CN114344466B

CN114344466B - Pcsk9抑制剂在制备用于治疗角化异常性疾病的产品中的应用

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Publication number: CN114344466B
Application number: CN202110743738.7A
Authority: CN
Inventors: 陈敏; 请求不公布姓名
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Priority date: 2020-10-14
Filing date: 2021-06-30
Publication date: 2024-01-02
Anticipated expiration: 2041-06-30
Also published as: CN114344466A

Abstract

本发明提供了PCSK9抑制剂在制备用于治疗角化异常性疾病的产品中的应用，PCSK9蛋白为前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型，属前蛋白转换酶家族。本发明有益效果是：本发明提供的PCSK9抑制剂的应用，为痤疮等角化异常性疾病的治疗提供了新的、更好的治疗制剂，可进一步制备系统或外用的PCSK9抑制剂产品，进而开发出包含各类PCSK9抑制剂的单体新药或复方制剂，用于治疗痤疮等角化异常性疾病。研究结果证明此类包含PCSK9抑制剂的药物疗效显著、副作用小、患者耐受性好，尤其是仅外用也能明显改善症状，非常适宜于目前的临床需求，可为市场提供一系列疗效好、安全、经济的新产品。

Description

PCSK9抑制剂在制备用于治疗角化异常性疾病的产品中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及PCSK9在制备用于治疗角化异常性疾病的产品中的作用。

背景技术

痤疮(俗称青春豆)是好发于毛囊皮脂腺的慢性炎症性疾病，发病率约9.4％，已成为世界第8大流行性疾病。于青春期多见，痤疮的产生与青春期皮肤的生理病理变化密切相关。临床表现主要有粉刺、丘疹、脓疱、结节、囊肿、疤痕等，愈合时间长，给患者的容貌和心理带来严重的影响。痤疮与多个发病机制相关，毛囊口角化异常是本病发病的重要基础，炎症和感染是痤疮的发病因素。痤疮患者的皮脂腺较大，皮脂腺分泌增加，皮脂中亚油酸水平相对减少，影响脂肪的合成，导致滤泡上皮缺乏脂肪酸，从而诱导滤泡过度角化，使上皮细胞不能正常脱落，毛囊皮脂腺口过度变小，皮脂不能顺畅排出，形成粉刺。毛囊皮脂腺口被堵塞而形成毛囊皮脂腺内缺氧的环境，造成厌氧性的痤疮丙酸杆菌大量繁殖，分解皮脂，产生化学趋化因子，白细胞聚集形成丘疹。毛囊皮脂腺内的大量中性粒细胞聚集，吞咽痤疮丙酸杆菌后发生炎症反应，使得大量脓细胞堆积而形成脓疱、囊肿，愈后易形成凹陷性疤痕。当面部、额部、颊部、下颌部、胸部、背部及肩部出现大小不等的结节、囊肿，常继发化脓感染，破溃后常流出带血的胶冻状脓液，以后形成窦道。雄激素水平升高是加速痤疮产生的关键环节，使皮肤角化异常堵塞毛囊皮脂腺导管，导致细菌滞留、繁殖，产生炎症。

与痤疮具有类似角化异常机制的疾病包括鱼鳞病、毛周角化病(又名毛发苔藓)、毛囊角化病和汗孔角化症等，毛周角化病见毛囊口扩大，内有角栓，鱼鳞病表现为汗腺和皮脂腺减少，毛囊内出现角质性栓塞。

以上疾病容易反复出现，治疗困难。治疗角化异常，消除角栓和粉刺的药物主要是维甲酸类药物。维甲酸类药物可抑制角化，减少皮脂分泌，促进角质形成细胞的正常角化，并具有调节免疫和抗炎作用，从而减少粉刺、丘疹和脓疱的形成，在临床上被广泛应用来治疗痤疮、鱼鳞病、毛周角化病、毛囊角化病和汗孔角化症等角化异常性疾病。但维甲酸类药物外用对皮肤有刺激，容易导致红肿、刺痛，加重原有皮损，长期外用维甲酸类药物可导致皮肤变薄，光敏和皮肤屏障受损等，而口服维甲酸类药物有肝损和血脂升高等不良反应。因此，临床上需要更多治疗此类疾病的药物。

另一方面，面部痤疮粉刺在人群中非常普遍，使皮肤看起来暗黄粗糙、毛孔粗大，影响美观，市场上真正能够解决此问题的产品非常稀缺，因此，需要寻找安全、有效的控制粉刺的产品来满足广大爱美群体的需求。

