KR102033949B1 - miRNA-630 및 이의 모방체를 함유하는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하고, 서열번호 2의 염기서열과 85% 이상의 서열 상동성을 갖는 miRNA 또는 이의 모방체(mimic)를 유효성분으로 포함하는 아토피피부 개선용 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 염증성 사이토카인의 발현을 조절하여 피부 염증, 보습 및 장벽기능을 조절함으로써 아토피 피부 치료에 사용될 수 있다.

Description

miRNA-630 및 이의 모방체를 함유하는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSITION FOR IMPROVING ATOPIC DERMATITIS CONTAINING MICRO RNA-630 AND ITS MIMICS}

본 발명은 마이크로 RNA인 miRNA-630 및 이의 모방체를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 miRNA-630 및 이의 모방체를 함유하는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

일반적으로, 피부는 외부환경과 항상 접하고 있는 기관으로서, 수분손실을 막는 보호장벽으로서의 역할을 수행한다. 표피의 각질층 역시 피부에 가장 외측에 존재하면서 피부 밖으로 수분과 전해질이 소실되는 것을 억제함으로써, 피부의 건조를 막아 피부가 정상적인 대사과정을 수행할 수 있도록 환경을 제공한다. 또한, 외부의 물리적 손상과 화학물질로부터 인체를 보호하거나 세균, 바이러스 등이 피부로 침입하는 것을 막아주는 중요한 역할을 한다.

이러한 피부에 환경적, 유전적인 문제로 인하여 기능이 저하되어 생기는 질환이 아토피 피부염이다. 아토피성 피부염은 피부 장벽기능장애와 알르레기원과 미생물과 같은 환경 인자 사이의 복잡한 상호작용과 관련된 유일한 질병이다(Incovaria et al., Clin. Exp. Immunol., 153: 27-29, 2003). 멜라닌세포(melanocyte)와 각질세포(keratinocyte)를 포함하는 모든 피부세포는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)와 활성질소종(reactive nitrogen species, RNS)을 생산한다(Pelle et al., J. Invest. Dermatol., 124: 793-797, 2005;Kornina and Pastore, Front. Biosci. 1: 123-141, 2005). 덧붙여, 피부세포로부터 생성된 ROS는 또한 지질 분자 또는 리폭시게나제(lipoxigenase)와 시클로옥시게나제(cyclooxygenase)와 같은 산화환원-민감성 지질대사 효소와 반응함으로써 지질 라디칼(lipid radical), 과산화물(peroxide), 하이드로과산화물(hydroperoxide)와 같은 활성지질종(reactive lipid species) 또는 알데히드를 생산할 수 있다. 만성 염증질환인 아토피성 피부염은 그러한 산화 환원균형을 붕괴시켜서 ROS, RNS의 과잉생산과 지질 과산화물의 높은 수준을 야기하는데, 이는 결국 질병상태를 악화시키고 Th2-편향된 면역반응 쪽으로 치우치게 한다(Briganti and Picardo, J. Eur. Acad. Dermatol., 17: 663-669, 2003; Wu et al., Clin. Exp. Immunol., 135: 194-199, 2004).

피부에 나타나는 염증 반응은 붉어짐, 따끔거림, 화끈거림, 팽윤, 조직의 변화와 같은 5가지 현상으로 나타나는데, 이는 해로운 주위 환경, 즉 세균과 같은 외부 물질의 침입과 기계적 손상으로부터 생체를 보호하려는 생리적인 반응이다. 염증과 관계되는 대표적인 피부 트러블의 형태로는 아토피와 여드름 등이 있다. 특히, 아토피에 대해서 설한다면, 아토피는 심한 가려움증이 특징인데 피부에 자극을 가하면 가려움증이 더욱 심해지고, 자꾸 더 긁다보면 상처가 나게된다. 이로 인해 세균감염(황색포도상구균, 연쇄상구균 등)이 일어나게 되어 염증이 발생한다. 아토피의 문제 중에 중요한 인자의 하나는 이때 일어나는 2차 감염 및 초항원 독소이다. 아토피 환자의 80~90%는 피부에 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)과 연쇄상구균(Stereptococcus pyogenes)의 감염이 있는데, 이때 anti- Staphylococcus, IgE가 만들어지며, 이는 T-cell 반응을 자극하는 초항원 독소에 의해 유발된다. 보다 구체적으로, 이러한 황색포도상구균의 초항원 독소는 랑게르한스 세포내 항원제시세포를 통하여 T 임파구를 선택적으로 자극하여 인터루틴-1과 TNF-alpha를 생산하게 하고, 이들에 의해 자극된 T-cell에서 여러 가지 세포내 사이토카인이라는 독소를 분비하여 염증을 일으키게 된다. 즉, 초항원 독소는 인터루틴-4와 인터루틴-5의 분비를 촉진하여 IFN-gamma의 분비는 저해하고, CLA의 수를 증가시켜 결국 IgE의 생성을 촉진시킨다. 이러한 IgE에 의하여 호염구에서 히스타민이라는 물질이 분비되어 아토피 피부염이 악화된다.

