CN103333224A - 禽流感病毒ns1蛋白b细胞抗原表位多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种禽流感病毒NS1蛋白B细胞抗原表位多肽及其应用。本发明以原核表达并纯化的NS1重组蛋白免疫BALB/c小鼠，采用淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞，通过间接ELISA进行筛选，得到2株能够稳定分泌抗NS1蛋白MAbs的杂交瘤细胞，Western blot鉴定表明，这2株MAbs均能够识别NS1重组蛋白。利用噬菌体展示技术得到D9对应的短肽WNLNTVRVS，与NS1蛋白aa182～aa190基本匹配，提示¹⁸²WNDNTVRVS¹⁹⁰为NS1蛋白的一个线性表位。本发明还涉及该抗原表位多肽在制备诊断或检测禽流感病毒感染药物中的应用，为进一步建立高效检测禽流感的方法提供理论依据。

Description

禽流感病毒NS1蛋白B细胞抗原表位多肽及其应用

技术领域

本发明涉及抗原表位多肽，尤其涉及禽流感病毒NS1蛋白B细胞抗原表位多肽，本发明还涉及该抗原表位多肽在制备诊断或检测禽流感病毒感染药物中的应用，属于分子免疫学领域。

背景技术

禽流感（Avian influenza，AI）是由正粘病毒科流感病毒属A型AI病毒(AIV)所引起的一种禽类传染病。根据致病力不同AIV可分为高致病性（HPAIV）、低致病性(LPAIV)。近年来HPAIV在全球范围内呈现流行态势。

疫苗免疫接种是预防禽流感传播的有效措施。然而疫苗的大范围使用，免疫鸡群血清学阳性率极高，与病毒感染途径引起的血清学阳性相混淆。这两种途径发生的血清学改变，除疫苗本身带有特定标记或者采用亚单位疫苗外，通过现有的血清学检测技术，如血凝抑制试验、ELISA、琼脂扩散实验等均不能鉴别疫苗免疫与病毒感染，给禽流感的监控工作带来一定困扰，因此很多研究开始关注禽流感感染和免疫的鉴别(Differentiation of infected and vaccinated animals)方法研究。

AIV属于单股负链RNA病毒，由8个节段组成，分别编码血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）、聚合酶蛋白（PA、PB1、PB2）、核蛋白（NP）、基质蛋白（M）、非结构蛋白（NS）。NS基因具有两个ORF，ORF1编码202～237个氨基酸的NS1蛋白（约为26ku），ORF2编码121个氨基酸的NS2蛋白（约为14ku）。NS在感染早期大量合成，存在于细胞核内，不存在于成熟的病毒粒子中，NS1蛋白属于非结构蛋白，可以利用NS1蛋白作为检测抗原对免疫鸡群中野毒感染和灭活疫苗产生的抗体进行鉴别检测。因此，目前对流感病毒感染和免疫的鉴别研究主要集中在NS1蛋白上（郭莹莹，吴春艳，王靖飞.禽流感分离株GD/1/96(H5N1)非结构蛋白结构建模[J].中国预防兽医学报，2010，03:171-174；Avellaneda G,Mundt E,Lee C W,et al.Differentiation of infected and vaccinated animals(DIVA)using the NS1protein of avianinfluenza virus[J].Avian Dis,2010,54(1Suppl):278-286.）。

MAb结合噬菌体随机展示肽库技术是目前应用最广、发展最快的抗原表位筛选平台之一。该技术已成功应用于多种病原微生物抗原表位的分析。与其他抗原表位的分析方法相比，它快速、便捷，既可分析线性表位，又可分析构象表位或是与构象表位功能相同的模拟表位。目前，已经鉴定的流感病毒抗原表位多数来源于人源H1N1和H3N2病毒株，而对H5亚型禽流感的抗原表位研究基本处在空白之中，特别是尚未见到国内外有利用噬菌体展示肽库技术分析H5N1亚型禽流感NS1蛋白抗原表位的相关报道（Akifumi Yamashita,Norihito Kawashita,RitsukoKubota-Koketsu,et al.Highly conserved sequences for human neutralization epitope onhemagglutinin of influenza A viruses H3N2,H1N1and H5N1:implicationfor humanmonoclonal antibody recognition[J].Biochemical and Biophysical ResearchCommunications,2010,393:614-618.）。