前蛋白转化酶枯草杆菌转化酶(Recombinant Proprotein ConvertaseSubtilisin/Kexin Type 9，PCSK9)是前蛋白转换酶家族中的一员，前蛋白转换酶在肝脏内作为一种不活跃酶原分泌。PCSK9基因cDNA的大小为3617bp，编码692个氨基酸组成的PCSK9蛋白。PCSK9前体在内质网内经过分子内自动催化分离其N-末端前肽，分离后的N-末端前区与催化区相连，允许成熟的PCSK9蛋白离开内质网并进入分泌途径。PCSK9分泌至细胞外后，在细胞表面的第一表皮生长因子样区域与低密度脂蛋白(LDL)受体结合，PCSK9-LDL受体复合体可进入溶酶体降解，从而导致细胞表面LDL受体下降，即PCSK9水平与LDL受体成负相关关系。而多项研究显示，PCSK9基因的突变功能丧失可使不同人种的LDL-C水平及冠心病发生率明显下降。鉴于抑制PCSK9对降低LDL-C及冠心病发生率的显著作用，已有多项治疗方案正在研发阻断PCSK9的药物，用于降低LDL-C及冠心病的发生率。

PCSK9抑制剂包括两大类：1、阻止PCSK9与LDL-R的结合，如单抗、模拟肽(多肽抑制剂)、模拟抗体蛋白药；2、抑制PCSK9分子的表达或干扰PCSK9分泌，如小分子干扰RNA、反义寡核苷酸、小分子化合物抑制剂等。单克隆抗体由于阻断效率高、靶位准确和稳定性好而成为新药研究的热点。目前，全球上市的PCSK9靶向单抗药物，均为阻止PCSK9与LDL-R结合的药物。包括安进(Amgen)和安斯泰来(Astellas)联合开发的的evolocumab(依洛尤单抗)，商品名Repatha(瑞百安)；赛诺菲(Sanofi)和再生元(Regeneron)联合开发的alirocumab(阿利西尤单抗，阿利珠单抗)，商品名Praluent(波立达)，以及Eli lilly公司的LY3015014，君实生物的重组人源化抗PCSK9单克隆抗体(JS002)，和信立泰药业的重组全人源抗PCSK9单克隆抗体注射液。临床研究发现，以上药物治疗高胆固醇血症耐受性良好，安慰剂组与积极治疗组不良反应的发生率无明显区别。此外，Inclisiran是一款siRNA(小干扰RNA)药物，不同于直接与PCSK9分子结合的单抗，它可以抑制PCSK9基因的表达，使LDL受体不会因PCSK9而被降解，从而改善肝细胞对LDL颗粒的摄取，降低血液中的LDL水平。Alnylam公司的Inclisiran采用专有技术，由脂质纳米颗粒与GalNAc(N-乙酰半乳糖胺)结合而成，而GalNAc可与肝细胞表面表达的唾液酸糖蛋白受体ASGR1和ASGR2结合。该技术允许皮下给药并靶向肝脏。Affiris公司的ALN-PCS和ALN-PCSsc也属于siRNA(小干扰RNA)药物。PCSK9干扰RNAI抑制剂药物还有Alnylam公司的Inclisran，Affiris公司的ALN-PCS和ALN-PCSsc。辉瑞公司设计的一种相关的疫苗药物，以及Affiris公司的AT04A和AT06A疫苗，患者只需每年接受一次疫苗即可达到长期降低LDL的效果，可以减少使用频率。PCSK9模拟肽和PCSK9模拟抗体蛋白药药物研发包括Pieris公司的DS9001和Merck公司的1G08等。PCSK9反义寡核苷酸药物包括Santaris Pharma公司的SPC5001等。

到目前为止，尚未见到应用PCSK9抑制剂治疗痤疮、鱼鳞病、毛周角化病、毛囊角化病和汗孔角化症等角化异常性疾病的相关文献、专利和产品。

发明内容

本发明需要解决的问题是：通过动物模型明确PCSK9基因在治疗痤疮、鱼鳞病、毛周角化病、毛囊角化病和汗孔角化症等角化异常性疾病机制中的作用，以及PCSK9抑制剂在制备治疗痤疮、鱼鳞病、毛周角化病、毛囊角化病和汗孔角化症等角化异常性疾病的药物中的应用。本研究人员首次发现敲除PCSK9基因能够明显抑制痤疮皮损的形成，PCSK9抑制剂能够明显改善粉刺，抑制毛囊内角栓的形成。由于目前还没有成熟的鱼鳞病、毛周角化病、毛囊角化病和汗孔角化症等疾病的动物模型，本发明通过建立兔耳痤疮模型，发现了PCSK9基因在痤疮发病机制中起关键作用，以及PCSK9抑制剂在制备治疗痤疮的药物中的应用价值。

