポペプチド及びモノリポペプチドの
組合せを投与することにより、結果として優れた細胞性応答及び体液性応答を生じた。

本発明の別の利点は、異なるリポペプチドをリポソームに組み入れることができ、それ
によって、同時にかつ同一条件で、免疫系に輸送し、提供できることである。従って、個
体をＴ１誘導性モノリポペプチド及びＴ２誘導性ジリポペプチドを含むリポソームで治療
することにより、その個体で、多数の免疫応答を誘導することが可能である。あるいは、
多数の免疫応答を同時に誘導するために、リポソーム的に結合したモノリポペプチド及び
リポソーム的に結合したジリポペプチドの混合物を使用することもできる。

従って、本発明は、抗原性ペプチドに付着している脂質の数を変えることによって新規
な組成物及び免疫応答を調節する方法を提供する。免疫応答は、免疫応答の強度と同様に
、二つ以上の脂質を抗原性ペプチドに加えることにより調節することができる。さらに、
免疫応答の強度は、脂質間のアミノ酸の間隔を変えることにより、調節することができる
。

予備刺激した抗原提示細胞又はＴ細胞を患者に注射することにより、免疫応答を生じさ
せることもできる。「養子免疫療法」として知られるこの技法は、いったん体内に再導入
されると、原因物質と戦うために準備刺激される抗原特異的細胞の拡大した個体群をｉｎ
ｖｉｔｒｏで作る。本質的に、細胞を患者から除去し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激し、及び
再感染させて患者の血流に戻す。具体的には、抗原提示細胞等の末梢血液リンパ球を単離
し、次いで、ｉｎ ｖｉｔｒｏでこの細胞を抗原に暴露することによって、「負荷される
（charged）」。この抗原は抗原提示細胞によりエンドサイトーシスを受け、その結果、
主要組織適合複合体と結合し、次に細胞の外面に提示される。次いで、この予備刺激され
た細胞個体群を、患者に再感染させることができる。負荷前に、末梢血リンパ球を、樹状
細胞及び／又はマクロファージに分けることもできる。

従って、膜結合した、抗原性リポペプチドを含む本発明のリポソーム製剤を、単離され
た抗原提示細胞にｎ ｖｉｔｒｏで加えて、それらを「負荷」する。たとえば、モノリポ
−ＭＵＣ Ｉペプチド、ジリポ−ＭＵＣ Ｉペプチド、又は両ペプチドの組合せを含むリ
ポソーム製剤を使用して、末梢血液リンパ球を負荷し、次いでこれを細胞ワクチンとして
患者に再感染させることができる。

あるいは、「養子Ｔ細胞輸送療法」を実施してもよい。これは、患者のＴ細胞を、予備
的に負荷した抗原提示細胞とともに、ｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートすることを伴う
。このＴ細胞は活性化され、たとえば、腺癌に罹患している患者に再投与される。当該技
術分野で広く認められた、養子Ｔ細胞輸送療法のための技法の説明に関しては、Ｂａｒｔ
ｅｌｓら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，３（１）：６７
（１９９６）（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照されたい。
このように、本発明に従って、脂質付加された抗原性ペプチドは、選択され、リポソーム
に組み入れられており、末梢血リンパ球を刺激するために使用され、この末梢血リンパ球
は患者に注射で戻してもよく、又はそれ自体を使用して、単離Ｔ細胞を活性化することも
できる。Ｔ細胞活性化方法も、癌、腫瘍、ウイルス感染症、及び細菌感染症等の、様々な
病状に関与する抗原に対する細胞障害性及びヘルパーＴ細胞応答を生じさせるのに有用で
ある。

［リポソーム］
リポソームは、水性コンパートメントを取り囲む一つ以上の脂質二重層からなる微小な
小胞である。たとえば、Ｂａｋｋｅｒ−Ｗｏｕｄｅｎｂｅｒｇら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ
．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２（補遺１）：Ｓ６１（１９９３年）
及びＫｉｍ，Ｄｒｕｇｓ，４６：６１８（１９９３年）を参照されたい。リポソームは、
天然の細胞膜にも存在する嵩高い脂質分子を用いて製剤化ができるため、一般に、安全に
投与することができ、また生分解性である。

調製方法によって、リポソームはユニラメラであってもマルチラメラであってもよく、
また様々のサイズであってもよく、その直径は約０．０２μｍ〜約１０μｍの範囲である
。様々な薬剤をリポソームに封入することができる。疎水性薬剤は二重層中に分配され、
親水性薬剤は内部の水性空間に分配される。たとえば、Ｍａｃｈｙら、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ
ｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒａｍａｃｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ
Ｌｉｂｂｅｙ，１９８７年）、及びＯｓｔｒｏら、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊ．Ｈｏｓｐ．
Ｐｈａｒｍ．４６：１５７６（１９８９年）を参照されたい。

