DE69837350T2

DE69837350T2 - Topische immunostimulierung zur induzierung der migration der langerhanszellen

Info

Publication number: DE69837350T2
Application number: DE69837350T
Authority: DE
Inventors: Carol O. La Jolla COWING
Original assignee: Torrey Pines Institute for Molecular Studies
Current assignee: Torrey Pines Institute for Molecular Studies
Priority date: 1998-04-20
Filing date: 1998-04-20
Publication date: 2007-11-29
Anticipated expiration: 2018-04-21
Also published as: EP1071411B1; WO1999053912A1; EP1071411A4; ATE356620T1; CA2325818A1; CA2325818C; JP4540845B2; EP1071411A1; ES2283053T3; DE69837350D1; JP2002512186A; AU765260B2; AU7132498A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Des Körpers erste Verteidigungslinie gegen Pathogene bildet die Haut. Die äußerste Schicht, das Stratum corneum, ist eine breite Zone mit einer Dicke von 20 bis 30 Zellschichten. Die Reste der abgestorbenen Zellen, aus denen das Stratum corneum besteht, sind fast komplett mit Keratinfasern gefüllt und von hoch geordneten Lipid-Doppelschichten umgeben. Solange die Epidermis nicht beschädigt ist, stellt das stark keratinisierte Stratum corneum eine erhebliche physische Barriere für den Eintritt der meisten Fremdsubstanzen dar. Die Schleimhäute, welche die Verdauungs-, Atem-, Harn- und Fortpflanzungswege auskleiden, stellen eine ähnliche, aber weniger ausgeprägte physische Barriere, der das dicke Stratum corneum fehlt, bereit.
Die darunter liegenden Schichten des Epithels in der Haut und den Schleimhäuten sind reich besetzt mit unreifen dendritischen Zellen, genannt Langerhans-Zellen. Diese phagozytierenden Leukozyten sind bereit, Antigene einzufangen, welche die unteren Schichten der Epidermis durch physische Bruchstellen im Stratum corneum erreichen können. Nach physischen Verletzungen der Haut, werden Signale erzeugt, welche die Langerhanszellen dazu veranlassen, das Epithel zu verlassen und durch afferente Lymphbahnen zu den Lymphknoten zu wandern, dabei tragen sie irgendwelche Antigene (d. h., virale, bakterielle, parasitische, allergische) mit sich, die das schützende Stratum corneum durchdrungen hatten. Sehr kleine, lipophile Moleküle und einige hoch-reaktive Moleküle, bekannt als Haut-sensibilisierende Wirkstoffe, wie TNCB, Giftsumach-Catechol, Oxazolon usw., können das intakte Stratum corneum durchdringen, wobei sie nachfolgend an Proteine in der darunter liegenden Epidermis binden und Langerhanszellen aktivieren.
Eingefangene Protein-Antigene werden durch die Langerhanszellen aufgenommen und abgebaut, wobei sich kleine Peptide ergeben, die in die Peptidbindungsfurchen von MHC-Molekülen eingelagert werden. Die MHC-Peptid-Komplexe werden dann für die Präsentation zu T-Zellrezeptoren in die Plasmamembran eingebaut. Während ihrer Wanderung zu den Lymphknoten, differenzieren die Langerhanszellen in reife lymphoide, dendritische Zellen, die ihre phagozytierenden Eigenschaften verlieren und statt dessen hohe Mengen an MHC-Klasse-I und -II-Molekülen, sowie costimulatorische Moleküle und Adhesions-Moleküle exprimieren, die essentiell für eine wirksame Antigenpräsentation sind (Udey, Clin. Exp. Immunol. 107:6–8, 1997). Während es jetzt gut bekannt ist, dass Langerhanszellen von dem Epithel zu den T-Zellbereichen von drainierenden Lymphknoten wandern, ist über die Signale, welche die Wanderung und Differenzierung der Langerhanszellen induzieren, relativ wenig bekannt. Sobald sie in den Lymphknoten sind, aktivieren die differenzierten Langerhanszellen, die MHC-Peptid-Komplexe enthalten, auf jeden Fall primäre CD4+ T-Helferzellen und CD8+ zytolytische T-Zellen. Diese neu differenzierten Langerhanszellen, die kürzlich in die Lymphknoten eingewandert sind, sind die potentesten Induktoren der T-Zell-Immunität, die bekannt sind.
Es ist kürzlich gezeigt worden, dass dendritische Zellen von Mäusen oder Menschen, die Tumorantigenen oder -peptiden ausgesetzt wurden, wirksame Induktoren von tumorspezifischer Immunität sind, die sogar etablierte Tumore eliminieren oder unterdrücken können (Young und Inaba, J. Exp. Med. 183:7–11, 1996; Zitvogel et al., J. Exp. Med. 183:87–97, 1996; Celluzzi et al., J. Exp. Med. 183:283–287, 1996; und Paglia et al., J. Exp. Med. 183:317–322, 1996). In diesen Untersuchungen wurden dendritische Zellen aus Knochenmark oder Blut gesammelt, in Gewebekultur vermehrt, in vitro den Tumorantigenen ausgesetzt und schließlich i.v. in den Spender rückinjiziert. Solche individualisierte Therapie ist in einer Outbred-Population notwendig, um sicherzustellen, dass die entsprechenden, syngenen MHC- Moleküle für die T-Zellen des Individuums und zur zielgerichteten Erfassung der Tumorzellen verwendet werden. Während dieses individualisierte Verfahren hoch wirksam ist, ist es zu unhandlich, zeitraubend und teuer, um eine breit anwendbare therapeutische Maßnahme zu sein.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Ein topisches Impfverfahren zur Erhöhung der Immunantwort gegen ein Antigen ist offengelegt. Antigene von Tumoren, viralen oder bakteriellen Pathogenen, sowie Parasiten sind innerhalb des Bereiches der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Das Verfahren beinhaltet die Verabreichung des Antigens in Verbindung mit: 1) ein Mittel zur Erhöhung der Penetration des Antigens durch die Haut oder Schleimhäute und 2) einen Wirkstoff zur Induktion der Wanderung der Langerhanszellen zu den Lymphknoten. Das Antigen ist vorzugsweise ein Peptid mit einer Länge von 3–20 Aminosäureresten und stärker bevorzugt enthält das Peptid 8–14 Aminosäurereste. Das Antigen wird vorzugsweise mit einem Konzentrationsbereich von etwa 1 μg/ml bis etwa 100 mg/ml verabreicht.
