CN115154609B - Il-37的抑制剂在制备治疗色素沉着增多性皮肤病药物中的应用 - Google Patents

Il-37的抑制剂在制备治疗色素沉着增多性皮肤病药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了IL‑37的抑制剂在制备治疗色素沉着增多性皮肤病药物中的应用。本发明的实验结果发现IL‑37处理人色素细胞和皮肤后，其黑素含量明显增多，黑素生成关键基因MITF、TYR、TYRP1、DCT的表达水平也显著上调，同时酪氨酸酶活性也显著增强。本研究结果提示IL‑37是调控黑素生成的关键炎症因子，可以作为色素沉着增多性皮肤病的候选治疗药物或治疗靶点。

Description

IL-37的抑制剂在制备治疗色素沉着增多性皮肤病药物中的 应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及IL-37的抑制剂在制备治疗色素沉着增多性皮肤病药物中的应用。
背景技术
色素沉着增多性皮肤病在临床上十分常见。紫外线辐射、烧伤、创伤和炎症等都可导致皮肤色素沉着过度，其需要数月甚至数年才能消退，严重影响患者的外观。尽管异常色素沉着的潜在机制仍不清楚，但一些炎性细胞因子已被确定为潜在因素。色素沉着是黑素生成过程协调一致的结果，黑素生成过程涉及黑素在黑素细胞中的产生和运输，然后在角质形成细胞中分布和降解。最近的研究表明，一些炎症因子可以调节黑素生成。例如，IL-17和TNF协同抑制PKA和MAPK信号通路以减少黑素生成，IL-1β、IL-4、IFN-γ、IL-6和IL36-γ通过阻断NF-κB、JNK、JAK2-STAT6和STAT1或其他信号通路来抑制黑素生成。相反，IL-33和IL-18通过激活PKA和p38/MAPK信号通路增强黑素生成。因此，有必要确定调节黑素生成的核心炎症因子，并探索其潜在机制，为治疗或预防色素沉着增多性皮肤病提供新的靶点和思路。
IL-37是IL-1家族的一员，可以通过结合IL-18Rα和招募IL-1R8来抑制促炎基因的转录，从而抑制炎症和免疫反应。在银屑病、类风湿性关节炎、狼疮、和特异性皮炎等皮肤疾病中发挥重要调节作用。然而，目前尚无研究报道IL-37是否参与调控黑素生成。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是探究IL-37在黑素生成中的调控作用，提供一种新的治疗色素沉着增多性皮肤病的药物。
本发明的技术方案是：
本发明提供了IL-37的抑制剂在制备治疗色素沉着增多性皮肤病药物中的应用。
优选的，所述色素沉着增多性皮肤病包括黄褐斑，雀斑、咖啡斑。
本发明还提供了IL-37的抑制剂在制备酪氨酸酶抑制剂中的应用。
本发明还提供了IL-37的抑制剂在制备调控黑素生成抑制剂中的应用。
本发明的实验结果发现IL-37处理人色素细胞和皮肤后，其黑素含量明显增多，黑素生成关键基因MITF、TYR、TYRP1、DCT的表达水平也显著上调，同时酪氨酸酶活性也显著增强。本研究结果提示IL-37是调控黑素生成的关键炎症因子，可以作为色素沉着增多性皮肤病的候选治疗药物或治疗靶点。
以下结合附图和具体实施方式对本发明的详细结构作进一步描述。
附图说明
图1是在黄褐斑数据集GSE72140中行相关性分析，发现IL37与黑素生成高度正相关图。
图2是氨银染色法检测不同浓度IL37处理细胞细胞的黑素含量、人包皮组织的黑素含量图，其中图2（A）是氨银染色法检测不同浓度IL37处理后细胞的黑素含量图；图2（B）是氨银染色法检测不同浓度IL37处理后人包皮组织的黑素含量图。
图3是不同浓度的IL-37处理MNT1细胞后的检测图，其中图3（A）是用不同浓度的IL-37处理MNT1细胞后，qRT-PCR检测MITF、TYR、TYRP1和DCT mRNA水平图；图3（B）是用不同浓度的IL-37处理MNT1细胞后，WB检测MITF、TYR、TYRP1和DCT蛋白质水平图；图3（C）是用不同浓度的IL-37处理MNT1细胞后，L-DOPA法测定酪氨酸酶活性图。
图4是在扁平苔癣数据集GSE130403中分析IL37在皮损组（LP）与非皮损组（non_lesion）中mRNA表达情况的箱式图。
具体实施方式
实验方法：
1、细胞培养和处理
黑素生成研究工具细胞MNT1在含有20％胎牛血清（美森, 中国浙江）, 1%非必需氨基酸（Gibco, 美国）, 1％青霉素-链霉素抗生素（Biosharp, 中国合肥）和不同浓度IL37(Cloud-Clone Corp, 中国武汉)的DMEM培养基（Gibco, 美国）中培养24或48小时。细胞培养于37℃且含5％CO2的培养箱中。
