TWI828061B - 痘苗病毒致炎兔皮提取物治療神經系統脫髓鞘疾病的用途 - Google Patents

Abstract

本發明涉及痘苗病毒致炎兔皮提取物的治療用途。更具體而言，本發明涉及痘苗病毒致炎兔皮提取物用於治療神經系統脫髓鞘疾病的用途。此外，本發明涉及痘苗病毒致炎兔皮提取物用於在患有神經系統脫髓鞘疾病的患者中恢復神經功能的用途。神經系統脫髓鞘疾病可以是多發性硬化症、急性播散性腦脊髓炎或者視神經脊髓炎。此外，所述痘苗病毒致炎兔皮提取物可以是立再適。

Description

痘苗病毒致炎兔皮提取物治療神經系統脫髓鞘疾病的用途

本發明屬於醫藥領域。具體而言，本發明涉及痘苗病毒致炎兔皮提取物的新治療用途。更具體而言，本發明涉及痘苗病毒致炎兔皮提取物的治療用途。更具體而言，本發明涉及痘苗病毒致炎兔皮提取物的醫藥用途，用於治療神經系統脫髓鞘疾病，特別是中樞神經系統脫髓鞘疾病。神經系統脫髓鞘疾病可以是多發性硬化症、急性播散性腦脊髓炎或者視神經脊髓炎。

神經纖維分為無髓鞘神經纖維和有髓鞘神經纖維。有髓鞘神經纖維如植物神經節前纖維和較大的軀體神經纖維，其軸索有外鞘，稱為髓鞘。髓鞘由髓鞘細胞的細胞膜構成。中樞神經的髓鞘細胞是少樹突膠質細胞。周圍神經纖維的髓鞘由施萬氏細胞的細胞膜構成。髓鞘由脂質及蛋白質組成，可保護軸索且具有對神經衝動的絕緣作用，並且可加速神經衝動的傳導。髓鞘厚的纖維衝動傳導亦快。在髓鞘遭到破壞時，傳導速度減慢。神經傳導也受溫度的影響，在髓鞘脫失時體溫的升高可引起傳導阻滯。 脫髓鞘疾病可包括中樞神經系統脫髓鞘疾病和周圍神經系統脫髓鞘疾病。臨床較為常見的中樞神經系統脫髓鞘疾病包括多發性硬化症、急性散播性腦脊髓炎、視神經脊髓炎等，近年來中樞神經系統脫髓鞘疾病發病率呈逐年升高趨勢，對患者生活品質產生嚴重影響，對患者身心健康構成嚴重威脅。 多發性硬化症(Multiple Sclerosis，MS)是以中樞神經系統白質炎性脫髓鞘病變為主要特點的疾病。本病最常累及的部位為腦白質、視神經、脊髓、腦幹和小腦，主要臨床特點為中樞神經系統白質散在分佈的多病灶與病程中呈現的緩解復發，症狀和體征的空間多發性和病程的時間多發性。多發性硬化症在2018年收錄在中國《第一批罕見病目錄》中。 急性播散性腦脊髓炎(Acute Disseminated Encephalomyelitis, ADEM)是特發性中樞神經系統脫髓鞘病的一種，兒童多見，但亦可發生於任何年齡。依據國際兒童多發性硬化研究組(International Pediatric MS Study Group, IPMSSG)的定義，ADEM是急性或亞急性起病的伴有腦病(行為異常或意識障礙)表現的、影響中樞神經系統多個區域的首次發生的脫髓鞘疾病。 視神經脊髓炎(neuromyelitis optica，NMO)是視神經與脊髓同時或相繼受累的急性或亞急性脫髓鞘病變。該病由Devic(1894)首次描述，其臨床特徵為急性或亞急性起病的單眼或雙眼失明，在其前或其後數日或數周伴發橫貫性或上升性脊髓炎，後來本病被稱為Devic病或Devic綜合征。視神經脊髓炎也在2018年收錄在中國《第一批罕見病目錄》中。 本領域中一直存在開發藥物用於減輕、緩解或治療神經系統脫髓鞘疾病的需要。 糖皮質激素類藥物已被用於多發性硬化症和急性播散性腦脊髓炎的治療中。代表性的糖皮質激素類有甲基潑尼松龍和潑尼松等(見Myhr KM等, Corticosteroids in the treatment of multiple sclerosis, Acta Neurol Scand2009: 120(Suppl. 189): 73-80)。