Die Mittel zur Erhöhung der Penetration des Antigens beinhalten das Verwenden einer lipophilen Trägersubstanz des Penetrationsverstärkers, wie Dimethylsulfoxid (DMSO) oder Azone, niederfrequenter Ultraschall, Elektroporation, Iontophorese, intraepidermale Zuführung und deren Kombinationen. Vorzugsweise wird die Peptid-Penetration des Stratum corneum gefördert durch Dimethylsulfoxid in Kombination mit einem von den physikalischen transdermalen Zuführungsmitteln.
Wirkstoffe, die eine Wanderung der Langerhanszellen induzieren, werden ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Dibutylphthalat, Dibutyl-D-tartrat, N,N-diethyl-toluamid, Dibutylfumarat, Di(2-ethylhexyl)fumarat, Diisooctylmaleat, Diethylhexylmaleat, Diisooctylfumarat, Benzosäure, Benzalkoniumchlorid, Kampfer, Bihenylmaleat, Dioctylphthalat, Dibutylmaleat, Dioctylmaleat, Dibutylsuccinat, Dioctylsuccinat, Dinonylphthalat, Diisononylphthalat, Dimethylphthalat, Diettylphthalat, Dipropylphthalat, Diphenylphthalat, Dibenzylbutylphthalat und Diethylmethylphthalat. Niederfrequenter Ultraschall kann auch als ein Induktor der Wanderung von Langerhanszellen angewendet werden. Vorzugsweise wird Dibutylphthalat zum Induzieren der Wanderung von Langerhanszellen verabreicht.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 veranschaulicht den Effekt der verschiedenen Behandlungsregime auf die gesamten und die FITC+ lymphoiden, dendritischen Zellen 2 Tage nach der Behandlung.
2 zeigt die Kinetiken der Wanderung der Langerhanszellen als Reaktion auf FITC in Aceton und Dibutylphthalat.
3 zeigt den Effekt der topischen Verabreichung von FITC in Aceton und Dibutylphthalat auf die Gesamtzahl der dendritischen Lymphknotenzellen.
4 zeigt die schwache Hemmung des EG7-OVA Tumorwachstums durch kutane topische Verabreichung des Tumorpeptids SIINFEKL in Aceton und Dibutylphthalat.
5 veranschaulicht die Induktion der kompletten EG7-OVA tumorspezifischen Immunisierung durch intravaginale topische Verabreichung von SIINFEKL in Aceton und Dibutylphthalat.
6 zeigt die komplette Hemmung des EG7-OVA Tumorwachstums durch kutane topische Verabreichung des Tumorpeptids SIINFEKL in DMSO, gefolgt durch Dibutylphthalat in Aceton.
7 zeigt den Effekt von verschiedenen potentiellen Induktoren der Wanderung der Langerhanszellen in dem FITC Screening-Assay.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Antigen zur Aufnahme durch die einer Einzelperson eigenen Langerhanszellen topisch verabreicht. Ein lipophiles Lösemittel wird vorzugsweise einbezogen, um die Penetration des Antigens durch das Stratum corneum und in die darunterliegende Epidermis zu fördern. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann ein physikalisches Reizmittel, wie niederfrequenter Ultraschall oder ein elektrisches Feld, auf die Haut nach der topischen Verabreichung angewendet werden, um die Penetration des Antigens durch das Stratum corneum zu erhöhen. Die Verabreichung des Antigens auf die Haut ist begleitet durch die topische Anwendung von einem weiteren Wirkstoff(en), wie Dibutylphthalat, der(die) die Wanderung von Langerhanszellen zu den drainierenden Lymphknoten induziert(en).
