TW201536311A - 基於毒素之治療性肽的眼科用途及其醫藥組合物 - Google Patents

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Abstract

本文揭示藉由投與包含基於毒素之治療性肽之醫藥組合物來治療諸如乾眼及葡萄膜炎之眼科病症的方法。該肽可包括位於C-端之酸或醯胺且可附接至具有陰離子電荷之有機或無機化學實體。

Description

基於毒素之治療性肽的眼科用途及其醫藥組合物 相關申請案之交叉參考
本申請案主張2013年7月22日申請之美國臨時專利申請案序號61/857,157之優先權，該案係以其全文引用之方式併入本文中。
揭示於本文中之方法係關於一種基於毒素之治療性肽尤其於治療包括乾眼及葡萄膜炎之眼科病症之用途。該基於毒素之治療性肽可包括基於ShK之肽。亦揭示包含該基於毒素之治療性肽之醫藥組合物。
眼睛的淚液分泌可保護並維持包括角膜、角膜緣、結膜、血管、及眼瞼之眼表面組織的完整性。淚液分泌對保護眼睛免受感染性因子及環境損傷影響具重要性。藉由淚液形成之液膜亦為提供平滑光學表面及維持細胞健康所必需。
一種最常見眼科病症為乾眼症候群(亦稱為乾燥性角膜結膜炎及「乾眼」)。乾眼係由會導致眼睛發炎及損傷之淚液不足或缺乏所界定。
乾眼可能具有許多種病因。例如，乾眼之暫時形式可能因眼睛創傷或感染之發炎反應所引起。其中，暫時性乾眼可(例如)在局部眼 自體免疫病症形成時變為慢性。
乾眼亦可能因全身性病症引起。例如，休格倫氏症候群(Sjogren’s syndrome)為藉由其兩種最常見症狀眼乾及口乾識別之自體免疫疾病。休格倫氏症候群會導致對眼睛及口之黏膜及水分分泌腺造成免疫系統損傷。細胞及組織損傷會導致淚液及唾液生成減少。休格倫氏症候群通常伴隨著諸如類風濕關節炎及紅斑狼瘡之其他免疫系統疾病。
針對因休格倫氏症候群引起之乾眼之當前治療包括藥品，諸如毛果芸香鹼(Pilocarpine)、環孢黴素或西維美林(Cevimeline)，這兩者在經口服用情況下主要增加唾液生成。毛果芸香鹼可呈滴眼劑形式投與，但須要考慮光瞳之收縮及癲癇類型效應之風險。
休格倫氏症候群僅為導致乾眼之病症的一個實例，其不存在無不可接受副反應下的有效治療。作為另一個實例，在美國約10%的視力受損係因葡萄膜炎(葡萄膜之發炎)所致。葡萄膜包括虹膜、睫狀體、及脈絡膜。葡萄膜炎在解剖學上最常被分類為前部、中間、後部、或瀰漫性。前部葡萄膜炎主要位於眼睛前段及包括虹膜炎及虹膜睫狀體炎。中間葡萄膜炎(亦稱為周邊葡萄膜炎)集中在緊接於睫狀體及平坦部區域中虹膜及晶狀體之後的區域，因此亦可使用替代術語「睫狀體炎」及「平坦部炎」。後部葡萄膜炎表示葡萄膜炎之許多種形式，包括視網膜炎、脈絡膜炎、及視神經炎。瀰漫性葡萄膜炎意指涉及眼睛所有部分(包括前部、中間、及後部結構)之發炎。針對於葡萄膜炎之當前治療包括主要局部應用及/或全身性類固醇治療。
在美國，約6%的葡萄膜炎病例發生在兒童中，而國際人群中2.2至33.1%的葡萄膜炎病例發生在兒童及青少年中。小兒葡萄膜炎之一種主要病因係與包括以下之自體免疫疾病相關聯：幼年特發性關節炎、反應性關節炎、僵直性脊椎炎、潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病 (Crohns disease)、兒童期類肉瘤病、及川崎病(Kawasaki disease)。小兒葡萄膜炎為兒童的主要健康問題，因為併發症包括帶狀角膜病變、青光眼、結核、白內障形成、黃斑水腫、及視神經退化。慢性葡萄膜炎會導致致病及視力損失。
本發明提供治療包括乾眼、葡萄膜炎、鞏膜炎、及眼睛之其他發炎病症之眼科病症之方法。本發明進一步提供治療全身性自體免疫疾病之眼表現(諸如表層鞏膜炎、角膜炎、視網膜血管炎、或其他涉及角膜、視網膜、鞏膜、及/或眼窩發炎之疾病)的方法。該等方法藉由投與治療有效量之包括基於毒素之治療性肽之醫藥組合物來治療眼科病症。亦提供識別將自所述治療獲益之個體之方法。
圖1提供一組顯示ShK-186對經毒胡蘿蔔素刺激之人全血中發炎性細胞激素含量之效應之四個圖。ShK-186係以劑量相依方式抑制發炎性細胞激素介白素(IL)-2、IL-17、IL-4、及干擾素(IFN)-γ。
圖2提供一組顯示ShK-186對經毒胡蘿蔔素刺激之人周邊血液單核細胞(PBMC)中發炎性細胞激素含量之效應之四個圖。ShK-186係以劑量相依方式抑制發炎性細胞激素IL-2、IL-17、IL-4、及IFN-γ。