本发明的技术方案：

痤疮的发病机制复杂，其中皮肤毛囊口的异常角化是本病发病的重要基础。毛囊皮脂腺口被角质细胞堵塞，角化物和皮脂充塞其中，形成粉刺，导致毛孔堵塞，痤疮杆菌、金黄葡萄球菌生长，侵害皮肤组织。丙酸痤疮杆菌可诱导和改变补体的激活路径，有助于炎症反应。鱼鳞病、毛周角化病(又名毛发苔藓)等角化异常性疾病的发病机制中表现为与痤疮类似出现角栓，见毛囊口扩大。由于目前尚没有成熟的鱼鳞病、毛周角化病、毛囊角化病和汗孔角化症等角化异常性疾病的动物研究模型，因此本研究选取兔耳痤疮粉刺模型作为代表来研究PCSK9在以上角化异常性疾病的发病机制中的作用，以及PCSK9抑制剂在改善皮肤角化异常，抑制角栓形成中的作用。

维甲酸类药物可抑制角化，促进角质形成细胞的正常角化，并具有调节免疫和抗炎作用，从而减少粉刺、丘疹和脓疱的形成。阿达帕林可通过调节毛囊皮脂腺上皮角化异常过程来去除角质栓，从而起到防止及消除粉刺皮损的作用，故本研究选择阿达帕林(商品名：达芙文)作为实验的阳性对照品，达芙文是目前治疗痤疮粉刺、消除角栓的金标准药物。

兔耳是一种常用来衡量引起粉刺物质作用强度的动物模型，兔和人一样毛囊皮脂腺大小变化很大。动物随着年龄的增加，形成粉刺的能力也增加，因此选择成年雄性家兔来复制痤疮模型，使其体内的雄性激素对皮肤具有一定的刺激作用。

本发明于新西兰家兔耳内侧面涂2％煤焦溶液，每天1次，连续涂14d，建立痤疮微粉刺模型，肉眼观察耳厚薄、硬度、粗糙程度和毛囊口有无黑色角栓等局部皮肤的变化，进行镜下实验性粉刺组织学分级评分。通过以上研究发现，PCSK9基因敲除能明显抑制煤焦油诱导的兔痤疮模型症状，减少毛孔堵塞，明显抑制黑头粉刺形成，证实PCSK9在痤疮的发病机制中起着关键作用。

本发明所述的PCSK9基因编码的蛋白是前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型，属前蛋白转换酶家族，genebank序列号：255738。

本发明所述的抑制PCSK9基因表达的物质，可以为常规的任何的分子生物学，或者通过药物化学手段能够抑制PCSK9基因表达或者产生作用的产品或方法，例如但不限于通过现有分子生物学技术对PCSK9基因进行敲除或者沉默；在一些实施例中，还可以采用PCSK9基因抑制剂，所述PCSK9基因抑制剂包括但不限于PCSK9小分子化合物抑制剂、PCSK9干扰RNA、PCSK9单克隆抗体、PCSK9模拟肽、PCSK9模拟抗体蛋白、PCSK9反义寡核苷酸或PCSK9疫苗等。

本发明在能够明显阻断PCSK9的抑制剂中，分别选取了具有代表性的PCSK9单克隆抗体、PCSK9多肽抑制剂、PCSK9小分子化合物抑制剂和PCSK9小干扰RNA，通过皮下注射或者皮肤外用治疗兔耳痤疮模型，与阴性对照组和阳性药物(达芙文)比较。结果发现，PCSK9抑制剂组的症状均明显轻于模型对照组，各PCSK9抑制剂组均未出现局部和全身不良反应，如红斑、水肿、脱屑等，家兔活动和觅食正常，未见呼吸和中枢神经系统异常表现。实验证实，系统或外用PCSK9抑制剂均能明显抑制兔耳痤疮模型症状，减少毛囊角栓和黑头粉刺形成，并对皮肤温和无刺激，显示PCSK9抑制剂对痤疮具有明显的治疗作用。

本领域技术人员公知，基于疾病的共同发病机制和以上实验显示的结果，可以推测PCSK9抑制剂(阻断剂)对其他角化异常性疾病也具有治疗作用，包括鱼鳞病、毛周角化病、毛囊角化病和汗孔角化症等。PCSK9抑制剂(阻断剂)可以单独使用，也可以联合其他药物或者治疗方法一起使用，包括传统药物和其他靶向生物制剂。

基于上述研究，本发明涉及了PCSK9抑制剂(阻断剂)在制备用于治疗角化异常性疾病的药物中的应用，其中所述PCSK9属前蛋白转换酶家族；所述角化异常性疾病包括痤疮、鱼鳞病、毛周角化症、毛发苔藓、毛囊角化病和/或汗孔角化症；优选为痤疮。