リポソームは、実質的にあらゆるタイプの細胞に吸着し、次いで組み入れられた薬剤を
放出することができる。あるいは、リポソームは標的細胞と融合し、それによってリポソ
ームの内容物が標的細胞に流れ込むことができる。あるいは、リポソームは、食作用を有
する細胞によりエンドサイトーシスを受けることができる。エンドサイトーシスに続いて
リポソーム脂質のリソソーム内分解及び封入された薬剤の放出が起こる。Ｓｃｈｅｒｐｈ
ｏｆら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，４４６：３６８（１９８５年）。

本発明の方法で使用される他の適当なリポソームとしては、マルチラメラ小胞（ＭＬＶ
）、オリゴラメラ（ｏｌｉｇｏｌａｍｅｌｌａｒ）小胞（ＯＬＶ）、ユニラメラ小胞（Ｕ
Ｖ）、小型ユニラメラ小胞（ＳＵＶ）、中型ユニラメラ小胞（ＭＵＶ）、大型ユニラメラ
小胞（ＬＵＶ）、巨大ユニラメラ小胞（ＧＵＶ）、多小胞（ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａ
ｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）（ＭＶＶ）、逆相蒸発法（ＲＥＶ）で作られたユニラメラ又はオリ
ゴラメラ（ｏｌｉｇｏｌａｍｅｌｌａｒ）小胞、逆相蒸発法（ＲＥＶ）で作られたマルチ
ラメラ小胞（ＭＬＶ−ＲＥＶ）、安定なプルリラメラ小胞（ｐｌｕｒｉｌａｍｅｌｌａｒ
ｖｅｓｉｃｌｅ）（ＳＰＬＶ）、凍結乾燥及び解凍したＭＬＶ（ＦＡＴＭＬＶ）、押出
成形法で作製された小胞（ＶＥＴ）、フレンチプレスにより作製された小胞（ＦＰＶ）、
融合により作製された小胞（ＦＵＶ）、脱水−再水和小胞（ＤＲＶ）、及びバブルソーム
（ｂｕｂｂｌｅ ｓｏｍｅ）（ＢＳＶ）などがある。当業者は、これらのリポソームを作
製する技法は当該技術分野で周知であることを理解するであろう。Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ
Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，６６巻（Ｊ．Ｋｒｅｕｔｅｒ編、Ｍａｒ
ｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９９４年）

［脂質］
「脂質」は、酸素基、窒素基、又はイオウ基を有するアミノ酸に付着することができる
ミリスチル分子、パルミトイル分子、又はラウリル分子であってもよい。このようなアミ
ノ酸としては、スレオニン、セリン、リジン、アルギニン、及びシステインアミノ酸等が
あるが、この限りではない。「モノリポペプチド」は、脂質鎖が１個だけ付着しているペ
プチドである。同様に、「ジリポペプチド」は、１個又は２個のアミノ酸に２個の脂質鎖
が付着したペプチドである。２個の脂質鎖が２個のアミノ酸残基に付着している場合、こ
れらの残基は、任意のアミノ酸数だけ間隔をあけて配置されていてもよい。

「リポソームの製剤」は、モノリポペプチド及び／又はジリポペプチドを組み入れるこ
とができるｉｎ ｖｉｔｒｏで作られる脂質小胞を示す。従って、「リポソーム的に結合
した」は、部分的にリポソームに組み入れられた、またはリポソームに付着しているペプ
チドを指す。リポソーム製剤は、「リポソームワクチン」を指すこともある。リポソーム
製剤は、二つのタイプのリポソームを含んでもよく、第１のものは、全部ではないが主と
して、その構造に組み入れられたモノリポペプチドを含み、第２のものは、全部ではない
が主として、その構造の中にジリポペプチドを含む。モノリポペプチドとジリポペプチド
が同一リポソーム上に存在しなくても、「モノリポソーム」及び「ジリポソーム」の個別
の調製物を一緒に投与して、免疫応答調節することができる。

リポソームに組み入れる場合、モノリポペプチドとジリポペプチドとは、同一の抗原性
エピトープであるペプチドであってもよい。あるいは、各リポペプチドに関するペプチド
配列は、異なるエピトープを含んでもよい。このリポペプチドは、同一のタンパク質又は
異なるタンパク質と関連した抗原であってもよい。

ペプチド分子の脂質が脂質二重層に自然に組み込まれるため、リポペプチドをリポソー
ムに組み入れることができる。従って、リポペプチドを、リポソームの「表面」に提示す
ることが可能である。あるいは、ペプチドをリポソーム内に封入してもよい。リポソーム
を作製し、ペプチド等の分子とともにそれらを製剤化する技法は、当業者に周知である。

［代表的なアジュバント］
本発明のリポソームワクチンは、アジュバントを用いて有利に製剤化することも可能で
ある。当該技術分野で従来知られている通り、アジュバントは、抗原に対する特異的応答
を増強するための、特異的抗原刺激と関連して作用する物質である。モノホスホリルリピ
ドＡ（ＭＰＬＡ）は、たとえば、特異的Ｔリンパ球へのリポソーム抗原の提示増強を引き
起こす有効なアジュバントである。Ａｌｖｉｎｇ，Ｃ．Ｒ．，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ．，
１８７：４３０−４４６（１９９３年）。当業者は、リピドＡ及びその誘導体等の脂質を
主成分とするアジュバントも適することを理解するであろう。ムラミールジペプチド（Ｍ
ＤＰ）は、リポソームに組み込まれたとき、アジュバント性を増強することも明らかにさ
れている（Ｇｕｐｔａ ＲＫら、「毒性及びアジュバント性との間のＡｄｊｕｖａｎｔｓ
−Ａバランス」、Ｖａｃｃｉｎｅ，１１，２９３−３０６（１９９３年））。