圖3A至3D顯示依指示每天局部投與ShK-186或ShK-198三次後局部(眼睛)及全身(血漿)流體中ShK-186及ShK-198之定量。圖3A顯示發現局部投與之ShK-186以顯著濃度存於經處理之右眼(RE)之前房房水中而非存於左眼(LE)或血漿(P)中，表明藥物之眼內遞送。圖3B顯示在取自未經處理之左眼(LE)之樣本中不存在可偵測ShK-186但在經處理之右眼(RE)中存在顯著量的藥物。在給藥21天後收集樣本。圖3C顯示局部投與0.1% ShK-186或1% ShK-186持續7天導致眼睛前房中藥物濃度以濃度相依方式增加。全身暴露量低於偵測水平(未顯示)。1-1至 1-4：經鹽水媒劑處理；3-1至3-3：在P6N中之ShK-186 0.1%溶液；4-1至4-4：在P6N中之ShK-186 1%溶液。在第19天用29號針頭回收前房房水，稀釋並藉由標準ELISA方法分析。圖3D顯示每天局部投與0.1% ShK-198或1% ShK-198三次持續7天導致眼睛中藥物濃度以濃度相依方式增加。全身暴露量低於偵測水平(未顯示)。2-1至2-4：經P6N媒劑處理；5-1至5-4：在P6N中之ShK-198 0.1%溶液；6-1至6-4：在P6N中之ShK-198 1%溶液。在第19天用29號針頭回收房水，稀釋並藉由標準ELISA方法分析。
圖4A至4D顯示實驗前部葡萄膜炎模型中局部投與ShK-186之療效。圖4A：ShK-186之局部投與使得實驗自體免疫前部葡萄膜炎(EAAU)大鼠模型中之臨床得分值減小。在藉由免疫接種輔助黑色素相關抗原(MAA)乳液誘發EAAU後第11天、第13天、第15天、及第18天使用狹縫燈對每隻動物進行臨床觀察。基於光瞳功能(縮瞳)、虹膜結構、前房中細胞之存在、及前房中蛋白質之存在(光斑)來給定眼睛個別得分值。接著將得分值轉換為每天綜合臨床得分值。發現自第0至第8天每天經0.1% ShK-186處理眼睛三次及自第9至第18天每天經1% ShK-186局部處理眼睛三次之動物之綜合得分值明顯低於其等經媒劑處理者。N=8隻大鼠/16隻眼睛。圖4B：ShK-186之局部投與使得實驗自體免疫葡萄膜炎之大鼠模型中總病理減低。左圖：每天三次藉由媒劑(P6N)對動物給藥。在免疫接種後第18天，觀察到動物3-2具有13之綜合臨床得分值：縮瞳完全充滿蛋白質(得分值=4)，一些損傷充盈虹膜血管(得分值=3)，許多浸潤細胞存於前房中(得分值=4；未描繪出)，及輕度光斑(得分值=2；未描繪出)。右圖：動物自於免疫接種誘發EAAU後第0天至(且包括)第8天接受0.1% ShK186繼而在第9天開始接受1% ShK-186直到(且包括)第18天。於免疫接種後第18天，觀察到動物4-8具有0之綜合臨床得分值：正常光瞳(得分值=0)，正常虹膜 血管及結構(得分值=0)，前房中不存在可見的細胞或蛋白質(各分別為得分值=0；未描繪出)。圖4C：ShK-186之局部投與使得EAAU組織病理減低。將免疫接種輔助MAA後第19天收集至10%福馬林中之眼睛切片並利用蘇木精及伊紅染色。觀察眼睛切片及基於虹膜及睫狀體結構及發炎性細胞浸潤至虹膜及/或睫狀體及前房之基質之程度(基於Kim等人，Korean J.Ophthalmol.12,14-18(1998)中所概述之參數)由獨立獸醫病理學家來評分。(1.)對照健康眼睛(10X)；(2.)及(4.)對來自經媒劑處理之動物之眼睛給定2之組織病理學得分值(10X、40X)；(3.)及(5.)對來自每天經0.1% ShK-186處理三次持續9天接著每天經1% ShK-186處理三次持續10天之動物之眼睛給定0之組織病理學得分值(10X、40X)。(6.)基於來自媒劑處理組(P6N)或如上所示ShK-186處理組(1% ShK-186)之四隻眼睛之組織病理學分析之綜合臨床得分值。圖4D：ShK-198之局部投與使得EAAU大鼠模型中之臨床得分值減小。在藉由免疫接種輔助MAA乳液誘發EAAU後第13天使用狹縫燈對每隻動物進行臨床觀察。基於細胞存在於前房中(頂圖)、及蛋白質存在於前房或光斑(底圖)來給定眼睛個別得分值。每天利用P6N媒劑或1% ShK-198局部處理大鼠眼睛三次。N=10隻大鼠/20隻眼睛。
淚液分泌係藉由具有緊密神經連接之複雜系統來調節，此點可由對身體、環境、微生物、及情緒刺激之快速淚液分泌反應獲得證實。淚液分泌組織包括淚腺、瞼板腺、結膜杯狀細胞、及上皮細胞。淚液形成系統之完全或部分破壞會導致淚液生成不足(係一種稱為乾眼之病症)。
乾眼可能係因局部性或全身性病症引起。例如，呈局部性病症之乾眼可能係因眼表面應力所導致。此種眼睛應力可係因感染及/或發炎因子(諸如細胞激素及趨化細胞激素)之調節受到破壞所致。該種 病症可係暫時。於其他實例中，然而，在眼表面破壞期間，抗原呈現細胞(APC)可得以活化且使經過處理並呈現之自體抗原內部化，藉此促進自體免疫反應。所致組織損傷可在致使包括角膜、杯狀細胞、及上皮細胞之眼組織破壞下引起持續自體免疫反應。此種破壞會最終導致持續乾眼及發炎性眼睛疾病之其他表現。
乾眼亦可能係因包括休格倫氏症候群、眼瘢痕性類天皰瘡、及史蒂芬-強森症候群(Stevens-Johnson syndrome)之全身性自體免疫疾病所致。導致乾眼之全身性自體免疫性亦可能係起因於幹細胞移植中表現為移植物抗宿主疾病之同種異體移植。
導致乾眼之局部性及全身性自體免疫反應一般使得自體反應性T-及/或B-細胞活化。一般而言在乾眼中及更特定言之在休格倫氏症候群中，自體反應性T-細胞活化、分化、及至眼表面組織之歸巢係與包括干擾素(IFN)-γ及介白素(IL)-17之細胞激素之增加相關聯。IFN-γ改變角膜上皮細胞上之黏蛋白從而導致組織損傷及減小之杯狀細胞密度。