일반적으로 아토피 피부염 환자는 정상인에 비하여 세균, 바이러스, 곰팡이에 의한 피부 감염이 잘 발생하는 것으로 알려져 있다. 특히 아토피 환자의 90%가 피부에 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus)이 집적되어 번식하고 있으며, 많은 연구 결과들을 통해서 아토피 환자의 상피세포에 황색 포도상구균의 감염되어 있음이 알려져 있다. 그러나 이런 아토피 환자에게 상피세포에 포도상 구균의 감염 및 번식하는 기전은 명확하지 않다. 아토피성 질환 부모의 소아에서 아토피성 피부염의 빈도가 높아 유전적인 소인이 있는 것으로 추정되고, 아토피성 피부염을 가지고 있는 모체로부터 수유기간이 증가할수록 아토피성 피부염의 발생 빈도도 증가하는 것으로 알려지고 있다

이들 포도상구균에 의한 피부 감염증은 주로 각질층 내의 세라마이드(Ceramides)의 함량을 감소시킴으로써 발생한다. 아토피는 각질층의 수분유지기능이 떨어짐에 따라 피부가 건조되어 각질이 다량 일어나며, 피부장벽 기능이 저하됨에 따라 자극유발물질이 각질층 내로 침입하여 자극을 유발시켜 정상피부에서는 침입하기 어려운 항원 단백질이 침입하며, 피부 알러지 등이 용이하게 발생하여 심한 소양증을 나타낸다. 따라서, 아토피 환자의 90% 이상이 포도상구균에 감염되어 있으며, 이것은 환자가 가려움을 참지 못하여 긁어서 생기기도 하지만 세균의 외독소가 우리 몸의 면역체계를 자극하여 알레르기를 일으키는 화학물질을 나오게 하여 아토피를 악화시킨다.

이러한 문제를 해결하기 위하여, 현재 일반적으로 사용되고 있는 아토피 피부를 치료하는 방법으로는 보습제 사용, 타르제제 사용, 바르거나 먹는 스테로이드제제 사용, 자외선 치료, 클린다마이신, 디클록사시린(dicloxacilline)과 같은 항생제, 항소양제, 과망간산칼륨(potassium permanganate), 세트리마이드(cetrimide), 클로르헥시딘(chlorhexidine), 클로옥시레놀(chloroxylenol), 디브로모프로파미딘(dibromopropamidine), 폴리녹시린(polynoxylin), 포비돈 아이오다인(povidone iodine), 트리클로산(triclosan)과 같은 항균제, 면역 관련 치료제, 식품, 향기, 한방 등의 방법을 사용하고 있다.

그러나, 타르제제는 알코올 성분이 있어 냄새가 좋지 않고 건조한 피부를 자극하는 단점이 있고, 스테로이드 제제는 발진, 피부색 변화, 고혈압, 백내장 등의 부작용이 심각하며, 자외선 치료는 햇볕의 화상, 가려움증 유발, 색소 침착과 장기간 치료 시에는 피부의 조기 노화와 암의 위험이 높고, 항생제는 주로 내복약으로 사용하는 단점이 있다.