然而，作為激素類藥物，糖皮質激素短期大量用藥會有過敏反應；而長期用藥的副作用較大，包括肌肉萎縮、肥胖、高血壓、高血脂、尿糖升高、骨質疏鬆等。因此，仍有需要開發其它藥物代替糖皮質激素來治療中樞神經系統脫髓鞘疾病，而且所述藥物不會產生糖皮質激素的副作用。 痘苗病毒致炎兔皮提取物是從接種痘苗病毒後致炎的兔的皮膚中提取的活性物質。這種痘苗病毒致炎兔皮提取物可市售獲得，商品名為立再適(Lepalvir)，用於疼痛治療。痘苗病毒致炎兔皮提取物已被證明在臨床上是安全並且不會產生上述副作用。此外，WO2020/211009公開了痘苗病毒致炎兔皮提取物用於治療造血系統損傷的用途；WO 2020/248240公開了痘苗病毒致炎兔皮提取物用於治療癌症的用途，它們的全部內容通過引用結合到本文中。 實驗性自身免疫性腦炎(experimental autoimmune encephalitis, EAE)是目前研究多發性硬化症的有效常用模型，並已廣泛應用於多發性硬化症發病機制的研究和治療藥物的探索(H. Levy等, Characterization of brain lesions in a mouse model of progressive multiple sclerosis, Experimental Neurology226(2010)148-158)。 TNF-α、IL-6均是生物體內重要的炎症因子，可以由T細胞、B細胞、樹突細胞、成纖維細胞以及平滑肌細胞等多種細胞產生，但以單核-巨噬細胞為主。IL-6作為早期炎症急性蛋白，誘導T細胞向Th17分化，啟動慢性組織損傷。IL-6與TNF-α協同作用，共同參與和加重EAE的炎症反應。研究表明，在活性MS損傷處，一系列的炎症細胞因子的水準升高，包括IL-1β、TNF-α和IL-6(Schonrock LM等, Interleukin-6 expression in human multiple sclerosis lesions. Neurosci Lett. 2000; 294:45–8；以及Hofman FM等，Tumor necrosis factor identified in multiple sclerosis brain. J Exp Med. 1989; 170:607–12)。被批准用於治療MS的那他珠單抗(Natalizumab)顯著降低MS患者腦脊液中各種炎症細胞因子例如IL-6和TNF-α的水準(J Mellergård等, Natalizumab treatment in multiple sclerosis: marked decline of chemokines and cytokines in cerebrospinal fluid, Multiple Sclerosis, 2010 Feb; 16(2)208-217)。

本發明的目的包括提供用於預防、緩解或治療神經系統脫髓鞘疾病的藥物。更具體而言，本發明的目的包括提供用於預防、緩解或治療多發性硬化症或急性播散性腦脊髓炎的藥物。 本發明的技術問題通過提供痘苗病毒致炎兔皮提取物，較佳地立再適來解決。 總體而言，發明人發現，痘苗病毒致炎兔皮提取物能夠有效預防、治療或緩解神經系統脫髓鞘疾病，特別是中樞神經系統脫髓鞘疾病，例如多發性硬化症或急性播散性腦脊髓炎。此外，發明人預料不到地發現，痘苗病毒致炎兔皮提取物治療所述疾病的效果優於被批准使用的潑尼松。這樣的效果是令人驚訝的，因為潑尼松療法已經廣泛用於多發性硬化症的臨床治療中。 在一個方面，本發明涉及痘苗病毒致炎兔皮提取物在製備用於在患者中預防或治療神經系統脫髓鞘疾病的藥物中的用途。