關於乾眼小鼠模型之實驗進一步支持T-細胞在病症之發展及病理中之作用。Stern等人(Int.Rev.Immunol.32：19-41,2013)藉由暴露於產生乾燥應力之條件來誘發小鼠乾眼。數天後，小鼠展現T-細胞浸潤及增加之細胞激素含量(IFN-γ、IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、及IL-17)。眼表面展現細胞凋亡及細胞死亡，及淚液生成減少。
衍生自該等乾眼小鼠(供者小鼠)之淋巴結及脾臟之CD4+ T-細胞係經移除並注射至T-細胞缺乏小鼠(受者小鼠)中。受者小鼠發展出與供者小鼠之其等類似的乾眼病症，包括T-細胞至眼表面組織之歸巢、增加之細胞激素含量、減低之杯狀細胞密度、減低之淚液生成及減低之淚液更換。Stern等人之結論為衍生自供者小鼠之CD4+ T-細胞足以誘發受者小鼠乾眼。該結論與觀測到活化CD4+ T-細胞位於乾眼患者 之眼表面組織中一致。
與T-細胞浸潤及活化相關聯之發炎性眼睛疾病或病症包括棘阿米巴蟲(acanthamoeba)感染、急性視網膜色素上皮炎、過敏、關節炎、細菌感染、貝塞特氏病(Behcet's disease)、貝塞特氏病相關視網膜炎、瞼炎、化學品暴露、脈絡膜炎、脈絡膜視網膜發炎、克羅恩病(Crohn's disease)、結膜炎、糖尿病性視網膜病變、乾眼、表層鞏膜炎、眼睛瘀傷、眼睛創傷、食物過敏、異物暴露、真菌感染、蕁麻疹、虹膜睫狀體炎、虹膜炎、幼年特發性關節炎、角膜炎、狼瘡、分枝桿菌感染、視神經視網膜炎、寄生蟲感染、手術後病症、後部睫狀體炎、視網膜血管炎、視網膜炎、類風濕關節炎、類肉瘤病、類肉瘤病相關視網膜炎、季節性過敏、鞏膜炎、螺旋體感染、毒素暴露、潰瘍性結腸炎、葡萄膜炎、及病毒感染。
許多種免疫相關疾病及代謝疾病(包括T-細胞介導之眼科病症)至少部分地歸因於記憶T-細胞之作用。已知記憶T-細胞之兩種類別為：中央記憶T-細胞(TCM)及效應子記憶T-細胞(TEM)。
常在罹患免疫相關疾病之患者中觀察到TEM擴增群體，及於一些情況中，此係影響調節T-細胞(Treg)之疾病之結果。Treg為抑制其他細胞(包括TEM)之免疫反應之T-細胞的一種類型。於不存在正常含量之Treg下，身體免疫反應變的無法控制並侵襲健康問題及器官。Treg功能之此種破壞會導致多種自體免疫疾病(包括眼科病症)。
於活化後，TEM上調其Kv1.3 K+離子通道表現。引起並造成損傷自體免疫過程結果之TEM係高度依賴該等Kv1.3通道以持續為活化、增殖、及細胞激素生成所需的細胞內鈣含量。因此，TEM之增殖對Kv1.3 K+通道阻斷劑敏感。Wulff等人，J.Clin.Invest.,111,1703-1713(2003)。可表現Kv1.3通道且對發炎具重要性之其他細胞類型包括巨噬細胞、樹突細胞、類別轉換記憶B-細胞、及小神經膠質細胞。
在不受理論約束下，咸信揭示於本文中之基於毒素之治療性肽可藉由阻斷Kv1.3 K+通道有效地治療乾眼及其他發炎性眼科病症(包括彼等與上調之TEM相關聯者)。因此，本發明提供使用基於毒素之治療性肽來治療諸如乾眼及葡萄膜炎之免疫介導之眼科病症之方法。該基於毒素之治療性肽提供針對於免疫介導之眼科病症之新穎治療選項，其可以比現有治療更有利的安全特性減低自體免疫相關眼睛損傷及乾眼。
基於毒素之治療性肽
用於本文所揭示方法中之基於毒素之治療性肽之特定實例結合電壓閘控通道。例示性電壓閘控通道包括Kv1.1、Kv1.2、Kv1.3、Kv1.4、Kv1.5、Kv1.6、Kv1.7、Kv2.1、Kv3.1、Kv3.2、Kv11.1、Kc1.1、Kc2.1、Kc3.1、Nav1.2、Nav1.4、及Cav1.2。
毒素肽可由多種生物體產生並已演進成與離子通道及受體結合。衍生自蛇、蠍、蜘蛛、蜜蜂、蝸牛、及海葵之天然毒素肽通常為10至80個胺基酸長且包含2至5個建立緊湊分子結構之雙硫鍵。該等肽似乎已從小數目之結構架構演進。該等肽叢集成為折疊形式之家族，其透過半胱胺酸/二硫迴路結構守恆以維持造成效價、穩定性、及選擇性結果之三維結構(Pennington等人，Biochemistry,38,14549-14558(1999)；Tudor等人，Eur.J.Biochem.，251,133-141(1998)；及Jaravine等人，Biochemistry，36,1223-1232(1997))。
如本文所用，「基於毒素之治療性肽」包括表1之基於毒素之肽(或其變體、D取代類似物、具有羧基末端之醯胺、修飾物、衍生物或醫藥上可接受之鹽)或表2之基於Shk之肽(或其變體、D取代類似物、具有羧基末端之醯胺、修飾物、衍生物或醫藥上可接受之鹽)。基於毒素之治療性肽可係合成或自然生成。
「基於毒素之肽」任包括何合成或自然界已知之毒素肽及其等 揭示於表1中之肽及其變體、D取代類似物、具有羧基末端之醯胺、修飾物、衍生物及醫藥上可接受之鹽。用於本文所揭示方法中之特定例示性基於毒素之治療性肽包括列於表1中且如序列表中以SEQ ID NO：225至256所顯示之基於毒素之肽。於各種實施例中，治療眼科病症之方法包括投與基於毒素之治療性肽，包括表1之基於毒素之肽(SEQ ID NO：225至256)。於各種實施例中，表1之基於毒素之肽(SEQ ID NO：225至256)可用於製造可治療眼科病症之醫藥組合物(或藥物)。