INDUKTION DER WANDERUNG VON LANGERHANSZELLEN DURCH DIBUTYLPHTHALAT
Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) ist ausgiebig durch den Erfinder und andere zur Charakterisierung der Wanderung von Langerhanszellen benutzt worden. FITC ist ein kleines (MW 389) nicht peptidartiges, überwiegend lipophiles Molekül, das fähig ist, das Stratum corneum zu durchqueren. Die immunogene Aktivität von FITC wird durch die Reaktionsfähigkeit seiner Isothiocyanatgruppe (-N=C=S) mit freien Aminogruppen verursacht, wodurch es ermöglicht wird, dass es kovalent an Proteine und/oder Peptide gebunden wird. C57BL/6-Mäuse erhielten die folgenden Behandlungen: 1) Keine; 2) Nur Rasur des Bauches; 3) Topische Verabreichung von FITC in Aceton; 4) Topische Verabreichung von FITC in Aceton und Olivenöl; 5) Topische Verabreichung von FITC in Aceton und DMSO, verdünnt in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS); und 6) Topische Verabreichung von FITC in Aceton und Dibutylphthalat. Die in der Leistengegend gelegenen drainierenden Lymphknoten wurden dann auf eingewanderte Langerhanszellen durch Immunfluoreszenz-Durchflusszytometrie jeden Tag danach untersucht. Wandernde Langerhanszellen wurden durch die Anwesenheit von FITC und der hohen Expression von MHC-Klasse-II-Molekülen identifiziert oder durch einen für Langerhanszellen spezifischen monoklonalen Antikörper (NLDC-145). Andere dendritische Zellen der Lymphknoten konnten auch durch Verwenden eines für dendritische Zellen spezifischen monoklonalen Antikörpers, 33Dl, differenziert werden. Die Aufnahme von FITC und die Antwort der Langerhanszellen auf Wanderungssignale waren bereits sechs Stunden nach der topischen Verabreichung in den drainierenden Lymphknoten beobachtbar. Jedoch wurden 48–72 Stunden für die maximale Rate der Einwanderung in die Lymphknoten benötigt. 1 veranschaulicht den Effekt der verschiedenen Behandlungsregime auf die gesamten und die FITC+ lymphoiden, dendritischen Zellen 2 Tage nach der Behandlung. In Tieren, die FITC in Aceton verabreicht bekamen, wurde keine durch Olivenöl oder Dimethylsulfoxid (DMSO) induzierte Erhöhung in der Zahl der FITC+ Langerhanszellen gefunden, obwohl DMSO einen kleinen stimulatorischen Effekt auf die unspezifische Einwanderung hatte, was darauf hinweist, dass Antigenkontakt und Wanderung der Langerhanszellen unabhängig reguliert werden. Das Hinzufügen von Dibutylphthalat hatte eine bemerkenswerte Wirkung auf die Wanderung der FITC+-Zellen und der gesamten dendritischen Zellen in die Lymphknoten. Demnach war Dibutylphthalat ein sehr leistungsfähiger Induktor der Wanderung.
Die Kinetiken der Wanderung der Langerhanszellen in Mäusen, die mit FICT in Aceton und Dibutylphthalat behandelt waren, ist in 2 gezeigt. Eine hohe Anzahl von FITC+ Langerhanszellen war in den Lymphknoten nach 32 Stunden vorhanden und der Höchstwert der Dichte von eingewanderten Langerhanszellen trat etwa 2 bis 3 Tage nach der topischen Verabreichung auf. Jedoch ist zu beachten, dass zusätzlich zur Induktion der Wanderung der FITC+ Langerhans-Zellen, die Anzahl der nicht-markierten dendritischen Zellen auch merklich erhöht war, wobei Höchstwerte 9–10 Tage nach der Behandlung erreicht wurden. Die nicht-markierten dendritischen Zellen waren sehr wahrscheinlich Langerhans-Zellen, die den FITC-Marker verloren hatten. Die Gesamtzahl der Lymphknotenzellen als Antwort auf die topische Verabreichung ist in 3 gezeigt. Fünf Tage nach der Hautauftragung war die Zellpopulation der Lymphknoten ungefähr 7,2-fach über den Grundwert gestiegen. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass das Antigen (FITC) in Aceton und Dibutylphthalat nicht nur die Wanderung von antigen+ Langerhanszellen stimulierte, sondern auch in einer dramatischen Antwort der T- und B-Zellen in den drainierenden Lymphknoten resultierte.
INDUKTION DER LANGERHANSZELL-VERMITTELTEN TUMORSPEZIFISCHEN IMMUNITÄT
Die C57BL/6 Thymusdrüsen-Tumorzelllinie EL4 wurde mit dem kompletten Gen für Hühner-Ovalbumin (OVA) transfiziert. Die resultierende transfizierte Zelllinie EG7-OVA exprimiert Hühner-Ovalbumin. Ein Peptid mit acht Aminosäuren, OVA 257-264, mit der Sequenz SIINFEKL ist in dem MHC-Klasse-I-Molekül K^b exprimiert, wo gezeigt wurde, dass es als Tumorassoziiertes Peptidantigen für CD8+ CTLs sowohl in vivo und in vitro funktioniert (Celluzzi et al., J. Exp. Med. 183:283 (1996)). Ausgehend von den positiven Ergebnissen der Verwendung von FITC, folgten die Erfinder einem ähnlichen Protokoll in einem Ansatz, Immunität zu dem EG7-OVA-Tumor durch topische Verabreichung des gut charakterisierten, synthetischen Tumor-assoziierten Peptids SIINFEKL zu induzieren.
C57BL/6-Mäuse wurden wie folgt behandelt: 1) Nur Rasur; 2) Topische Verabreichung von Aceton und Dibutylphthalat; 3) SIINFEKL (240 :g/ml) in DMSO, verdünnt in PBS, gefolgt von Aceton und Dibutylphthalat nach 5 Stunden, und 4) SIINFEKL (240 :g/ml) in Aceton und Dibutylphthalat. Alle Mäuse wurden nachfolgend mit 5 × 10⁵ EG7-OVA-Zellen (die 5-fache tumorigene Dosis) subkutan injiziert. Die Tumor-spezifische Immunität wurde durch Messung der Tumorgröße überwacht. Die in 4 gezeigten Ergebnisse weisen darauf hin, dass keines der Behandlungsprotokolle in der Hemmung des Tumorzellwachstums wirksam war. Da es aus den FITC-Experimenten bekannt war, dass Dibutylphthalat ein potenter Induktor der Wanderung der Langerhanszellen war, und dass SIINFEKL leicht in das MHC-Klasse-I-Molekül K^b aufgenommen wurde, wo es CD8+ CTLs aktivierte (Celluzzi et al., J. Exp. Med. 183:283 (1996)), wurde gefolgert, dass das SIINFEKL-Peptid nicht durch das Stratum corneum gelangen konnte.