別のクラスのアジュバントは、ＩＬ−２等の刺激性サイトカイン類を含む。従って、本
発明のリポソームワクチンは、ＩＬ−２とともに製剤化してもよく、又は、最適な抗原性
応答を得るために、ＩＬ−２を別々に投与してもよい。ＩＬ−２は、リポソームを使用し
て、製剤化することが可能である。

［代表的なワクチン製剤］
ワクチンは、薬学的に許容し得る賦形剤とともに製剤化することが可能である。このよ
うな賦形剤は、当該技術分野で周知であるが、一般的に生理学的に耐容でき、かつ本発明
の組成物のワクチン特性に関して不活性であるか又は増強性でなければならない。例とし
ては、滅菌水、生理学食塩水等の液体媒体等が挙げられる。賦形剤は、リポソームワクチ
ンを製剤化する任意の段階で加えてもよく、また完成したワクチン組成物と混合してもよ
い。

ワクチンは、複数の投与経路に合わせて製剤化することが可能である。特に好ましい経
路としては、一度に又は複数の単位投薬量で投与される、筋内注射、皮下注射、皮内注射
、エアロゾル、又は経口投与、又はこれらの経路の組合せによる等がある。ワクチンの投
与は周知であり、最終的には個々の製剤及び担当医の判断に左右される。ワクチン製剤は
、懸濁液として維持してもよく、凍結乾燥し、後で水和して使用可能なワクチンを作って
もよい。

より大きい特異性を提供するためには、従ってｉｎ ｖｉｖｏ投与中の毒性又は他の好
ましくない作用のリスクを低減するためには、本発明の組成物がそれを介して作用するよ
うにデザインされる細胞、すなわち、抗原提示細胞を、本発明の組成物の標的にすること
が有利である。これは、免疫原性ペプチドを含有するリポソームを、体内のある特定の位
置に誘導する、従来のターゲティング技術を使用して、便利に達成することが可能である
。抗原提示細胞をターゲットするためには、例えば、マンノース及び抗体のＦｃ部分を、
抗原性ペプチドに化学的に結合させるか、又はターゲティングペプチドを、免疫原性リポ
ペプチドに組み換え的に融合させる。他の、類似した戦術は、専門家によく知られている
。

［リポペプチド及びリポソーム製剤の代表的な量］
免疫応答を異なる強度に調節するように、リポソーム内の抗原性モノリポペプチドとジ
リポペプチドの比率を変えることができる。たとえば、リポソーム内に組み入れられてい
るジリポペプチドの量を、モノリポペプチドの量に比して増加させることにより、結果と
して得られる製剤を、より体液誘導性にすることができる。もちろん、異なる抗原に対す
る応答の大きさが異なるため、体液性応答と細胞性応答との所望のバランスを達成するた
めには、異なる比率を必要とする可能性がある。

たとえば、当業者は、モノリポペプチドの比率がリポソームの約０％以上から約１００
％未満まで変化する、共有結合した免疫原性モノリポペプチドとジリポペプチドの比で構
成されているリポソームを作ることができる。同様に、ジリポペプチドは、０以上から約
１００％未満までの比率で、リポソーム膜中に存在してもよい。たとえば、モノリポペプ
チド７５％とジリポペプチド２５％とを含むリポソームは、主としてＴ１免疫応答と多少
のＴ２活性をもたらす。本発明は、モノリポペプチド約１〜約３０％、モノリポペプチド
約３０〜約５０％、又はモノリポペプチド約５０〜約９９％を含むリポソームを作る方法
を提供する。同様に、ジリポペプチド約１〜約３０％、ジリポペプチド約３０〜約５０％
、又はジリポペプチド約５０〜約９９％を含むリポソームを作ることもできる。従って、
本発明は、たとえば、約１０％：約９０％、約３０％：約７０％、約５０％：約５０％、
約７０％：約３０％、約９０％：約１０％及び約９９％：約１％等の比率でモノリポペプ
チド：ジリポペプチドを含有するリポソームの作製を可能にする。相対的な免疫原性の決
定は、免疫学において普通の技術を有する者の範囲内である。

モノリポペプチドとジリポペプチドとは、同一リポソーム小胞又は異なるリポソーム小
胞のいずれかと関連している。少なくとも１種のモノリポペプチドと少なくとも１種のジ
リポペプチドとを含有するリポソーム製剤の有効量を、患者に投与することができる。従
って、ある比率のモノリポペプチドとジリポペプチドとを含む単一のリポソーム製剤を患
者に投与して、所望の免疫応答を生じさせることができる。又は代わりに、異なる比率の
モノリポペプチドとジリポペプチドとを含む、少なくとも二つのリポソーム製剤の組合せ
を患者に投与して、類似の又は異なる免疫応答を生じさせることができる。