「ShK」肽為亦可用於本文所述方法及醫藥組合物中之毒素肽之亞型。ShK肽最初係自加勒比海葵(Stichodactyla helianthus)單離得。ShK肽充當Kv1.3通道之抑制劑。藉由抑制Kv1.3通道，ShK在某些實施例中可以皮莫耳濃度抑制TEM或藉由TEM之活化、增殖及/或細胞激素生成。
如本文所用，「抑制劑」為可減低或消除生物活性之任何基於毒 素之治療性肽，其通常基於包括生物合成及/或催化活性、受體或信號轉導路徑活性、基因轉錄或轉譯、細胞蛋白質輸送等等之化合物與受體相互作用產生。
天然ShK肽述於(例如)Pennington等人，Int.J.Pept.Protein Res.，46,354-358(1995)中。屬於本發明範疇之例示性ShK結構亦公開於Beeton等人，Mol.Pharmacol.，67,1369-1381(2005)；美國公開案第2008/0221024號；PCT公開案第WO/2012/170392號；及美國專利案號8,080,523及8,440,621中。
「基於ShK之肽」包括任何合成或自然界已知之ShK肽及其變體、D取代類似物、具有羧基末端之醯胺、修飾物、衍生物及醫藥上可接受之鹽。
與本文中所揭示方法及醫藥組合物併用之特定例示性基於ShK之肽可包括列於表2中且如序列表中以SEQ ID NO：1至224所顯示之其等。於各種實施例中，一種治療眼科病症之方法包括投與治療有效量之表2之基於ShK之肽(SEQ ID NO：1至224)。於各種實施例中，表2之基於ShK之肽(SEQ ID NO：1至224)可用於製造可治療眼科病症之醫藥組合物(或藥物)。用於本文所揭示特定實施例中之基於ShK之肽包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：210、SEQ ID NO：217、及SEQ ID NO：221之其等。
熟習此項技藝者明瞭用於設計具有改良性質之基於毒素之治療性 肽之技術，諸如丙胺酸掃描、使用已知序列及/或分子建模之基於比對介導之突變形成之合理設計。例如，基於毒素之治療性肽可經設計以移除蛋白酶裂解部位(例如，在K或R殘基處之胰蛋白酶裂解部位及/或在F、Y、或W殘基處之胰凝乳蛋白酶裂解部位)。非水解性磷酸鹽取代亦賦予對磷酸基團之穩定效應、及抗磷酸酶之穩定性。非水解性磷酸基團包括磷酸酪胺酸之膦酸鹽類似物，諸如4-膦醯基甲基苯丙胺酸(Pmp)、4-膦醯基二氟甲基苯丙胺酸(F2Pmp)、對膦醯基苯丙胺酸、單氟膦醯基甲基苯丙胺酸、磺基(二氟甲基)苯丙胺酸(F2Smp)及羥基膦醯基甲基苯丙胺酸。於其他實施例中，可使用磷酸酪胺酸擬似物，諸如(例如)OMT、FOMT及其他如Burke及Lee，Acc.Chem.Res.,36,426-433(2003)中所述使用羧酸基以複製磷酸鹽官能度之類似物。又於另一個實施例中，非水解性類似物包括甲基-、芳氧基-及硫乙基膦酸。又於另一個實施例中，非水解性磷酸鹽衍生物包括二氟亞甲基膦酸及二氟亞甲基磺酸。
為增進基於毒素之治療性肽之結構之藥物動力學及藥效動力學(PK/PD)性質，可針對於對降解性質敏感之殘基進行取代、置換、或修飾。以醯胺修飾C-端酸官能亦可賦予穩定性。該等針對基於毒素之治療性肽之一級結構之改變可與N-端處陰離子性部分組合以獲得穩定且選擇性Kv1.3阻斷劑。為了製得具有較高活體內半衰期之基於毒素之治療性肽，可製得該等肽之變體或修飾物，其中關鍵蛋白質分解消化部位可經取代以降低蛋白酶感受性。此可包括非必需殘基改由守恆電子等排替代物取代(例如，Lys替代為Lys(乙醯基)或Gln)及/或改由中性替代物(Ala)取代。
揭示於本文中之基於毒素之治療性肽之「變體」包括相較揭示於本文中之基於毒素或基於ShK之肽具有一或多個胺基酸加成、缺失、終止位置、或取代之肽。
胺基酸取代可係守恆或非守恆取代。揭示於本文中之基於毒素之治療性肽之變體可包括具有一或多個守恆胺基酸取代之其等。如本文所用，「守恆取代」包括以下守恆取代組別中一組中所存在的取代：組別1：丙胺酸(Ala；A)、甘胺酸(Gly；G)、絲胺酸(Ser；S)、蘇胺酸(Thr；T)；組別2：天冬胺酸(Asp；D)、麩胺酸(Glu；E)；組別3：天冬醯胺酸(Asn；N)、麩醯胺酸(Gln；Q)；組別4：精胺酸(Arg；R)、離胺酸(Lys；K)、組胺酸(His；H)；組別5：異白胺酸(Ile；I)、白胺酸(Leu；L)、甲硫胺酸(Met；M)、纈胺酸(Val；V)；及組別6：苯丙胺酸(Phe；F)、酪胺酸(Tyr；Y)、色胺酸(Trp；W)。