在一個方面，本發明涉及痘苗病毒致炎兔皮提取物，其用於在患者中預防或治療神經系統脫髓鞘疾病。在一個方面，本發明涉及一種預防或治療有需要的患者中神經系統脫髓鞘疾病的方法，所述方法包括將治療有效量的痘苗病毒致炎兔皮提取物給予所述患者。 在一個方面，本發明涉及痘苗病毒致炎兔皮提取物在製備用於在患有神經系統脫髓鞘疾病的患者中恢復神經功能的藥物中的用途。在一個方面，本發明涉及痘苗病毒致炎兔皮提取物，其用於在患有神經系統脫髓鞘疾病的患者中恢復神經功能。在一個方面，本發明涉及一種在患有神經系統脫髓鞘疾病的患者中恢復神經功能的方法，所述方法包括將治療有效量的痘苗病毒致炎兔皮提取物給予所述患者。 在一個方面，本發明涉及痘苗病毒致炎兔皮提取物在製備用於在患有神經系統脫髓鞘疾病的患者中緩解或減少炎症或降低炎症細胞因子水準的藥物中的用途。在一個方面，本發明涉及痘苗病毒致炎兔皮提取物，其用於在患有神經系統脫髓鞘疾病的患者中緩解或減少炎症或降低炎症細胞因子水準。在一個方面，本發明涉及一種在患有神經系統脫髓鞘疾病的患者中緩解或減少炎症或降低炎症細胞因子水準的方法，所述方法包括將治療有效量的痘苗病毒致炎兔皮提取物給予所述患者。在該方面，所述提取物可以降低所述患者的血液、脾臟、病變部位或腦脊液的炎症細胞因子水準。在該方面，緩解或減少炎症或通過降低炎症細胞因子來實現，例如降低所述患者的血液、脾臟、病變部位或腦脊液的炎症細胞因子水準 神經系統脫髓鞘疾病可以是特徵在於或伴隨炎症細胞因子水準升高，例如IL-6或TNF-α水準升高的神經系統脫髓鞘疾病。 炎症細胞因子、炎性細胞因子和促炎性細胞因子可以互換使用，是一系列可以促進炎症的細胞因子的總稱。炎症細胞因子可以是白細胞介素(IL)或腫瘤壞死因子(TNF)，例如IL-6或TNF-α。 在一個方面，神經系統脫髓鞘疾病的治療通過在患者中緩解或減少炎症實現。在一個方面，神經系統脫髓鞘疾病的治療通過降低炎症細胞因子水準例如IL-6或TNF-α水準來實現。 較佳地的是，神經系統脫髓鞘疾病是多發性硬化症。 在一個方面，神經系統脫髓鞘疾病包括中樞神經系統脫髓鞘疾病或周圍神經系統脫髓鞘疾病，較佳地中樞神經系統脫髓鞘疾病。 在一個方面，神經系統脫髓鞘疾病包括多發性硬化症、視神經脊髓炎、急性播散性腦脊髓炎、急性出血性白質腦炎、彌漫性硬化(Schilder病)或同心圓性硬化(Balo病)，較佳地多發性硬化症或急性播散性腦脊髓炎，更佳地多發性硬化症。在一個方面，所述疾病是多發性硬化症。在另一方面，所述疾病是急性播散性腦脊髓炎。 在一個方面，神經系統脫髓鞘疾病中病變的部位包括腦白質、視神經、脊髓、腦幹或小腦。 在一個方面，恢復神經功能包括改善、緩解或消除以下症狀：感覺喪失或異常、肌肉無力、視力模糊、反射增強、痙攣、運動困難、共濟失調、肢體震顫、發音困難、吞咽障礙、眼球震顫、眼肌麻痹、視神經炎、疲勞、複視、失禁、思考障礙或認知障礙。 在一個方面，神經系統脫髓鞘疾病為多發性硬化症，其選自以下類型：臨床單一綜合征(CIS)、復發緩解型(RRMS)、繼發進展型(SPMS)、原發進展型(PPMS)或進展復發型(PRMS)。 在一個方面，痘苗病毒致炎兔皮提取物可作為唯一的活性成分用於治療神經系統脫髓鞘疾病。在該方面中，痘苗病毒致炎兔皮提取物可作為唯一的活性成分用於製備藥物，所述藥物用於治療神經系統脫髓鞘疾病，或者在患有神經系統脫髓鞘疾病的患者中恢復神經功能。在治療患者神經系統脫髓鞘疾病的方法中或者在患有神經系統脫髓鞘疾病的患者中恢復神經功能的方法中，痘苗病毒致炎兔皮提取物可作為唯一的活性成分被給予所述患者。“唯一活性成分”意味著痘苗病毒致炎兔皮提取物不與其它神經系統脫髓鞘疾病治療藥物一起使用、給予患者或者製備藥物。