CN111110827A - 一种外涂药物组合物、制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于提供一种外涂药物组合物、制备方法及其应用,包括金属硫蛋白,其技术方案在于,还包括与该金属硫蛋白联用的间充质干细胞无血清培养基上清。本发明所述的间充质干细胞无血清培养基上清冻干粉与金属硫蛋白联用后,能够有效针对应激性皮肤炎症导致的皮肤红肿,瘙痒等症状,使用后能够快速减少面部红肿,减轻瘙痒症状;也可以激素药物使用不当导致的激素性皮肤症状,使用后能够有效缓解面部激素依赖性皮炎导致的面部发红,红血丝等症状。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白药物领域,特别涉及一种包含间充质干细胞无血清培养上清联合金属硫蛋白的外涂药物组合物、制备方法及其应用。
背景技术
皮肤是覆盖在人体表面的最大的器官,由于与外界环境接触频繁且人自身代谢的原因,极易产生各种炎症性皮肤病,常见的炎症性皮肤病根据其炎症浸润模式主要分为以下9类 :①浅层血管周围皮炎;②浅层及深层血管周围皮炎;③血管炎;④界面皮炎;⑤结节性和弥漫性皮炎;⑥间质性皮炎;⑦毛囊炎;⑧水疱性皮炎;⑨脂膜炎。这些皮肤炎症不仅对人们的日常生活造成影响,若是长时间无法治愈或者治愈时用错方法或者滥用激素类药物,极易对皮肤造成永久性的损伤,或者色素沉着等现象。这对于如今越来越追求美丽外表的人们来说是无法接受的。
近20年前,研究人员Haynesworth等首次报道间充质干细胞(MSCs)能够合成和分泌多种生长因子、趋化因子和细胞因子,首次描述了MSCs的旁分泌效应。间充质干细胞(是一类具有自我更新与多向分化以及免疫调节能力的成体干细胞。MSCs来源广泛,从骨髓、脂肪、脐带、胎盘等组织均可分离获得MSCs,且由于其具有低免疫原性,移植后不产生免疫排斥,无致瘤性,因此广泛用于临床试验和基础研究。随后有13篇报道报道这些分泌因子增强动脉生成,保护肢体组织损伤,促进新生血管。
金属硫蛋白的一级结构高度保守。哺乳动物MT分子由61~81个氨基酸残基组成(MT-1、MT-2和MT-4亚型包括61~62个氨基酸残基, 而MT-3包含68个氨基酸残基) , 其中含有多达20个半胱氨酸 (Cys) 残基。蛋白质测序显示, 金属硫蛋白多肽链的Cys残基位于Cys-X-Cys、Cys-X-X-Cys和Cys-Cys序列中, 其中“X”表示除半胱氨酸残基以外的其他氨基酸残基。因为金属硫蛋白具有强烈的抗自由基功能,所以其在美容和护肤品行业中具有极为广泛的应用前景。在小鼠的毒理学试验、家兔的多次皮肤刺激试验以及北京市疾病预防控制中心所做的人体贴斑试验均表明,MT 在皮肤表面应用时为弱致敏原,无潜在致敏原。所以在可以预见的将来,MT 完全可以作为细胞保护添加剂添加在化妆品中。
也有如中国专利公开号:CN104232585,名为《一种携带人金属硫蛋白基因的脐带间充质干细胞及其应用》的专利中,公开了携带人金属硫蛋白基因的脐带间充质干细胞或分泌液可用来制备成用于氧自由基、重金属导致疾病或衰老治疗的制品。
可见,现有技术中对于金属硫蛋白与间充质干细胞无血清培养上清联用的研究还处在初期,利用金属硫蛋白与间充质干细胞无血清培养上清联用进行抗应激性皮肤炎的应用也未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种外涂药物组合物、制备方法及其应用,能够有效针对应激性皮肤炎症导致的皮肤红肿,瘙痒等症状。
本发明采用的具体方案为:一种外涂药物组合物,包括金属硫蛋白,其技术方案在于,还包括与该金属硫蛋白联用的间充质干细胞无血清培养基上清。
所述的间充质干细胞无血清培养基上清是粉状物或液体;所述的金属硫蛋白的浓度为19~21ppm。
一种如上述外涂药物组合物的制备方法,包括以下步骤:将间充质干细胞无血清培养基上清进行-20℃冷藏,得到目标冻干粉;将该目标冻干粉与浓度为19~21ppm的金属硫蛋白进行混合,得到最终药物组合物。