进一步的，上述的应用，所述PCSK9抑制剂包括但不限于PCSK9小分子化合物抑制剂、PCSK9单克隆抗体、PCSK9干扰RNAi抑制剂、PCSK9模拟肽、PCSK9模拟抗体蛋白、靶向PCSK9的反义寡核苷酸或PCSK9疫苗；优选为PCSK9小分子化合物抑制剂、PCSK9干扰RNAi抑制剂或PCSK9单克隆抗体。

进一步地，所述PCSK9小分子化合物或PCSK9干扰RNA或PCSK9单克隆抗体或PCSK9模拟肽或PCSK9模拟抗体蛋白或PCSK9反义寡核苷酸或PCSK9疫苗在制备系统或者外用治疗痤疮、鱼鳞病、毛周角化症、毛囊角化病和汗孔角化症等角化异常性疾病的产品中的应用。

进一步的，上述的应用，所述的PCSK9小分子化合物包括但不限于如式(Ⅰ)、式(Ⅱ)、式(Ⅲ)或式(Ⅳ)所示的化合物；

其中，式(Ⅰ)化合物，化学式为C₂₄H₂₇N₃O₂，分子量为389.49；式(Ⅱ)化合物，化学式为C₂₂H₂₀ClN₇O，分子量为434.5；式(Ⅲ)化合物，化学式为C₃₁H₃₃N₃O₅，分子量为527.62；式(Ⅳ)化合物，化学式为C₂₆H₂₇N₃O₂，分子量为413.51。

进一步的，上述的应用，所述PCSK9单克隆抗体包括但不限于PCSK9小鼠单克隆抗体mAbcam84041、依洛尤单抗、阿利西尤单抗、重组人源化抗PCSK9单克隆抗体JS002、重组全人源抗PCSK9单克隆抗体注射液或PCSK9抑制剂LY3015014。

进一步的，上述的应用，

所述PCSK9干扰RNAi抑制剂包括但不限于Inclisran注射剂、ALN-PCS注射剂或ALN-PCSsc注射剂；

所述模拟肽包括但不限于小鼠PCSK9多肽ab32727；

所述PCSK9模拟抗体蛋白包括但不限于模拟抗体蛋白药DS-9001或作用于PCSK9羧基末端结构域的人类抗体-抗原结合片段1G08；

所述靶向PCSK9的反义寡核苷酸包括但不限于Santaris Pharma公司的SPC5001；

所述PCSK9疫苗包括但不限于疫苗类PCSK9抑制剂AT04A或疫苗类PCSK9抑制剂AT06A。

进一步的，上述的应用，所述用于治疗角化异常性疾病的药物中，还包括与PCSK9抑制剂配合使用的辅剂或联合用药，所述联合用药选择为维甲酸类或果酸类产品，辅剂选择为现有可适用的所有药用辅剂；联合用药优选为异维A酸、阿达帕林、维胺酯和果酸等。

本发明所述的“产品”，可以为任何适合于根据药学领域中常用的方法施用至患者的制剂，例如药品等。

本发明所述的产品可以施用于哺乳动物，例如大鼠、小鼠、家畜、人等；在一些具体实例中为人。

本发明与现有技术相比其有益效果是：本发明提供了PCSK9抑制剂在制备用于治疗角化异常性疾病的药物中的应用，为痤疮、鱼鳞病、毛周角化症、毛囊角化病和汗孔角化症等角化异常性疾病的治疗提供了新的、更好的治疗制剂，通过本发明的揭示可进一步制备系统或外用的PCSK9抑制剂(阻断剂)产品，进而开发出包含各类PCSK9抑制剂的单体新药或复方制剂，用于治疗痤疮、鱼鳞病、毛周角化症、毛囊角化病和汗孔角化症等角化异常性疾病。已经有的研究结果证明此类包含PCSK9抑制剂的药物疗效显著、副作用小、患者耐受性好，尤其是仅仅外用也能明显改善症状，非常适宜于目前的临床需求。可为市场提供一系列疗效好、安全、经济的新产品。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明，均属于本发明的保护范围。

实施例1：

PCSK9基因敲除对兔耳痤疮模型的影响：

1.实验方法：

1.1动物分组与造模：

实验动物：SPF级新西兰家兔，PCSK9-/-SPF级新西兰家兔(利用CRISPR基因编辑技术，敲除Pcsk9基因exon 2-3，建立Pcsk9基因敲除兔模型)，1.8～2.3kg，雄性。动物来源于南模生物。