Micro RNA는 인트론 부위에 위치하며 크기는 17~25의 뉴클레오타이드로서 매우 작은 유전물질로서 세포의 유전자 발현을 선택적으로 조절하여, 세포의 성장, 분화, 노화, 활성 등에 관여하는 역할을 한다. 인간에게는 1000개의 마이크로 RNA가 존재할 것으로 추정되며, 각각의 마이크로 RNA에 대한 세포 내 기전 규명은 활발히 진행중이다.

현재까지 밝혀진 miRNA는 주로 암과 같은 질병이나 발달과정과 관련된 것들이다. 예를 들어 miR-17과 miR-92는 전사인자인 E2F1의 발현을 직접적으로 조절하여 세포의 증식을 촉진하며 유방암, 폐암, 결장암, 위암, 췌장암에서 과발현되어 있다고 보고되었다. 또한, miR-29a는 미토콘드리아 외막에 존재하여 세포 사멸을 억제시키는 Mcl-1 유전자의 발현을 직접적으로 제어하여 세포사멸(Apoptosis)을 유발하고 miR-21은 종양억제유전자인 PTEN의 발현을 직접적으로 조절하여 세포 사멸을 저해하고 정상세포를 종양세포로 형질 전환시키며 다양한 암종에서 과발현되어 있다고 보고되었다.

반면 피부에서의 miRNA의 역할에 대한 연구는 초기단계이며 현재까지 밝혀진 miRNA 중 대표적인 예로, 2011년 miR-125b가 각질형성세포 내 FGFR2의 유전자 발현을 직접적으로 조절하여 건선(psoriasis)를 조절할 수 있다고 보고되었다. 그 외에도 miR-152 및 mir-630은 세포외기질(extra-cellular matrix)을 조절하여 피부진피세포의 노화를 조절하고, miR-434-5p가 피부세포의 미백에 관여한다는 보고 등이 있다. 이처럼 피부에서도 피부노화현상과 관련하여 miRNA가 중요한 역할을 수행할 것으로 보이며 향후 피부노화에서의 miRNA의 역할은 학술적 또는 산업적으로 큰 가치를 지닐 것으로 판단된다.

한국등록특허 제10-1776000호는 miR-181a 및 이의 모방체를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

이에, 본 발명자는 염증성 사이토카인 발현 억제 효과, NF-κB 활성 억제효과, 보습효과, 피부 장벽기능 개선 효과를 지니는 신규 물질을 찾는 연구를 수행한 결과 miR-630 또는 이의 모방체(mimic)가 그 효능이 매우 우수하다는 것을 발견하게 되었다.

본 발명의 목적은 miR-630 또는 이의 모방체(mimic)를 함유하여 아토피 피부개선용 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하고, 서열번호 2의 염기서열과 85% 이상의 서열 상동성을 갖는 마이크로 RNA 또는 이의 모방체를 유효성분으로 포함하는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

바람직하게는, 상기 화장료 조성물은 NF-κB의 활성을 조절한다.

또한 바람직하게는, 상기 화장료 조성물은 염증성 사이토카인의 발현 억제효과를 갖는다.

또한 바람직하게는, 상기 화장료 조성물은 보습 효과를 갖는다.

또한 바람직하게는, 상기 화장료 조성물은 피부장벽기능 개선 효과를 갖는다.

본 발명에 miR-630 및 이의 모방체를 유효성분으로 포함하는 조성물은 NF-κB 활성 억제효과(실험예 1), 염증성 사이토카인의 발현 억제 효과(실험예 2), 보습 효과(실험예3), 피부장벽기능 개선 효과(실험예 4)를 갖는다.

도 1은 서열번호 2 내지 14에 따른 IkB 단백질량의 발현 정도를 나타내는 그래프이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 하기의 정의를 가지며 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미에 부합된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다. 용어 약이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, 포함하다 및 포함하는 이란 말은 제시된 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "씨드 서열(seed sequence)"는 마이크로 RNA 염기서열 내에 타겟 mRNA에 완벽하게 일치하여 붙는 염기서열을 뜻하며 타겟 단백질, 유전자 발현 등에 관여하는 서열을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "서열 상동성"은 기준이 되는 서열의 뉴클레오타이드와 구성이 일치하는 정도를 퍼센트로 나타낸 것을 의미한다.