所述其它神經系統脫髓鞘疾病治療藥物可以是糖皮質激素類藥物，例如甲基潑尼松龍或潑尼松。本領域技術人員理解，將兩種藥物聯合給予患者並實現治療效果的提高並不意味著單獨給予這兩種藥物都分別能實現治療效果。例如，本發明提取物與糖皮質激素類藥物一起使用可能導致糖皮質激素類藥物的療效提高，但這並非意味著本發明的提取物本身就會被本領域技術人員預期有治療效果。此外，兩種藥物的聯合使用仍然無法解決糖皮質激素類藥物自身的副作用。事實上，發明人驚訝地發現，單獨使用痘苗病毒致炎兔皮提取物就能取得比單獨使用的糖皮質激素類藥物更好的療效，同時能夠避免糖皮質激素類藥物顯著的副作用。 在一個方面，本發明涉及一種藥物組合物，其包含痘苗病毒致炎兔皮提取物和任選的藥學上可接受的載體、輔料或賦形劑。在本發明的一個方面，所述藥學上可接受的載體、輔料或賦形劑是將藥物配製成口服製劑或注射劑的那些。在一個方面，所述痘苗病毒致炎兔皮提取物配被製成口服製劑或注射劑，較佳地肌肉注射劑或靜脈注射劑。在一個方面，所述痘苗病毒致炎兔皮提取物是立再適。相應地，本發明還涉及所述藥物組合物用於治療神經系統脫髓鞘疾病，或者在患有神經系統脫髓鞘疾病的患者中恢復神經功能的用途。本發明還涉及痘苗病毒致炎兔皮提取物在製備所述藥物組合物中的用途。 在一個方面，所述痘苗病毒致炎兔皮提取物是立再適。 在一個方面，所述痘苗病毒致炎兔皮提取物配製成口服製劑或注射劑，較佳地肌肉注射劑或靜脈注射劑。 在一個方面，患者是哺乳動物，較佳地人。 在一個方面，所述痘苗病毒致炎兔皮提取物以0.05 U/kg至50 U/kg，較佳地0.1 U/kg至10 U/kg，更佳地0.5 U/kg至5 U/kg的量給予患者，例如人。 在一個方面，製備的藥物包含3 U至3000 U，較佳地6 U 至600 U，更佳地30 U至300 U的所述述痘苗病毒致炎兔皮提取物。 在一個方面，所述痘苗病毒致炎兔皮提取物(較佳地立再適)以0.05 U/kg至50 U/kg，較佳地0.1 U/kg至10 U/kg，更佳地0.5 U/kg至5 U/kg的量給予患者，較佳地人。例如，所述痘苗病毒致炎兔皮提取物以選自以下的量給予患者，較佳地人：0.05 U/kg、0.06 U/kg、0.07 U/kg、0.08 U/kg、0.09 U/kg、0.1 U/kg、0.2 U/kg、0.3 U/kg、0.4 U/kg、0.5 U/kg、0.6 U/kg、0.7 U/kg、0.8 U/kg、0.9 U/kg、1 U/kg、1.5 U/kg、2 U/kg、2.5 U/kg、3 U/kg、3.1 U/kg、3.2 U/kg、3.3 U/kg、3.4U/kg、3.5 U/kg、3.6 U/kg、3.7 U/kg、3.8 U/kg、3.9 U/kg、4 U/kg、4.5 U/kg、5 U/kg、5.5 U/kg、6 U/kg、6.5 U/kg、7 U/kg、7.5 U/kg、8 U/kg、8.5 U/kg、9 U/kg、9.5 U/kg、10 U/kg、11 U/kg、12 U/kg、13 U/kg、14 U/kg、15 U/kg、16 U/kg、17 U/kg、18 U/kg、19 U/kg、20 U/kg、25 U/kg、30 U/kg、35 U/kg、40 U/kg、45 U/kg、50 U/kg以及以這些數位為邊界的範圍。本領域技術人員知曉，對於給藥量而言，人的劑量(U/kg或者mg/kg)=小鼠的劑量(U/kg或者mg/kg)/ 12.3；或者人的劑量(U/kg或者mg/kg)=小鼠的劑量(U/kg或者mg/kg)×0.08。以上劑量可以是治療患者中上述疾病的有效量。在一個方面，所述痘苗病毒致炎兔皮提取物以上述劑量注射給藥，例如肌肉注射或者靜脈注射。 在本發明一個方面，被製備的藥物或者藥物組合物包含包含3 U至3000 U，較佳地6 U 至600 U，更佳地30 U至300 U的痘苗病毒致炎兔皮提取物。所述藥物或藥物組合物被用於給予人，例如成人。成人的平均體重例如是60 kg。相應地，包含在本發明製備的藥物中的痘苗病毒致炎兔皮提取物的量例如為3 U、4 U、5 U、6 U、7 U、8 U、9 U、10 U、15 U、20 U、25U、30 U、35 U、40 U、42 U、44 U、45 U、46 U、47 U、48 U、49 U、50 U、55 U、60 U、65 U、70 U、80 U、90 U、100 U、120 U、150 U、160 U、170 U、180 U、190 U、192 U、194 U、195 U、196 U、198 U、200 U、220 U、240 U、260 U、280 U、300 U、350 U、400 U、500 U、600 U、700 U、800 U、900 U、1000 U、1500 U、2000 U、2500 U、3000 U以及以這些數位為邊界的範圍。在一個方面，所述藥物或藥物組合物被製備成注射劑，例如肌肉注射劑或者靜脈注射劑。在一個方面，所述藥物或注射劑是不能分割的固定劑量。在一個方面，所述藥物或注射劑在1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天之內不能分割成更小劑量。在一個方面，所述藥物或注射劑在1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天之內只給藥一次。 在一個方面，每隔6-72小時、較佳地12-48小時、更佳地24-36小時、更佳地24小時向所述患者給予痘苗病毒致炎兔皮提取物。 在一個方面，向患者給藥的方案為每天三次，每天二次，每天一次，兩天一次，三天一次，四天一次，五天一次，六天一次，一週一次，兩週一次，三週一次，每月一次。例如，可以向患者每天一次給予本發明的提取物。 在一個方面，向患者給予本發明的提取物持續至少24個月、至少12個月、至少6個月、至少2個月、至少1個月、至少3周、至少2周、至少10天、至少7天、至少5天、至少2天或至少1天。 本文所述的“痘苗病毒致炎兔皮提取物(extract from rabbit skin inflamed by vaccinia virus)”是指從接種痘苗病毒的發炎兔皮中例如經過浸提、純化、精製等工序提取的一種含有活性物質的提取物。這種提取物通常是黃色或淡黃色液體，但也可通過乾燥方法製成固體。這種痘苗病毒致炎兔皮提取物的注射液可市售獲得，商品名為立再適(Lepalvir)。本發明的痘苗病毒致炎兔皮提取物可包含肽。例如已經發現所述提取物中可含有天然存在的肽(即不是額外加入的肽)。所述肽可以是短肽。WO2013173941描述了從痘苗病毒致炎兔皮提取物中分離的短肽。因此，在這個方面，本發明的痘苗病毒致炎兔皮提取物可以不是非蛋白的提取物。 在本發明提取物的製備中，製備方法包括使用苯酚水溶液提取痘苗病毒接種後發炎的兔皮碎片，其中較佳地使用苯酚濃度為約1%-10%，較佳地約2%-5%，更佳地約2%或約3%的苯酚水溶液在低於約12℃下，例如約0-10℃，較佳地約2-8℃，更佳地約3-6℃，更佳地約4℃進行。此外，製備方法還包括用吸附劑(例如活性炭)吸附用苯酚水溶液處理後的提取液，並且在鹼性條件下進行脫吸附，其中較佳地吸附在酸性條件下(例如約pH3-6，更佳地約pH4-5，更佳地約pH4.5)進行，並且脫吸附的鹼性條件為約pH9-12，較佳地約pH10或pH11。 在一個方面，痘苗病毒致炎兔皮提取物或者立再適可以通過包括以下步驟的方法來製備： (1) 收集用痘苗病毒接種後發炎的兔皮，將所述兔皮碎片化，用提取溶劑提取，獲得溶液A； (2) 對溶液A進行酸和加熱處理，得到溶液B； (3) 對溶液B進行堿和加熱處理，得到溶液C； (4) 在酸性條件下對溶液C進行吸附和過濾，在鹼性條件下進行脫吸附，得到溶液D； (5) 對溶液D進行中和以及加熱處理，得到溶液E； (6) 濃縮溶液E，得到所述提取物；和 (7) 任選將提取物與藥學上可接受的載體、輔料或賦形劑混合。 在一個方面，在步驟(1)中，用痘苗病毒接種家兔，收集出痘的皮膚，將所述皮膚碎片化，加入苯酚水溶液，在低於約12℃下(例如約0-10℃，較佳地約2-8℃，更佳地約3-6℃，更佳地約4℃)下浸泡至少約12小時(例如約24-90小時，較佳地約48-72小時，更佳地約70或約72小時)，離心獲得上清液，過濾得到溶液A。所述苯酚水溶液中苯酚濃度為約1%-10%，較佳地約2%-5%，更佳地約2%或約3%。 在一個方面，在步驟(2)中，用酸(例如鹽酸)將溶液A調至酸性(例如約pH4-6，更佳地約pH4.5-5.5，更佳地約pH5)，加熱(例如在約90-100℃，較佳地約95℃下持續至少約10分鐘，例如約20-50分鐘，較佳地約30-40分鐘)，任選降溫(例如至低於約50℃，較佳地低於約30℃)，隨後離心獲得上清液，過濾後得到溶液B。所述步驟(2)可以在氮氣環境下進行。 在一個方面，在步驟(3)中，用堿(例如氫氧化鈉)將溶液B調至鹼性(例如約pH8-10，更佳地約pH8.5-9.5，更佳地約pH9或約pH9.2)，加熱(例如在約90-100℃，較佳地約95℃下持續至少10分鐘，例如約30-50分鐘，較佳地約30-40分鐘)，任選降溫(例如至低於約50℃，較佳地低於約30℃)，過濾後得到溶液C。所述步驟(3)可以在氮氣環境下進行。 在一個方面，在步驟(4)中，用酸(例如鹽酸)將溶液C調至酸性(例如約pH3-6，更佳地約pH4-5，更佳地約pH4.5)，向其中加入吸附劑(例如活性炭)進行浸泡(例如在攪拌下持續至少約1小時，較佳地約2-10小時，更佳地約4小時)，之後移除溶液並收集含有活性成分的吸附劑。隨後，將上述吸附劑加入洗脫液(例如水)中，用堿(例如氫氧化鈉)將pH調節至鹼性(例如約pH9-12，較佳地約pH10或pH11)使活性成分從吸附劑中分離(例如攪拌至少約1小時，較佳地2-10小時，更佳地4小時，隨後過濾，再用水洗滌吸附劑)，得到溶液D。所述步驟(4)可以在氮氣環境下進行。 在一個方面，在步驟(5)中，用酸(例如鹽酸)將溶液D調中和至弱酸性(例如約pH5.5-6.6，較佳地約pH6)，得到溶液E。較佳地地，所述步驟(5)可以在無菌條件下進行。 在一個方面，在步驟(6)中，將溶液E濃縮(例如減壓濃縮，較佳地減壓蒸發濃縮，例如在約50℃-70℃下，較佳地約54℃-56℃下)，隨後過濾，得到含有活性成分的提取物。所述步驟(6)可以在氮氣環境下進行。 本領域技術人員理解，本發明的提取物也可以通過用痘苗病毒接種其它動物組織獲得。例如，在本發明中，可以使用接種痘苗病毒的炎症組織提取物。所述組織可以來自哺乳動物的組織，所述哺乳動物可包括伴侶動物、實驗動物、畜牧動物，例如為兔、牛、馬、綿羊、山羊、猴、鼠、豬。所述組織可為皮膚。