本発明との関係で、その様々な文法的な形で「治療する」は、疾患状態、疾患進行、疾
患原因物質、又は他の異常な状態の悪影響を予防すること、治癒すること、無効にするこ
と、軽減すること、緩和すること、最小限にすること、抑制すること、又は停止させるこ
とを指す。

［本発明で有用な代表的な免疫原性ペプチド］
ｉｎ ｖｉｖｏで免疫応答を誘導又は調節する目的で、任意のペプチド抗原又はエピト
ープに脂質付加して、リポソーム内に組み入れることが可能である。１、２、又は２より
多い脂質を、ペプチドの任意の部分に加えることができる。当業者は、抗原性ペプチドが
、個体を冒している疾患のタイプに基づいて選択されることを理解するであろう。たとえ
ば、「ＭＵＣ−１」抗原は、腺癌の処置に使用することができる抗原特異的Ｔ細胞を作る
の有用である。同様に、結核ペプチド、Ｂ型肝炎ペプチド、又はマラリアペプチドは全て
、本発明に従って脂質付加することができ、またそのペプチド類が関連した特異的疾患を
治療するために、必要に応じて、細胞性免疫及び体液性免疫を生じさせるのに使用するこ
とができる。本発明は、ＭＵＣ−１、結核ペプチド、Ｂ型肝炎ペプチド、又はマラリアペ
プチドのリポソーム的に結合したリポペプチドワクチンとしての使用に限定されない。

様々な免疫原性ペプチドに脂質付加して、リポソーム膜内に組み入れ、多数の異なる免
疫原性特異的ワクチンを作成することができる。たとえば、ムチン由来ペプチドに脂質付
加したときの免疫原性効果を、本明細書に記載する。ＭＵＣ Ｉムチンは、健常者の全て
の上皮細胞で発現される高分子糖タンパク質である。ＭＵＣ Ｉのコアペプチド配列は、
タンパク質の全体にわたってどこかで６０〜１２０回反復される２０アミノ酸残基を含む
。反復される配列、ＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨは、グリコシル化が可能
な５部位（ボールド体で表すＳ（セリン）及びボールド体で表すＴ（スレオニン））及び
免疫原性「ＤＴＲ」エピトープ（下線部）を有する。

一般に、炭水化物は、セリン残基又はスレオニン残基の一つ以上にＯで結合された構造
として連結され、５部位全てがグリコシル化されるとき、エピトープは隠蔽される。しか
し、癌細胞では、結果として生じる炭水化物が切断型であるように、このグリコシル化工
程が早くに終結される。結果として、ＤＴＲエピトープが露出し、ペプチドのコア配列及
び炭水化物は免疫原性になる。従って、このペプチド配列は、免疫応答を誘導して調節す
るために、本発明と関連して使用することが可能なエピトープの一例である。たとえば、
本発明の抗原性ＭＵＣ Ｉペプチドは、配列ＳＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡ
ＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧＶＳＳＬ（配列番号１）の任意の部分か
ら選択することができ、また１、２、又は２以上の脂質を含むように、脂質付加すること
ができる。

免疫原性ペプチドのサイズも変化を受ける。サイズが１６（１８８２ダルトン）〜４０
（５０５０ダルトン）アミノ酸の範囲の脂質付加されたＭＵＣ−Ｉペプチド分子は、たと
えば、本発明に記載のような免疫応答を生じさせる。しかし、このような免疫原性ペプチ
ドは、サイズによって限定されず、所望の免疫原の一部であってもよく、全部であっても
よい。一般に、小さいペプチド抗原は、製造しやすくかつ特異性が高いため、好適である
。従って、ＳＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡ及びＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲ
ＰＡＰＧＳＴＡＰＰは、本発明に従って脂質付加することができる、より小さいＭＵＣ
Ｉペプチドである。従ってそれらがマルチマー（すなわち、同一エピトープの多数のコピ
ー）でない限り、ほとんどの抗原が、約９〜約１００アミノ酸を含む。より具体的には、
記載通りに、サイズが約９〜約２０、約２０〜約４０、約４０〜約６０、約６０〜約８０
、及び約８０〜約１００アミノ酸である抗原に脂質付加してリポソーム内に組み入れるこ
とができる。タンパク質抗原の断片を組換えＤＮＡ技法で製造してアッセイし、個々のエ
ピトープを同定することができる。小さいペプチドをｉｎ ｖｉｔｒｏ合成方法で製造し
てアッセイすることが好ましい。従って、本発明に従って、任意の抗原性配列の全部又は
一部を、脂質付加形で使用することが可能である。「全部、又は一部」は、抗原性ペプチ
ド全体又はより大きいペプチドから誘導される幾らか小さいペプチドのいずれも脂質付加
できることを意味する。「より小さいペプチド」は、より大きいペプチド抗原の断片であ
ってもよく、組み換えにより、又は化学的に合成してもよい。