分组与造模：将不同基因型兔分三组：阴性对照组、模型对照组和PCSK9-/-模型组，每组6只。取兔右耳内侧脱毛处理作为观察区，阴性对照组涂95％酒精；模型对照组和PCSK9-/-模型组均涂2％煤焦油溶液(Alfa Aesar中国公司)，用95％酒精配制成2％的煤焦油溶液，用无菌棉签均匀涂于家兔耳内侧面耳导管开口处约2cm×2cm范围，每天1次，每次0.5mL，并且用温水擦拭前次涂药部位，连续涂14d，建立痤疮微粉刺模型。肉眼观察局部皮肤的变化，耳厚薄、硬度、粗糙程度和毛囊口有无黑色角栓等。末次涂18h后处死取材，使用5mm打孔器在涂药部位打孔取皮肤组织，10％甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色后，进行病理组织学观察分析。

1.2观察指标：

痤疮模型组织学判定分级标准：按组织学级别为3级，分别为：

0级为漏斗部仅有松散的角化的细胞，无粉刺生成，以“—”表示；

1级为兔耳表面皮肤发红，或毛囊漏斗部见少量致密角化物质，漏斗部不扩张，以“+”表示；

2级为毛囊漏斗部见中等致密角化物质，并向皮脂腺延伸，伴随皮脂腺导管的增生，漏斗扩张，以“2+”表示；

3级为毛囊内有广泛的角化物质，毛囊中紧密的角质栓塞引起毛囊重度扩张，皮脂腺导管上皮明显增生，皮肤凸起、瘢痕，部分皮脂腺发生退行变，以“3+”表示。

2.实验结果：

涂煤焦油14d后，阴性对照组兔耳柔软、薄白，毛细血管清晰，兔耳管开口处可见毛孔大小均匀。模型对照组兔耳厚度增加、变硬，毛囊口有黑色角栓，呈黑头粉刺状，毛囊口隆起呈丘疹状，表面粗燥，触之较硬，部分融合成片。PCSK9-/-模型组兔的外耳道皮肤轻微干燥，毛孔稍有增大，肉眼观察未见有黑色物质堵塞毛孔，未见丘疹。

组织切片观察：与阴性对照组比较，模型对照组兔耳见不同程度的颗粒层、棘层肥厚，毛囊口角质化，皮肤组织结构被破坏，PCSK9-/-模型组仅见皮肤棘层轻微增厚，毛囊面积轻度增大。各组镜下实验性粉刺组织学分级见表1。

表1各组镜下实验性粉刺组织学分级

组别	n	—	1级+	2级+	3级+
						阴性对照组	10	10	0	0	0
模型对照组	10	0	1	4	5
						PCSK9-/-模型组	10	8	2	0	0

从表1可以看出，敲除Pcsk9基因的模型组，确实能够有效的降低痤疮微粉刺的发病率，也由此可知，抑制Pcsk9基因也确实能够达到类似的效果。

3.实验结论：

PCSK9基因敲除能明显抑制煤焦油诱导的兔痤疮模型症状，减少毛孔堵塞，明显减少黑头粉刺形成。充分说明，PCSK9基因确实能够影响痤疮的发生通路，也为抑制PCSK9的表达(PCSK9抑制剂)在针对痤疮治疗药物的中的应用提供了基础理论支撑。

实施例2：

PCSK9抑制剂对兔耳痤疮模型的影响：

1.实验方法：

1.1材料：

(1)PCSK9干扰RNA-1序列及修饰如下表2所示。

表2

将siPcsk9-1和2等量混合后用生理盐水稀释至20μM，取稀释后siRNA与润肤液均匀混合。

PCSK9干扰RNAi抑制剂-2：RNA序列与Alnylam公司的Inclisran相同；PCSK9干扰RNAi抑制剂-3：RNA序列与Affiris公司的ALN-PCS相同。

(2)PCSK9小分子化合物抑制剂1：Selleck公司产品R-IMPP，化学式：C₂₄H₂₇N₃O₂，分子量：389.49，结构式：PCSK9小分子化合物抑制剂2：Selleck公司产品PF-06446846，化学式：C₂₂H₂₀ClN₇O，分子量：434.04，结构式：/>PCSK9小分子化合物抑制剂3：Selleck公司产品SBC-115076，化学式：C₃₁H₃₃N₃O₅，分子量：527.61，结构式：/>PCSK9小分子化合物抑制剂4：Selleck公司产品SBC-110736，化学式：C₂₆H₂₇N₃O₂，分子量：413.51，结构式：/>

(3)PCSK9单克隆抗体1：购于Abcam公司(ab84041)；PCSK9单克隆抗体2：evolocumab(依洛尤单抗)；PCSK9单克隆抗体3：alirocumab(阿利西尤单抗)。

