CN116688131A - 一种抑制剂及其在制备治疗炎症性皮肤病产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明对咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎(IIPLD)小鼠局部施用GSDMD抑制剂双硫仑，显著改善了小鼠皮肤的炎症反应，包括减轻了皮肤红斑、减少了鳞屑以及缓解了银屑病样的皮损增厚等。基于上述事实，本发明首次发现了GSDMD抑制剂双硫仑在细胞焦亡信号通路下游过程中发挥的重要作用，即双硫仑可以抑制GSDMD活化后的膜穿孔作用，从而发挥治疗银屑病的效果。该发现从机理上阐明了双硫仑对银屑病治疗效应的根本机制，将研究精确到焦亡过程下游信号通路中更为精确的作用靶点，从而避免了对无关信号通路的干扰，为未来高效选择银屑病靶点提供了理论基础。对于银屑病患者的治疗，开发安全、高效且经济的新型银屑病治疗药物具有重大意义。

Description

一种抑制剂及其在制备治疗炎症性皮肤病产品中的应用

技术领域

本发明属于皮肤病技术领域，具体涉及一种治疗炎症性皮肤病的抑制剂，及该抑制剂在制备炎症性皮肤病相关产品中的应用。

背景技术

细胞焦亡是近十年的研究热点之一，在多个疾病类型中研究进展迅速，为多种难治性疾病带来了新的治疗思路。作为一种调节性细胞死亡的模式，细胞焦亡主要特征是细胞膜上活性孔道的形成，导致跨膜离子通量升高、细胞肿胀，最后导致细胞渗透裂解死亡。2015年邵峰等人首次揭示了Gasdermin D(GSDMD)是细胞焦亡的执行者。同时，现有研究表明，Caspase-1/4/5/11介导的结构域间的裂解决定了细胞的焦亡，即在任何细胞系统中，GSDMD结构域都足以驱动细胞焦亡，是细胞死亡性质的决定性因素。上述可概括为，细胞焦亡过程即为炎症小体激活Caspase-1/4/5/11后切割GSDMD，形成的GSDMD-N端裂解后致细胞膜孔隙形成、细胞内容物肿胀破裂流出后致细胞炎症性死亡。

银屑病是一种慢性、系统性、复发性、炎症性的疾病，在全球范围内患病率较高，根据目前流行病学统计，患病人数已超过1.2亿。银屑病除表现出显著过度增殖的组织学特征外，其特征包括角质形成细胞过度增殖和呈现细胞因子、炎症细胞浸润和损伤相关分子模式的过度分泌等。银屑病作为复杂性疾病，并非单一因素所影响。目前银屑病的治疗按药物种类主要分为传统疗法和生物靶向治疗方法。传统治疗效果大多只能达近期临床疗效，难以治愈；生物靶向治疗较传统疗法有更高的功效和更好的安全性。从用药方式上来看，银屑病主要分为局部给药和系统给药。部分局部给药方式控制银屑病皮损效果良好，并且从安全性和患者依从性考虑，局部用药优于系统治疗。

双硫仑(disulfiram，分子式：C10H20N2S4，CAS号：97-77-8)是一种被美国食品药品监督管理局批准用于酒精成瘾的临床治疗。新近研究发现，双硫仑可通过共价修饰人/小鼠焦亡执行蛋白GSDMD的Cys191/Cys192位点进而抑制其活化后的膜打孔过程发挥抗焦亡效应。然而，GSDMD介导的角质形成细胞焦亡作为促炎性细胞死亡方式，是否在银屑病皮肤炎症中起关键作用仍是未知的。

虽然现有技术中，有专利通过基因的关联分析，找出一些与疾病特征相关的提示性结果，但大都仅提出双硫仑可能会通过抑制细胞焦亡和减轻免疫细胞的炎症反应，从而缓解血管神经性皮炎和银屑病等皮肤疾病，其机理尚不明确，尤其对其易感基因的下游机制鲜有报道。如中国专利CN112641768A中公开了双硫仑在制备防治NLRP3炎症小体相关疾病药物中的应用，其针对的NLRP3作为焦亡通路的上游信号靶点，只与细胞焦亡的其中一种启动过程相关，且其影响的下游靶分子和信号通路较多较复杂，对下游信号的靶点和相关作用机制，该专利亦未进行深入研究；同时该专利通过腹腔注射给药，无法避免对全身多系统的影响。