另外，胺基酸可依類似功能、化學結構、或組成(例如，酸性、鹼性、脂族、芳族、含硫)分組為守恆取代組別。例如，基於取代之目的，脂族分組可包括Gly、Ala、Val、Leu、及Ile。包含被視為與另一種胺基酸守恆取代之胺基酸之其他組別包括：含硫：Met與Cys；酸性：Asp、Glu、Asn、及Gln；小脂族、非極性或略為極性之殘基：Ala、Ser、Thr、Pro、及Gly；極性、帶負電荷之殘基及其醯胺：Asp、Asn、Glu、及Gln；極性、帶正電荷之殘基：His、Arg、及Lys；大脂族、非極性殘基：Met、Leu、Ile、Val、及Cys；及大芳族殘基：Phe、Tyr、及Trp。其他資訊可參見Creighton(1984)Proteins，W.H.Freeman and Company。
揭示於本文中之基於毒素之治療性肽之變體亦包括相對本文中所揭示肽序列具有至少70%序列一致性、至少80%序列一致性、至少85%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性、或至少99%序列一致性之肽。
適於與本文中所揭示之基於基於毒素之肽之方法併用之基於毒素之治療性肽之變體包括共享以下序列一致性之肽：相對SEQ ID NO：225-256中任一者70%序列一致性；相對SEQ ID NO：225至256中任一者75%序列一致性；相對SEQ ID NO：225至256中任一者80%序列一致性；相對SEQ ID NO：225至256中任一者81%序列一致性；相對SEQ ID NO：225至256中任一者82%序列一致性；相對SEQ ID NO：225至256中任一者83%序列一致性；相對SEQ ID NO：225至256中任一者84%序列一致性；相對SEQ ID NO：225至256中任一者85%序列一致性；相對SEQ ID NO：225至256中任一者86%序列一致性；相對SEQ ID NO：225至256中任一者87%序列一致性；相對SEQ ID NO：225至256中任一者88%序列一致性；相對SEQ ID NO：225至256中任一者89%序列一致性；相對SEQ ID NO：225至256中任一者90%序列一致性；相對SEQ ID NO：225至256中任一者91%序列一致性；相對SEQ ID NO：225至256中任一者92%序列一致性；相對SEQ ID NO：225至256中任一者93%序列一致性；相對SEQ ID NO：225至256中任一者94%序列一致性；相對SEQ ID NO：225至256中任一者95%序列一致性；相對SEQ ID NO：225至256中任一者96%序列一致性；相對SEQ ID NO：225至256中任一者97%序列一致性；相對SEQ ID NO：225至256中任一者98%序列一致性；或相對SEQ ID NO：225至256中任一者99%序列一致性。
適於與本文中所揭示之基於基於ShK之肽之方法併用之基於毒素之治療性肽之變體包括共享以下之肽：相對SEQ ID NO：1至224中任一者80%序列一致性；相對SEQ ID NO：1至224中任一者81%序列一致性；相對SEQ ID NO：1至224中任一者82%序列一致性；相對SEQ ID NO：1至224中任一者83%序列一致性；相對SEQ ID NO：1至224中任一者84%序列一致性；相對SEQ ID NO：1至224中任一者85%序列一致性；相對SEQ ID NO：1至224中任一者86%序列一致性；相對SEQ ID NO：1至224中任一者87%序列一致性；相對SEQ ID NO：1至224中任一者88%序列一致性；相對SEQ ID NO：1至224中任一者89%序列一致 性；相對SEQ ID NO：1至224中任一者90%序列一致性；相對SEQ ID NO：1至224中任一者91%序列一致性；相對SEQ ID NO：1至224中任一者92%序列一致性；相對SEQ ID NO：1至224中任一者93%序列一致性；相對SEQ ID NO：1至224中任一者94%序列一致性；相對SEQ ID NO：1至224中任一者95%序列一致性；相對SEQ ID NO：1至224中任一者96%序列一致性；相對SEQ ID NO：1至224中任一者97%序列一致性；相對SEQ ID NO：1至224中任一者98%序列一致性；或相對SEQ ID NO：1至224中任一者99%序列一致性。
特定的例示性實施例包括基於毒素之治療性肽，其中該等肽共享相對式SEQ ID NO：208之80%序列一致性、85%序列一致性、86%序列一致性、87%序列一致性、88%序列一致性、89%序列一致性、90%序列一致性、91%序列一致性、92%序列一致性、93%序列一致性、94%序列一致性、95%序列一致性、96%序列一致性、97%序列一致性、98%序列一致性、或99%序列一致性。於另一個實施例中，與本文中所揭示方法併用之變體包括共享相對式SEQ ID NO：209之80%序列一致性、85%序列一致性、86%序列一致性、87%序列一致性、88%序列一致性、89%序列一致性、90%序列一致性、91%序列一致性、92%序列一致性、93%序列一致性、94%序列一致性、95%序列一致性、96%序列一致性、97%序列一致性、98%序列一致性、或99%序列一致性之肽。