(4)PCSK9多肽：Abcam公司的ab32727。

(5)阳性治疗药：0.1％阿达帕林凝胶(商品名：达芙文，法国高德美制药公司生产)

(6)实验动物：普通级新西兰家兔，1.9～2.4kg，雄性，来源于上海斯莱克实验动物有限责任公司。

(7)治疗乳膏制备方法：赋形剂基质组成成分包括甲基硅油(15％)、硬脂酸(6％)、白凡士林(5％)、液体石蜡(5％)、十八醇(5％)、甘油(20％)、烷基芳基聚乙醇醚(1％)、脂肪醇聚氧乙烯醚(1％)、吐温-807(1％)、尼泊金乙酯(0.1％)、蒸馏水(约31-55％)，分别与适量以上PCSK9抑制剂混匀形成混合乳剂。本实施例所用的乳膏基质是指乳膏除去活性成分的基质成分。

1.2动物分组与造模：

按体重编号，采用随机排列表法分为化合物组1(皮肤涂抹0.1％R-IMPP乳膏，每天2次)、化合物组2(皮肤涂抹0.1％PF-06446846乳膏，每天2次)、化合物组3(皮肤涂抹0.1％SBC-115076乳膏，每天2次)、化合物组4(皮肤涂抹0.1％SBC-110736乳膏，每天2次)、PCSK9干扰RNA组1(皮肤涂抹0.1％PCSK9小干扰RNA-1乳膏，每天2次)、PCSK9干扰RNA组2(皮肤涂抹0.1％Inclisran乳膏，每天2次)、PCSK9干扰RNA组3(皮肤涂抹0.1％ALN-PCS乳膏，每天2次)、单抗组1(皮下注射PCSK9单克隆抗体ab81041，1mg/kg.d)、单抗组2(皮下注射evolocumab，1mg/kg.d)、单抗组3(皮下注射alirocumab，1mg/kg.d)、多肽组(皮下注射Abcam公司ab32727,0.5mg/kg.d)、联合治疗组1(皮肤涂抹0.1％PF-06446846乳膏和0.1％阿达帕林凝胶，每天分别2次)、联合治疗组2(皮肤涂抹0.1％PCSK9小干扰RNA-1乳膏和0.1％阿达帕林凝胶，每天分别2次)、阳性治疗组(涂抹0.1％阿达帕林凝胶)、模型对照组(涂抹乳膏基质)，每天2次，每组10只。取兔右耳内侧脱毛处理作为观察区，所有家兔左耳作为自身阴性对照，涂抹95％酒精，模型组和治疗组右耳内侧均涂2％煤焦油(Alfa Aesar中国公司，用95％酒精配制成2％的煤焦油溶液)，用无菌棉签均匀涂于家兔耳内侧面耳导管开口处约2cm×2cm范围，每天1次，每次0.5mL，并且用温水擦拭前次涂药部位，连续涂14d，建立痤疮微粉刺模型。肉眼观察局部皮肤的变化，包括耳厚薄、硬度、粗糙程度和毛囊口有无黑色角栓等。末次涂18h后处死取材，使用5mm打孔器在涂药部位打孔取皮肤组织，10％甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色后，进行病理组织学观察分析。

1.3观察指标：

痤疮模型组织学判定分级标准：按组织学级别为3级。0级“—”为漏斗部仅有松散的角化的细胞，无粉刺生成；1级为兔耳表面皮肤发红，或毛囊漏斗部见少量致密角化物质，漏斗部不扩张“+”；2级为毛囊漏斗部见中等致密角化物质，并向皮脂腺延伸，伴随皮脂腺导管的增生，漏斗扩张“2+”；3级为毛囊内有广泛的角化物质，毛囊中紧密的角质栓塞引起毛囊重度扩张，皮脂腺导管上皮明显增生，皮肤凸起、瘢痕，部分皮脂腺发生退行变“3+”。

在显微镜下观察其组织病理改变情况，并用Biomias99图像分析系统测量一张切片上5处不同表皮的厚度，计算平均值；检测4张切片中位置相同而结构最完整的2个毛囊的面积和4个皮脂腺的直径，计算各自的平均值，然后将各组兔左、右外耳道数据相减，即得各兔的左、右耳表皮厚度差、毛囊面积差和皮脂腺直径差。

1.4统计学处理：

用SPSS16软件进行统计分析。自身左右对照采用配对t检验，各组间比较用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2.实验结果：