发明内容

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明的第一个发明点为提供一种GSDMD抑制剂。

进一步地，所述GSDMD抑制剂包括抑制GSDMD蛋白质活性的试剂、降低GSDMD蛋白质表达水平的试剂、降低GSDMD mRNA表达水平的试剂和敲除GSDMD DNA的试剂。

优选地，所述抑制GSDMD蛋白质活性的试剂选自caspase1、caspase4、caspase5和/或caspase11的抑制剂；所述降低GSDMD蛋白质表达水平的试剂优选选自GSDMD蛋白拮抗剂和抗GSDMD抗体。

优选地，所述降低GSDMD mRNA表达水平的试剂优选自GSDMD mRNA的反义序列。

优选地，所述敲除GSDMD DNA的试剂选自用于通过CRISPR-Cas9敲除GSDMD DNA的试剂。

进一步地，所述GSDMD抑制剂可应用于制备炎症性皮肤病治疗产品。

进一步地，所述GSDMD抑制剂可与caspase1、caspase4、caspase5和/或caspase11结合，抑制caspase1、caspase4、caspase5和/或caspase11对GSDMD的剪切作用。

进一步地，所述GSDMD抑制剂包括但不限于双硫仑和坏死磺酰胺，所述炎症性皮肤病包括但不限于银屑病，系统性红斑狼疮，扁平苔癣，特异性皮炎，急性接触性皮炎，脂溢性皮炎，痤疮和酒渣鼻。

进一步地，所述GSDMD抑制剂为双硫仑，所述炎症性皮肤病为银屑病，所述双硫仑通过抑制细胞焦亡，实现对银屑病的治疗效果。

进一步地，所述双硫仑通过抑制GSDMD活化后的膜打孔过程，抑制细胞焦亡。

本发明的第二个发明点为提供所述GSDMD抑制剂在制备炎症性皮肤病治疗产品中的应用。

进一步地，所述GSDMD抑制剂为双硫仑。

进一步地，所述应用包括如下步骤：

S1，构建咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎(IIPLD)小鼠，作为实验动物；

S2，将GSDMD抑制剂用于治疗S1中所述的银屑病样皮炎(IIPLD)小鼠。

进一步地，在步骤S2中，使用1％、2％和5％双硫仑乳膏，对银屑病样皮炎(IIPLD)小鼠局部给药。

进一步地，所述应用包括将药学有效量的治疗炎症性皮肤病的抑制剂与药学上可接受的辅料合制备药学上可接受的任意药物制剂。

进一步地，所述应用包括将药学有效量的TNFα抑制剂,IL-12/23抑制剂，IL-17A抑制剂，IL-17RA和GSDMD抑制剂中的一种或几种和/或一切药学上可接受的载体或赋性剂联合，基于现有的制备设备和手段，制得药学上可以接受的任意药物制剂。

进一步地，上述抑制剂为GSDMD抑制剂，将所述GSDMD抑制剂用于制备经外用、局部、经皮、皮内、系统、吸入、气管内或通过插管术施用给药的任意药物制剂。

进一步地，将所述GSDMD抑制剂用于制备注射制剂和外用制剂中的至少一种。

优选地，所述的注射制剂为皮下注射制剂。

优选地，所述的外用制剂为凝胶剂、乳膏、乳液、面霜、软膏、糊剂、洗剂、贴剂、敷贴、涂膜剂、巴布剂、气雾剂或喷雾剂中的至少一种。

进一步地，将所述GSDMD抑制剂用于制备处于进行期、静止期或消退期的炎症性皮肤病。

进一步地，所述炎症性皮肤病为湿疹、银屑病、色素沉着过度、痣、皮疹、特应性皮炎、荨麻疹、与光过敏或光老化相关的疾病和病症、皱纹、瘙痒、感觉迟钝、湿疹爆发、嗜酸性皮肤病、反应性嗜中性皮肤病、天疱疮、类天疱疮、免疫大疱性皮肤病、皮肤纤维组织细胞增殖、瘢痕疙瘩、皮肤淋巴瘤和皮肤狼疮中的至少一种。