所述的间充质干细胞无血清培养基上清的制备过程如下:
S1.无菌环境下将人的脐带剪成1cm小段,得到小段的脐带;
S2.剥离S1步骤所述小段的脐带的动脉、静脉后,剪碎移入α-MEM完全培养基培养72 h,每隔2-3 d 更换一次培养液;
S3.待细胞达到80%融合度时,加入0.25 %胰蛋白酶消化传代,得到第3代的MSCs备用;
S4.将S3步骤备用的培养至第3代的MSCs采用无血清培养基培养48 h后,收集MSCs无血清培养上清,得到间充质干细胞无血清培养基上清。
S2步骤中所述的α-MEM完全培养基的培养体系为:含10% PBS的α-MEM培养基中添加29~31mg/l 碱性成纤维细胞生长因子、49~51 mg/l 表皮生长因子、4~6%体积分数的人血白蛋白、1.2~1.8mg/L 还原型谷胱甘肽、0.08~0.12mmol/L β-巯基乙醇、0.8~1.2%体积分数的SITE、8~12mg/L 氢化可的松、8~12nmol/L 地塞米松和8~12nmol/L 氨基酸浓缩液。
一种如上述外涂药物组合物在抗应激性皮肤炎的制品中的应用。
有益效果:本发明所述的间充质干细胞无血清培养基上清冻干粉与金属硫蛋白联用后,能够有效针对应激性皮肤炎症导致的皮肤红肿,瘙痒等症状,使用后能够快速减少面部红肿,减轻瘙痒症状;也可以激素药物使用不当导致的激素性皮肤症状,使用后能够有效缓解面部激素依赖性皮炎(激素脸)导致的面部发红,红血丝等症状。
附图说明
图1为家兔对照实验的结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
需要明确的是:本发明所述的药物组合物为金属硫蛋白与间充质干细胞无血清培养基上清联用后形成的药物组合物,以下简称药物组合物。
具体实施例I:制备本发明所述的药物组合物包含以下步骤:
一)制备α-MEM完全培养基的培养体系:含10% PBS的α-MEM培养基中添加30mg/l 碱性成纤维细胞生长因子、50 mg/l 表皮生长因子、5%体积分数的人血白蛋白、1.5mg/L 还原型谷胱甘肽、0.1mmol/L β-巯基乙醇、1%体积分数的SITE、10mg/L 氢化可的松、10nmol/L 地塞米松和10nmol/L 氨基酸浓缩液。
二)制备间充质干细胞无血清培养基上清:
S1.无菌环境下将人的脐带剪成1cm小段,得到小段的脐带;
S2.剥离S1步骤所述小段的脐带的动脉、静脉后,剪碎移入α-MEM完全培养基培养72 h,每隔2-3 d 更换一次培养液;
S3.显微镜下观察,待细胞达到80%融合度时,加入0.25 %胰蛋白酶消化传代,得到第3代的MSCs备用;
S4.将S3步骤备用的培养至第3代的MSCs采用无血清培养基培养48 h后,收集MSCs无血清培养上清,得到间充质干细胞无血清培养基上清。
三)为了使用方便,可将S4步骤获得的间充质干细胞无血清培养基上清分装后在-20℃冷冻,形成冻干粉。
四)在使用中,形成的外涂药物组合物包含上述的间充质干细胞无血清培养基上清冻干粉以及金属硫蛋白,且该金属硫蛋白的浓度为19~21ppm,优选为20ppm。
对于应激性皮炎,在使用本发明所述药物组合时,在患处均匀涂抹,涂抹药量根据情况使用。
实验论证:
一)家兔对照实验。
选择2-4kg重的家兔60只,在每只兔子的背部,选取位置相同的一处面积约为4cm2的部位剔除毛发。其中30只家兔用人工药物处理的方法:4%SDS+0.5%DNCB,先涂抹4%SDS涂抹剔除毛发部位,破坏皮肤和角质层的屏障功能,干燥后用0.5%的DNCB,涂抹200微升,处理时间为1-3天使得提出毛发部位发生炎症反应,按照控制单一变量的方法进行此实验,其中:
10只家兔炎症区域每次均匀涂抹本发明所述药物组合物,0.5 mL,命名为研究组;
10只家兔仅使用干细胞无血清培养基上清的治疗方案,命名为研究组2;