合成し、脂質付加し、リポソーム的に調製されるワクチンで使用することができるペプ
チドの他の実例としては、結核、Ｂ型肝炎、マラリア、及び癌疾患に関与するペプチドな
どがあるが、この限りではない。

Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの３８ｋＤａの分泌タンパク
質が起源である結核ペプチドＤＱＶＨＦＱＰＬＰＰＡＶＶＫＬＳＤＡＬＩＫ（配列番号２
）は、一つ又は二つの脂質を使用して作り、上述のリポソーム製剤に製剤化することがで
きる。

同様に、Ｂ型肝炎抗原性ペプチドは、アミノ酸配列ＩＲＴＰＰＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬＫ
（配列番号３）で示される。同様に、マラリアペプチドＶＴＨＥＳＹＱＥＬＶＫＫＬＥＡ
ＬＥＤＡＶＫ（配列番号４）も、リポソームワクチンに製剤化することができる。

抗原性ペプチドの天然の配列内に存在する、スレオニン、セリン、リジン、アルギニン
、又はシステイン等のアミノ酸は、脂質を連結させることができる便利な部位である可能
性がある。あるいは、脂質部分の連結を促進するために、これらのアミノ酸のうちの任意
の一つを、末端又はペプチド配列内のいずれかに付加してもよい。このように、二つの脂
質の連結を容易にするために、２個のリジン残基をそのカルボキシル末端に持つ抗原性ペ
プチドを作ることができる。「作られる」によって、本発明は、一つ以上の付加的アミノ
酸をペプチド配列に導入するために、従来のペプチド合成方法を使用することを意味する
。しかし、所望のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドをデザインするために、組
換え方法も使用することができる。従って、本発明は、脂質付加を受けやすい抗原性ペプ
チドの化学的合成及び組換え合成を予見するものである。

本明細書を通して、米国特許公報を含む、公的に入手できる書類へのあらゆる及び全て
の言及は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。

以下の実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明を制限するためのもの
ではない。これらは、使用され得るものの代表であるが、当業者に周知の他の手順を使用
することもできる。

この実施例の目的は、ＭＵＣ−１抗原リポソームワクチンの投与に応答したＴ細胞増殖
応答及び抗ＭＵＣ−１抗体レベルを決定することである。

使用した手順の概要
（ｉ）免疫化
ＭＵＣ１に基づくリポソームワクチン（「ＢＬＰ２５リポソームワクチン」）を１００
μｇ（２５０μｌ）の用量で、２週間間隔で、２、３、又は４回、右鼠径部及び左鼠径部
に皮下注射した（各部位に１２５μｌ）。

（ｉｉ）Ｔ細胞増殖アッセイ
ＢＬＰ２５リポソームワクチンで最後に免疫化した９日後、全てのマウスを屠殺し、リ
ンパ節を外科的に切除した。次いで、ナイロンウール精製したリンパ節Ｔ細胞を、未実験
の同系マウスの脾臓から得て、マイトマイシンＣ処理した抗原提示細胞（ＡＰＣ）ととも
に培養した。これらの混合培養に、ＭＵＣ１由来の合成リポペプチド（ＢＰ１−１４８）
及び対照ペプチド（ＢＰ１−７２）を、４日間パルス投与した。第４日の後、ＩＦＮ−ｇ
アッセイ用に幾らかの上澄を回収し、次いでこの培養に、トリチウム標識チミジンを含有
する新鮮な培地をパルス投与した。さらに１８〜２０時間後、ＤＮＡに取り込まれたトリ
チウムの取り込みを、液体シンチレーションカウンターでカウントした。

（ｉｉｉ）ＩＦＮ−γアッセイ
回収した上澄中のＩＦＮ−γレベルを、サンドイッチ技法を使用した特異的ＥＬＩＳＡ
法で決定した。簡単に記載すると、９６ウェルマキシソープ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ）平底プ
レート（デンマークのＮｕｎｃ社製）を、５０μｌのキャッチャーモノクローナル抗体Ｒ
４．６Ａ２（バイオミラ（Ｂｉｏｍｉｒａ）社製、ロット番号ＩＭ９８Ａ２０Ａ）で、３
７℃、５％のＣＯ₂にて３５分間、被覆した。次いで、このプレートを洗浄し、被検サン
プル及び陽性標準サイトカインサンプル（ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）社製
、ロット番号Ｍ０３１５５４）とともに、４５分間インキュベートした。