进一步地，所述炎症性皮肤病为银屑病。

进一步地，所述的银屑病为寻常型银屑病、红皮病型银屑病、关节型银屑病或脓疱型银屑病中的至少一种。

本发明具有如下有益效果：

1、本发明发现GSDMD介导的角质形成细胞的细胞焦亡，在炎症性皮肤病，特别是银屑病发生发展中发挥重要作用，而敲降GSDMD能够抑制小鼠银屑病表型的进展。基于此，施用GSDMD抑制剂可以控制银屑病的发生和发展。通过对咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎(IIPLD)小鼠局部施用质量浓度为1％、2％和5％的双硫仑(外用乳膏剂型)，显著改善了小鼠皮肤的炎症反应，包括减轻了皮肤红斑、减少了鳞屑以及缓解了银屑病样的皮损增厚等。

2、本发明首次发现了GSDMD抑制剂双硫仑在细胞焦亡信号通路下游过程中发挥的重要作用，即双硫仑可以抑制GSDMD活化后的膜穿孔作用，从而发挥治疗银屑病的效果。从机理上，本发明阐明了双硫仑对银屑病治疗效应的根本机制，将研究精确到焦亡过程下游信号通路中更为精确的作用靶点，从而避免了对无关信号通路的干扰。

3、本发明采用外用抹药膏的方式，副作用更小，因此双硫仑能以更小的剂量，更精准地作用在皮肤上。该局部涂抹方式的治疗效果明显优于传统的腹腔注射的系统给药方法。此外，采用外用途径，避免了系统治疗的不良反应，有助于进一步降低副作用。

4、本发明对银屑病内在发生和调控机制以及各种因素在银屑病进程中的影响进行了研究，为未来高效选择银屑病靶点提供了理论基础。对于银屑病患者的治疗，开发安全、高效且经济的新型银屑病治疗药物具有重大意义。

附图说明

图1为外用1％、2％和5％浓度的双硫仑(DSF)乳膏治疗咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮炎的外观表型照片

图2为小鼠皮损H&E染色，以显示外用1％、2％和5％浓度的双硫仑(DSF)乳膏治疗咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮炎的皮肤组织病理学改变

图3为小鼠皮损Ki67组化染色以显示外用1％、2％和5％浓度的双硫仑(DSF)乳膏缓解咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮炎中的表皮过度增殖

图4为小鼠皮损表皮分离蛋白电泳结果，以显示外用1％、2％和5％浓度的双硫仑(DSF)乳膏缓解咪喹莫特诱导的Caspase-1活化、GSDMD剪切活化以及成熟的IL-1β的释放。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在限制本发明。本文中所使用的试剂和仪器均商购可得，所涉及的表征手段均可参阅现有技术中的相关描述，本文中不再赘述。

为了进一步了解本发明，下面结合最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1

本实施例探讨银屑病皮损患者的表皮角质形成细胞中，GSDMD介导的细胞焦亡过程中相关标志物表达水平的变化。

1实验操作：

采用碘化丙丁(PI)细胞染色法观察细胞焦亡情况。具体操作为，收集各组细胞，加入4％多聚甲醛固定，之后使用PBS洗涤细胞。避光条件下，加入PI染色液，室温染色15min。倾去PI染色液，避光条件下加入DAPI染色3～5min，PBS洗涤。荧光倒置显微镜下观察细胞染色情况并拍照，以PI阳性细胞率表示细胞焦亡情况。PI阳性细胞率越高，细胞焦亡发生率越高。

本实施例对10例寻常型银屑病患者(银屑病患者组)的皮损组织样本和10例正常皮肤组织样本(正常组)的皮肤组织样本进行了比较和研究。具体地，对两组样本表皮细胞中，N-GSDMD、Ki-67、Caspase-1和PI阳性细胞的表达水平进行了观察和比较。

