JP2016508722A - 血清低密度リポタンパク質(ldl)レベルを調節するためのpcsk9(プロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型)アロステリック結合リガンド - Google Patents
血清低密度リポタンパク質(ldl)レベルを調節するためのpcsk9(プロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型)アロステリック結合リガンド Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、高コレステロール血症の分野に関する。特に、本発明は、350〜2,000Daの範囲の3〜8のアミノ酸配列を有する合成リガンドおよび/または合成リガンド誘導体を使用して、タンパク質PCSK9の立体構造を変えることにより低密度リポタンパク質の循環レベルを調節するための組成物ならびに方法を提供する。PCSK9の立体構造を変えることにより、PCSK9と、内在性低密度リポタンパク質受容体との間の相互作用に影響を与え、LDLコレステロールの循環レベルを増加または低下させることができる。高いLDL−コレステロールレベルは、心疾患に関するリスクの増加に関連する。低いLDL‐コレステロールレベルは、肝機能不全などの他の病態で問題となる場合があり、したがって、LDLレベルを上げることのできるリガンドも有用である。【選択図】図1
Description
本発明は、高コレステロール血症の分野に関する。特に、本発明は、350〜2,000Daの範囲の3〜8のアミノ酸配列を有する合成リガンドおよび/または合成リガンド誘導体を使用してタンパク質PCSK9の立体構造を変えることにより低密度タンパク質の循環レベルを調節する組成物ならびに方法を提供する。PCSK9の立体構造を変えることにより、PCSK9と内在性低密度リポタンパク質受容体との間の相互作用に影響を与え、LDLコレステロールの循環レベルを低下または増加させることができる。高いLDLコレステロールレベルは心疾患のリスクの増加に関連する。低いLDLコレステロールレベルは肝機能不全などの他の病態で問題となる場合があり、したがってLDLレベルを上げることのできるリガンドも有用である。
低密度リポタンパク質コレステロール(LDL−C)の血漿レベルの上昇は、冠動脈性心疾患の発症にとって最も高いリスク因子を意味する。血漿からのLDL−Cのクリアランスは、細胞表面の糖タンパク質であるLDL受容体(LDLR)の作用を介して主に肝臓により行われる。LDLRは、LDL粒子上でアポリポタンパク質B100(アポB100)と高い親和性で結合し、エンドサイトーシスの取り込みを媒介する。(Goldstein et al.,Anna.Rev.Cell Biol.1:1−39(1985)。常染色体優性高コレステロール血症(ADH)は、LDLR(家族性高コレステロール血症(FH))またはアポB100(FDB(家族性アポB100欠損)をコードする遺伝子で見出される血漿LDLクリアランスを低減する変異に関連する(それぞれHobbs et al.,Annu.Rev.Genet.24,133−170 (1990);およびInnerarity et al.,J.Lipid Res.31:1337−1349 (1990),)。
低密度タンパク質(LDL)受容体(LDLR)は、VLDL、VLDLレムナント、およびLDLのエンドサイトーシスを効率的に媒介する。エンドサイトーシス工程の一部として、LDLRは、リポタンパク質を肝臓のエンドソームへ放出する。
LDLコレステロールレベルを調節する手法の1つとして、LDLRエンドサイトーシスによるリポタンパク質クリアランスの比率が希望通りに増加または減少するために、PCSK9と結合し、PCSK9およびLDLRの間の相互作用の動態を変えるペプチドの同定が挙げられる。
本発明は、高コレステロール血症の分野に関する。特に、本発明は、350〜2,000Daの範囲の3〜8のアミノ酸配列を有する合成リガンドおよび/または合成リガンド誘導体を使用して、タンパク質PCSK9の立体構造を変えることにより、低密度リポタンパク質の循環レベルを調節する組成物ならびに方法を提供する。PCSK9の立体構造を変えることにより、PCSK9と内在性低密度リポタンパク質受容体との間の相互作用に影響を与え、LDLコレステロールの循環レベルの減少または増加を引き起こすことができる。高いLDLコレステロールレベルは、心疾患のリスクの増加に関連する。低いLDLコレステロールレベルは、肝機能不全などの他の病態で問題となる場合がある。したがって、LDLレベルを上げることのできるリガンドも有用である。
一実施形態では、本発明は、a)i)PCSK9タンパク質であって、アロステリック調節を誘導する結合部位および低密度リポタンパク質受容体結合部位を含む、PCSK9タンパク質、ii)上記結合部位に結合可能なリガンド、iii)低密度リポタンパク質受容体および低密度リポタンパク質を含む複数の肝細胞を提供することと、b)上記結合部位に上記合成リガンドを結合することであって、上記合成リガンドが、上記タンパク質の立体構造の変化を誘導することと、c)上記立体構造の変化により上記低密度リポタンパク質受容体に対する上記低密度リポタンパク質受容体結合部位の親和性を調節することとを考察する。一実施形態では、結合部位は、PCSK9タンパク質のHis417、Lys421、Pro446、Trp453、Gln454、Glu628、Gly629、Asn652、およびThr653を含む。一実施形態では、合成リガンドは、アロステリック阻害剤のリガンドであって、上記調節が、上記低密度タンパク質受容体に対する低密度リポタンパク質受容体結合部位の親和性を減少することにより、上記複数の肝細胞による低密度リポタンパク質の内部移行が増加する。一実施形態では、合成リガンドは、合成リガンドは、アロステリックエンハーサーのリガンドであり、上記調節が、上記低密度リポタンパク質受容体に対する上記低密度リポタンパク質受容体結合部位の親和性を増大させることにより、上記複数の肝細胞による上記低密度リポタンパク質の内部移行が減少する。一実施形態では、上記タンパク質の立体構造の変化は、誘導適合型の変化および生体力学的な変化からなる群から選択される。一実施形態では、合成リガンドは、VYVRFW、VLELYWおよびISDLSYからなる群から選択される合成ペプチドである。一実施形態では、アロステリック阻害剤はペプチドであり、SRX55、SRX56、SRX60、SRX61、SRX62、SRX63、SRX64、SRX65およびSRX6からなる群より選択される。一実施形態では、アロステリックエンハーサーはペプチドであり、SRX64、SRX67、SRX68、SRX69、SRX72およびSRX73からなる群から選択される。一実施形態では、合成ペプチドは約3〜8つのアミノ酸を含む。一実施形態では、合成ペプチドは6つのアミノ酸を含む。一実施形態では、合成ペプチドは1,300Da未満である。一実施形態では、合成ペプチドは約466〜1067Daの範囲にある。一実施形態では、合成ペプチドは、約175〜1,000Daの範囲にある。
一実施形態では、本発明は、a)i)アロステリック調節を誘導する結合部位および低密度リポタンパク質受容体結合部位を含むPCSK9タンパク質、ii)上記結合部位と結合可能な合成リガンド、iii)低密度リポタンパク質受容体の集合を含む複数の肝細胞を提供することと、b)上記結合部位に上記合成リガンドを結合することであって、上記合成リガンドが、上記タンパク質の立体構造の変化を誘導することと、c)上記立体構造の変化により、上記低密度リポタンパク質受容体の集合を調節することとを含む方法を考察する。一実施形態では、結合部位は、PCSK9タンパク質のHis417、Lys421、Pro446、Tip453、Gln454、Glu628、Gly629、Asn652、およびThr653を含む。一実施形態では、合成リガンドはアロステリック阻害剤のリガンドであって、上記調節は、上記複数の肝細胞の細胞表面で測定可能な低密度リポタンパク質受容体の集合を増加させる。一実施形態では、合成リガンドは、アロステリックエンハーサーのリガンドであって、上記調節は、上記複数の肝細胞の細胞表面で測定可能な低密度リポタンパク質受容体の集合を減少させる。一実施形態では、上記タンパク質の立体構造の変化は、誘導適合型の変化および生体力学的変化からなる群から選択される。一実施形態では、リガンドは、VYVRFW、VLELYWおよびISDLSYからなる群から選択される合成ペプチドである。一実施形態では、アロステリック阻害剤のペプチドは、SRX55、SRX56、SRX60、SRX61、SRX62、SRX63、SRX64、SRX65およびSRX66からなる群から選択される。一実施形態では、アロステリックエンハーサーのペプチドは、SRX64、SRX67、SRX68、SRX69、SRX72およびSRX73からなる群から選択される。一実施形態では、合成ペプチドは、約3〜8つのアミノ酸を含む。一実施形態では、合成ペプチドは、6つのアミノ酸である。一実施形態では、合成ペプチドは、1,300Da未満である。一実施形態では、合成ペプチドは約466〜1067Daの範囲にある。一実施形態では、合成ペプチドは約50〜1,000Daの範囲にある。
一実施形態では、本発明は、式
であって、
式中、
i)アミノ酸残基の数のnが、3〜8の範囲の整数であり;
ii)構成アミノ酸が、独立して選択される天然または天然ではないアミノ酸の単一のエナンチオマーであり;
iii)R2およびR3が、水素、低級アルキル、分枝アルキル、ヒドロキシアルキル、シクロアルキル、複素環、アリール、ヘテロアリール、アシル、置換型または非置換型ベンゾイル、アルキルスルホニルまたはアリールスルホニル(たとえばメシルまたはトシル)およびカルバモイル(たとえばBOC)からなる群から独立して選択され;
iv)R1が、−OHおよび−NR4−R5からなる群から選択され;
v)R4およびR5が、独立して、水素;低級アルキル、アリール、シクロアルキル、芳香複素環、ピリジン、テトラゾール、アルコキシ、シクロアルコキシからなる群から選択され;あるいは、R4およびR5が、ピペリジン;ピロリジン;モルフォリン;ピペラジン;4−メチルピペラジンなどの置換型複素環;またはジヒドロキノリンもしくはインドリンなどの縮合複素環などの複素環(heterocyle)として結合し、S1、S2およびS3が側鎖である、
式の化合物を考察する。一実施形態では、本化合物は負電荷極性基をさらに含む。一実施形態では、負電荷極性基は、上記側鎖S1、S2、またはSnに組み込まれるO−ホスフェート、O−スルファート、5−O−および5−N−テトラゾールからなる群のうちの少なくとも1つから選択される。一実施形態では、S1、S2、およびSnからなる群から選択される側鎖はホスホセリンを含む。一実施形態では、側鎖S1は、−CH2−NH−テトラゾールを含む。一実施形態では、本化合物は、グリシンC末端をさらに含む。一実施形態では、本化合物は、Val−Tyr−Val−Arg−Phe−Trp、β−Ala−Phe(3−CH2NH2)−Val−D−Ser(p)−Phe−Trp、Thr−Leu−Cys(CH2−Ph)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Thr−Leu−Asp(NHCH2Ph)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Thr−Leu−Gly(CH2CH2シクロヘキシル)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Thr−Leu−HPh−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Thr−Leu−Cys(CH2−Ph)−Thr−Trp(3−Me)−Ser−Ser−Ser(p)、Val−Leu−Glu−Leu−Tyr−Trp、Leu−Asp−Leu−Phe−Phe−Ser、Ile−Leu−Asp−Leu−Ser−Tyr、Ac−Trp−Ser−Ser(p)、Ac−Trp−Ala−Ser(p)、Ac−Trp(5−F)−Ala−Ser(p)−モルフォリン、Thr−Leu−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Ac−Tyr−Trp−Gly、Phe(4−Ph)−Ala−Ser(p)−モルフォリンからなる群から選択される。一実施形態では、本化合物は、約3〜8つのアミノ酸を含む。一実施形態では、本化合物は6つのアミノ酸である。一実施形態では、本化合物は、1,300Da未満である。一実施形態では、本化合物は466〜1067Daの範囲にある。一実施形態では、本化合物は約175〜1,000Daの範囲にある。一実施形態では、本化合物は合成ペプチドを含む。一実施形態では、本化合物は医薬組成物として製剤化される。一実施形態では、医薬組成物は、医薬品をさらに含む。一実施形態では、医薬品は、スタチン、心血管治療薬、代謝薬、および高血圧治療薬からなる群から選択される。一実施形態では、医薬品は、エゼチミブ、アムロジピンベシル酸塩、シタグリプチン、メトホルミン、アトルバスタチン、ロスバスタチンおよびシンバスタチンからなる群から選択される。一実施形態では、医薬組成物は、錠剤、液剤、ゲル、カプセル、小袋、マイクロ粒子、リポソーム、ナノ粒子、塩、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、ストリップ剤、座薬、スプレー、および粉体からなる群から選択されるように製剤化される。
式中、
i)アミノ酸残基の数のnが、3〜8の範囲の整数であり;
ii)構成アミノ酸が、独立して選択される天然または天然ではないアミノ酸の単一のエナンチオマーであり;
iii)R2およびR3が、水素、低級アルキル、分枝アルキル、ヒドロキシアルキル、シクロアルキル、複素環、アリール、ヘテロアリール、アシル、置換型または非置換型ベンゾイル、アルキルスルホニルまたはアリールスルホニル(たとえばメシルまたはトシル)およびカルバモイル(たとえばBOC)からなる群から独立して選択され;
iv)R1が、−OHおよび−NR4−R5からなる群から選択され;
v)R4およびR5が、独立して、水素;低級アルキル、アリール、シクロアルキル、芳香複素環、ピリジン、テトラゾール、アルコキシ、シクロアルコキシからなる群から選択され;あるいは、R4およびR5が、ピペリジン;ピロリジン;モルフォリン;ピペラジン;4−メチルピペラジンなどの置換型複素環;またはジヒドロキノリンもしくはインドリンなどの縮合複素環などの複素環(heterocyle)として結合し、S1、S2およびS3が側鎖である、
式の化合物を考察する。一実施形態では、本化合物は負電荷極性基をさらに含む。一実施形態では、負電荷極性基は、上記側鎖S1、S2、またはSnに組み込まれるO−ホスフェート、O−スルファート、5−O−および5−N−テトラゾールからなる群のうちの少なくとも1つから選択される。一実施形態では、S1、S2、およびSnからなる群から選択される側鎖はホスホセリンを含む。一実施形態では、側鎖S1は、−CH2−NH−テトラゾールを含む。一実施形態では、本化合物は、グリシンC末端をさらに含む。一実施形態では、本化合物は、Val−Tyr−Val−Arg−Phe−Trp、β−Ala−Phe(3−CH2NH2)−Val−D−Ser(p)−Phe−Trp、Thr−Leu−Cys(CH2−Ph)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Thr−Leu−Asp(NHCH2Ph)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Thr−Leu−Gly(CH2CH2シクロヘキシル)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Thr−Leu−HPh−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Thr−Leu−Cys(CH2−Ph)−Thr−Trp(3−Me)−Ser−Ser−Ser(p)、Val−Leu−Glu−Leu−Tyr−Trp、Leu−Asp−Leu−Phe−Phe−Ser、Ile−Leu−Asp−Leu−Ser−Tyr、Ac−Trp−Ser−Ser(p)、Ac−Trp−Ala−Ser(p)、Ac−Trp(5−F)−Ala−Ser(p)−モルフォリン、Thr−Leu−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Ac−Tyr−Trp−Gly、Phe(4−Ph)−Ala−Ser(p)−モルフォリンからなる群から選択される。一実施形態では、本化合物は、約3〜8つのアミノ酸を含む。一実施形態では、本化合物は6つのアミノ酸である。一実施形態では、本化合物は、1,300Da未満である。一実施形態では、本化合物は466〜1067Daの範囲にある。一実施形態では、本化合物は約175〜1,000Daの範囲にある。一実施形態では、本化合物は合成ペプチドを含む。一実施形態では、本化合物は医薬組成物として製剤化される。一実施形態では、医薬組成物は、医薬品をさらに含む。一実施形態では、医薬品は、スタチン、心血管治療薬、代謝薬、および高血圧治療薬からなる群から選択される。一実施形態では、医薬品は、エゼチミブ、アムロジピンベシル酸塩、シタグリプチン、メトホルミン、アトルバスタチン、ロスバスタチンおよびシンバスタチンからなる群から選択される。一実施形態では、医薬組成物は、錠剤、液剤、ゲル、カプセル、小袋、マイクロ粒子、リポソーム、ナノ粒子、塩、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、ストリップ剤、座薬、スプレー、および粉体からなる群から選択されるように製剤化される。
一実施形態では、本発明は、約350〜1,500Daの範囲のPCSK9アロステリックリガンドを含む組成物を考察する。一実施形態では、PCSK9アロステリックリガンドは1,300Da未満である。一実施形態では、PCSK9アロステリックリガンドは、約3〜6つのアミノ酸を含む。一実施形態では、PCSK9アロステリックリガンドは、約550〜1,000Daの範囲にある。一実施形態では、本組成物は医薬組成物である。一実施形態では、本組成物は、医薬組成物である。一実施形態では、この投与は、限定するものではないが、リポソーム、マイクロ粒子、およびナノ粒子を含む群から選択される送達システムをさらに含む。一実施形態では、医薬組成物は、上記リガンドの有効用量を含む。一実施形態では、医薬組成物は塩を含む。一実施形態では、医薬組成物は経口投与用に製剤化される。
一実施形態では、本発明は、a)PCSK9アロステリック阻害剤ペプチドを対象に投与することであって、上記対象が心血管疾患のうちの少なくとも1つの症状を有することと、b)上記PCSK9アロステリック阻害剤ペプチドの投与により上記心血管疾患のうちの少なくとも1つの症状を低減することとを含む方法を考察する。一実施形態では、上記少なくとも1つの症状が10%〜85%低減する。一実施形態では、上記少なくとも1つの症状が20%〜65%低減する。一実施形態では、上記少なくとも1つの症状が30%〜55%低減する。一実施形態では、心血管疾患は、冠疾患を含む。一実施形態では、心血管疾患は、高血圧を含む。一実施形態では、心血管疾患は高コレステロール血症を含む。一実施形態では、心血管疾患はアテローム性動脈硬化症を含む。一実施形態では、少なくとも1つの症状は、循環する高密度リポタンパク質の減少を含む。一実施形態では、少なくとも1つの症状は、循環コレステロールの増加を含む。一実施形態では、少なくとも1つの症状は、循環する低密度リポタンパク質の増加を含む。一実施形態では、少なくとも1つの症状は高血圧を含む。一実施形態では、投与は、PCSK9アロステリック阻害剤ペプチドの有効用量を含む。一実施形態では、上記投与は、限定するものではないが、リポソーム、マイクロ粒子、およびナノ粒子を含む群から選択される送達システムをさらに含む。一実施形態では、有効用量は医薬組成物を含む。一実施形態では、医薬組成物は塩を含む。一実施形態では、医薬組成物は経口投与用に製剤化される。一実施形態では、アロステリック阻害剤ペプチドは、約3〜8つのアミノ酸を含む。一実施形態では、アロステリック阻害剤ペプチドは6つのアミノ酸である。一実施形態では、アロステリック阻害剤ペプチドは、1,300Da未満である。一実施形態では、アロステリック阻害剤ペプチドは、466〜1067Daの範囲にある。一実施形態では、アロステリック阻害剤ペプチドは、175〜1,000Daの範囲にある。