因此，本发明人开展了NS1抗原表位的鉴定工作，以期能够为进一步建立高效的检测禽流感的方法提供理论依据。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供禽流感病毒NS1蛋白B细胞抗原表位多肽，为此，本发明用体外表达制备的NS1蛋白免疫BALB/c小鼠，共制备2株能稳定分泌抗NS1特异性抗体的杂交瘤细胞株。Western blot鉴定表明，这2株MAbs均能够识别NS1重组蛋白。进一步用IFA的方法鉴定了能与真核表达系统瞬时表达的NS1蛋白特异性结合的2株MAbs，并验证了MAbs的特异性，分别命名为NS1MabD7和NS1Mab D9。利用噬菌体展示肽库技术筛选抗NS1Mab D9的克隆，最终获得24个阳性克隆，测序后得到15个多肽序列，其共有序列为WNLNTV，与本研究所用毒株的NS1蛋白编码的氨基酸序列比对发现其与aa182～aa190有5个氨基酸位点完全匹配，提示¹⁸²WNDNTVRVS¹⁹⁰为NS1抗原的一个线性表位。

因此，本发明提出了一种禽流感病毒NS1蛋白B细胞抗原表位多肽，其特征在于，所述抗原表位多肽具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

进一步的，本发明还提供了编码所述的抗原表位多肽的核苷酸序列。

在本发明中，优选的，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

含有所述的核苷酸序列的表达载体以及含有所述表达载体的宿主细胞也应属于本发明所要求保护的范围。

更进一步的，本发明还提供了所述的抗原表位多肽在制备诊断或检测禽流感病毒感染药物中的用途。

禽流感病毒NS1蛋白B细胞抗原表位多肽的鉴定为进一步建立高效检测禽流感的方法提供了依据，同时也为研究NS1蛋白的结构和功能奠定了基础。

附图说明

图1为纯化后NS1蛋白SDS-PAGE及Western blot分析结果；

M：蛋白质分子量标准；1：纯化后NS1蛋白SDS-PAGE；2：NS1蛋白Westernblot（阴性对照）3：纯化后NS1蛋白Western blot；

图2为Western blot鉴定结果；

M：蛋白质分子量标准；1：纯化后的NS1蛋白与MAbD7反应；2：纯化后的NS1蛋白与Mab D9反应；

图3为两株Mabs的IFA鉴定；

1：阳性对照；2：D7；3：D9；4：阴性对照

图4为筛选出的噬菌体与Mab D9结合ELISA反应结果；

图5为合成的禽流感病毒NS1蛋白B细胞抗原表位多肽与SPF对照鸡、禽流感免疫鸡和禽流感感染鸡血清结合ELISA反应结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1禽流感病毒NS1蛋白B细胞抗原表位多肽的鉴定

1.材料和方法

1.1主要实验材料和实验动物

SF9细胞、SP2/0细胞由本实验室保存；表达AIV A/duck/Hubei/2003(H5N1)的NS1的重组质粒pET-NS1由本实验室构建；6～8周龄SPF BALB/c雌性小鼠购自本研究所实验动物中心。

1.2主要试剂

蛋白纯化试剂盒购自Novagen公司；辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG抗体(HRP-IgG)、HAT、HT、PEG2000、石蜡油购自Sigma公司；二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；免疫球蛋白亚类鉴定试剂盒购自SouthernBiotech公司；转染试剂Lipofectamine^TM2000购自Invitrogen公司；异硫氰酸荧光素标记羊抗鼠IgG抗体(FITC-IgG)购自Santa Cruz公司；噬菌体随机7肽库试剂盒购自New England Biolabs(NEB)公司。

1.3动物免疫

将原核表达的重组蛋白NS1纯化后与佐剂等体积混合免疫雌鼠，免疫采用腹腔注射的方式，剂量为100μg/只，每隔2周免疫一次，共免疫4次。各次免疫后7d断尾采血，利用NS1重组蛋白包被的ELISA板测血清效价。在融合前3d选择血清效价最高的小鼠加强免疫。

1.4间接ELISA方法的建立

按常规间接ELISA操作，利用方阵法确定MAb的筛选条件。纯化后的NS1重组蛋白浓度为2mg/ml，用包被液对其进行1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280倍稀释，用PBS对阳性血清进行1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000倍稀释。以阳性孔OD值最接近于1，P/N值大于2.1的蛋白和血清浓度作为最佳工作浓度。

1.5杂交瘤细胞的制备

将小鼠脾细胞和SP2/0融合后的细胞用间接ELISA检测，对阳性孔采用有限稀释法进行克隆培养，克隆3～5次后获得稳定分泌特异性MAb的杂交瘤细胞。

1.6MAb腹水的制备

将灭菌的液体石蜡油腹腔注射8周龄BALB/c雌鼠，0.5mL/只,1周后将杂交瘤细胞以5×10⁵个/只～1×10⁶个/只腹腔注射小鼠，7～10d后小鼠腹腔明显膨大时抽取腹水，6000r/min离心5min，吸取上清即为MAb腹水。用建立的间接ELISA检测方法测定其效价，同时以SP2/0细胞上清作为阴性对照，以P/N>2.1的最大稀释度作为效价。按照SouthernBiotech公司的亚类试剂盒说明书进行检测。