2实验结果：

NLRP3受体感知胞质紊乱水平后，招募NLRP3炎症小体作为caspase-1的激活位点。活性Caspase-1裂解53kDa的gasdermin D(GSDMD)，生成31-kDa的N端孔隙形成片段，控制焦亡。GSDMD也可以通过caspase-11的非炎症小体激活来处理。在该途径中，小鼠的caspase-11和人的caspase-4和5与革兰氏阴性菌感染后释放到细胞质中的脂蛋白结合并被激活。与caspase-1不同，caspase-11不能将IL-1β和IL-18转化为成熟的形式。相反，在NLRP3炎症小体激活后，焦亡过程促进K+外流，激活caspase-1依赖的促炎细胞因子IL-1β和IL-18的成熟。在焦亡过程中，Caspase-1是GSDMD裂解的上游调控因子之一，裂解GSDMD生成N-GSDMD，而N-GSDMD被锚定在细胞膜上并促进孔的形成。Ki-67是与细胞增殖有关的一种细胞核中的核抗原，Ki-67细胞中出现过度表达。

研究表明，银屑病患者组的皮损表皮细胞中，N-GSDMD的表达呈现异常水平，而Ki-67、裂解的Caspase-1和PI阳性细胞水平显著增加。但在正常组中，未观察到N-GSDMD、Ki-67、裂解的Caspase-1和PI的异常表达。

实施例2

本实施例建立了咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎(IIPLD)小鼠，并观察各类焦亡标志物在IIPLD小鼠和正常对照组小鼠中的含量情况。

1实验操作：

取8周龄体重20±2g雌雄各半的C57/BL6品系健康小鼠(购自江苏集萃药康生物科技有限公司)16只，分别于躯干背部脱毛2*3cm²，脱毛24小时后，确认脱毛处无异常变化，将小鼠随机分为2组，分别为：

(1)正常对照组(8只)：不进行任何特殊操作；

(2)银屑病小鼠模型组(8只)：于小鼠躯干背部脱毛处，用棉签均匀涂抹62.5mg5％咪喹莫特乳膏，每日一次，连续涂抹6天，每次间隔时间为24小时。

造模结束后，观察小鼠背部皮损，相较于对照组，银屑病模型组出现明显的红斑、脱屑及皮肤增厚等表现，且由两名独立的有经验的实验人员进行严重程度评分(即PASI评分，评分对红斑、鳞屑进行0分—4分的分级量化评分；其中0分表示与正常对照组无明显差异，1、2、3分表示小鼠背部皮损逐渐加重，4分表示小鼠已出现极重度红斑、极重度鳞屑)，并统计得出银屑病模型组小鼠PASI评分明显增加。此外，取银屑病模型组小鼠背部造模处皮肤进行组织石蜡包埋，常规切片进行HE染色观察，与正常对照组比较，以出现角化不全、棘层肥厚等银屑病典型的组织病理学改变判定模型成立。

2实验结果：

咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎小鼠表皮中Ki-67表达异常，即观察到Ki-67的连续表达，且在基底层中的角质形成细胞上呈现异常增加。而Ki-67在正常小鼠表皮基底层呈间歇性、局灶性的表达模式。

在细胞焦亡过程中，N-GSDMD被锚定在细胞膜上并促进孔的形成。在咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎小鼠的皮肤切片中，本发明检测到鬼笔环肽标记的细胞(可视化细胞骨架以显示细胞轮廓)中GSDMD的定位，即GSDMD易位到角质形成细胞的细胞膜上。

与对照组小鼠相比，咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎小鼠表皮裂解物中N-GSDMD和裂解的Caspase-1蛋白水平显著升高。同时，裂解的IL-1β水平显著增加，而IL-1β是通过GSDMD介导的细胞焦亡中的关键细胞因子。

通过流式细胞术测定来自表皮组织的单细胞悬浮液，观察到7-氨基放线菌素D(7-AAD，细胞死亡指示剂)阳性细胞比例在CD 45染色阴性的细胞(即表皮组织中的非免疫细胞，其中绝大部分为角质形成细胞)中显著增加。7-氨基放线菌素D(7-AAD)，是细胞死亡指示剂，可以作为细胞焦亡的一种标记物。

上述结果表明，在银屑病皮损的角质形成细胞中发生了GSDMD介导的细胞焦亡过程。

实施例3

本实施例用IL-17A、IL-22、IL-1α、制瘤素M和TNF-α(这五种细胞因子的组合后文中统称为M5)处理原代人表皮角质形成细胞，模拟银屑病免疫微环境对角质形成细胞的攻击。