본 발명은 피부각질형성세포의 분화 및 피부 보습 조절용 조성물로서, 서열번호 1의 염기서열을 포함하고 총 15 내지 22개의 올리고뉴클레오타이드, 바람직하게는 22개의 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 마이크로 RNA 또는 이의 모방체(mimic)를 유효성분으로 포함하는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

5' - GUAUUC - 3' (서열번호 1)

또한, 본 발명은 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 서열번호 2의 염기서열은 서열번호 1의 올리고뉴클레오타이드를 포함하며 miR-630와 동일한 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이다.

5' - AGUAUUCUGUACCAGGGAAGGU - 3' (서열번호 2)

본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하면서 서열번호 2의 염기서열과 85% 이상의 서열 상동성을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는 본 발명은 서열번호 2의 염기서열과 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 상기 범위보다 낮은 서열 상동성을 갖는 경우에는 다른 염기서열과의 결합이 약하거나 제한되어서 원하는 효과를 얻을 수 없다.

또한, 본 발명에서 본 발명에서 85% 이상의 서열 상동성을 갖는다는 것은 씨드 서열(서열번호 1)을 포함하면서 기준 서열(서열번호 2)의 올리고뉴클레오타이드를 기준으로 3개의 뉴클레오타이드가 변형된 것을 의미하고, 90% 이상의 서열 상동성을 갖는다는 것은 2개의 뉴클레오타이드가 변형된 것을 의미하고, 95% 이상의 서열 상동성을 갖는다는 것은 1개의 뉴클레오타이드가 변형된 것을 의미한다. 기준 서열의 올리고뉴클레오타이드의 길이는 15 내지 22개로 변형될 수 있으나, 본 발명에서는 하나의 뉴클레오타이드가 변형되는 경우 5% 서열 상동성이 감소되는 것으로 볼 것이다.

아토피나 건선과 같은 난치성 피부질환의 중요 요인 중 하나가 염증에 의한 피부질환이며, 이들의 공통점은 염증악화에 의해 병변이 증가된다는 점인데, 공통적으로 발견되는 염증 원인이 NF-κB 과활성화로 인한 증상 악화이다. 따라서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 조성물은 상기 NF-κB의 활성을 조절하여 염증성 사이토카인의 발현을 억제시킬 수 있다. 염증성 사이토카인의 발현이 감소하면 염증반응을 감소시킴으로써 아토피피부 개선용 조성물로서 이용될 수 있다.

본 발명에서 miR-630는 인간 또는 마우스로부터 유래된 것일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 서열번호 1의 염기서열을 갖는 miRNA를 이용하여 miR-630 및 이의 모방체(mimic)로 miR-630과 동일/유사한 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 분자를 제작할 수 있다. 또한, hsa-miR-630의 모방체(mimic)는 상기 hsa-miR-630 염기서열과 유사한 서열로서, NF-κB의 활성을 억제하고 염증성 사이토카인 유전자의 발현을 조절하는 기능을 수행하는 것들을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 올리고뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드 분자로 이루어질 수도 있다. 예컨대, 2'-O-알킬(예: 메틸, 에틸), 2'-O-알릴, 2'-O-알릴과 같은 2'-치환된 라이보스를 포함하는 뉴클레오타이드 분자를 부분적으로 또는 전체적으로 포함할 수 있다. 또한, 치환된 염기를 갖는 뉴클레오타이드 분자를 부분적으로 또는 전체적으로 포함할 수도 있다.

본 발명은 본 발명에 따른 마이크로 RNA 또는 이의 모방체를 유효성분으로 포함하여 NF-κB 활성 억제효과, 염증성 사이토카인 발현 억제효과, 보습효과 및 피부장벽기능 개선효과를 갖는 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 본 발명에 따른 마이크로 RNA 또는 이의 모방체는 조성물의 전체 중량에 대해서 0.00001 ~ 30.0 중량% 함유되며, 더욱 바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오타이드를 화장료 조성물의 전체 중량에 대해서 0.001 ~ 10 중량% 함유되는 것을 특징으로 한다. 상기 올리고뉴클레오타이드의 함량이 0.00001 중량% 미만인 경우에는 피부 개선 효과가 나타나지 않으며, 30.0 중량%를 초과하는 경우에는 함유량 증가에 대한 피부 개선 효과 증대 정도가 미미하며, 제형상의 안전 및 안정성에 문제가 있으며 경제적이지도 못하다.