10只家兔仅使用金属硫蛋白的治疗方案,命名为研究组3;
10只家兔炎症区域涂抹市场上常见的治疗皮炎药物,命名为阳性对照组。
10只家兔不进行任何药物处理命名为阴性对照组;
余下10只未进行人工药物处理致使皮炎的家兔,剔除毛发区域涂抹与研究组相同的药物,命名为空白对照组。
药物处理的三组每天涂抹相应的药物两次,时间间隔为12 h。每次涂抹时,确保用药量相同。观察并记录涂抹3-7天后的皮肤反应。
实验结果:
在涂抹药物的3-7天的时间内后,几组家兔生活正常,并未见特殊反应动作。
如图1所示,对于空白对照组的10只家兔,剔除毛发区域用药后并未见皮肤发红,发疹,水泡等皮肤刺激现象,说明在应用时并未造成皮肤刺激性反应,无不良反应。
且观察三组实验家兔验证区域处皮肤,每天测量炎症红肿消退面积,发现炎症红肿面积消退速度为研究组>研究组2>阳性对照>研究组3>阴性对照,说明本发明所采用的方法行之有效即:将干细胞无血清培养基上清与金属硫蛋白联用的效果远高于二者单独使用的效果,二者连用的效果在7天时炎症消除区域能够达到98%。而此时培养基上清和金属硫蛋白的单独使用的效果分别为83%和50%,阳性对照组的结果为80%。
二)就医人员治疗效果比对。
实验组:用干细胞无血清培养基上清与金属硫蛋白联用的治疗方案命名为实验组;
对照组1:仅采用干细胞无血清培养基上清的治疗方案命名为对照组1;
对照组2:采用市面上常见的皮炎治疗药剂如维生素E软膏,治疗方案命名为对照组2;
对照组3:仅采用金属硫蛋白的治疗方案命名为对照组3;
空白组:患者采用自愈的方式进行的治疗方案命名为空白组。
选取30-50岁的100名受试者,受试者的皮肤均患有不同程度的皮肤炎症,受试者皮肤有红肿现象且红肿面积较大,并且伴有不同程度的瘙痒。
受试者分共为四组,在分组是采用随机分组,尽量使得四组受试者分配为随机平均分配,无人为因素影响。对应上文五个组别,每组20人,分别为实验组,对照组1,对照组2,空白组。
进行皮肤治疗时,给药部位多集中于受试者的面部,四肢内侧等角质层较薄的部位,给药之前对于四组受试者进行同样的给药前处理(清洗患处,皮屑清除等),尽量减少外界因素对于不同组别受试者治疗效果的影响。
具体结果如下表I所示:
表I:
效果评估:
跟踪观察15天,根据患者自身满意度,以及医者观察受试者的患处红肿及询问瘙痒程度。
效果验证:
实验组与对照组均未出现因用药而导致的皮肤炎症进一步加重,说明所用药物对皮肤无刺激性且安全,在用药3,7,15天后对受试者进行回访,按照上述效果评估方法进行效果评估。
在用药15天后对复诊的受试者使用Likert量表评估患者的满意度,其评分包括非常不满意、不满意、一般、满意和非常满意。其中实验组的满意度远高于对照组的满意度。具体情况如下表II所示:
表II:
组别 | 例数 | 非常满意 | 满意 | 一般 | 不满意 | 非常不满意 |
实验组 | 20 | 19 | 0 | 1 | 0 | 0 |
对照组1 | 20 | 13 | 4 | 3 | 0 | 0 |
对照组2 | 20 | 9 | 1 | 5 | 3 | 2 |
对照组3 | 20 | 8 | 2 | 6 | 2 | 2 |
可以看到,在为期15天的跟踪观察中,干细胞无血清培养基上清与金属硫蛋白联用的实验组治疗效果最好,受试者皮肤红肿面积减少最多可以达到96%,受试者皮肤瘙痒症状消减很快,而单独使用干细胞无血清培养基上清和单独使用金属硫蛋白的治疗方案中,受试者皮肤红肿面积减少只有72%和40%,受试者皮肤瘙痒症状消减速度对应为一般和较慢,对照组2中的市场常用治疗软膏的治愈效果也仅仅达到70%,受试者皮肤瘙痒症状消减速度一般。
由上述数据可知,与传统的皮肤炎症药物和单独的间充质干细胞无血清培养基的上清以及单独的金属硫蛋白使用效果相比,间充质干细胞无血清培养基的上清与金属硫蛋白联用的效果更好,起到了意想不到的技术效果,能够在短时间内缓解由皮肤炎症导致的红肿,瘙痒等症状,并且受试者满意度更高。