1实验操作：

正常人原代角质形成细胞购自ATCC(世界上最大的非营利性的生物资源中心)，在适合的培养条件下体外培养(37℃，5％的二氧化碳环境)，使用时传代次数不超8代，已经过STR鉴定以保证其细胞系未受其他细胞或物种交叉污染。在培养的正常人原代角质形成细胞经过24小时饥饿处理以同步细胞周期后，分别加入或不加入10ng/ml的M5处理24小时，并进行相关实验，包括但不限于：

(1)通过ELISA检测细胞上清中各银屑病相关的细胞因子的释放水平差异；

(2)通过活细胞成像系统下观察拍摄正常人原代角质形成细胞出现细胞焦亡的形态学特点；

(3)蛋白质免疫印迹检测细胞焦亡的蛋白标记物；

(4)免疫荧光检测细胞焦亡相关标记物的定位情况；

等。

2实验结果：

银屑病是一种由多种致病因子刺激引起的T细胞介导的针对皮肤的自身免疫病。机制上，以往认为Th1通路是银屑病发病的主要原因，代表性细胞因子有TNF-α、IL-12、IL-23等。后来的研究认为，Th17是银屑病发病的关键驱动因素。IL-17/IL-23是致病的主要因素。IL-17由Th17细胞分泌，促进其他细胞因子传递，并直接促进活化的角质细胞产生更多趋化因子。

结果表明，银屑病中典型的促炎细胞因子IL-1β、CXCL 2、CCL 20、IL-8和S100A8/A9的蛋白质水平在M5刺激的人表皮角质形成细胞的培养上清液中含量增加，提示该银屑病体外模型构建合理。

通过活细胞成像发现，M5刺激的人表皮角质形成细胞(即银屑病炎症环境下的角质形成细胞)呈现典型的细胞焦亡形态，伴有细胞肿胀和大气泡从膜中挤出，同时观察到PI立即被吸收到人表皮角质形成细胞中，焦亡细胞形成大量小泡(即焦亡小体)。

体内观察的结果表明，GSDMD、Caspase-1和IL-1β在M5刺激的人表皮角质形成细胞中被裂解活化。

与对照组相比，Caspase-1和GSDMD的裂解蛋白水平，在M5模拟的人表皮角质形成细胞的分泌上清液中的含量升高。

同时，在M5刺激的角质形成细胞中观察到鬼笔环肽荧光标记的孔洞形成，提示膜孔道的形成，进一步表明了细胞焦亡的发生。

更为重要的是，细胞的死亡标志物Pl和细胞增殖标志物Ki-67的阳性染色细胞，在M5刺激的人表皮角质形成细胞中增加，这表明在M5刺激后增殖性角质形成细胞中发生细胞焦亡。

上述结果证实GSDMD介导的细胞焦亡在人表皮角质形成细胞中，因受到银屑病病样炎症环境的刺激而被激活。

为了进一步证实GSDMD是否介导由M5刺激的角质形成细胞中的焦亡，我们观察了来自Gsdmd^-/-(GSDMD基因敲除小鼠)小鼠和WT小鼠的鼠原代角质形成细胞中的焦亡形态。在野生型小鼠表皮角质形成细胞中，M5刺激可诱导出现细胞焦亡形态和IL-1β的分泌。然而，它们不能在来自Gsdmd^-/-小鼠表皮角质形成细胞中观察到。进一步通过电穿孔转运rnGSDMD(N端GSDMD重组蛋白片段)进入胞内的来自Gsdmd^-/-小鼠表皮角质形成细胞中则可以再次观察到细胞焦亡形态和IL-Ιβ的分泌，但仅在培养基中简单添加游离rnGSDMD并不能观察到细胞焦亡的发生以及IL-Ιβ的分泌。

本实施例还证实，被裂解的GSDMD仅可以在通过电穿孔转运rnGSDMD的小鼠表皮角质形成细胞的裂解物中观察到，但在孵育游离rnGSDMD的小鼠表皮角质形成细胞中未观察到。本部分实验精确的提示了，胞内的活化的GSDMD蛋白是银屑病炎症刺激下诱导角质形成细胞焦亡的关键。这些结果表明，在表皮角质形成细胞中，通过M5处理以模拟银屑病样炎症环境刺激可诱导角质形成细胞的细胞焦亡过程，并且N-GSDMD在此过程中起关键作用。