一実施形態では、本発明は、a)PCSK9アロステリックエンハーサーペプチドを対象に投与することであって、上記対象が心血管疾患の少なくとも1つの症状を有することと、b)PCSK9アロステリック阻害剤ペプチドの投与により、上記心血管疾患の少なくとも1つの症状を低減することとを含む、方法を考察する。一実施形態では、心血管疾患は高コレステロール血症を含む。一実施形態では、上記少なくとも1つの症状は循環コレステロールの減少を含む。一実施形態では、上記少なくとも1つの症状は、高密度リポタンパク質の増加を含む。一実施形態では、少なくとも1つの症状は、低密度リポタンパク質の減少を含む。一実施形態では、少なくとも1つの症状は、低血圧を含む。一実施形態では、上記少なくとも1つの症状が10%〜85%低減する。一実施形態では、上記少なくとも1つの症状が20%〜65%低減する。一実施形態では、上記少なくとも1つの症状が30%〜55%低減する。一実施形態では、上記投与は、上記PCSK9アロステリック阻害剤ペプチドの有効用量を含む。一実施形態では、上記投与は、限定するものではないが、リポソーム、マイクロ粒子、およびナノ粒子を含む群から選択される送達システムをさらに含む。一実施形態では、有効用量は医薬組成物を含む。一実施形態では、医薬組成物は塩を含む。一実施形態では、医薬組成物は経口投与用に製剤化される。一実施形態では、アロステリックエンハーサーペプチドは、約3〜8つのアミノ酸を含む。一実施形態では、アロステリックエンハーサーペプチドは、6つのアミノ酸である。一実施形態では、アロステリックエンハーサーペプチドは、1,300Da未満である。一実施形態では、アロステリックエンハーサーペプチドは約466〜1067Daの範囲である。一実施形態では、アロステリックエンハーサーペプチドは、約175〜1,000Daの範囲である。
一実施形態では、本発明は、a)PCSK9アロステリック合成ペプチドを対象に投与することであって、上記対象が肝疾患の少なくとも1つの症状を有することと、b)上記PCSK9アロステリックペプチドの投与により上記肝疾患の少なくとも1つの症状を低減することとを含む、方法を考察する。一実施形態では、少なくとも1つの症状は、低密度リポタンパク質受容体の密度の増加を含む。一実施形態では、少なくとも1つの症状は低密度リポタンパク質受容体の密度の低下を含む。一実施形態では、上記少なくとも1つの症状が10%〜85%低減する。一実施形態では、上記少なくとも1つの症状が20%〜65%低減する。一実施形態では、上記少なくとも1つの症状が30%〜55%低減する。一実施形態では、PCSK9アロステリック合成ペプチドは、PCSK9アロステリックエンハーサーペプチドを含む。一実施形態では、PCSK9アロステリック合成ペプチドは、PCSK9アロステリック阻害剤ペプチドを含む。一実施形態では、本投与は、上記PCSK9アロステリックペプチドの有効用量を含む。一実施形態では、上記投与は、限定するものではないが、リポソーム、マイクロ粒子、およびナノ粒子を含む群から選択される送達システムをさらに含む。一実施形態では、有効用量は医薬組成物を含む。一実施形態では、医薬組成物は塩を含む。一実施形態では、医薬組成物は経口投与用に製剤化される。一実施形態では、アロステリック合成ペプチドは約3〜8つのアミノ酸を含む。一実施形態では、アロステリック合成ペプチドは6つのアミノ酸である。一実施形態では、アロステリック合成ペプチドは、1,300Da未満である。一実施形態では、アロステリック合成ペプチドは約466〜1067Daの範囲にある。一実施形態では、アロステリック合成ペプチドは、約175〜1,000Daの範囲にある。
一実施形態では、本発明は、a)i)PCSK9タンパク質であって、アロステリック調節部位オルソステリック低密度リポタンパク質受容体(LDLR)結合部位を含むPCSK9タンパク質、およびii)上記アロステリック調節部位に結合可能なアロステリック合成ペプチドを提供することと、b)上記アロステリック調節部位に上記アロステリック合成ペプチドを結合することであって、上記アロステリック合成ペプチドが、上記オルソステリックLDLR結合部位の立体構造の変化を誘導することとを含む、方法を考察する。一実施形態では、上記アロステリック調節部位への上記アロステリック合成ペプチドの結合は、上記オルソステリックLDLR結合部位の誘導適合した立体構造の変化を阻害する。一実施形態では、この結合は上記PCSK9タンパク質の立体構造の変化を誘導する。一実施形態では、結果として得られるPCSK9の立体構造の変化は、上記LDLRに対する上記オルソステリックLDLR結合部位の相互作用の結合親和性を低減し、ここで低密度リポタンパク質のクリアランスは増大する。一実施形態では、立体構造の変化は、低密度リポタンパク質受容体からの上記オルソステリック低密度リポタンパク質受容体の結合部位の解離を高める。一実施形態では、立体構造の変化は、結合リガンドに対するオルソステリックCis−Hisリッチドメイン(CHRD)の結合部位を低減する(たとえば、低pHで小胞輸送を促進する;DeVay et al,“Characterization of Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin Type 9(PCSK9) trafficking reveals a novel lysosomal targeting mechanism via amyloid precursor−like protein 2 (APLP2)” J Biol Chem.288(15):10805−10818 (2013))。一実施形態では、オルソステリック低密度リポタンパク質受容体結合部位の立体構造の変化は、融合適合型の阻害を含む。一実施形態では、上記アロステリック合成ペプチドの結合は、PCSK9のオルソステリックLDLR結合部位の誘導適合に必要な立体構造の変化を低減し、上記オルソステリックLDLR相互作用の結合親和性を阻害し、低密度リポタンパク質のクリアランスを増加させる。一実施形態では、上記オルソステリック低密度リポタンパク質受容体結合部位の立体構造の変化の誘導は生体力学的である。一実施形態では、立体構造の変化は、PCSK9の触媒ドメインとPCSK9のC末端ドメインとの間の結合ループの生体力学的硬化をもたらす。一実施形態では、生体力学的な立体構造の変化は、アミノ酸のアラニン443の側鎖および/または主鎖の転移性および/または回転性の移動を含む。一実施形態では、生体力学的な立体構造の変化は、アミノ酸バリン441の側鎖および/または主鎖の転移性および/または回転性の移動を含む。一実施形態では、生体力学的な立体構造の変化は、アミノ酸アスパラギン酸442側鎖および主鎖の転移性および/または回転性の移動を含む。一実施形態では、生体力学的な立体構造の変化は、アミノ酸スレオニン162の側鎖および/または主鎖の転移性および/または回転性の移動を含む。一実施形態では、生体力学的な立体構造の変化は、アミノ酸プロリン445の側鎖および/または主鎖の転移性および/または回転性の移動を含む。一実施形態では、生体力学的な立体構造の変化は、アミノ酸プロリン446の側鎖および/または主鎖の転移性および/または回転性の移動を含む。一実施形態では、生体力学的な立体構造の変化は、ヒスチジン449の再配向および転移を含む。一実施形態では、生体力学的な機構は、アミノ酸アラニン443の側鎖および/または主鎖の転移性および/または回転性の移動の阻害を含む。一実施形態では、生体力学的な機構は、アミノ酸バリン441の側鎖および/または主鎖の転移性および/または回転性の移動の阻害を含む。一実施形態では、生体力学的な機構は、アミノ酸アスパラギン酸422の側鎖および/または主鎖の転移性および/または回転性の移動の阻害を含む。一実施形態では、生体力学的な機構は、アミノ酸スレオニン162の側鎖および/または主鎖の転移性および/または回転性の移動の阻害を含む。一実施形態では、生体力学的な機構は、アミノ酸プロリン445の側鎖および/または主鎖の転移性および/または回転性の移動の阻害を含む。一実施形態では、生体力学的な機構は、アミノ酸プロリン446の側鎖および/または主鎖の転移性および/または回転性の移動の阻害を含む。一実施形態では、生体力学的な変化は、ヒスチジン449の側鎖および/または主鎖の転移性および/または回転性の移動の阻害を含む。一実施形態では、アロステリック合成ペプチドはVYVRFWである。一実施形態では、アロステリック合成ペプチドはVLELYWである。一実施形態では、アロステリック合成ペプチドはISDLSYである。一実施形態では、アロステリック合成ペプチドは、約3〜8つのアミノ酸を含む。一実施形態では、アロステリック合成ペプチドは6つのアミノ酸である。一実施形態では、アロステリック合成ペプチドは1,300Da未満である。一実施形態では、アロステリック合成ペプチドは約466〜1067Daの範囲にある。一実施形態では、アロステリック合成ペプチドは約175〜1,000Daの範囲にある。
一実施形態では、本発明は、式
であって、式中、
i)アミノ酸残基の数nが、3〜8の範囲の整数であり、ii)構成アミノ酸が、天然または天然ではないアミノ酸から独立して選択される単一のエナンチオマーであり、iii)R2およびR3が、水素、低級アルキル、分枝アルキル、ヒドロキシアルキル、シクロアルキル、複素環、アリール、ヘテロアリール、アシル、置換型または非置換型ベンゾイル、アルキルスルホニルまたはアリールスルホニル(たとえばメシルまたはトシル)およびカルバモイル(たとえばBOC)からなる群から独立して選択され、iv)R1が、−OHおよび−NR4−R5からなる群から選択され、v)R4およびR5が、独立して、水素;低級アルキル、アリール、シクロアルキル、芳香複素環、ピリジン、テトラゾールからなる群から選択されるか;あるいはR4およびR5は、ピペリジン;ピロリジン;モルフォリン;ピペラジン;4−メチルピペラジンなどの置換型複素環;またはジヒドロキノリンもしくはインドリンなどの縮合複素環などの複素環(heterocyle)として結合する、式の化合物を考察する。一実施形態では、本化合物は負電荷極性基をさらに含む。一実施形態では、負電荷極性基は、限定するものではないが、S1、S2、もしくはS3に組み込まれるO−ホスフェート、O−スルファート、または5−O−または5−N−テトラゾールを含む。一実施形態では、側鎖S1、S2、またはS3はホスホセリンを含む。一実施形態では、側鎖S1は、−CH2−NH−テトラゾールを含む。一実施形態では、C末端はグリシンを含む。一実施形態では、本化合物は約3〜8つのアミノ酸を含む。一実施形態では、本化合物は6つのアミノ酸である。一実施形態では、本化合物は1,300Da未満である。一実施形態では、本化合物は約466〜1067Daの範囲にある。一実施形態では、本化合物は、約175〜1,000Daの範囲にある。一実施形態では、本化合物は合成ペプチドを含む。
i)アミノ酸残基の数nが、3〜8の範囲の整数であり、ii)構成アミノ酸が、天然または天然ではないアミノ酸から独立して選択される単一のエナンチオマーであり、iii)R2およびR3が、水素、低級アルキル、分枝アルキル、ヒドロキシアルキル、シクロアルキル、複素環、アリール、ヘテロアリール、アシル、置換型または非置換型ベンゾイル、アルキルスルホニルまたはアリールスルホニル(たとえばメシルまたはトシル)およびカルバモイル(たとえばBOC)からなる群から独立して選択され、iv)R1が、−OHおよび−NR4−R5からなる群から選択され、v)R4およびR5が、独立して、水素;低級アルキル、アリール、シクロアルキル、芳香複素環、ピリジン、テトラゾールからなる群から選択されるか;あるいはR4およびR5は、ピペリジン;ピロリジン;モルフォリン;ピペラジン;4−メチルピペラジンなどの置換型複素環;またはジヒドロキノリンもしくはインドリンなどの縮合複素環などの複素環(heterocyle)として結合する、式の化合物を考察する。一実施形態では、本化合物は負電荷極性基をさらに含む。一実施形態では、負電荷極性基は、限定するものではないが、S1、S2、もしくはS3に組み込まれるO−ホスフェート、O−スルファート、または5−O−または5−N−テトラゾールを含む。一実施形態では、側鎖S1、S2、またはS3はホスホセリンを含む。一実施形態では、側鎖S1は、−CH2−NH−テトラゾールを含む。一実施形態では、C末端はグリシンを含む。一実施形態では、本化合物は約3〜8つのアミノ酸を含む。一実施形態では、本化合物は6つのアミノ酸である。一実施形態では、本化合物は1,300Da未満である。一実施形態では、本化合物は約466〜1067Daの範囲にある。一実施形態では、本化合物は、約175〜1,000Daの範囲にある。一実施形態では、本化合物は合成ペプチドを含む。
一実施形態では、本発明は、式Val−Tyr−Val−Arg−Phe−Trpの化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、式β−Ala−Phe(3−CH2NH2)−Val−D−Ser(p)−Phe−Trpの化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、式Thr−Leu−Cys(CH2−Ph)−Thr−Trp−Ser−Ser−−Ser(p)の化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、式Thr−Leu−Asp(NHCH2Ph)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)の化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、式Thr−Leu−Gly(CH2CH2シクロヘキシル)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)の化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、式Thr−Leu−Hph−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)の化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、式Thr−Leu−Cys(CH2−Ph)−Thr−Trp(3−Me)−Ser−Ser−Ser(p)の化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、式Val−Leu−Glu−Leu−Tyr−Trpの化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、式Leu−Asp−Leu−Phe−Phe−Serの化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、式Ile−Leu−Asp−Leu−Ser−Tyrの化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、式Ac−Trp−Ser−Ser(p)の化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、式Ac−Trp−Ala−Ser(p)の化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、式Ac−Trp(5−F)−Ala−Ser(p)−モルフォリンの化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、式Thr−Leu−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)の化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、式Ac−Tyr−Trp−Glyの化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、式Phe(4−Ph)−Ala−Ser(p)−モルフォリンの化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、限定するものではないが、Val−Tyr−Val−Arg−Phe−Trp−NH2、Ala−Phe(3−CH2NH2)−Val−D−Ser(p)−Phe−Trp−NH2、Thr−Leu−Cys(CH2−Ph)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)−NH2、Thr−Leu−Asp(NHCH2Ph)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)−NH2、Thr−Leu−Gly(CH2CH2シクロヘキシル)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)−NH2、Thr−Leu−Hph−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)−NH2、Thr−Leu−Cys(CH2−Ph)−Thr−Trp(3−Me)−Ser−Ser−Ser(p)−NH2、Val−Leu−Glu−Leu−Tyr−Trp−NH2、Leu−Asp−Leu−Phe−Phe−Ser−NH2、Ile−Leu−Asp−Leu−Ser−Tyr−NH2、Ac−Trp−Ser−Ser(p)−NH2、Ac−Trp−Ala−Ser(p)−NH2、Ac−Trp(5−F)−Ala−Ser(p)−NH2およびThr−Leu−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)−NH2を含む化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、限定するものではないが、Ac−Trp−Ser−Ser(p)−NHCH3、Ac−Trp−Ala−Ser(p)−NHCH3、Ac−Trp−Ala−Ser(p)−モルフォリン、Ac−Trp−Ala−Ser(p)−4−メチルピペリジン(piperizine)、Ac−Trp−Ala−Ser(p)−ピペリジン、Ac−Trp−Ala−Ser(p)−ピロリジンを含む化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、限定するものではないが、Ac−Thr−Leu−Cys(CH2−Ph)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Ac−Thr−Leu−Asp(NHCH2Ph)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Ac−Thr−Leu−Gly(CH2CH2シクロヘキシル)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Ac−Thr−Leu−Hph−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Ac−Thr−Leu−Cys(CH2−Ph)−Thr−Trp(3−Me)−Ser−Ser−Ser(p)、Ac−Val−Leu−Glu−Leu−Tyr−Trp、Ac−Leu−Asp−Leu−Phe−Phe−Ser、Ac−Ile−Leu−Asp−Leu−Ser−TyrおよびAc−Thr−Leu−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)を含む化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、限定するものではないが、Thr−Leu−Cys(CH2−Ph)−Thr−Trp−Ser−Ala−Ser(p)、Thr−Leu−Asp(NHCH2Ph)−Thr−Trp−Ser−Ala−Ser(p)、Thr−Leu−Gly(CH2CH2シクロヘキシル)−Thr−Trp−Ser−Ala−Ser(p)、Thr−Leu−Hph−Thr−Trp−Ser−Ala−Ser(p)、Thr−Leu−Cys(CH2−Ph)−Thr−Trp(3−Me)−Ser−Ala−Ser(p)およびThr−Leu−Thr−Trp−Ser−Ala−Ser(p)を含む化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、限定するものではないが、Thr−Leu−Cys(CH2−Ph)−Thr−Trp−Ser−Ala−Ser(p)−NH2、Thr−Leu−Asp(NHCH2Ph)−Thr−Trp−Ser−Ala−Ser(p)−NH2、Thr−Leu−Gly(CH2CH2シクロヘキシル)−Thr−Trp−Ser−Ala−Ser(p)−NH2、Thr−Leu−Hph−Thr−Trp−Ser−Ala−Ser(p)−NH2、Thr−Leu−Cys(CH2−Ph)−Thr−Trp(3−Me)−Ser−Ala−Ser(p)−NH2およびThr−Leu−Thr−Trp−Ser−Ala−Ser(p)−NH2を含む化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、限定するものではないが、Ac−Thr−Leu−Cys(CH2−Ph)−Thr−Trp−Ser−Ala−Ser(p)、Ac−Thr−Leu−Asp(NHCH2Ph)−Thr−Trp−Ser−Ala−Ser(p)、Ac−Thr−Leu−Gly(CH2CH2シクロヘキシル)−Thr−Trp−Ser−Ala−Ser(p)、Ac−Thr−Leu−Hph−Thr−Trp−Ser−Ala−Ser(p)、Ac−Thr−Leu−Cys(CH2−Ph)−Thr−Trp(3−Me)−Ser−Ala−Ser(p)およびAc−Thr−Leu−Thr−Trp−Ser−Ala−Ser(p)を含む化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、限定するものではないが、Ac−Thr−Leu−Cys(CH2−Ph)−Thr−Trp−Ser−Ala−Ser(p)−NH2、Ac−Thr−Leu−Asp(NHCH2Ph)−Thr−Trp−Ser−Ala−Ser(p)−NH2、Ac−Thr−Leu−Gly(CH2CH2シクロヘキシル)−Thr−Trp−Ser−Ala−Ser(p)−NH2、Ac−Thr−Leu−Hph−Thr−Trp−Ser−Ala−Ser(p)−NH2、Ac−Thr−Leu−Cys(CH2−Ph)−Thr−Trp(3−Me)−Ser−Ala−Ser(p)−NH2、Ac−Thr−Leu−Thr−Trp−Ser−Ala−Ser(p)−NH2を含む化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、限定するものではないが、Thr−Leu−(CH2−Ph)−Thr−Trp−Ser−Ser(p)、Thr−Leu−Asp(NHCH2Ph)−Thr−Trp−Ser−Ser(p)、Thr−Leu−Gly(CH2CH2シクロヘキシル)−Thr−Trp−Ser−Ser(p)、Thr−Leu−Hph−Thr−Trp−Ser−Ser(p)、Thr−Leu−Cys(CH2−Ph)−Thr−Trp(3−Me)−Ser−Ser(p)およびThr−Leu−Trp−Ser−Ser(p)を含む化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、限定するものではないが、Ac−Thr−Leu−Cys(CH2−Ph)−Thr−Trp−Ser−Ser(p)−NH2、Ac−Thr−Leu−Asp(NHCH2Ph)−Thr−Trp−Ser−Ser(p)−NH2、Ac−Thr−Leu−Gly(CH2CH2シクロヘキシル)−Thr−Trp−Ser−Ser(p)−NH2、Ac−Thr−Leu−Hph−Tnr−Trp−Ser−Ser(p)−NH2、Ac−Thr−Leu−Cys(CH2−Ph)−Thr−Trp(3−Me)−Ser−Ser(p)−NH2およびAc−Thr−Leu−Thr−Trp−Ser−Ser(p)−NH2を含む化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、限定するものではないが、Thr−Leu−Cys(CH2−Ph)−Thr−Trp−Ala−Ser(p)、Thr−Leu−Asp(NHCH2Ph)−Thr−Trp−Ala−Ser(p)、Thr−Leu−Gly(CH2CH2シクロヘキシル)−Thr−Trp−Ala−Ser(p)、Thr−Leu−Hph−Thr−Trp−Ala−Ser(p)、Thr−Leu−Cys(CH2−Ph)−Thr−Trp(3−Me)−Ala−Ser(p)およびThr−Leu−Thr−Trp−Ala−Ser(p)を含む化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、限定するものではないが、Ac−Thr−Leu−Cys(CH2−Ph)−Thr−Trp−Ala−Ser(p)−NH2、Ac−Thr−Leu−Asp(NHCH2Ph)−Thr−Trp−Ala−Ser(p)−NH2、Ac−Thr−Leu−Gly(CH2CH2シクロヘキシル)−Thr−Trp−Ala−Ser(p)−NH2、Ac−Thr−Leu−Hph−Thr−Trp−Ala−Ser(p)−NH2、Ac−Thr−Leu−Cys(CH2−Ph)−Thr−Trp(3−Me)−Ala−Ser(p)−NH2およびAc−Thr−Leu−Thr−Trp−Ala−Ser(p)−NH2を含む化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、限定するものではないが、Thr−Leu−Cys(CH2−Ph)−Ala−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Thr−Leu−Asp(NHCH2Ph)−Ala−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Thr−Leu−Gly(CH2CH2シクロヘキシル)−Ala−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Thr−Leu−Hph−Ala−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Ac−Thr−Leu−Cys(CH2−Ph)−Ala−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Ac−Thr−Leu−Asp(NHCH2Ph)−Ala−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Ac−Thr−Leu−Gly(CH2CH2シクロヘキシル)−Ala−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Ac−Thr−Leu−Hph−Ala−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Ac−Thr−Leu−Cys(CH2−Ph)−Ala−Trp−Ser−Ser−Ser(p)−NH2、Ac−Thr−Leu−Asp(NHCH2Ph)−Ala−Trp−Ser−Ser−Ser(p)−NH2、Ac−Thr−Leu−Gly(CH2CH2シクロヘキシル)−Ala−Trp−Ser−Ser−Ser(p)−NH2およびAc−Thr−Leu−Hph−Ala−Trp−Ser−Ser−Ser(p)−NH2を含む化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、限定するものではないが、Thr−Leu−Cys(CH2−Ph)−Ser−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Thr−Leu−Αsp(NHCH2Ph)−Ser−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Thr−Leu−Gly(CH2CH2シクロヘキシル)−Ser−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Thr−Leu−Hph−Ser−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Ac−Thr−Leu−Cys(CH2−Ph)−Ser−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Ac−Thr−Leu−Asp(NHCH2Ph)−Ser−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Ac−Thr−Leu−Gly(CH2CH2シクロヘキシル)−Ser−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Ac−Thr−Leu−Hph−Ser−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Ac−Thr−Leu−Cys(CH2−Ph)−Ser−Trp−Ser−Ser−Ser(p)−NH2、Ac−Thr−Leu−Αsp(NHCH2Ph)−Ser−Trp−Ser−Ser−Ser(p)−NH2、Ac−Thr−Leu−Gly(CH2CH2シクロヘキシル)−Ser−Trp−Ser−Ser−Ser(p)−NH2およびAc−Thr−Leu−Hph−Ser−Trp−Ser−Ser−Ser(p)−NH2を含む化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、限定するものではないが、Ac−Cys(CH2−Ph)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Ac−Asp(NHCH2Ph)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Ac−Gly(CH2CH2シクロヘキシル)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Ac−Hph−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Ac−Cys(CH2−Ph)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)−NH2、Ac−Asp(NHCH2Ph)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)−NH2、Ac−Gly(CH2CH2シクロヘキシル)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)−NH2およびAc−Hph−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)−NH2を含む化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、限定するものではないが、BOC−Cys(CH2−Ph)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、BOC−Asp(NHCH2Ph)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、BOC−Gly(CH2CH2シクロヘキシル)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、BOC−Hph−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、BOC−Cys(CH2−Ph)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)−NH2、BOC−Asp(NHCH2Ph)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)−NH2、BOC−Gly(CH2CH2シクロヘキシル)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)−NH2およびBOC−Hph−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)−NH2を含む化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、限定するものではないが、Thr−Leu−Cys(CH3)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Thr−Leu−Cys(CH(CH3)2)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Thr−Leu−Cys(CH2−3,4−ジフルオロフェニル)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Thr−Leu−Cys(CH2−3−ヒドロキシフェニル)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Thr−Leu−Cys(CH2−3−メチルフェニル)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)およびAc−Leu−Cys(CH2−Ph)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)−NH2を含む化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、式Phe(4−Ph)−Gly(Et)−Ser(p)−モルフォリンを有する化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、Ac−Tyr−Trp(6−OMe)−Gly、Ac−Tyr(3−F)−Trp−Gly、ピバロイル−Tyr−Trp−Gly、メシル−Tyr−Trp−Gly、BOC−Tyr−Trp−Gly、
および
からなる群から選択される化合物を考察する。
および
からなる群から選択される化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、式Ac−D−Trp−D−Phe(3CF3)−D−Arg−NH2の化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、式Ac−D−Trp−D−Phe(3Cl)−D−Arg−NH2の化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、式Ac−D−Trp−D−Phe−D−Arg−NH2の化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、式Ac−D−Trp−D−Phe−D−Argの化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、式NAc−NMe−D−Arg−D−Phe(3OH)−D−Trp−NH2の化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、式Ac−Arg−Phe(3CF3)−Glyの化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、式Ac−Ala−Val−Arg−N(Me)(Ph3CF3)の化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、式Ac−D−Arg−D−Phe(3OH)−D−Trpの化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、式Ac−D−Arg−D−Phe(3OH)−D−Trp−NH2の化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、式プロピオニル−D−Arg−D−Phe(3OH)−D−Trpの化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、式Ac−Val−Arg−Phe−Trpの化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、式Ac−Tyr−Val−Arg−Phe−Trpの化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、式Val−Tyr−Asp−Arg−Phe−Trpの化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、式Val−Tyr−Glu−Arg−Phe−Trpの化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、式Val−Tyr−Val−Cit−Phe−W(Cit=シトルリン)の化合物を考察する。
一実施形態では、本発明は、式
であって、式中、
i)アミノ酸残基の数であるnが、3〜8の範囲の整数であり;ii)構成アミノ酸が、独立して選択した天然または天然ではないアミノ酸である単一のエナンチオマーであり;iii)R2およびR3が、水素、低級アルキル、分枝アルキル、ヒドロキシアルキル、シクロアルキル、複素環、アリール、ヘテロアリール、アシル、置換型または非置換型ベンゾイル、アルキルスルホニルまたはアリールスルホニル(たとえばメシルまたはトシル)およびカルバモイル(たとえばBOC)からなる群から独立して選択され;iv)R1が、−OHおよび−NR4−R5からなる群から選択され;v)R4およびR5が、水素;低級アルキル、アリール、シクロアルキル、芳香複素環、ピリジン、テトラゾールからなる群から独立して選択されるか;あるいはR4およびR5が、ピペリジン;ピロリジン;モルフォリン;ピペラジン;4−メチルピペラジンなどの置換型複素環;またはジヒドロキノリンもしくはインドリンなどの縮合複素環などの複素環として結合する、式の化合物ならびにキャリアーを含む医薬組成物を考察する。一実施形態では、医薬組成物は負電荷極性基をさらに含む。一実施形態では、上記負電荷極性基は、S1、S2、またはS3に組み込まれるO−ホスフェート、O−スルファート、または5−O−もしくは5−N−テトラゾールからなる群のうち少なくとも1つから選択される。一実施形態では、側鎖S1、S2、またはS3は、ホスホセリンを含む。一実施形態では、側鎖S1は、−CH2−NH−テトラゾールを含む。一実施形態では、C末端はグリシンを含む。一実施形態では、医薬組成物はスタチンをさらに含む。一実施形態では、スタチンは、限定するものではないが、アトルバスタチン、ロスバスタチンおよび/またはシンバスタチンを含む。一実施形態では、医薬組成物は、抗糖尿病薬を含む。一実施形態では、医薬組成物は、心血管治療薬を含む。一実施形態では、医薬組成物はエゼチミブ(Zetia(登録商標))を含む。一実施形態では、医薬組成物は、限定するものではないが、アムロジピンベシル酸塩(Norvasc(登録商標))を含む降圧剤を含む。一実施形態では、抗糖尿病薬は、限定するものではないが、シタグリプチン(Januvia(登録商標))および/またはメトホルミンを含む。一実施形態では、本化合物は、約3〜8つのアミノ酸を含む。一実施形態では、本化合物は6つのアミノ酸である。一実施形態では、本化合物は、1,300Da未満である。一実施形態では、本化合物は約466〜1067Da未満の範囲にある。一実施形態では、本化合物は、約175〜1,000Daの範囲にある。一実施形態では、本化合物は合成ペプチドを含む。
i)アミノ酸残基の数であるnが、3〜8の範囲の整数であり;ii)構成アミノ酸が、独立して選択した天然または天然ではないアミノ酸である単一のエナンチオマーであり;iii)R2およびR3が、水素、低級アルキル、分枝アルキル、ヒドロキシアルキル、シクロアルキル、複素環、アリール、ヘテロアリール、アシル、置換型または非置換型ベンゾイル、アルキルスルホニルまたはアリールスルホニル(たとえばメシルまたはトシル)およびカルバモイル(たとえばBOC)からなる群から独立して選択され;iv)R1が、−OHおよび−NR4−R5からなる群から選択され;v)R4およびR5が、水素;低級アルキル、アリール、シクロアルキル、芳香複素環、ピリジン、テトラゾールからなる群から独立して選択されるか;あるいはR4およびR5が、ピペリジン;ピロリジン;モルフォリン;ピペラジン;4−メチルピペラジンなどの置換型複素環;またはジヒドロキノリンもしくはインドリンなどの縮合複素環などの複素環として結合する、式の化合物ならびにキャリアーを含む医薬組成物を考察する。一実施形態では、医薬組成物は負電荷極性基をさらに含む。一実施形態では、上記負電荷極性基は、S1、S2、またはS3に組み込まれるO−ホスフェート、O−スルファート、または5−O−もしくは5−N−テトラゾールからなる群のうち少なくとも1つから選択される。一実施形態では、側鎖S1、S2、またはS3は、ホスホセリンを含む。一実施形態では、側鎖S1は、−CH2−NH−テトラゾールを含む。一実施形態では、C末端はグリシンを含む。一実施形態では、医薬組成物はスタチンをさらに含む。一実施形態では、スタチンは、限定するものではないが、アトルバスタチン、ロスバスタチンおよび/またはシンバスタチンを含む。一実施形態では、医薬組成物は、抗糖尿病薬を含む。一実施形態では、医薬組成物は、心血管治療薬を含む。一実施形態では、医薬組成物はエゼチミブ(Zetia(登録商標))を含む。一実施形態では、医薬組成物は、限定するものではないが、アムロジピンベシル酸塩(Norvasc(登録商標))を含む降圧剤を含む。一実施形態では、抗糖尿病薬は、限定するものではないが、シタグリプチン(Januvia(登録商標))および/またはメトホルミンを含む。一実施形態では、本化合物は、約3〜8つのアミノ酸を含む。一実施形態では、本化合物は6つのアミノ酸である。一実施形態では、本化合物は、1,300Da未満である。一実施形態では、本化合物は約466〜1067Da未満の範囲にある。一実施形態では、本化合物は、約175〜1,000Daの範囲にある。一実施形態では、本化合物は合成ペプチドを含む。