２回洗浄した後、第２のビオチニル化抗体を加えた。ＸＭＧ１．２（バイオミラ（Ｂｉ
ｏｍｉｒａ）社製、ロット番号ＢＧ９８Ｇ０２Ｂ）。洗浄後、ペルオキシダーゼ複合スト
レプトアビジン（ジャクソン・イムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅ
ａｒｃｈ社製）、ロット番号４２３５０）を加え、再度３０分間インキュベートした。５
回洗浄した後、ＨＲＰＯ基質溶液１００μｌ：クエン酸及びＮａ₂ＨＰＯ₄・７Ｈ₂Ｏで緩
衝化した１ｍｇ/ｍｌのＡＢＴＳ（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）社製、ロット番号０
１３２８ＥＳ）１０ｍｌで希釈した３０％のＨ₂０₂ １μｌを使用直前に調製し、各ウェ
ルに加えた。サーモマックス（Ｔｈｅｒｍｏｍａｘ）ＥＬＩＳＡ読取装置を使用し、４０
５ｎｍの波長にて、カイネティック・モードで１０分間、最適密度を測定した。参照標準
と比較することにより、被検サンプルのサイトカインレベルを決定した。

（ｉｖ）抗ＭＵＣ１抗体レベル
マイクロタイター９６ウェルプレートを、ＢＰ１−１５１ＨＳＡ複合体（ＨＳＡに結合
させたＭＵＣ１ ２４アミノ酸ペプチド）、又はＢｌｅｎｄ Ｃ（Ｂｌｅｎｄ Ｃは、卵
巣癌腹水から精製された天然のヒトＭＵＣ１ムチンである）で被覆した。血清の段階希釈
を抗原被覆プレート上で、室温にて１時間、インキュベートし、その後、ウェルを完全に
洗浄した。ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ特異的抗体を加え、室温にて１時間
、インキュベートした。次いで各プレートを洗浄し、ＡＢＴＳ基質を加えた。１５分後、
ＥＬＩＳＡ読取装置を使用して、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。

［モノ及びジ脂質付加ＭＵＣ Ｉ抗原性ペプチド］
この実施例の目的は、リポソーム的に結合した、２個の脂質鎖を有するＭＵＣ Ｉペプ
チドは、１個の脂質を有するＭＵＣ Ｉペプチドと比較して、免疫化マウスにおける抗Ｍ
ＵＣ Ｉ抗体の産生を劇的に増加させることを示すことである。

ＭＵＣ Ｉペプチドは、脂質を１個又は２個含むように、化学的に合成された。「ＢＰ
１−２１７」は、コアペプチド配列のカルボキシ末端に付着した２個のリポセリン残基を
有し、「ＢＰ１−２２８」は、カルボキシ末端に着いたリポセリンを１個だけ有する。モ
ノリポペプチドとジリポペプチドとを、リポソームに別々に組み入れ、結果として得られ
たリポソーム製剤をワクチンとして評価した。
ＢＰ１−２１７：ＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＳ（ミリスチル）Ｓ（ミリスチル）
Ｌ
ＢＰ１−２２８：ＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＳ（ミリスチル）Ｌ

Ｃ５７ＢＬ/６マウスを、ジリポペプチドリポソームワクチン、ＢＰ１−２１７で、少
なくとも２回、皮下免疫化した後、Ｔ２、体液性応答を誘導し、非常に高レベルの抗ＭＵ
Ｃ Ｉ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を産生した。対照的に、モノリポペプチド、ＢＰ１−
２２８で２回免疫化したマウスでは、非常に低レベルのＩｇＧ産生を伴う細胞性応答が引
き起こされた。たとえば、ＢＰ１−２１７は、ＢＰ１−１５１ＨＳＡ固相で１/７２，０
００〜１/２１８，７００の範囲の抗ＭＵＣ Ｉ ＩｇＧ力価をもたらし、Ｂｌｅｎｄ
Ｃ固相で１/１００−１１２７００の力価をもたらしたが、ＢＰ１−２２８は、ＢＰ１−
１５１ＨＳＡ固相で低力価のＩｇＧ抗体を産生したにすぎず、また、ＢｌｅｎｄＣ固相で
は抗体が検出されなかった。以下の表１を参照されたい。

モノリポペプチドであるＢＰ１−２２８又はＢＬＰ−２５は、２個の脂質鎖を有するＭ
ＵＣ１ペプチドに比して、非常に低い抗体レベルを生じさせるか、又は抗体レベルを全く
生じさせない。試験した全ての製剤が、リポソーム製剤であり、リピドＡアジュバントを
含有する。

免疫化ごとに、４０〜１００μｇの任意の量のＭＵＣ１リポペプチドを使用してもよく
（本発明はこれらの量に限定されない）、使用される特異的ペプチドによって変化しても
よい。リポソーム内のＭＵＣ１ペプチド５μｇは、強いＴ１免疫応答を引き出したが、抗
体は産生しなかった。臨床治験では、患者に注射した用量１０００μｇのＢＬＰ２５は、
特異的Ｔ細胞増殖の誘導に非常に有効であった。

脂質鎖間の定性的というよりむしろ定量的な差が、Ｔ１応答又はＴ２応答を引き出す上
で重要なことも明らかにされちる。すなわち、ペプチドに付着している脂質鎖のタイプと
関係なく、体液性免疫応答を引き出すことができる。たとえば、ＭＵＣ Ｉペプチド、二
つの隣り合ったリジン残基に付着した二つのパルミトイルリジン新油性アミノ酸残基を有
する「ＢＰ１−１３２」も、体液性免疫を誘導することが明らかにされている。表２を参
照されたい。
ＢＰ１−１３２：ＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＫ（パルミテート
）Ｋ（パルミテート）Ｇ