实施例4

本实施例对GSDMD在咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎小鼠发病机制中的关键作用进行了研究。

1实验操作：

为探讨GSDMD在银屑病发病机制中的作用，本实施例比较了Gsdmd^-/-小鼠和野生型小鼠在咪喹莫特刺激后表型的差异。

2实验结果：

结果发现，咪喹莫特诱导的Gsdmd^-/-小鼠不表现出与咪喹莫特诱导的野生型小鼠一样的银屑病样皮肤表现，例如红斑、鳞屑和增厚，以及组织学特征，包括表皮过度增殖和炎性细胞浸润。

野生型小鼠中，咪喹莫特诱导的Ki-67的异常表达模式，在Gsdmd^-/-小鼠中未观察到。兜甲蛋白是一种角质形成细胞终末分化标志物，并且在银肩病皮损的表皮中显著降低，表明银肩病角质形成细胞中的去终末化。同时结果还表明，兜甲蛋白在咪喹莫特诱导的Gsdmd^-/-小鼠中没有呈现出与其在咪喹莫特诱导的野生型小鼠中一样的异常低的表达水平，恢复了正常的终末角化。

角蛋白5(Keratin 5，K5)作为一种角质形成细胞初始分化标志物，通常在表皮基底层表达。在银屑病皮损模型中，其在整个表皮中异常表达。Gsdmd^-/-小鼠未表现出与野生型小鼠相似的咪喹莫特诱导的K5异常表达。

此外，与咪喹莫特诱导的野生型小鼠相比，咪喹莫特诱导的Gsdmd^-/-小鼠中髓过氧化物酶(MPO)阳性炎性细胞的浸润减少。在表皮裂解物中，观察到Gsdmd^-/-小鼠中GSDMD的缺乏和咪喹莫特诱导的IL-Ιβ裂解的阻断。

通过耳内皮内注射鼠源IL-23重组蛋白建立的银屑病样炎症小鼠(通过皮内注射的方式打入小鼠耳部皮肤组织，单次注射剂量为1ug，隔天一次，共6次。造模结束后通过观察小鼠耳部的红斑、脱屑和增厚等临床表现并进行评分和组织化学染色以评价该模型的构建效果)。我们验证了Gsdmd^-/-小鼠对IL-23刺激无反应。这些数据表明，GSDMD缺陷能够抑制小鼠对诱导银屑病样皮炎的刺激的反应。

为了进一步阐明角质形成细胞GSDMD在银屑病发病机制和发展中的重要性，我们比较了咪喹莫特刺激后表皮角质形成细胞特异性敲除GSDMD的基因工程小鼠和其对照小鼠之间的差异。

与对照组小鼠相比，在GSDMD条件性敲除的小鼠中，咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎的发展进程被抑制，小鼠背部皮肤红斑、脱屑和增厚的情况明显缓解。在咪喹莫特诱导的GSDMD条件性敲除的小鼠中，Ki-67的异常表达恢复到正常的基底层间断表达的模式。同时，在GSDMD条件性敲除的小鼠中，不能在表皮角质形成细胞中检测到GSDMD，并且咪喹莫特诱导的IL-Ιβ裂解过程也被抑制。

在咪喹莫特诱导的对照组小鼠的外周血血浆中，作为银屑病核心致病细胞因子的IL-17A和TNF-α的含量升高。然而，在GSDMD条件性敲除小鼠中，IL-17A和TNF-α的含量并未发生改变。

对表皮组织的单细胞悬浮液进行流式细胞术，测定结果表明，对照组小鼠CD 45阴性的表皮细胞中，FVS 780和Ki-67阳性率增加，但在GSDMD条件性敲除小鼠的CD45阴性的表皮细胞中，FVS 780和Ki-67阳性率没有增加。FVS 780是一种细胞死亡指示物，而Ki-67是一种细胞核的增殖指示物，代表着细胞增殖的活跃程度，Ki-67阳性率越高，代表着细胞增殖越活跃，通常银屑病患者的角质形成细胞存在增殖异常活跃的典型特征，因而Ki-67往往在银屑病的角质形成细胞中明显升高，并能够随着病情的缓解而减低。