Da vorausgesetzt wurde, dass die topische Verabreichung von SIINFEKL in Aceton und Dibutylphthalat es nicht geschafft hatte, eine Tumor-spezifische Immunität zu verleihen, weil das Peptid das Stratum corneum nicht durchdrang, wurde der selbe topische Wirkstoff intravaginal angewendet. Den Schleimhäuten fehlt die durch das Stratum corneum gestellte widerstandsfähige Barriere. Die in 5 gezeigten Ergebnisse geben zu erkennen, dass ein kompletter Schutz vor dem Tumor durch SIINFEKL in Aceton und Dibutylphthalat induziert wurde. Die EL4-Ausgangs-Tumorzelllinie, der Hühner-Ovalbumin fehlt, wurde als eine positive Kontrolle verwendet: Es wurde keine Immunität gegenüber den EL4-Tumorzellen gesehen. Somit wurde die Hypothese der Erfinder, die Penetration des Stratum corneum betreffend, bestätigt; das SIINFEKL-Peptid konnte die Langerhanszellen unterhalb des Stratum corneum nicht erreichen.
Während die intravaginale topische Verabreichung des Tumor antigens ein wirksames Mittel der Leitung des Antigens zu den Langerhanszellen für die nachfolgende Induktion der Tumor-spezifischen Immunität bereitstellte, sind Schleimhäute, wie die Vagina, als Anwendungsorte nicht gut geeignet für die komfortable Verwendung und das Überwachen durch die allgemeinen Fachleute, die voraussichtlich mit der Verabreichung der topischen Impfungen der vorliegenden Erfindung beteiligt sind. Somit wurde, um die Wirksamkeit der kutanen topischen Verabreichung zu erhöhen, SIINFEKL in DMSO gelöst und ohne Verdünnung auf die Haut aufgetragen. Dibutylphthalat in Aceton wurde 5 Stunden später auf die selbe Stelle aufgetragen. Alle Mäuse wurden nachfolgend mit 5 × 10⁵ EG7-OVA-Zellen subkutan injiziert. Die in 6 gezeigten Ergebnisse lassen erkennen, dass das Peptid in DMSO fähig war das Stratum corneum zu durchqueren, wobei es effektiven Zugang zu den Langerhanszellen erreichte. Das Tumorwachstum war nach 6 bis 9 Tagen unterdrückt und sogar die etablierten Tumore wurden vollständig 16 Tage nach der Beimpfung eliminiert. Demnach durchdrang das Tumor-spezifische Peptid SIINFEKL, in konzentriertem DMSO, das Stratum corneum, wurde in das MHC-Klasse-I-Molekül K^b in epidermalen Langerhanszellen eingebaut und in der Anwesenheit des Induktors der Wanderung, Dibutylphthalat, wirksam den CD8+ CTLs in den Lymphknoten präsentiert.
ANTIGEN-HERKUNFT
„Antigen", wie hierin gebraucht, schließt jedes Molekül ein, das, wenn es gemäß der vorliegenden Erfindung verabreicht wird, fähig ist, eine Antigen-spezifische Immunität auszulösen. Dementsprechend muss das Antigen, oder ein Fragment davon, fähig sein (1) die Haut oder die Schleimhaut zu durchdringen; (2) mit den Langerhanszellen in der Epidermis oder dem Epithel von Schleimhäuten zu interagieren; (3) im Ganzen oder zum Teil mit einem MHC-Klasse-I oder -II-Molekül zu assoziieren, und (4) T-Zellrezeptoren an CD4+ oder CD8+ T-Zellen zu aktivieren, um Antigen-spezifische Immunität zu verleihen. Noch genauer, die topische Impfmethode der vorliegenden Erfindung ist in Richtung auf Antigene von Tumorzellen, virale und bakterielle Pathogene und Parasiten gerichtet.
Obwohl nicht essentiell, sind kleine Peptidantigene besonders bevorzugt, da es einfacher ist, kleinere Peptide (ungefähr 3 bis 20 Aminosäurereste) durch das Stratum corneum und in die Epidermis zu bringen, als größere Proteine. Weiterhin werden Peptide mit der richtigen Größe, wie SIINFEKL, wahrscheinlich eher direkt an MHC-Moleküle an der Oberfläche von Langerhanszellen durch den Prozess des Peptidaustausches gebunden, in welchem die exogen zugesetzten Peptide solche endogenen Peptide verdrängen, die eine niedrigere Affinität für die Peptidbindungsfurche der MHC-Klasse-I oder-II-Moleküle aufweisen. Die Eigenschaften von Peptiden, die für eine direkte Verbindung mit Klasse-I oder -II-MHC-Molekülen geeignet sind, sind ausgiebig untersucht worden. Somit sind Fachleute fähig, auf der Peptidstruktur basierend, Sequenzen vorauszusagen, die wahrscheinlich mit einem gegebenen MHC-Molekül assoziieren. Peptide, die effektiv an Klasse-I MHC-Moleküle binden, enthalten allgemein etwa 8–9 Aminosäurereste, während Peptide, die vorzugsweise mit Klasse-II MHC-Molekülen assoziieren, etwa 11–14 Aminosäuren lang sind. In der Tat sind einige antigene Peptide, die fähig sind, direkt mit MHC-Molekülen an dendritischen Zellen zu interagieren, bekannt und können durch Standardtechniken synthetisiert werden.
