JP2010508817A - Ｐｃｓｋ９のアンタゴニスト - Google Patents

Abstract

ヒトプロタンパク質コンバターゼサブチリシン−ケキシン９型（「ＰＣＳＫ９」）のアンタゴニストが開示されている。開示されるアンタゴニストは、ＰＣＳＫ９機能の阻害において有効であり、したがって、ＰＣＳＫ９活性と関連する症状の治療において用いるのに望ましいアンタゴニストを提示する。本発明はまた、前記アンタゴニストをコードする核酸、ベクター、宿主細胞、及びアンタゴニストを含む組成物を開示する。ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを作製する方法並びにＰＣＳＫ９機能を阻害又は拮抗するためにアンタゴニストを使用する方法も開示され、さらなる本開示内容の重要な態様を形成する。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、両方とも２００６年１１月７日に出願された米国仮出願第６０／８５７，２９３号及び同６０／８５７，２４８号の利益を主張する。

連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
該当なし

マイクロフィッシュ付属物の参照
該当なし

プロタンパク質コンバターゼサブチリシン−ケキシン（ｋｅｘｉｎ）９型（本明細書において以下、「ＰＣＳＫ９」と呼ぶ）は、神経アポトーシス調節コンバターゼ１（「ＮＡＲＣ−１」）としても知られており、分泌性サブチラーゼファミリーの９番目のメンバーとして同定されるプロテイナーゼＫ様サブチラーゼ（ｓｕｂｔｉｌａｓｅ）である；Ｓｅｉｄａｈら、２００３年、ＰＮＡＳ、１００：９２８〜９３３頁参照のこと。ＰＣＳＫ９の遺伝子は、ヒト染色体１ｐ３３−ｐ３４．３に位置している；Ｓｅｉｄａｈら、上記。ＰＣＳＫ９は、例えば、肝細胞、腎間葉細胞、腸の回腸及び結腸上皮、並びに胎生期脳終脳ニューロンを含む増殖及び分化可能な細胞において発現される；Ｓｅｉｄａｈら、上記。

ＰＣＳＫ９の最初の合成は、約７２ｋＤａの不活性酵素前駆体又はチモーゲンの形であり、これは、小胞体（「ＥＲ」）において、自己触媒的分子内プロセシングを受けて、その機能性を活性化する。この内部プロセシング事象は、ＳＳＶＦＡＱ↓ＳＩＰＷＮＬ^１５８モチーフで起き、最初の３個のＮ末端残基Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏを提供すると報告されており（Ｂｅｎｊａｎｎｅｔら、２００４年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：４８８６５〜４８８７５頁）、ＥＲからの出るための必要条件としても報告されている；Ｂｅｎｊａｎｎｅｔら、上記；Ｓｅｉｄａｈら、上記。次いで、切断されたタンパク質が分泌される。切断されたペプチドは活性化され、分泌された酵素と結合したままである；上記。

約２２ｋｂの長さであり６９２個のアミノ酸のタンパク質をコードする１２のエキソンを含むヒトＰＣＳＫ９の遺伝子配列は、例えば、寄託番号ＮＰ＿７７７５９６．２で見い出すことができる。ヒト、マウス及びラットＰＣＳＫ９核酸配列は、寄託されている；例えば、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＸ１２７５３０（同様にＡＸ２０７６８６）、ＡＸ２０７６８８及びＡＸ２０７６９０参照のこと。

ＰＣＳＫ９は、以下：ＷＯ０１／３１００７、ＷＯ０１／５７０８１、ＷＯ０２／１４３５８、ＷＯ０１／９８４６８、ＷＯ０２／１０２９９３、ＷＯ０２／１０２９９４、ＷＯ０２／４６３８３、ＷＯ０２／９０５２６、ＷＯ０１／７７１３７及びＷＯ０１／３４７６８；ＵＳ公開番号ＵＳ２００４／０００９５５３及びＵＳ２００３／０１１９０３８並びに欧州公開番号ＥＰ１４４０９８１、ＥＰ１０６７１８２及びＥＰ１４７１１５２をはじめとするいくつかの特許公報において開示され、及び／又は、特許請求されているが、それだけには限定されない。

ＰＣＳＫ９は、肝細胞及び神経細胞の分化において役割を果たしているとされており（Ｓｅｉｄａｈら、上記）、胎生肝において高度に発現され、コレステロール恒常性に強力に関与しているとされている。最近の研究は、コレステロール生合成又は取り込みにおける特定の役割を示唆しているようである。Ｍａｘｗｅｌｌらは、コレステロール食を与えられたラットの研究において、ＰＣＳＫ９は、コレステロール生合成に関与する３種のその他の遺伝子と同様に下流で制御されることを見い出した。（Ｍａｘｗｅｌｌら、２００３年、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４４：２１０９〜２１１９頁）。さらに、興味深いことに、ＰＣＳＫ９の発現は、コレステロール代謝を含むその他の遺伝子について見られるのと同様に、ステロール調節エレメント結合性タンパク質（「ＳＲＥＢＰ」）によって調節された；上記。これらの知見は、このような調節が、リポタンパク質代謝に関係しているその他遺伝子にかなり特有であることを実証したＰＣＳＫ９転写調節の研究によって後に支持された；（Ｄｕｂｕｃら、２００４年、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ、２４：１４５４〜１４５９頁）。ＰＣＳＫ９発現は、薬物のコレステロール低下効果による方法でスタチンによって上流で制御された；上記。さらに、ＰＣＳＫ９プロモーターは、コレステロール調節を含む２つの保存された部位、ステロール調節エレメント及びＳｐ１部位を有していた；上記。ＰＣＳＫ９のアデノウイルス発現は、循環ＬＤＬの顕著な時間依存性増大につながることがわかっている（Ｂｅｎｊａｎｎｅｔら、２００４年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：４８８６５〜４８８７５頁）。さらに、ＰＣＳＫ９遺伝子を欠失させたマウスは、肝ＬＤＬ受容体のレベルを増大させ、血漿からＬＤＬをより迅速に除去した；（Ｒａｓｈｉｄら、２００５年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０２：５３７４〜５３７９頁）。最近、ＰＣＳＫ９を用いて一過性にトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞から得られた培地は、トランスフェクトされていないＨｅｐＧ２細胞に移された場合に、細胞表面ＬＤＬＲ及びＬＤＬのインターナリゼーションの量を減少させたと報告された；Ｃａｍｅｒｏｎら、２００６年、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１５：１５５１〜１５５８頁参照のこと。ＰＣＳＫ９又はＰＣＳＫ９によって作用される因子のいずれかが分泌され、トランスフェクトされた細胞及びトランスフェクトされていない細胞の両方においてＬＤＬＲを低下させることができると結論付けられた。より最近、ＨｅｐＧ２細胞の培地に添加された精製ＰＣＳＫ９は、細胞表面ＬＤＬＲの数を、用量及び時間依存的に減少させる作用を有すると実証された；（Ｌａｇａｃｅら、２００６年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１６：２９９５〜３００５頁）。

また、遺伝子ＰＣＳＫ９中のいくつかの突然変異は、早発性心血管不全につながり得る常染色体優性高コレステロール血症（「ＡＤＨ」）、血漿における低密度リポタンパク質（「ＬＤＬ」）粒子の著しい上昇を特徴とする遺伝性代謝障害と確実に関係している；（Ａｂｉｆａｄｅｌら、２００３年、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３４：１５４〜１５６頁）；（Ｔｉｍｍｓら、２００４年、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１１４：３４９〜３５３頁）；（Ｌｅｒｅｎ，２００４年、Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．６５：４１９〜４２２頁）参照のこと。Ａｂｉｆａｄｅｌら、上記のＳ１２７Ｒ突然変異に関する後に公開された研究では、このような突然変異を保持する患者は、（１）アポＢ１００含有リポタンパク質、例えば、低密度リポタンパク質（「ＬＤＬ」）、超低密度リポタンパク質（「ＶＬＤＬ」）及び中間密度リポタンパク質（「ＩＤＬ」）の過剰産生、及び（２）前記リポタンパク質のクリアランス又は変換における関連する減少、に帰因する血漿中のより高い総コレステロール及びアポＢ１００を示すということが報告された；（Ｏｕｇｕｅｒｒａｍら、２００４年、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２４：１４４８〜１４５３頁）。

合わせて考えると、上記で参照される研究は、ＰＣＳＫ９はＬＤＬ産生の調節において役割を果たすという事実を証明する。ＰＣＳＫ９の発現又は上流での制御は、ＬＤＬコレステロールの血漿レベルの上昇と関係しており、ＰＣＳＫ９の発現の阻害又は欠如は、低いＬＤＬコレステロールレベルと関係している。ＰＣＳＫ９の配列変化と関係している低いＬＤＬコレステロールレベルが、冠動脈心疾患に対する保護を与えたということは重要である；（Ｃｏｈｅｎ、２００６年、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５４：１２６４〜１２７２頁）。

心血管疾患の治療において有効な化合物及び／又は薬剤の同定は、非常に望ましい。ＬＤＬコレステロールレベルの低下は、冠動脈イベントの率と直接関連していることを臨床試験においてすでに実証した；（Ｌａｗら、２００３年、ＢＭＪ、３２６：１４２３〜１４２７頁）。より最近、血漿ＬＤＬコレステロールレベルの中程度の生涯にわたる低下は、冠動脈イベントの発生率の実質的な減少と実質的に相関していることがわかった；Ｃｏｈｅｎら、上記。このことは、非脂質関連心血管危険因子の高い有病率を有する集団においてさえもそうであることがわかった；上記。したがって、ＬＤＬコレステロールレベルの管理された制御から得られる大きな利点がある。

したがって、ＰＣＳＫ９の活性及び種々の治療条件においてＰＣＳＫ９が果たす対応する役割を阻害又は拮抗するＰＣＳＫ９の治療ベースのアンタゴニストを製造することは非常に重要である。

発明の要旨
本発明は、ＰＣＳＫ９、特に、ヒトＰＣＳＫ９のアンタゴニストに関する。ＰＣＳＫ９のタンパク質特異的アンタゴニスト（又は本明細書において、「ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト」とも呼ばれる）は、ＰＣＳＫ９タンパク質特異的結合分子又はＰＣＳＫ９機能と関連している又はＰＣＳＫ９機能によって影響を与えられる症状、例えば、それだけには限らないが、高コレステロール血症、冠動脈心疾患、メタボリックシンドローム、急性冠動脈症候群及び関連症状の治療において重要なＰＣＳＫ９機能の阻害において有効なタンパク質である。ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、ＰＣＳＫ９の選択的認識及び結合を特徴とする。ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、アンタゴニスがＰＣＳＫ９特異的結合部分にさらなる別個の特異性を付与するよう補われている特定の例以外では、ＰＣＳＫ９以外との有意な結合を示さない。特定の実施形態では、ＰＣＳＫ−９特異的アンタゴニストは、１．２×１０−６以下のＫＤでヒトＰＣＳＫ９と結合する。特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、１×１０−７以下のＫＤでヒトＰＣＳＫ９と結合する。さらなる実施形態では、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、１×１０−８以下のＫＤでヒトＰＣＳＫ９と結合する。その他の実施形態では、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、５×１０−９以下の、又は１×１０−９以下のＫＤでヒトＰＣＳＫ９と結合する。さらなる実施形態では、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、１×１０−１０以下のＫＤ、１×１０−１１以下のＫＤ、１×１０−１２以下のＫＤでヒトＰＣＳＫ９と結合する。特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、その他のタンパク質とは上記のレベルで結合しない。

ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、細胞のＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９依存性阻害に対抗するのに有効である。ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、ＬＤＬ取り込みに対するＰＣＳＫ９の効果の用量依存性阻害を繰り返し実証する。したがって、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、血漿ＬＤＬコレステロールレベルの低下にとって重要である。前記アンタゴニストはまた、ＰＣＳＫ９の検出及び定量化において種々の診断目的で有用性を有する。

特定の実施形態では、本発明は、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト、特定の実施形態では、開示される重鎖及び／又は軽鎖可変領域、その１以上の保存的アミノ酸置換を有する等価物及び相同体を含む抗体分子を包含する。特定の実施形態は、開示されるＣＤＲドメイン又は重鎖及び／又は軽鎖ＣＤＲドメインのセット、及び１以上の保存的アミノ酸置換を有することを特徴とするその等価物を含む単離されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを含む。当業者には当然のことながら、ＰＣＳＫ９を拮抗する能力を保持するＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの断片を、種々のフレームワークに挿入してもよく、例えば、抗原結合に基づいて予め選択された抗体ループをディスプレイするために使用できる種々の足場を議論し、米国特許第６，８１８，４１８号及びそれに含まれる参照文献を参照のこと。別の方法では、ＶＬ及びＶＨをコードする遺伝子を、組換え法を用いて、例えば、ＶＬ及びＶＨ領域対が、別に一本鎖Ｆｖｓ（「ＳｃＦＶｓ」）として知られる一価の分子を形成する単一タンパク質鎖として作製されるのを可能にする合成リンカーを用いて結合してもよく；例えば、Ｂｉｒｄら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６頁、及びＨｕｓｔｏｎら、１９８８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９〜５８８３頁参照のこと。

ＰＣＳＫ−９特異的アンタゴニスト及び断片は、種々の非抗体ベースの足場、例えば、それだけには限らないが、アビマー（ａｖｉｍｅｒｓ）（Ａｖｉｄｉａ）；ダーピン（ＤＡＲＰｉｎｓ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ）；アドネクチン（Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ）（Ａｄｎｅｘｕｓ）、アンチカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ）（Ｐｉｅｒｉｓ）及びアフィボディー（Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ）（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）の形であり得る。タンパク質結合のための代替足場の使用は、科学文献においてよく理解され、例えば、Ｂｉｎｚ＆Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、２００５年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：１〜１１頁。したがって、細胞のＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９依存性阻害に対抗する、ＰＣＳＫ９に対して選択性を有する非抗体ベースの足場又はアンタゴニスト分子は、本発明の重要な実施形態を形成する。

別の態様では、本発明は、開示されるＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストをコードする核酸を提供する。本発明は、特定の態様において、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストをコードする核酸、特定の実施形態において、開示される可変重鎖及び軽鎖領域及びその選択成分、特に開示される個々のＣＤＲ３領域を含む開示される抗体分子を提供する。別の態様では、本発明は、前記核酸を含むベクターを提供する。別の態様では、本発明は、開示されるＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストをコードする核酸を含む単離細胞、特定の実施形態では開示される抗体分子及び記載されるようなその成分を提供する。別の態様では、本発明は、本発明のポリペプチド又はベクターを含む単離細胞を提供する。

別の態様では、本発明は、ＰＣＳＫ９と選択的に結合するＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト、例えば、それだけには限らないが、抗体、抗原結合断片、誘導体、キメラ分子、前記のもののいずれかのその他のポリペプチドとの融合物、又はＰＣＳＫ９と特異的に結合できる代替構造／組成物を作製する方法を提供する。本方法は、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト（類）をコードする核酸を含む又は１種以上のその成分をコードする個々の核酸を含む細胞をインキュベートすることを含み、前記核酸は、発現される場合には、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト（類）の発現及び／又は構築を可能にする条件下で、集合的にアンタゴニスト（類）を産生し、そして細胞から前記アンタゴニスト（類）を単離することを含む。当業者ならば、同様に、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて本明細書に開示されるＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを得ることができる。

別の態様では、本発明は、前記アンタゴニストがＰＣＳＫ９と結合するのを可能にする条件下で、細胞、細胞の集団、又はＰＣＳＫ９を発現する（又はＰＣＳＫ９で処理された）注目する組織サンプルを、本明細書に開示されるＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストと接触させることを含む、ＰＣＳＫ９の活性若しくは機能又はＰＣＳＫ９の顕著な効果を拮抗する方法を提供する。本発明の特定の実施形態は、細胞がヒト細胞であるこのような方法を含む。これに一致するアンタゴニストは、ＰＣＳＫ９機能の阻害において有効である。開示されるＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、ＬＤＬ取り込みに対するＰＣＳＫ９の効果を用量依存的に阻害することがわかった。

別の態様では、本発明は、被験者に、治療上有効な量の本発明のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを投与することを含む、ＰＣＳＫ９活性に関連する症状又はＰＣＳＫ９が機能することが特定の被験者には禁忌である症状を示す被験者においてＰＣＳＫ９の活性を拮抗する方法を提供する。選択された実施形態では、症状は、高コレステロール血症、冠動脈心疾患、メタボリックシンドローム、急性冠動脈症候群又は関連症状であり得る。別の態様では、本発明は、本発明のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストと、薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤、安定剤、バッファー又は治療される個体への所望の量のアンタゴニストの投与を促進にするよう設計された代替物とを含む医薬組成物又は別の組成物を提供する。

本発明はまた、精製ＰＣＳＫ９及び標識されたＬＤＬ粒子を細胞サンプルに提供し；ＰＣＳＫ９アンタゴニストであると疑われる分子（類）を細胞サンプルに提供し；細胞サンプルを、細胞によるＬＤＬ粒子取り込みを可能にするのに十分な時間インキュベートし；上清を除去することによって細胞サンプルの細胞を単離し；標識されたＬＤＬ粒子の非特異的結合を減少させ；細胞を溶解し；細胞溶解物内に保持される標識の量を定量し；ＰＣＳＫ９が単独投与される場合に観察されるものと比較して定量される標識の量の増大をもたらす候補アンタゴニストを同定することを含む、細胞サンプルにおいてＰＣＳＫ９アンタゴニストを同定する方法に関する。定量される標識の量の増大をもたらす候補アンタゴニストは、ＰＣＳＫ９アンタゴニストである。この方法は、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを同定するための有効な手段であることがわかっており、したがって、本発明の重要な態様を形成する。

以下の表は、本出願において論じられる配列の一般的な概略を提供する：

Ｆａｂ発現ベクターｐＭＯＲＰＨ＿ｘ９＿ＭＨを示す図である。 ＥｘｏｐｏｌａｒにおけるＰＣＳＫ９突然変異体の効力が、血漿ＬＤＬコレステロールとどのように相関するかを示す図である。 図３Ａ〜３Ｄは、１ＣＸ１Ｇ０８及び３ＣＸ４Ｂ０８の、ＬＤＬ取り込みに対するＰＳＣＫ９依存的効果の用量依存的阻害を示す。図３Ｂ及び３Ｄは、２種の対照：（ｉ）細胞のＬＤＬ取り込みの基礎レベルを示す細胞のみの対照、及び（ｉｉ）ＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９依存性喪失のレベルを示す、細胞＋ＰＣＳＫ９（２５μｇ／ｍｌ）対照を有する。Ｆａｂ及びＰＣＳＫ９を含む力価測定実験は、固定濃度のＰＣＳＫ９（２５μｇ／ｍｌ）及びグラフに示される漸増濃度のＦａｂで実施した。図３Ａ及び３Ｃは、ＩＣ−５０の算出を示す。 図４Ａ〜４Ｄは、３ＢＸ５Ｃ０１及び３ＣＸ２Ａ０６の、ＬＤＬ取り込みに対するＰＳＣＫ９依存性効果の用量依存性阻害を示す。図４Ｂ及び４Ｄは、２種の対照：（ｉ）細胞のＬＤＬ取り込みの基礎レベルを示す細胞のみの対照、及び（ｉｉ）ＬＳＬ取り込みのＰＣＳＫ９依存性喪失のレベルを示す、細胞＋ＰＣＳＫ９（２５μｇ／ｍｌ）対照を有する。Ｆａｂ及びＰＣＳＫ９を含む力価測定実験は、固定濃度のＰＣＳＫ９（２５μｇ／ｍｌ）及びグラフに示される漸増濃度のＦａｂで実施した。図４Ａ及び４Ｃは、ＩＣ−５０の算出を示す。 図５Ａ〜５Ｂは、３ＣＸ３Ｄ０２の、ＬＤＬ取り込みに対するＰＳＣＫ９依存性効果の用量依存性阻害を示す。図５Ｂは、２種の対照：（ｉ）細胞のＬＤＬ取り込みの基礎レベルを示す細胞のみの対照、及び（ｉｉ）ＬＳＬ取り込みのＰＣＳＫ９依存性喪失のレベルを示す、細胞＋ＰＣＳＫ９（２５μｇ／ｍｌ）対照を有する。Ｆａｂ及びＰＣＳＫ９を含む力価測定実験は、固定濃度のＰＣＳＫ９（２５μｇ／ｍｌ）及びグラフに示される漸増濃度のＦａｂで実施した。図５Ａは、ＩＣ−５０の算出を示す。 ＩｇＧ１（配列番号８９の残基２４〜３５３）、ＩｇＧ２（配列番号９０の残基７〜３３２）、ＩｇＧ４（配列番号９１の残基７〜３３３）及びＩｇＧ２ｍ４（配列番号９２の残基７〜３３２）アイソタイプのＦｃドメインの配列比較を示す図である。

発明の詳細な記載
本発明は、ＰＣＳＫ９、特にヒトＰＣＳＫ９のアンタゴニストに関する。これに一致して、ＰＣＳＫ９のタンパク質特異的アンタゴニスト（又は「ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト」）は、ＰＣＳＫ９機能の阻害に有効であり、従って、ＰＣＳＫ９機能と関連する／ＰＣＳＫ９機能によって影響を与えられる症状、例えば、それだけには限らないが、高コレステロール血症、冠動脈心疾患、メタボリックシンドローム、急性冠動脈症候群及び関連症状の治療において重要である。本明細書において、ＰＣＳＫ９機能又はＰＣＳＫ９活性への言及は、ＰＣＳＫ９を必要とするか、それによって悪化する又は増強される任意の活性／機能を指す。本明細書において、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、細胞のＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９依存性阻害を抑制するのに特に有効であることが実証された。開示されるアンタゴニストは、ＬＤＬ取り込みに対するＰＣＳＫ９の効果の用量依存性阻害を繰り返し実証した。

したがって、本明細書に開示されるＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、血漿ＬＤＬコレステロールレベルを低下するのに望ましい分子である。ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、獣医学上重要な商業用又は家畜用の任意の霊長類、哺乳類又は脊椎動物にとって有用である。ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、ＬＤＬ受容体を保有する細胞又は組織の集団にとっても同様に有用である。ＬＤＬ取り込み、そしてそれに対する種々の効果を測定する手段は、文献に記載されている；例えば、Ｂａｒａｋ＆Ｗｅｂｂ、１９８１年、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９０：５９５〜６０４頁、及びＳｔｅｐｈａｎ＆Ｙｕｒａｃｈｅｋ、１９９３年、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３４：３２５３３０参照のこと。さらに、血漿中のＬＤＬコレステロールを測定する手段は、文献に十分に記載されている；例えば、ＭｃＮａｍａｒａら、２００６年、Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、３６９：１５８〜１６７頁参照のこと。

ＰＳＣＫ９特異的アンタゴニストはまた、ＰＳＣＫ９の検出及び定量化において、種々の診断目的上有用である。

本明細書に定義されるＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、ＰＣＳＫ９を選択的に認識し、特異的に結合する。本明細書において、用語「選択的」又は「特異的」の使用は、開示されるアンタゴニストが、アンタゴニストがＰＣＳＫ９特異的結合部分にさらなる別個の特異性を付与するよう補われている特定の例（例えば、分子が少なくとも一方がＰＣＳＫ９と特異的に結合する２つの機能を結合又は達成するよう設計されている二重特異性又は二機能性分子におけるような）を除いて、ＰＳＣＫ９以外と有意な結合を示さないという事実を指す。特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、ヒトＰＣＳＫ９と１．２×１０−６以下のＫＤで結合する。特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、ヒトＰＣＳＫ９と５×１０−７以下の、２×１０−７以下の、又は１×１０−７以下のＫＤで結合する。さらなる実施形態では、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、ヒトＰＣＳＫ９と１×１０−８以下のＫＤで結合する。その他の実施形態では、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、ヒトＰＣＳＫ９と、５×１０−９以下の、又は１×１０−９以下のＫＤで結合する。さらなる実施形態では、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、ヒトＰＣＳＫ９と１×１０−１０以下のＫＤ、１×１０−１１以下のＫＤ、又は１×１０−１２以下のＫＤで結合する。特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、上記のＫＤでその他のタンパク質とは結合しない。ＫＤとは、Ｋｄ（特定の結合分子−標的タンパク質相互作用の解離速度）対Ｋａ（特定の結合分子−標的タンパク質相互作用の結合速度）の割合、すなわち、モル濃度（Ｍ）として表されるＫｄ／Ｋａから得られる解離定数を指す。ＫＤ値は、当技術分野で十分に確立された方法を用いて求めることができる。結合分子のＫＤを求めるための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴法、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）システムなどのバイオセンサーシステムを用いることによる。

ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、ＬＤＬ取り込みに対するＰＣＳＫ９依存的効果を用量依存的に阻害することがわかっている。したがって、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、細胞へのＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９依存性阻害を抑制するその能力を特徴とする。ＬＤＬ受容体による細胞へのＬＤＬのこの取り込みは、本明細書において、「細胞のＬＤＬ取り込み」と呼ばれる。特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、１．２×１０−６以下のＩＣ５０を示して細胞へのＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９依存性阻害を拮抗する。特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、５×１０−７以下、２×１０−７以下又は１×１０−７以下のＫＤを示して細胞へのＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９依存性阻害を拮抗する。さらなる実施形態では、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、１×１０−８以下のＩＣ５０を示して細胞へのＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９依存性阻害を拮抗する。その他の実施形態では、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、５×１０−９以下、２×１０−９以下、又は１×１０−９以下のＩＣ５０を示して細胞へのＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９依存性阻害を拮抗する。さらなる実施形態では、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、１×１０−１０以下のＩＣ５０、１×１０−１１以下のＫＤ又は１×１０−１２以下のＫＤを示して細胞へのＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９依存性阻害を拮抗する。任意のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストによる阻害の程度は、対照に対する統計的比較において、又はＰＣＳＫ９機能に対する負の効果又はＰＣＳＫ機能の阻害を評価するために当技術分野において利用可能な任意の代替法（すなわち、ＰＣＳＫ９機能の拮抗作用を評価できる任意の方法）によって定量的に測定することができる。特定の実施形態では、阻害は、少なくとも約１０％阻害である。その他の実施形態では、阻害は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％である。

本明細書と一致して、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、ＰＣＳＫ９タンパク質に対する特異性を有する任意の結合分子であり得、例えば、それだけには限らないが以下に定義される抗体分子、任意のＰＣＳＫ９特異的結合構造、ＰＣＳＫ９と特異的に結合する任意のポリペプチド又は核酸構造、種々のタンパク質足場、例えばそれだけには限らないが種々の非抗体ベースの足場に組み込まれた前記のもののいずれか、及びＰＣＳＫ９との選択的結合を与えることができる種々の構造、例えばそれだけには限らないが小モジュラー免疫薬剤（ｓｍａｌｌ ｍｏｄｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（すなわち、「ＳＭＩＰ」；Ｈａａｎ＆Ｍａｇｇｏｓ、２００４年、Ｂｉｏｃｅｎｔｕｒｙ、１月２６日参照のこと）；免疫タンパク質（例えば、Ｃｈａｋら、１９９６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：６４３７〜６４４２頁参照のこと）；チトクロム ｂ５６２（Ｋｕ及びＳｃｈｕｌｔｚ、１９９５年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２：６５５２〜６５５６頁参照のこと）；ペプチドα２ｐ８（Ｂａｒｔｈｅら、２０００年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．９：９４２〜９５５頁参照のこと）；アビマー（ａｖｉｍｅｒｓ）（Ａｖｉｄｉａ；Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、２００５年、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１５５６〜１５６１頁参照のこと）；ダーピン（ＤＡＲＰｉｎｓ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ；Ｂｉｎｚら、２００３年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２：４８９〜５０３頁；及びＦｏｒｒｅｒら，２００３年、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５３９：２〜６頁参照のこと）；テトラネクチン（Ｋａｓｔｒｕｐら、１９９８年、Ａｃｔａ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５４：７５７〜７６６頁参照のこと）；アドネクチン（Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ）（Ａｄｎｅｘｕｓ；Ｘｕら、２００２年、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９：９３３〜９４２頁参照のこと）、アンチカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ）（Ｐｉｅｒｉｓ；Ｖｏｇｔ＆Ｓｋｅｒｒａ、２００４年、Ｃｈｅｍｏｂｉｏｃｈｅｍ．５：１９１〜１９９頁；Ｂｅｓｔｅら、１９９９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６：１８９８〜１９０３年；Ｌａｍｌａ＆Ｅｒｄｍａｎｎ、２００３年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２９：３８１〜３８８頁；及びＬａｍｌａ＆Ｅｒｄｍａｎｎ、２００４年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．３３：３９〜４７頁参照のこと）；Ａ−ドメインタンパク質（Ｎｏｒｔｈ＆Ｂｌａｃｋｌｏｗ、１９９９年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３８：３９２６〜３９３５頁参照のこと）、リポカリン（Ｌｉｐｏｃａｌｉｎｓ）（Ｓｃｈｌｅｈｕｂｅｒ＆Ｓｋｅｒｒａ、２００５年、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ、１０：２３〜３３頁参照のこと）；アンキリンリピートタンパク質などのリピートモチーフタンパク質（Ｓｅｄｇｗｉｃｋ＆Ｓｍｅｒｄｏｎ、１９９９年、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２４：３１１〜３１６頁；Ｍｏｓａｖｉら、２００２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９：１６０２９〜１６０３４頁；及びＢｉｎｚら、２００４年、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：５７５〜５８２頁参照のこと）；昆虫デフェンシンＡ（Ｚｈａｏら、２００４年、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、２５：６２９〜６３５頁参照のこと）；クニッツドメイン（Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：２４２９〜２４３３頁；Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９９２年、Ｇｅｎｅ、１２１：９〜１５頁；Ｄｅｎｎｉｓ＆Ｌａｚａｒｕｓ、１９９４年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２２１２９〜２２１３６頁；及びＤｅｎｎｉｓ＆Ｌａｚａｒｕｓ、１９９４年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２２１３７〜２２１４４頁参照のこと）；ＰＤＺドメイン（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９９９年、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７０〜１７５頁）；カリブドトキシンなどのサソリ毒（Ｖｉｔａら、１９９８年、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、４７：９３〜１００頁参照のこと）；１０番目フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（又は１０Ｆｎ３；Ｋｏｉｄｅら、１９９８年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８４：１１４１〜１１５１頁、及びＸｕら、２００２年、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９：９３３〜９４２頁参照のこと）；ＣＴＬＡ−４（細胞外ドメイン；Ｎｕｔｔａｌｌら、１９９９年、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、３６：２１７〜２２７頁；及びＩｒｖｉｎｇら、２００１年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４８：３１〜４５頁参照のこと）；ノッティン（Ｋｎｏｔｔｉｎｓ）（Ｓｏｕｒｉａｕら、２００５年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４４：７１４３〜７１５５頁、及びＬｅｈｔｉｏら、２０００年、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、４１：３１６〜３２２頁参照のこと）；ネオカルチノスタチン（Ｈｅｙｄら２００３年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４２：５６７４〜５６８３頁参照のこと）；糖結合モジュール４−２（ＣＢＭ４−２；Ｃｉｃｏｒｔａｓら、２００４年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１７：２１３〜２２１頁参照のこと）；テンダミスタット（Ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔ）（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ＆Ｈｏｅｓｓ、１９９５年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５０：４６０〜４７０頁、及びＬｉら、２００３年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１６：６５〜７２頁参照のこと）；Ｔ細胞受容体（Ｈｏｌｌｅｒら、２０００年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７：５３８７〜５３９２頁；Ｓｈｕｓｔａら、２０００年、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：７５４〜７５９頁；及びＬｉら、２００５年、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：３４９〜３５４頁参照のこと）；アフィボディー（Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ）（Ａｆｆｉｂｏｄｙ；Ｎｏｒｄら、１９９５年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：６０１〜６０８頁；Ｎｏｒｄら、１９９７年、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：７７２〜７７７頁；Ｇｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎら、１９９９年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１２：８７３〜８７８頁参照のこと）；及び文献において認識される、その他の選択的結合タンパク質又は足場であり得る；例えば、Ｂｉｎｚ＆Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、２００５年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：１〜１１頁；Ｇｉｌｌ＆Ｄａｍｌｅ、２００６年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１〜６頁；Ｈｏｓｓｅら、２００６年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１５：１４〜２７頁；Ｂｉｎｚら、２００５年、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１２５７〜１２６８頁；Ｈｅｙら、２００５年、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：５１４〜５２２頁；Ｂｉｎｚ＆Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、２００５年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：４５９〜４６９頁；Ｎｙｇｒｅｎ＆Ｓｋｅｒｒａ、２００４年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２９０：３〜２８頁；Ｎｙｇｒｅｎ＆Ｕｈｌｅｎ、１９９７年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：４６３〜４６９頁参照のこと。抗体及び抗原結合断片の使用は、文献において十分に定義されている。タンパク質結合のための代替足場の使用は、同様に科学文献において十分に理解されており、例えば、Ｂｉｎｚ＆Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、２００５年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：１〜１１頁；Ｇｉｌｌ＆Ｄａｍｌｅ、２００６年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１〜６頁；Ｈｏｓｓｅら、２００６年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１５：１４〜２７頁；Ｂｉｎｚら、２００５年、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１２５７〜１２６８頁；Ｈｅｙら、２００５年、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：５１４〜５２２頁；Ｂｉｎｚ＆Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、２００５年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：４５９〜４６９頁；Ｎｙｇｒｅｎ＆Ｓｋｅｒｒａ、２００４年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２９０：３〜２８頁；Ｎｙｇｒｅｎ＆Ｕｈｌｅｎ、１９９７年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：４６３〜４６９頁参照のこと。したがって、細胞のＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９依存性阻害に対抗する、ＰＣＳＫ９に対して選択性を有する非抗体ベースの足場又はアンタゴニスト分子は、本発明の重要な実施形態を形成する。アプタマー（標的分子と選択的に結合できる核酸又はペプチド分子）は、１つの具体的な例である。それらは、ランダム配列プールから選択され、リボスイッチなどの天然供給源から同定され得る。ペプチドアプタマー、核酸アプタマー（例えば、構造化核酸、例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡベースの構造の両方）及び核酸デコイは、注目するタンパク質と選択的に結合し、阻害する点で効果的であり得る；例えば、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ＆Ｂｕｔｚ、２０００年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７８：４２６〜４３０頁；Ｂｏｃｋら、１９９２年、Ｎａｔｕｒｅ３５５：５６４〜５６６頁；Ｂｕｎｋａ＆Ｓｔｏｃｋｌｅｙ、２００６年、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４：５８８〜５９６頁；Ｍａｒｔｅｌｌら、２００２年、Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．６：３０〜３４頁；Ｊａｙａｓｅｎａ、１９９９年、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４５：１６２８〜１６５０頁参照のこと。

種々のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの発現及び選択は、適した技術、例えばそれだけには限らないが、ファージディスプレイ（例えば、国際出願番号ＷＯ９２／０１０４７、Ｋａｙら、１９９６年、Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ： Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ参照のこと）、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイ、Ｔ７ディスプレイ、及びリボソームディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｅ＆Ｊｅｒｍｕｔｕｓ、２００４年、Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５１７〜５２７頁参照のこと）を用いて達成できる。

本明細書に記載される「抗体分子」又は「抗体」は、ＰＣＳＫ９と選択的に結合する免疫グロブリン由来構造、例えば、それだけには限らないが、全長又は全抗体、抗原結合断片（抗体構造に物理的に又は概念的に由来する断片）、前記のもののいずれかの誘導体、キメラ分子、前記のもののいずれかのその他のポリペプチドとの融合物、又はＰＣＳＫ９と選択的に結合する／ＰＣＳＫ９の機能を阻害する目的で前記のもののいずれかを組み込む代替構造／組成物を指す。「全」抗体又は「全長」抗体とは、ジスルフィド結合によって相互接続している２つの重鎖（Ｈ）及び２つの軽鎖（Ｌ）含むタンパク質を指し、（１）重鎖に関しては、可変領域（本明細書において「Ｖ_Ｈ」と略される）及び３つのドメイン、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２及びＣ_Ｈ３を含む重鎖定常領域を含み、（２）軽鎖に関しては、軽鎖可変領域（本明細書において「Ｖ_Ｌ」と略される）及び１つのドメインＣ_Ｌを含む軽鎖定常領域を含む。

本明細書において用いる場合、「単離された」とは、開示されるＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト、核酸又はその他のものを、天然にみられるものとは異なるようにするよう、属するような特性として記載する。この相違は、例えば、天然にみられるものとは異なる純度である場合もあるし、又は天然にみられるものとは異なる構造であるか、異なる構造の一部を形成する場合もある。天然に見られない構造として、例えば、組換えヒト免疫グロブリン構造、例えば、それだけには限らないが、最適化されたＣＤＲを含む組換えヒト免疫グロブリンが挙げられる。天然に見られない構造のその他の例として、その他の細胞物質を実質的に含まないＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト又は核酸がある。単離されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、通常、異なるタンパク質特異性を有するその他のタンパク質に特異的な（すなわち、ＰＣＳＫ９以外に対して親和性を有する）アンタゴニストを含まない。

抗体断片、より詳しくは抗原結合断片は、ＰＣＳＫ９、特にヒトＰＣＳＫ９との選択結合を付与する、抗体可変領域又はそのセグメントを有する（開示されるＣＤＲ３ドメイン、重及び／又は軽のうち１つ以上を含む）分子である。このような抗体可変領域を含有する抗体断片としては、それだけには限らないが、以下の抗体分子が挙げられる：Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体分子（ＰＣＳＫ９特異的抗体とは異なる結合特異性を有する第２の機能性部分、例えば、限定するものではないが、抗体又は受容体リガンドなどの別のペプチド又はタンパク質と連結している本明細書に開示されるＰＣＳＫ９特異的抗体又は抗原結合断片を含む抗体分子）、二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体、単離されたＣＤＲ３、ミニボディー、「ｓｃＡｂ」、ｄＡｂ断片、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー、ミニボディー及びタンパク質足場に基づいた人工抗体、例えば、それだけには限らないが、フィブロネクチンＩＩＩ型ポリペプチド抗体（例えば、米国特許第６，７０３，１９９号及び国際出願番号ＷＯ０２／３２９２５及びＷＯ００／３４７８４参照のこと）又はチトクロムＢ；例えば、Ｎｙｇｒｅｎら、１９９７年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：４６３〜４６９頁参照のこと。抗体部分又は結合断片は、天然であってよいし、又は部分的に若しくは全体的に合成によって製造されていてもよい。このような抗体部分は、当業者に公知の種々の手段、例えば、それだけには限らないが、パパイン又はペプシン消化などの従来技術によって調製できる。

本発明は、特定の一態様では、ＰＣＳＫ９機能に拮抗する、単離されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを提供する。特定の実施形態では、前記ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、細胞のＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９の拮抗作用を阻害する。開示されるＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、ＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９の阻害を効率的に拮抗し、ひいては、血漿ＬＤＬコレステロールレベルを低下するのに望ましい分子を形成する；例えば、Ｃｏｈｅｎら、２００５年、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３７：１６１〜１６５頁（ここでは、対立遺伝子ＰＣＳＫ９におけるナンセンス突然変異の個体のヘテロ接合性について相当に低い血漿ＬＤＬコレステロールレベルが記されている）；Ｒａｓｈｉｄら、２００５年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０２：５３７４〜５３７９頁（ここでは、ＰＣＳＫ９ノックアウトマウスは、肝細胞中のＬＤＬＲ数の増加、血漿ＬＤＬクリアランスの促進及び血漿コレステロールレベルの大幅な低下を証明した）；及びＣｏｈｅｎら、２００６年、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５４：１２６４〜１２７２頁（ここでは、突然変異された機能喪失ＰＣＳＫ９についてのヒトヘテロ接合が、アテローム硬化性心疾患を発症する長期の危険の大幅な減少を示した）参照のこと。

実験を反復する中で、５種のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト、すなわち、抗体分子１ＣＸ１Ｇ０８、３ＢＸ５Ｃ０１、３ＣＸ２Ａ０６、３ＣＸ３Ｄ０２及び３ＣＸ４Ｂ０８が、ＬＤＬ取り込みに対するＰＣＳＫ９の効果を用量依存的に阻害した。したがって、特定の実施形態では、本発明は、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを包含し、より特定の実施形態では、これらの抗体分子内に重鎖及び／又は軽鎖可変領域を含む抗体分子、並びにその等価物（１以上の保存的アミノ酸置換を有することを特徴とする）又は相同体を包含する。特定の実施形態は、本明細書に開示されるＣＤＲドメイン又は本明細書に開示される重鎖及び／又は軽鎖ＣＤＲドメインのセットを含む単離されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト、又は１以上の保存的アミノ酸置換を有することを特徴とするその等価物を含む。本明細書において、用語「ドメイン」又は「領域」の使用は、単純に、問題の配列又はセグメントが存在する、又は別の方法では現在存在している抗体分子の個々の部分を指す。

特定の実施形態では、本発明は、単離されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを提供し、より特定の実施形態では、配列番号１１、配列番号２７、配列番号４５、配列番号６１及び配列番号７９からなる群から選択される重鎖可変領域を含む抗体分子、１以上の保存的アミノ酸置換を有することを特徴とするその等価物及びその相同体を提供する。開示されるアンタゴニストは、細胞のＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９依存性の阻害を阻害するはずである。特定の実施形態では、本発明は、本明細書に開示される、細胞のＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９依存性阻害を阻害するアンタゴニストと少なくとも９０％相同性であることを特徴とする、開示されるアンタゴニストの相同体を提供する。

特定の実施形態では、本発明は、単離されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを提供し、より特定の実施形態では、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９及び配列番号１０１からなる群から選択される軽鎖可変領域を含む抗体分子；１以上の保存的アミノ酸置換を有することを特徴とするその等価物及びその相同体を提供する。開示されるアンタゴニストは、細胞のＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９依存性阻害を阻害するはずである。特定の実施形態では、本発明は、細胞のＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９依存性阻害を阻害する、本明細書に開示されるアンタゴニストと少なくとも９０％相同性であることを特徴とする、開示されるアンタゴニストの相同体を提供する。

特定の実施形態では、本発明は、単離されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを提供し、より特定の実施形態では、（ｉ）配列番号１１を含む重鎖可変領域及び配列番号９３を含む軽鎖可変領域、（ｉｉ）配列番号２７を含む重鎖可変領域及び配列番号９５を含む軽鎖可変領域、（ｉｉｉ）配列番号４５を含む重鎖可変領域及び配列番号９７を含む軽鎖可変領域、（ｉｖ）配列番号６１を含む重鎖可変領域及び配列番号９９を含む軽鎖可変領域、（ｖ）配列番号７９を含む重鎖可変領域及び配列番号１０１を含む軽鎖可変領域を含む抗体分子；又は所定の配列中に１以上の保存的アミノ酸置換を有することを特徴とする前記抗体分子のいずれかの等価物を提供する。特定の実施形態として、細胞のＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９依存性阻害を阻害する前記アンタゴニストがある。

特定の実施形態では、本発明は、単離されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを提供し、より特定の実施形態では、配列番号１７、配列番号３３、配列番号５１、配列番号６７及び配列番号８５からなる群から選択される可変重ＣＤＲ３配列を含むＰＣＳＫ９抗体分子；及びその保存的修飾を提供し、その特定の実施形態は、細胞のＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９依存性阻害を阻害する。特定の実施形態は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３配列が、（ｉ）それぞれ、配列番号１３、配列番号１５及び／又は配列番号１７、（ｉｉ）それぞれ、配列番号２９、配列番号３１及び／又は配列番号３３、（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号４７、配列番号４９及び／又は配列番号５１、（ｉｖ）それぞれ、配列番号６３、配列番号６５及び／又は配列番号６７、（ｖ）それぞれ、配列番号８１、配列番号８３及び／又は配列番号８５を含む、重鎖可変領域を含む単離されたアンタゴニスト；又は任意の１以上のＣＤＲ配列中に１以上の保存的アミノ酸置換を有することを特徴とするその等価物を提供する。

特定の実施形態では、本発明は、単離されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを提供し、より特定の実施形態では、配列番号７、配列番号２３、配列番号４１、配列番号５７及び配列番号７５からなる群から選択される可変軽ＣＤＲ３配列を含む抗体分子；及びその保存的修飾を提供し、その特定の実施形態は、細胞のＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９依存性阻害を阻害する。特定の実施形態は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３配列が、（ｉ）それぞれ、配列番号３、配列番号５及び／又は配列番号７、（ｉｉ）それぞれ、配列番号２１、配列番号５及び／又は配列番号２３、（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号３７、配列番号３９及び／又は配列番号４１、（ｉｖ）それぞれ、配列番号５５、配列番号３９及び／又は配列番号５７、（ｖ）それぞれ、配列番号７１、配列番号７３及び／又は配列番号７５を含む、軽鎖可変領域を含む単離されたアンタゴニスト；又は任意の１以上のＣＤＲ配列中に１以上の保存的アミノ酸置換を有することを特徴とするその等価物を提供する。

特定の実施形態では、本発明は、単離されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを提供し、より特定の実施形態では、（ｉ）それぞれ、配列番号１７及び７、（ｉｉ）それぞれ、配列番号３３及び２３、（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号５１及び４１、（ｉｖ）それぞれ、配列番号６７及び５７、並びに（ｖ）それぞれ、配列番号８５及び７５を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ３配列及び軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列を含む抗体分子、又は任意の１以上のＣＤＲ３配列におけるその保存的修飾物を提供し、その特定の実施形態は、細胞のＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９依存性阻害を阻害する。

特定の実施形態は、単離されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを提供し、より特定の実施形態では、（ｉ）それぞれ、配列番号１３、１５、１７、３、５及び７、（ｉｉ）それぞれ、配列番号２９、３１、３３、２１、５及び２３、（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号４７、４９、５１、３７、３９及び４１、（ｉｖ）それぞれ、配列番号６３、６５、６７、５５、３９及び５７、並びに（ｖ）それぞれ、配列番号８１、８３、８５、７１、７３及び７５を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、並びに軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む抗体分子；及び任意の１以上のＣＤＴ配列中に１以上の保存的アミノ酸置換を有することを特徴とするその等価物を提供し、その特定の実施形態は、細胞のＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９依存性阻害を阻害する。

当業者には当然であろうが、保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基を、同様又はより良好な（意図される目的にとって）機能的特徴及び／又は化学的特徴を付与するよう置き換える置換である。例えば、保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものであることが多い。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において規定されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β−分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。このような修飾は、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの結合又は機能阻害特徴を改善する可能性はあるものの、このような特性を大幅に低下又は変更するようには設計されない。置換を行う目的は、重要なものではなく、限定するものではないが、残基を、分子の構造、分子の電荷若しくは疎水性、又は分子の大きさをより良好に維持若しくは増強できるもので置き換えることが挙げられる。例えば、あまり望まない残基を、同一の極性又は電荷のもので置換することを単純に望む場合がある。このような修飾は、当技術分野における既知の標準法、例えば、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ媒介性突然変異誘発によって導入できる。当業者が保存的アミノ酸置換を達成する１つの具体的な手段として、例えば、ＭａｃＬｅｎｎａｎら、１９９８年、Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｕｐｐｌ．６４３：５５〜６７頁、及びＳａｓａｋｉら、１９９８年、Ａｄｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５：１〜２４頁に論じられるアラニンスキャニング突然変異形成がある。次いで、変更されたアンタゴニストを、当技術分野で利用可能な又は本明細書に記載される機能アッセイを用いて、保持された又はより良好な機能について試験する。ヒトＰＣＳＫ９と選択的に結合し、ＰＣＳＫ９の機能をこのようなアミノ酸変更を有さない分子と同様以上のレベルで拮抗する能力を保持する１以上のこのような保存的アミノ酸置換を有するＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、これは本明細書において開示されるアンタゴニストの「機能的等価物」と呼ぶが、本発明の特定の実施形態を形成する。

別の態様では、本発明は、単離されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを提供し、より特定の実施形態では、細胞のＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９依存性阻害を阻害し、開示される抗体分子の対応するアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を含む、重鎖及び／又は軽鎖可変領域を含む抗体分子を提供する。特定の実施形態としては、それぞれ、開示される重鎖及び／又は軽鎖可変領域と少なくとも９０％相同性であり、重鎖及び／又は軽鎖可変領域を含むアンタゴニストである。「少なくとも９０％相同」は、少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９及び１００％相同性の配列を含む。

本明細書に記載されるアンタゴニストのアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を含むＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、通常、ＰＣＳＫ９に対する特異性を変更せず、アンタゴニストの１以上の特性を改善するよう作製される。当業者に利用可能な唯一の方法ではないが、このような配列を得るための１つの方法としては、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストをコードする配列又はその特異性決定領域を突然変異させ、突然変異配列を含むアンタゴニストを発現させ、本明細書に記載されるものをはじめとする利用可能な機能アッセイを用いて、保持される機能についてコードされるアンタゴニストを試験することがある。突然変異は、部位指定突然変異誘発又はランダム突然変異誘発であってもよい。当業者には当然であろうが、その他の突然変異誘発方法も同様の効果を容易にもたらし得る。例えば、特定の方法では、突然変異体のスペクトラムは、アミノ酸化学的特徴若しくは構造的特徴のいずれかに基づいて、又はタンパク質構造を考慮することによって、保存的置換を無作為でなく標的とすることによって制約される。親和性成熟実験では、無作為に選択されたものであろうと無作為でなく選択されたものであろうと、単一の選択された分子中にいくつかのこのような突然変異が見られる場合がある。また、例えば、米国特許第７，１１７，０９６号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０２／０８４２７７及びＷＯ０３／０９９９９９において実証されるような親和性成熟に向けた種々の構造ベースのアプローチがある。

本明細書において用いる場合、２種のアミノ酸配列間の相同性パーセントは、２種の配列間の同一性パーセントと等価である。２種の配列間の同一性パーセントは、２種の配列の最適アラインメントのために導入される必要があるギャップの数、各ギャップの長さを考慮した配列によって共有される同一の位置の数の関数（すなわち、相同性％＝同一な位置の＃／位置の総＃×１００）である。配列間の配列の比較及び同一性パーセントの決定は、一般に当業者に公知の方法を用いて決定してよく、数学アルゴリズムを用いて達成できる。例えば、アミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＭｅｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒ、１９８８年、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１〜１７頁のアルゴリズムを用いて決定してよい。さらに、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、Ａｃｃｅｌｒｙｓからオンラインで入手可能なＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを用い、そのデフォルトパラメータを用いて決定してよい。

一態様では、本発明は、その中に少なくとも１つの軽鎖可変ドメインと少なくとも１つの重鎖可変ドメイン（それぞれＶＬ及びＶＨ）を有する、ヒトＰＣＳＫ９の単離されたＰＣＳＫ９特異的抗体分子を提供する。

同様以上の特異性を有するその他の結合分子を製造するためのタンパク質特異的分子の操作は、十分に当業者の範囲内である。これは、例えば、組換えＤＮＡ技術の技術を用いて達成できる。これの一具体例は、異なる免疫グロブリンの可変領域、定常領域又は定常領域及びフレームワーク領域への、適切な抗体の免疫グロブリン可変領域又は１以上のＣＤＲをコードするＤＮＡの導入を含む。このような分子は、本発明の重要な態様を形成する。特定の開示された配列が挿入され得る、又は別の方法では不可欠な部分を形成する特定の免疫グロブリンとしては、限定されないが、本発明の特定の実施形態を形成する以下の抗体分子が挙げられる：Ｆａｂ（可変軽（ＶＬ）、可変重（ＶＨ）、定常軽（ＣＬ）及び定常重１（ＣＨ１）ドメインを含む一価の断片）、Ｆ（ａｂ’）_２（ジスルフィド橋によって、あるいはヒンジ領域で連結されている２つのＦａｂ断片を含む二価の断片）、Ｆｄ（ＶＨ及びＣＨ１ドメイン）、Ｆｖ（ＶＬ及びＶＨドメイン）、ｓｃＦｖ（ＶＬ及びＶＨがリンカー、例えばペプチドリンカーによって接続されている一本鎖Ｆｖ、例えば、Ｂｉｒｄら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６頁、Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８年、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、８５：５８７９〜５８８３頁参照のこと）、二重特異性抗体分子（例えば、限定するものではないが、抗体又は受容体リガンドなどの別のペプチド又はタンパク質を含む抗体以外の異なる結合特異性を有する第２の機能性部分、と連結している本明細書に開示されるＰＣＳＫ９特異的抗体又は抗原結合断片を含む抗体分子）、二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５参照のこと）、単離されたＣＤＲ３、ミニボディー（約８０ｋＤａの二価の二量体に自己集合する一本鎖−ＣＨ３融合物）、「ｓｃＡｂ」（ＶＨ及びＶＬ並びにＣＬ又はＣＨ１のいずれかを含む抗体断片）、ｄＡｂ断片（ＶＨドメイン、例えば、Ｗａｒｄら、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ、３４１：５４４〜５４６頁、及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０年、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２〜５５４頁；又はＶＬドメイン；Ｈｏｌｔら、２００３年、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２１：４８４〜４８９頁参照のこと）、ダイアボディー（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、１９９３年、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、９０：６４４４〜６４４８頁及び国際出願番号ＷＯ９４／１３８０４参照のこと）、トリアボディー、テトラボディー、ミニボディー（ＣＨ３と接続しているｓｃＦｖ；例えば、Ｈｕら、１９９６年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３０５５〜３０６１頁参照のこと）、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はその任意の誘導体、及びタンパク質足場に基づく人工抗体、例えば、それだけには限らないが、フィブロネクチンＩＩＩ型ポリペプチド抗体（例えば、米国特許第６，７０３，１９９号及び国際出願番号ＷＯ０２／３２９２５参照のこと）又はチトクロムＢ；例えば、Ｋｏｉｄｅら、１９９８年、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２８４：１１４１〜１１５１頁、及びＮｙｇｒｅｎら、１９９７年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、７：４６３〜４６９頁参照のこと。特定の抗体分子、例えば、それだけには限らないが、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディー分子又はドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ）は、ＶＨ及びＶＬドメインを並べるようジスルフィド橋を導入することによって安定化できる。例えば、Ｒｅｉｔｅｒら、１９９６年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：１２３９〜１２４５頁参照のこと。二重特異性抗体は、従来技術（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ＆Ｗｉｎｔｅｒ、１９９３年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：４４６〜４４９頁参照のこと、この特定の方法は、化学的又はハイブリッドハイブリドーマからの製造を含む）及びその他の技術、例えば、それだけには限らないが、ＢｉＴＥ（商標）技術（ペプチドリンカーを用いて異なる特異性の抗原結合領域を有する分子）及びｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ工学（例えば、Ｒｉｄｇｅｗａｙら、１９９６年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９：６１６〜６２１頁参照のこと）を用いて製造できる。二重特異性ダイアボディーは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で製造でき、その他のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト同様、これらの分子は、当業者には当然であろうが、適当なライブラリーにおいてファージディスプレイを用いて選択できる（例えば、国際出願番号ＷＯ９４／１３８０４参照のこと）。

注目するＣＤＲが挿入されている可変ドメインは、任意の生殖系列又は再配列されたヒト可変ドメインから得ることができる。可変ドメインはまた合成によって製造してもよい。ＣＤＲ領域は、組換えＤＮＡ技術を用いて、それぞれの可変ドメインに導入できる。これを達成できる１つの手段が、Ｍａｒｋｓら、１９９２年、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９〜７８３頁に記載されている。可変重ドメインは、可変軽ドメインと対を形成し、抗原結合部位を提供し得る。さらに、独立領域（例えば、可変重ドメイン単独）を用いて、抗原と結合できる。さらに、技術者ならば、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは、おそらくは別個の遺伝子によってコードされているが、組換え法を用い、合成リンカーによって接続でき、このためにＶＬ及びＶＨ領域対が一価分子（ｓｃＦｖｓ）を形成する単一のタンパク質鎖として作製されるのが可能となるということは十分承知している。

特定の実施形態では、ＣＤＲ（類）を生殖系列フレームワーク領域中に提供する。本明細書において、特定の実施形態は、配列番号１７及び配列番号８５からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ（類）を、関連ＣＤＲ（類）の代わりにＶＨ３中に提供する。本明細書において、特定の実施形態は、配列番号３３、配列番号５１及び配列番号６７からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ（類）を、関連ＣＤＲ（類）の代わりにＶＨ５中に提供する。本明細書において、特定の実施形態は、配列番号７、配列番号２３及び配列番号７５からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ（類）を、関連ＣＤＲ（類）の代わりにＶＬ３中に提供する。本明細書において、特定の実施形態は、配列番号４１及び配列番号５７からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ（類）を、関連ＣＤＲ（類）の代わりにＶＫ１中に提供する。

特定の実施形態では、配列番号１、配列番号１９、配列番号３５、配列番号５３及び配列番号６９からなる群から選択される配列を含む軽鎖領域を含む、本明細書に定義される抗体分子を提供する。さらなる実施形態は、記載される軽鎖領域と、配列番号９、配列番号２５、配列番号４３、配列番号５９及び配列番号７７からなる群から選択される配列を含む重鎖領域の両方を含む抗体分子を提供する。

本発明は、ヒト、ヒト化、脱免疫された、キメラ化及び霊長類化された抗体分子を包含する。本発明はまた、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）の方法によって製造される抗体分子を包含する。例えば、Ｍａｒｋら、１９９４年、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、第１１３巻：Ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１０５〜１３４頁参照のこと。開示される抗体分子に関して「ヒト」とは、具体的に、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変及び／又は定常領域を有する抗体分子を指し、ここで、前記配列は、必ずしもそうではないが、特定のアミノ酸置換又はヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされていない残基を有するよう修飾／変更されている場合もある。このような突然変異は、それだけには限らないが、インビトロでのランダム又は部位特異的突然変異誘発、又はインビボでの体細胞突然変異によって導入できる。文献において論じられた突然変異技術の特定の例として、Ｇｒａｍら、１９９２年、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、８９：３５７６〜３５８０頁；Ｂａｒｂａｓら、１９９４年、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、９１：３８０９〜３８１３頁、及びＳｃｈｉｅｒら、１９９６年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１〜５６７頁に開示されるものがある。これらは、単に特定の例であって、唯一の利用可能な技術を表すものではない。科学文献中には、利用可能である多量の突然変異技術があり、当業者には広く理解されている。開示される抗体分子に関して「ヒト化」とは、具体的に、別の哺乳類種、例えば、マウスに由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列にグラフトされている抗体分子を指す。開示される抗体分子に関して「霊長類化」とは、非霊長類のＣＤＲ配列が、霊長類フレームワーク配列中に挿入されている抗体分子を指し、例えば、ＷＯ９３／０２１０８及びＷＯ９９／５５３６９参照のこと。

本発明の特定の抗体として、モノクローナル抗体があり、特定の実施形態では、以下の抗体形式のうちの１種である：ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又は前記のいずれかの任意の誘導体。これに関して、用語「その誘導体」又は「誘導体」とは、とりわけ、（ｉ）可変領域の一方又は両方（すなわち、ＶＨ及び／又はＶＬ）に修飾を含む抗体及び抗体分子、（ｉｉ）ＶＨ及び／又はＶＬの定常領域中に操作を含む抗体及び抗体分子、（ｉｉｉ）通常は免疫グロブリン分子の一部ではないさらなる化学部分を含む（例えばペグ化）抗体及び抗体分子、を含む。

可変領域の操作は、１以上のＶＨ及び／又はＶＬ ＣＤＲ領域内であり得る。部位特異的突然変異誘発、ランダム突然変異誘発又は配列若しくは分子多様性を生じさせるためのその他の方法を使用して突然変異体を作製することができ、これをその後、本明細書に記載されるものを含む利用可能なインビトロ又はインビボアッセイにおいて注目する機能特性について調べることができる。

本発明の抗体はまた、注目する抗体の１以上の特性を改善するよう、ＶＨ及び／又はＶＬ内のフレームワーク残基に修飾がなされているものを含む。通常、このようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低減するよう行われる。例えば、１つのアプローチとして、１個以上のフレームワーク残基を、対応する生殖系列配列に「逆突然変異させる」ことがある。より具体的には、体細胞突然変異を受けている抗体は、抗体が由来するものから得られる生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含み得る。このような残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来するものから得られた生殖系列配列と比較することによって同定できる。このような「逆突然変異された」抗体もまた、本発明に含まれるものとする。別の種類のフレームワーク修飾は、フレームワーク領域内の、さらには、１以上のＣＤＲ領域内の１個以上の残基を突然変異させて、Ｔ細胞エピトープを除去し、それによって抗体の免疫原性の可能性を低減することを含む。このアプローチはまた、「脱免疫化」と呼ばれ、Ｃａｒｒらによる米国特許公開第２００３０１５３０４３号において、さらに詳細に記載されている。

フレームワーク又はＣＤＲ領域内になされる修飾に加え又はそれに代わるものとして、本発明の抗体は、Ｆｃ領域内に修飾を含むよう設計してもよく、存在する場合には、通常、抗体の１以上の機能特性、例えば、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合及び／又は抗原依存性の細胞傷害活性を変更する。

所望のエフェクター機能に焦点を合わせるよう種々の抗体アイソタイプを含む「ハイブリッド」又は「コンビナトリアル」ＩｇＧ型を作製するという概念は、概して記載されている；例えば、Ｔａｏら、１９９１年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１０２５〜１０２８頁参照のこと。本発明の特定の実施形態は、抗体の側でＦｃγＲ受容体又はＣ１ｑとの結合の低減をもたらすことがわかっているＦｃ領域に特定の操作をほどこす抗体分子を包含する。したがって、本発明は、通常の薬物動態学的（「ＰＫ」）特性を保持しながら、抗体依存性細胞傷害（「ＡＤＣＣ」）、補体媒介性細胞傷害（「ＣＭＣ」）を誘発しない（又はより低い程度に誘発する）、又は免疫複合体を形成する、本記載に一致する抗体を包含する。本発明の特定の実施形態は、その免疫グロブリン構造の一部として、配列番号８７を含む、本発明に従って定義される抗体分子を提供する。図６は、配列番号８７、特に、ＩｇＧ２ｍ４の、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４との比較を示す。

特定のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、検出可能な標識を保持してもよいし、毒素（例えば細胞毒）、放射性同位元素、放射性核種、リポソーム、標的部分、バイオセンサー、カチオン性テール又は酵素（例えばペプチジル結合又はリンカーを介して）と結合していてもよい。このようなＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト組成物は、本発明のさらなる態様を形成する。

別の態様では、本発明は、開示されるＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストをコードする単離された核酸を提供する。核酸は、全細胞中に、細胞溶解物中に、部分精製された形で又は実質的に純粋な形で存在し得る。核酸は、例えば、限定するものではないが、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動及び当技術分野で公知のその他の適した方法を含む標準技術を用いて、その他の細胞成分又はその他の夾雑物、例えばその他の細胞性核酸又はタンパク質から分離して精製された場合に、「単離される」又は「実質的に純粋にされる」。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含めて）及び／又はＲＮＡを含み得る。本発明の核酸は、標準的な分子生物学の技術を用いて得ることができる。ハイブリドーマ（例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保持する形質転換マウスから調製されたハイブリドーマ）によって発現される抗体については、標準的なＰＣＲ増幅又はｃＤＮＡクローニング技術によって得られるハイブリドーマによって作製された抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡを得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから得られる（例えば、ファージディスプレイ技術を用いて）抗体については、抗体をコードする核酸をライブラリーから回収することができる。

本発明は、開示される可変重鎖及び／又は軽鎖及びその選択成分、特に開示される個々のＣＤＲ３領域をコードする単離された核酸を包含する。その特定の実施形態では、ＣＤＲ（類）は、抗体フレームワーク領域内に提供される。特定の実施形態は、ＣＤＲ（類）をコードする単離された核酸を、生殖系列フレームワーク領域中に提供する。本明細書において、特定の実施形態は、重鎖ＣＤＲ（類）配列番号１８又は８６をコードする単離された核酸を、関連ＣＤＲ（類）をコードする核酸の代わりにＶＨ３中に提供する。本明細書において特定の実施形態は、重鎖ＣＤＲ（類）配列番号３４、５２又は６８をコードする単離された核酸を、関連ＣＤＲ（類）をコードする核酸の代わりにＶＨ５中に提供する。本明細書において、特定の実施形態は、軽鎖ＣＤＲ（類）配列番号８、２４又は７６をコードする単離された核酸を、関連ＣＤＲ（類）をコードする核酸の代わりにＶＬ３中に提供する。本明細書において、特定の実施形態は、軽鎖ＣＤＲ（類）配列番号４２又は５８をコードする単離された核酸を、関連ＣＤＲ（類）をコードする核酸の代わりにＶＫ１中に提供する。可変領域をコードする単離された核酸は、任意の所望の抗体分子形式、例えば、それだけには限らないが、以下：Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体分子（例えば、限定するものではないが、抗体又は受容体リガンドなどの別のペプチド又はタンパク質とは異なる結合特異性を有する第２の機能性部分と連結している本明細書に開示されるＰＣＳＫ９特異的抗体又は抗原結合断片を含む抗体分子）、二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体、ミニボディー、ｄＡｂ断片、ダイアボディー、トリアボディー又はテトラボディー、ミニボディー、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はその任意の誘導体内に提供され得る。

特定の実施形態は、配列番号１、配列番号１９、配列番号３５、配列番号５３及び配列番号６９からなる群から選択される配列を含む軽鎖領域を含む本明細書に定義される抗体分子をコードする単離された核酸を提供する。特定の実施形態は、配列番号２、配列番号２０、配列番号３６、配列番号５４及び配列番号７０からなる群から選択される核酸を含む。さらなる実施形態は、記載される軽鎖領域と、配列番号９、配列番号２５、配列番号４３、配列番号５９及び配列番号７７からなる群から選択される配列を含む重鎖領域の両方を含む抗体分子を提供する。重鎖領域をコードする核酸配列は、特定の実施形態では、配列番号１０、配列番号２６、配列番号４４、配列番号６０及び配列番号７８からなる群から選択される配列を含み得る。

特定の実施形態は、配列番号１１、配列番号２７、配列番号４５、配列番号６１及び配列番号７９からなる群から選択される重鎖可変ドメインを含む抗体分子をコードする単離された核酸を提供し、その特定の実施形態は、それぞれ、核酸配列配列番号１２、配列番号２８、配列番号４６、配列番号６２又は配列番号８０を含む。本発明の特定の実施形態は、（ｉ）重鎖ＣＤＲ１ヌクレオチド配列配列番号１４、（ｉｉ）重鎖ＣＤＲ２ヌクレオチド配列配列番号１６、及び／又は（ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３ヌクレオチド配列配列番号１８、を含む抗体分子をコードする単離された核酸を提供する。本発明の特定の実施形態は、（ｉ）重鎖ＣＤＲ１ヌクレオチド配列配列番号３０、（ｉｉ）重鎖ＣＤＲ２ヌクレオチド配列配列番号３２、及び／又は（ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３ヌクレオチド配列配列番号３４、を含む抗体分子をコードする単離された核酸を提供する。本発明の特定の実施形態は、（ｉ）重鎖ＣＤＲ１ヌクレオチド配列配列番号４８、（ｉｉ）重鎖ＣＤＲ２ヌクレオチド配列配列番号５０、及び／又は（ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３ヌクレオチド配列配列番号５２、を含む抗体分子をコードする単離された核酸を提供する。本発明の特定の実施形態は、（ｉ）重鎖ＣＤＲ１ヌクレオチド配列配列番号６４、（ｉｉ）重鎖ＣＤＲ２ヌクレオチド配列配列番号６６、及び／又は（ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３ヌクレオチド配列配列番号６８、を含む抗体分子をコードする単離された核酸を提供する。本発明の特定の実施形態は、（ｉ）重鎖ＣＤＲ１ヌクレオチド配列配列番号８２、（ｉｉ）重鎖ＣＤＲ２ヌクレオチド配列配列番号８４、及び／又は（ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３ヌクレオチド配列配列番号８６、を含む抗体分子をコードする単離された核酸を提供する。特定の実施形態は、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９及び配列番号１０１からなる群から選択される軽鎖可変ドメインを含む抗体分子をコードする単離された核酸を提供し、その特定の実施形態は、それぞれ、核酸配列配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００又は配列番号１０２を含む。本発明の特定の実施形態は、（ｉ）軽鎖ＣＤＲ１ヌクレオチド配列配列番号４、（ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ２ヌクレオチド配列配列番号６、及び／又は（ｉｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３ヌクレオチド配列配列番号８、を含む抗体分子をコードする単離された核酸を提供する。本発明の特定の実施形態は、（ｉ）軽鎖ＣＤＲ１ヌクレオチド配列配列番号２２、（ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ２ヌクレオチド配列配列番号６、及び／又は（ｉｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３ヌクレオチド配列配列番号２４、を含む抗体分子をコードする単離された核酸を提供する。本発明の特定の実施形態は、（ｉ）軽鎖ＣＤＲ１ヌクレオチド配列配列番号３８、（ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ２ヌクレオチド配列配列番号４０、及び／又は（ｉｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３ヌクレオチド配列配列番号４２、を含む抗体分子をコードする単離された核酸を提供する。本発明の特定の実施形態は、（ｉ）軽鎖ＣＤＲ１ヌクレオチド配列配列番号５６、（ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ２ヌクレオチド配列配列番号４０、及び／又は（ｉｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３ヌクレオチド配列配列番号５８、を含む抗体分子をコードする単離された核酸を提供する。本発明の特定の実施形態は、（ｉ）軽鎖ＣＤＲ１ヌクレオチド配列配列番号７２、（ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ２ヌクレオチド配列配列番号７４、及び／又は（ｉｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３ヌクレオチド配列配列番号７６、を含む抗体分子をコードする単離された核酸を提供する。本発明の特定の実施形態は、抗体の側でＦｃγＲ受容体又はＣ１ｑとの結合の低減をもたらす、Ｆｃ領域中に操作を有する抗体分子をコードする核酸を包含する。本発明の特定の一実施形態は、配列番号８８を含む単離された核酸である。特定の実施形態では、合成ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、適した発現ベクター内で合成され、構築されるオリゴヌクレオチドから作製された核酸からの発現によって製造でき、例えば、Ｋｎａｐｐｉｃｋら、２０００年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７〜８６、及びＫｒｅｂｓら、２００１年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２５４：６７〜８４頁参照のこと。

また、本明細書に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも約９０％同一であり、より好ましくは、少なくとも約９５％同一であるヌクレオチド配列を含み、そのヌクレオチド配列が細胞のＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９依存性阻害を阻害するＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストをコードする単離された核酸が、本発明内に含まれる。同一性を調べるための配列比較法は、当業者には公知であり、先に論じられたものを含む。「少なくとも約９０％同一である」とは、少なくとも約９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％同一であるものを含む。

本発明はさらに、特定のハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に開示される核酸の相補体とハイブリダイズする単離された核酸を提供し、その核酸は、ＰＣＳＫ９と特異的に結合し、ＰＣＳＫ９機能を拮抗する。核酸をハイブリダイズさせる方法は、当技術分野では周知であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．、６．３．１−６．３．６、１９８９年参照のこと。本明細書において定義される中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、５×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、０．５％ｗ／ｖ ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有する予備洗浄溶液、約５０％ｖ／ｖホルムアミド、６×ＳＳＣのハイブリダイゼーションバッファー及び５５℃のハイブリダイゼーション温度（又は４２℃のハイブリダイゼーション温度を用い、その他の類似のハイブリダイゼーション溶液、例えば、約５０％ｖ／ｖホルムアミドを含有するもの）及び０．５×ＳＳＣ、０．１％ｗ／ｖ ＳＤＳ中、６０℃の洗浄条件を用いてもよい。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、４５℃で６×ＳＳＣ、及びそれに続く０．１×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中、６８℃での１回以上の洗浄であり得る。さらに、当業者ならば、互いに少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸が、通常、互いにハイブリダイズされたままであるようにハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを高め又は低下させるよう、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件を操作できる。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を及ぼす基本パラメータ及び適した条件を考案する指針は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、第９及び１１章、１９８９年、及びＡｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、２．１０及び６．３〜６．４節、１９９５年によって示されており、当業者によって、例えばＤＮＡの長さ及び／又は塩基組成に基づいて容易に決定され得る。

別の態様では、本発明は、前記核酸を含むベクターを提供する。本発明に一致するベクターとしては、限定されないが、意図される目的上適当なレベルでの所望の抗体分子の発現に適したプラスミド及びその他の発現構築物（例えば、必要に応じてファージ又はファージミド）が挙げられる；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ参照のこと。ほとんどのクローニング目的に、ＤＮＡベクターを使用してよい。一般的なベクターには、プラスミド、改変ウイルス、バクテリオファージ、コスミド、酵母人工染色体及びその他の形のエピソームＤＮＡ又は組み込まれたＤＮＡが含まれる。個々の遺伝子導入、組換えＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの作製又はその他の用途のために適当なベクターを決定することは十分に当業者の範囲内である。特定の実施形態では、ベクターは、組換え遺伝子に加え、宿主細胞における自己複製のための複製起点、適当な調節配列、例えば、プロモーター、終結配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、選択マーカー、限定された数の有用な制限酵素部位、必要に応じてその他の配列及び高コピー数のための可能性も含み得る。タンパク質特異的アンタゴニストを製造するための発現ベクターの例は、当技術分野では周知であり、例えば、Ｐｅｒｓｉｃら、１９９７年、Ｇｅｎｅ、１８７：９〜１８頁；Ｂｏｅｌら、２０００年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２３９：１５３〜１６６頁、及びＬｉａｎｇら、２００１年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４７：１１９〜１３０頁参照のこと。必要であれば、アンタゴニストをコードする核酸を、当技術分野で周知の技術を用いて宿主染色体に組み込んでもよく、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９９年、及びＭａｒｋｓら、国際出願番号ＷＯ９５／１７５１６参照のこと。核酸はまた、エピソームで維持された又は人工染色体に組み込まれたプラスミドで発現されてもよく、例えば、Ｃｓｏｎｋａら、２０００年、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１１３：３２０７〜３２１６頁；Ｖａｎｄｅｒｂｙｌら、２００２年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、５：１０参照のこと。抗体分子に関して具体的には、抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は、別個のベクターに挿入される場合があり、又は、より通常は、両遺伝子は同一の発現ベクター中に挿入され得る。任意のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストをコードする核酸は、標準法（例えば、核酸断片及びベクター上の相補的制限部位のライゲーション又は制限部位が存在しない場合には平滑末端ライゲーション）を用いて発現ベクター中に挿入できる。これを実施するやり方の別の特定の例として、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈの「ＩｎＦｕｓｉｏｎ」システム若しくはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎの「ＴＯＰＯ」システム（両方ともインビトロ）又は細胞内（例えば、Ｃｒｅ−Ｌｏｘシステム）での組み換え法の使用がある。抗体分子に関して具体的には、軽鎖及び重鎖可変領域を用い、ベクター内でＶＨセグメントがＣＨセグメント（類）と機能し得る形で連結されるよう、そして、ベクター内でＶＬセグメントがＣＬセグメントと機能し得る形で連結されるよう、それらを所望のアイソタイプの重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をすでにコードしている発現ベクターに挿入することによって、任意の抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を作製できる。さらに又はあるいは、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストをコードする核酸を含む組換え発現ベクターは、宿主細胞からのアンタゴニストの分泌を容易にするシグナルペプチドをコードし得る。核酸は、シグナルペプチドをコードする核酸が、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストをコードする核酸に隣接してインフレームで連結されるようベクターにクローニングできる。シグナルペプチドは、免疫グロブリン又は非免疫グロブリンシグナルペプチドであり得る。当業者に利用可能な任意の技術を使用して、宿主細胞に核酸を導入してよい；例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、１９８５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：１２０２頁参照のこと。注目する核酸分子を発現ベクターにサブクローニングし、ベクターを含有する宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトする方法、及びそれぞれの発現ベクターを宿主細胞に導入するステップ及び適当な条件下で宿主細胞を培養するステップを含む実質的に純粋なタンパク質を作製する方法は周知である。そのように製造されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、従来法で宿主細胞から回収できる。注目する細胞に核酸を導入するのに適した技術は、使用されている細胞の種類に応じて変わる。一般的な技術としては、それだけには限らないが、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介性トランスフェクション及び注目する細胞株に適当なウイルス（例えば、レトロウイルス、ワクシニア、バキュロウイルス又はバクテリオファージ）を用いる形質導入が挙げられる。

別の態様では、本発明は、開示されるＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストをコードする核酸を含む単離された細胞（類）を提供する。ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの組換え製造には、種々の異なる細胞株、例えば、それだけには限らないが、原核生物由来のもの（例えば、大腸菌、桿菌及びストレプトマイセス属）及び真核生物由来のもの（例えば、酵母、バキュロウイルス及び哺乳類）を用いることができる；例えば、Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．及びＳｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、１９９９年参照のこと。形質転換植物を含めた植物細胞及び形質転換動物を含めた動物細胞（ヒト以外）も、本明細書に開示される核酸又はアンタゴニストを含み、本発明の一部として考慮される。適した哺乳類細胞株、例えば、それだけには限らないが、チャイニーズハムスター卵巣に由来するもの（ＣＨＯ細胞、例えば、それだけには限らないが、例えばＤＨＦＲ選択マーカー（例えば、Ｋａｕｆｍａｎ及びＳｈａｒｐ、１９８２年、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１〜６２１頁に記載される）とともに用いられるＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ、１９８０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６〜４２２０頁に記載される）、ＮＳ０骨髄腫細胞（ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６及びＥＰ３３８，８４１に記載されるようなＧＳ発現系が用いられ得る）、ＣＯＳ細胞、ＳＰ２細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＹＢ２／０ラット骨髄腫細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト胎児網膜細胞及び本明細書に開示される核酸又はアンタゴニストを含むその他のものは、本発明のさらなる実施形態を形成する。本発明の特定の実施形態は、大腸菌；例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、１９９１年、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：５４５〜５５１頁参照のこと、又はピキアなどの酵母及びその組換え誘導体（例えば、Ｌｉら、２００６年、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：２１０〜２１５頁）を使用してよい。本発明のさらなる特定の実施形態は、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの製造のために真核細胞を使用してよく、Ｃｈａｄｄ＆Ｃｈａｍｏｗ、２００１年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１２：１８８〜１９４頁、Ａｎｄｅｒｓｅｎ＆Ｋｒｕｍｍｅｎ、２００２年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３：１１７頁、Ｌａｒｒｉｃｋ＆Ｔｈｏｍａｓ、２００１年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１２：４１１〜４１８頁参照のこと。本発明の特定の実施形態は、適切な翻訳後修飾を用いて、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを産生できる哺乳類細胞を使用してよい。翻訳後修飾としては、限定されるものではないが、ジスルフィド結合形成及びグリコシル化が挙げられる。別の種類の翻訳後修飾としては、シグナルペプチド切断がある。本明細書において好ましい実施形態は、適当なグリコシル化があり、例えば、Ｙｏｏら、２００２年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２６１：１〜２０頁参照のこと。天然に存在する抗体は、重鎖と結合している少なくとも１個のＮ結合型炭水化物を含む。同文献。異なる種類の哺乳類宿主細胞を用いて、効率的な翻訳後修飾を提供できる。このような宿主細胞の例として、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ、Ｃ６、ＰＣ１２及び骨髄腫細胞が挙げられ、Ｙｏｏら、２００２年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２６１：１〜２０頁、及びＰｅｒｓｉｃら、１９９７年、Ｇｅｎｅ、１８７：９〜１８頁参照のこと。

別の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドを含む単離された細胞を提供する。

別の態様では、本発明は、ヒトＰＣＳＫ９に対する特異性を有するＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト、又は所望のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの重鎖及び／若しくは軽鎖（所望のアンタゴニストによって決定される）をコードする核酸を含む細胞を、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの発現又は前記重鎖及び／若しくは軽鎖の発現及びＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストへの構築を可能にする条件下でインキュベートし、そして細胞から前記ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを単離することを含む、本発明のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを作製する方法を提供する。特定の所望の重鎖及び／又は軽鎖配列を作製するための一例は、まず、ＰＣＲを用いて生殖系列重鎖及び／又は軽鎖可変配列を増幅（及び修飾）することである。ヒト重及び／又は軽可変領域の生殖系列配列は、当業者にとって容易に入手可能であり、例えば、「Ｖｂａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベース、及びＫａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ら、１９９１年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国保険社会福祉省、ＮＩＨ出版番号９１〜３２４２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ、Ｉ．Ｍ．ら、１９９２年、「Ｔｈｅ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｒｍｌｉｎｅ ＶＨ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｒｅｖｅａｌｓ ａｂｏｕｔ Ｆｉｆｔｙ Ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ＶＨ Ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ Ｌｏｏｐｓ」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６〜７９８頁；及びＣｏｘ，Ｊ．Ｐ．Ｌ．ら、１９９４年、「Ａ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ Ｖｋ Ｓｅｇｍｅｎｔｓ Ｒｅｖｅａｌｓ ａ Ｓｔｒｏｎｇ Ｂｉａｓ ｉｎ ｔｈｅｉｒ Ｕｓａｇｅ」、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７〜８３６頁参照のこと。生殖系列配列の突然変異誘発は、標準法、例えば、突然変異がＰＣＲプライマー中に組み込まれるＰＣＲ媒介性突然変異誘発、又は部位特異的突然変異誘発を用いて実施してよい。全長抗体が望まれる場合は、ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列が入手可能であり、例えばＫａｂａｔ．Ｅ．Ａ．ら、１９９１年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国保険社会福祉省、ＮＩＨ出版番号９１〜３２４２参照のこと。これらの領域を含む断片は、例えば、標準ＰＣＲ増幅によって得ることができる。あるいは、当業者ならば、重鎖及び／又は軽鎖定常領域をすでにコードしているベクターを利用できる。

元の抗体の特異性を保持する他の抗体分子を組換え製造するために利用可能な技術が存在する。この特定の例として、免疫グロブリン可変領域又はＣＤＲをコードするＤＮＡが、別の抗体分子の定常領域又は定常領域及びフレームワーク領域に導入されているものがあり；例えば、ＥＰ−１８４，１８７、ＧＢ２１８８６３８及びＥＰ−２３９４００を参照のこと。キメラ抗体を含む抗体分子のクローニング及び発現は、文献に記載されており、例えば、ＥＰ０１２０６９４及びＥＰ０１２５０２３を参照のこと。

本発明に一致する抗体分子は、一例では、公知の技術を用いて産生され、次いで本明細書において同定される特徴についてスクリーニングされ得る。モノクローナル抗体を調製するための基礎技術は、文献に記載されており、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５年、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７頁）参照のこと。完全ヒトモノクローナル抗体は、利用可能な方法によって製造できる。これらの方法として、限定されるものではないが、マウス抗体遺伝子が不活化されており、次いで機能的ヒト抗体遺伝子のレパートリーで置換されており、一方で、マウス免疫系のその他の成分は変更されていない免疫系を有する遺伝子操作されたマウス株の使用が挙げられる。このような遺伝子操作されたマウスによって、高親和性の完全ヒトモノクローナル抗体をもたらす自然なインビボ免疫応答及び親和性成熟プロセスが可能となる。この技術は当技術分野では周知であり、種々の刊行物、例えば限定されないが、米国特許第５，５４５，８０６号、同５，５６９，８２５号、同５，６２５，１２６号、同５，６３３，４２５号、同５，７８９，６５０号、同５，８７７，３９７号、同５，６６１，０１６号、同５，８１４，３１８号、同５，８７４，２９９号、同５，７７０，２４９号（ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌに譲渡され、「ＵｌｔｒａＭａｂ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ」の保護の下、Ｍｅｄａｒｅｘによって利用可能）並びに米国特許第５，９３９，５９８号、同６，０７５，１８１号、同６，１１４，５９８号、同６，１５０，５８４号及び関連ファミリーメンバー（Ａｂｇｅｎｉｘに譲渡され、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を開示する）に十分に記載されている。また、Ｋｅｌｌｅｒｍａｎ及びＧｒｅｅｎ、２００２年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３：５９３〜５９７頁、並びにＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ＆Ｓｔｅｆａｎ、２００１年、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌｓからの総説を参照のこと。

あるいは、本発明と一致するＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストのライブラリーを、ＰＣＳＫ９と接触させてもよく、選択された特異的結合を実証することができる。次いで、適切な機能、すなわち細胞のＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９依存性阻害の阻害を確実にすることができるように機能研究を実施する。濃縮技術、例えばそれだけには限らないが、ファージディスプレイ（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号、同５，７３３，７４３号、同５，８７１，９０７号、同５，８７２，２１５号、同５，８８５，７９３号、同５，９６２，２５５号、同６，１４０，４７１号、同６，２２５，４４７号、同６，２９１，６５０号、同６，４９２，１６０号、同６，５２１，４０４号、同６，５４４，７３１号、同６，５５５，３１３号、同６，５８２，９１５号、同６，５９３，０８１号、並びに１９９２年５月２４日に出願された優先出願ＧＢ９２０６３１８に頼るその他の米国ファミリーメンバー及び／又は出願に開示されるＣａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（「ＣＡＴ」）からの技術を参照のこと；また、Ｖａｕｇｈｎら、１９９６年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：３０９〜３１４頁も参照のこと）、リボソームディスプレイ（例えば、Ｈａｎｅｓ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、１９９７年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：４９３７〜４９４２頁参照のこと）、細菌ディスプレイ（例えば、Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、１９９７年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５：２９〜３４頁参照のこと）、及び／又は酵母ディスプレイ（例えば、Ｋｉｅｋｅら、１９９７年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１０：１３０３〜１３１０頁参照のこと）を用いてライブラリーからタンパク質特異的分子を選択するために当業者にとって利用可能な種々の技術がある。例えば、ライブラリーをバクテリオファージ粒子の表面上にディスプレイでき、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストをコードする核酸がその表面上に発現され、ディスプレイされる。次いで、所望のレベルの活性を示すバクテリオファージ粒子から核酸を単離し、この核酸を所望のアンタゴニストの開発に用いてよい。ファージディスプレイは、文献に十分に記載されており；例えば、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ＆Ｓｔｅｆａｎ、上記及び国際出願番号ＷＯ９２／０１０４７参照のこと。抗体分子に関して具体的には、本発明と一致する個々の重鎖又は軽鎖クローンを用いて、組み合わされた重鎖及び軽鎖の分子を相互作用により形成することができる相補的重鎖又は軽鎖をそれぞれスクリーニングしてもよく、例えば、国際出願番号ＷＯ９２／０１０４７参照のこと。当業者にとって利用可能な任意のパニング法を用いて、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを同定してもよい。これを達成するための別の具体的な方法は、溶液中で標的抗原、例えば、ビオチン化可溶性ＰＣＳＫ９に対してパニングし、次いで、ストレプトアビジンコートされた磁性ビーズ上にＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト−ファージ複合体を捕獲し、次いで、これを洗浄して非特異的に結合したファージを除去することである。次いで、捕獲されたファージを、本明細書に記載されるプレート（例えば、ＤＴＴ）の表面から回収される同様の方法でビーズから回収できる。

ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、当業者にとって利用可能な技術によって精製してよい。関連アンタゴニスト調製物、腹水、ハイブリドーマ培養液又は関連サンプルの力価は、それだけには限らないが、沈殿、受身凝集反応、酵素結合免疫吸着抗体（「ＥＬＩＳＡ」）技術及びラジオイムノアッセイ（「ＲＩＡ」）技術を含む種々の血清学的又は免疫学的アッセイによって決定できる。

別の態様では、本発明は、ＰＣＳＫ９によって通常影響を受ける（すなわち、ＬＤＬ受容体を含む）細胞又は組織サンプルを、本明細書に開示されるＰＳＣＫ９特異的アンタゴニストと、前記アンタゴニストが存在する場合にＰＣＳＫ９と結合し、細胞のＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９の阻害を阻害するのを可能にする条件下で接触させることを含む、ＰＣＳＫ９の活性を拮抗する方法を提供する。本発明の特定の実施形態は、細胞がヒト細胞であるこのような方法を含む。別の態様では、本発明は、被験者に治療上有効量の本発明のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト投与することを含む、被験者においてＰＣＳＫ９の活性を拮抗する方法を提供する。用語「拮抗性の」の使用は、ＰＣＳＫ９の１以上の機能に対立する、対抗する、中和する又は抑制する作用を指す。１以上の関連ＰＣＳＫ９機能特性の阻害又は拮抗作用は、当技術分野で公知の方法論（例えば、Ｂａｒａｋ＆Ｗｅｂｂ、１９８１年、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９０：５９５〜６０４頁；Ｓｔｅｐｈａｎ＆Ｙｕｒａｃｈｅｋ、１９９３年、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３４：３２５３３０頁；及びＭｃＮａｍａｒａら、２００６年、Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、３６９：１５８〜１６７頁参照のこと）並びに本明細書に記載されるものに従って容易に調べることができる。阻害又は拮抗作用は、アンタゴニストの不在下で見られるもの、又は、例えば無関係の特異性を有する対照アンタゴニストが存在する場合に見られるものに対してＰＣＳＫ９活性の低下をもたらす。本発明と一致するＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、ＰＣＳＫ９機能を、測定されるパラメータの少なくとも１０％低下させて拮抗し、より好ましくは、測定されるパラメータの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％及び９５％の低下が好ましい。ＰＣＳＫ９機能のこのような阻害／拮抗作用は、その機能が、被験者に負に影響を与える特定の表現型、疾患、障害又は症状に少なくとも幾分か寄与している例では特に有効である。また、ＰＣＳＫ９関連疾患、障害又は症状、あるいは、ＰＣＳＫ９アンタゴニストの効果から恩恵を受ける疾患、障害又は症状の治療のための医薬の製造のために開示されるアンタゴニストを使用する方法も意図される。本明細書に開示されるＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを、特定の個体（ヒト又は霊長類）を治療又は診断する方法において用いることができる。治療する方法は、実際は、予防的又は治療的であり得る。別の態様では、本発明は、本発明のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト、及び薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤、安定剤、バッファー又は治療される個体への所望の形式及び量でのアンタゴニストの投与を容易にするよう設計された代替物とを含む薬学的に許容される組成物を提供する。本発明と一致する治療方法は、個体に治療上（又は予防上）有効な量の本発明のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを投与することを含む。量に関して、用語「治療上有効な」又は「予防上有効な」の使用は、所望の期間、所望の治療効果／予防効果を達成するよう意図される投与量で必要な量を指す。所望の効果は、例えば、治療される症状と関連する少なくとも１つの症状の寛解であり得る。これらの量は、当業者には当然であるが、種々の因子、例えば、それだけには限らないが、個体の疾患の状態、年齢、性別及び体重、並びにＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの個体において所望の効果を誘発する能力に従って変わる。応答は、インビトロアッセイ、インビボ非ヒト動物研究によって実証され、及び／又は臨床試験からさらに支えられ得る。本発明のアンタゴニストベースの医薬組成物は、当技術分野で公知の任意の数の方法によって製剤でき、例えば、ＭｃＧｏｆｆ及びＳｃｈｅｒ、２０００年、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ／Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｉｎ−ＭｃＮａｌｌｙ、Ｅ．Ｊ．編Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ：Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ；１３９〜１５８頁；Ａｋｅｒｓ＆Ｄｅｆｉｌｉｐｐｉｓ、２０００年、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｉｎ−Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ：Ｔａｙｌｏｒ及びＦｒａｎｃｉｓ；１４５〜１７７頁；Ａｋｅｒｓら、２００２年、Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：４７〜１２７頁参照のこと。患者投与に適した薬学的に許容される組成物は、生物活性を保持し、その一方で、許容される温度範囲内の貯蔵の間、最大安定性も促進するように、製剤中にＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの有効量を含む。

アンタゴニストベースの薬学的に許容される組成物は、液体又は固体の形であり得る。液体又は固体製剤を製造するための任意の技術を利用してよい。このような技術は、十分に当業者の能力の範囲内である。固体製剤は、任意の利用可能な方法、例えば、それだけには限らないが、凍結乾燥、噴霧乾燥又は超臨界流体技術による乾燥によって製造してよい。経口投与のための固体製剤は、所定量及び所定の期間内に、アンタゴニストを患者が利用しやくする任意の形であってよい。経口製剤は、いくつかの固体製剤、例えば、それだけには限らないが、錠剤、カプセル剤又は散剤の形をとり得る。あるいは、固体製剤は、凍結乾燥して、単回投与又は複数回投与のために投与前に溶液にしてもよい。アンタゴニスト組成物は、通常、生物学的に関連するｐＨ範囲内で製剤されなければならず、貯蔵の間、適切なｐＨ範囲を維持するよう緩衝される場合もある。液体及び固体製剤の両方とも、長期間の安定性を保持するためには、通常、低温（例えば、２〜８℃）での貯蔵を必要とする。製剤されたアンタゴニスト組成物、特に液体製剤は、貯蔵の間のタンパク質分解を防ぐ又は最小にするために、静菌薬、例えば、それだけには限らないが、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、クロロブタノール、メチルパラベン及び／又はプロピルパラベンを、有効濃度（例えば、≦１％ｗ／ｖ）で含み得る。静菌薬は、一部の患者には禁忌であり得る。したがって凍結乾燥製剤は、このような成分を含有するか含有しないかのいずれかの溶液で再構築され得る。緩衝された液体又は固体アンタゴニスト製剤のいずれかに、さらなる成分、例えば、それだけには限らないが、抗凍結剤として糖類（例えば、それだけには限らないが、ソルビトール、マンニトール、グリセロール及びズルシトールなどのポリヒドロキシ炭化水素及び／又はスクロース、ラクトース、マルトース又はトレハロースなどの二糖類）、及び、いくつかの例では、関連する塩（例えば、それだけには限らないが、ＮａＣｌ、ＫＣｌ又はＬｉＣｌ）が加えられてもよい。長期間の貯蔵が予定されているこのようなアンタゴニスト製剤、特に液体製剤は、例えば、２〜８℃又はそれより高い温度での長期間の安定性を促進し、その一方で、製剤を非経口注射にとって有用にもするような、有用な総浸透圧の範囲に依存する。必要に応じて、保存料、安定剤、バッファー、抗酸化物質及び／又はその他の添加剤が含まれてもよい。製剤は、二価の陽イオン（例えば、それだけには限らないが、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２及びＭｎＣｌ２）、及び／又は非イオン性界面活性剤（例えば、それだけには限らないが、ポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ８０（商標））、ポリソルベート−６０（Ｔｗｅｅｎ６０（商標））、ポリソルベート−４０（Ｔｗｅｅｎ４０（商標））及びポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ２０（商標））、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、例えば、それだけには限らないが、Ｂｒｉｊ５８（商標）、Ｂｒｉｊ３５（商標）、並びにＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（商標）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４（商標）、ＮＰ４０（商標）、Ｓｐａｎ ８５及びプルロニックシリーズの非イオン性界面活性剤（例えば、プルロニック１２１））などのその他のものを含み得る。このような成分の任意の組み合わせは、本発明の特定の実施形態を形成する。

液体形式の医薬組成物は、液体担体、例えば、水、石油、動物油、植物油、鉱油又は合成オイルを含み得る。液体形式はまた、生理食塩水、デキストロース又はその他のサッカライド溶液又はグリコール、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールを含み得る。

医薬組成物は、好ましくは発熱物質を含まず、適したｐＨ、浸透圧及び安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形であり得る。医薬組成物は、等張性ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液又は乳酸加リンガー注射液に希釈された後、投与のために製剤され得る。

アンタゴニスト治療薬の投与は十分に当業者の範囲内であり（例えば、Ｌｅｄｅｒｍａｎら、１９９１年、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、４７：６５９〜６６４頁；Ｂａｇｓｈａｗｅら、１９９１年、Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、４：９１５〜９２２頁参照のこと）、また、いくつかの因子、例えば、それだけには限らないが、用いられる個々のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト、治療される患者、患者の症状、治療領域、投与経路及び望まれる治療に基づいて変わる。通常の技術を有する医師又は獣医は、アンタゴニストの有効な治療量を容易に決定及び処方できる。投与量範囲は、宿主体重１ｋｇあたり約０．０１〜１００ｍｇ、より通常は、０．０５〜２５ｍｇであり得る。例えば、投与量は、０．３ｍｇ／体重１ｋｇ、１ｍｇ／体重１ｋｇ、３ｍｇ／体重１ｋｇ、５ｍｇ／体重１ｋｇ又は１０ｍｇ／体重１ｋｇ又は１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。例示の目的上、制限されるものではないが、特定の実施形態では、５ｍｇ〜２．０ｇの量を用いて、アンタゴニストを全身に送達できる。毒性を伴わずに効力を生じる範囲内のアンタゴニストの濃度を達成する最適精度は、標的部位に対する薬物のアベイラビリティーの動態学に基づいた投与計画を必要とする。これは、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの分配、平衡及び排出についての検討を含む。本明細書に記載されるアンタゴニストは、適当な投与量で単独で用いてもよい。あるいは、その他の薬剤の同時投与又は逐次投与が望ましい場合もある。代替治療計画と併せて、本発明のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの治療的投与計画を示すことが可能である。例えば、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、その他のコレステロール低下薬、例えば、それだけには限らないが、コレステロール吸収阻害剤（例えば、ゼチーア（商標））及びコレステロール合成阻害剤（例えば、ゾコール（商標）及びバイトリン（商標））と組み合わせて、又はそれとともに用いてもよい。治療できる個体（被験者）として、霊長類、ヒト及び非ヒトが含まれ、また、獣医学上重要な商業用又は家畜用の任意の非ヒト哺乳類又は脊椎動物を含む。

ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、当技術分野で理解される任意の投与経路、例えば、それだけには限らないが、経口投与、注射による投与（その特定の実施形態として、静脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内注射を含む）、吸入による投与、鼻腔内又は局所投与によって、単独又は個体の治療において補助するよう設計されたその他の薬剤と組み合わせて個体に投与してよい。投与経路は、当業者に理解されるいくつかの検討、例えば、それだけには限らないが、治療の所望の生理化学的特徴に基づいて決定されなければならない。治療は、毎日、毎週、隔週又は毎月ベースで、又は所望の治療が効果的でありそして維持されるよう、適当な量のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを所定の回数で個体に送達する任意のその他のレジメで提供され得る。本製剤は、単回投与で又は別個の時点の２回以上の投与で投与してもよい。

特定の実施形態では、治療される症状は、以下からなる群：高コレステロール血症、冠動脈心疾患、メタボリックシンドローム、急性冠動脈症候群及び関連症状から選択される。ＰＳＣＫ９関連症状、あるいは、ＰＣＳＫ９アンタゴニストから恩恵を受ける側にあり得る症状、例えば、上記で特定されたものの治療のための医薬の製造におけるＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの使用は、本発明の重要な実施形態を形成する。

本発明は、遺伝子治療目的の、開示される抗ＰＣＳＫ９アンタゴニストの投与をさらに提供する。このような方法によって、被験者の細胞は、本発明のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストをコードする核酸を用いて形質転換される。次いで、この核酸を含む被験者は、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを内因的に産生する。これまでに、Ａｌｖａｒｅｚら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：３０８１〜３０８７頁、２０００年が、遺伝子治療アプローチを用いて、被験者に一本鎖抗ＥｒｂＢ２抗体を導入した。Ａｌｖａｒｅｚらの、上記によって開示される方法は、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体をコードする核酸の、被験者への導入に容易に適用させることができる。

任意のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストをコードする核酸を被験者に導入できる。

核酸は、当技術分野で公知の任意の手段によって被験者の細胞に導入できる。好ましい実施形態では、核酸がウイルスベクターの一部として導入される。ベクターが由来し得る好ましいウイルスの例として、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、アルファウイルス、インフルエンザウイルス及び望ましい細胞指向性を有するその他の組換えウイルスが含まれる。

種々の企業がウイルスベクターを工業的に製造しており、例えば、限定されるものではないが、Ａｖｉｇｅｎ、Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ、Ｃａｌｉｆ．；ＡＡＶベクター）、Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｓｙｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．；レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶベクター及びレンチウイルスベクター）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（レトロウイルス及びバキュロウイルスベクター）、Ｇｅｎｏｖｏ，Ｉｎｃ．（Ｓｈａｒｏｎ Ｈｉｌｌ、Ｐａ．；アデノウイルス及びＡＡＶベクター）、Ｇｅｎｖｅｃ（アデノウイルスベクター）、ＩｎｔｒｏＧｅｎｅ（Ｌｅｉｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；アデノウイルスベクター）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ及びヘルペスウイルスベクター）、Ｎｏｒｇｅｎ（アデノウイルスベクター）、Ｏｘｆｏｒｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ；レンチウイルスベクター）及びＴｒａｎｓｇｅｎｅ（Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、Ｆｒａｎｃｅ；アデノウイルス、ワクシニア、レトロウイルス及びレンチウイルスベクター）が挙げられる。

ウイルスベクターを構築し、使用する方法は、当技術分野では公知である（例えば、Ｍｉｌｌｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、７：９８０〜９９０頁、１９９２年参照のこと）。好ましくは、ウイルスベクターは複製欠損であり、すなわち、それらは標的細胞において自立的に複製できず、したがって感染性でない。好ましくは、複製欠損ウイルスは最小ウイルスであり、すなわち、ゲノムをキャプシド形成してウイルス粒子を製造するのに必要なそのゲノムの配列のみを保持する。ウイルス遺伝子を完全に又はほぼ完全に欠く欠損ウイルスが好ましい。欠損ウイルスベクターの使用によって、ベクターがその他の細胞に感染し得るという懸念がなく、特定の局在化した領域中の細胞への投与が可能となる。したがって、特定の組織を特異的にターゲッティングできる。

弱毒化された又は欠損したＤＮＡウイルス配列を含むベクターの例として、それだけには限らないが、欠損ヘルペスウイルスベクター（Ｋａｎｎｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．６：１４７〜１５４頁、１９９９年；Ｋａｐｌｉｔｔら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈ．７１：１２５〜１３２頁、１９９７年、及びＫａｐｌｉｔｔら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏ Ｏｎｃ．１９：１３７〜１４７頁、１９９４年）が含まれる。

アデノウイルスは、本発明の核酸を種々の細胞種に効率的に送達するよう改変され得る真核生物ＤＮＡウイルスである。弱毒化されたアデノウイルスベクター、例えば、Ｓｔｒａｆｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：６２６〜６３０頁、１９９２年によって記載されるベクターは、一部の例において望ましいものである。種々の複製欠損アデノウイルス及び最小アデノウイルスベクターが記載されている（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／２６９１４、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９５／０２６９７及びＷＯ９６／２２３７８）。本発明の複製欠損組換えアデノウイルスは、当業者にとって技術上既知の任意の方法によって調製できる（Ｌｅｖｒｅｒｏら、Ｇｅｎｅ１０１：１９５頁、１９９１年；ＥＰ１８５５７３；Ｇｒａｈａｍ、ＥＭＢＯ Ｊ．３：２９１７頁、１９８４年；Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９頁、１９７７年）。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、比較的小さい大きさのＤＮＡウイルスであり、安定に、そして部位特異的に、それらが感染する細胞のゲノムに組み込まれ得る。それらは、細胞増殖、形態又は分化に対して何ら効果を誘導することなく、広範な細胞に感染することができ、ヒトの病状には関与していないようである。インビトロ及びインビボでの遺伝子導入のためのＡＡＶに由来するベクターの使用は記載されている（Ｄａｌｙら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１３４３〜１３４６頁、２００１年、Ｌａｒｓｏｎら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏ．４８９：４５〜５７頁、２００１年；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１８０８８及びＷＯ９３／０９２３９；米国特許第４，７９７，３６８号及び同５，１３９，９４１号及びＥＰ４８８５２８Ｂ１参照のこと）。

別の実施形態では、遺伝子は、例えば、米国特許第５，３９９，３４６号、同４，６５０，７６４号、同４，９８０，２８９号及び同５，１２４，２６３号；Ｍａｎｎら、Ｃｅｌｌ３３：１５３頁、１９８３年；Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６２：１１２０頁、１９８８年；ＥＰ４５３２４２及びＥＰ１７８２２０に記載されるように、レトロウイルスベクターに導入できる。レトロウイルスは、分裂細胞に感染する組み込まれるウイルスである。

レンチウイルスベクターは、脳、網膜、筋肉、肝臓及び血液を含めたいくつかの組織種において、本発明のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストをコードする核酸の直接送達及び持続的発現のための物質として使用できる。このベクターは、これらの組織において分裂細胞及び非分裂細胞に効率的に形質導入し、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの長期の発現を維持できる。総説については、Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３〜８０頁、１９９８年、及びＫａｆｒｉら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．３：３１６〜３２６頁、２００１年参照のこと。レンチウイルスパッケージング細胞株は、入手可能であり、当技術分野で一般に知られている。それらによって、遺伝子治療のための高力価のレンチウイルスベクターの製造が容易になる。一例として、テトラサイクリン誘導性ＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルスパッケージング細胞株があり、これは、１０^６ＩＵ／ｍｌを越える力価のウイルス粒子を少なくとも３〜４日間生成でき、Ｋａｆｒｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：５７６〜５８４頁、１９９９年参照のこと。誘導可能な細胞株によって産生されたベクターは、必要に応じてインビトロ及びインビボで非分裂細胞に効率的に形質導入するために濃縮してもよい。

シンドビスウイルスは、アルファウイルス属のメンバーであり、１９５３年に始まった世界各地でのその発見以来、広く研究されている。アルファウイルス、特に、シンドビスウイルスに基づいた遺伝子形質導入は、インビトロで十分に研究されている（Ｓｔｒａｕｓら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、５８：４９１〜５６２頁、１９９４年；Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６７：６４３９〜６４４６頁、１９９３年；Ｉｊｉｍａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ８０：１１０〜１１８頁、１９９９年及びＳａｗａｉら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｒ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２４８：３１５〜３２３頁、１９９８年参照のこと。アルファウイルスベクターの多数の特性により、それらが例えば、発現構築物の迅速なエンジニアリング、感染性粒子の高力価ストックの製造、非分裂細胞の感染及び高レベルの発現を含む開発されているその他のウイルス由来ベクター系の望ましい代替物となる（Ｓｔｒａｕｓｓら、１９９４年上記）。遺伝子治療のためのシンドビスウイルスの使用は開示されている。（Ｗａｈｌｆｏｒｓら、Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．７：４７２〜４８０頁、２０００年、及びＬｕｎｄｓｔｒｏｍ、Ｊ．Ｒｅｃｅｐ．Ｓｉｇ．Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ．Ｒｅｓ．１９（１−４）：６７３〜６８６頁、１９９９年参照）。

別の実施形態では、リポフェクション、又はその他のトランスフェクション促進剤（ペプチド、ポリマーなど）を用いてベクターを細胞に導入できる。合成陽イオン性脂質は、マーカーをコードする遺伝子のインビボ及びインビトロトランスフェクションのためのリポソームの調製に使用できる（Ｆｅｉｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：７４１３〜７４１７頁、１９８７年、及びＷａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：７８５１〜７８５５頁、１９８７年）。核酸の導入にとって有用な脂質化合物及び組成物は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／１８８６３及びＷＯ９６／１７８２３に、及び米国特許第５，４５９，１２７号に開示されている。

また、裸のＤＮＡプラスミドとしてインビボでベクターを導入することが可能である。遺伝子治療のための裸のＤＮＡベクターは、当技術分野で公知の方法、例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃の使用又はＤＮＡベクタートランスポーターの使用によって所望の宿主細胞に導入され得る（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３〜９６７頁、１９９２年；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：２７２６〜２７３０頁、１９９１年参照のこと）。プラスミドのトランスフェクションのためによく用いられるその他の試薬としては、限定されるものではないが、フュージーン（ＦｕＧｅｎｅ）、リポフェクチン及びリポフェクタミンを含む。受容体媒介性ＤＮＡ送達アプローチもまた使用できる（Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１〜１４６２４頁、１９８８年）。米国特許第５，５８０，８５９号及び同５，５８９，４６６号には、哺乳類におけるトランスフェクション促進剤のない外因性ＤＮＡ配列の送達が開示されている。最近、エレクトロトランスファーと呼ばれる相対的に低い電圧、高い効率のインビボＤＮＡ導入技術が開示された（Ｖｉｌｑｕｉｎら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１０９７頁、２００１年；Ｐａｙｅｎら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２９：２９５〜３００頁、２００１年；Ｍｉｒ、Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ５３：１〜１０頁、２００１年；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／０１１５７、ＷＯ９９／０１１５８及びＷＯ９９／０１１７５）。

このような遺伝子治療アプローチに適し、本発明の抗ＰＣＳＫ９アンタゴニストをコードする核酸を含む医薬組成物は、本発明の範囲内に含まれる。

別の態様では、本発明は、本発明のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを用いて、注目するサンプル中のＰＣＳＫ９を同定、単離、定量又は拮抗する方法を提供する。ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、免疫組織学的分析、免疫沈降などの免疫化学分析、又は当技術分野で公知のその他の免疫化学分析（例えば、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ編Ｇｏｅｒｓ、Ｊ．１９９３年、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ参照のこと）又は種々の精製プロトコールにおいて研究ツールとして使用してもよい。アンタゴニストは、関連する活性の即時の同定又は測定を容易にするよう組み込まれる標識、又は付加されている標識を有し得る。当業者ならば、種々の種類の検出可能な標識（例えば、酵素、色素又は、容易に検出可能であるか又は容易に検出可能である何らかの活性／結果を引き起こすその他の適した分子）に容易に精通しており、これらは上記のプロトコールにおいて有用であるか、又は有用であり得る。

本発明のさらなる態様として、本明細書に開示されるＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト又は医薬組成物、及び使用するための指示書を含むキットがある。キットは、必ずしもそうではないが、通常、キットの内容物の意図される用途を示すラベルを含む。用語ラベルは、任意の文書又はキット上に、又はキットとともに供給されるか、又はキットに伴う。

本発明はまた、細胞サンプルに、精製ＰＣＳＫ９（又は機能的等価物）及び標識されたＬＤＬ粒子を提供し；細胞サンプルに、ＰＣＳＫ９アンタゴニストであると疑われる分子を提供し；前記細胞サンプルを細胞によるＬＤＬ粒子取り込みを可能にするのに十分な期間インキュベートし；細胞に組み込まれた標識の量を定量し；そしてＰＣＳＫ９（又は機能性等価物）が単独で投与される場合に観察されるものと比較して、定量される標識の量の増大をもたらす候補アンタゴニストを同定することを含む、細胞サンプル中のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを同定する方法に関する。本発明はまた、細胞サンプルに精製ＰＣＳＫ９（又は機能性等価物）及び標識されたＬＤＬ粒子を提供し；細胞サンプルにＰＣＳＫ９アンタゴニストであると疑われる分子を提供し；前記細胞サンプルを細胞によるＬＤＬ粒子取り込みを可能にするのに十分な期間インキュベートし；上清を除去することによって細胞サンプルの細胞を単離し；標識されたＬＤＬ粒子の非特異的結合（プレートと、細胞と又はＬＤＬ受容体以外の何かとにかかわらず）を減少させ；細胞を溶解し；細胞溶解物内に保持される標識の量を定量し；ＰＣＳＫ９が単独で投与される場合に観察されるものと比較して、定量される標識の量の増大をもたらす候補アンタゴニストを同定することを含む、細胞サンプル中のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを同定する方法に関する。定量される標識の量の増大をもたらす候補アンタゴニストがＰＣＳＫ９アンタゴニストである。この方法は、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを同定するのに有効な手段であることが証明されており、したがって、本発明の重要な態様を形成する。ＬＤＬ受容体を保有する任意の種類の細胞、例えば、それだけには限らないが、ＨＥＫ細胞、ＨｅｐＧ２細胞及びＣＨＯ細胞を開示される方法において使用できる。ＰＣＳＫ９の「機能性等価物」とは、保存的アミノ酸置換又はその修飾のいずれかを有し、アミノ酸レベルでＰＣＳＫ９に対して少なくとも８０％の相同性を有するタンパク質として本明細書において定義され；前記タンパク質は、測定可能なＬＤＬ受容体によるＬＤＬ取り込みの阻害を示す。前記タンパク質をコードする核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＰＣＳＫ９をコードする核酸の相補体とハイブリダイズする。任意の数の細胞をプレーティングしてよい。例示目的で、現方法は、９６ウェルプレートに３０，０００個細胞／ウェルをプレーティングした。好ましい実施形態では、細胞は、ＰＣＳＫ９（又は機能性等価物）が添加される時点では血清不含培地中にある。特定の実施形態では、細胞を、血清を含む培地に一定の期間（例えば約２４時間）プレーティングし；続いて、血清不含培地（血清含有培地が除去されている）に一定期間（例えば約２４時間）プレーティングし；その後、精製ＰＣＳＫ９（又は機能性等価物）及び標識されたＬＤＬ粒子を添加する。標識されたＬＤＬ粒子の非特異的結合を減少させるステップは、当業者ならば承知しているように、非特異的結合の減少を達成する任意の技術を使用できるが、通常、洗浄／すすぎステップによって実施される。任意の供給源に由来するＬＤＬ粒子は、上記のアッセイにおいて有用である。好ましい実施形態は、ＬＤＬ粒子は、血液に由来する新鮮な粒子である。これは、当業者に利用可能な任意の方法、例えば、それだけには限らないが、Ｈａｖｅｌら、１９５５年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．３４：１３４５〜１３５３頁の方法によって達成できる。特定の実施形態では、ＬＤＬ粒子は、蛍光で標識される。特定の実施形態では、標識されたＬＤＬ粒子は、可視波長によって励起されるフルオロフォア３，３’−ジオクタデシルインドカルボシアニンヨーダイド（ｄｉｌ（３））を中に組み込んでおり、強い蛍光を発するＬＤＬ誘導体ｄｉｌ（３）−ＬＤＬを形成する。当業者によって認識されるように、本発明は、当業者が細胞溶解物中のＬＤＬを検出するのを可能にする任意の標識を用いて実施できる。特定の実施形態では、細胞内で代謝された場合に、又は例えば、内在化されるようになる過程において、その他の分子と結合している（又は解離している）ようになった場合にのみ検出可能になる（例えば、蛍光を発するなど又は異なる波長で蛍光性になる）ＬＤＬ類似体を使用できる（例えば、ＬＤＬ類似体が第２の蛍光と結合するようになる、あるいはクエンチャーから解離されるＦＲＥＴアッセイ）。本発明では、標識されたＬＤＬ粒子の内在化を検出するために当技術分野において利用可能な任意の手段を使用できる。ＬＤＬ粒子及びＰＣＳＫ９の、細胞とのインキュベーション時間は、細胞によるＬＤＬ粒子取り込みを可能にするのに十分な時間の量である。特定の実施形態では、この時間は、５分〜３６０分の範囲内である。特定の実施形態では、細胞に添加されるＰＣＳＫ９又は機能性等価物の濃度は、１ｎＭ〜５μＭの範囲にある。より特定の実施形態では、細胞に添加されるＰＣＳＫ９又は機能性等価物の濃度は、０．１ｎＭ〜３μＭの範囲にある。当業者が、個々のＰＣＳＫ９タンパク質の濃度の範囲を決定できる１つの特定の手段としては、ＬＤＬ取り込みアッセイにおいて用量応答曲線を作成することである。ＰＣＳＬ９の濃度は、ＬＤＬ取り込みの最大減少近くにあり、依然として用量応答曲線の直線範囲中にあるものを選択できる。通常、この濃度は、用量応答曲線から抽出されたタンパク質のＥＣ−５０の約５倍である。この濃度はタンパク質ごとに変わり得る。例示目的で、実施例５において用いられる野生型ＰＣＳＫ９の量は、約３２０ｎＭであるのに対し、「機能の獲得」のＰＣＳＫ９（例えば、Ｓ１２７Ｒ及びＤ３７４Ｙ）を用いる同等のアッセイでは、前記突然変異体を低濃度（例えば、６〜５０ｎＭ）で加えた。記載されるアッセイでは、細胞は、通常、その維持及び／又は増殖に適した温度で維持される。特定の実施形態では、温度は、約３７℃で維持される。

以下の実施例は、本発明を例示するために提供され、本発明をそれに限定するものではない。

実施例１
組換えＦａｂディスプレイファージの単離
以下に手短に記載される方法によって、組換えＦａｂファージディスプレイライブラリー（例えば、Ｋｎａｐｐｉｋら、２０００年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７〜８６頁参照のこと）を、固定化された組換えヒトＰＣＳＫ９に対してパニングした：ファージＦａｂディスプレイライブラリーを、まず、３つのプールに分けた：ＶＨ２＋ＶＨ４＋ＶＨ５からなる１つのプール、ＶＨ１＋ＶＨ６からなるもう１つのもの、ＶＨ３からなる３番目のプール。ファージプール及び固定化されたＰＣＳＫ９タンパク質を、脱脂粉乳を用いてブロッキングした。

パニングの第１ラウンドのために、各ファージプールを、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートのウェルに固定化され、Ｖ５−、Ｈｉｓタグを付けたＰＣＳＫ９タンパク質に独立して結合させた。固定化されたファージ−ＰＣＳＫ９複合体を、（１）ＰＢＳ／０．５％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０（３回の迅速な洗浄）；（２）ＰＢＳ／０．５％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０（１回の５分間のミルクとともに振盪しながらのインキュベーション）；（３）ＰＢＳ（３回の迅速な洗浄）；及び（４）ＰＢＳ（２回の５分のミルクとともに振盪しながらのインキュベーション）を用いて逐次洗浄した。結合されているファージを、２０ｍＭ ＤＴＴを用いて溶出し、３回溶出したファージ懸濁液のすべてを１つの試験管中に合わせた。大腸菌ＴＧ１を、溶出したファージを用いて感染させた。ファージミド保有細胞（クロファムフェニコール耐性）のプールされた培養物を増殖させ、ファージミド保有細胞の凍結ストックを作製した。ヘルパーファージとの同時感染によってファージを培養物から救出し、パニングの次のラウンドのためにファージストックを作製した。

パニングの第２のラウンドのために、ラウンド１から得たファージを、固定化され、ブロッキングされたＶ５−、Ｈｉｓタグを付けたＰＣＳＫ９タンパク質と結合させた。固定化されたファージ−ＰＣＳＫ９複合体を、（１）ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０（１回の迅速な洗浄）；（２）ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０（４回の５分のミルクとともに振盪しながらのインキュベーション）；（３）ＰＢＳ（１回の迅速な洗浄）；及び（４）ＰＢＳ（４回の５分のミルクとともに振盪しながらのインキュベーション）を用いて逐次洗浄した。ラウンド１においてと同様に、結合されているファージを溶出し、大腸菌ＴＧ１細胞に感染させ、ファージを救出した。

パニングの第３のラウンドのために、ラウンド２から得たファージを、固定化され、ブロッキングされたＶ５−、Ｈｉｓタグを付けたＰＣＳＫ９タンパク質と結合させた。固定化されたファージ−ＰＣＳＫ９複合体を、（１）ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０（１０回の迅速な洗浄）；（２）ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０（５回の５分のミルクとともに振盪しながらのインキュベーション）；（３）ＰＢＳ（１０回の迅速な洗浄）；及び（４）ＰＢＳ（５回の５分のミルクとともに振盪しながらのインキュベーション）を用いて逐次洗浄した。ラウンド１においてと同様に、結合されているファージを溶出し、大腸菌ＴＧ１細胞に感染させた。ファージミド感染細胞を一晩増殖させ、ファージミドＤＮＡを調製した。

ラウンド３ファージミドＤＮＡから得られたＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ挿入断片を、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ Ｆａｂ発現ベクターｐＭＯＲＰＨ＿ｘ９＿ＭＨ（例えば、図１参照のこと）にサブクローニングし、大腸菌ＴＧ１ Ｆ⁻においてＦａｂ発現クローンのライブラリーを作製した。形質転換体をＬＢ＋クロラムフェニコール＋グルコースプレートに広げ、一晩増殖させて細菌コロニーを作製した。個々の形質転換体コロニーを選び取り、Ｆａｂ発現についての増殖及びスクリーニングのために２枚の９６ウェルプレートのウェルに入れた。

実施例２
細菌によって発現されたＦＡＢのＥＬＩＳＡスクリーニング
個々の形質転換体の培養物を、Ｆａｂ発現のためにＩＰＴＧ誘導し、一晩増殖させた。培養上清（候補Ｆａｂ）を、９６ウェルＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートのウェルに固定化され、精製されたＶ５−、Ｈｉｓタグを付けたＰＣＳＫ９タンパク質とともにインキュベートし、ＰＢＳ中の０．１％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０を用い、プレートウォッシャーを使用して洗浄し、ＨＲＰ共役抗Ｆａｂ抗体とともにインキュベートし、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（商標）２０で再度洗浄した。結合されているＨＲＰをＴＭＰ基質の添加によって検出し、プレートリーダーを用いてウェルのＡ_４５０値を読み取った。

負の対照を、以下のとおりに含めた：
各プレートでの非特異的Ｆａｂ結合のための対照を、抗ＥｓＢ、無関係のＦａｂの平行して発現された調製物とともにインキュベートした。
増殖培地のみである。

ＥＬＩＳＡ及びＦａｂ発現の陽性対照は、以下のとおりに含めた：
ＥｓＢ抗原を、プレートの３つのウェルと結合させ、続いて、抗ＥｓＢ Ｆａｂとともにインキュベートした。Ｆａｂが、組換えＰＣＳＫ９抗原のＶ５又はＨｉｓタグと反応するのを制御するために、元のＰＣＳＫ９抗原と同一細胞に発現され、同様に精製されたＶ５、Ｈｉｓタグをつけた分泌性アルカリホスファターゼタンパク質（ＳＥＡＰ）を用いて平行ＥＬＩＳＡを実施した。推定ＰＣＳＫ９反応性Ｆａｂは、ＰＣＳＫ９抗原とともにインキュベートされた場合に、＞３×バックグラウンドの値を生じ、ＳＥＡＰとともにインキュベートされた場合には陰性であると同定した。スクリーニングの第１ラウンドにおいてＰＣＳＫ９反応性としてスコアを示すクローンを、単一のプレートにまとめ、３連で再増殖させ、ＩＰＴＧを用いて再誘導し、ＰＣＳＫ９及びＳＥＡＰに対する平行ＥＬＩＳＡにおいて再アッセイした。陽性及び陰性対照は上記のとおりに含めた。３の複製のうち少なくとも２において陽性をスコアしたクローンを、その後の特性決定に進めた。既知又は疑われる混合予備クローンの場合には、クロラムフェニコールを含む２ｘＹＴプレート上で、単一コロニーのためにストリークすることによって培養物を再精製し、３以上の別個のコロニーから得た液体培養物を、上記のようにＥＬＩＳＡによって３連で再度アッセイした。

実施例３
ＰＣＳＫ９ ＥＬＩＳＡ陽性ＦＡＢクローンのＤＮＡ配列決定
陽性Ｆａｂのマスターグリセロールストックから得た１．２ｍｌのクロラムフェニコールを含む２ｘＹＴ液体培地を播種し、一晩増殖させることによって、ＤＮＡ調製のための細菌培養物を作製した。ＤＮＡを、ＢｉｏＲｏｂｏｔ９６００で実施したＱｉａｇｅｎ Ｔｕｒｂｏ Ｍｉｎｉ ｐｒｅｐｓを使用して一晩培養物から遠心分離した細胞ペレットから調製した。Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ規定のシークエンシングプライマー及びＡＢＩ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒで実施するＤＮＡでのＡＢＩ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒサイクルシークエンシングを行い、ＦａｂクローンのＤＮＡ配列を得た。ＤＮＡ配列を、互いに比較して、独特のクローン配列を決定し、また、Ｆａｂクローンの軽鎖及び重鎖サブタイプを決定した。

実施例４
独特のＰＣＳＫ９ ＥＬＩＳＡ陽性クローンから得たＦＡＢの発現及び精製
ＥＬＩＳＡ陽性クローン（１ＣＸ１Ｇ０８、３ＢＸ５Ｃ０１、３ＣＸ２Ａ０６、３ＣＸ３Ｄ０２及び３ＣＸ４Ｂ０８）から得たＦａｂ及びＥｓＢ（陰性対照）Ｆａｂを、大腸菌ＴＧ１Ｆ⁻細胞においてＩＰＴＧ誘導によって発現させた。培養物を溶解し、固定化された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によってＨｉｓタグを付けたＦａｂを精製し、遠心ダイアフィルトレーションによって、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３／１５０ｍＭ ＮａＣｌ中にタンパク質を交換した。タンパク質をＣａｌｉｐｅｒ Ｌａｂ−Ｃｈｉｐ９０での電気泳動によって、及び従来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイによって定量化した。精製Ｆａｂタンパク質を、段階希釈においてＥＬＩＳＡによって再評価し、精製Ｆａｂの活性を確認した。陽性及び陰性対照を以前のとおり実施した。精製Ｆａｂ調製物を、以下の記載するＥＸＯＰＯＬＡＲ（コレステロール取り込み）アッセイにおいて分析した。

実施例５
ＥＸＯＰＯＬＡＲアッセイ：細胞のＬＤＬ取り込みに対する外因性ＰＣＳＫ９の効果
１日目に、３０，０００個の細胞／ウェルを、９６ウェルのポリＤ−リジンコーティングしたプレートにプレーティングした。２日目に、培地を、血清を含有しないＤＭＥＭ培地に交換した。３日目に、培地を除去し、細胞をＯｐｔｉＭＥＭで洗浄した。ＬＰＤＳ及びｄＩ−ＬＤＬを含有する１００μｌのＤＭＥＭ中で、精製ＰＣＳＫ９を加えた。プレートを３７℃で６．５時間インキュベートした。細胞を、２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有するＴＢＳで迅速に洗浄し、次いで、ＴＢＳ−ＢＳＡで２分間洗浄し、次いで、ＴＢＳで２回（ただし、迅速に）洗浄した。この細胞を、１００μｌのＲＩＰＡバッファーに溶解した。次いで、Ｅｘ５２０、Ｅｍ５８０ｎｍを用いて、蛍光をプレートにおいて測定した。各ウェル中の総細胞タンパク質を、ＢＣＡタンパク質アッセイを用いて測定し、次いで、蛍光単位を総タンパク質に対して標準化した。

Ｅｘｏｐｏｌａｒアッセイは、ＬＤＬ取り込みに対する変異体の効果を特定するのに有効である；Ｅｘｏｐｏｌａｒアッセイにおいて、ＰＣＳＫ９突然変異体の効力が、血漿ＬＤＬコレステロールとどのように相関するかを示す図２を参照のこと。データは以下のように表にされている：

結果：５種の抗体分子（１ＣＸ１Ｇ０８；３ＢＸ５Ｃ０１；３ＣＸ２Ａ０６；３ＣＸ３Ｄ０２；及び３ＣＸ４Ｂ０８）は、ＬＤＬ取り込みに対するＰＣＳＫ９の効果を用量依存的に阻害し、その効果は再現性よく観察された。細胞に添加されるＰＣＳＫ９の量は、約３２０ｎＭとした。抗体分子は、以下のとおりに含む：（ａ）１ＣＸ１Ｇ０８、配列番号１の軽鎖（「ＬＣ」）（配列番号９３のＶＬを含む）及び配列番号９のＦｄ鎖（配列番号１１のＶＨを含む）；（ｂ）３ＢＸ５Ｃ０１、配列番号１９のＬＣ鎖（配列番号９５のＶＬを含む）及び配列番号２５のＦｄ鎖（配列番号２７のＶＨを含む）；（ｃ）３ＣＸ２Ａ０６、配列番号３５のＬＣ鎖（配列番号９７のＶＬを含む）及び配列番号４３のＦｄ鎖（配列番号４５のＶＨを含む）；（ｄ）３ＣＸ３Ｄ０２、配列番号５３のＬＣ鎖（配列番号９９のＶＬを含む）及び配列番号５９のＦｄ鎖（配列番号６１のＶＨを含む）、並びに（ｅ）３ＣＸ４Ｂ０８、配列番号６９のＬＣ鎖（配列番号１０１のＶＬを含む）及び配列番号７７のＦｄ鎖（配列番号７９のＶＨを含む）。図３Ａ〜３Ｄは、１ＣＸ１Ｇ０８及び３ＣＸ４Ｂ０８の、ＬＤＬ取り込みに対するＰＳＣＫ９依存性効果の用量依存的阻害を示す。図３Ｂ及び３Ｄは、２種の対照：（ｉ）細胞のＬＤＬ取り込みの基礎レベルを示す細胞のみの対照、及び（ｉｉ）ＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９依存性喪失のレベルを示す、細胞＋ＰＣＳＫ９（２５μｇ／ｍｌ）対照を有する。Ｆａｂ及びＰＣＳＫ９を含む力価測定実験は、固定濃度のＰＣＳＫ９（２５μｇ／ｍｌ）及びグラフに示される漸増濃度のＦａｂで実施した。図３Ａ及び３Ｃは、ＩＣ−５０の算出を示す。１ＣＸ１Ｇ０８が、細胞のＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９依存性阻害の５３％の阻害を示し、一方、３ＣＸ４Ｂ０８は、６１％の阻害を示した。図４Ａ〜４Ｄは、３ＢＸ５Ｃ０１及び３ＣＸ２Ａ０６の、ＬＤＬ取り込みに対するＰＳＣＫ９依存性効果の用量依存性阻害を示す。図４Ｂ及び４Ｄは、２種の対照：（ｉ）細胞のＬＤＬ取り込みの基礎レベルを示す細胞のみの対照、及び（ｉｉ）ＬＳＬ取り込みのＰＣＳＫ９依存性喪失のレベルを示す、細胞＋ＰＣＳＫ９（２５μｇ／ｍｌ）対照を有する。Ｆａｂ及びＰＣＳＫ９を含む力価測定実験を、固定濃度のＰＣＳＫ９（２５μｇ／ｍｌ）及びグラフに示される漸増濃度のＦａｂで実施した。図４Ａ及び４Ｃは、ＩＣ−５０の算出を示す。３ＢＸ５Ｃ０１が、細胞のＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９依存性阻害の２５％阻害を示し、一方、３ＣＸ２Ａ０６は、２３％阻害を示した。図５Ａ〜５Ｂは、３ＣＸ３Ｄ０２の、ＬＤＬ取り込みに対するＰＳＣＫ９依存性効果の用量依存性阻害を示す。図５Ｂは、２種の対照：（ｉ）細胞のＬＤＬ取り込みの基礎レベルを示す細胞のみの対照、及び（ｉｉ）ＬＳＬ取り込みのＰＣＳＫ９依存性喪失のレベルを示す、細胞＋ＰＣＳＫ９（２５μｇ／ｍｌ）対照を有する。Ｆａｂ及びＰＣＳＫ９を含む力価測定実験を、固定濃度のＰＣＳＫ９（２５μｇ／ｍｌ）及びグラフに示される漸増濃度のＦａｂで実施した。図５Ａは、ＩＣ−５０の算出を示す。３ＣＸ３Ｄ０２が、細胞のＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９依存性阻害の２３％阻害を示した。

実施例６
ＦＡＢの動態学的評価：表面プラズモン共鳴（「ＳＰＲ」）によるＰＣＳＫ９相互作用
ＳＰＲ測定を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）２０００システムを用いて実施した。センサーチップＣＭ５及び固定化のためのアミンカップリングキットは、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）製のものであった

抗Ｆａｂ ＩｇＧ（ヒト特異的）を、固定化ウィザードを使用し、「Ａｉｍ ｆｏｒ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ」オプションを用いて、第一アミン基を介してセンサーチップＣＭ５の表面１及び２に共有結合によってカップリングした。５０００ＲＵの標的固定化を特定した。ウィザードは、１００ｍＭのＮＨＳ及び４００ｍＭのＥＤＣの１：１混合物を用いた７分の活性化を使用し、リガンドを数回のパルスで注入して所望のレベルを達成し、次いで、エタノールアミンの７分のパルスを用いて残りの表面を不活化する。

抗ＰＣＳＫ９Ｆａｂは、捕獲表面２上に捕獲され、表面１をＦａｂの動態学研究：ＰＣＳＫ９相互作用の参照として用いた。Ｆａｂは、５００ｎｇ／ｍｌの溶液を、５μｌ／分で１〜１．５分間流すことによって捕獲し、反応は１００〜１５０ＲＵのＲ_ｍａｘの標的Ｒ_Ｌに達した。５〜１０濃度のｈＰＣＳＫ９ｖ５Ｈｉｓ又はｍＰＣＳＫ９ｖ５Ｈｉｓ抗原を、３０μｌ／分で３〜４分間表面中に流した。１５〜６０分の解離時間を認め、その後、１０ｍＭグリシンｐＨ２．０の３０秒のパルスを用いて抗Ｆａｂ表面を再生した。

ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて、各Ｆａｂを用いて分析された、ＰＣＳＫ９抗原の複数の濃度から得たセンソグラムを評価し、Ｆａｂ：ＰＣＳＫ９相互作用の動態学定数を推定した。

表３は、開示される抗ＰＣＳＫ９ Ｆａｂの、測定された動態学パラメータを示す。

＊「直接」＝ＰＣＳＫ９の共有結合による固定化；移動相からのＦａｂを結合する。
「Ａｂ捕獲」＝抗−Ｆａｂ−Ａｂの共有結合による固定化；試験Ａｂの捕獲と、その後、移動相からのＰＣＳＫ９と結合する。

Claims (38)

1. ＰＣＳＫ９の細胞のＬＤＬ取り込み阻害に拮抗する、単離されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
2. ＰＣＳＫ９の細胞のＬＤＬ取り込み阻害に拮抗し、１２００ｎＭ未満の平衡解離定数（ＫＤ）でヒトＰＣＳＫ９と結合する、単離されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
3. ５００ｎＭ未満のＫＤでヒトＰＣＳＫ９と結合する、請求項２に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
4. １００ｎＭ未満のＫＤでヒトＰＣＳＫ９と結合する、請求項２に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
5. ５ｎＭ未満のＫＤでヒトＰＣＳＫ９と結合する、請求項２に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
6. ５００ｎＭ未満のＩＣ５０でＰＣＳＫ９の細胞のＬＤＬ取り込み阻害に拮抗する、単離されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
7. ２００ｎＭ未満のＩＣ５０でＰＣＳＫ９の細胞のＬＤＬ取り込み阻害に拮抗する、請求項６に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
8. １００ｎＭ未満のＩＣ５０でＰＣＳＫ９の細胞のＬＤＬ取り込み阻害に拮抗する、請求項６に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
9. ＰＣＳＫ９の細胞のＬＤＬ取り込み阻害に少なくとも２０％拮抗する、単離されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
10. ＰＣＳＫ９の細胞のＬＤＬ取り込み阻害に少なくとも５０％拮抗する、単離されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
11. ＰＣＳＫ９の細胞のＬＤＬ取り込み阻害に少なくとも６０％拮抗する、単離されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
12. ＰＣＳＫ９の細胞の取り込み阻害に少なくとも２０％拮抗する、単離されたＰＣＳＫ９特異的抗体分子。
13. ＰＣＳＫ９の細胞のＬＤＬ取り込み阻害に拮抗する、単離されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストであって、
    （ａ）配列番号８５を含むＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域又はＣＤＲ３ドメイン中に１以上の保存的アミノ酸置換を有することを特徴とするその等価物；及び／又は
    （ｂ）配列番号７５を含むＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域又はＣＤＲ３ドメイン中に１以上の保存的アミノ酸置換を有することを特徴とするその等価物；
    を含むアンタゴニスト。
14. １２００ｎＭ未満の平衡解離定数（ＫＤ）でヒトＰＣＳＫ９と結合する、請求項１３に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
15. ５００ｎＭ未満のＫＤでヒトＰＣＳＫ９と結合する、請求項１３に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
16. １００ｎＭ未満のＫＤでヒトＰＣＳＫ９と結合する、請求項１３に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
17. ５ｎＭ未満のＫＤでヒトＰＣＳＫ９と結合する、請求項１３に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
18. ５００ｎＭ未満のＩＣ５０でＰＣＳＫ９の細胞のＬＤＬ取り込み阻害に拮抗する、請求項１３に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
19. ２００ｎＭ未満のＩＣ５０でＰＣＳＫ９の細胞のＬＤＬ取り込み阻害に拮抗する、請求項１３に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
20. １００ｎＭ未満のＩＣ５０でＰＣＳＫ９の細胞のＬＤＬ取り込み阻害に拮抗する、請求項１３に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
21. ＰＣＳＫ９の細胞の取り込み阻害に少なくとも２０％拮抗する、請求項１３に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
22. 抗体分子である、請求項１３に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
23. （ａ）配列番号８１を含む重鎖可変ＣＤＲ１配列；
    （ｂ）配列番号８３を含む重鎖可変ＣＤＲ２配列；
    （ｃ）配列番号７１を含む軽鎖可変ＣＤＲ１配列；及び／又は
    （ｄ）配列番号７３を含む軽鎖可変ＣＤＲ２配列；
    を含む、請求項１３に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
24. 配列番号７９を含む重鎖可変領域及び／又は配列番号１０１を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１３に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
25. 配列番号７７を含む重鎖領域及び／又は配列番号６９を含む軽鎖領域を含む、請求項１３に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
26. 配列番号８７を含む定常配列を含む重鎖を含む、請求項２２に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
27. 請求項１３に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト及び薬学的に許容される担体を含む組成物。
28. 請求項１３に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを使用することを含む、ＰＣＳＫ９機能を拮抗する方法。
29. ＰＣＳＫ９機能によって引き起こされる、及び／又は増悪する障害、症状又は疾患を寛解させるための医薬の製造における、請求項１３に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの使用。
30. 請求項１３に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストをコードする単離された核酸。
31. 請求項１３に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストをコードする単離された核酸であって、
    （ａ）ＣＤＲ３ドメインが配列番号８６を含む核酸配列によってコードされる重鎖可変領域；及び／又は
    （ｂ）ＣＤＲ３ドメインが配列番号７６を含む核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域；
    を含む核酸。
32. （ａ）配列番号８２及び配列番号８４からなる群から選択される少なくとも１種の核酸配列を含む核酸配列によってコードされるＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２ドメインをそれぞれ含む重鎖可変領域；及び／又は
    （ｂ）配列番号７２及び配列番号７４からなる群から選択される少なくとも１種の核酸配列を含む核酸配列によってコードされるＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２ドメインを含む軽鎖可変領域；
    を含む抗体分子をコードする、請求項３１に記載の単離された核酸。
33. （ａ）配列番号８０を含む核酸配列によってコードされる重鎖可変領域、及び／又は
    （ｂ）配列番号１０２を含む核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域、
    を含む抗体分子をコードする、請求項３１に記載の単離された核酸。
34. （ａ）少なくとも一部が配列番号７８を含む核酸によってコードされる重鎖領域、及び／又は
    （ｂ）少なくとも一部が配列番号７０を含む核酸によってコードされる軽鎖領域、
    を含む抗体分子をコードする、請求項３１に記載の単離された核酸。
35. 請求項３０に記載の核酸を含むベクター。
36. 請求項３０に記載の核酸を含む、インビトロ又はインサイチュでの単離された宿主細胞又は宿主細胞集団。
37. ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを製造する方法であって、
    （ａ）ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを製造するのに適当な条件下で、請求項３６に記載の細胞を培養するステップ；及び
    （ｂ）製造されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを単離するステップ；
    を含む方法。
38. 請求項１３に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを含む、インビトロ又はインサイチュでの単離された宿主細胞又は宿主細胞集団。

Images