、人体皮肤培养
经捐献者和湘雅三医院伦理委员会批准，从包皮环切术后的健康男性包皮中获取人皮肤样本。从包皮样本中去除皮下组织和脂肪，然后将包皮切成2 cm2的切片。皮肤切片放置在含10%FBS、1%青霉素/链霉素/两性霉素B和IL37（0、50、100、200 ng/ml）的DMEM培养基上，表皮朝上，真皮向下。培养皿在37℃和5%CO2下培养5天。
、氨银染色
用4%中性多聚甲醛（Biosharp，中国合肥）固定细胞。使用氨银溶液（Sloarbio，中国北京）以染色黑色素。通过倒置显微镜（奥林巴斯 X71）观察并记录黑色素。
、RT-PCR
通过快速提取RNA试剂盒（FASTAGEN, 中国上海）提取总RNA，并使用逆转录试剂盒（TransGen，中国北京）逆转为cDNA。qPCR SuperMix (TransGen，中国北京) 用于qRT-PCR分析。所有反应均在实时PCR仪器（Roche LightCycler480II，德国）上进行。mRNA表达量的计算以GAPDH为内参。
、Western blot（WB)分析
使用含蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物（Roche, Basel,Switzerland）的RIPA裂解缓冲液（Thermo Fisher, 中国上海）提取细胞的总蛋白。10％SDS-PAGE电泳分离总蛋白，并将蛋白转移到PVDF膜上。 用0.1％BSA封闭后，将膜与一抗在4°C孵育过夜，然后在室温下与二抗（1：10000， LI-COR Biosciences，美国）孵育1小时。通过增强的LI-COR Odyssey红外成像系统（LI-COR Biosciences，NE，美国）检测蛋白含量。GAPDH为内参。
、酪氨酸酶活性测定
收集IL37处理48h后的细胞，用PBS清洗，并计数。在4°C下用500μL 0.5%脱氧胆酸钠溶液孵育15分钟，然后在37°C下孵育10分钟以释放TYR。添加1mL 0.1%左旋多巴底物溶液后，立即将200μL等量液体添加到96孔板中。使用多模平板读取器在0分钟（A0）和30分钟（A30）时测量475 nm处的吸光度。TYR活性计算为（A30-A0）/细胞数。
、统计分析
使用GraphPad Prism 8.0.2软件进行统计学分析，多组比较均采用单变量方差分析（ANOVA）。P <0.05被认为具有统计学意义，*表示P <0.05，**表示P <0.01，***表示P <0.001。
实验结果：
1、IL37与黑素生成正相关
在黄褐斑数据集GSE72140中行相关性分析，发现IL37与黑素生成高度正相关（图1）。
、IL-37促进MNT1细胞和人皮肤的黑素生成
不同浓度IL-37处理细胞或皮肤组织后：通过氨银染色法检测色素细胞（图2A）和人包皮切片（图2B）的黑素含量，发现与未处理组相比，IL37处理组黑色素含量均增加。
、IL-37上调黑素生成相关基因
我们进一步研究了IL-37对黑素生成相关基因的影响，包括MITF、TYR、TYRP1和DCT。IL-37处理能显著上调MNT1细胞中的MITF、TYR、TYRP1及DCT mRNA（图3A）和蛋白质（图3B）的表达水平；此外，IL-37还以浓度依赖性的方式增强MNT1细胞中的酪氨酸酶活性（图3C）。
、IL37在扁平苔癣中的表达情况
在扁平苔癣数据集GSE130403中分析IL37在皮损组与非皮损组中mRNA表达情况（图4），发现IL37的表达水平无显著差异性，提示IL37可能与扁平苔癣的发生发展无关。
实验结论：
1、IL-37能促进色素细胞和人皮肤的黑素生成；
2、IL-37可能通过促进黑色素形成相关基因(MITF、TYR、TYRP1和DCT)的表达，增强酪氨酸酶活性来促进黑素生成。
本发明的实验结果发现IL-37处理人色素细胞和皮肤后，其黑素含量明显增多，黑素生成关键基因MITF、TYR、TYRP1、DCT的表达水平也显著上调，同时酪氨酸酶活性也显著增强。本研究结果提示IL-37是调控黑素生成的关键炎症因子，可以作为色素增加性皮肤病的候选治疗药物或治疗靶点。

Claims (2)

1.IL-37在制备酪氨酸酶活性增强剂中的应用。
2.IL-37在制备黑色素生成促进剂中的应用。
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