Während sonst die spezifischen tumorassoziierten Antigene für viele menschliche Tumore identifiziert wurden, sind die relevanten Peptide noch unbekannt. Nichtsdestoweniger können rohe säure-eluierte Tumorpeptide schnell und leicht hergestellt werden und sind, wenn sie mit dendritischen Zellen assoziiert sind, als wirksame Induktoren der tumorspezifischen Immunität gezeigt worden (Zitvogel et al., J. Exp. Med. 183:87-97, 1996). Somit können sowohl bekannte, homo gene Präparationen von synthetischen Peptiden als auch unbekannte Gemische von extrahierten Peptiden für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sein. Die Wahl und die Herstellung von geeigneten Peptid-Antigenen ist dem Fachmann gut bekannt. Sehen sie nachfolgend eine ausführliche Beschreibung von spezifischen Arbeitsbeispielen.
Nicht-peptidartige immunogene Verbindungen, die zur Induktion spezifischer Immunität fähig sind, werden gemäß der vorliegenden Erfindung auch als potentielle Antigene betrachtet. Kleine, nicht-peptidartige Haptene können nach der Durchquerung des Stratum corneum kovalent an Peptide oder Proteine binden, wodurch sie, durch Assoziation mit einem MHC-Molekül, Zugang zu den Standard-Signalwegen der Antigenpräsentation erlangen. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass die Immunogenität von FITC durch die Reaktionsfähigkeit der Isothiocyanatgruppe (-N=C=S) mit freien Aminogruppen verursacht wird, wodurch es ermöglicht wird, dass es kovalent in Proteine und/oder Peptide eingebaut wird. Somit können nicht-peptidartige antigene Teile von Tumorzellen, Pathogenen, Parasiten, Allergenen, usw., in der Praktizierung der topischen Impfverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Es sollte beachtet werden, dass die Wahl der Herkunft des Antigens nicht kritisch ist für die Erfindung, die eine allgemeine Methode zur Steigerung der Antigen-spezifischen Immunität ist. Jedoch wird die spezifisch erhaltene Immunantwort natürlich von dem jeweiligen eingesetzten Antigen abhängen. Es ist die Art und Weise der topischen Verabreichung, die Penetration des Stratum corneum, die Induktion der Wanderung der Langerhanszellen und die nachfolgende Antigenpräsentation durch MHC-abhängige Signalwege, die einzeln oder in Kombination, die Merkmale der offenbarten Erfindung beispielhaft zeigen. Die Tatsache, dass keine Beschränkungen der Auswahl an Antigenen aus einer großen Anzahl an Quellen auferlegt wurden, stimmt überein mit der Verwendung von grundlegenden Methoden zur Induktion Antigen-spezifischer Immunität gegen viele Antigene. Somit wird die Wahl und die Herkunft eines bestimmten Antigens von der Anwendung abhängen und ist innerhalb der Durchschnittsfachleute auf dem Gebiet der Immunologie gegeben.
DURCHDRINGUNG DES STRATUM CORNEUM
Die äußere Schicht der Haut ist ausgelegt, dem Eindringen von Fremdmaterialien in den Körper Widerstand zu leisten. Da sie aus dicht gepackten Schichten von Keratinozytenzellmembranen und Keratinfäden gebildet ist, ist das Stratum corneum undurchlässig für die meisten Moleküle mit größerer Molekularmasse, besonders solche mit einer hydrophilen Beschaffenheit. Infolgedessen werden nur wenige Arzneistoffe transdermal verabreicht. Solche Moleküle sind typischerweise klein und lipophil. Die transdermale Zuführung von Peptiden ist aufgrund ihrer Hydrophilizität und allgemein hoher Molekularmasse nicht begünstigt. Zahllose Studien dokumentieren die große Schwierigkeit, Peptide durch das Stratum corneum zu bekommen (als Übersichtsartikel siehe Steinstrasser und Merkle, Pharm. Acta. Helv. 70:3-24 (1995)). Unter den Ansätzen, die einigen Erfolg in der Steigerung der Peptid-Penetration hatten, sind eingeschlossen lipophile Trägerstoffe, niederfrequenter Ultraschall, Elektroporation, Iontophorese und intraepidermale Zuführung. Diese werden nachfolgend betrachtet.
Lipophile Lösemittel – Lipophile Lösemittel wie Aceton, Azone und Dimethylsulfoxid (DMSO) sind bekannt, dass sie das Stratum corneum durchdringen. Wie vorhergehend diskutiert, hat der Erfinder gefunden, dass kleine Peptide wie SIINFEKL, gelöst in DMSO, das Stratum corneum durchqueren und in die unteren Schichten der Epidermis eindringen. Somit umfasst die vorliegende Offenlegung, im Bezug auf die Antigen-Penetrationsverstärker, eine große Anzahl an lipophilen Lösemitteln, einschließlich DMSO, und symmetrische oder asymmetri sche Sulfide und Sulfoxide, wobei die Alkylgruppe 1 bis 16 Kohlenstoffatome enthält, sowie Liposomen.
Wo lipophile Penetrationsmittel, wie DMSO, in der vorliegenden Erfindung zur Steigerung der Peptidpenetration zum Einsatz kommen, können solche Lösemittel pur oder verdünnt mit anderen Lösungen, wie PBS, verabreicht werden. Die Verhältnisse der Mischungen können von etwa 1:9 bis etwa 9:1 (Penetrationsmittel zu Verdünnungsmittel) reichen. Vorzugsweise ist der Penetrationsverstärker unverdünnt.