1.7Western blot鉴定

将纯化的NS1蛋白经SDS-PAGE电泳后，转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%脱脂乳37℃封闭1h，一抗为MAb上清，二抗为1:4000稀释的羊抗鼠HRP-IgG，显色判定结果。

1.8IFA鉴定

将重组质粒pCAGGs-NS1转染SF9细胞，同时转染pCAGGs空载体为空白对照，以免疫后小鼠血清作为阳性对照，阴性小鼠血清作为阴性对照，1:100倍稀释的2株MAb腹水作为一抗，1:200稀释的羊抗鼠FITC-IgG作为二抗，荧光显微镜下观察荧光信号。

1.9MAb识别抗原表位的初步鉴定

按照NEB公司的噬菌体展示肽说明书对MAb对应的抗原表位进行鉴定。用100μg/μl MAb包板(150μl/孔)，4℃过夜。0.1%TBST洗板封闭后，每孔加入4×10¹⁰pfu的噬菌体，孵育1h后洗脱结合噬菌体并扩增。测定扩增前后噬菌体的滴度，以备下轮筛选用。第二、三轮淘选时，MAb的包板浓度分别降至75μg/μl、50μg/μl，TBST浓度分别增至0.3%、0.5%，第三轮淘选产物测完滴度后随机挑取噬菌体克隆进行扩增。用100μg/μl MAb包板(150μl/孔)，扩增后噬菌体作为一抗进行噬菌体ELISA反应。对于反应呈阳性者进行测序。

2结果

2.1NS1重组蛋白的表达鉴定

SDS-PAGE结果表明，pET-NS1重组质粒转化BL21感受态并经IPTG诱导后，在约30ku处出现一条明显的蛋白表达带，与预期大小相符，并且该重组蛋白主要以包涵体的形式存在，其纯化后如图1。对重组蛋白的抗原性进行western blot分析，结果如图1，可见纯化后的NS1蛋白能被AIV感染鸡的阳性血清特异性识别。

2.2MAb的制备及鉴定

2.2.1间接ELISA方法的建立

经方阵法确定了重组蛋白最佳包被浓度为12.5μg/ml,阳性血清最佳稀释度为1:4000。

2.2.2MAb的制备

杂交瘤细胞经3～5次克隆纯化后，共制备2株能稳定分泌抗NS1特异性抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为D7和D9。测定2株杂交瘤细胞的腹水效价均为1:100000，亚类鉴定均为IgG1型，轻链为κ链。

2.2.3Western blot鉴定

2株杂交瘤细胞上清经western blot鉴定均能与NS1蛋白发生特异性反应，结果如图2。

2.2.4IFA鉴定

IFA结果显示，阳性血清、2株MAbs均能与重组质粒pCAGGs-NS1反应，表现出强荧光信号，而与pCAGGs空载体没有反应，阴性血清与pCAGGs-NS1重组质粒和pCAGGs空载体均没有反应（图3）。该结果表明2株MAbs均能特异性识别真核表达的NS1蛋白。

2.3MAb识别抗原表位的鉴定

Mab D9包被ELISA板，进行噬菌体筛选，3轮筛选完毕后，随机挑取噬菌体克隆扩增后与MAb进行ELISA反应得到24个阳性克隆（图4），测序结果表明，MAb D9识别的共有氨基酸序列为WNLNTV，将该序列与本研究所用毒株的NS1蛋白编码的氨基酸序列比较，结果发现与aa182～aa190基本匹配(表1)，提示¹⁸²WNDNTVRVS¹⁹⁰为NS1蛋白的一个线性表位。

表1阳性噬菌体插入外源序列比对

*加粗的为共有氨基酸

实施例2本发明的禽流感病毒NS1蛋白B细胞抗原表位多肽在诊断或检测禽流感病毒感染中的用途

将合成多肽WNDNTVRVS稀释成0.1μg/μl，按照100μl/孔包被ELISA板，以SPF鸡血清作为对照、禽流感疫苗免疫鸡血清和禽流感病毒感染鸡血清作为一抗，兔抗鸡HRP-IgG作为二抗，进行间接ELISA验证，OPD显色后，于酶标仪中读取490nm处OD值，结果显示合成多肽与感染鸡血清反应后其OD值明显高于对照组和免疫组。说明该合成多肽与感染鸡血清有结合特性，能够用于禽流感病毒的诊断和检测，结果如图5所示。

Claims (6)

1.禽流感病毒NS1蛋白B细胞抗原表位多肽，其特征在于，所述抗原表位多肽具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述的抗原表位多肽的核苷酸序列。

3.如权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。

4.一种表达载体，其特征在于含有权利要求2或3所述的核苷酸序列。

5.一种宿主细胞，其特征在于含有权利要求4所述的表达载体。

6.权利要求1所述的抗原表位多肽在制备诊断或检测禽流感病毒感染药物中的用途。

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