肉眼观察：涂煤焦油14d后，所有组兔左耳皮肤柔软，其外耳道毛囊口排列整齐，未见粉刺、丘疹及脓疱等。模型对照组兔右耳涂煤焦油后耳厚度增加、变硬，表面粗燥，毛囊口有黑色角栓，形成黑头粉刺，毛囊口隆起呈丘疹状，触之较硬，部分融合成片。siPcsk9治疗组右耳表现为耳部皮肤粗燥肥厚，丘疹较前变平，仍可见毛囊角栓，毛孔稍由缩小。小分子化合物治疗组表现为兔右耳与左耳相比，皮肤变薄，大部分毛囊性丘疹消退，粉刺减少变平，毛孔缩小，皮肤稍干燥。单抗治疗组、多肽治疗组和联合治疗组右耳表现为皮肤变薄柔软，粉刺减少，毛孔明显缩小，无脱屑，基本接近正常兔耳。阳性治疗组兔右耳与左耳相比，皮肤轻度发红，有少许脱屑，少量毛囊角栓和粉刺，未见丘疹。

组织切片观察：模型组左耳显示表皮较薄，可见毛囊，真皮与表皮交界清楚。模型组右耳造模后见表皮增厚，角化过度，颗粒层和棘层增厚，毛囊扩大，角栓堵塞毛囊口，并向皮脂腺延伸，毛囊漏斗部充满角化物质并扩大呈壶状；真皮上层毛细血管扩张，毛囊周围散在炎症细胞浸润，少量中性粒细胞浸润；皮脂腺数量增多，皮脂腺体积增大。

各组镜下实验性粉刺组织学分级(见表3)：模型组兔右与其左耳(空白对照)进行比较，差异有统计学意义(P<0.05)，各治疗组兔右耳与模型组兔右耳进行比较，差异均有统计学意义(P均<0.05)。各组痤疮粉刺的组织学分级如下表3所示。

表3各组痤疮粉刺的组织学分级

组别/组织学分级	n	_	1+	2+	3+
						模型组左耳	10	10	0	0	0
模型组右耳	10	0	1	5	4
						化合物组1	10	6	3	1	0
化合物组2	10	7	2	1	0
						化合物组3	10	5	3	2	0
化合物组4	10	5	2	3	0
						单抗组1	10	8	2	0	0
单抗组2	10	9	1	0	0
						单抗组3	10	9	1	0	0
干扰RNA组1	10	4	5	1	0
						干扰RNA组2	10	6	3	1	0
干扰RNA组2	10	5	4	1	0
						多肽组	10	5	4	1	0
联合治疗组1	10	8	2	0	0
						联合治疗组2	10	8	1	1	0
阳性治疗组	10	6	2	2	0

从表3可以看出，具有抑制PCSK9功效的化合物组1-4、单抗组1-3、干扰RNA组1-3、多肽组以及联合治疗组与模型组右耳相比，均具有不同程度的效果提升，其中单抗组1-3的效果要优于其它组别，考虑其主要原因在于给药方式为注射，属于体内给药，故而效果更优，其它组别均为外用涂抹，效果相应会有所降低，但也均优于模型组右耳，同时，也与阳性治疗组治疗效果相当，尤其是其中的联合治疗组，其治疗效果已经达到了与效果最好的单抗组相近似的程度，考虑到联合治疗组采用的是外用涂抹的方式，给药方式要比单抗组跟容易，发明人认为，联合治疗组必然产生了比单独使用更加优异的效果。

模型组兔右耳表皮厚度、毛囊画积和皮脂腺直径与其左耳(空白对照)进行比较，差异有统计学意义(P<0.05)，提示兔耳痤疮模型复制成功；各治疗组兔右耳表皮厚度、毛囊画积和皮脂腺直径与模型组兔右耳进行比较，差异均有统计学意义(P<0.05)(见表4)。各组耳表皮厚度、毛囊面积和皮脂腺直径如下表4所示。