Niederfrequenter Ultraschall – Mitragotri et al. berichteten, dass sogar große Proteinmoleküle wie Insulin (MW 6.000), IFN-γ (MW 17.000) und Erythropoietin (MW 48.000) dazu gebracht werden konnten, mit etwa 12 % Effizienz das Stratum corneum zu durchqueren, unter der Verwendung von niederfrequentem Ultraschall (Mitragotri et al., Science 269:850-853 (1995)). Ultraschall wirkt auf die Haut durch nicht-thermische Kavitationseffekte, die Mikrobläschen erzeugen, die sich im Stratum corneum ausdehnen und zusammenziehen, was in einer zeitweiligen Zunahme der Permeabilität resultiert. Kavitation tritt bei viel niedrigeren Schallwellenfrequenzen (d. H. etwa 20 kHz) auf als bei der traditionellen diagnostischen Bildgebung (2–12 MHz), wobei beide Anwendungen eine Intensität von ungefähr 0,2 W/cm² benötigen.
Elektroporation – Vanbever et al. offenbarten, dass etwa 10 des kleinen (MW 267) Moleküls Metoprolol während 4 Stunden nach 5 einzelnen 450-V Pulsen durch die Haut transportiert werden konnten (Vanbever et al., Pharm. Res. 11:1000-1003 (1994)). Die Elektroporation ist ausgiebig zur Permeabilisierung von Zellmembranen zum Zwecke der Einführung von DNA in Zellen verwendet worden. Der transdermale Transport von Peptiden kann durch örtliches begrenztes Aussetzen der Haut zu elektrischen Feldpulsen hoher Intensität bewerkstelligt werden, die vorübergehende wäßrige Poren in den Lipid-Dop pelschichten erzeugen können.
Iontophorese – Bodde et al. fanden, dass nur etwa 0,4 Vasopressin (MW 1.084) pro Stunde das Stratum corneum durchquerten (Bodde et al., Biochem. Soc. Trans. 17:943–945 (1990)). Iontophorese geht mit dem Aussetzen der Haut zu Strom niedriger Intensität einher. Polare Moleküle bewegen sich als Antwort auf den Strom. Jedoch wird angenommen, dass der Transport über die Drüsen oder Haarfollikel geschieht, die durch die Epidermis hindurch in die Dermis hinein ragen. Infolgedessen kann die Methode nicht ideal geeignet sein, um einen Zugang der epidermalen Langerhanszellen zu den permeierenden Peptiden bereitzustellen. Nichtsdestoweniger ist das Verfahren innerhalb der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Intraepidermale Zuführung – Sicherlich kann das Stratum corneum unter Verwendung scharfer Instrumente penetriert werden. Somit sind intraepidermale Injektionen unter Verwendung traditionell abgeschrägter Nadeln und Spritzen möglich. Ähnlich ist auch die Einführung des antigenen Wirkstoffes in die Epidermis möglich unter Verwendung von mit Zinken besetzten Instrumenten, wie solche, die für die Anwendung des Tine-Tests verwendet werden. Solche invasiven physikalischen Methoden können das Penetrationsproblem lösen und können sogar gleichzeitig Wanderungssignale zu den Langerhanszellen bereitstellen. Jedoch können solche Methoden auch einige der Hauptvorteile der vorliegenden Erfindung vereiteln, wie die Erleichterung der topischen Anwendung ohne die Notwendigkeit von sterilen Instrumenten oder hochqualifiziertem medizinischen Personal. Weiterhin ist die Verwendung invasiver Prozeduren immer von erhöhten Infektionsrisiken begleitet.
INDUKTION DER WANDERUNG VON LANGERHANS-ZELLEN
Während das wirksame Inkontaktbringen von Antigenen mit den Langerhanszellen in der Epidermis notwendig ist für das Praktizieren der vorliegenden topischen Impfmethode, ist sie an sich nicht ausreichend, um eine starke Antigen-spezifische Immunität zu induzieren, die für ein Impfverfahren gewünscht wird. In der Tat ist es der zweite Schritt, die Induktion der Wanderung der Langerhanszellen, die für sehr lange Zeit, bis zu der vorliegenden Offenlegung, unklar blieb. Obwohl das Phänomen der Wanderung der Langerhanszellen von dem Epithel zu den Lymphknoten für lange Jahre gut bekannt gewesen ist, waren die komplexen regulatorischen Signalwege, welche die Wanderung und die Differenzierung der Langerhanszellen in vivo kontrollieren, nicht gut verstanden. Außerdem gibt es offensichtlich eine Anzahl häufig festgehaltener falscher Vorstellungen bezüglich der Wanderung der Langerhanszellen. Zum Beispiel nehmen einige Forscher an, dass die spontane und/oder kontinuierliche Wanderung der Langerhanszellen ausreichend ist zur Induktion der Antigen-spezifischen Immunität (siehe z. B. Matsuno et al., J. Exp. Med. 183:1865 (1996)). Andere auf dem Gebiet glauben, dass die Tatsache, dass Kontakt-sensibilisierende Antigene fähig sind, selbst die Wanderung der Langerhanszellen zu induzieren, darauf hinweist, dass ein separater Induktionsstimulus für irgendwelche Antigene nicht notwendig ist (siehe z. B. Udey, Clin. Exp. Immunol. 107:6 (1997)). Dementsprechend glauben Wissenschaftler, die FITC in Aceton und Dibutylphthalat verwenden, um die Wanderung der Langerhanszellen zu studieren, das es das Antigen (FITC) ist, das die Wanderung induziert (siehe z. B. Tang et al., J. Immunol. 88:284 (1996)). Zusammengefasst, der heutige Stand der Technik auf diesem Gebiet betrachtet weder die Existenz von exogenen Induktoren der Wanderung der Langerhanszellen noch eine Rolle für diese Induktoren in der gesteigerten Antigenspezifischen Immunität.