具體實施方式除非另有說明，否則本文使用的所有科學術語都和本領域一般技術人員通常理解的含義一致。下文描述了示例方法和材料，可以使用其等同物。本文提及的所有出版物和其它參考文獻都通過引用整體結合到本文中。 提供以下的實施例是為了進一步闡述本發明。以下實施例無意以任何理由限制本發明的範圍。 實施例 實施例 1- 立再適對多發性硬化症 (EAE 模型 ) 的治療作用1. 試驗目的 研究立再適對多發性硬化症(EAE模型)的治療作用 2. 試驗方法 SPF級別C57BL/6小鼠，18-22g，250只，雄性。檢疫結束後，除陰性對照組16只外，其餘所有小鼠在背部皮膚分3點注射0.2mL Mog35-55乳化劑抗原(MOG35-55注射量為200ug/只)，每個部位注射1/3。第1、3天按200ng/只腹腔注射百日咳毒素。篩選動物神經功能評分約達2分的小鼠隨機分為模型對照組、醋酸潑尼松組、“立再適”低、中、高劑組，16只/組。分組後每天腹腔給予相應的受試藥物，模型對照組給予等量的生理鹽水，1次/d。在給藥第21天及第28天，每組隨機取一半小鼠進行檢測。 3. 實驗材料 3.1 受試藥物 痘苗病毒致炎兔皮提取物(“立再適”原液，簡稱LZS)。 3.2 陽性對照藥 醋酸潑尼松注射液(簡稱PA)。 4. 實驗動物分組 篩選動物神經功能評分約達2分的小鼠，隨機分為模型對照組、醋酸潑尼松組、“立再適”低(10U/Kg)、中(20U/Kg)、高劑組(40U/Kg)，16只/組。 5. 藥物配製 5.1 乳化劑配製： 將5mg MOG35-55乾粉溶於PBS中溶解至2.5mL，得到濃度為2mg/mL的溶液。將MOG35-55溶液與同體積完全弗氏免疫佐劑混合(1:1)，佐劑加結核桿菌10mg/mL，形成乳化劑。 5.2 高劑量LZS(4U/mL)： 取LZS原液以生理鹽水稀釋成4U/ml。 5.3 中劑量LZS(2U/mL)： 取高劑量LZS以生理鹽水稀釋2倍配成2U/ml。 5.4 低劑量LZS(1U/mL)： 取高劑量LZS以生理鹽水稀釋4倍配成1U/ml。 5.5 醋酸潑尼松(PA)： 取醋酸潑尼松注射液以生理鹽水稀釋到0.7mg/mL。 5.6 百日咳毒素(PTX)： 以生理鹽水溶解PTX，調整濃度到2 μg/mL。 6. 造模方法： 除了陰性對照組外，所有小鼠每只注射0.2 mL乳化劑(即MOG35-55注射量為200ug/只)。第1天經小鼠背部皮下分3點注射0.2mL抗原配劑，一點在肩部中線上，另外兩點在背部下部中線兩側。每個部位注射1/3。第1、3天腹腔注射200ng/只百日咳毒素。造模第14天，篩選出動物神經功能評分約達2分的小鼠，隨機分為模型對照組、醋酸潑尼松組、“立再適”低(10U/Kg)、中(20U/Kg)、高劑組(40U/Kg)，16只/組。 7. 給藥方法： 分組後每天腹腔給予相應的受試藥物，模型對照組給予等量的生理鹽水，1次/天。在給藥第21天及第28天，每組取8只小鼠進行檢測： 7. 檢測指標 每天觀察動物的一般臨床表現，每週測量動物的體重1次。每週進行神經功能評分1次，計算改善度。 改善度（%）=(給藥後神經功能評分-給藥前神經功能評分)/給藥前神經功能評分×100% 8. 資料統計方法： 所有資料採用( )表示，應用SPSS 21.0軟體進行統計分析；計量資料資料方差齊，或資料經轉換後方差齊，則採用組間兩兩比較的單因素方差分析方法；若資料經轉換後方差仍不齊，採用秩和檢驗進行統計分析。檢驗水準α=0.05。 9. 實驗結果 9. 1 一般觀察與體重(見表3)： 各組動物一般日常觀察未見異常表現，各組動物體重正常增長，均無統計學差異(P＞0.05)，實驗過程中無動物死亡。 9.2 神經功能評分(見表4)： 與模型對照組相比，在給藥7-28天，LZS低(10U/Kg)、中(20U/Kg)、高劑組(40U/Kg)和醋酸潑尼松組小鼠神經功能平均評分均有下降的趨勢。