总之，上述结果表明，角质形成细胞中GSDMD的缺陷，减轻了银屑病的核心表型，包括表皮的过度增殖和异常活跃的炎症反应。

实施例5

1实验操作：

为了进一步验证角质细胞GSDMD在咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎中的关键作用，本实施例设计了皮肤移植实验，包括如下3组小鼠：

组i:将Gsdmd^-/-小鼠的皮肤组织移植到野生型小鼠中

组ii:将野生型小鼠的皮肤组织移植到Gsdmd^-/-小鼠中

组iii:将Gsdmd^-/-小鼠的皮肤组织移植到Gsdmd^-/-小鼠中

移植后比较3组小鼠皮肤对咪喹莫特诱导的银屑病样炎症反应的差异。

2实验结果：

接受来自野生型小鼠的皮肤移植物的Gsdmd^-/-小鼠(组ii)和接受来自Gsdmd^-/-小鼠的皮肤移植物的野生型小鼠(组i)，在咪喹莫特刺激后均呈现严重的银屑病样皮肤炎症，而接受来自Gsdmd^-/-小鼠的皮肤移植物的Gsdmd^-/-小鼠保持轻度反应。

除了接受来自Gsdmd^-/-小鼠的皮肤移植物的Gsdmd^-/-小鼠之外，其他小鼠组(组i和组ii)在含有皮肤移植物的咪喹莫特诱导的皮肤区域中呈现银屑病样组织学特征和表皮增厚。此外，咪喹莫特诱导的兜甲蛋白和K5的异常表达在接受来自WT小鼠的皮肤移植物的Gsdmd^-/-小鼠中被诱发，但在接受来自Gsdmd^-/-小鼠的皮肤移植物的Gsdmd^-/-小鼠中未被诱发。

这些发现表明，将野生型小鼠的皮肤组织移植到Gsdmd^-/-小鼠上，可以在Gsdmd^-/-小鼠的整个皮肤区域(不限于移植区域)中“点燃”或“唤醒”其对咪喹莫特诱导的反应，即接受来自野生型小鼠的皮肤移植物在Gsdmd^-/-小鼠中引起对咪喹莫特诱导的反应。但是在接受来自另一Gsdmd^-/-小鼠的皮肤移植的Gsdmd^-/-小鼠中没有观察到这种效果。

这些结果有力地证明GSDMD介导的角质形成细胞焦亡在咪喹莫特诱导的银屑病样皮肤炎症的起始中起关键作用。

实施例6

基于上述研究结果，本实施例推断并证明，靶向GSDMD介导的细胞焦亡干预，可以抑制银屑病样免疫微环境中角质形成细胞的反应。

根据体内研究的结果，发明人发现GSDMD siRNA的电穿孔转染，可以减少M5诱导的原代角质形成细胞中裂解的GSDMD、Caspase-1和IL-Ιβ的分泌。

在GSDMD敲减细胞中，并未观察到M5诱导的Ki-67和PI增加。双硫仑被报道可通过阻断N-GSDMD与细胞膜的结合而抑制GSDMD介导的细胞焦亡。同时研究表明，双硫仑处理抑制体外培养的人表皮角质形成细胞中M5诱导的切割形式的GSDMD、Caspase-1和IL-Ιβ的分泌。由于双硫仑可以阻断GSDMD介导的孔形成以防止焦亡中的成熟IL-Ιβ释放，观察到裂解的IL-Ιβ在M5刺激的人表皮角质形成细胞中的细胞内积累。M5诱导的Ki-67上调和PI染色增加均被双硫仑处理抑制。双硫仑处理显著抑制了人表皮角质形成细胞中M5诱导的IL-Ιβ、CXCL 2、CCL 20、IL-8和S100A8/A9的增加。

Cu(DTC)₂中文全称为n,n-二乙基二硫代氨基甲酸铜，是戒酒药物双硫仑(disulfiram)与Cu²⁺反应生成的金属有机配合物。本实施例进一步验证了Cu(DTC)₂，其代谢物二乙基二硫代氨基甲酸盐(DTC)和铜的复合物的处理，也可以减少M5诱导的原代角质形成细胞中裂解形式的GSDMD、Caspase-1和IL-Ιβ的分泌。