따라서, 상기 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 아토피피부 개선용 화장료 조성물은 염증성 사이토카인 발현 억제 효과, NF-κB 활성 억제효과, 보습효과, 피부 장벽기능 개선 효과를 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 화장료 조성물은 리보핵산 분해효소의 활성을 저해시키는 성분을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 대한민국 등록특허 제10-1675916호 및 대한민국 특허출원 제10-2016-0055465호에 기재된 바와 같이 천녀목란 추출물 및 정향 추출물을 포함할 수 있다. 다만 이에 한정되지 않으며 리보핵산 분해효소의 활성을 저해시킬 수 있는 모든 성분을 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 상기 유효 성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다. 본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로 서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다. 본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다. 본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 제형 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클렌징 제형은 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실험예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실험예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예의 제조: miR -630 및 이의 모방체의 제조

miRNA-630 및 이의 모방체의 농도가 100nM가 되도록 리포좀(liposome)을 이용하여 인간 피부 섬유아세포에 트렌스펙션하였다. 트렌스펙션은 TransITsiQUEST 트렌스펙션 reagent(Mirus, PanVera, Madison, WI)를 이용하여 제조사의 사용법에 따라 수행하였다. miR-630과 동일한 염기서열의 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)는 서열번호 2이고, miR-630에서 씨드서열 외의 염기서열에서 1개의 염기가 다른 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 3, 4, 5 및 6이고, miR-630에서 씨드서열 외의 염기서열에서 2개의 염기가 다른 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 7, 8, 9 및 10이고, miR-630에서 씨드서열 외의 염기서열에서 3개의 염기가 다른 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 11, 12, 13 및 14이다. 이들을 세포 내로 주입하여 miR-630의 과발현을 유도할 수 있다. 대조군으로는 현재까지 알려진 어떤 miRNA와도 중복되지 않는 올리고뉴클레오타이드(- control)를 트렌스펙션시킨 샘플을 이용하였다. 실험에 사용된 miR-630 및 이의 모방체의 염기서열은 표 1과 같다.

시료명	염기서열
서열번호 2	5'- AGUAUUCUGUACCAGGGAAGGU - 3'
서열번호 3	5'- AGUAUUCUGUACGAGGGAAGGU - 3'
서열번호 4	5'- AGUAUUCUGUACCAGGAAAGGU - 3'
서열번호 5	5'- AGUAUUCUGUACCAGGGAAUGU - 3'
서열번호 6	5'- AGUAUUCUGUACCAUGGAAGGU - 3'
서열번호 7	5'- AGUAUUCUGUACCGGGCAAGGU - 3'
서열번호 8	5'- AGUAUUCUGUACCAGGGACCGU - 3'
서열번호 9	5'- AGUAUUCUGUACCAAGGAAGCU - 3'
서열번호 10	5'- AGUAUUCUGUACCAGGCUAGGU - 3'
서열번호 11	5'- AGUAUUCUGUGGAAGGGAAGGU - 3'
서열번호 12	5'- AGUAUUCUGAACCAGCGAAGCU - 3'
서열번호 13	5'- AGUAUUCUGUACCACGGAACGG - 3'
서열번호 14	5'- AGUAUUCUGUACGAGGGCGGGU - 3'

실험예 1: miR -630 및 이의 모방체의 NF - κB 활성 조절효과

miR-630 및 이의 모방체가 염증반응에 중요한 전사인자인 NF-κB의 활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. NF-κB는 세포질에서 IkB라는 단백질과 결합한 상태로 존재할 때는 IkB에 의해 활성이 저해되지만, 특정 신호가 전달되어 IkB가 인산화되어 분해되면서 IkB로부터 떨어져 핵으로 이동하게 되고 염증반응과 관련된 유전자의 발현을 조절한다.