需要明确的是:本文所述的脐带为健康产妇的脐带,取自医院,经医院伦理学委员会批准并获得产妇及其家人的知情同意。
需要明确的是:本文在就医人员治疗效果比对部分中,已报批临床委员会并与就医者签署了相关协议。
以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易变化或替换,都属于本发明的保护范围之内。因此本发明的保护范围所述以权利要求的保护范围为准。
Claims (7)
1.一种外涂药物组合物,包括金属硫蛋白,其特征在于,还包括与该金属硫蛋白联用的间充质干细胞无血清培养基上清。
2.根据权利要求1所述的外涂药物组合物,其特征在于,所述的间充质干细胞无血清培养基上清是粉状物或液体;所述的金属硫蛋白的浓度为19~21ppm。
3.一种如权利要求1所述外涂药物组合物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:将间充质干细胞无血清培养基上清进行-20℃冷藏,得到目标冻干粉;将该目标冻干粉与浓度为19~21ppm的金属硫蛋白进行混合,得到最终药物组合物。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于:所述的间充质干细胞无血清培养基上清的制备过程如下:
S1.无菌环境下将人的脐带剪成1cm小段,得到小段的脐带;
S2.剥离S1步骤所述小段的脐带的动脉、静脉后,剪碎移入α-MEM完全培养基培养72 h,每隔2-3 d 更换一次培养液;
S3.待细胞达到80%融合度时,加入0.25 %胰蛋白酶消化传代,得到第3代的MSCs备用;
S4.将S3步骤备用的培养至第3代的MSCs采用无血清培养基培养48 h后,收集MSCs无血清培养上清,得到间充质干细胞无血清培养基上清。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于:S2步骤中所述的α-MEM完全培养基的培养体系为:含10% PBS的α-MEM培养基中添加29~31mg/l 碱性成纤维细胞生长因子、49~51mg/l 表皮生长因子、4~6%体积分数的人血白蛋白、1.2~1.8mg/L 还原型谷胱甘肽、0.08~0.12mmol/L β-巯基乙醇、0.8~1.2%体积分数的SITE、8~12mg/L 氢化可的松、8~12nmol/L地塞米松和8~12nmol/L 氨基酸浓缩液。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法,其特征在于:所述的α-MEM完全培养基的最优培养体系为:含10% PBS的α-MEM培养基中添加30mg/l 碱性成纤维细胞生长因子、50 mg/l 表皮生长因子、5%体积分数的人血白蛋白、1.5mg/L 还原型谷胱甘肽、0.1mmol/L β-巯基乙醇、1%体积分数的SITE、10mg/L 氢化可的松、10nmol/L 地塞米松和10nmol/L 氨基酸浓缩液。
7.一种如权利要求1或2所述外涂药物组合物在抗应激性皮肤炎的制品中的应用。
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CN113975297A (zh) * | 2020-07-27 | 2022-01-28 | 奥瑞京生物科技(北京)有限公司 | 一种用于治疗激素脸和痘痘肌的组合物及其制备方法 |
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- 2020-02-25 CN CN202010114711.7A patent/CN111110827A/zh active Pending
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication |