KR20160069363A

KR20160069363A - 항체 선별 방법

Info

Publication number: KR20160069363A
Application number: KR1020140175232A
Authority: KR
Inventors: 이샛별; 신동규; 김경아; 이지민
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2014-12-08
Filing date: 2014-12-08
Publication date: 2016-06-16
Also published as: US20160161500A1

Abstract

다양한 pH에서의 항원-항체 결합 여부 및/또는 수준을 측정하는 단계를 포함하는 항체 선별 방법, 및 상기 선별된 항체를 포함하는 항체-약물 접합체 (Antibody-Drug Conjugate)를 제공한다.

Description

항체 선별 방법{Screening Method of Antibody}

치료용 항체를 선별하는 방법으로, 표적(항원)에 대한 친화도를 이용하는 방법이 가장 광범위하게 이용되고 있다. 이 때, 친화도는 고정된 pH에서 측정된 값만으로 항체 선별에 이용된다. 그러나 실제 세포 내에서의 pH는 혈액에서부터 세포 내의 엔도좀(endosome)으로 전달되기까지 다양하게 변화한다. 표적에 대한 친화도가 높다 하더라도 pH 변화에 의해 표적과 쉽게 분리가 된다면 소망하는 치료 효과를 발휘할 수 없다는 단점이 있다.

c-Met과 같은 많은 표적들의 경우, 리간드의 pH-의존성 결합에 따른 세포 내 이동의 차이에 대한 연구가 거의 이루어지지 않은 상태이며, 이들을 항원으로 하는 항체들의 pH-의존성 결합 차이도 거의 발표된 바가 없다.

KR2012-0138241

일 예는 다양한 pH에서의 항원-항체 결합 여부 및/또는 수준을 측정하는 단계를 포함하는 항체 선별 방법을 제공한다. 상기 항체 선별 방법은 세포내 엔도좀 또는 라이소좀의 pH 범위에서 항원-항체 결합이 유지되는 항체를 선별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

다른 예는 상기 선별된 항체를 포함하는 항체-약물 접합체 (Antibody-Drug Conjugate)를 제공한다.

다양한 pH에서의 항원-항체 결합 여부 및/또는 수준을 측정하여 우수한 치료 효과를 발휘하는 치료용 항체를 선별하는 기술이 제공된다.

일반적으로 체내의 pH는 약 7.4 정도로 알려져 있다. 그러나 신체 각 부위마다 그 기능에 따라 고유의 pH를 가지고 있다. 혈액이나 세포질의 경우 pH7.4 정도를 유지하지만, 위의 경우 매우 낮은 pH를 유지하며 대장의 경우 오히려 알칼리성을 유지한다. 세포 내에서도 세포내 소기관마다 조금씩 다른 pH를 유지하는데, 세포내의 엔도좀 (endosome) 내부는 ~pH 6.0 또는 ~pH 6.5 정도를 유지하며, 세포내의 단백질 분해기관인 리소좀 (lysosome)의 경우에는 ~pH 4.5 또는 ~pH 5.5 정도의 산성을 유지한다.

낮은 pH (예컨대, pH4.5 이하)에서도 쉽게 표적과 분리되지 않는 항체를 미리 선별해 낸다면, 실제 치료용 항체로서 개발되었을 때 표적이 어떠한 조건에 있다 하더라도 높은 결합력을 유지하여 치료효과를 유지시킬 수 있고, 세포 내 환경에서도 분리되지 않고 성공적으로 세포내 전달됨으로써 치료효과를 높이고, 표적을 분해시켜 암세포 특이적인 항암효과를 보일 수 있기 때문에 표적이 다시 recycling 되는 부작용을 줄이는데 기여할 수 있다.

이에, 치료용 항체 또는 상기 항체를 포함하는 항체-약물 접합체의 제작 및 선별 방법에 관한 것이다. 상세하게는 pH-의존적 항원-항체 결합을 측정하여 항원의 세포 내재화 및/또는 세포 내 분해를 유도하는 항체를 선별하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 "항체"라 함은, 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질을 의미하는 것으로서, 생체 내에서 생산된 것뿐만 아니라 재조합적 또는 합성적으로 생산된 것을 포함하며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 상기 항체는 생체에서 생산된 것뿐 아니라, 인위적 방법, 예컨대, 재조합 또는 합성적 방법으로 생산된 것도 포함하는 개념이다. 항체는 최근에 질병 치료제의 용도로 많이 사용되고 있다. 상기 항체는 다중 복합체 (polymeric polypeptide) 구조의 완전한 면역글로불린 (예컨대, IgA, IgD, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4), IgM, 또는 IgE)의 형태를 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 의미하는 것일 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 항체의 scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

항체가 항원을 특이적으로 인식하고 성공적인 항원-항체 결합을 형성하기 위하여, 상기 항체는 항원이 존재하는 생체 내, 예컨대, 세포표면, 세포질, 또는 혈액의 일반적인 pH 조건, 예컨대, pH 6.6 내지 8.5, pH 6.8 내지 8.3, pH 7 내지 8, pH 7.2 내지 7.6, pH 7.3 내지 7.5, 또는 약 pH 7.4에서 항원-항체 결합을 형성 또는 유지하는 것이어야 한다. 따라서, 상기 항체 선별 방법은 pH 6.6 내지 8.5, 예컨대, pH 6.8 내지 8.3, pH 7 내지 8, pH 7.2 내지 7.6, pH 7.3 내지 7.5, 또는 약 pH 7.4에서 항원-항체 결합을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 pH 범위에서의 항원-항체 결합 측정 단계는 상기 기재된 pH 범위 중에서 선택된 하나 이상의 지점 (point of pH)에서 항원-항체 결합을 측정하는 것을 의미할 수 있다. 상기 항원-항체 결합은 항원-항체 결합 여부 (항원-항체 복합체 존재 여부) 및/또는 항원-항체 결합 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 항체-항원 결합 수준은 상기 항체의 항원에 대한 결합 친화도로서 측정될 수 있으며, 이 경우 상기 항체 선별 방법은 상기 각각의 pH 범위에서 항원에 대한 항체의 결합 친화도를 측정하는 단계를 각각 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 항체는 상기 각각의 pH 범위에서의 항원에 대한 결합 친화도(Kd값; 예컨대, Biacore, ELISA 등 통상적 방법으로 측정)가 10mM 이하, 1mM 이하, 1nM 이하 또는 1 pM 이하, 0.01 pM 내지 10 mM, 0.1 pM 내지 10 mM, 1 pM 내지 10 mM, 1 nM 내지 10 mM, 1 mM 내지 10 mM, 0.01 pM 내지 1 mM, 0.1 pM 내지 1 mM, 1 pM 내지 1 mM, 1 nM 내지 1 mM, 0.01 pM 내지 1 nM, 0.1 pM 내지 1 nM, 1 pM 내지 1 nM, 0.01 pM 내지 1 pM, 또는 0.1 pM 내지 1 pM인 것일 수 있다.

상기 항체는 항원과 함께 세포 내재화 (internalization) 및/또는 세포내 분해되어 항원에 대하여 길항작용을 갖는 것일 수 있다. 이러한 작용을 갖는 항체의 경우, 성공적인 세포 내재화 및/또는 세포내 분해를 위하여, 항원-항체 복합체의 엔도좀 및/또는 라이소좀으로의 성공적인 이동이 필요하므로, 상기 방법은 상기 일반적인 생체 내 pH 범위보다 낮은 범위에서의 항원-항체 결합을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

구체적으로, 항체가 항원과 함께 성공적으로 세포 내재화되기 위해서, 엔도좀(endosome) 내의 pH 환경 내에서도 항원-항체 결합이 유지되어야 한다. 따라서, 상기 항체는 엔도좀 내 pH 범위인 pH 6.5 이하, pH 6.2 이하, 또는 pH 6.0 이하, 예컨대, pH 5.3 내지 6.5, pH 5.3 내지 6.2, pH 5.3 내지 6.0, pH 5.5 내지 6.5, pH 5.5 내지 6.2, pH 5.5 내지 6.0, pH 5.8 내지 6.5, pH 5.8 내지 6.2, 또는 pH 5.8 내지 6.0에서 항원-항체 결합을 유지하는 것일 수 있다. 따라서, 상기 항체 선별 방법은 pH 6.5 이하, pH 6.2 이하, 또는 pH 6.0 이하, 예컨대, pH 5.3 내지 6.5, pH 5.3 내지 6.2, pH 5.3 내지 6.0, pH 5.5 내지 6.5, pH 5.5 내지 6.2, pH 5.5 내지 6.0, pH 5.8 내지 6.5, pH 5.8 내지 6.2, 또는 pH 5.8 내지 6.0에서 항원-항체 결합을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 pH 범위에서의 항원-항체 결합 측정 단계는 상기 기재된 pH 범위 중에서 선택된 하나 이상의 지점 (point of pH)에서 항원-항체 결합을 측정하는 것을 의미할 수 있다. 상기 항원-항체 결합은 항원-항체 결합 여부 (항원-항체 복합체 존재 여부) 및/또는 항원-항체 결합 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 항체-항원 결합 수준은 상기 항체의 항원에 대한 결합 친화도로서 측정될 수 있으며, 이 경우 상기 항체 선별 방법은 상기 각각의 pH 범위에서 항원에 대한 항체의 결합 친화도를 측정하는 단계를 각각 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 항체는 상기 각각의 pH 범위에서의 항원에 대한 결합 친화도가 10mM 이하, 1mM 이하, 1nM 이하 또는 1 pM 이하, 0.01 pM 내지 10 mM, 0.1 pM 내지 10 mM, 1 pM 내지 10 mM, 1 nM 내지 10 mM, 1 mM 내지 10 mM, 0.01 pM 내지 1 mM, 0.1 pM 내지 1 mM, 1 pM 내지 1 mM, 1 nM 내지 1 mM, 0.01 pM 내지 1 nM, 0.1 pM 내지 1 nM, 1 pM 내지 1 nM, 0.01 pM 내지 1 pM, 또는 0.1 pM 내지 1 pM인 것일 수 있다.

또한, 항체가 항원과 함께 성공적으로 세포내에서 분해되기 위해서, 라이소좀(lysosome) 내의 pH 환경 내에서도 항원-항체 결합이 유지되어야 한다. 따라서, 상기 항체는 라이소좀 내 pH 범위인 pH 5.5 이하, pH 5.2 이하, pH 5.0 이하, pH 4.8 이하, 또는 pH 4.5 이하, 예컨대, pH 3.0 내지 5.5, pH 3.0 내지 5.2, pH 3.0 내지 5.0, pH 3.0 내지 4.8, pH 3.0 내지 4.5, pH 3.5 내지 5.5, pH 3.5 내지 5.2, pH 3.5 내지 5.0, pH 3.5 내지 4.8, pH 3.5 내지 4.5, pH 4.0 내지 5.5, pH 4.0 내지 5.2, pH 4.0 내지 5.0, pH 4.0 내지 4.8, 또는 pH 4.0 내지 4.5에서 항원-항체 결합을 유지하는 것일 수 있다. 따라서, 상기 항체 선별 방법은 pH 5.5 이하, pH 5.2 이하, pH 5.0 이하, pH 4.8 이하, 또는 pH 4.5 이하, 예컨대, pH 3.0 내지 5.5, pH 3.0 내지 5.2, pH 3.0 내지 5.0, pH 3.0 내지 4.8, pH 3.0 내지 4.5, pH 3.5 내지 5.5, pH 3.5 내지 5.2, pH 3.5 내지 5.0, pH 3.5 내지 4.8, pH 3.5 내지 4.5, pH 4.0 내지 5.5, pH 4.0 내지 5.2, pH 4.0 내지 5.0, pH 4.0 내지 4.8, 또는 pH 4.0 내지 4.5에서 항원-항체 결합을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 pH 범위에서의 항원-항체 결합 측정 단계는 상기 기재된 pH 범위 중에서 선택된 하나 이상의 지점 (point of pH)에서 항원-항체 결합을 측정하는 것을 의미할 수 있다. 상기 항원-항체 결합은 항원-항체 결합 여부 (항원-항체 복합체 존재 여부) 및/또는 항원-항체 결합 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 항체-항원 결합 수준은 상기 항체의 항원에 대한 결합 친화도로서 측정될 수 있으며, 이 경우 상기 항체 선별 방법은 상기 각각의 pH 범위에서 항원에 대한 항체의 결합 친화도를 측정하는 단계를 각각 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 항체는 상기 각각의 pH 범위에서의 항원에 대한 결합 친화도가 10mM 이하, 1mM 이하, 1nM 이하 또는 1 pM 이하, 0.01 pM 내지 10 mM, 0.1 pM 내지 10 mM, 1 pM 내지 10 mM, 1 nM 내지 10 mM, 1 mM 내지 10 mM, 0.01 pM 내지 1 mM, 0.1 pM 내지 1 mM, 1 pM 내지 1 mM, 1 nM 내지 1 mM, 0.01 pM 내지 1 nM, 0.1 pM 내지 1 nM, 1 pM 내지 1 nM, 0.01 pM 내지 1 pM, 또는 0.1 pM 내지 1 pM인 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 항체 선별 방법은,

1) pH 6.6 내지 8.5, 예컨대, pH 7 내지 8, pH 7.2 내지 7.6, pH 7.3 내지 7.5, 또는 약 pH 7.4에서 항원-항체 결합을 측정하는 단계; 및

2) pH 6.5 이하, pH 6.2 이하, 또는 pH 6.0 이하, 예컨대, pH 5.3 내지 6.5, pH 5.3 내지 6.2, pH 5.3 내지 6.0, pH 5.5 내지 6.5, pH 5.5 내지 6.2, pH 5.5 내지 6.0, pH 5.8 내지 6.5, pH 5.8 내지 6.2, 또는 pH 5.8 내지 6.0에서 항원-항체 결합을 측정하는 단계

를 포함할 수 있다 (상기 두 단계의 순서는 바뀌어도 무방하다).

상기 방법은,

i) pH 6.6 내지 8.5, 예컨대, pH 7 내지 8, pH 7.2 내지 7.6, pH 7.3 내지 7.5, 또는 약 pH 7.4의 pH 범위; 및

ii) pH 6.5 이하, pH 6.2 이하, 또는 pH 6.0 이하, 예컨대, pH 5.3 내지 6.5, pH 5.3 내지 6.2, pH 5.3 내지 6.0, pH 5.5 내지 6.5, pH 5.5 내지 6.2, pH 5.5 내지 6.0, pH 5.8 내지 6.5, pH 5.8 내지 6.2, 또는 pH 5.8 내지 6.0의 pH 범위

에서 모두 항원-항체 결합을 형성(또는 유지)하는 항체를 선별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

다른 예에서, 상기 항체 선별 방법은,

2) pH 5.5 이하, pH 5.2 이하, pH 5.0 이하, pH 4.8 이하, 또는 pH 4.5 이하, 예컨대, pH 3.0 내지 5.5, pH 3.0 내지 5.2, pH 3.0 내지 5.0, pH 3.0 내지 4.8, pH 3.0 내지 4.5, pH 3.5 내지 5.5, pH 3.5 내지 5.2, pH 3.5 내지 5.0, pH 3.5 내지 4.8, pH 3.5 내지 4.5, pH 4.0 내지 5.5, pH 4.0 내지 5.2, pH 4.0 내지 5.0, pH 4.0 내지 4.8, 또는 pH 4.0 내지 4.5에서 항원-항체 결합을 측정하는 단계

상기 방법은,

ii) pH 5.5 이하, pH 5.2 이하, pH 5.0 이하, pH 4.8 이하, 또는 pH 4.5 이하, 예컨대, pH 3.0 내지 5.5, pH 3.0 내지 5.2, pH 3.0 내지 5.0, pH 3.0 내지 4.8, pH 3.0 내지 4.5, pH 3.5 내지 5.5, pH 3.5 내지 5.2, pH 3.5 내지 5.0, pH 3.5 내지 4.8, pH 3.5 내지 4.5, pH 4.0 내지 5.5, pH 4.0 내지 5.2, pH 4.0 내지 5.0, pH 4.0 내지 4.8, 또는 pH 4.0 내지 4.5의 pH 범위

다른 예에서, 상기 항체 선별 방법은,

1) pH 6.6 내지 8.5, 예컨대, pH 7 내지 8, pH 7.2 내지 7.6, pH 7.3 내지 7.5, 또는 약 pH 7.4에서 항원-항체 결합을 측정하는 단계;

2) pH 6.5 이하, pH 6.2 이하, 또는 pH 6.0 이하, 예컨대, pH 5.3 내지 6.5, pH 5.3 내지 6.2, pH 5.3 내지 6.0, pH 5.5 내지 6.5, pH 5.5 내지 6.2, pH 5.5 내지 6.0, pH 5.8 내지 6.5, pH 5.8 내지 6.2, 또는 pH 5.8 내지 6.0에서 항원-항체 결합을 측정하는 단계; 및

3) pH 5.5 이하, pH 5.2 이하, pH 5.0 이하, pH 4.8 이하, 또는 pH 4.5 이하, 예컨대, pH 3.0 내지 5.5, pH 3.0 내지 5.2, pH 3.0 내지 5.0, pH 3.0 내지 4.8, pH 3.0 내지 4.5, pH 3.5 내지 5.5, pH 3.5 내지 5.2, pH 3.5 내지 5.0, pH 3.5 내지 4.8, pH 3.5 내지 4.5, pH 4.0 내지 5.5, pH 4.0 내지 5.2, pH 4.0 내지 5.0, pH 4.0 내지 4.8, 또는 pH 4.0 내지 4.5에서 항원-항체 결합을 측정하는 단계

를 포함할 수 있다 (상기 세 단계의 순서는 서로 바뀌어도 무방하다).

이 경우, 단계 2)와 단계 3)의 pH는 서로 다른 값을 갖도록 선택할 수 있으며, 예컨대, 단계 3)의 pH를 단계 2)의 pH 보다 낮은 범위로 정할 수 있다.

상기 방법에서,

i) pH 6.6 내지 8.5, 예컨대, pH 7 내지 8, pH 7.2 내지 7.6, pH 7.3 내지 7.5, 또는 약 pH 7.4의 pH 범위;

ii) pH 6.5 이하, pH 6.2 이하, 또는 pH 6.0 이하, 예컨대, pH 5.3 내지 6.5, pH 5.3 내지 6.2, pH 5.3 내지 6.0, pH 5.5 내지 6.5, pH 5.5 내지 6.2, pH 5.5 내지 6.0, pH 5.8 내지 6.5, pH 5.8 내지 6.2, 또는 pH 5.8 내지 6.0의 pH 범위; 및

iii) pH 5.5 이하, pH 5.2 이하, pH 5.0 이하, pH 4.8 이하, 또는 pH 4.5 이하, 예컨대, pH 3.0 내지 5.5, pH 3.0 내지 5.2, pH 3.0 내지 5.0, pH 3.0 내지 4.8, pH 3.0 내지 4.5, pH 3.5 내지 5.5, pH 3.5 내지 5.2, pH 3.5 내지 5.0, pH 3.5 내지 4.8, pH 3.5 내지 4.5, pH 4.0 내지 5.5, pH 4.0 내지 5.2, pH 4.0 내지 5.0, pH 4.0 내지 4.8, 또는 pH 4.0 내지 4.5의 pH 범위

상기 항원-항체 결합을 형성(또는 유지)하는 항체는

상기 각각의 pH 범위에서 항원-항체 복합체를 형성하거나, 및/또는

상기 각각의 pH 범위에서의 항원에 대한 결합 친화도가 10mM 이하, 1mM 이하, 1nM 이하 또는 1 pM 이하, 0.01 pM 내지 10 mM, 0.1 pM 내지 10 mM, 1 pM 내지 10 mM, 1 nM 내지 10 mM, 1 mM 내지 10 mM, 0.01 pM 내지 1 mM, 0.1 pM 내지 1 mM, 1 pM 내지 1 mM, 1 nM 내지 1 mM, 0.01 pM 내지 1 nM, 0.1 pM 내지 1 nM, 1 pM 내지 1 nM, 0.01 pM 내지 1 pM, 또는 0.1 pM 내지 1 pM인 것

일 수 있다.

상기 항원-항체 복합체의 존재 (형성) 여부는 통상적인 효소 반응, 형광, 발광 및/또는 방사선 검출을 통하여 하여 측정될 수 있으며, 구체적으로, 면역크로마토그래피(Immunochromatography), 면역조직화학염색, 효소결합 면역흡착 분석(enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay: RIA), 효소 면역분석(enzyme immunoassay: EIA), 형광면역분석(Floresence immunoassay: FIA), 발광면역분석(luminescence immunoassay: LIA), 웨스턴블라팅(Western blotting), 표면 플라스몬 공명 (Surface Plasmon Resonance: SPR), 항체와 항원의 3차원 구조를 이용한 결합에너지 계산 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법에 의하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 예에서, 상기 항원-항체 복합체의 존재 (형성) 여부는 항체와 항원의 3차원 구조를 이용한 결합에너지 계산, 예컨대, 모델링을 통한 항원-항체 결합력 측정에 의하여 확인할 수 있다.

항체와 항원의 pH 의존적 결합은 측정하고자 하는 항체와 항원의 3차원 구조를 이용한 결합에너지 계산을 통해 예측할 수 있다. 결합에너지를 계산하기 위해서는 항체와 항원 단백질의 3차원 구조, 결합구조가 필요하다.

단백질의 3차원 구조는 다음과 같은 방법으로 얻을 수 있다.

1) X-ray crystallography: 3차원 구조를 밝히기를 원하는 단백질을 클로닝(cloning), 대량발현(overexpression), 및 정제(protein purification)하여 순수한 단백질을 결정화(crystallization)한다. 결정화된 단백질의 x-ray 회절(diffraction) 실험을 통해 얻은 결과를 이용하여 단백질 원자들의 전자밀도지도(electron density map)를 얻고 아미노산들을 사상(mapping)하고 개량(refinement)하여 단백질을 구성하는 원자들의 3차원 좌표를 얻는다.

2) PDB(Protein Data Bank, http://www.pdb.org) 검색: 공개적으로 발표되는 단백질들의 3차원 구조들은 PDB에 저장된다. 단백질의 이름이나 아미노산 서열을 이용하여 PDB를 검색하여 3차원 구조가 존재하면 단백질 원자들의 3차원 좌표를 내려 받아 사용한다.

3) 호몰로지 모델링(homology modeling): X-ray crystallography나 PDB 검색으로 단백질의 3차원구조를 얻을 수 없으면 호몰로지 모델링 방법으로 단백질의 3차원 구조를 구한다. 호몰로지 모델링은 구하고자 하는 단백질의 시퀀스 정보를 이용하여 블라스트(BLAST, Basic Local Alignment Search Tool) 검색(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)하여 하나 이상의 유사한 단백질의 아미노산 서열로 주형(template)을 만들고, 이를 구하고자 하는 아미노산 서열과 함께 정렬(alignment)시킨다. 구하고자 하는 단백질의 아미노산 서열을 주형의 아미노산 서열에 매칭하여 구조를 생성하고, 단백질 원자들의 3차원 좌표를 구하고, 분자동역학(molecular dynamics)을 이용하여 최적화하여, 구하고자 하는 단백질의 3차원 구조를 얻는다.

단백질의 3차원 결합 구조는 다음과 같은 방법으로 구할 수 있다.

a) X-ray crystallography: 구하고자 단백질들을 클로닝, 대량발현 및 정제한 후 함께 결정화(co-crystallization)하여 결정을 얻고 x-ray 회절실험 후, 상기 1)과 같은 방법으로 단백질 3차원 결합구조를 구한다.

b) PDB 검색: 단백질 3차원 결합구조가 PDB에 존재한다면 원자들의 3차원 좌표를 내려 받아 사용할 수 있다.

c) 단백질과 단백질 도킹(docking): 실험적으로 구할 수 없는 항원과 항체의 단백질의 3차원 결합구조는 단백질과 단백질 도킹 계산으로 예측할 수 있다. 단백질의 3차원 구조가 고정된 것(rigid body)으로 가정하고, 결합부분이 알려진 항체 단백질의 결합 부분을 리간드(ligand)로 모든 결합 가능한 모드를 구한다. 결합면의 상보성(shape complementarity), 용해화 에너지(desolvation energy), 정전기적 에너지(electrostatic energy)로 평가한다. 높은 점수의 결합구조를 대상으로 구조적 충돌을 제거하고 최적화하여 용해화 에너지와 정전기적 에너지를 다시 계산하여 낮은 에너지의 결합 구조를 3차원 결합구조로 제시한다 (Chen, R.; Weng, Z. P. Docking unbound proteins using shape complementarity, desolvation, and electrostatics. Proteins 2002, 47(3), 281-294).

일 예에서, 두 단백질의 결합에너지 ΔG_bind는 반데르발스 결합에너지(E_vdw), 단백질-단백질 및 단백질-용매 사이의 정전기적 결합에너지(ΔG_el), 단백질의 실험적 엔트로피 에너지(ΔG_entr), 그리고 무극성 용매화에너지(ΔG_np)의 합으로 다음과 같은 식으로 나타낼 수 있다.

ΔG_bind = a·E_vdw + b·ΔG_el + c·ΔG_entr + d·ΔG_np

(a, b, c, d: 실험적 무게 계수)

위 식에서, pH의존적 결합에너지 ΔG_bind(pH) 는

ΔG_bind(pH) = a·E_vdw + b·ΔG_el(pH) + c·ΔG_entr + d·ΔG_np

이며 pH 7.4에서와 다른 pH사이의 결합에너지 차이 ΔΔG는

ΔΔG = ΔG_bind(pH) - ΔG_bind(pH=7.4) = b·(ΔG_el(pH) - ΔG_el(pH=7.4))

로 나타낼 수 있으며 실험적으로 b는 1이며 ΔG_el(pH)는 다음의 식으로 계산된다.

ΔG_el(∞)는 탈수소 상태에(deprotonated states) 서의 정전기적 에너지, θ_i(pH)는 pH에서 i번째 아미노산의 fractional protonation 이고, ΔG_el는 다음 식으로 계산될 수 있다.

q_i 및 q_j는 각각 i 및 j 번째 원자전하(atomic charge), α_i 및 α_j는 각각 i 및 j 번째 유효 본 반지름(effective Born radius), r_i _.j는 i번째와 j번째 원자의 핵간 거리, ε_m 과 ε_slv 는 각각 단백질과 용매의 유전계수이다 (Spassov, V.Z.; Yan, L. pH-Selective mutagenesis of protein-protein interfaces: In silico design of therapeutic antibodies with prolonged half-life PROTEINS : Structure, Function , Bioinformatics 2013, 81, 704-714).

한편, 타이로신 카이네이즈 (Receptor tyrosine kinases; RTKs)와 다양한 리간드가 종양 형성 (tumorigenesis) 및 암의 진행 (progression)에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 따라서, 상기 pH 의존적 선별 방법에 의하여 선별 가능한 (선별된) 항체는 상기 수용체 타이로신 카이네이즈 및/또는 상기 리간드를 항원으로 하여 상기 항원과 함께 세포 내재화 및/또는 세포내 분해되어 상기 항원에 대하여 길항작용함으로써 암 등의 다양한 질병의 치료용으로 사용되는 것일 수 있다.

상기 수용체 티로신 카이네이즈는, 예컨대, c-Met 단백질, c-Met 단백질 변이체 (mutants), 상피세포 성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor; EGFR; ErbB1), HER2(Human Epidermal growth factor Receptor 2 protein; ErbB2), HER3(Human Epidermal growth factor Receptor 3 protein; ErbB3), 혈소판유래 성장인자 수용체 (platelet-derived growth factor receptors; PDGFR), 혈관내피세포 성장인자 수용체 (vascular endothelial growth factors; VEGFR), 인슐린-유사 성장인자 1 수용체 (Insulin-like Growth Factor 1 Receptor; IGF1R), 에프린 수용체(ephrin receptors) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 리간드는 예컨대, EGF, VEGF, PDGF, FGF, Ang2 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

예컨대, c-Met은 세포 표면에 존재하는 대표적인 수용성 타이로신 카이네이즈로서, 그 리간드인 HGF (Hepatocyte Growth Factor)와 결합하여 세포 내 신호전달을 촉진시켜 세포의 성장을 촉진할 뿐 아니라 암세포에 과 발현되어 암 발생, 암 전이, 암세포 이동, 암세포 침투, 신생 혈관 형성에도 광범위하게 관여하고 있다. 이 때문에 c-Met을 타겟으로 하여 분해시키는 것 만으로도 암세포의 tumorigenesis가 억제되는 현상도 관찰이 가능하다. c-Met을 타겟으로 하는 항체가 c-Met과 결합하여 세포내로 이동할 때 혈액보다 낮은 pH를 가진 엔도좀을 통해 이동하게 되는데, 이때 엔도좀의 pH에서 항체가 항원과 분리되면 c-Met은 더 이상 라이소좀까지 이동하지 못하고 recycling된다. 그러나, 엔도좀의 pH에서도 항원과 분리되지 않고 항원-항체 결합을 견고하게 유지한다면 라이소좀까지 이동하여 c-Met이 분해될 확률이 매우 높아진다. 더욱이, 상기 항체가 엔도좀보다 낮은 라이소좀의 pH 범위에서도 항원과 분리되지 않고 항원-항체 결합을 견고하게 유지한다면 c-Met이 분해될 확률이 더욱 높아진다.

따라서, 상기 pH 의존적인 항체 선별 방법으로 선별 가능한 (선별된) 항체는 항 c-Met 항체일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 항 c-Met 항체는 c-Met을 항원으로 인식 및/또는 c-Met에 특이적으로 결합하고, c-Met의 세포 내재화(internalization) 및/또는 세포내 분해(degradation)를 유도하는 모든 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 항 c-Met 항체의 scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다. 상기 항 c-Met 항체는 c-Met의 특정 부위, 예컨대 SEMA 도메인 내의 특정 부위를 에피토프로 인식하는 것일 수 있다.

상기 "c-Met 단백질"은 간세포 성장 인자와 결합하는 수용체 티로신 카이네이즈를 의미한다. 상기 c-Met 단백질은 모든 종에서 유래하는 것일 수 있으며, 예컨대, 인간 c-Met (예컨대, NP_000236), 원숭이 c-Met (예컨대, Macaca mulatta, NP_001162100) 등과 같은 영장류 유래의 것, 또는 마우스 c-Met (예컨대, NP_032617.2), 래트 c-Met (예컨대, NP_113705.1) 등과 같은 설치류 유래의 것 등일 수 있다. 상기 단백질은 예를 들면, GenBank Aceession Number NM_000245에 제공된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드, 또는 GenBank Aceession Number NM_000236에 제공된 폴리펩티드 서열에 의해 암호화된 단백질, 또는 그의 세포외 도메인을 포함한다. 수용체 티로신 키나제 c-Met은 예를 들면, 암발생, 암전이, 암세포 이동, 암세포 침투, 신생혈관 생성 과정 등의 여러 가지 기작에 관여한다.

HGF(Hepatocyte growth factor)의 수용체인 c-Met은 세포외 부위, 막투과 부위, 세포내 부위의 세 부분으로 구분되며, 세포외 부위의 경우, 이황화 결합에 의해 α-소단위체와 β-소단위체가 연결된 형태로 HGF 결합 도메인인 SEMA 도메인, PSI 도메인(plexin-semaphorins-integrin homology domain) 및 IPT 도메인(immunoglobulin-like fold shared by plexins and transcriptional factors domain)으로 이루어진다. c-Met 단백질의 SEMA 도메인은 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, c-Met의 세포외 부위에 존재하는 도메인으로서, HGF가 결합하는 부위에 해당한다. SEMA 도메인 중에서 특정 부위, 예컨대, 106번째부터 124번째까지에 해당하는 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 영역은 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 에피토프 중 2번과 3번 프로펠러 도메인 사이의 루프(loop) 부위에 해당하며, 본 발명에서 제안되는 항 c-Met 항체의 에피토프로 작용할 수 있다.

용어, "에피토프(epitope)"는 항원 결정 부위(antigenic determinant)로서, 항체에 의해 인지되는 항원의 일부분을 의미하는 것으로 해석된다. 일 구체예에 따르면, 상기 에피토프는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 연속하는 5개 이상의 아미노산을 포함하는 부위, 예컨대, c-Met 단백질의 SEMA 도메인(서열번호 79) 내의 106번째부터 124번째까지에 해당하는 서열번호 71 내에 위치하는 연속하는 5개 내지 19개의 아미노산을 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 에피토프는 서열번호 71의 아미노산 서열 중 서열번호 73(EEPSQ)을 포함하여 연속하는 5 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다.

상기 서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 에피토프는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 2번과 3번 프로펠러 구조의 도메인 사이의 루프 부위 중 가장 바깥으로 위치한 부위에 해당하며, 상기 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 에피토프는 일 구체예에 따른 항체 또는 항원 결합 단편이 가장 특이적으로 결합하는 부위이다.

따라서, 항 c-Met 항체는 서열번호 71의 아미노산 서열 중 서열번호 73(EEPSQ)을 포함하는 연속하는 5 내지 19개의 아미노산을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 71, 서열번호 72, 또는 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 항 c-Met 항체는,

서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, 서열번호 5의 아미노산 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 내의 3번째부터 10번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 8 내지 19개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열, 서열번호 85의 아미노산 서열, 또는 서열번호 85의 아미노산 서열 내의 1번째부터 6번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 6 내지 13개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR), 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 부위;

서열번호 7의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2, 및 서열번호 9의 아미노산 서열, 서열번호 15의 아미노산 서열, 서열번호 86의 아미노산 서열, 또는 서열번호 89의 아미노산 서열 내의 1번째부터 9번째까지의 아미노산을 포함하는 9 내지 17개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위;

상기 중쇄 상보성 결정영역 및 경쇄 상보성 결정영역의 조합; 또는

상기 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위의 조합

을 포함하는 것일 수 있다.

상기 서열번호 4 내지 서열번호 9는 각각 하기 일반식 Ⅰ 내지 일반식 Ⅵ으로 표시되는 아미노산 서열이다:

일반식 Ⅰ

Xaa₁-Xaa₂-Tyr-Tyr-Met-Ser (서열번호 4),

일반식 Ⅱ

Arg-Asn-Xaa₃-Xaa₄-Asn-Gly-Xaa₅-Thr (서열번호 5),

일반식 Ⅲ

Asp-Asn-Trp-Leu-Xaa₆-Tyr (서열번호 6),

일반식 Ⅳ

Lys-Ser-Ser-Xaa₇-Ser-Leu-Leu-Ala-Xaa₈-Gly-Asn-Xaa₉-Xaa₁₀-Asn-Tyr-Leu-Ala (서열번호 7)

일반식 Ⅴ

Trp-Xaa₁₁-Ser-Xaa₁₂-Arg-Val-Xaa₁₃ (서열번호 8)

일반식 Ⅵ

Xaa₁₄-Gln-Ser-Tyr-Ser-Xaa₁₅-Pro-Xaa₁₆-Thr (서열번호 9)

상기 일반식 Ⅰ에서, Xaa₁은 존재하지 않거나 Pro 또는 Ser이고, Xaa₂는 Glu 또는 Asp이며,

상기 일반식 Ⅱ에서, Xaa₃은 Asn 또는 Lys이며, Xaa₄는 Ala 또는 Val이고, Xaa₅는 Asn 또는 Thr이며,

상기 일반식 Ⅲ에서, Xaa₆은 Ser 또는 Thr이고,

상기 일반식 Ⅳ에서, Xaa₇은 His, Arg, Gln 또는 Lys이고, Xaa₈은 Ser 또는 Trp이고, Xaa₉은 His 또는 Gln이며, Xaa₁₀는 Lys 또는 Asn이고,

상기 일반식 Ⅴ에서, Xaa₁₁은 Ala 또는 Gly이며, Xaa₁₂은 Thr 또는 Lys이고, Xaa₁₃는 Ser 또는 Pro이며,

상기 일반식 Ⅵ에서, Xaa₁₄은 Gly, Ala 또는 Gln이고, Xaa₁₅는 Arg, His, Ser, Ala, Gly 또는 Lys이며, Xaa₁₆는 Leu, Tyr, Phe 또는 Met이다.

일 구체예에서, 상기 CDR-H1은 서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 CDR-H2는 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 CDR-H3는 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 CDR-L1은 서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 CDR-L2는 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 CDR-L3은 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 1, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2, 서열번호 25, 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 3, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 85으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H3)를 포함하는 중쇄 가변 부위; 및 서열번호 10, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 11, 서열번호 34, 서열번호 35, 및 서열번호 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 37, 서열번호 86, 및 서열번호 89로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L3)를 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 항 c-Met 항체 또는 항원 결합 단편에서, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 17, 서열번호 74, 서열번호 87, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93 또는 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 부위는 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 75, 서열번호 88, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99 또는 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 항체는 마우스 유래 항체, 마우스-인간 키메릭 항체, 인간화 항체, 또는 인간 유래 항체일 수 있다. 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 생체에서 분리되거나 비자연적(인위적)으로 생성된 것일 수 있다. 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 재조합적 또는 합성적으로 생성된 것일 수 있다. 상기 항체는 단클론 항체일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 항 c-Met 항체는,

서열번호 62의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 64의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임) 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 66의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 17번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 및 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및

서열번호 68의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 20번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열, 서열번호 70의 아미노산 서열 (이 중에서 1번째부터 20번째까지의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드임), 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열, 및 서열번호 108의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄

를 포함하는 것일 수 있다.

예컨대, 상기 항-c-Met 항체는,

서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 68의 아미노산 서열 또는 서열번호 68의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 70 또는 서열번호 70의 21번째부터 240번째까지의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체

서열번호 62의 아미노산 서열 또는 서열번호 62의 18번째부터 462번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 18번째부터 461번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체; 및

서열번호 66의 아미노산 서열 또는 서열번호 66의 18번째부터 460번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체

로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

다른 예에서, 상기 항체는 두 개 이상의 항원을 인식하는 다중 특이 항체, 예컨대 이중 특이 항체일 수 있다. 일 예에서, 상기 항체는 1) 앞서 설명한 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 2) 항 EGFR 항체, 항 HER2 항체, 항 HER3 항체, 항 Ang2 항체, 항 VEGF 항체 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 다중 특이 항체 (예컨대, 이중 특이 항체)일 수 있다.

일 예에서, 상기 항체는 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 항 EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 c-Met 및 EGFR에 대한 이중 특이 항체 (항 c-Met/항 EGFR 이중특이항체)일 수 있다. 이 때, 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 앞서 설명한 바와 같다. 상기 항 EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 EGFR을 항원으로 인식하는 모든 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 일 예에서, 상기 항 EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,

서열번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 110의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 111의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 부위;

서열번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위;

상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 및 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 조합; 또는

상기 중쇄 가변 부위 및 상기 경쇄 가변 부위의 조합

을 포함하는 것일 수 있다.

	중쇄 CDR		경쇄 CDR
CDR-H1	NYDMS(서열번호109)	CDR-L1	TGSSSNIGNNDVS(서열번호112)
CDR-H2	GISHSSGSKYYADSVKG(서열번호110)	CDR-L2	DDNKRPS(서열번호113)
CDR-H3	KDATPRPLKPFDY(서열번호111)	CDR-L3	GSWDASLNA(서열번호114)

예컨대, 상기 항 EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 115 또는 서열번호 117의 중쇄 가변 부위, 서열번호 116 또는 서열번호 118의 경쇄 가변 부위, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 항 EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 115 또는 서열번호 117의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 116 또는 서열번호 117의 경쇄 가변 부위를 포함하는 항 EGFR scFv일 수 있다.

<서열번호 115: 항 EGFR 항체의 중쇄 가변 부위>

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYDMSWVRQAPGKGLEWVSGISHSSGSKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDATPRPLKPFDYWGQGTLVTVSS　　

(상기 서열에서 굵은 글씨로 표시한 부분이 CDR 부위이며, 순서대로 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3이다)

<서열번호 116: 항 EGFR 항체의 경쇄 가변 부위>

QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGNNDVSWYQQLPGTAPKLLIYDDNKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDASLNAYVFGGGTKLTVLG

(상기 서열에서 굵은 글씨로 표시한 부분이 CDR 부위이며, 순서대로 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3이다)

<서열번호 117: 항 EGFR 항체의 중쇄 가변 부위>

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYDMSWVRQAPGKCLEWVSGISHSSGSKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDATPRPLKPFDYWGQGTLVTVSS　　

<서열번호 118: 항 EGFR 항체의 경쇄 가변 부위>

QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGNNDVSWYQQLPGTAPKLLIYDDNKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDASLNAYVFGCGTKLTVLG

다른 예에서, 상기 항 EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 시툭시맙(Cetuximab; Erbitux), 패니투무맙(Panitumumab), 서열번호 121의 중쇄가변부위, 서열번호 123의 경쇄가변부위, 또는 이들의 조합을 포함하는 항 EGFR 항체, 서열번호 125의 중쇄가변부위, 서열번호 126의 경쇄가변부위, 또는 이들의 조합을 포함하는 항 EGFR 항체, 및 이들의 항원 결합 단편으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

상기 항 c-Met 항체 또는 항 EGFR 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편의 앞서 정의된 CDR 부위 또는 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역을 제외한 부위, 예컨대 경쇄 불변 영역과 중쇄 불변 영역은 모든 서브타입의 면역글로불린(예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, 등)으로부터 유래하는 것일 수 있으며, 예컨대, IgG (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)로부터 유래하는 것일 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. 예를 들어, scFv, (scFv)₂, scFv-Fc, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 본 발명에서의 항체의 항원 결합 단편은 상기한 상보성 결정 영역을 하나 이상 포함하는 항체 단편, 예컨대, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

상기 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체에 있어서, 항 c-Met 항체는 c-Met 단백질이 세포 내로 이동하고 분해되는 것을 매개하는 역할을 하므로, 이러한 역할을 온전히 수행하기 위하여 완전한 항체 구조를 갖는 것이 유리할 수 있고, 항 EGFR 항체 등은 EGFR에 대한 특이적 인식 및 결합이 중요하므로, EGFR를 인식하는 항원 결합 단편을 포함하여도 무방할 수 있다. 따라서, 상기 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체는 완전한 (full length) 면역글로불린 (예컨대 IgG (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)) 형태의 항 c-Met 항체 및 상기 항체 (예컨대, 상기 항체의 중쇄)의 C 말단에 연결된 항 EGFR 항체의 항원 결합 단편 (예컨대, 항 EGFR scFv)를 포함하는 것일 수 있다.

상기 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체에 있어서, 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 항 EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 링커, 예컨대, 펩타이드 링커를 통하거나 통하지 않고 연결될 수 있다. 또한 항원 결합 단편 내의 중쇄 부분과 경쇄 부분, 예컨대 scFv 단편 내의 중쇄 가변 부위와 경쇄 가변 부위도 펩타이드 링커를 통하거나 통하지 않고 연결될 수 있다. 상기 항 c-Met 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 항 EGFR 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 연결하는 펩타이드 링커와 항원 결합 단편 내의 중쇄 부분과 경쇄 부분을 연결하는 펩타이드 링커는 동일하거나 상이할 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 1 내지 100개 또는 2 내지 50개의 임의의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있으며, 그 포함된 아미노산 종류는 제한이 없다. 상기 펩타이드 링커는, 예컨대, Gly, Asn 및/또는 Ser 잔기를 포함할 수 있으며, Thr 및/또는 Ala과 같은 중성 아미노산들도 포함될 수 있다. 펩타이드 링커에 적합한 아미노산 서열은 당 업계에 공지되어 있다. 한편, 상기 링커는 상기 이중 특이 항체의 기능에 영향을 미치지 않는 한도 내에서, 그 길이를 다양하게 결정할 수 있다. 예컨대, 상기 펩타이드 링커는 Gly, Asn, Ser, Thr 및 Ala로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 총 1 내지 100개, 2 내지 50개, 또는 5 내지 25개를 포함하여 이루어진 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 펩타이드 링커는 (G4S)n (n은 G4(GGGGS)의 반복수)로서, 1 내지 10의 정수, 예컨대 2 내지 5의 정수)로 표현되는 것일 수 있다.

상기한 항 c-Met 항체 또는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은

i) pH 6.6 내지 8.5, 예컨대, pH 7 내지 8, pH 7.2 내지 7.6, pH 7.3 내지 7.5, 또는 약 pH 7.4; 및/또는

ii) pH 6.5 이하, pH 6.2 이하, 또는 pH 6.0 이하, 예컨대, pH 5.3 내지 6.5, pH 5.3 내지 6.2, pH 5.3 내지 6.0, pH 5.5 내지 6.5, pH 5.5 내지 6.2, pH 5.5 내지 6.0, pH 5.8 내지 6.5, pH 5.8 내지 6.2, 또는 pH 5.8 내지 6.0; 및/또는

iii) pH 5.5 이하, pH 5.0 이하, pH 4.8 이하, 또는 pH 4.5 이하, 예컨대, pH 3.0 내지 5.5, pH 3.0 내지 5.0, pH 3.0 내지 4.8, pH 3.0 내지 4.5, pH 3.5 내지 5.5, pH 3.5 내지 5.0, pH 3.5 내지 4.8, pH 3.5 내지 4.5, pH 4.0 내지 5.5, pH 4.0 내지 5.0, pH 4.0 내지 4.8, 또는 pH 4.0 내지 4.5

의 pH 범위에서 항원-항체 결합을 형성할 수 있다.

상기 pH 의존적인 항체 선별 방법으로 선별된 항체는 항원을 효과적으로 세포 내재화 및/또는 분해하여 항원에 대하여 효과적인 길항 작용을 나타내므로, 다양한 질병 및/또는 증상, 예컨대 암에 대한 치료용 항체로서 사용 가능하다. 또한, 상기 선별된 항체는 단독으로 사용 가능할 뿐 아니라, 다른 약물과 함께 항체-약물 접합체 (Antibody-Drug Conjugate; ADC)로서 사용될 수 있다.

따라서, 상기 pH 의존적 항체 선별 방법은 항체-약물 접합체 (ADC) 제조를 위한 항체를 선별하기 위한 것이 수 있다.

다른 예는 상기 pH 의존적 항체 선별 방법에서 사용되는 항체가 항체-약물 접합체 (ADC)에 포함된 항체일 수 있다. 이 경우, 상기 pH 의존적 항체 선별 방법은 항체-약물 접합체 (ADC) 선별을 위한 방법일 수 있다.

다른 예는 상기 pH 의존적 항체 선별 방법에 의하여 선별된 항체 또는 상기 항체를 포함하는 항체-약물 접합체를 포함하는 항암제를 제공한다.

다른 예는 상기 pH 의존적 항체 선별 방법에 의하여 선별된 항체와 약물이 접합된 항체-약물 접합체 (ADC)를 제공한다. 상기 항체-약물 접합체 (ADC)에서, 상기 항체 및 약물은 링커를 통하거나 통하지 않고 연결된 것일 수 있다. 상기 항체-약물 접합체는 세포질뿐 아니라 엔도좀 및/또는 라이소좀까지 성공적으로 전달될 수 있다.

ADC는 항체의 항암효과를 증진시키면서 화학 약물(chemical drug)의 특이성(specificity)을 극복하여 효능은 증대시키고 부작용은 줄이기 위한 방법으로 고안된 플랫폼이다. ADC에서 약물은 항체를 통해 암세포를 표적하여 세포 내 전달 후 항체로부터 해리되어 암세포 특이적 세포 독성을 나타내도록 하는 전략이 많이 사용되고 있다. 이러한 전략은 최소용량, 제한된 독성으로 정상세포가 아닌 암세포에만 약물을 전달하여 환자들에게 부작용을 최소화 하기 위하여 개발되고 있다. 예를 들어, 허셉틴 (Herceptin, Tratuzumab)과 DM1 (Emtansine)을 결합시킨 로슈의 T-DM1의 경우 유방암 환자를 대상으로 한 임상시험에서 무진행 생존기간 (PFS)를 기존 약물인 타이커브 (Tykerb, lapatinib) 또는 젤로다 (Xeloda, capecitabine)보다 길었고, 2년 생존율도 높았으며, 부작용도 기존 치료제보다 우수하였다.

ADC를 개발하는데 있어서 표적(항원), 항체, 링커(항체와 약물을 연결), 및 약물에 따른 전략이 매우 중요하지만, 그 중에서도 항체의 선별이 매우 중요한 역할을 한다. 동일한 표적, 링커, 및 약물을 포함하는 ADC일지라도 항체에 따라서 치료효과가 크게 달라진다는 연구 결과가 있기 때문에, ADC를 만들기 위한 치료용 항체를 선별하는 방법이 매우 중요하다. ADC내 포함된 항체가 엔도좀의 pH 범위에서 쉽게 항원과 분리되면, 빠르게 recycling될 수 있기 때문에, ADC의 세포 내부 존재 시간이 짧아지고, 이와 함께 세포 내부의 약물 노출(존재)시간도 짧아지게 된다. 그러나, ADC 내 포함된 항체가 엔도좀 및/또는 라이소좀의 pH 범위에서 항원과의 결합력을 유지하여 쉽게 항원과 분리되지 않는다면, 엔도좀 및/또는 라이소좀에서 항원-항체 결합이 분해될 때까지 약물을 세포 내에 노출(존재)시킬 수 있고, 링커에 따라서 그 항체가 분해되기 전 (분해성 링커(cleavable linker)의 경우), 또는 분해 된 후 (비분해성 링커(non-cleavable linker)의 경우)에 약물을 ADC로부터 해리시켜서 항암효과를 보이게 된다. 이 경우 암세포가 아닌 정상세포에 약물이 미치는 영향이 최소화되서 항암 활성 약물 사용에 따른 부작용을 크게 줄일 수 있다.

상기 ADC에서 항체와 약물이 링커를 통하여 연결(화학적 결합(예컨대, 공유결합)을 통하여)된 것인 경우, 상기 링커는 분해성 링커(cleavable linker) 또는 비분해성 링커(non-cleavable linker)일 수 있다.

상기 분해성 링커는 펩타이드 링커, 히드라존(hydrazone) 링커, 다이설파이드 (disulfide) 링커 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 펩타이드 링커는 1 내지 100개 또는 2 내지 50개의 임의의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있으며, 그 포함된 아미노산 종류는 제한이 없다. 상기 펩타이드 링커는, 예컨대, Gly, Asn 및/또는 Ser 잔기를 포함할 수 있으며, Thr 및/또는 Ala과 같은 중성 아미노산들도 포함될 수 있다. 펩타이드 링커에 적합한 아미노산 서열은 당 업계에 공지되어 있다. 한편, 상기 링커는 상기 항체와 약물의 기능에 영향을 미치지 않는 한도 내에서, 그 길이를 다양하게 결정할 수 있다. 예컨대, 상기 펩타이드 링커는 Gly, Asn, Ser, Thr 및 Ala로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 총 1 내지 100개, 2 내지 50개, 또는 5 내지 25개를 포함하여 이루어진 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 펩타이드 링커는 (G4S)n (n은 G4S(GGGGS)의 반복수)로서, 1 내지 10의 정수, 예컨대 2 내지 5의 정수)로 표현되는 것일 수 있다.

상기 하이드라존 링커는 하이드라존 구조 (R₁R₂C=NNH₂)를 갖고 생체에서 분해되는 모든 유기화합물일 수 있다. 상기 하이드라존 링커는 pH 의존적으로 반응하는 화합물일 수 있다.

상기 다이설파이드 링커는 다이설파이드 결합을 갖는 다이설파이드 구조 (R-S-S-R'; R과 R'은 각각 독립적으로 수소 또는 유기화합물)를 포함하고 생체에서 분해되는 모든 유기 화합물일 수 있다. 상기 다이설파이드 링커는 pH 의존적으로 반응하는 화합물일 수 있다.

상기한 분해성 링커가 소망하는 pH 범위에서 분해되면, 항원-항체 결합 유지 여부와 무관하게 약물이 ADC로부터 방출되어 본래의 효능을 발휘할 수 있다.

상기 비분해성 링커는 생체적합성 및 생체비분해성을 갖는 모든 화합물일 수 있다. 예컨대, 상기 비분해성 링커는 티오에테르 (thioether) 링커, 아마이드 (amide) 링커, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 티오에테르 링커는 티오에테르 구조([C-S-C]로 연결된 R''-S-R''' 구조; R''와 R'''는 각각 독립적으로 수소 또는 유기 화합물)를 갖고 생체에서 분해되지 않는 모든 유기황 화합물일 수 있다. 이와 같은 비분해성 링커의 경우, 상기한 pH 범위에서 ADC에 포함된 항체가 항원과 분리되거나 라이소좀에서 항원과 항체가 분해될 때 ADC에 포함된 약물이 ADC로부터 방출되어 약물 본래의 효과를 발휘할 수 있다.

상기 ADC에 포함된 약물은 치료하고자 하는 질병 및/또는 증상, 예컨대 암에 대하여 치료 효과를 갖는 모든 약물일 수 있다. 예컨대, 상기 약물은 모든 항암제일 수 있다. 상기 항암제는 다음으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:

1) 알킬화제 (alkylating agents):

i) 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin) 등을 포함하는 백금계 화합물,

ii) 메클로레타민(mechlorethamine), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로람부실(chlorambucil) 등을 포함하는 니트로겐 머스타드계 화합물(nitrogen mustard-based compounds),

iii) 티오테파(thiotepa), 알트레타민(altretamine) 등을 포함하는 에틸렌이민계 및 메틸멜라민계 약물,

iv) 프로카바진(procarbazine) 등을 포함하는 메틸하이드라진(methylhydrazine) 유도체,

v) 부설판(busulfan) 등을 포함하는 알킬설포네이트계 약물,

vi) 카무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine) 등을 포함하는 니트로소우레아계 약물(nitrosourea-based drugs),

vii) 다카바진(dacarbazine) 등을 포함하는 트리아진계 약물 (triazine-based drugs);

2) 대사 길항제(antimetabolites):

i) 플루오로우라실(fluorouracil; 5-FU), 카페시타빈(capecitabine), 시타라빈(cytarabine), 젬시타빈(gemcitabine) 등을 포함하는 피리미딘 유도체,

ii) 메토트렉세이트(methotrexate; MTX) 등을 포함하는 엽산(folic acid) 유도체,

iii) 머캅토퓨린(mercaptopurine; 6-MP) 등을 포함하는 퓨린 유도체;

3) 천연 물질:

i) 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 비노렐빈(vinorelvine) 등을 포함하는 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid),

ii) 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel) 등을 포함하는 탁산류,

iii) 에토포시드(etoposide) 등을 포함하는 에피포도필로톡신(epipodophyllotoxin),

iv) 토포테칸(topotecan), 이리노테칸(irinotecan) 등을 포함하는 캄프토테신(camptothecin);

4) 항생제: 닥티노마이신(dactinomycin), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 미토마이신(mitomycin), 블레오마이신(bleomycin), 등;

5) 프레드니손(prednisone), 6-티오구아닌(6-thioguanine; 6-TG), 등.

본 발명의 항체 선별 방법은 pH 의존적 항원-항체 결합을 미리 측정하여 항원을 효과적으로 분해할 수 있는 항체 개발에 적용 가능하며, 상기 선별된 항체는 치료용 항체로서 유용하다. 또한, pH 의존적 항원-항체 결합을 미리 측정하여 약물을 세포 내에서 분리시킬 수 있는 부작용이 적은 항체-약물 접합체(ADC)의 개발에 적용 가능하다. 즉 상기 항체 선별 방법은 ADC 제작을 위한 항체 선별 및 개발된 ADC 선별방법으로 사용 가능하다.

도 1은 pH에 따른 항 c-Met 항체의 c-Met과의 결합 에너지를 보여주는 그래프이다.
도 2는 EBC-1 세포에서의 pH에 따른 항 c-Met 항체와 c-Met과의 결합 수준을 보여주는 그래프이다.
도 3은 EBC-1 세포에서의 pH에 따른 항 c-Met 항체와 c-Met과의 결합 수준을 보여주는 그래프이다.
도 4는 EBC-1세포에서의 항 c-Met 항체의 c-Met 분해 정도를 보여주는 면역 블라팅 결과이다.
도 5는 EBC-1의 xenograft model에서의 항 c-Met 항체의 c-Met 분해 정도를 보여주는 그래프이다.
도 6 및 도 7은 항 c-Met 항체의 라이소좀으로의 이동을 보여주는 형광 이미지이다.
도 8 및 도 9는 항 c-Met 항체의 항암 효과를 보여주는 그래프이다.
도 10은 EBC-1의 xenograft model에서 항 c-Met 항체 처리에 따른 종양 조직의 크기 변화를 보여주는 그래프이다.
도 11 내지 13는 항 c-Met 항체와 도세탁셀이 접합된 항체-약물 접합체의 항암 효과를 보여주는 그래프이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 항체의 준비

다음과 같은 항 c-Met 항체를 준비하였다:

항 c-Met 항체 A (실험군: 서열번호 71의 아미노산 서열 중 서열번호 73(EEPSQ)을 포함하는 연속하는 5 내지 19개의 아미노산을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체): 서열번호 66의 중쇄 및 서열번호 68의 경쇄를 포함하는 IgG2형 항체;

항 c-Met 항체 B (비교군 1): 다음의 서열번호 127의 중쇄 및 서열번호 128의 경쇄를 포함하는 항체:

서열번호 127: 중쇄

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

서열번호 128: 경쇄

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGDC;

항 c-Met 항체 C (비교군): 5D5 항체 (American Type Culture Collection; ATCC Cat. # HB11895 하이브리도마 세포에서 분리 정제);

c-Met 이중항체 A (항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체: 실험군): 항 c-Met 항체 A의 Fc의 c-말단에 항 EGFR scFv(서열번호 117 (중쇄가변부위) 및 서열번호 118 포함 (경쇄가변부위)가 GGGGSGGGGSGGGGS 펩타이드 링커로 연결됨)이 GGGGSGGGGS 펩타이드 링커를 통하여 연결된 이중 특이 항체.

실시예 2: 항체-항원 간 pH 의존적 결합에너지 차이 계산

항원으로 사용되는 c-Met의 3차원 구조 정보는 PDB에서 확보하였다 (code: 4K3J, chain: B).

항 c-Met 항체 A, B, 및 C의 3차원 구조 정보는 실시예 1에서 제공된 염기서열을 호몰로지 빌딩 모듈인 Discovery Studio 프로그램(Accelrys Inc.) 내 Blast search & Model Antibody Framework에 대입하여 확보하였다.

항 c-Met 항체 A, B, 및 C와 항원 c-Met과의 결합 구조는 확보된 항원 항체의 구조를 단백질과 단백질의 도킹 모듈인 Discovery Studio 프로그램 내 Dock Proteins(ZDOCK)에 대입하여 확보하였다.

항 c-Met 항체 A, B, 및 C와 항원 c-Met의 pH 의존적 결합에너지의 계산은 확보된 항원 항체 결합 구조를Discovery Studio 프로그램(Accelrys) 내 Calculate Mutation Energy(Binding) 모듈에 대입하여 계산하고, pH에 따라 변화하는 정전기적 에너지를 이용하여 pH7.4를 기준으로 각 pH에서의 결합에너지 차이를 계산하였다.

두 단백질 (항 c-Met 항체 A, B, 및 C 중 하나와 c-Met) 간의 결합에너지 ΔG_bind는 반데르발스 결합에너지(E_vdw), 단백질-단백질 및 단백질-용매 사이의 정전기적 결합에너지(ΔG_el), 단백질의 실험적 엔트로피 에너지(ΔG_entr), 그리고 무극성 용매화에너지(ΔG_np)의 합으로 다음과 같은 식으로 나타낼 수 있다.

ΔG_bind = a·E_vdw + b·ΔG_el + c·ΔG_entr + d·ΔG_np

(a, b, c, d: 실험적 무게 계수)

위 식에서, pH의존적 결합에너지 ΔG_bind(pH) 는

ΔG_bind(pH) = a·E_vdw + b·ΔG_el(pH) + c·ΔG_entr + d·ΔG_np

이며 pH 7.4에서와 다른 pH사이의 결합에너지 차이 ΔΔG는

ΔG = ΔG_bind(pH) - ΔG_bind(pH=7.4) = b·(ΔG_el(pH) - ΔG_el(pH=7.4))

로 나타낼 수 있으며, 실험적으로 b는 1이며 ΔG_el(pH)는 다음의 식으로 계산된다.

상기 계산된 결합에너지 차이를 도 1 및 표 2에 나타내었다:

pH	ΔΔG(c-MET 항체 A/이중항체 A)	ΔΔG(c-MET 항체 B)	ΔΔG(c-MET 항체 C)
4	-0.68	3.89	2.96
4.5	-1.26	2.99	2.01
5	-1.32	2.36	1.28
6	-0.62	1.25	0.40
7.4	0.00	0.00	0.00

도 1 및 표 2에 나타낸 바와 같이, 항 c-Met 항체 A 및 이중항체 A의 경우 생체 내 pH 조건인 pH7.4 이하에서 c-Met과의 결합에너지가 낮은 것을 확인할 수 있었고, 특히 pH4 내지 pH6의 비교적 낮은 pH 범위에서 다른 항체에 비해 매우 안정한(낮은) 결합에너지 값을 가지는 것을 확인하였다.

실시예 3: 항 c- Met 항체의 pH 의존적 항원 결합 측정

실제로 항 c-Met 항체가 c-Met과 결합할 때 pH의 영향을 어느 정도 받는지를 관찰하기 위해서, c-Met과 항체를 결합시킨 후 다양한 pH의 buffer를 처리하여 pH의 변화를 준 후 여전히 항원 (c-Met)과 결합하고 있는 항체의 양을 측정하였다.

구체적으로, 실험에 사용할 EBC-1 세포(ATCC)를 counting 하여 한 tube당 약 3X10⁵ cells/well의 양으로 e-tube에 넣어주었다. 이 때 배지는 RPMI-1640 (Gibco)를 사용하였다. 인산완충식염수(PBS)로 세척하여 배지를 제거한 뒤, 상기 실시예 1에서 준비된 c-Met 항체A, B, C 및 c-Met 이중항체 A를 각각 1 ug(microgram)/ml의 양으로 각 tube에 넣어준 뒤 ice에 30분간 두었다. 여기에 4% Formaldehyde를 10분간 처리하여 세포를 고정시켰다. PBS(pH7.4)로 세척한 뒤에, pH가 상이한 FACS buffer (0.2%(v/v) FBS (Fetal bovine serum) in PBS, pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.4)를 넣고 ice에 5분간 두었다. PBS(pH7.4)로 세척한 뒤에 100 ul(microliter)의 secondary antibody solution (Alexa488 or Alexa594-conjugated anti-human IgG antibody for c-Met 항체 A, B, 및 이중항체 A; Invitrogen, 1/500 dilution in FACS buffer pH 7.4)을 넣고 ice에 30분간 두었다. 세포 표면에 결합하고 있는 c-Met항체의 양을 Flow cytometry (BD, FACS CantoII)로 분석하였다.

상기 얻어진 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타난 바와 같이, c-Met과 항체를 결합시킨 후에 다양한 pH 조건을 가진 buffer로 씻어 줬을 때, 항 c-Met 항체 A 및 c-Met 이중항체 A는 pH가 낮은 buffer를 사용하더라도 c-Met과의 결합을 유지하고 있지만, 항 c-Met 항체 B는 결합을 유지하지 못하고 일부 c-Met과 분리되는 것을 확인할 수 있다.

또한, 살아 있는 세포의 세포막에 존재하는 c-Met과 c-Met 항체와의 결합을 측정하기 위해서 다양한 pH 조건에서 살아있는 세포에 존재하는 c-Met과 c-Met 항체를 결합시켜 보았다.

구체적으로, 실험에 사용할 EBC-1 세포(ATCC)를 counting 하여 한 tube당 약 3X10⁵ cells/well의 양으로 e-tube에 넣어주었다. 이 때 배지는 RPMI-1640 (Gibco)를 사용하였다. PBS(pH 7.4)로 세척하여 배지를 제거한 뒤, pH에 따른 FACS buffer (0.2% FBS in PBS, pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.4) 및 c-Met 항체A, B, 또는 C를 1 ug/ml의 양으로 각 tube에 넣어주고 ice에 30분간 두었다. PBS(pH7.4)로 세척한 뒤에 100 ul의 secondary antibody solution (Alexa488 or Alexa594-conjugated anti-human IgG antibody for c-Met 항체 A, B, 및 이중항체 A; Invitrogen, 1/500 dilution in FACS buffer pH 7.4)을 넣고 ice에 30분간 두었다. 세포 표면에 결합하고 있는 c-Met항체의 양을 FACS로 분석하였다.

상기 얻어진 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 바와 같이, 항 c-Met 항체 A는 항원이 처한pH의 조건과 상관없이 세포 표면에 있는 c-Met과 잘 결합하였지만, 항 c-Met 항체 B는 pH가 낮은 조건일수록 결합하는 항체의 비율이 낮아지는 것을 알 수 있었다.

위의 두 가지 실험에 따른 도 2 및 도 3의 결과를 통해서 pH의존적 항체 항원 결합에너지의 모델링을 통한 계산값(도 1)과 실제값 (도 2 및 도 3)이 일치하는 결과를 보여줌을 알 수 있다.

실시예 4: 항 c- Met 항체의 c- Met 분해 효과

항체가 항원과 결합하여 세포 내로 들어갈 때 c-Met의 경우 endosome을 통해 endocytosis 되는데, 이 때 endosome의 pH는 serum이나 cytoplasm에 비해 낮다고 알려져 있다. 따라서 낮은 pH에서도 c-Met과 결합을 견고하게 유지하는 항체는 c-Met을 endosome 또는 lysosome으로 유도시켜 c-Met의 분해를 보다 효과적으로 유도할 수 있을 것이다.

이를 확인하기 위해서 항 c-Met 항체별 c-Met 분해효과를 확인하여 보았다. c-Met이 많이 발현되는 EBC-1세포주(ATCC)에 항 c-Met항체를 처리하고 c-Met의 양을 확인하였다.

구체적으로 EBC-1 세포주를 10%(v/v) FBS가 포함된 RPMI-1640 배지(Gibco)에 1X10⁶ cells/well의 양으로 넣고, 24시간 후에 상기 실시예 1에서 준비된 항체를 각각 5 ug/ml의 양으로 처리하였다. 30분 또는 60분 후에 세포를 떼어서 웨스턴블라팅 방법으로 전체 c-Met양과 인산화된 Akt, Erk의 양을 측정하였다.

상기 얻어진 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, c-Met 항체 A는 세포 내에서 c-Met을 효과적으로 분해시키고, 하위 신호전달물질인 Akt 및 Erk의 인산화를 억제하는 것으로 나타나서, lysosome 또는 endosome의 낮은 pH 조건에서도 c-Met과의 결합을 유지하는 것을 알 수 있는 반면, 항 c-Met 항체 B 및 C의 경우에는 c-Met을 상대적으로 적게 분해시키는 것으로 나타나서 이들 항체는 lysosome 또는 endosome의 낮은 pH 조건에서 비교적 쉽게 c-Met과 분리되는 것을 확인할 수 있다.

또한, EBC-1의 xenograft model에서 항체 처리에 따른 종양 조직의 c-Met level을 확인하여 보았다.

구체적으로, BALB/c Nude mice에 EBC1 (JCRB0820) 세포 5000개를 injection하였다. injection 시에는 serum-free media에 있는　5000개의 cell의 volume과 matrigel(Corning Life Sciences)의 volume을 1:1이 되게 (Total volume 200 ul) 하여 준비하였다. injection후 7일이 경과한 다음 tumor volume이 200 mm³이 되었을 때 mouse를 randomize하여 group당 15마리로 분류하였다. 각 항체는 5 mg/kg의 dose, IV injection으로 일주일에 한 번씩 투여하였다. 총 4번의 항체를 투여하여 4주 경과 후 실험을 종료하였다. 실험이 종료된 후 tumor 조직을 적출하여 flash frozen 상태로 보관한 후 단백질 용해에 사용하였다. 용해 버퍼로는 Complete lysis-M (Roche, 04719956001)을 이용하였다. 상기 얻어진 조직 용해물에 대하여 Human total HGF R/c-MET ELISA KIT (R&D systems, DYC358)를 이용하여　제조사 사용지침서에 따라서 샌드위치 ELISA를 수행하여, 20 ug(microgram)의 조직용해물에 들어있는 전체 c-Met　양의 변화를 측정하였다.

상기 얻어진 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 항 c-Met항체 A의 c-Met 분해능이 항 c-Met 항체 B 및 C보다 우수함을 알 수 있다.

실시예 5: 항 c- Met 항체의 라이소좀 공동위치화( lysosome co - localization )

항 c-Met 항체 A가 c-Met을 효과적으로 분해시키는 것이 c-Met과 함께 라이소좀으로 이동하였기 때문인 것인지 확인하기 위하여, 항 c-Met 항체 A와 라이소좀 마커(lysosome marker)와의 공동위치화(co-localization)을 공초점현미경(confocal microscope)으로 확인하였다.

구체적으로, protein labelling kit(Invitrogen)을 사용하여 상기 실시예 1에서 준비된 항 c-Met 항체 A에 Alexa Flour 647(Invitrogen)을 conjugation 시킨 후, EBC-1 (ATCC; 20,000 cells/well) 및 MKN45 세포주(JCRB (Japanese Collection of Research Bioresources, 30,000 cells/well)에 각각 1 ug(microliter)/ml의 농도로 처리하였다. 4시간 후에 1 drop 의NucBlue live cell stain (Invitrogen)과 2 ul/ml의Lysotracker DND-99 (Invitrogen)을 1 ml의 PBS에 넣은 후 20 ul/well의 양으로 넣어서 핵과 라이소좀을 염색한 후, 공초점 현미경 (Zeiss)으로 관찰하였다. Fixing cell image를 위해서, 항체 처리하기 전에 4% formaldehyde를 세포에 처리하여 10분간 둔 후에 위와 같은 방법으로 항체를 처리하여 공초점 현미경으로 관찰하였다.

상기 얻어진 결과를 도 6 (EBC-1 세포) 및 도 7 (MKN45 세포)에 나타내었다. 도 6 및 도 7에 나타난 바와 같이, 항 c-Met 항체 A가 세포내로 이동하는 것과 함께, 항 c-Met 항체 A와 라이소좀 마커(Lysotracker DND-99) 신호가 동일한 위치에 존재함(co-localization)을 확인하였다.

실시예 6: 항 c- Met 항체의 항암효과

낮은 pH에서 c-Met과의 결합을 유지하는 항c-Met 항체 A와 낮은 pH에서 c-Met과의 결합 정도가 낮은 항c-Met 항체 B의 항암효과를 비교하기 위하여, c-Met의 발현양이 많은 세포주 Hs746T(JCRB)와 MKN45(JCRB)를 대상으로 항체 처리시의 세포 생존률을 측정하였다.

구체적으로, 10%(v/v) FBS를 포함하는 RPMI1640 배지(GIBCO)가 들어있는 96-well plate에 5,000 cells/well의 양으로 Hs746T와 EBC-1을 각각 seeding한 후, 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 다음날 상기 실시예 1에서 준비된 항체를 각각 10 ug/ml부터 연속희석(serial dilution)하여 100 ul씩 처리하였다. 72시간 동안 인큐베이션 후에 CellTiter-GLO reagent(Promega)로 cell viability를 측정하였다.

상기 얻어진 결과를 도 8 (Hs746T) 및 도 9 (MKN45)에 나타내었다. 도 8 및 도 9에 나타난 바와 같이, 두 종류 세포에서 모두 항 c-Met 항체 B와 비교하여, 낮은 pH에서 항원-항체 결합 활성이 우수한 항 c-Met 항체 A의 경우 항암효과(암세포 생장 저해 효과)가 훨씬 우수함을 확인하였다.

또한, EBC-1의 xenograft model에서 항체 처리에 따른 종양 조직의 크기를 확인하여 보았다.

구체적으로, BALB/c Nude mice에 EBC1 (JCRB0820) 5000개 세포를 injection하였다. injection 시에는 serum-free media에 있는　5000개의 cell의 volume과 matrigel의 volume을 1:1이 되게 (Total volume 200 ul) 하여 준비하였다. injection후 7일이 경과한 다음 tumor volume이 200 mm³이 되었을 때 mouse를 randomize하여 group당 15마리로 분류하였다. 항체는 5 mg/kg의 dose, IV injection으로 일주일에 한 번씩 투여하였다. 총 4번의 항체를 투여하여 4주 경과 후 실험을 종료하였다. 총 4주의 기간 동안 7, 11, 16, 18, 21, 23, 25, 28일에 종양조직의 volume을 측정하였다.

상기 얻어진 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10에 나타난 바와 같이 항 c-Met항체 B, C와 비교하여, 낮은 pH에서 항원-항체 결합 활성이 우수한 항 c-Met항체 A의 경우 항암효과가 훨씬 우수함을 확인하였다.

실시예 7: 항체-약물 접합체 ( ADC )의 항암 효과

pH 의존성이 가장 낮은 것으로 확인된 항 c-Met 항체 A를 대상으로 ADC를 제작하여 항암 효과를 시험하였다. 시험을 위하여 상기 실시예 1에서 제작된 항 c-Met 항체 A와 Docetaxel과의 항체-약물 접합체(ADC)를 아래의 반응식에 따라 제작하였다.

[반응식]

구체적으로, 하기 화학식 1의 도세탁셀 유도체 NHS-Docetaxel을 DMSO (sigma)에 5mg/ml로 녹였다. C-Met 항체 A를 최종적으로 20% DMSO (Sigma), 10mM CHAPS (Sigma), 80% PBS (pH 7.4)(Gibco) 용액으로 2 mg/ml 되게 준비한 후, NHS-Docetaxel를 항체 몰량의 5 배, 10배, 15배 또는 20 배를 투입하여 섞은 후 상온에서 1시간 동안 반응하였다. 그 다음 AKTA Prime (GE healthcare)의 Desalting column (GE healthcare)을 이용하여 항체-도세탁셀 접합체만 정제하였다. 정제 과정은 AKTA prime에 desalting column을 설치하고 PBS (pH 7.4)로 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후 반응물을 컬럼에 투입하여 크기 차를 이용하여 항체-도세탁셀 접합체와 도세탁셀 을 분리하였다.

[화학식 1]

상기 제작된 c-Met 항체 A와 Docetaxel과의 항체-약물 접합체(ADC)를 사용하여 하기 시험을 수행하였다.

10%(v/v) FBS를 포함하는 RPMI1640 배지(GIBCO)가 들어있는 96-well plate에 5,000 cells/well의 양으로 MKN45, Hs746T 및 EBC-1을 각각 seeding한 후, 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 다음날 상기 제작된 ADC를 10 ug/ml부터 연속희석(serial dilution)하여 100 ul/well씩 처리하였다. 72시간 동안 인큐베이션 후에 CellTiter-GLO reagent(Promega)로 cell viability를 측정하였다.

상기 얻어진 결과를 도 11 (EBC-1 세포), 도 12 (Hs746T 세포), 및 도 13 (MKN45 세포)에 나타내었다. 도 11 내지 13에서 확인되는 바와 같이, 낮은 pH에서 항원-항체 결합 활성이 우수한 항 c-Met항체 A와 도세탁셀이 접합된 ADC의 항암 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다.

<110> Samsung Electronics Co. Ltd <120> Screening Method of Antibody <130> DPP20143121KR <160> 128 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 of AbF46 <400> 1 Asp Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR2 of AbF46 <400> 2 Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR3 of AbF46 <400> 3 Asp Asn Trp Phe Ala Tyr 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 of c-Met antibody <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> X is Pro or Ser or absent <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> X is Glu or Asp <400> 4 Xaa Xaa Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR2 of c-Met antibody <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> X is Asn or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> X is Ala or Val <220> <221> MOD_RES 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<222> (751)..(753) <223> stop codon <220> <221> misc_difference <222> (754)..(759) <223> XhoI restriction site <400> 39 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gacattttga tgacccagtc tccatcctcc 120 ctgactgtgt cagcaggaga gaaggtcact atgagctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccagc agaaaccagg acgatctcct 240 aaaatgctga taatttgggc atccactagg gtatctggag tccctgatcg cttcataggc 300 agtggatctg ggacggattt cactctgacc atcaacagtg tgcaggctga agatctggct 360 gtttattact gtcagcagtc ctacagcgct ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg 420 gagctgaaac gtacggtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag 480 ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc 540 aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca 600 gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca 660 gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc 720 gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 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ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 660 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 720 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1080 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320 ctctccctgt ctccgggtaa atgactcgag 1350 <210> 48 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tgaggtcaca 780 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1080 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320 ctctccctgt ctccgggtaa atgactcgag 1350 <210> 49 <211> 1350 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of H4-heavy <400> 49 gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60 tcctgtgcag cttctggctt caccttcact gattactaca tgagctgggt gcgtcaggcc 120 ccgggtaagg gcctggaatg gttgggtttt attagaaaca aagctaatgg ttacacaaca 180 gagtacagtg catctgtgaa gggtcgtttc actataagca gagataattc caaaaacaca 240 ctgtacctgc agatgaacag cctgcgtgct gaggacactg ccgtctatta ttgtgctaga 300 gataactggt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ccgtctcctc ggctagcacc 360 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 660 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 720 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1080 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320 ctctccctgt ctccgggtaa atgactcgag 1350 <210> 50 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of H1-light <400> 50 gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agtccagcca gagtctttta gctagcggca accaaaataa ctacttagct 120 tggcaccagc agaaaccagg acagcctcct aagatgctca ttatttgggc atctacccgg 180 gtatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaatc ctatagtgct 300 cctctcacgt tcggaggcgg taccaaggtg gagatcaaac gtacggtggc tgcaccatct 360 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 420 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 480 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 540 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 600 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 660 tgactcgag 669 <210> 51 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of H2-light <400> 51 gatattgtga tgacccagac tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca agtccagtca gagtctttta gctagtggca accaaaataa ctacttggcc 120 tggcacctgc agaagccagg gcagtctcca cagatgctga tcatttgggc atccactagg 180 gtatctggag tcccagacag gttcagtggc agtgggtcag gcactgattt cacactgaaa 240 atcagcaggg tggaggctga ggatgttgga gtttattact gccagcagtc ctacagcgct 300 ccgctcacgt tcggacaggg taccaagctg gagctcaaac gtacggtggc tgcaccatct 360 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 420 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 480 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 540 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 600 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 660 tgactcgag 669 <210> 52 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of H3-light <400> 52 gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agtccagcca gagtctttta gctagcggca accaaaataa ctacttagct 120 tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca ttatttgggc atctacccgg 180 gtatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaatc ctatagtgct 300 cctctcacgt tcggaggcgg taccaaggtg gagatcaaac gtacggtggc tgcaccatct 360 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 420 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 480 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 540 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 600 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 660 tgactcgag 669 <210> 53 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of H4-light <400> 53 gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60 atcacctgca agtccagtca gagtctttta gctagtggca accaaaataa ctacttggcc 120 tggcaccaac agaaaccagg aaaagctccg aaaatgctga ttatttgggc atccactagg 180 gtatctggag tcccttctcg cttctctgga tccgggtctg ggacggattt cactctgacc 240 atcagcagtc tgcagccgga agacttcgca acttattact gtcagcagtc ctacagcgct 300 ccgctcacgt tcggacaggg taccaaggtg gagatcaaac gtacggtggc tgcaccatct 360 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 420 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 480 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 540 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 600 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 660 tgactcgag 669 <210> 54 <211> 23 <212> PRT <213> 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aagctaattc tacttcatac attttcaatt aagatgcagt 540 tacttcgctg tttttcaata ttttctgtta ttgctagcgt tttagcagaa gttcaattgg 600 ttgaatctgg tggtggtttg gttcaaccag gtggttcttt gagattgtct tgtgctgctt 660 ctggttttac tttcaccgat tattacatgt cctgggttag acaagctcca ggtaaaggtt 720 tggaatggtt gggtttcatt agaaacaagg ctaacggtta cactaccgaa tattctgctt 780 ctgttaaggg tagattcacc atttctagag acaactctaa gaacaccttg tacttgcaaa 840 tgaactcctt gagagctgaa gatactgctg tttattactg cgctagagat aattggtttg 900 cttattgggg tcaaggtact ttggttactg tttcttctgg cctcgggggc ctcggaggag 960 gaggtagtgg cggaggaggc tccggtggat ccagcggtgt gggttccgat attcaaatga 1020 cccaatctcc atcttctttg tctgcttcag ttggtgatag agttaccatt acttgtaagt 1080 cctcccaatc tttgttggct tctggtaatc agaacaatta cttggcttgg catcaacaaa 1140 aaccaggtaa agctccaaag atgttgatta tttgggcttc taccagagtt tctggtgttc 1200 catctagatt ttctggttct ggttccggta ctgattttac tttgaccatt tcatccttgc 1260 aaccagaaga tttcgctact tactactgtc aacaatctta ctctgctcca ttgacttttg 1320 gtcaaggtac aaaggtcgaa atcaagagag aattcggtaa gcctatccct aaccctctcc 1380 tcggtctcga ttctacgggt ggtggtggat ctggtggtgg tggttctggt ggtggtggtt 1440 ctcaggaact gacaactata tgcgagcaaa tcccctcacc aactttagaa tcgacgccgt 1500 actctttgtc aacgactact attttggcca acgggaaggc aatgcaagga gtttttgaat 1560 attacaaatc agtaacgttt gtcagtaatt gcggttctca cccctcaaca actagcaaag 1620 gcagccccat aaacacacag tatgtttttt gagtttaaac ccgctgatct gataacaaca 1680 gtgtagatgt aacaaaatcg actttgttcc cactgtactt ttagctcgta caaaatacaa 1740 tatacttttc atttctccgt aaacaacatg ttttcccatg taatatcctt ttctattttt 1800 cgttccgtta ccaactttac acatacttta tatagctatt cacttctata cactaaaaaa 1860 ctaagacaat tttaattttg ctgcctgcca tatttcaatt tgttataaat tcctataatt 1920 tatcctatta gtagctaaaa aaagatgaat gtgaatcgaa tcctaagaga attgggcaag 1980 tgcacaaaca atacttaaat aaatactact cagtaataac ctatttctta gcatttttga 2040 cgaaatttgc tattttgtta gagtctttta caccatttgt ctccacacct ccgcttacat 2100 caacaccaat aacgccattt aatctaagcg catcaccaac attttctggc gtcagtccac 2160 cagctaacat aaaatgtaag ctctcggggc tctcttgcct tccaacccag tcagaaatcg 2220 agttccaatc caaaagttca cctgtcccac ctgcttctga atcaaacaag ggaataaacg 2280 aatgaggttt ctgtgaagct gcactgagta gtatgttgca gtcttttgga aatacgagtc 2340 ttttaataac tggcaaaccg aggaactctt ggtattcttg ccacgactca tctccgtgca 2400 gttggacgat atcaatgccg taatcattga ccagagccaa aacatcctcc ttaggttgat 2460 tacgaaacac gccaaccaag tatttcggag tgcctgaact atttttatat gcttttacaa 2520 gacttgaaat tttccttgca ataaccgggt caattgttct ctttctattg ggcacacata 2580 taatacccag caagtcagca tcggaatcta gagcacattc tgcggcctct gtgctctgca 2640 agccgcaaac tttcaccaat ggaccagaac tacctgtgaa attaataaca gacatactcc 2700 aagctgcctt tgtgtgctta atcacgtata ctcacgtgct caatagtcac caatgccctc 2760 cctcttggcc ctctcctttt cttttttcga ccgaatttct tgaagacgaa agggcctcgt 2820 gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttagg acggatcgct 2880 tgcctgtaac ttacacgcgc ctcgtatctt ttaatgatgg aataatttgg gaatttactc 2940 tgtgtttatt tatttttatg ttttgtattt ggattttaga aagtaaataa agaaggtaga 3000 agagttacgg aatgaagaaa aaaaaataaa caaaggttta aaaaatttca acaaaaagcg 3060 tactttacat atatatttat tagacaagaa aagcagatta aatagatata cattcgatta 3120 acgataagta aaatgtaaaa tcacaggatt ttcgtgtgtg gtcttctaca cagacaagat 3180 gaaacaattc ggcattaata cctgagagca ggaagagcaa gataaaaggt agtatttgtt 3240 ggcgatcccc ctagagtctt ttacatcttc ggaaaacaaa aactattttt tctttaattt 3300 ctttttttac tttctatttt taatttatat atttatatta aaaaatttaa attataatta 3360 tttttatagc acgtgatgaa aaggacccag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa 3420 cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac 3480 cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg 3540 tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc 3600 tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg 3660 atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga 3720 gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tgttgacgcc gggcaagagc 3780 aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag 3840 aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa 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cactctgacc atcagcagtc tgcagccgga agacttcgca 360 acttattact gtgcacagtc ctacagccat ccgttctctt tcggacaggg taccaaggtg 420 gagatcaaac gtacg 435 <210> 61 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding CDR-L3 derived from L3-5 clone <400> 61 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc 120 ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc atcacctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccaac agaaaccagg aaaagctccg 240 aaaatgctga ttatttgggc atccactagg gtatctggag tcccttctcg cttctctgga 300 tccgggtctg ggacggattt cactctgacc atcagcagtc tgcagccgga agacttcgca 360 acttattact gtcagcagtc ctacagccgc ccgtttacgt tcggacaggg taccaaggtg 420 gagatcaaac gtacg 435 <210> 62 <211> 462 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide consisting of heavy chain of huAbF46-H4-A1, U6-HC7 hinge and constant region of human IgG1 <400> 62 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Val Thr 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region <400> 69 aattcactag tgattaattc gccgccacca tggattcaca ggcccaggtc ctcatgttgc 60 tgctgctatc ggtatctggt acctgtggag atatccagat gacccagtcc ccgagctccc 120 tgtccgcctc tgtgggcgat agggtcacca tcacctgcaa gtccagtcag agtcttttag 180 ctagtggcaa ccaaaataac tacttggcct ggtaccaaca gaaaccagga aaagctccga 240 aaatgctgat tatttgggca tccactaggg tatctggagt cccttctcgc ttctctggat 300 ccgggtctgg gacggatttc actctgacca tcagcagtct gcagccggaa gacttcgcaa 360 cttattactg tcagcagtcc tacagccgcc cgtacacgtt cggacagggt accaaggtgg 420 agatcaaacg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt 480 tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca 540 aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag 600 agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag 660 actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg 720 tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt gactcgag 758 <210> 70 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide consisting of light 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acaacagagt acagtgcatc tgtgaagggt cggttcacca tctccagaga taattcccaa 300 agcatcctct atcttcaaat ggacaccctg agagctgagg acagtgccac ttattactgt 360 gcaagagata actggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgcagct 420 agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 720 tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 780 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 840 gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 900 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 960 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1020 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1140 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1200 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1380 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga ctcgag 1416 <210> 77 <211> 759 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of light chain of anti-c-Met antibody (AbF46 or huAbF46-H1) <220> <221> misc_difference <222> (1)..(6) <223> EcoRI restriction site <220> <221> misc_difference <222> (7)..(90) <223> signal sequence <220> <221> misc_difference <222> (91)..(432) <223> VL - light chain variable region <220> <221> misc_difference <222> (430)..(435) <223> BsiWI restriction site <220> <221> misc_difference <222> (433)..(750) <223> CL - light chain constant region <220> <221> misc_difference <222> (751)..(753) <223> stop codon <220> <221> misc_difference <222> (754)..(759) <223> XhoI restriction site <400> 77 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gacattttga tgacccagtc tccatcctcc 120 ctgactgtgt cagcaggaga gaaggtcact atgagctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccagc agaaaccagg acgatctcct 240 aaaatgctga taatttgggc atccactagg gtatctggag tccctgatcg cttcataggc 300 agtggatctg ggacggattt cactctgacc atcaacagtg tgcaggctga agatctggct 360 gtttattact gtcagcagtc ctacagcgct ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg 420 gagctgaaac gtacggtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag 480 ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc 540 aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca 600 gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca 660 gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc 720 gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt tgactcgag 759 <210> 78 <211> 4170 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding c-Met protein <400> 78 atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag 60 aggagcaatg gggagtgtaa agaggcacta gcaaagtccg agatgaatgt gaatatgaag 120 tatcagcttc ccaacttcac cgcggaaaca cccatccaga atgtcattct acatgagcat 180 cacattttcc ttggtgccac taactacatt tatgttttaa atgaggaaga ccttcagaag 240 gttgctgagt acaagactgg gcctgtgctg gaacacccag attgtttccc atgtcaggac 300 tgcagcagca aagccaattt atcaggaggt gtttggaaag ataacatcaa catggctcta 360 gttgtcgaca cctactatga tgatcaactc attagctgtg gcagcgtcaa cagagggacc 420 tgccagcgac atgtctttcc ccacaatcat actgctgaca tacagtcgga ggttcactgc 480 atattctccc cacagataga agagcccagc cagtgtcctg actgtgtggt gagcgccctg 540 ggagccaaag tcctttcatc tgtaaaggac cggttcatca acttctttgt aggcaatacc 600 ataaattctt cttatttccc agatcatcca ttgcattcga tatcagtgag aaggctaaag 660 gaaacgaaag atggttttat gtttttgacg gaccagtcct acattgatgt tttacctgag 720 ttcagagatt cttaccccat taagtatgtc catgcctttg aaagcaacaa ttttatttac 780 ttcttgacgg tccaaaggga aactctagat gctcagactt ttcacacaag aataatcagg 840 ttctgttcca taaactctgg attgcattcc tacatggaaa tgcctctgga gtgtattctc 900 acagaaaaga gaaaaaagag atccacaaag aaggaagtgt ttaatatact tcaggctgcg 960 tatgtcagca agcctggggc ccagcttgct agacaaatag gagccagcct gaatgatgac 1020 attcttttcg gggtgttcgc acaaagcaag ccagattctg ccgaaccaat ggatcgatct 1080 gccatgtgtg cattccctat caaatatgtc aacgacttct tcaacaagat cgtcaacaaa 1140 aacaatgtga gatgtctcca gcatttttac ggacccaatc atgagcactg ctttaatagg 1200 acacttctga gaaattcatc aggctgtgaa gcgcgccgtg atgaatatcg aacagagttt 1260 accacagctt tgcagcgcgt tgacttattc atgggtcaat tcagcgaagt cctcttaaca 1320 tctatatcca ccttcattaa aggagacctc accatagcta atcttgggac atcagagggt 1380 cgcttcatgc aggttgtggt ttctcgatca ggaccatcaa cccctcatgt gaattttctc 1440 ctggactccc atccagtgtc tccagaagtg attgtggagc atacattaaa ccaaaatggc 1500 tacacactgg ttatcactgg gaagaagatc acgaagatcc cattgaatgg cttgggctgc 1560 agacatttcc agtcctgcag tcaatgcctc tctgccccac cctttgttca gtgtggctgg 1620 tgccacgaca 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atgggatcct ttccaaatac tttgatctca tttatgtaca taatcctgtg 2520 tttaagcctt ttgaaaagcc agtgatgatc tcaatgggca atgaaaatgt actggaaatt 2580 aagggaaatg atattgaccc tgaagcagtt aaaggtgaag tgttaaaagt tggaaataag 2640 agctgtgaga atatacactt acattctgaa gccgttttat gcacggtccc caatgacctg 2700 ctgaaattga acagcgagct aaatatagag tggaagcaag caatttcttc aaccgtcctt 2760 ggaaaagtaa tagttcaacc agatcagaat ttcacaggat tgattgctgg tgttgtctca 2820 atatcaacag cactgttatt actacttggg tttttcctgt ggctgaaaaa gagaaagcaa 2880 attaaagatc tgggcagtga attagttcgc tacgatgcaa gagtacacac tcctcatttg 2940 gataggcttg taagtgcccg aagtgtaagc ccaactacag aaatggtttc aaatgaatct 3000 gtagactacc gagctacttt tccagaagat cagtttccta attcatctca gaacggttca 3060 tgccgacaag tgcagtatcc tctgacagac atgtccccca tcctaactag tggggactct 3120 gatatatcca gtccattact gcaaaatact gtccacattg acctcagtgc tctaaatcca 3180 gagctggtcc aggcagtgca gcatgtagtg attgggccca gtagcctgat tgtgcatttc 3240 aatgaagtca taggaagagg gcattttggt tgtgtatatc atgggacttt gttggacaat 3300 gatggcaaga 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Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Ala Ser Leu 85 90 95 Asn Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 117 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region of anti-EGFR antibody (modified) <400> 117 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser His Ser Ser Gly Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Ala Thr Pro Arg Pro Leu Lys Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 118 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of anti-EGFR antibody (modified) <400> 118 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Ala Ser Leu 85 90 95 Asn Ala Tyr Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 119 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> coding nucleotide sequence of heavy chain variable region of anti-EGFR antibody <400> 119 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc aattatgata tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggg atctctcata gtagtggtag taaatattac 180 gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaagatgct 300 actccgcgtc cgctgaagcc tttcgactac tggggccagg gtacactggt caccgtgagc 360 tca 363 <210> 120 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> coding nucleotide sequence of light chain variable region of anti-EGFR antibody <400> 120 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgtactg gctcttcatc taatattggc aataatgatg tctcctggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gatgataata agcggccaag cggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa atctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtggt tcttgggatg ctagcctgaa tgcttatgtc 300 ttcggcggag gcaccaagct gacggtccta ggc 333 <210> 121 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy-chain variable region of anti-EGFR antibody <400> 121 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Lys Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 122 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding heavy-chain variable region of anti-EGFR antibody <400> 122 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cctctggttt cacattcact gactacaaga tacactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggctcgagtg gatgggatat ttcaacccta acagcggtta tagtacctac 180 gcacagaagt tccagggcag ggtcaccatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagactatcc 300 ccaggcggtt actatgttat ggatgcctgg ggccaaggga ccaccgtgac cgtctcctca 360 360 <210> 123 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light-chain variable region of anti-EGFR antibody <400> 123 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Phe Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 <210> 124 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding light-chain variable region of anti-EGFR antibody <400> 124 gatatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgggtcacc 60 atcacctgcc gggcaagtca gggcattaac aattacttaa attggtacca gcagaagcca 120 gggaaagccc ctaagcgcct gatctataat accaacaact tgcagacagg cgtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc cgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg ccacctatta ctgcttgcag cataatagtt ttcccacgtt tggccagggc 300 accaagctcg agatcaagcg tacg 324 <210> 125 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified heavy-chain variable region of anti-EGFR antibody <400> 125 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Lys Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ala Ser Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 126 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified light-chain variable region of anti-EGFR antibody <400> 126 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Glu Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Phe Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Cys Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 <210> 127 <211> 442 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of anti-c-Met antibody B <400> 127 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Val Asn Pro Asn Arg Arg Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Glu Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Asn Trp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 225 230 235 240 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 245 250 255 Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 260 265 270 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 290 295 300 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 305 310 315 320 Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 325 330 335 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu 340 345 350 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 355 360 365 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 370 375 380 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn 405 410 415 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 <210> 128 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of anti-c-Met antibody B <400> 128 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser Val Ser Ser Ile 20 25 30 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Val Tyr Ser Gly Tyr Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys 210 215

Claims

pH 6.6 내지 8.5에서의 항체-항원 결합을 측정하는 단계, 및
상기 pH 보다 낮은 범위에서의 항체-항원 결합을 측정하는 단계
를 포함하는, 항체 선별 방법.
제1항에 있어서,
1) pH 6.6 내지 8.5에서 항원-항체 결합을 측정하는 단계; 및
2) pH 6.2 이하에서 항원-항체 결합을 측정하는 단계
를 포함하는, 항체 선별 방법.
제2항에 있어서,
1) pH 6.6 내지 8.5에서 항원-항체 결합을 측정하는 단계; 및
2) pH 5.3 내지 6.2에서 항원-항체 결합을 측정하는 단계
를 포함하는, 항체 선별 방법.
제1항에 있어서,
1) pH 6.6 내지 8.5에서 항원-항체 결합을 측정하는 단계; 및
2) pH 5.5 이하에서 항원-항체 결합을 측정하는 단계
를 포함하는, 항체 선별 방법.
제4항에 있어서,
1) pH 6.6 내지 8.5에서 항원-항체 결합을 측정하는 단계; 및
2) pH 3.0 내지 5.5에서 항원-항체 결합을 측정하는 단계
를 포함하는, 항체 선별 방법.
제1항에 있어서,
1) pH 6.6 내지 8.5에서 항원-항체 결합을 측정하는 단계;
2) pH 5.3 내지 6.5에서 항원-항체 결합을 측정하는 단계; 및
3) pH 3.0 내지 5.5에서 항원-항체 결합을 측정하는 단계
를 포함하고,
단계 2)와 단계 3)의 pH는 서로 다른 값을 갖는,
항체 선별 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-항체 결합은 면역크로마토그래피(Immunochromatography), 면역조직화학염색, 효소결합 면역흡착 분석(enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay: RIA), 효소 면역분석(enzyme immunoassay: EIA), 형광면역분석(Floresence immunoassay: FIA), 발광면역분석(luminescence immunoassay: LIA), 웨스턴블라팅(Western blotting), 표면 플라스몬 공명 (Surface Plasmon Resonance: SPR), 및 항체와 항원의 3차원 구조를 이용한 결합에너지 계산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법으로 수행되는 것인, 항체 선별 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각 pH에서 항원-항체 결합이 유지되는 항체를 선택하는 단계를 추가로 포함하는, 항체 선별 방법.
제1항 내지 제6항에 있어서, 상기 선별된 항체는 항체-약물 접합체 제조에 사용하기 위한 것인, 항체 선별 방법.
제8항의 항체 선별 방법에 의하여 선별된 항체를 포함하는 항암제.
제8항의 항체 선별 방법에 의하여 선별된 항체를 포함하는 항체-약물 접합체.
제11항에 있어서, 항체와 약물을 연결하는 분해성 링커를 추가로 포함하는, 항체-약물 접합체.
제12항에 있어서, 상기 분해성 링커는 펩타이드 링커, 히드라존(hydrazone) 링커, 및 다이설파이드 (disulfide) 링커로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 항체-약물 접합체.
제11항에 있어서, 항체와 약물을 연결하는 비분해성 링커를 추가로 포함하는, 항체-약물 접합체.
제14항에 있어서, 상기 비분해성 링커는, 티오에테르 링커, 아마이드 링커, 또는 이들의 조합인, 항체-약물 접합체.