定義
本明細書で使用される用語「化合物」または「リガンド」は、結合するパートナーと相互作用(たとえば付着、結合)することにより、結合するパートナーの生物学的機能を変えることのできる天然のアミノ酸を含むいずれかの外因性分子を指す。化合物/リガンドは、限定するものではないが、少なくとも2つのペプチド結合、抗体、タンパク質、ペプチド、および/またはトリペプチドを含むアミノ酸鎖を含んでもよい。このような化合物/リガンドは、限定するものではないが、ヒドロキシル、硫黄、アミン、アミド、エーテル、エステル、脂肪族鎖、芳香環、脂性環、置換型芳香環および/または置換型脂性環を含む置換基により誘導体化されてもよい。このような化合物/リガンドは、阻害剤化合物/リガンドまたはエンハーサー化合物/リガンドであってもよい。また化合物/リガンドは、「薬剤」を含むことにより、所望の作用を得る、投与できるいずれかの薬理学的活性物質を指してもよい。薬剤または化合物/リガンドは合成するか、または天然に存在するものとすることができる。
本明細書で使用される用語「化合物」または「リガンド」は、結合するパートナーと相互作用(たとえば付着、結合)することにより、結合するパートナーの生物学的機能を変えることのできる天然のアミノ酸を含むいずれかの外因性分子を指す。化合物/リガンドは、限定するものではないが、少なくとも2つのペプチド結合、抗体、タンパク質、ペプチド、および/またはトリペプチドを含むアミノ酸鎖を含んでもよい。このような化合物/リガンドは、限定するものではないが、ヒドロキシル、硫黄、アミン、アミド、エーテル、エステル、脂肪族鎖、芳香環、脂性環、置換型芳香環および/または置換型脂性環を含む置換基により誘導体化されてもよい。このような化合物/リガンドは、阻害剤化合物/リガンドまたはエンハーサー化合物/リガンドであってもよい。また化合物/リガンドは、「薬剤」を含むことにより、所望の作用を得る、投与できるいずれかの薬理学的活性物質を指してもよい。薬剤または化合物/リガンドは合成するか、または天然に存在するものとすることができる。
本明細書で使用される用語「合成リガンド」は、リガンドであるアミノ酸を含む分子を指し、ex vivoで設計され、続いてin vitroまたはin vivo、またはin vitroおよびin vivoでの手段で合成して、予め特定した特徴(たとえば電荷、形状、分子量)の分子を生成し、別の天然に存在する生体分子により結合して、複合体を形成する。好ましくはこれらの合成リガンドは標的となる天然の生体分子より小さく、より好ましくはこれらの合成リガンドは、1,300Da未満であり、より好ましくは350〜1250Daである。
本明細書で使用される用語「合成ペプチド」は、約3〜8つのアミノ酸であり、約350〜1,500Daの範囲にある非天然のアミノ酸配列を指す。約4〜5つのアミノ酸であり、約550〜1,000Daの範囲にある非天然のアミノ酸が好ましい。たとえば、合成ペプチドは、6つのアミノ酸であり、1,300Da未満であり、たとえば約466〜1067Daの範囲にある。好ましくは、合成ペプチドは実施例Vにしたがって作製される。
本明細書で使用される用語「アロステリック部位」は、外因性リガンドへの結合が、(酵素としての)タンパク質の形状および活性を変化させる際の、本来の化学的活性/受容体結合部位以外のリガンド結合部位を指す。たとえば、「アロステリックエンハーサーペプチド」は、タンパク質の本来の活性および/またはそれぞれの親和性を増大させ得るアロステリック部位へ結合するリガンドを指す(たとえばPCSK9アロステリックエンハーサーペプチド)。あるいは、「アロステリック阻害剤ペプチド」は、タンパク質の本来の活性および/またはそれぞれの親和性を減少させ得るアロステリック部位へ結合するリガンドを指す(たとえばPCSK9アロステリック阻害剤ペプチド)。たとえば、結合部位タンパク質は、PCSK9タンパク質のHis417、Lys421、Pro446、Trp453、Gln454、Glu628、Gly629、Asn652、およびThr653を含む。
本明細書で使用される用語「オスロステリック部位」は、主に、受容体、結合部位および/または触媒部位へのリガンド(たとえばペプチド)の調節されていない結合部位を指す。
本明細書で使用される用語「立体構造」は、アミノ酸配列の3次元の立体化学上の構成を指す。たとえば、いずれかの特定の立体構造は、アミノ酸配列における個々のアミノ酸の間での立体相互作用、疎水性相互作用、電気化学的結合、および/または塩橋相互作用の間の熱力学的均衡からもたらされる。
本明細書で使用される用語「立体構造の変化」は、第1の熱力学的均衡(立体構造1)を第2の熱力学的均衡(立体構造2)に変えることが可能であるか、または、孤立したタンパク質、および/もしくはタンパク質−リガンド複合体、および/もしくはタンパク質‐タンパク質複合体の中の準安定的なフォールディング状態の動的範囲および/もしくは種類および/もしくは数を高める外因性の力または分子(たとえば阻害剤ペプチド)の導入を指す。さらに、立体構造の変化は、特定の外部条件(pH、温度など)の下、および/または、限定するものではないが、分子の認識、初期の結合相互作用、誘導適合相互作用、官能基の活性および/もしくは解離に好ましい条件を含む、孤立したタンパク質もしくは複数の複合体の寿命の範囲内の特定の期間の間で、優性的に示されてもよい。
本明細書で使用される用語「EGFA」は、低密度リポタンパク質受容体の最もアミノ性のEGF様ドメインを指す。たとえば、EGF様ドメインは、LDLR受容体の細胞外の一部を指す。
本明細書で使用される用語「LDL−R」および「LDLR」は、低密度リポタンパク質受容体の略語を指す。略語は、全体のLDL−R受容体タンパク質またはそのいずれかの一部に関してであってもよい。LDL−Rは細胞表面にあり、低密度リポタンパク質と結合することにより、LDL−R/LDL複合体は、細胞(たとえば肝細胞)内で内部移行し、LDLは放出され、LDL−Rは、細胞表面に戻り再利用されることが可能になる。
本明細書で使用される用語「結合面」は、少なくとも2つの異なる分子の官能基(たとえば、ヒドロキシル、アミド、アミン、カルボキシル、アミジン、グアニジン、炭化水素、スルホニルなど)の間での吸引相互作用(たとえば水素結合、静電相互作用、疎水性相互作用など)のいずれかの集合を指す。吸引力の集合は、安定した分子面を形成し、それにより、少なくとも2つの分子間に「結合面」を形成する。
本明細書で使用される用語「誘導適合」は、受容体の立体構造の変化を必要とするペプチドのいずれかの受け入れを指す。このような立体構造は、アミノ酸側鎖および可動性ループの転移性/回転性の移動により促進され、これにより、静電領域および/または疎水性領域を再配置してもよい。
本明細書で使用される用語「複合体」または「組成物」は、共有結合よりも静電結合により通常結合する2つ以上のイオンまたは分子のいずれかの化学的会合を指す。例えば、複合体または組成物は、本明細書に記載されるペプチドと、PCSK9アミノ酸配列との間で形成されそれにより、ペプチド/PCSK9アミノ酸配列複合体または組成物を作製してもよい。任意に、このような複合体または組成物はまた、限定するものではないが、EGFA領域を含むLDLRアミノ酸配列もしくはそのいずれかの一部を含んでもよい。
本明細書で使用される用語「水素結合」は、1つの極性分子(以後水)の水素原子と、同一または異なる極性物質である通常別の分子の小さな電気陰性原子(以後酸素、窒素、またはフッ素)との間の静電引力である。
本明細書で使用される用語「塩橋」は、水素結合および/または静電相互作用などのいずれかの相互作用または相互作用の組み合わせを指し、荷電した部位を重ねる方法で陽イオン性および陰イオン性の構造を整列させる。
本明細書で使用される用語「相互作用」は、1つの分子および/官能基が、別の分子および/または官能基を有し得るいずれかの作用を指す。このような作用は、限定するものではないが、立体的(たとえば物理的)作用、静電(たとえば、電気性吸引または反作用)作用、電磁作用、親水性作用、または疎水性作用を含んでもよい。
本明細書で使用される用語「重ねる」は、1つの分子の電子構造が、別の分子の境界上にあり、この境界を超えて延びる方法またはこの方法で位置付けされる分子のいずれかの位置付けを指す。
本明細書で使用される用語「高コレステロール血症」は、血液コレステロールレベルが、臨床的に推奨されるレベルを超えて上昇する、いずれかの医学的状態を指す。たとえば、コレステロールを、低密度リポタンパク質(LDL)を使用して測定する場合、測定したLDLレベルがたとえば約70mg/dlを超える場合に、高コレステロール血症が発症し得る。あるいはコレステロールを、遊離血漿コレステロールを使用して測定する場合、測定した遊離コレステロールレベルがたとえば約200〜220mg/dlを超える場合に高コレステロール血症が発症し得る。
本明細書で使用される、「〜のリスクがある」との文言は、患者を特定の疾患または罹患
にさせやすい場合がある、患者により示される医学的状態または一連の医学的状態を指す。たとえば、これらの状態は、限定するものではないが、行動性、状動性、化学的、生化学的、または環境性の影響を含む影響からもたらされてもよい。
にさせやすい場合がある、患者により示される医学的状態または一連の医学的状態を指す。たとえば、これらの状態は、限定するものではないが、行動性、状動性、化学的、生化学的、または環境性の影響を含む影響からもたらされてもよい。
本明細書で使用される用語「有効量」は、臨床的に有益な結果(たとえば症状の低減)を達成する治療薬剤を含む医薬組成物の特定の量を指す。このような組成物の毒性および治療上の効力は、たとえば、LD50(集合の50%に致死性である用量)およびED50(集合の50%に治療上の有効性のある用量)を決定するために、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手法により決定できる。毒性および治療有効性の間の用量の比率は、治療指数であり、LD50/ED50として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。これらの細胞培養物アッセイおよび追加的な動物試験から入手したデータは、ヒトに使用するある範囲の用量を製剤化する際に使用できる。このような化合物の用量は、好ましくは、ほとんど毒性がないか、または毒性のないED50を含む循環濃度の範囲内にある。用量は、使用する剤形、患者の重症度、および投与経路に応じこの範囲内で反動する。
本明細書で使用される用語「症状」は、患者により観察される疾患または身体的障害の主観的または客観的なエビデンスを指す。たとえば、主観的なエビデンスは、通常患者自身の報告に基づき、限定するものではないが、疼痛、頭痛、視覚障害、吐き気および/または嘔吐を含んでもよい。あるいは、客観的なエビデンスは、通常、限定するものではないが、体温、全血球計算値、脂質パネル、甲状腺パネル、血圧、心拍数、心電図、組織イメージングスキャン、および/または身体のイメージングスキャンを含む医療試験の結果である。
本明細書で使用される用語「疾患」および/または「障害」は、生活機能の特性を妨害または修正する生存する動物または植物体、またはそれらの一部の正常な状態のいずれかの機能障害を指す。概して、兆候および症状を識別することにより顕在化され、通常、i)環境的な要因(栄養不良、工業災害、もしくは気候として)、ii)特定の感染因子(虫、細菌、もしくはウイルスとして);iii)生物の遺伝上の欠損(遺伝子の異常)、および/またはiv)これらの要因の組み合わせに応答する。
処置した対象と比較して処置していない対象のいずれかの症状の発現に関して、用語「低減する」、「阻害する」、「少なくする」、「抑制する」、「減少する」、「予防する」、および「文法上の同義語(「少ない」、「小さい」などを含む)は、医学的な訓練を受けたいずれかの人物により臨床的に関連すると認識される任意の量の差だけ、処置した対象の症状の量および/または大きさが、処置していない対象よりも少ないことを意味する。一実施形態では、処置した対象の症状の量および/または大きさは処置していない対象の症状の量および/または大きさの少なくとも10%未満、少なくとも25%未満、少なくとも50%未満、少なくとも75%未満、および/または少なくとも90%未満である。
処置した対象と比較して処置していない対象のいずれかの症状の発現に関して、用語「増加する」、「高める」、「上がる」、および文法上の同義語(「高い」、「大きい」などを含む)は、医学的な訓練を受けたいずれかの人物により臨床的に関連すると認識される任意の量の差だけ、処置した対象の症状の量および/または大きさが、処置していない対象よりも大きいことを意味する。一実施形態では、処置した対象の症状の量および/または大きさは、未処置の対象の症状の量および/または大きさの、少なくとも10%超、少なくとも25%超、少なくとも50%超、少なくとも75%超、および/または少なくとも90%超である。
本明細書で使用される用語「付着した」は、媒体(またはキャリアー)および薬剤の間のいずれかの相互作用を指す。付着は、可逆的または不可逆的であってもよい。このような付着は、限定するものではないが、共有結合、イオン結合、ファンデルワールス力または摩擦などを含む。薬剤は、含侵、組み込み、コーティング、懸濁、乳化、溶解、混合した場合、媒体(またはキャリアー)に付着する。
本明細書で使用される用語「投与した」または「投与する」は、組成物が患者に意図する作用を有するように、患者に組成物を提供するいずれかの方法を指す。例示的な投与方法は、局所組織投与(たとえば血管外配置)、経口取り込み、経皮パッチ、局所、吸引、座薬などの直接的な機構によるものである。
本明細書で使用される用語「患者」または「対象」は、ヒトまたは動物であり、入院する必要はない。たとえば、外来患者、老人ホームにいる人物は「患者」である。患者は、任意の年齢のヒトまたはヒトではない動物を含んでもよく、したがって、成人および若年(すなわち子供)を含む。用語「患者」は、医療処置の必要性を包有することを意図するものではなく、したがって患者は、自発的または不随意に、臨床的または基本的な科学試験を支援する実験の一部であってもよい。
本明細書で使用される用語「親和性」は、複数の複合体を形成するよう会合し、この複合体で会合を維持するための2つ以上の分子の熱力学的傾向の測定を指す。たとえば、SRX55リガンドは、PCSK9に高親和性を有し、複合体を形成するために熱力学的に適している。条件の変化(たとえば、受容体の内部移行工程の間のpH)、たとえば、LDLRおよび2つの分子に対するLDL親和性が減少すると、互いに解離または分離してもよいことが理解されるものである。
本明細書で使用される用語「由来する」は、化合物またはアミノ酸配列の供給源を指す。1つの態様では、化合物またはアミノ酸配列は、生物または特定の種に由来してもよい。別の態様では、化合物またはアミノ酸配列は、より大きな複合体または配列に由来してもよい。別の態様では、化合物または配列は、自然に見出されるアミノ酸配列の一部または全ての化学的修飾物により由来してもよい。
本明細書で使用される用語「タンパク質」は、ペプチド結合により結合するアミノ酸残基からなり、元素の炭素、水素、窒素、酸素、通常硫黄を含む、天然に存在する非常に複合的な物質(酵素または抗体として)のいずれかを指す。一般的に、タンパク質は、数百の範囲内の大きさの桁を有するアミノ酸を含む。
本明細書で使用される用語「ペプチド」は、別のカルボキシル基と1つの酸であるアミノ酸を組み合わせることによる3つ以上のアミノ酸に由来し、通常部分的なタンパク質の加水分解により得られる多様なアミドのいずれかを指す。一般的に、ペプチドは、10以下の範囲内の大きさの桁を有するアミノ酸を含む。
本明細書で使用される用語「薬学的」または「薬理学的に許容可能な」は、動物またはヒトに投与する際に、逆反応、アレルギー反応、または他の有害な反応を起こさない分子エンティティおよび組成物を指す。
本明細書で使用される用語「薬学的に許容可能なキャリアー」は、限定するものではないが、水、エタノール、ポリオール(たとえばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、それらの適切な混合物、ならびにジメチルスルホキシド、植物油、コーティン剤、等張剤、および吸収遅延剤、リポソーム、商業的に入手可能なクレンザーなどを含む、いずれかの、すべての溶媒または分散媒体を含む。補助的な生理活性成分もまた、このようなキャリアーに組み込むことができる。
本明細書で使用される用語「精製した」、または「単離した」は、多様な他の成分を除去し、組成物が実質的に生物学的な活性を呈したままである処置(たとえば分画)を行ったペプチド組成物を指し得る。
用語「実質的に精製した」を使用する際、この記載は、タンパク質またはペプチドが、組成物の約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%以上(たとえば重量/重量および重量/体積)を構成するなどの組成物の大部分を形成する組成物を指す。用語「均一に精製した」は、1種類のタンパク質(たとえばSDS=PAGEまたはHPLC解析に基づく)が存在するように、「明らかに均一である」ように精製した組成物を含むよう使用される。精製した組成物は、いくらかの微量不純物が残り得る意味を意図するものではない。
本明細書で使用されるように、用語「実質的に精製した」は、天然の環境から除去され、天然に会合する他の成分から、少なくとも60%遊離し、好ましくは75%遊離し、より好ましくは90%遊離する、アミノ酸配列などの分子を指す。したがって、「単離ポリペプチド」は、実質的に精製したポリペプチドである。
本明細書で使用されるように、用語「生体適合性」は、宿主の実質的に有害な応答を誘発するものではないいずれかの物質を指す。外来の物質が生存する体内に導入される際、この物質が、宿主において陰性作用を有する炎症応答などの免疫応答を誘導することが常に考察される。本発明の文脈では、生体適合性は、たとえば、包帯が皮膚に生体適合性があると考察され、またインプラント型医療装置は、身体の内部組織に生体適合性があると考察されるといったように設計される適用にしたがって評価される。好ましくは、生体適合性物質は、限定するものではないが、生物分解性物質および生体安定性物質を含む。
本明細書で使用される用語「アミノ酸配列」「および「ポリペプチド配列」は、互換可能であり、アミノ酸配列を指す。
タンパク質の「変異体」は、ポリペプチド配列またはポリペプチド配列のいずれかのホモログ由来の1つ以上のアミノ酸が異なるアミノ酸を含む。変異体は、「保存」変化を有しても良く、ここで、置換されたアミノ酸はたとえば、イソロイシンとロイシンの置換といった、類似の構造上または化学的な特性を有する。まれに、変異体は、たとえば、トリプトファンとグリシンの置換といった「非保存」変化を有してもよい。類似の少数の変異はまた、アミノ酸の欠損または挿入(追加)、またはその両方を含んでもよい。
「欠損」は、1つ以上のアミノ酸残基がそれぞれ存在しないアミノ酸配列における変化と定義される。
「挿入」または「追加」は、1つ以上のアミノ酸残基が追加されたアミノ酸配列における変化である。
本明細書で使用される用語「誘導体」は、アミノ酸のいずれかの化学的修飾物を指す。このような修飾物の例として、限定するものではないが、アルキル、アリール、ヒドロキシル、スルフヒドリル、スルホキシル、スルホニル、アシル、ホスホリル、アルコキシル、アミノまたはアミノ複素環基による水素との置換を含む。たとえば、チロシンは、フェニルアミンの4−ヒドロキシルアミノ酸の誘導体であり、ホスホセリンは、セリンのO―リン酸誘導体である。他の可能性のある化学的修飾物は、限定するものではないが、C−末端のアミド、およびアシルまたはスルホニルのN末端修飾物を含んでもよい。
本明細書で使用される用語「結合する」は、永続的または一時的であり得る物理的付着または閉鎖会合のいずれかを含む。一般的に、水素結合、疎水力、ファンデルワールス力、共有結合およびイオン結合などの相互作用は、対象となる分子と、測定または影響する分析物/標的との間の物理的な付着を容易にする。「結合」相互作用は、結合が化学的反応を発生させる状況のように明らかであってもよい。結合成分が酵素である際に、分析物/標的が酵素の基質であることが一般的である。結合剤と、分析物/標的との間の接触からもたらされる反応はまた、本発明の目的のための結合の定義の範囲内にある。
本発明は、高コレステロール血症の分野に関する。特に、本発明は、350〜2,000Daの範囲の3〜8アミノ酸の合成ペプチドおよび/または合成ペプチド誘導体を使用して、タンパク質PCSK9の立体構造を変化させることにより、低密度リポタンパク質の循環レベルを調節する組成物ならびに方法を提供する。PCSK9の立体構造を変化させることにより、PCSK9と内在性低密度リポタンパク質受容体との間の相互作用に影響を与え、循環するLDLコレステロールのレベルの低下または増加を引き起こす可能性がある。高いLDLコレステロールレベルは心疾患のリスクの増加に関連する。低いLDL−コレステロールレベルは、肝機能不全などの他の病態で問題となる場合があり、したがって、LDLレベルを上げることのできるリガンドも有用である。