Gegenwärtig konzentriert sich die Untersuchung der Regulation der Wanderung der Langerhanszellen auf die Produktion von Cytokinen und Chemokinen durch eine Reihe von Zellen, welche anscheinend die Wanderung und Reifung der Langer hanszellen in vitro modulieren. Zum Beispiel können der Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF) und Interleukin-1α (IL-1α) die Reifung in vitro stimulieren (Larregina et al., Immunology 87:317–325, 1996). Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) ist an der Wanderung der Langerhanszellen beteiligt (Banchereau und Steinman, Nature 392:245 (1998)). Andere Faktoren, die in die Kontrolle unterschiedlicher Aspekte der Reifung und/oder Wanderung der Langerhanszellen verwickelt sind, schließen MIP-la, G-Protein-gekoppelter Rezeptor für Calcitonin-Gen-Related-Peptid, C5a und andere Chemokine ein (Banchereau und Steinman, Nature 392:245 (1998)). Dementsprechend bleibt, während viele mögliche Signale und Signalwege identifiziert worden sind, das regulatorische System unklar.
Weiterhin tendieren die ausgeklügelten Signale und Signalwege, wie vorstehend diskutiert, sich auf die „normale" Antwort auf traumatische Brüche in der Epidermis zu konzentrieren. Exogene Induktoren der Wanderung der Langerhanszellen sind nicht vor dieser Arbeit des Erfinders berücksichtigt worden. In der Tat hatten Forscher nicht einmal erkannt, dass die Stimulation der Wanderung der Langerhanszellen ein kritischer Schritt in der therapeutischen Induktion einer Antigen-spezifischen Immunität war.
Verbindungen mit der Kapazität die Wanderung der Langerhanszellen zu induzieren können dargestellt werden durch die allgemeine Formel:
wobei R₁ und R₂ unabhängig voneinander Alkyl- oder Arylseitenketten sein können, die 1 bis 16 Kohlenstoffatome enthalten. Die Arylreste sind vorzugsweise substituierte oder nicht-substituierte Benzyl- oder Phenyl-Gruppen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die R₁- und R₂-Gruppen identische Alkylreste mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie Dibutylphthalat, wobei R₁ und R₂ (CH₂)₃-CH₃ sind.
Verbindungen, die als Induktoren der Wanderung der Langerhanszellen nützlich sind, können unter Verwendung der für die Daten der 1–3 beschriebenen Standard-FITC-Methoden gescreent werden. C57BL/6-Mäuse werden an ihren Bäuchen rasiert und mit 100 μl Testlösung, die 5 mg/ml FITC in einer 50/50 (v/v) Mischung aus Aceton und dem Wanderungsinduktor/z. B. Dibutylphthalat) enthält, angestrichen. Nach 2 Tagen wird der drainierende Lymphknoten der Leistengegend entfernt und die Gesamtzahl der dendritischen Zellen (sowohl FITC+ and FITC-) mittels Durchflusszytometrie und MHC-Klasse-Immunoassay bestimmt.

Spezifische Verbindungen, die innerhalb der vorliegenden Erfindung zur Induktion der Wanderung der Langerhanszellen eingeschlossen sind, sind nachfolgend aufgeführt.

Abkürzung	Verbindung
DBP	Dibutylphthalat
DBT	Dibutyl-D-tartrat
DET	N,N-Diethyl-toluamid
DBF	Dibutylfumarat
DEHF	Di(2-ethylhexyl)fumarat
DIOM	Diisooctylmaleat
DEHM	Di(ethylhexyl)maleat
DIOF	Diisooactylfumarat
BA	Benzoesäure
BC	Benzalkonium chlorid
C	Kampfer
BM	Bihenylmaleat
DOP	Dioctylphthalat
DBM	Dibutylmaleat
DOM	Dioctylmaleat
DBS	Dibutylsuccinat
DOS	Dioctylsuccinat
DNP	Dinonylphthalat
DINP	Diisononylphthalat
DMP	Dimethylphthalat
DEP	Diethylphthalat
DPP	Dipropylphthalat
DphP	Diphenylphthalat
DBBP	Dibenzylbutylphthalat
DMEP	Diethylmethylphthalat

Die Testergebnisse sind in 7 gezeigt. Die MHC-Klasse-II-Gesamtzellen wurden auf Werte oberhalb des Hintergrundes für die meisten der getesteten Verbindungen gesteigert. DNP, C, DBBP, DBT und DINP waren innerhalb 1 Standardabweichung von der Positiv-Kontrolle Dibutylphthalat (DBP).
Der Erfinder hat festgestellt, dass, neben den chemischen Induktoren der Wanderung der Langerhanszellen, niederfrequenter Ultraschall auch positive Ergebnisse in der vorstehend beschriebenen FITC-Wanderungs-Screeningprozedur aufweist. Demnach kann in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung niederfrequenter Ultraschall sowohl als Penetrationsmittel und/oder als ein Induktor der Wanderung der Langerhanszellen angewendet werden.