於另一個實施例中，適於與本文中所揭示方法併用之變體包括共享相對式SEQ ID NO：217之80%序列一致性、85%序列一致性、86%序列一致性、87%序列一致性、88%序列一致性、89%序列一致性、90%序列一致性、91%序列一致性、92%序列一致性、93%序列一致性、94%序列一致性、95%序列一致性、96%序列一致性、97%序列一致性、98%序列一致性、或99%序列一致性之肽。於另一個實施例中，適於與本文中所揭示方法併用之變體包括 共享相對式SEQ ID NO：210之80%序列一致性、85%序列一致性、86%序列一致性、87%序列一致性、88%序列一致性、89%序列一致性、90%序列一致性、91%序列一致性、92%序列一致性、93%序列一致性、94%序列一致性、95%序列一致性、96%序列一致性、97%序列一致性、98%序列一致性、或99%序列一致性之肽。於另一個實施例中，適於與本文中所揭示方法併用之變體包括共享相對式SEQ ID NO：218之80%序列一致性、85%序列一致性、86%序列一致性、87%序列一致性、88%序列一致性、89%序列一致性、90%序列一致性、91%序列一致性、92%序列一致性、93%序列一致性、94%序列一致性、95%序列一致性、96%序列一致性、97%序列一致性、98%序列一致性、或99%序列一致性之肽。
「序列一致性%」係指兩種或更多種序列之間之相關性，如藉由比對該等序列來確定。於本技藝中，「一致性」亦意指肽序列之間之序列相關程度，如藉由該等序列之序列串之間之匹配之來確定。「一致性」(通常稱為「相似性」)可由已知之方法輕易計算得，包括其等述於以下中之方法：Computational Molecular Biology(Lesk,A.M.編輯)(牛津大學出版社，紐約(1988))；Biocomputing：Informatics and Genome Projects(Smith,D.W.編輯)(學術出版社，紐約(1994))；Computer Analysis of Sequence Data,Part I(Griffin,A.M.及Griffin,H.G.編輯)(胡馬納出版社(Humana Press)，新澤西州(1994))；Sequence Analysis in Molecular Biology(Von Heijne,G.編輯)(學術出版社(1987))；及Sequence Analysis Primer(Gribskov,M.及Devereux,J.編輯)(牛津大學出版社，紐約(1992))。確定序列一致性之較佳方法係經設計以提供所測試序列之間之最佳匹配。確定序列一致性及相似性之方法係以可公開取得的電腦程式編碼。序列比對及百分比一致性計算可使用LASERGENE生物資訊計算套裝軟體之Megalign程式 (DNASTAR,Inc.，威斯康辛州麥迪遜)來進行。該等序列之多重比對亦可使用Clustal比對法(Higgins and Sharp CABIOS，5,151-153(1989)以預設參數(GAP PENALTY=10，GAP LENGTH PENALTY=10)進行。相關程式亦包括GCG程式套組(Wisconsin套裝軟體9.0版，Genetics Computer Group(GCG)，威斯康辛州麥迪遜)；BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)；DNASTAR(DNASTAR,Inc.，威斯康辛州麥迪遜)；及併有Smith-Waterman演算法之FASTA程式(Pearson,Comput.Methods Genome Res.,[Proc.Int.Symp.](1994)，會議日期1992年，111-20.編輯：Suhai,Sandor.出版人：Plenum，紐約。於本發明上下文中，應理解在使用序列分析軟體來分析之情況下，分析之結果係基於所提及程式之「預設值」。如本文所用，「預設值」將意指在首次初始化時原本與軟體一起負載之任何值或參數集。
「D取代類似物」包括揭示於本文中之具有一或多個經D-胺基酸取代之L-胺基酸之基於毒素之治療性肽。D-胺基酸可係與存於肽序列中之胺基酸相同之胺基酸類型或可為不同的胺基酸。因此，D-類似物亦為變體。
「修飾物」包括揭示於本文中之基於毒素之治療性肽，其中一或多個胺基酸已藉由非胺基酸組分置換，或其中該胺基酸已與官能基共軛或官能基係以其他方式與胺基酸或肽結合。經修飾之胺基酸可為(例如)糖基化胺基酸、聚乙二醇化胺基酸、法尼基化胺基酸、乙醯化胺基酸、生物素化胺基酸、與脂質部分共軛之胺基酸、與人血清白蛋白共軛之胺基酸、或與有機衍生劑共軛之胺基酸。經修飾之胺基酸之存在可有利於(例如)(a)延長肽血清半衰期及/或功能活體內半衰期、(b)降低肽抗原性、(c)增進肽儲存穩定性、(d)增進肽溶解性、(e)延長循環時間、及/或(f)提高生物可利用性(例如，增加曲線下方面積 (AUCsc))。胺基酸可例如在重組體產生期間進行共轉譯或轉譯後修飾(例如，在哺乳動物細胞中之表現期間於N-X-S/T基序之處N-連接糖基化)或藉由合成方法來修飾。經修飾之胺基酸可在序列中或在序列之末端。修飾物可包括如述於本文別處之衍生物。