給藥14天，LZS中劑組和高劑組小鼠的功能評分降低均具有統計學差異(P＜0.05)，改善度分別為35.3%、55.6%。給藥21天，LZS中劑組和高劑組小鼠的功能評分降低均具有統計學差異(P＜0.05)，改善度分別為41.2%、55.6%。給藥28天，LZS低劑組、中劑組和高劑組小鼠的功能評分降低均具有統計學差異(P＜0.05)，改善度分別為38.9%、52.9%、55.6%，均優於醋酸潑尼松組的27.8%。 實施例 2- 立再適對在多發性硬化症中對炎症細胞因子的作用對實施例1中的各組動物采血後，取脾臟，冷凍保存。流式細胞術檢測脾臟中T細胞亞群(Th1、Th17、Treg、CD4+IL-10+T細胞)的比例，ELISA法檢測脾臟IL-6、TNF-α表達量。 IL-6水準：模型組小鼠在給藥23天的IL-6低於空白對照組，在給藥30天的IL-6高於空白對照組，均無統計學差異(P＞0.05)。給藥30天，陽性對照組和LZS低、中劑量組的IL-6水準顯著降低(P＜0.05)。 TNF-α水準：模型組小鼠在給藥23天的TNF-α水準低於空白對照組具有統計學差異(P＜0.04)，在給藥30天的TNF-α水準高於空白對照組，但無統計學差異(P＞0.05)。給藥30天，LZS中劑量組的TNF-α水準顯著降低(P＜0.05)。 本研究結果提示，LZS具有降低IL-6和TNF-α的作用。此外，LZS各劑量組小鼠Th1、Th17、Treg、CD4+IL-10+Tcells(%)、CD3(%)、CD4(%)、CD8(%)均無統計學差異(P＞0.05)(資料未顯示)。 綜上，使用MOG35-55免疫C57BL/6小鼠成功地誘導了自身免疫性疾病的EAE模型。LZS具有改善EAE模型小鼠的功能評分，可能通過對IL-6和TNF-α炎症因子起作用。

Claims (12)

1. 一種痘苗病毒致炎兔皮提取物在製備用於在患者中預防或治療多發性硬化症的藥物中之用途。
2. 如請求項1之用途，其中該藥物用於在患有多發性硬化症的患者中恢復神經功能的用途。
3. 一種痘苗病毒致炎兔皮提取物在製備用於在患有多發性硬化症的患者中緩解或減少炎症或降低炎症細胞因子水準的藥物中之用途。
4. 如請求項1-3中任一項之用途，其中神經系統脫髓鞘疾病中病變的部位包括腦白質、視神經、脊髓、腦幹或小腦。
5. 如請求項2之用途，其中恢復神經功能包括改善、緩解或消除以下症狀：感覺喪失或異常、肌肉無力、視力模糊、反射增強、痙攣、運動困難、共濟失調、肢體震顫、發音困難、吞咽障礙、眼球震顫、眼肌麻痹、視神經炎、疲勞、複視、失禁、思考障礙或認知障礙。
6. 如請求項1-3中任一項之用途，其中該神經系統脫髓鞘疾病為多發性硬化症，其類型選自臨床單一綜合征(CIS)、復發緩解型(RRMS)、繼發進展型(SPMS)、原發進展型(PPMS)或進展復發型(PRMS)。
7. 如請求項3之用途，其中該炎症細胞因子選自IL-6或TNF-α。
8. 如請求項1-3中任一項之用途，其中該痘苗病毒致炎兔皮提取物是立再適。
9. 如請求項1-3中任一項之用途，其中該痘苗病毒致炎兔皮提取物配製成口服製劑或注射劑，較佳地肌肉注射劑或靜脈注射劑。
10. 如請求項1-3中任一項之用途，其中該患者是人。
11. 如請求項1-3中任一項之用途，其中該痘苗病毒致炎兔皮提取物以0.05U/kg至50U/kg，較佳地0.1U/kg至10U/kg，更佳地0.5U/kg至5U/kg的量給予患者。
12. 如請求項1-3中任一項之用途，其中該藥物包含3U至3000U，較佳地6U至600U，更佳地30U至300U的該述痘苗病毒致炎兔皮提取物。