上述结果表明，GSDMD的裂解和活化有助于银屑病免疫微环境中人表皮角质形成细胞的异常增殖和细胞应答。

实施例7

考虑到双硫仑在体外对M5模拟的银屑病炎症有良好的抑制作用，本实施例进一步在体内实验中检测其作用，即局部应用双硫仑治疗咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎小鼠。

将双硫仑制备成不同浓度(1％、2％或5％)的乳膏制剂，常温下保存。应用时，每天1次，每次100mg，涂抹于小鼠背部面积约6cm²的咪喹莫特诱发的银屑病样皮损处。局部应用质量分数为1％、2％或5％双硫仑乳膏在小鼠中有助于抑制咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎的发展。在小鼠的表皮裂解物中，与基质乳膏(即不含有双硫仑药物成分的空白对照乳膏)处理的咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎小鼠相比，在2％和5％双硫仑乳膏处理的咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎小鼠中GSDMD、Caspase-1和IL-Ιβ的裂解降低，表明局部应用双硫仑抑制了Caspase-1/GSDMD/IL-1β途径的活化。

此外，咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎小鼠中Ki-67的异常表达，也通过局部施用1％、2％或5％的双硫仑乳膏而得到缓解。

总之，这些结果表明，靶向GSDMD介导的焦亡可以被认为是治疗银屑病的潜在治疗策略。

本实施例表明，局部应用双硫仑可有效减轻咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎小鼠的疾病发展进程。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种治疗炎症性皮肤病的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂为TNFα抑制剂,IL-12/23抑制剂，IL-17A抑制剂，IL-17RA和GSDMD抑制剂中的一种或几种。

2.根据权利要求1所述的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂为GSDMD抑制剂，所述GSDMD抑制剂通过抑制GSDMD蛋白的活性、降低GSDMD蛋白的表达水平和/或降低GSDMDmRNA的表达水平，治疗炎症性皮肤病。

3.根据权利要求2所述的抑制剂，其特征在于，所述GSDMD抑制剂可与caspase1、caspase4、caspase5和/或caspase11结合，从而抑制caspase1、caspase4、caspase5和/或caspase11对GSDMD的裂解作用。

4.根据权利要求3所述的抑制剂，其特征在于，所述GSDMD抑制剂包括但不限于双硫仑(DSF)、富马酸二甲酯(DMF)和坏死磺酰胺(NSA)，所述炎症性皮肤病包括但不限于湿疹、银屑病、色素沉着过度、痣、皮疹、特应性皮炎、荨麻疹、与光过敏或光老化相关的疾病和病症、皱纹、瘙痒、感觉迟钝、湿疹爆发、嗜酸性皮肤病、反应性嗜中性皮肤病、天疱疮、类天疱疮、免疫大疱性皮肤病、皮肤纤维组织细胞增殖、瘢痕疙瘩、皮肤淋巴瘤和皮肤狼疮。

5.根据权利要求4所述的抑制剂，其特征在于，所述GSDMD抑制剂为双硫仑，所述炎症性皮肤病为银屑病，所述双硫仑通过抑制GSDMD介导的细胞焦亡，实现控制银屑病进程的目的。

6.根据权利要求5所述的抑制剂，其特征在于，所述双硫仑通过抑制GSDMD介导的细胞膜穿孔过程，抑制细胞焦亡。

7.一种如权利要求1-6中任意一项所述的抑制剂在制备治疗炎症性皮肤病产品中的应用，其特征在于，所述应用包括将药学有效量的治疗炎症性皮肤病的抑制剂与药学上可接受的辅料联合制备药学上可接受的任意药物制剂，所述药物制剂用于治疗银屑病。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抑制剂为双硫仑，将所述双硫仑用于制备经外用、局部、经皮、皮内、系统、吸入、气管内或通过插管术施用给药的任意药物制剂。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将所述双硫仑用于制备注射制剂和外用制剂中的至少一种，所述的注射制剂为皮下注射制剂，所述的外用制剂为凝胶剂、乳膏、乳液、面霜、软膏、糊剂、洗剂、贴剂、敷贴、涂膜剂、巴布剂、气雾剂或喷雾剂中的至少一种。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将双硫仑乳膏通过局部外用涂抹给药的方式，治疗银屑病。