C-端可為羧酸或醯胺基團，就基於毒素之治療性肽之各C-端而言，較佳係羧酸基團。本發明亦關於進一步經(i)對C-端進行諸如Tyr、碘-Tyr、螢光標籤之加成、或(ii)對N-端進行諸如Tyr、碘-Tyr、焦麩胺酸鹽、或螢光標籤之加成修飾之基於毒素之治療性肽。
此外，可加成熟習此項技藝者所熟知的可提高穩定性之殘基或殘基群組至C-端及/或N-端。此外，可加成熟習此項技藝者所熟知的可增進口服可利用性之殘基或殘基群組至C-端及/或N-端。
於特定的實施例中，C-端為酸(例如，COOH)或醯胺(例如，CONH2)。「醯胺」係指酸之C-端羥基(OH)改由NH2取代。該種取代在本文中用術語「醯胺」來表示或表示為C-端胺基酸-NH2，如呈「-Cys-NH2」形式。
已研究多種治療性肽之安全性、效價、及特異性，及已顯示肽附接至具有陰離子電荷之有機或無機化學實體可改良用於醫藥組合物中之適合性。附接位點可為N-端，但修飾並不受限於該位點之處之附接。
適宜化學實體之實例包括L-Pmp(OH2)；D-Pmp(OH2)；D-Pmp(OHEt)；Pmp(Et2)；D-Pmp(Et2)；L-Tyr；L-Tyr(PO3H2)(對磷酸酪胺酸)；L-Phe(p-NH2)；L-Phe(p-CO2H)；L-天冬胺酸；D-天冬胺酸；L-麩胺酸；及D-麩胺酸。使用的縮寫定義如下：Pmp(對膦醯基甲基苯丙胺酸)；及Ppa(對磷脂醯基苯丙胺酸)。PmP及Ppa之替代品包括Pfp(對膦醯基(二氟甲基)苯丙胺酸)及Pkp(對磷酸基甲基酮基苯丙胺酸)。
例示性化學實體可藉由諸如胺基乙基氧基乙基氧基-乙醯基連接子(本文中稱為AEEAc)之連接子方式、或藉由任何其他適宜方法來附接。化學實體/連接子組合之實例包括AEEAc-L-Pmp(OH2)；AEEAc-D-Pmp(OH2)；AEEAc-D-Pmp(OHEt)；AEEAc-L-Pmp(Et2)；AEEAc-D-Pmp(Et2)；AEEAc-L-Tyr；AEEAc-L-Tyr(PO3H2)；AEEAc-L-Phe(p-NH2)；AEEAc-L-Phe(p-CO2H)；AEEAc-L-天冬胺酸；AEEAc-D-天冬胺酸；AEEAc-L-麩胺酸；及AEEAc-D-麩胺酸。一般在胺基酸殘基具有對掌性中心之化學實體中，可使用胺基酸殘基之D及/或L對映異構體。
揭示於本文中之所有基於毒素之治療性肽可藉由胺基乙基氧基乙基氧基乙酸之N-端附接、及/或C-端之處之醯胺附接(例如，ShK-186；SEQ ID NO：217)來修飾。AEEAc在用於描述形成過程中之連接子之情況下可互換地表示胺基乙基氧基乙基氧基乙酸及Fmoc-胺基乙基氧基乙基氧基乙酸。在用於表示呈其最終狀態之特異性肽中之連接子之情況下，該術語係指胺基乙基氧基乙基氧基乙酸。
揭示於本文中之所有基於毒素之治療性肽可藉由添加聚乙二醇、人血清白蛋白、抗體、脂肪酸、包括Fab及Fc區之抗體片段、羥乙基澱粉、聚葡萄糖、寡糖、聚唾液酸、透明質酸、糊精、聚(2-乙基2-噁唑酮)、聚麩胺酸(PGA)、N-(2-羥丙基)甲基丙烯醯胺共聚物(HPMA)、胺基酸特定言之包括胺基酸Ala、Glu、Gly、Ser及Thr之非結構化親水性序列、及許多個如Schmidt,S.R.(編輯)，Fusion Protein Targeting for Biopharmaceuticals：Applications and Challenges，John Wiley and Sons：新澤西州霍博肯，2013中所述之其他連接子及加成來修飾。可使用：(a)PEG碳酸琥珀醯亞胺酯、(b)PEG碳酸苯并三唑酯、(c)PEG二氯三嗪、(d)PEG三氟乙磺酸酯、(e)PEG碳酸對硝基苯酯、(f)PEG碳酸三氯苯酯、(g)PEG羰基咪唑及(h)PEG琥珀酸琥珀醯亞 胺酯，將PEG基附接至離胺酸之ε胺基。PEG基可經包括胺基甲酸苄酯之對-或鄰-二硫化物之可分解連接子附接至半胱胺酸。PEG之定點引入可藉由利用PEG-醛之還原烷基化或藉由α-胺基於存在氰基硼氫化鈉下之甘油醛修飾來達成。聚乙二醇化化學品已述於許多出版物中，包括Robert等人，Advanced Drug Delivery Reviews，54,459-476(2002)。寡糖可係N-連接或O-連接。包括聚唾液酸之N-連接寡糖係藉由藉附接至Asn-Xxx-Ser/Thr(其中Xxx為除脯胺酸外任何者)之一致序列製造細胞株而添加。O-連接寡糖係附接至Ser或Thr。
特定的實施例包括經由胺基乙基氧基乙基氧基乙醯基連接子(稱為AEEAc)附接至具有陰離子電荷之有機或無機化學實體的SEQ ID NO：1-224之基於毒素之治療性肽。
基於毒素之治療性肽之另一個實例為ShK-186之基於ShK之DOTA共軛物(稱為ShK-221)。「DOTA」係指可經胺基己酸附接至本文所揭示治療性肽之N-端之1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸。DOTA共軛可提供諸如銦或釓之螯合金屬原子位置。可共軛至本文所揭示治療性肽之其他分子包括二伸乙基三胺五乙酸(DTPA)、氮川三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、亞胺及二乙酸(IDA)、乙二醇四乙酸(EGTA)、1,2-雙(鄰-胺基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)、1,4,7-三氮雜環壬烷-N,N',N"-三乙酸(NOTA)及相關分子。