miR-630 및 이의 모방체가 NF-κB의 활성을 조절하는지 확인하기 위해 서열번호 2 내지 14를 트랜스펙션시킨 각질형성세포(HaCaT)에 20ng/ml의 TNF-α를 처리하여 염증반응을 유발시켰다. 구체적으로, TNF-α를 처리한 서열번호 2 내지 14를 트랜스펙션한 세포를 1% NP-40 및 complete proteinase inhibitor(Roche)를 포함하는 PBS(phosphate-buffer saline)로 처리하여 세포 용해액을 수득한 뒤 동일한 양(20 μg)의 SDS-PAGE를 수행하여 단백질을 분리시킨 다음, 니트로셀룰로오스 멤브레인에 옮겼다. 이후 상기 트랜스퍼한 멤브레인을 5% 스킴밀크로 30분간 블로킹한 후, 항-Ikb(abcam. USA) 및 항-β-actin 항체(모노클로날항체, abcam, USA) 1차 항체와 함께 배양한 후 항-토끼 HRP(horseradish peroxidase)-융합 2차 항체(abcam, USA)와 함께 배양하였다. 그 후 각 멤브레인에 화학발광 솔루션(chemiluminescence solution, Thermo Fisher cientific., USA)을 처리한 뒤, 단백질 발현을 확인하였다. 단백질의 발현정도는 β-actin으로 정규화(normalization)하고 Image J 프로그램을 이용하여 정량하였다. 그 결과를 도 1에 나타냈다.

도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 서열번호 2 내지 14를 트랜스펙션한 각질형성세포에서 TNF-α에 의해 감소된 IkB 단백질량을 현저히 증가시킴을 알 수 있었으며, 이를 통해 서열번호 2 내지 14가 NF-κB의 활성을 감소시켰음을 확인할 수 있다.

실험예 2: miR -630 및 이의 모방체의 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제효과

실험예 2는 제조예 2 내지 14의 miR-630 및 이의 모방체의 자외선 조사에 의해 발현되는 염증성 사이토카인 발현 억제 효과를 평가하기 위한 것으로서, 24-웰 시험 플레이트에 5x10⁴ 개씩 넣고 24시간 동안 부착시킨 각질형성세포(HaCaT)세포에 서열번호 2 내지 14를 트랜스펙션시킨 뒤 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500 ㎕의 PBS를 넣었다. 이 각질형성세포에 자외선B(UVB) 램프(Model: F15TB, UV B 15W, Sankyo Dennki사 Japan)을 이용하여 자외선 10 mJ/cm²를 조사한 후 배양 상층액을 150 ㎕을 취하여 IL-1 α을 정량함으로써 서열번호 2 내지 14의 염증성 사이토카인 발현 억제 효과를 판단하였다. IL-1 α의 양은 효소 면역 분석법(Enzyme-linked immunosorbent assay)을 이용하여 정량화하였으며, 염증성 사이토카인(IL-1 α)의 발현 억제율(%)은 하기 수학식 1에 따라 계산하였다.

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 IL-1 α 생성량

Bt : 자외선 조사하고 시료 처리하지 않은 웰의 IL-1 α 생성량

St : 자외선 조사하고 시료 처리한 웰의 IL-1 α 생성량

시료명	염증성 사이토 카인 발현 억제율 (%)
서열번호2	72.74 ± 1.56
서열번호3	70.18 ± 2.11
서열번호4	69.84 ± 1.89
서열번호5	70.21 ± 0.86
서열번호6	69.44 ± 1.01
서열번호7	66.84 ± 1.18
서열번호8	67.22 ± 1.21
서열번호9	67.10 ± 0.72
서열번호10	67.52 ± 0.83
서열번호11	66.70 ± 0.72
서열번호12	65.10 ± 0.93
서열번호13	66.52 ± 0.84
서열번호14	65.17 ± 1.12
인도메타신 100ppm	61.23 ± 0.81
무처치	8.24 ± 0.35

표 2에 따르면, 서열번호 2 내지 14를 트랜스펙션한 세포는 자외선에 의한 염증성 사이토카인인 IL-1 α의 생성을 억제하는 것을 알 수 있었다. 본 발명에 따른 서열번호 2 내지 14는 염증성사이토카인 발현 억제물질인 인도메타신보다도 우수한 염증성 사이토카인 발현 억제율을 보임을 알 수 있었다.　따라서 본 발명의 서열번호 2 내지 14는 자외선 조사에 의한 염증 발생을 효과적으로 방어함을 알 수 있다.