I.天然のPCSK9の生理的役割
プロタンパク質変換酵素スブチリシン/カチン9型はPCSK9としても知られており、ヒトではPCSK9遺伝子によりコードされる酵素である(Seidah et al.,“The secretory proprotein convertase neural apoptosis−regulated convertase 1 (NARC−1):liver regeneration and neuronal differentiation” Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100 (3):928−933 (2003))。同様の遺伝子(オルソログ)は、多くの種で見出される。PSCK9を含む多くの酵素は、活性を阻止するペプチド鎖部を有しているため、最初に合成される際には不活性であり、プロタンパク質変換酵素がこの部分を除去して酵素を活性化させる。
プロタンパク質変換酵素スブチリシン/カチン9型はPCSK9としても知られており、ヒトではPCSK9遺伝子によりコードされる酵素である(Seidah et al.,“The secretory proprotein convertase neural apoptosis−regulated convertase 1 (NARC−1):liver regeneration and neuronal differentiation” Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100 (3):928−933 (2003))。同様の遺伝子(オルソログ)は、多くの種で見出される。PSCK9を含む多くの酵素は、活性を阻止するペプチド鎖部を有しているため、最初に合成される際には不活性であり、プロタンパク質変換酵素がこの部分を除去して酵素を活性化させる。
例示的な実施形態は、アロステリック調節合成ペプチド(たとえばSRX55)のPCSK9タンパク質に対する結合を示す。図8を参照されたい。プロドメインは水色で示される。PCSK9「触媒」ドメインの両半分は黄色および暗青色でそれぞれ示される。EGF−A結合部位は、青色および黄色の空白埋めで示される。SRX55(緑)は、アロステリックリガンド結合部位に対する結合を示す。N末端へリックスは白色で示される。
PSCK9遺伝子は、分泌性のスブチラーゼファミリーのプロテイナーゼKサブファミリーに属するプロタンパク質変換酵素をコードする。コードされるタンパク質は、小胞体内での自己触媒分子内処理を経る可溶性の酵素前駆体として合成される。タンパク質は、プロタンパク質変換酵素として機能してもよい。たとえば、ヒトPCSK9のアミノ酸配列は、
である。
PSCK9は、コレステロールのホメオスタシスを制御する役割を果たすと考えられている。たとえば、PSCK9は、LDL−Rの内部移行および分解をもたらす低密度リポタンパク質受容体(LDL−R)の上皮増殖因子様反復A(EGF−A)ドメインに結合できる。明らかに、LDL−Rレベルの低下はLDL−Cの代謝を減少させ、抗コレステロール血症をもたらす場合があることが予測される。
約900万人のアメリカ人が、PCSK9阻害剤が(特にスタチンとの併用の際に)有益である可能性のある心臓に関連する問題の高いまたは非常に高いリスクを有している。PCSK阻害剤は特定の病態でスタチンを置換する可能性を有するように広範な用途をもたらす可能性がある。PCSK9は、コレステロールのホメオスタシスに作用するため医学的に重要である。PCSK9の生物学的作用を阻害する薬剤は、(LDL‐Rの利用能、および結果的にLDL−Cクリアランスを増大させることにより)、低密度リポタンパク質コレステロール(LDL−C)レベルの循環を少なくすると考えられている。このような薬剤は、ヒトにおいて安全性および有効性を評価し、心疾患の予後を改善できるかどうかを決定するために第III相臨床試験を開始している。
LDL−R/PCSK9複合体の形成を阻害する薬剤は、商業的に入手可能なコレステロール降下剤(たとえばスタチン)よりもコレステロールを非常に少なくすることが示唆されている。またこのことは、コレステロールの上昇により引き起こされる心臓発作および他の疾患を少なくすることが生物学的にも妥当である。現在進行中の第III相臨床試験を含むヒトでの試験は、PCSK9阻害が実際に、許容可能な副作用を伴いながら心血管疾患を低減するかどうかに焦点が当てられている(Lopez D.,“Inhibition of PCSK9 as a novel strategy for the treatment of hypercholesterolemia” Drug News Perspect.21(6):323−e30 (2008);Steinberg et al.,“Inhibition of PCSK9:a powerful weapon for achieving ideal LDL cholesterol levels” Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.106(24):9546−9547 (2009);Mayer,“Annexin A2 is a C−terminal PCSK9−binding protein that regulates endogenous low density lipoprotein receptor levels” J.Biol.Chem.283(46):31791−31801 ((2008);およびAnonomyous,“Bristol−Myers Squibb selects Isis drug targeting PCSK9 as development candidate for prevention and treatment of cardiovascular disease” Press Release.FierceBiotech.2008−04−08)。
現在、PCSK9抗体薬剤は臨床試験の段階にあることが報告されている(たとえばSanofi/Regeneron,Amgen,Pfizer,Novartis,Roche)。しかしながら、抗体療法の欠点の1つは、投与が皮下注射または静脈内注射により実施される点である。LRL−Rと相互作用し、したがって、LDL−R/PCSK9複合体の形成を阻害する触媒ドメインの近くのPCSK9に結合する多くのモノクローナル抗体は、現在臨床試験の段階にある。これらの抗体として、AMG145(Amgen)、1D05−IgG2(Merck & Co.)およびSAR236553/REGN727(Aventis/Regeneron)が挙げられる(Lambert et al,“The PCS 9 decade” J.Lipid Res.53(12):2515−2524 (2012))。
LDL−RのEGF−Aドメインを模倣するペプチドは、LDL−R/PCSK9複合体の形成を阻害するために開発されてきた(Shan et al.,“PCS 9 binds to multiple receptors and can be functionally inhibited by an EGF−A peptide”.Biochem.Biophys.Res.Commun.375(1):69−73 (2008))。EGF−A結合部位のペプチドPCSK9阻害剤は、リニアおよびジスルフィドー条件付き段階−表示ペプチドライブラリーの両方をスクリーニングすることにより同定した。この手法は、LDL受容体の天然の結合ドメインの構造上の模倣物を含む13のアミノ酸ペプチド(Pep2−8)を同定した。ペプチド阻害剤結合部位は、EGF(A)ドメインの結合部位と大きく重なるように決定され、したがって、Pep2−8は、LDL受容体結合の競合阻害剤として作用する。これは、抗‐PCSK9モノクローナル抗体の阻害機構と類似し、また、PCSK9とLDL受容体−EGF(A)の相互作用を妨害する(Zhang et al.,“Identification of a Small Peptide That Inhibits PCSK9 Protein Binding to the Low Density Lipoprotein Receptor’ J Biol Chem 289:942−955 (2014))。
PCSK9アンチセンスオリゴヌクレオチド(Isis Pharmaceuticals)は、マウスにおいてLDL−Rの発現を増大し、循環する総コレステロールレベルを減少することが示されている(Graham et al.,“Antisense inhibition of Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin Type 9 reduces serum LDL in hyperlipidemic mice” J.Lipid Res.48(4):763−767 (2007))。ロックド核酸(Santaris Pharma)が、マウスのPCSK9mRNAレベルを低減したことも報告されている(Gupta et al.,“A locked nucleic acid antisense oligonucleotide (LNA) silences PCSK9 and enhances LDLR expression in vitro and in vivo” PLoS ONE 5(5):e10682 (2010);およびLindholm et al.,“PCSK9 LNA antisense oligonucleotides induce sustained reduction of LDL cholesterol in nonhuman primates”.Mol.Ther.20(2):376−381 (2012)。RNAi(ALN−PCS,Alnylam Pharmaceuticals)の初期の臨床試験は、LDL−R/PCSK9複合体の形成を阻害する有効な手段として肯定的な結果を示した(Frank−Kamenetsky et al.,“Therapeutic RNAi targeting PCSK9 acutely lowers plasma cholesterol in rodents and LDL cholesterol in nonhuman primates” Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105(33):11915−11920 (2008))。
II.PCSK9アロステリック部位調節ペプチド
PCSK9の変異体は、循環コレステロールを減少または増加させることができる(Abifadel et al.,“Mutations in PCSK9 cause autosomal dominant hypercholesterolemia” Nat.Genet.34 (2):154−156(2003))。LDL−Cは、通常、肝細胞の表面でLDL−Rに結合する際に、血液から除去され、受容体リガンド複合体として肝細胞の中で内部移行する。しかしながら、PCSK9がLDL−Rに結合する際、LDL−Rは、複合LDL粒子と共に同時に分解される。しかしながら、PCSK9がLDL−Rに結合しない場合、LDL−Rは、内部移行の後に再利用され、これにより、さらにコレステロールを除去するため細胞の表面に戻される。
PCSK9の変異体は、循環コレステロールを減少または増加させることができる(Abifadel et al.,“Mutations in PCSK9 cause autosomal dominant hypercholesterolemia” Nat.Genet.34 (2):154−156(2003))。LDL−Cは、通常、肝細胞の表面でLDL−Rに結合する際に、血液から除去され、受容体リガンド複合体として肝細胞の中で内部移行する。しかしながら、PCSK9がLDL−Rに結合する際、LDL−Rは、複合LDL粒子と共に同時に分解される。しかしながら、PCSK9がLDL−Rに結合しない場合、LDL−Rは、内部移行の後に再利用され、これにより、さらにコレステロールを除去するため細胞の表面に戻される。
いくつかの実施形態では、本発明は、3〜8つの長さのアミノ酸であり、約1,300Da未満であり、LDL−R/PCSK複合体を形成するPCSK9の特質に関する調節作用を有する、合成ペプチド配列に関する。いくつかの実施形態では、合成ペプチドは、脂溶性N末端アミノ酸(たとえばフェニルアラニン)を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、PCSK9アロステリック部位に結合するペプチドの用途を考察する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、LDL−R/PCSK9複合体形成を減少させ、それにより脂質調節不全を含む様々な疾患を処置することに有益となる。いくつかの実施形態では、ペプチドは、LDL−R/PCSK9複合体形成を増加させ、それにより、LDL調節不全に関連する治療の探索および開発に有益である。
本発明の機構を理解する必要はないが、「機能獲得型」(GOF)PCSK9の変異が、限定するものではないが、高コレステロール血症を含む病態をもたらし得ると考えられている。たとえば、PCSK9アロステリック部位に結合し、細胞(たとえば肝細胞)の表面の低密度リポタンパク質受容体に対するPCSK9の低密度リポタンパク質受容体の親和性を増大させるペプチド(たとえば合成ペプチドおよび/または合成ペプチド誘導体)は、低密度リポタンパク質受容体の内部移行および分解を増大させることにより、高コレステロール血症の症状を増大させることが予測される。
本発明の機構を理解する必要はないが、「機能喪失型」(LOF)PCSK9の変異が、低密度リポタンパク質の減少を含む状態をもたらす場合があり、低コレステロール血症をもたらすことが予測され、これにより、限定するものではないが、冠動脈心疾患を含む心血管疾患のリスクを低減すると考えられている。たとえば、細胞(たとえば肝細胞)の表面の低密度リポタンパク質受容体に対するPCSK9の低密度リポタンパク質受容体結合部位の親和性を減少するPCSK9アロステリック部位に結合するペプチドは、同時に起こる低密度リポタンパク質受容体の再利用により低密度リポタンパク質の内部移行およびクリアランスを促進することにより、高コレステロール血症の症状を低減すると予想される。
PCSK9アロステリックペプチドの本開示の実施形態は、上述したLDLを制御する現在の治療上の戦略を上回るいくつかの利点を有する。たとえば、本明細書で考察される低分子PCSK9アロステリックペプチドは、これらのペプチドが、抗体投与に見られる免疫応答、または核酸投与(すなわちアンチセンスまたはロックド核酸)で見られる全身性の分解が行われることなく経口投与できる。にもかかわらず、これらの低分子ペプチドは半減期が長いため、リポソームまたは他の生分解性保護組成物などの封入剤送達システムは、抗体または核酸のいずれかよりも半減期が長くなる。
本明細書で提示されたデータは、PCSK9アロステリック部位に結合することにより媒介されるLDL−Rに結合するPCSK9の特質に関して様々な作用を有する16の合成ペプチドを例示する。たとえば、これらの合成ペプチドは、HuH7細胞におけるFACSにより測定するように、WT PCSK9/LDL−R複合体の形成を予防することにより、LDL−Rの細胞表面の発現を、60〜95%増大させることができた。特に、1つの合成ペプチド(SRX55)は、WT PCSK9/LDL−R複合体の親和性を変えることにより、LDLの細胞表面の発現を100%増大させることができた。図1を参照されたい。これらの同一の3つの合成ペプチドは、HuH7細胞におけるdil−LDLの取り込みにより測定されるように、LDL内部移行を30〜50%増大させると判定された。別の試験では、1つのペプチドは、HepG2細胞におけるdil−LDLの取り込みにより測定されるように、GOF PCSK9−D374Yの活性を100%、HuH7細胞におけるdil−LDLの取り込みにより測定されるように、示される4つのペプチドの活性を20〜30%阻害できた。
特に、本データは、PCSK9にペプチドを結合することにより、LDLRの細胞表面レベルを調節するPCSK9アロステリック合成ペプチドの特質を示す。図1を参照されたい。この実験では、肝細胞培養モデル(HuH7細胞)のLDLRレベルを、実施例IIIにしたがってFACS(fluorescence activated cell sorting)により測定した。細胞表面のLDLRは、LDLRの基礎レベルのパーセンテージとして記録されており、上部のグラフのCnt_Amm.Bic、Cnt_Ac.Acid、およびCntのバーにより示される。図1(上部パネル)を参照されたい。外因性PCSK9の存在下でのLDLRレベルは、WT_Amm.Bic、WT−Ac.Acid、およびWTとして示され、試験ペプチドと併用した外因性PCSK9は、SRX##として示される。測定したLDLRレベルは、それぞれのグループの%対基礎対照(Cnt)として記録される。LDLR細胞表面を陽性的に調節する(増加する)ペプチド(たとえばアロステリック合成阻害剤ペプチド)の例として、SRX55、SRX56、SRX60、およびSRX62が挙げられ、LDLR細胞表面レベルを陰性的に調節する(減少する)例示的なペプチド(たとえばアロステリック合成エンハーサーペプチド)として、SRX69、SRX72、およびSRX73が挙げられる。これを、パーセント阻害としてさらに示し(%阻害は、[SRX−WT]/[Cnt−WT]×100%で計算した)、LDLRレベルの陽性調節(増加)は、陽性%阻害として記録し、LDLRレベルの陰性調節(減少)は、陰性%阻害として記録する。図1(下部パネル)を参照されたい。
PCSK9:LDLR複合体へのリガンドの結合による肝細胞のLDL内部移行を調節する特質は、図2〜7に例示される。LDLの内部移行を、外因性PCSK9存在なし(Cnt)、外因性PCSK9(正常なPCSK9=WT、D374Y変異体PCSK9=DY)の存在する中、またはPCSK9および試験ペプチドの存在する中(単一ペプチドの結果がグラフに示される場合、SRX##またはSRXと表される)での蛍光的にタグ付したLDL分子(dil−LDL)の取り込みにより測定した。
dil−LDL%取り込み対Cntにより記録されるように、LDL内部移行は、試験SRXペプチドの存在する中、モデルとなる肝細胞株(HuH7)で調節できる。図2(上部パネル)を参照されたい。LDLの内部移行は、SRX55、SRX56、SRX60、およびSRX67などのアロステリック合成阻害剤ペプチドにより陽性的に調節(増大)されることが示された。LDLの内部移行は、SRX36、SRX61、SRX64、SRX65、SRX66、およびSRX73などのアロステリック合成エンハーサーペプチドにより陰性的に調節(減少)できる。パーセント阻害は、LDLの内部移行における陽性調節(増加)が、>0%阻害と記録され、LDLの内部移行における陰性調節(減少)が、<0%阻害と記録されることを示す。図2(下部パネル)を参照されたい。
dil−LDL%取り込み対Cntにより記録されるように、LDLの内部移行は、臨床的に関連する病理学的な機能獲得型D374Y外因性PCSK9(DY)と組み合わせた試験SRXペプチドの存在により、モデルとなる肝細胞株(HuH7)で調節できる。図3(上部パネル)を参照されたい。LDLの内部移行は、SRX55、SRX56、SRX60、SRX63、SRX64、およびSRX66などのアロステリック合成阻害剤ペプチドにより陽性的に調節(増大)することが示された。LDLの内部移行は、SRX36、SRX71、SRX72、およびSRX73などのアロステリック合成エンハーサーペプチドにより陰性的に調節(減少)できる。パーセント阻害は、LDLの内部移行における陽性調節(増大)が、>0%阻害と記録され、LDLの内部移行における陰性調節(減少)が、<0%阻害と記録されることを示す。図3(下部パネル)を参照されたい。
dil−LDL%取り込み対Cntにより記録されるように、LDLの内部移行は、臨床的に関連する病理的機能獲得型D374Y PCSK9(DY)と組み合わせたアロステリック合成阻害剤ペプチド(SRX55、SRX60、SRX66およびSRX56)の存在により陽性的に調節(増大)できる。SRX55は、用量依存性の方法で陽性的な調節を伴うことを示した。図4(上部パネル)を参照されたい。パーセント阻害は、LDLの内部移行における陽性調節(増大)が、>0%阻害と記録され、ただし11.1μMのSRX55は、0%のサンプリングノイズの範囲内にあることを示す。図4(下部パネル)を参照されたい。
dil−LDL%取り込み対Cntにより記録されるように、LDLの内部移行は、SRX55を用いる用量依存性の方法での、臨床的に関連する病理的機能獲得型D374Y PCSK9(DY)と組み合わせた第2のモデルとなる肝細胞株(HepG2)で陽性的に調節(増大)できる。図5(上部パネル)を参照されたい。この陽性的な調節は、さらにパーセント阻害として示され、ここでLDLの内部移行における陽性調節(増大)が、>0%阻害と記録される。図5(下部パネル)を参照されたい。
dil−LDL%取り込み対Cntにより記録されるように、LDLの内部移行は、SRX55を用いる用量依存性の方法で臨床的に関連する病理的機能獲得型D374Y PCSK9(DY)または正常なPCSK9(WT)と組み合わせて予めインキュベーションする際に第2の肝細胞株(HepG2)で陽性的に調節できる。図6(上部パネル)を参照されたい。この陽性調節は、さらにパーセント阻害として示され、ここでLDLの内部移行における陽性調節(増大)が、>0%阻害と記録される。図6(下部パネル)を参照されたい。
dil−LDL%取り込みvsCntにより記録されるように、LDLの内部移行は、SRX55を用いる用量依存性の方法で、臨床的に関連する病理的機能獲得型D374Y PCSK9(DY)または正常なPCSK9(WT)と組み合わせて予めインキュベートする際に第3の肝細胞株(FL83B)で陽性的に調節(増大)できる。図7(上部パネル)を参照されたい。この陽性調節は、さらにパーセント阻害として示され、ここでLDLの内部移行における陽性調節(増大)が、>0%阻害と記録される。図7(上部パネル)を参照されたい。
最実も有効なペプチド(たとえばSRX55:化合物1)は、全てのアッセイおよびPCSK9表現型を通して一貫した桁で施した。次いで、改善型ペプチドを、予備的な解析結果に応じて設計される際に良好な薬剤様の特性を有すると予測されるよう設計した。概して、これらの改善型ペプチドの設計は、リン酸塩、硫酸塩、テトラゾール、またはカルボン酸などの負電荷極性基と共に組み込まれたC末端由来の第1の3つのアミノ酸のうちの少なくとも1つを有する。たとえば、化合物3では、極性基は、リン酸基:
化合物3:Thr−Leu−Cys(CH2−Ph)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)
を含む。
を含む。
構成アミノ酸は、通常、天然の「L」エナンチオマーと立体化学的に定義されてもよく、天然に存在する側鎖または合成側鎖を有してもよい。ペプチドの「N」末端は、自由にアルキル化、スルホン化、またはアシル化してもよい。「C」末端は、カルボン酸またはアミドとしてもよい。
多様な天然のアミノ酸および天然ではないアミノ酸も考察されてもよい。トリプトファンのインドール側鎖は、アルキル、アルコキシ、ハロ、カルボキシなどと置換して、他の類似体を形成してもよい。フェニルアラニン(phenyalanine)、チロシン、およびホモフェニルアラニンのフェニル部位は、アルキル、アルコキシ、ハロ、カルボキシなどのさらなるフェニル置換を有してもよい。セリンは、いくつかの例ではアラニンにより置換されてもよい。スレオニンは、セリンまたはアラニンにより置換されてもよい。バリン、ロイシン、およびイソロイシンは、一部の類似体と交換されてもよい。アスパラギン酸などのカルボン酸側鎖を有するアミノ酸は、アミドとして誘導体化される側鎖を有しても良い。
III.臨床療法
いくつかの実施形態では、本発明は、心血管疾患の症状を有する対象へのPCSK9アロステリック阻害剤ペプチドの投与を考察する。一実施形態では、心血管疾患は高コレステロール血症を含む。一実施形態では、心血管疾患は高血圧を含む。一実施形態では、高コレステロール血症は、低密度リポタンパク質レベルの上昇を含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、心血管疾患の症状を有する対象へのPCSK9アロステリック阻害剤ペプチドの投与を考察する。一実施形態では、心血管疾患は高コレステロール血症を含む。一実施形態では、心血管疾患は高血圧を含む。一実施形態では、高コレステロール血症は、低密度リポタンパク質レベルの上昇を含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、代謝性疾患の症状を有する対象へのPCSK9アロステリック阻害剤ペプチドの投与を考察する。一実施形態では、代謝性疾患は糖尿病を含む。
本発明の機構を理解する必要はないが、PCSK9アロステリック阻害剤合成ペプチド(たとえばSRX55)の投与が、PCSK9タンパク質の立体構造の変化を誘導し、それにより、低密度リポタンパク質受容体に対する低密度リポタンパク質結合部位の親和性が減少し、PCSK9/LDL−R複合体の形成が減少すると考えられる。PCSK9/LDL−R複合体の形成の減少は、循環LDLへの結合に関するLDL−R受容体の生物学的利用率の増加をもたらし、これによりLDL−RによるLDLの内部移行およびクリアランスを増大させる。さらに、PCSK9アロステリック阻害剤ペプチドが、肝細胞のLDL‐Rの生物学的利用率の増加をもたらすと考えられる。
A.高コレステロール血症
高コレステロール血症(Hypercholesterolemiaまたはhypercholesterolaemia)は、血液中に高いレベルのコレステロールが存在することである。これは「高脂血症」(血液中での高いレベルの脂質)および「高リポタンパク質血症」(血液中での高いレベルのリポタンパク質)の形態である(Durrington,P“Dyslipidaemia”The Lancet 362(9385):717−731)。高コレステロール血症は、概して、環境上の要因および遺伝的な要因の組み合わせによるものである。環境上の要因は、肥満および食事の選択を含む。遺伝的な要因は、通常、複数の遺伝子の相加的な作用によるものであり、場合によっては、家族性高コレステロール血症の事例などの単一の遺伝的欠損によるものであってもよい。存在する多くの二次的な原因は、2型真性糖尿病、アルコール、単クローングロブリン血症、透析、ネフローゼ症候群、閉塞性黄疸、甲状腺機能低下症、クッシング症候群、神経性食欲不振症、薬物(チアジド系利尿薬、シクロスポリン、グルココルチコイド、β遮断薬、レチノイン酸)を含む(Bhatnagar et al.,(2008)“Hypercholesterolaemia and its management”BMJ 337:a993)。遺伝的な異常は、家族性高コレステロール血症などの高コレステロール血症が全ての原因であり、PCSK9遺伝子またはLDL受容体遺伝子の常染色体優性 APOB遺伝子、常染色体劣性 LDLRAP1遺伝子、常染色体優性家族性高コレステロール血症(HCHOLA3)変異体において、1つ以上の遺伝的変異が存在する(“Hypercholesterolemia” Genetics Home Reference U.S.National Institutes of Health,ghr.nlm.nih.gov/condition=hypercholesterolemia)。高コレステロール血症の原因となる単一の変異が存在しない場合でさえ、遺伝的な素因は、ほとんど体を動かさないライフスタイル、肥満、またはアテローム生成食と併用して主要な役割を果たす(Citkowitz et al.,(2010)“Polygenic Hypercholesterolemia”.eMedicine Medscape,emedicine.medscape.com/article/121424−overview)。
高コレステロール血症(Hypercholesterolemiaまたはhypercholesterolaemia)は、血液中に高いレベルのコレステロールが存在することである。これは「高脂血症」(血液中での高いレベルの脂質)および「高リポタンパク質血症」(血液中での高いレベルのリポタンパク質)の形態である(Durrington,P“Dyslipidaemia”The Lancet 362(9385):717−731)。高コレステロール血症は、概して、環境上の要因および遺伝的な要因の組み合わせによるものである。環境上の要因は、肥満および食事の選択を含む。遺伝的な要因は、通常、複数の遺伝子の相加的な作用によるものであり、場合によっては、家族性高コレステロール血症の事例などの単一の遺伝的欠損によるものであってもよい。存在する多くの二次的な原因は、2型真性糖尿病、アルコール、単クローングロブリン血症、透析、ネフローゼ症候群、閉塞性黄疸、甲状腺機能低下症、クッシング症候群、神経性食欲不振症、薬物(チアジド系利尿薬、シクロスポリン、グルココルチコイド、β遮断薬、レチノイン酸)を含む(Bhatnagar et al.,(2008)“Hypercholesterolaemia and its management”BMJ 337:a993)。遺伝的な異常は、家族性高コレステロール血症などの高コレステロール血症が全ての原因であり、PCSK9遺伝子またはLDL受容体遺伝子の常染色体優性 APOB遺伝子、常染色体劣性 LDLRAP1遺伝子、常染色体優性家族性高コレステロール血症(HCHOLA3)変異体において、1つ以上の遺伝的変異が存在する(“Hypercholesterolemia” Genetics Home Reference U.S.National Institutes of Health,ghr.nlm.nih.gov/condition=hypercholesterolemia)。高コレステロール血症の原因となる単一の変異が存在しない場合でさえ、遺伝的な素因は、ほとんど体を動かさないライフスタイル、肥満、またはアテローム生成食と併用して主要な役割を果たす(Citkowitz et al.,(2010)“Polygenic Hypercholesterolemia”.eMedicine Medscape,emedicine.medscape.com/article/121424−overview)。
コレステロールはステロールであり、これは全ての動物が膜を構築するために利用される3つに分類される主要な脂質のうちの1つであり、したがって、すべての動物細胞により産生される。植物細胞はコレステロールを産生しない。また、ステロイドホルモン、胆汁酸、およびビタミンDの前駆体でもある。コレステロールは水に不溶であるため、タンパク質粒子(リポタンパク質)内の血液血漿に輸送される。リポタンパク質は、密度:非常に低い密度のリポタンパク質(VLDL)、中間型密度リポタンパク質(IDL)、低密度リポタンパク質(LDL)、および高密度リポタンパク質(HDL)により分類される(Biggerstaff et al.,(2004).“Understanding lipoproteins as transporters of cholesterol and other lipids” Adv Physiol Educ 28(1−4):105−6)。すべてのリポタンパク質はコレステロールを輸送するが、HDL以外の高いレベルのリポタンパク質(非HDLコレステロールと呼ばれる)、特にLDLコレステロールは、アテローム性動脈硬化症および冠動脈疾患のリスクの増加に関連する(Carmena et al.,(2004)“Atherogenic lipoprotein particles in ” Circulation 109(23 Suppl 1):III2−7)。対照的に、高いレベルのHDLコレステロールは保護的である(Kontush et al.,(2006) “Antiatherogenic small,dense HDL− guardian angel of the arterial wall?” Nat Clin Pract Cardiovasc Med 3(3):144− 153)。血液中での高いレベルの非HDLコレステロールおよびLDLは、食事、肥満、遺伝(inheritedまたはgenetic)疾患(家族性高コレステロール血症のLDL受容体変異など)の結果であってもよく、または糖尿病および甲状腺機能不全などの他の疾患の存在であってもよい。総コレステロールは、血液中のすべての脂肪量である。これらの脂肪は脂質と呼ばれる。総コレステロールを作製する異なる種類の脂質が存在する。2つの最も重要な種類は、低密度リポタンパク質(LDL)‐「悪玉」コレステロール、および高密度リポタンパク質(HDL)‐「善玉」コレステロールである。コレステロール、特に「悪玉」コレステロール(LDL)が高いと、動脈を妨害する場合がある。これは、心臓への血液の流れを低減し得る。高コレステロールは、心疾患、脳卒中、または心臓発作をもたらす場合がある。コレステロールは、デシリットル当たりのミリグラム(mg/dL)で測定される。心疾患または糖尿病などの病態では、LDLコレステロールは、100mg/dL未満のままとすべきである。心疾患のリスクがある場合、LDLコレステロールは、130mg/dL未満であるべきである。一般的に、LDLコレステロールは、160〜190mg/dL未満である。あるいは、HDL「善玉」コレステロールは高くあるべきである。たとえば、HDLレベルは、40mg/dL超であるべきであり、HDLレベルは、女性では50mg/dL超であるべきである。
高コレステロール血症の1つの症状は、アテローム性動脈硬化症を引き起こす可能性のある血清コレステロールの長期間にわたる上昇を含む(Bhatnagar et al.,(2008) “Hypercholesterolaemia and its management” BMJ 337:a993)。数十年の期間にわたり慢性的に上昇した血清コレステロールは、動脈にアテローム性プラークを形成するよう構築する。これは、関与する動脈の進行性の狭窄(閉塞)またさらには完全な閉塞(阻害)を引き起こす可能性がある。あるいは、より小さなプラークは血塊を破裂させ、血塊を引き起こすことにより、血流を形成し、閉塞する場合がある(Finn AV,Nakano M,Narula J,Kolodgie FD,Virmani R (July 2010).“Concept of vulnerable/unstable plaque” Arterioscler.Thromb.Vase.Biol 30(7):1282−1292)。冠動脈の突然の閉塞は、心筋梗塞または心臓発作をもたらす。脳へ供給する動脈の閉塞は脳卒中を引き起こす場合がある。狭窄または閉塞の発症は、組織へ供給が緩慢になり、臓器が機能不全となるまでゆっくりと臓器を縮小する。組織虚血(血液供給の限定)が限定するものではないが、脳の一時的な虚血(一般的に一過性脳虚血発作とも呼ばれる)を含む特定の症状として現れ得るこの時点で、視覚の一時的な喪失、眩暈および平衡感覚の障害、失語症(発話が困難)、不全麻痺(脱力)、および知覚異常(しびれまたは刺痛)が、通常身体の片側に現れ得る。心臓への不十分な血液供給により胸の疼痛が現れる場合があり、眼の虚血により、一過性の片目の視覚喪失が現れる場合がある。脚への不十分な血液の供給により、歩行の際に腓腹筋痛が現れる場合があり、食事を行った後腸に腹痛が現れる場合がある(Grundy et al.,(1998) “Primary prevention of coronary heart disease:guidance from Framingham:a statement for healthcare professionals from the AHA Task Force on Risk Reduction.American Heart Association” Circulation 97(18):1876−1887)。
B.低コレステロール血症
低コレステロール血症は、血液(‐血症)で異常に低い(ハイポ−)レベルのコレステロールが存在することである。高い総コレステロールの存在(高コレステロール血症)は、心血管疾患と相関するにも関わらず、体内でのコレステロールの産生の欠損は、同様に有害な結果をもたらす可能性がある。コレステロールは、哺乳類の細胞膜に必須の成分であり、適切な膜の透過性及び流動性を確立するために必要である。平均コレステロールレベルより低いレベルが直接的に有害であるかどうかは明らかではなく、しばしば特定の疾患で見受けられる。
低コレステロール血症は、血液(‐血症)で異常に低い(ハイポ−)レベルのコレステロールが存在することである。高い総コレステロールの存在(高コレステロール血症)は、心血管疾患と相関するにも関わらず、体内でのコレステロールの産生の欠損は、同様に有害な結果をもたらす可能性がある。コレステロールは、哺乳類の細胞膜に必須の成分であり、適切な膜の透過性及び流動性を確立するために必要である。平均コレステロールレベルより低いレベルが直接的に有害であるかどうかは明らかではなく、しばしば特定の疾患で見受けられる。
低コレステロールが起こり得る原因として、限定するものではないが、スタチン、甲状腺機能亢進症もしくは甲状腺機能亢進、副腎不全、肝疾患、セリアック病、栄養不良などの吸収障害(腸からの不適切な栄養吸収)、無βリポタンパク質血症(50mg/dl未満のコレステロールの測定値をもたらす遺伝性疾患)、低βリポタンパク血症(50mg/dl未満のコレステロールの測定値をもたらす遺伝性疾患)、マンガン欠乏症、スミス‐レムリ‐オピッツ症候群、マルファン症候群、白血病および他の血液疾患が挙げられる。
人口統計上の研究から、低コレステロールが、主にうつ病、癌、出血性卒中、大動脈解離、および呼吸器疾患による死亡率の増加に関連することが示唆されている(Jacobs et al.,(1992).“Report of the Conference on Low Blood Cholesterol:Mortality Associations” Circulation 86 (3):1046−1060;and Suarez E.C.,(1999) “Relations of trait depression and anxiety to low lipid and lipoprotein concentrations in healthy young adult women”.Psychosom Med 61(3):273−279.)。また低コレステロールレベルを引き起こすものがすべて死亡率をもたらし、低コレステロールが単純に健康不良のマーカーである可能性もある。
C.糖尿病
2,000万人超のアメリカ人が糖尿病を罹患している。4,000万人を超えるアメリカ人が、(大抵2型糖尿病を発症する前段階である)糖尿病前症を有している。糖尿病は、通常、血液中に高いレベルの糖が存在する生涯にわたる(慢性)疾患である。インシュリンは、血糖を制御する脾臓により産生されるホルモンである。糖尿病は、非常に少ないインシュリン、インシュリンに対する抵抗性、またはその両方により引き起こされる場合がある。糖尿病を理解するために、まず食物の消化およびエネルギーのための身体での使用する際の通常の工程を理解することが重要である。
2,000万人超のアメリカ人が糖尿病を罹患している。4,000万人を超えるアメリカ人が、(大抵2型糖尿病を発症する前段階である)糖尿病前症を有している。糖尿病は、通常、血液中に高いレベルの糖が存在する生涯にわたる(慢性)疾患である。インシュリンは、血糖を制御する脾臓により産生されるホルモンである。糖尿病は、非常に少ないインシュリン、インシュリンに対する抵抗性、またはその両方により引き起こされる場合がある。糖尿病を理解するために、まず食物の消化およびエネルギーのための身体での使用する際の通常の工程を理解することが重要である。
食物を消化する際にいくつかの事象が行われる。グルコースと呼ばれる糖が血液中に入る。グルコースは、身体の燃料の供給源である。膵臓と呼ばれる臓器はインシュリンを作製する。インシュリンの役割は、血液から、グルコースを燃料として使用できる筋肉、脂肪、および肝細胞の中へグルコースを移動させることである。
糖尿病を伴う患者の身体は、エネルギーを貯蔵する脂肪、肝臓、および筋肉の細胞へ糖を移動することができないため、高血糖を有する。これは、脾臓が十分なインシュリンを作製していないか、細胞がインシュリンに正常に応答していないかのいずれかによるものである。
主に2つの種類の糖尿病が存在する。原因およびリスク因子はそれぞれの種類により異なる。1型糖尿病はいずれの年齢でも発症する場合があるが、大部分は、小児、10代、または若年で診断される。この疾患では、身体でインシュリンがほとんどまたは全く作製されない。毎日インシュリンを注射することが必要である。正確な原因は知られていない。2型糖尿病は、糖尿病の大部分の事例を作製している。多くの場合成年で発症する。しかしながら肥満率が高いために、現在は10代または若年でも2型糖尿病と診断されている。2型糖尿病を伴う多くの人々が、2型糖尿病を発症していることを認識していない。
妊娠性糖尿病は、糖尿病を有していない女性が妊娠している最中のいずれかの時点で発症する高血糖である。
糖尿病の症状は、高血糖からもたらされ得、限定するものではないが、霧視、過度の口渇、疲労、空腹感、多尿、および体重の減少が挙げられる。
IV.医薬組成物