表4各组耳表皮厚度、毛囊面积和皮脂腺直径

组别	n	表皮厚度(mm)	毛囊面积(mm²)	皮脂腺直径(mm)
					模型组左耳	10	0.1238±0.0082*	0.1052±0.0978*	0.0426±0.0695*
模型组右耳	10	0.2913±0.0242	0.4821±0.1743	0.4127±0.1436
					化合物组1	10	0.2433±0.0196*	0.2726±0.0842*	0.0512±0.0327*
化合物组2	10	0.1968±0.0121*	0.2353±0.0812*	0.0467±0.0313*
					化合物组3	10	0.2245±0.0185*	0.2836±0.0851*	0.0542±0.0346*
化合物组4	10	0.2276±0.0193*	0.2853±0.0879*	0.0561±0.0362*
					单抗治疗组1	10	0.2325±0.0189*	0.2218±0.0826*	0.0465±0.0312*
单抗治疗组2	10	0.1532±0.0156*	0.1533±0.0562*	0.0432±0.0267*
					单抗治疗组3	10	0.1547±0.0149*	0.1526±0.0723*	0.0435±0.0285*
干扰RNA组1	10	0.2546±0.0211*	0.2954±0.1065*	0.0781±0.0518*
					干扰RNA组2	10	0.1856±0.0179*	0.1836±0.0856*	0.0561±0.0423*
干扰RNA组3	10	0.1987±0.0185*	0.1921±0.0933*	0.0615±0.0476*
					多肽组	10	0.2362±0.0192*	0.2462±0.1142*	0.0532±0.0415*
联合治疗组1	10	0.1723±0.0115*	0.2046±0.0782*	0.0448±0.0296*
					联合治疗组2	10	0.1851±0.0118*	0.2136±0.0789*	0.0463±0.0302*
阳性治疗组	10	0.2461±0.0205*	0.2915±0.0867*	0.0569±0.0836*

*为与模型组右耳比较P<0.05。

从表4可以看出，模型组右耳与模型组左耳和阳性治疗组相比，其表皮厚度、毛囊面积及皮脂腺直径均有大幅增长，而化合物组1-4、单抗组1-3、干扰RNA组1-3、多肽组以及联合治疗组与模型组左耳相比，虽也略有增长，但增长幅度不大，其中，单抗治疗组2-3的数据值与模型组左耳基本相当，考虑其主要原因在于给药方式为注射，属于体内给药，故而效果更优，其它组别均为外用涂抹，效果相应会有所降低，但也均优于模型组右耳，同时，也与阳性治疗组治疗效果相当，尤其是其中的联合治疗组，其治疗效果已经达到了与效果最好的单抗治疗组2-3相近似的程度，考虑到联合治疗组采用的是外用涂抹的方式，给药方式要比单抗组跟容易，发明人认为，联合治疗组同样产生了比单独使用更加优异的效果。

3.实验结论

PCSK9小分子化合物抑制剂、PCSK9干扰RNA、PCSK9单克隆抗体、PCSK9多肽抑制剂均能明显抑制煤焦油诱导的兔耳痤疮模型症状，减少毛孔堵塞和黑头粉刺形成，并对皮肤温和无刺激，显示对痤疮具有治疗作用。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110> 陈敏

<120> PCSK9抑制剂在制备用于治疗角化异常性疾病的产品中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1

gccuggaguu uauucggaa 19

<210> 2

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

uuccgaauaa acuccaggc 19

<210> 3

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

agguguaucu ccuagacac 19

<210> 4

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 4

gugucuagga gauacaccu 19

Claims

1.PCSK9抑制剂在制备用于治疗角化异常性疾病的产品中的应用，其特征在于，所述PCSK9蛋白为前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型，属前蛋白转换酶家族；所述角化异常性疾病为痤疮。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述PCSK9抑制剂为

PCSK9小分子化合物抑制剂、PCSK9单克隆抗体、PCSK9干扰RNAi抑制剂、PCSK9模拟肽、PCSK9模拟抗体蛋白、靶向PCSK9的反义寡核苷酸或PCSK9疫苗。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述PCSK9抑制剂为

PCSK9小分子化合物抑制剂或PCSK9单克隆抗体。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述PCSK9小分子化合物抑制剂为如式(Ⅰ)、式(Ⅱ)、式(Ⅲ)或式(Ⅳ)所示的化合物；

5.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述PCSK9单克隆抗体为PCSK9小鼠单克隆抗体mAbcam84041、依洛尤单抗、阿利西尤单抗、重组人源化抗PCSK9单克隆抗体JS002、重组全人源抗PCSK9单克隆抗体注射液或PCSK9抑制剂LY3015014。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述PCSK9干扰RNAi

抑制剂为Inclisran注射剂、ALN-PCS注射剂或ALN-PCSsc注射剂；所述模拟肽为小鼠PCSK9多肽ab32727；所述PCSK9模拟抗体蛋白为模拟抗体蛋白药DS-9001或作用于PCSK9羧基末端结构域的人类抗体-抗原结合片段1G08。

7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述靶向PCSK9的反义寡核苷酸为SPC5001；所述PCSK9疫苗为疫苗类PCSK9抑制剂AT04A或疫苗类PCSK9抑制剂AT06A。

8.根据权利要求1-7任意一项所述的应用，其特征在于，所述用于治疗角化异常性疾病的药物中，还包括与PCSK9抑制剂配合使用的辅剂或联合用药，所述联合用药选择为维甲酸类或果酸类产品。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述联合用药选择为阿达帕林、异维A酸、维胺酯或果酸。