제형예 1 내지 7. miR-630 및 miR-630의 모방체를 함유하는 화장료 조성물의 제조

miRNA-630 및 이의 모방체인 서열번호 2 내지 4, 7, 8, 11 및 12를 포함하는 화장료(제형예 1 내지 7)를 제조하였으며, 효능의 비교를 위해 miRNA-630 및 이의 모방체 대신에 보습제로서 글리세린 및 1,3-부틸렌글리콜을 포함하는 화장료 조성물(비교제형예 1), miR-630 및 이의 모방체나 보습제를 모두 포함하지 않는 화장료 조성물(비교제형예 2)을 하기 표 3과 같이 제조하였다.

구분	성분	제형예1	제형예2	제형예3	제형예4	제형예 5	제형예 6	제형예 7	비교제형예1	비교제형예2
A	서열번호2	0.01	-	-	-	-	-	-	-	-
	서열번호3	-	0.01	-	-	-	-	-	-	-
	서열번호4	-	-	0.01	-	-	-	-	-	-
	서열번호7	-	-	-	0.01		-	-	-	-
	서열번호8	-	-	-	-	0.01	-	-	-	-
	서열번호11	-	-	-	-	-	0.01	-	-	-
	서열번호12	-	-	-	-	-	-	0.01	-	-
	1,3-부틸렌글리콜	-	-	-	-	-	-	-	5	-
	글리세린	-	-	-	-	-	-	-	5	-
	정향추출물	1	1	1	1	1	1	1	1	1
	천녀목란추출물	1	1	1	1	1	1	1	1	1
	EDTA-2Na	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02
	정제수	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100
B	피이지-60하이드로 제네이티드캐스터오일	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
	폴리에틸렌 글라이콜400	3	3	3	3	3	3	3	3	3
	마이크로크리스탈린	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3
	솔비탄스테아레이트	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
	토코페릴아세테이트	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
	사이클로메치콘	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3
	BHT	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05
C	향,방부제	적량	적량	적량	적량	적량	적량	적량	적량	적량

실험예 3: miR-630 및 이의 모방체의 보습효과

상기 제형예의 화장료 조성물에 대한 임상 보습효과를 다음과 같이 측정하였다. 설문 조사를 통하여 피부가 건조하다고 느끼는 건강한 남녀 135명을 무작위로 15명씩 9개 그룹(A 내지 I)으로 나눈 후, A, B, C, D, E, F 및 G 그룹에는 제형예 1 내지 7의 화장료 조성물을, H 그룹에는 비교제형예 1의 화장료 조성물을, I 그룹에는 비교제형예 2의 화장료 조성물을 각각 1일 2회씩 4주간 안면에 도포하게 하였다. 보습효과는 실사용 시험 시작 후 매 2주간, 그리고 종료 후의 개선 효과를 Corneomater CM820 (Corage + Khazaka, Germany)를 이용하여 평가하였다. 그 결과는 하기의 표 4에 나타내었다.

구분	사용 전	사용 2주 후	사용 4주 후
제형예 1	30.15	45.48	55.89
제형예 2	29.15	44.15	53.52
제형예 3	28.98	44.19	53.29
제형예 4	30.81	43.98	54.01
제형예 5	30.11	42.15	51.45
제형예 6	30.43	42.17	52.32
제형예 7	31.21	41.88	52.19
비교제형예 1	30.3	42.1	50.9
비교제형예 2	28.5	29.4	28.9

상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 일반 다른 보습제를 함유한 비교제형예 1과 비교하여도, 본 발명의 miR-630 및 이의 모방체를 함유한 제형예 1 내지 7의 보습효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