Die Peptide/Antigene, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können allgemein topisch auf epidermale oder epitheliale Stellen in einem Dosisbereich von ungefähr 1 μg/ml bis etwa 100 mg/ml angewandt werden. Vorzugsweise können die Peptid-Antigene innerhalb des Dosisbereiches von 1 mg/ml bis 10 mg/ml verabreicht werden. Die topische Verabreichung auf die Haut kann Anwendungsvolumen von 0,01 bis 1 ml, bevorzugt etwa 0,05 bis 0,5 ml einschließen. Allgemein kann ein geringeres Volumen angewandt werden, wenn vaginale oder andere Schleimhäute als Anwendungsroute ausgewählt sind. Routen zur Verabreichung können ausgewählt werden aus jeder epidermalen und/oder Schleimhaut-Lokalisation, einschließlich der Haut, intravaginal, rektal, Aerosolzuführung in die Atemwege und Lunge und mögliche Verabreichung in den GI-Trakt (Magen-Darm-Trakt) für einige Antigene. wo chemische Induktoren der Wanderung der Langerhanszellen verwendbar sind, können chemische Induktoren pur oder gemischt mit einem organischen Lösemittel, wie Aceton, in einem Verhältnisbereich von etwa 1:9 bis etwa 9:1 (Induktor zu Lösemittel) gegeben werden, vorzugsweise in einem Verhältnisbereich von etwa 3:7 bis etwa 7:3 und äußerst bevorzugt bei einem Verhältnis von etwa 1:1.
In einigen Fällen kann es vorteilhaft sein, lediglich die Wanderung der Langerhanszellen zu steigern, ohne spezifische Verabreichung irgendeines Antigens. Zum Beispiel, wo eine Einzelperson Hautkrebs hat, wie Melanom oder Basalzellkarzinom, kann es in der Steigerung einer Immunantwort gegenüber dem Tumor nützlich sein, einen Induktor der Wanderung der Langerhanszellen auf Stellen, die den Tumor umgeben, vor der Operation zu verabreichen. Alternativ kann die topische Verabreichung der Entfernung und der anschließenden Chemotherapie und/oder Bestrahlung folgen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung der Teile eines Kits enthaltend: – Ein Antigen; – Mittel zum Erhöhen der Penetration des Antigens durch die Epidermis oder das Epithel von einem Säuger, wobei die Mittel ein lipophiles Lösemittel und/oder ein physikalischer Reiz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus niederfrequentem Ultraschall und einem elektrischen Feld, sind; – Mittel zum Induzieren der Wanderung von Langerhanszellen, umfassend eine Verbindung der Form
wobei R₁ und R₂ unabhängig für Alkyl- oder Arylseitenketten stehen, enthaltend von 1 bis 16 Kohlenstoffatomen, zum Herstellen eines Medikamentes zum Erhöhen einer Immunreaktion gegen das Antigen in einem Säuger durch topische Verabreichung.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzungen an einer epidermalen oder Schleimhautstelle des Säugers zu verabreichen sind.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Antigen ein Peptid mit einer Länge von etwa 3 bis 20 Aminosäureresten ist.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei das Peptid eine Länge von 8 bis 14 Aminosäuren hat.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Peptid mit einer Konzentration im Bereich von etwa 1 μg/ml bis etwa 100 mg/ml zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das lipophile Lösemittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus symmetrischen oder asymmetrischen Alkylsulfiden und Alkylsulfoxiden, wobei die Alkylgruppe von 1 bis 16 Kohlenstoffatome enthält.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das lipophile Lösemittel Dimethylsulfoxid ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das induzierende Mittel der Wanderung der Langerhanszellen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Dibutylphthalat, Dioctylphthalat, Dinonylphthalat, Diisononylphthalat, Dimethylphthalat, Diethylphthalat, Dipropylphthalat, Diphenylphthalat, Dibenzylbutylphthalat und Diethylmethylphthalat.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das induzierende Mittel der Wanderung der Langerhanszellen niederfrequenter Ultraschall ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das induzierende Mittel der Wanderung der Langerhanszellen Dibutylphthalat ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das lipophile Lösemittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus symmetrischen oder asymmetrischen Dialkylketonen, wobei die Alkylgruppe von 1 bis 16 Kohlenstoffatome enthält.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei das lipophile Lösemittel Aceton ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das elektrische Feld für Elektroporation oder Iontophorese oder Kombinationen davon angeglichen ist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Antigen aus einer Quelle stammt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tumoren, Viren, Bakterien und Parasiten.
Verwendung einer wirksamen Menge eines induzierenden Mittels der Wanderung von Langerhanszellen zum Herstellen eines Medikamentes zur Erhöhung einer Immunreaktion in einem Säuger durch topische Verabreichung des induzierenden Mittels der Wanderung der Langerhanszellen, wobei das induzierende Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Dibutylphthalat, Dibutyl-D-tartrat, N,N-Diethyltoluamid, Dibutylfumarat, Di(2-ethylhexyl)fumarat, Diisooctylmaleat, Diethylhexylmaleat, Diisooctylfumarat, Benzoesäure, Benzalkoniumchlorid, Bihenylmaleat, Dioctylphthalat, Dibutylmaleat, Dioctylmaleat, Dibutylsuccinat, Dioctylsuccinat, Dinonylphthalat, Diisononylphthalat, Dimethylphthalat, Diethylphthalat, Dipropylphthalat, Diphenylphthalat, Dibenzylbutylphthalat und Diethylmethylphthalat und Kampfer.