ＢＰ１−１３２を含むリポソーム製剤で２回免疫化したマウスは、ＢＰ１−２１７で記
録されたものと似た力価を有する、抗ＭＵＣ Ｉ抗体産生を誘導した（１/２１８，７０
０のＩｇＧ、１１８１００〜１/７２，９００のＩｇＭ）。

ジリポ−ＭＵＣ Ｉペプチドリポソームで２回免疫化することにより、主としてＴ２、
体液性、免疫応答が刺激されるが、Ｔ細胞増殖及びＩＦＮ−γ産生によって分かる通り、
多少の細胞性免疫系活性が残存する。しかし、本発明は、二つの脂質鎖（たとえば、パル
ミトイルリジン脂質鎖又はミリスチルセリン脂質鎖のいずれか）が付着したＭＵＣ Ｉペ
プチドのリポソーム投与は、抗体産生を劇的に増加し、体液性免疫系を刺激することを示
す。

この達成は、哺乳動物モデルでこれまで確認されていない。

観察された現象をさらに特性決定するために、モノリポペプチド又はジリポペプチドを
含む、ＭＵＣ Ｉに基づくリポソーム製剤で、ＭＵＣ Ｉトランスジェニックマウスを免
疫化した。表３に示す通り、ジリポペプチド（ＢＰ１−２１７）で免疫化したとき、強い
ＩｇＧ抗体応答が再度確認されたが、４回の免疫化後だけであった。これは、ＭＵＣ Ｉ
抗原寛容原性であるＣ５７Ｂ１/６ＭＵＣ Ｉトランスジェニックマウスは、この寛容性
を破って、高レベルの抗ＭＵＣ ＩＩｇＧを誘導するためには、正常なＣ５７Ｂ１/６マ
ウスより多い免疫化を必要とすることを示す。モノリポペプチド（たとえば、ＢＰ１−２
２８）のみで免疫化したマウスは、非常に低いＩｇＧ力価を示した。

従って、モノリポ−ＭＵＣ Ｉペプチドを含むリポソーム製剤の投与は、細胞性応答を
刺激する。ジリポ−ＭＵＣ Ｉペプチドリポソーム製剤による免疫化は、体液性応答を誘
導する。モノリポ−ＭＵＣ Ｉ及びジリポ−ＭＵＣ Ｉを含むリポソームの創製物は、免
疫化したとき、細胞性免疫応答及び体液性免疫応答の両者を生じさせる。従って、免疫応
答の調節は、特定のリポソーム製剤をある一定の順序で選択的に投与するステップによっ
て達成される。

［モノ−及びジ脂質付加結核ペプチド］
ＭＵＣ Ｉモノリポペプチドとジリポペプチドとで確認されたように、ジリポ結核ペプ
チドで免疫化することにより、抗体産生が劇的に増加した。表４を参照されたい。

ジリポ結核ペプチドで２回免疫化することにより、ＩｇＧ力価のレベルが、モノリポ結
核ペプチドによる免疫化後に誘導され力価に比して劇的に上昇した。以上の結果から、二
つの脂質が存在することにより、体液性応答に関連のある力価がほぼ１０倍上昇すること
がわかる。

［モノ−及びジ脂質付加Ｂ型肝炎ペプチド］

ジリポＢ型肝炎ペプチドで２回免疫化することにより、モノリポＢ型肝炎ペプチドによ
る免疫化後に誘導された力価に比して、ＩｇＧ力価のレベルが顕著に上昇した。同様に、
ＩｇＭ抗体のレベルは、ジリポペプチドリポソーム製剤を用いて免疫化処理をした後に、
より高かった。

［モノ−及びジ脂質付加マラリアペプチド］

ジリポマラリアペプチドで２回免疫化することにより、モノリポマラリアペプチドによ
る免疫化後に誘導された力価に比して、ＩｇＧ力価及びＩｇＭ力価の両者のレベルが上昇
した。この場合、マラリアジリポペプチドワクチンは、モノリポワクチンに比して、より
強い細胞増殖及びＩＦＮ−γレベルを誘導した。これは、抗原に付着した脂質の数を変え
ることによって、免疫応答の強度、すなわち、細胞性免疫応答を調節できることを示す。

［リポソーム中のモノ−及びジリポペプチドの比率変化］
種々の比率でモノリポペプチドとジリポペプチドとをリポソームに組み入れることによ
って、体液性応答のレベル及び強度を調節することが可能である。表７に、様々なリポソ
ーム構築物で２回免疫化した後のＣ５７ＢＩ/６マウスにおけるＩｇＭ力価をまとめる。
予想通り、ＢＬＰ２５モノリポペプチド又は生理食塩水で免疫化したマウス（グループ５
及び６）は、検出可能なＩｇＭ力価を生じなかった。しかし、全てのリポソーム製剤が、
類似した細胞性免疫応答を引き起こした（データは表示せず）。