실험예 4 : miR -630 및 이의 모방체의 피부장벽기능 개선효과

상기 제형예 1 내지 7 및 비교제형예 1 및 2의 피부장벽기능 개선 효과를 평가하였다. 20세 이상 성인 남녀 90 명을 무작위로 10 명씩 9개 그룹(1 내지 9그룹)으로 나눈 후, 전박에 1.0% SLS 수용액 20 μl를 finn-chamber 적용하여 16시간 첩포함으로써 피부장벽기능을 일시적으로 손상시켰다. 그 후 1 내지 7 그룹에는 제형예 1 내지 7의 화장료 조성물을, 8 그룹에는 miR-630 및 이의 모방체 대산에 보습제로서 글리세린 및 1,3-부틸렌글리콜을 포함하는 화장료 조성물(비교제형예 1), 9 그룹에는 추출물 및 보습제를 포함하지 않는 화장료 조성물(비교제형예 2)을 각각 1일 2회씩 1주간 도포하게 하였다. 피부장벽기능 개선효과는 SLS 첩포전, 첩포후, 제형도포 후 7일간 매일 경피수분손실량(Transepidermal Water Loss; TEWL)을 측정하였으며 결과를 표 5에 나타내었다.

	시험전	SLS 첩포후	Day1	Day2	Day3	Day4	Day5	Day6	Day7
제형예 1	6.7	21.7	17.3	9.2	7.0	6.5	6.3	6.0	6.2
제형예 2	6.4	21.5	18.7	9.7	7.6	6.8	6.7	6.4	6.5
제형예 3	6.7	21.8	18.8	9.8	7.5	6.8	6.7	6.6	6.7
제형예 4	6.6	22.0	18.3	10.1	7.6	6.7	6.6	6.6	6.5
제형예 5	6.7	21.2	19.4	11.3	8.1	6.8	6.4	6.7	6.8
제형예 6	6.7	21.9	19.3	11.8	8.0	6.6	6.6	6.7	6.7
제형예 7	6.6	21.6	18.8	10.9	7.8	6.8	6.5	6.8	6.7
비교제형예 1	6.4	21.4	17.5	13.3	8.2	6.8	6.5	6.5	6.6
비교제형예 2	6.3	22.2	20.4	19.5	18.7	17.8	15.7	13.6	10.7

상기 표 5에서 알 수 있듯이, 제형예 1 내지 7을 도포한 부위가 비교제형예 1 및 2에 비해 더 빠르게 장벽기능을 회복시키는 것을 확인할 수 있었다.

<110> COREANA COSMETICS CO., LTD. <120> COSMETIC COMPOSITION FOR IMPROVING ATOPIC DERMATITIS CONTAINING MICRO RNA-630 AND ITS MIMICS <130> DP-2017-0184 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 6 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-630 seed sequence <400> 1 guauuc 6 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-630 <400> 2 aguauucugu accagggaag gu 22 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 3 aguauucugu acgagggaag gu 22 <210> 4 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 4 aguauucugu accaggaaag gu 22 <210> 5 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 5 aguauucugu accagggaau gu 22 <210> 6 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 6 aguauucugu accauggaag gu 22 <210> 7 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 7 aguauucugu accgggcaag gu 22 <210> 8 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 8 aguauucugu accagggacc gu 22 <210> 9 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 9 aguauucugu accaaggaag cu 22 <210> 10 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 10 aguauucugu accaggcuag gu 22 <210> 11 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 11 aguauucugu ggaagggaag gu 22 <210> 12 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 12 aguauucuga accagcgaag cu 22 <210> 13 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 13 aguauucugu accacggaac gg 22 <210> 14 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 14 aguauucugu acgagggcgg gu 22

Claims (5)

1. 서열번호 1의 염기서열을 포함하고, 서열번호 2의 염기서열과 85% 이상의 서열 상동성을 갖는 마이크로 RNA를 유효성분으로 포함하는, 아토피 피부 개선용 화장료 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 화장료 조성물은 NF-κB의 활성 억제효과를 갖는, 아토피 피부 개선용 화장료 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 화장료 조성물은 염증성 사이토카인 발현 억제 효과를 갖는, 아토피 피부 개선용 화장료 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 화장료 조성물은 보습증진 효과를 갖는, 아토피 피부 개선용 화장료 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   상기 화장료 조성물은 피부장벽기능 개선 효과를 갖는, 아토피 피부 개선용 화장료 조성물.

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