本発明は、医薬組成物(たとえば上述したペプチドを含む)をさらに提供する。本発明の医薬組成物は、局所的または全身的な処置が必要とされているか、および処置される領域に応じて多くの方法で投与される。投与は、局所的(眼、ならびに膣および直腸での送達含む粘膜での投与を含む)、肺性(たとえば、ネブライザーによるものを含む粉体もしくはエアロゾルの吸引もしくはガス注入;気管内、鼻腔内、上皮性、および経皮性投与)、経口または非経口であってもよい。非経口投与として、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、筋肉内の注射もしくは注入;または頭蓋内(たとえば髄腔内もしくは脳室内)投与が挙げられる。
本発明は、医薬組成物(たとえば上述したペプチドを含む)をさらに提供する。本発明の医薬組成物は、局所的または全身的な処置が必要とされているか、および処置される領域に応じて多くの方法で投与される。投与は、局所的(眼、ならびに膣および直腸での送達含む粘膜での投与を含む)、肺性(たとえば、ネブライザーによるものを含む粉体もしくはエアロゾルの吸引もしくはガス注入;気管内、鼻腔内、上皮性、および経皮性投与)、経口または非経口であってもよい。非経口投与として、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、筋肉内の注射もしくは注入;または頭蓋内(たとえば髄腔内もしくは脳室内)投与が挙げられる。
局所投与用の医薬組成物および医薬製剤は、経皮パッチ、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、座薬、スプレー、液剤、および粉体を含んでも良い。従来の薬学的なキャリアー、水性、粉体、または油性の基剤、増粘剤などが、必要であるか、または望ましい場合がある。
経口、舌下、または頬側の投与用の化合物および製剤は、粉体または顆粒、水もしくは非水性媒体の懸濁剤もしくは溶液、カプセル、ゲル、ドロップ、ストリップ剤、ガム、小袋、または錠剤を含む。増粘剤、芳香剤、希釈剤、乳化剤、分散剤、または結合剤が望ましい場合がある。
非経口、髄腔内、脳室内の投与用の組成物および製剤は、緩衝剤、希釈剤、ならびに限定するものではないが、浸透促進剤、キャリアー化合物および他の薬学的に許容可能なキャリアーもしくは賦形剤などの他の適切な添加剤を含んでもよい。
本発明の医薬組成物は、限定するものではないが、溶液、エマルジョン、およびリポソーム含有製剤を含む。これらの組成物は、限定するものではないが、予め形成した液剤、自己乳化する固体、および自己乳化する半固体を含む様々な成分から作製されてもよい。
いくつかの実施形態では、本医薬組成物は、他の薬剤、ホルモン、および/またはペプチドをさらに含んでもよい。たとえば、本医薬組成物はスタチン剤をさらに含んでもよい。スタチン(またはHMG−CoAレダクターゼ阻害剤)は、肝臓のコレステロールの産生する役割を持つ酵素HMG−CoAレダクターゼを阻害することによりコレステロールレベルを低下させるために使用する薬剤に分類される。コレステロールレベルの増加は、心血管疾患に関連するとされており、したがって、スタチンはこれら疾患の予防に使用されている(Lewington et al.,“Blood cholesterol and vascular mortality by age,sex,and blood pressure:a meta−analysis of individual data from 61 prospective studies with 55,000 vascular deaths” Lancet 370(9602):1829−1839 (2007))。研究から、スタチンが、二次的な予防方法として心血管疾患(CVD)を処置するために最も有効であり、コレステロールの上昇に疑問のある利点を伴うが、従来のCVDを伴うものではないことが見出されている(Taylor et al.“Statins for the primary prevention of cardiovascular disease”.I Taylor,Fiona.Cochrane Database Syst Rev (1) (2011))。スタチンは、まれではあるが重篤な副作用、特に筋肉の損傷を有する。
スタチンの特定の例として、限定するものではないが、アトルバスタチン(Lipitor(登録商標)およびTorvast(登録商標))、フルバスタチン(Lescol(登録商標))、ロバスタチン(Mevacor(登録商標)、Altocor(登録商標)、Altoprev(登録商標))、プラバスタチン(Livalo(登録商標)、Pitava(登録商標))、プラバスタチン(Pravachol(登録商標)、Selektine(登録商標)、Lipostat(登録商標))、ロスバスタチン(Crestor(登録商標))およびシンバスタチン(Zocor(登録商標)、Lipex(登録商標))が挙げられる。スタチンおよびエゼチミブ/シンバスタチンなどの別の薬剤を組み合わせたいくつかの調製物もまた利用可能である。
心血管治療薬の特定の例として、限定するものではないが、プロプラノロール、ジギタリス、アムロジピンベシル酸塩、およびニフェジピンが挙げられる。
他の医薬組成物の特定の例として、限定するものではないが、エゼチミブ(exetimibe)(Zetia(登録商標))、アムロジピンベシル酸塩、(Norvasc(登録商標))、ナイアシン、シタグリプチン(Januvia(登録商標))、メトホルミンまたはオルリスタット(Alli(登録商標)/Xenical(登録商標))が挙げてもよい。
本発明の医薬組成物は、単位剤形にて簡便な状態で存在してもよく、医薬産業に良く知られている従来技術にしたがって調製されてもよい。このような技術は、薬学的なキャリアーまたは賦形剤と活性成分の会合を引き起こすステップを含む。一般的に、製剤は、液体キャリアーまたは細かく分割した固体キャリアーまたはその両方と活性成分の均一かつ密接な会合をもたらし、必要に応じて生成物の形状を整えることにより調製される。
本発明の組成物は、限定するものではないが、錠剤、カプセル、液体シロップ、軟性ゲル、座薬および浣腸剤などの多くの可能な剤形のいずれかに製剤化されてもよい。また本発明の組成物は、水性、非水性、または混合型媒体の懸濁剤として製剤化されてもよい。水性懸濁剤は、たとえば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および/またはデキストランを含む、懸濁剤の粘性を増大させる物質をさらに含んでもよい。また懸濁剤は安定化剤を含んでもよい。
本発明の一実施形態では、本医薬組成物は泡として製剤化し、使用してもよい。薬学的な泡は、限定するものではないが、エマルジョン、マイクロエマルジョン、クリーム、ゼリー、およびリポソームなどの製剤を含む。基本的に、本来類似するこれらの製剤は、最終生成物の組成および整合性の点で異なる。
本発明の組成物は、医薬組成物で従来見出されている他の調節成分をさらに含んでもよい。したがって、たとえば本組成物は、鎮痒薬、収斂薬、局麻剤もしくは抗炎症剤などの追加的であり適合可能な薬学的活性物質を含んでも良く、または色素、芳香剤、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤、および安定剤などの本発明の組成物の多様な剤形を物理的に製剤化する際に有益な追加的な物質を含んでもよい。しかしながら、このような物質は添加する際に、本発明の組成物の成分の生物学的な活性を不当に妨害すべきではない。本製剤は、安定化させることができ、必要に応じて、たとえば本製剤の活性薬学的成分と有害な相互作用を行わない潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響する塩、緩衝剤、着色剤、芳香剤および/または香料などといった補助剤と混合できる。
用量は、数日間から数か月間持続する処置工程の中で、または治癒に影響を与えるか、もしくは疾患状態の低減が達成されるまで、処置すべき疾患状態の重症度および応答性に依存する。最適な用量スケジュールは、患者の体内での薬剤の蓄積の測定値から計算できる。投与する医師は、最適用量、用量方法および反復率を容易に決定できる。最適用量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対効力に応じて変動してもよく、一般的に、in vitroおよびin vivoの動物モデルで有効であると見出されたEC50に基づき、または本明細書に記載されるペプチドに基づき評価できる。一般的に、用量は、0.1μg〜100g/kg体重であり、毎日、毎週、毎月、毎年1回以上投与されてもよい。処置する医師は、体液または組織中の薬剤の測定した滞留時間および濃度に基づき投与するための反復率を推定できる。処置が成功した後、疾患状態の再発を予防する維持療法を対象に経験させることが望ましい場合があり、この際ペプチドを、毎日1回以上〜20年ごとに1回、0.01μg〜100g/kg体重の範囲の維持用量で投与する。
実験
実施例I
細胞培養および遺伝子導入
内在性 PCSK9を欠損するHepG2/shPCSK9またはHuH7/shPCSK9細胞(1)を、12ウェルマイクロプレート(Greiner Bio−One)中、1×105細胞/ウェルで播種した。次いでこれらの細胞を、50μMの各ペプチド(必要に応じて50μM以下の最も活性するペプチド)と4時間予めインキュベートしたかまたはしていないV5−タグ付PCSK9またはその機能獲得型PCSK9−D374Yのいずれかを0.7μg/ml用いて、4時間または一晩インキュベートした。次いでこの細胞を、1%ノニデットP−40、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、1×コンプリート プロテアーゼインヒビター混合物(Roche Applied Science)を補充した0.1%SDSを含有する1×RIPA緩衝液(150mM NaCl、50mM Tris−HC1、pH8.0)で溶解し、ウェスタンブロットで解析した。
実施例I
細胞培養および遺伝子導入
内在性 PCSK9を欠損するHepG2/shPCSK9またはHuH7/shPCSK9細胞(1)を、12ウェルマイクロプレート(Greiner Bio−One)中、1×105細胞/ウェルで播種した。次いでこれらの細胞を、50μMの各ペプチド(必要に応じて50μM以下の最も活性するペプチド)と4時間予めインキュベートしたかまたはしていないV5−タグ付PCSK9またはその機能獲得型PCSK9−D374Yのいずれかを0.7μg/ml用いて、4時間または一晩インキュベートした。次いでこの細胞を、1%ノニデットP−40、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、1×コンプリート プロテアーゼインヒビター混合物(Roche Applied Science)を補充した0.1%SDSを含有する1×RIPA緩衝液(150mM NaCl、50mM Tris−HC1、pH8.0)で溶解し、ウェスタンブロットで解析した。
実施例II
ウェスタンブロット解析
細胞溶解物中のタンパク質を、10%Tris−グリシン SDS−PAGEにより分解した、ゲルをフッ化ポリビニリデン(PVDF、Perkin Elmer Life Sciences)膜(GE Healthcare)にブロッティングし、5%超の非脂肪ミルクを含むTBS−T(50mM Tris−HCl、pH7.5、150mM NaCl、0.1%Tween20)中で1時間ブロッキングし、自家製のポリクローナルPCSK9抗体(1:1000)(13)、ヒトLDLR抗体(1:1000、R&D Systems)、βアクチン((1:5000;Sigma)およびモノクローナル抗体(mAb)V5−HRP(1:5000;Sigma)で免疫ブロッティングした。適切なセイヨウワサビペルオキシダーゼ共役型二次抗体(1:10000、Sigma)を、ECL Plusキット(GE Healthcare)を使用して、化学発光を高めた状態での検出に使用したタンパク質バンドの定量化は、Image Jソフトウェアを使用して入手した。
ウェスタンブロット解析
細胞溶解物中のタンパク質を、10%Tris−グリシン SDS−PAGEにより分解した、ゲルをフッ化ポリビニリデン(PVDF、Perkin Elmer Life Sciences)膜(GE Healthcare)にブロッティングし、5%超の非脂肪ミルクを含むTBS−T(50mM Tris−HCl、pH7.5、150mM NaCl、0.1%Tween20)中で1時間ブロッキングし、自家製のポリクローナルPCSK9抗体(1:1000)(13)、ヒトLDLR抗体(1:1000、R&D Systems)、βアクチン((1:5000;Sigma)およびモノクローナル抗体(mAb)V5−HRP(1:5000;Sigma)で免疫ブロッティングした。適切なセイヨウワサビペルオキシダーゼ共役型二次抗体(1:10000、Sigma)を、ECL Plusキット(GE Healthcare)を使用して、化学発光を高めた状態での検出に使用したタンパク質バンドの定量化は、Image Jソフトウェアを使用して入手した。
実施例III
FACS解析
HuH7/shPCSK9細胞を、50μM(または最も活性したペプチドでは50μM以下)で使用する例示的なペプチドのそれぞれと、予めインキュベートするかまたはしていないPCSK9と、上述のように37℃で4時間インキュベートした(Benjannet et al.,“Effects of the prosegment and pH on the activity of PCS 9:evidence for additional processing events” J Biol Chem.285(52):40965−40978 (2010))。
FACS解析
HuH7/shPCSK9細胞を、50μM(または最も活性したペプチドでは50μM以下)で使用する例示的なペプチドのそれぞれと、予めインキュベートするかまたはしていないPCSK9と、上述のように37℃で4時間インキュベートした(Benjannet et al.,“Effects of the prosegment and pH on the activity of PCS 9:evidence for additional processing events” J Biol Chem.285(52):40965−40978 (2010))。
この細胞を、溶液A(0.5%のウシ血清アルブミン(Sigma)および1g/リットルのグルコースを含むカルシウム/マグネシウムフリーダルベッコPBS(Invitrogen))で3回洗浄した。次いでこの細胞を1×バーセネート液(Invitrogen)と共に、室温で10分間インキュベートし、類で、5mlの溶液Aを添加した。次いで細胞をヒトLDLR mAb−C7(1:100;Santa Cruz Biotechnology)を含む溶液Aの中で40分間インキュベートした。洗浄した後、細胞を二次抗体(Alexa Fluor 647 ロバ抗マウス抗体;1:250;Molecular Probes)を含む溶液Aの中で20分間インキュベートした。
0.2%のヨウ化プロピジウムを含むPBSで懸濁した後、細胞を、FACS BD LSR(BD Biosciences)を使用して、Alexa Fluor 647を伴う肝細胞におけるヨウ化プロピジウム(死細胞)およびLDLRに関してFACSにより解析した。
+は100μMで対照を超える>30%阻害を示す。
−は誤差の範囲内の阻害を示す。
(+)は、100μMで対照未満である>30%阻害を示す。
−は誤差の範囲内の阻害を示す。
(+)は、100μMで対照未満である>30%阻害を示す。
実施例IV
細胞dil−LDL取り込みアッセイ
HepG2、HuH7、FL83B、またはHepG2/shPCSK9、HuH7/shPCSK9、FL83B/shPCSK9などのショートヘアピン型PCSK9ノックダウン配列を遺伝子導入した細胞株などの細胞を、96ウェルプレートの中で、2×104細胞/ウェルで播種し、RPMI+10%FBSの中、37℃で培養した。約24時間後、細胞培地を吸引し、さらなる実験のためにRPMI+3−5mg/mL LPDS(Lipoprotein Deficient Serum,Millipore)培地と交換した(Benjannet et al.,“Effects of the prosegment and pH on the activity of PCSK9:evidence for additional processing events” J Biol Chem.285(52):40965−40978 (2010))。
細胞dil−LDL取り込みアッセイ
HepG2、HuH7、FL83B、またはHepG2/shPCSK9、HuH7/shPCSK9、FL83B/shPCSK9などのショートヘアピン型PCSK9ノックダウン配列を遺伝子導入した細胞株などの細胞を、96ウェルプレートの中で、2×104細胞/ウェルで播種し、RPMI+10%FBSの中、37℃で培養した。約24時間後、細胞培地を吸引し、さらなる実験のためにRPMI+3−5mg/mL LPDS(Lipoprotein Deficient Serum,Millipore)培地と交換した(Benjannet et al.,“Effects of the prosegment and pH on the activity of PCSK9:evidence for additional processing events” J Biol Chem.285(52):40965−40978 (2010))。
ペプチドの活性を、i)SRXペプチド/PCSK9タンパク質複合体なし(対照、Cnt)、ii)PCSK9タンパク質;およびiii)SRXペプチド/PCSK9複合体と細胞を培養することにより評価した。また、i)野生型PCSK9(WT);ii)変異型PCSK9(たとえばD374Y変異PCSK9、DY);iii)同一の濃度および/または組み合わせの様々なSRXペプチドおよび/またはPCSK9;iv)異なる濃度および/または組み合わせのSRXペプチドおよび/またはPCSK9;v)遺伝子導入したショートヘアピン配列を用いるか、または用いることのない上述の異なる細胞の使用、vi)PCSK9およびSRXペプチドのプレインキュベーション(たとえば、1時間、2時間、3時間、4時間など);vii)限定するものでないが、体温(たとえば37℃)、超生理的温度(たとえば39℃)を含む様々な温度;およびviii)撹拌(シェーカーまたはゆっくりとした定期的なボルテックス)を行う/行わない;ことを含む、これら実験の条件の様々な前突然変異を使用した。
先行する段落に記載される条件の組み合わせの1つを使用した細胞を16時間培養した。16時間後、5μg/mLのdil−LDLの培地濃度となるように必要とされるある量のdil−LDL(1,1´−ジオクタデシル−3,3,3’,3’−テトラメチルインドカルボシアニンペルクロラートと結合した低密度リポタンパク質)を、培養ウェルに添加し、細胞をこれらの新規の条件下でさらに4時間培養し続けた。4時間のインキュベーション期間(合計20時間の細胞培養)の終わりに、細胞の取り込みを、脱イオン化し、オートクレーブした水またはPBSなどの溶媒における4%ホルムアルデヒドを含む10μM Hoechst 33342を添加して停止し、試料を20℃で20分間インキュベートした。
細胞試料をPBSで2回すすぎ、次いで蛍光度を励起時の360nmおよび発光時の460nm時で測定して、DNA含量を測定した。次いで細胞試料を、0.1%のSDSを含む0.1N NaOHでインキュベートしながら、10分間振盪した。dil−LDLを含む試料の蛍光を、励起時の530nmおよび結果として得られる発光時の580nmで測定した。
dil−LDLRの蛍光測定を、評価した細胞数に対して正規化し、Hoechstの蛍光から決定した。データを、異なる実験条件で解析し、Cnt試料のパーセンテージ相対蛍光単位(RFU)として記録した。パーセント阻害を、[(SRX:RFU)−(PCSK9−非ペプチド:RFU)]/[(PCSK9−非ペプチド:RFU)−(Cnt:RFU)]×100として表すように、Cnt試料のRFUに対するPCSK9‐非ペプチドの差異により除算したPCSK9‐非ペプチドのRFUに対するペプチドに曝露した試料のRFUの差異として計算した。
実施例V
PCSK9アロステリック阻害剤ペプチドの作製方法
この実施例は、本発明のペプチドの同定および合成方法を提示する(R.B.Merrifield (1963).“Solid Phase Peptide Synthesis.I.The Synthesis of a tetrapeptide”.J.Am.Chem.Soc.85 (14):2149−2154;Albericio,F.(2000).Solid−Phase Synthesis:A Practical Guide (1 ed.).Boca Raton:CRC Press,p.848.ISBN 0−8247−0359−6;and Albericio F,Carpino LA.,“Coupling reagents and activation” Methods Enzymol.