３：１の比率の、モノリポペプチドとジリポペプチドとの混合物は、それぞれ、抗体力
価を有意に改善しなかった（グループ１）。しかし、１：１の比率でモノリポペプチドと
ジリポペプチドとをリポソームに組み入れたとき、グループ１と比較して、抗体力価の上
昇が認められた。１：３の比率でＭＵＣ１モノリポペプチドとジリポペプチドとを含有す
るリポソーム製剤で免疫化したマウス（グループ３）で、最強の抗体応答が確認された。

従って、種々の比率でモノリポペプチドとジリポペプチドとをリポソームに組み入れる
ことによって、体液性応答のレベルを調節することが可能である。

［ＭＵＣ１リポペプチドにおける脂質鎖の位置が体液性免疫応答に及ぼす作用］
カルボキシ末端に付着した２個のリポセリン残基を有するＭＵＣ１リポペプチドでマウ
スを免疫化した後、強力な抗体応答が実証され、この強い抗体応答が維持され得るかどう
か、リポセリン残基の位置又は数が変更されるかどうかという疑問が生じた。

この疑問に答えるために、異なるリポセリン残基配置を有する幾つかのＭＵＣ１リポペ
プチド構築物を合成した。表８に示すデータから、カルボキシ末端に３個のリポセリン残
基を有する製剤番号５のみが、強力な抗ＭＵＣ１ ＩｇＧ応答を引き起こすことができた
ことがわかる。二つの脂質鎖の間に３−セリンスペーサーを挿入することにより（製剤番
号４）、抗体応答のレベル低下を招いた。

同様に、ＭＵＣ１ペプチドの真ん中に脂質鎖１個だけが挿入された製剤番号２は、多少
低い抗体力価を示したが、ＭＵＣ１分子の中央の位置に２個のリポセリン残基が挿入され
たとき（製剤番号１）これらの抗体力価ははるかに高かった。リポセリン残基が極端な位
置に配置されたとき（１個はカルボキシ末端で、１個がアミノ末端（製剤番号２））、多
少低い抗体力価が確認された。

２個又は３個のリポセリン残基がカルボキシ末端に配置されるとき、最強の抗体応答を
生じさせ得る可能性がある。リポセリン残基の位置を変えることにより、かなりの抗体力
価が依然として維持され、ＢＬＰ２５又は生理食塩水（グループ６及び７）より高いが、
カルボキシ末端位置に比して有意に低い。

本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、本発明の方法及び組成物において様々な
改変及び変更を行うことができることは、当業者に明白であろう。従って、本発明は、添
付の特許請求の範囲及びそれらの均等物の範囲に入るという条件で、本発明の改変及び変
更を包含することを意図する。

Claims (8)

1. 個体の体液性免疫応答を刺激するための、
   ＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＳ（ミリスチル）Ｓ（ミリスチル）Ｌ（ＢＰ１−２１７）、
   ＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＫ（パルミテート）Ｋ（パルミテート）Ｇ、
   ＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＫ（パルミトイル）Ｋ（パルミトイル）Ｌ、
   ＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧＶＳ（リポ）Ｓ（リポ）Ｌ（ＢＰ１−２６５）、
   Ｓ（リポ）ＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＡＳ（リポ）Ｌ（ＢＰ１−２７３）、および
   ＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＳ（リポ）Ｓ（リポ）Ｓ（リポ）Ｌ（ＢＰ１−２７５）
   からなる群から選択される、ＭＵＣ Ｉリポペプチド。
2. ＢＰ１−２１７（ＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＳ（ミリスチル）Ｓ（ミリスチル）Ｌ）である、請求項１に記載のジリポペプチド。
3. ＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＫ（パルミテート）Ｋ（パルミテート）Ｇである、請求項１に記載のジリポペプチド。
4. ＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＫ（パルミトイル）Ｋ（パルミトイル）Ｌである、請求項１に記載のジリポペプチド。
5. ＢＰ１−２６５（ＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧＶＳ（リポ）Ｓ（リポ）Ｌ）である、請求項１に記載のジリポペプチド。
6. ＢＰ１−２７３（Ｓ（リポ）ＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＡＳ（リポ）Ｌ）である、請求項１に記載のジリポペプチド。
7. ＢＰ１−２７５（ＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＳ（リポ）Ｓ（リポ）Ｓ（リポ）Ｌ）である、請求項１に記載のトリリポペプチド。
8. 個体の体液性免疫応答を刺激するための請求項１〜７のいずれかに記載のリポペプチドを含む組成物であって、モノ脂質付加されたＭＵＣ Ｉペプチドをさらに含み、
   前記モノリポペプチドが、
   ＢＰ１−１４８（ＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰ−Ｌｙｓ（パルミトイル）またはＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰ−Ｌｙｓ（パルミトイル）Ｇ）、
   ＢＰ１−２２８（ＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＳ（ミリスチル）Ｌ）、または
   ＢＰ１−２７２（ＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＳ（リポ）ＳＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳ）である組成物。

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