1997;289:104−126)。
PCSK9アロステリック阻害剤ペプチドの作製方法
この実施例は、本発明のペプチドの同定および合成方法を提示する(R.B.Merrifield (1963).“Solid Phase Peptide Synthesis.I.The Synthesis of a tetrapeptide”.J.Am.Chem.Soc.85 (14):2149−2154;Albericio,F.(2000).Solid−Phase Synthesis:A Practical Guide (1 ed.).Boca Raton:CRC Press,p.848.ISBN 0−8247−0359−6;and Albericio F,Carpino LA.,“Coupling reagents and activation” Methods Enzymol.
1997;289:104−126)。
すべてのペプチドを、Fmoc(9−フルオレニルメチルオキシカルボニル)ケミストリー(21st Century Biochemicals,260 Cedar Hill St.,Marlboro,MA 01752)を使用して製造した。手短に述べると、ペプチドを、ポリスチレン樹脂を使用して作製し、適切なリンカーで官能基化し、次いでこのペプチドを、Intavis RS ペプチド合成器(ドイツ)を使用して製造するか、または真空により反応物を除去する粗いガラスフリットを備えるガラスペプチド合成容器(Chemglass)を使用して手で製造する。
いずれかの場合、アミノ酸を、以下のように経時的に添加する。アミノ酸を、NMP(N−メチル−2−ピロリドン)またはDMF(ジメチルホルムアミド)のいずれかに溶解する;またこれらの溶媒を各ステップ後の樹脂の洗浄に使用する。転化するFmoc‐保護型アミノ酸をHATU(0−(7−アザベンゾトリアゾール−l−イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスファート)またはHCTU(2−(6−クロロ−1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルアミニウム・ヘキサフルオロホスファート)のいずれかを使用して活性化する。(樹脂に対して)添加する4−倍の化学量論に対して、3.95倍の過度のHATUまたはHCTUを使用して活性エステルを作製する。基剤としての8倍の過度のDIPEA(Ν,Ν−ジイソプロピルアミン)に加えて、これらの試薬は、次のアミノ酸の添加を触媒する。一旦アミノ酸が結合すると(各サイクルは、効率的な結合を保証するために二重の結合周期を含む)、樹脂を20%の無水酢酸に曝露し、次のアミノ酸を添加しない(「キャップオフ」)の任意のペプチド鎖を終端とさせる。この樹脂を、DMF(3X)、メタノール(MeOH、2X)およびDMFで再び洗浄し、2×ピペリジンを使用いしてN末端アミンに曝露し、次のアミノ酸を添加できる各結合周期の終わりにFmoc基を除去する。
各ステップの合成が完了すると、(樹脂上の)ペプチドをMeOH(3X)およびDCM(3X)を使用して乾燥させ、92%TFA、2%水、2%トリイソプロピルシラン、2%チオアニソールおよび2%エタンジチオールを使用して、室温で3〜4時間脱保護した。ペプチドを、冷たいジエチルエーテル中に沈殿させ、遠心し(2,000rpm)、ペレットを冷たいエーテルで2回洗浄した。乾燥後、ペプチドを0.1%TFA(バッファーA)を含む水に可溶化し、C18カラムを使用してRP−HPLCを受けた(バッファーB=95%アセトニトリル/0.1%TFA)。
一部のPCSK9アロステリック合成ペプチドおよびそれらの物理的な特徴を以下に列挙する。
化合物1(SRX−55):Val−Tyr−Val−Arg−Phe−Trp,計算値 m/z:868.46;観測値:869.00
化合物2:(SRX−56)β−Ala−Phe(3−CH2NH2)−Val−D−Ser(p)−Phe−Trp,計算値864.36;観測値:864.80
化合物3(SRX−60):Thr−Leu−Cys(CH2−Ph)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p),計算値 m/z:1053.39;観測値:1053.80
化合物4(SRX−61):Thr−Leu−Asp(NHCH2Ph)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p),計算値 m/z:1064.42;観測値:1064.90
化合物5:(SRX−62)Thr−Leu−Gly(CH2CH2シクロヘキシル)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p),計算値 m/z1027.46;観測値:
化合物6:(SRX−63)Thr−Leu−Hph−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p),計算値 m/z:1021.42;観測値:1022.30
化合物7:(SRX−64)Thr−Leu−Cys(CH2−Ph)−Thr−Trp(3−Me)−Ser−Ser−Ser(p),計算値 m/z:1067.40;観測値:1067.80
化合物8:(SRX−65)Val−Leu−Glu−Leu−Tyr−Trp,計算値 m/z:821.43;観測値:821.90
化合物9:(SRX−66)Leu−Asp−Leu−Phe−Phe−Ser,計算値 m/z:740.37;観測値:740.80
化合物10:(SRX−67)Ile−Leu−Asp−Leu−Ser−Tyr,計算値 m/z:722.39;観測値:722.80
化合物11:(SRX−68)Ac−Trp−Ser−Ser(p),計算値 m/z:500.13;観測値:500.15
化合物12:(SRX−69)Ac−Trp−Ala−Ser(p),計算値 m/z:484.14;観測値:484.40
化合物13:(SRX−70)Ac−Trp(5−F)−Ala−Ser(p)−モルフォリン,計算値 m/z:571.18;観測値:571.00
化合物14:(SRX−72)Ac−Tyr−Trp−Gly,計算値 m/z:466.19;観測値:466.47
化合物15:(SRX−36)Thr−Leu−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p),計算値 m/z:860.33;観測値:860.00
化合物16:(SRX−73)Phe(4−Ph)−Ala−Ser(p)−モルフォリン,計算値 m/z:548.20;観測値:548.00
化合物1(SRX−55):Val−Tyr−Val−Arg−Phe−Trp,計算値 m/z:868.46;観測値:869.00
化合物2:(SRX−56)β−Ala−Phe(3−CH2NH2)−Val−D−Ser(p)−Phe−Trp,計算値864.36;観測値:864.80
化合物3(SRX−60):Thr−Leu−Cys(CH2−Ph)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p),計算値 m/z:1053.39;観測値:1053.80
化合物4(SRX−61):Thr−Leu−Asp(NHCH2Ph)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p),計算値 m/z:1064.42;観測値:1064.90
化合物5:(SRX−62)Thr−Leu−Gly(CH2CH2シクロヘキシル)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p),計算値 m/z1027.46;観測値:
化合物6:(SRX−63)Thr−Leu−Hph−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p),計算値 m/z:1021.42;観測値:1022.30
化合物7:(SRX−64)Thr−Leu−Cys(CH2−Ph)−Thr−Trp(3−Me)−Ser−Ser−Ser(p),計算値 m/z:1067.40;観測値:1067.80
化合物8:(SRX−65)Val−Leu−Glu−Leu−Tyr−Trp,計算値 m/z:821.43;観測値:821.90
化合物9:(SRX−66)Leu−Asp−Leu−Phe−Phe−Ser,計算値 m/z:740.37;観測値:740.80
化合物10:(SRX−67)Ile−Leu−Asp−Leu−Ser−Tyr,計算値 m/z:722.39;観測値:722.80
化合物11:(SRX−68)Ac−Trp−Ser−Ser(p),計算値 m/z:500.13;観測値:500.15
化合物12:(SRX−69)Ac−Trp−Ala−Ser(p),計算値 m/z:484.14;観測値:484.40
化合物13:(SRX−70)Ac−Trp(5−F)−Ala−Ser(p)−モルフォリン,計算値 m/z:571.18;観測値:571.00
化合物14:(SRX−72)Ac−Tyr−Trp−Gly,計算値 m/z:466.19;観測値:466.47
化合物15:(SRX−36)Thr−Leu−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p),計算値 m/z:860.33;観測値:860.00
化合物16:(SRX−73)Phe(4−Ph)−Ala−Ser(p)−モルフォリン,計算値 m/z:548.20;観測値:548.00
Claims (29)
- a)
i)PCSK9タンパク質であって、アロステリック調節を誘導する結合部位および低密度リポタンパク質受容体結合部位を含む、PCSK9タンパク質と、
ii)前記結合部位に結合可能な、3〜8の範囲のアミノ酸配列からなる合成リガンドと、
iii)低密度リポタンパク質受容体および低密度リポタンパク質を含む複数の肝細胞と
を提供することと、
b)前記合成リガンドを前記結合部位に結合することであって、前記合成リガンドが前記タンパク質の立体構造の変化を誘導することと、
c)前記立体構造の変化により、前記低密度リポタンパク質受容体に対する前記低密度リポタンパク質受容体結合部位の親和性を調節することと
を含む方法。 - 前記合成リガンドが、アロステリック阻害剤リガンドであり、前記調節により、前記低密度リポタンパク質受容体に対する前記低密度リポタンパク質受容体結合部位の親和性が減少し、それにより前記複数の肝細胞による前記低密度リポタンパク質の内部移行が増大する、請求項1に記載の方法。
- 前記合成リガンドがアロステリックエンハーサーリガンドであり、前記調節により、前記低密度リポタンパク質受容体に対する前記低密度リポタンパク質受容体結合部位の親和性が増大し、それにより前記複数の肝細胞による前記低密度リポタンパク質の内部移行が減少する、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質の前記立体構造の変化が、誘導適合型の変化および生体力学的な変化からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記合成リガンドが、VYVRFW、VLELYW、およびISDLSYからなる群から選択される合成ペプチドである、請求項1に記載の方法。
- 前記アロステリック阻害剤がペプチドであり、SRX55、SRX56、SRX60、SRX61、SRX62、SRX63、SRX64、SRX65およびSRX66からなる群から選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記アロステリックエンハーサーペプチドが、SRX64、SRX67、SRX68、SRX69、SRX72およびSRX73からなる群から選択される、請求項3に記載の方法。
- a)
i)PCSK9タンパク質であって、アロステリック調節を誘導する結合部位および低密度リポタンパク質受容体結合部位を誘導する結合部位を含む、PCSK9タンパク質と、
ii)前記結合部位に結合可能な、3〜8の範囲のアミノ酸配列からなる合成リガンドと、
iii)低密度リポタンパク質受容体の集合を含む複数の肝細胞と
を提供することと、
b)前記結合部位に前記合成リガンドを結合することであって、前記合成リガンドが前記タンパク質の立体構造の変化を誘導することと、
c)前記立体構造の変化により前記低密度リポタンパク質リポタンパク質受容体の前記集合を調節することと
を含む、方法。 - 前記合成リガンドが、アロステリック阻害剤リガンドであり、前記調節により、前記肝細胞の細胞表面で測定可能な前記低密度リポタンパク質受容体の前記集合が増加する、請求項8に記載の方法。
- 前記合成リガンドが、アロステリックエンハーサーリガンドであり、前記調節により、前記肝細胞の細胞表面で測定可能な前記低密度リポタンパク質受容体の前記集合が減少する、請求項8に記載の方法。
- 前記タンパク質の前記立体構造の変化が、誘導適合型の変化および生体力学的な変化からなる群から選択される、請求項8に記載の方法。
- 前記リガンドが合成ペプチドであり、VYVRFW、VLELYW、およびISDLSYからなる群から選択される、請求項8に記載の方法。
- 前記アロステリック阻害剤がペプチドであり、SRX55、SRX56、SRX60、SRX61、SRX62、SRX63、SRX64、SRX65およびSRX66からなる群から選択される、請求項9に記載の方法。
- 前記アロステリックエンハーサーがペプチドであり、SRX64、SRX67、SRX68、SRX69、SRX72およびSRX73からなる群から選択される、請求項10に記載の方法。
- 式
i)アミノ酸残基の数nが、3〜8の範囲の整数であり;
ii)構成アミノ酸が、独立して選択した天然または天然ではないアミノ酸の単一のエナンチオマーであり;
iii)R2およびR3が、独立して、水素、低級アルキル、分枝アルキル、ヒドロキシアルキル、シクロアルキル、複素環、アリール、ヘテロアリール、アシル、置換型または非置換型ベンゾイル、アルキルまたはアリール、メシル−スルホニル、トシル−スルホニルおよびカルバモイルからなる群から選択され;
iv)R1が、−OHおよび−NR4−R5からなる群から選択され;
v)R4およびR5が独立して、水素;低級アルキル、アリール、シクロアルキル、芳香複素環、ピリジン、テトラゾール、アルコキシ、シクロアルコキシからなる群から選択され;あるいは、R4およびR5が、ピペリジン;ピロリジン;モルフォリン;ピペラジン;4−メチルピペラジンなどの置換型複素環;またはジヒドロキノリンもしくはインドリンなどの縮合複素環などの複素環として結合し;vi)S1、S2、およびS3が側鎖であり、少なくとも1つの側鎖が、極性基、負電荷極性基、および陽電荷極性基から選択される、
式の化合物。 - 負電荷極性基をさらに含む、請求項15に記載の化合物。
- 前記負電荷極性基が、側鎖S1、S2、またはSnに組み込まれるO−ホスフェート、O−スルファート、5−O−、および5−N−テトラゾールからなる群のうち少なくとも1つから選択される、請求項16に記載の化合物。
- 前記側鎖のうちの少なくとも1つががホスホセリンを含む、請求項15に記載の化合物。
- 前記側鎖S1が、−CH2−NH−テトラゾールを含む、請求項15に記載の化合物。
- 極性C末端をさらに含む、請求項15に記載の化合物。
- 前記化合物が、Val−Tyr−Val−Arg−Phe−Trp、β−Ala−Phe(3−CH2NH2)−Val−D−Ser(p)−Phe−Trp、Thr−Leu−Cys(CH2−Ph)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Thr−Leu−Asp(NHCH2Ph)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Thr−Leu−Gly(CH2CH2シクロヘキシル)−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Thr−Leu−Hph−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Thr−Leu−Cys(CH2−Ph)−Thr−Trp(3−Me)−Ser−Ser−Ser(p)、Val−Leu−Glu−Leu−Tyr−Trp、Leu−Asp−Leu−Phe−Phe−Ser、Ile−Leu−Asp−Leu−Ser−Tyr、Ac−Trp−Ser−Ser(p)、Ac−Trp−Ala−Ser(p)、Ac−Trp(5−F)−Ala−Ser(p)−モルフォリン、Thr−Leu−Thr−Trp−Ser−Ser−Ser(p)、Ac−Tyr−Trp−Gly、Phe(4−Ph)−Ala−Ser(p)−モルフォリンからなる群から選択される、請求項15に記載の化合物。
- 前記化合物が、医薬組成物として製剤化される、請求項15に記載の化合物。
- 前記医薬組成物が医薬品をさらに含む、請求項22に記載の化合物。
- 前記医薬品が、スタチン、心血管治療薬、代謝薬、および高血圧治療薬からなる群から選択される、請求項23に記載の化合物。
- 前記医薬品が、エゼチミブ、アムロジピンベシル酸塩、シタグリプチン、メトホルミン、アトルバスタチン、ロスバスタチンおよびシンバスタチンからなる群から選択される、請求項23に記載の化合物。
- 前記医薬組成物が、錠剤、液剤、ゲル、カプセル、小袋、マイクロ粒子、リポソーム、ナノ粒子、塩、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、ストリップ剤、座薬、スプレー、および粉体からなる群から選択されるように製剤化される、請求項23に記載の化合物。
- 前記極性基が、シトルリンである、請求項15に記載の化合物。
- 前記極性C末端がグリシンである、請求項20に記載の化合物。
- 前記陽電荷極性基がアミドである、請求項15に記載の化合物。
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