本發明進一步關於所揭示的基於毒素之治療性肽之衍生物。衍生物包括具有其中之環狀排列保留天然ShK肽之天然橋接形式之非環狀排列的基於毒素之治療性肽。於一個實施例中，環化的基於毒素之治療性肽包括直鏈基於毒素之治療性肽及肽連接子，其中該直鏈基於毒素之治療性肽之N-及C-端係經肽連接子連接以形成醯胺環化肽主鏈。於一些實施例中，肽連接子包括選自Gly、Ala、及其組合之胺基酸。
各種環化方法可應用於本文所述之基於毒素之治療性肽。述於本文中之基於毒素之治療性肽可使用BOC-化學以引入Ala、Gly或Ala/Gly橋、及其組合或如由Schnolzer等人，Int J Pept Protein Res.，40,180-193(1992)所述之其他殘基而輕易地環化。使基於毒素之治療性肽環化，可增進其穩定性、口服生物可利用性及減低蛋白水解敏感性，而不會對基於毒素之治療性肽針對其特異性標靶之親和力造成影響。
揭示於本文中之各種基於毒素之治療性肽亦可包括於包括本文所揭示基於毒素之治療性肽序列之位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、或60之任何位置之處之加成、缺失、終止位置、取代、替代、共軛、締合、或排列。因此，於特定的實施例中，各種基於毒素之治療性肽之各個胺基酸位置可為Xaa位置，其中Xaa表示該胺基酸之於特定位置之處之加成、缺失、終止位置、取代、替代、共軛、締合或排列。於特定的實施例中，各種基於毒素之治療性肽在位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、或60中之一或多個位置之處具有1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46 個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個、57個、58個、59個、或60個Xaa位置。
基於毒素之治療性肽可具有多於一種改變(加成、缺失、終止位置、取代、替代、共軛、締合或排列)且作為變體、D取代類似物、具有羧基末端之醯胺、修飾物及/或衍生物中之一或多者合格。換言之，變體、D取代類似物、具有羧基末端之醯胺、修飾物及/或衍生物中一種類別之包含不排除於其他類別中之包含及其等在本文中統稱為「基於毒素之治療性肽」。一個實例包括SEQ ID NO：1，其中該於位置21之處之胺基酸為正亮胺酸且/或該於位置22之處之胺基酸係經二胺基丙酸置換。
於位置21之處為Met之任何肽中，Met可經取代以賦予抗氧化之穩定效應。於一個實施例中，位置21之處之Met係經Nle取代。於位置21之處具有Met之SEQ ID NO：1至256中任一者中，該Met可經Nle取代。於位置22之處具有Lys之SEQ ID NO：1至256中任一者中，該Lys可經二胺基丙酸取代。因此，本文中所揭示之一個實例包括SEQ ID NO：1，其中於位置21之處之Met係經Nle取代，醯胺係存於C-端及/或陰離子部分係存於N-端。
「非官能性胺基酸殘基」係指具有缺乏酸性、鹼性、或芳香族基團之側鏈之呈D-或L-形式之胺基酸殘基。例示性非官能性胺基酸殘基包括M、G、A、V、I、L及Nle。
醫藥組合物
基於在所揭示方法中之使用，可將基於毒素之治療性肽提供於醫藥組合物中。亦可使用基於毒素之治療性肽之前藥，及可藉由加成酯基以增進其親脂性因而於一些實施例中增進其跨角膜遞送來製造。可使用合成基於毒素之治療性肽、天然基於毒素之治療性肽或天然及合成基於毒素之治療性肽之混合物。
醫藥組合物包含基於毒素之治療性肽及至少一種醫藥上可接受之載劑。醫藥上可接受之載劑包括無論基於研究、預防性、及/或治療性治療目的均不產生超出投與效益之明顯不良、過敏、或其他不希望呈現的反應之其等。例示性醫藥上可接受之載劑及相關調配物揭示於Troy,D.B.及Beringer,P.(編輯)Remington：The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott；費城，2006.第21版中。所製得的醫藥組合物滿足如生物標準品之美國食品及藥品管理局(U.S.Food and Drug Administration)(FDA)及/或其他相關國外管理機構要求的滅菌、熱原性、及/或一般安全性及純度標準。
典型地，可將基於毒素之治療性肽與基於所選投藥模式來選擇的一或多種醫藥上可接受之載劑混合。關於遞送方法之實例，請參見美國專利案第5,844,077號。
例示性一般使用之醫藥上可接受之載劑包括任何及所有吸收延遲劑、抗氧化劑、黏結劑、緩衝劑、增積劑、螯合劑、共溶劑、塗料、著色劑、崩解劑、分散介質、乳化劑、填充劑、矯味劑、凝膠、等滲劑、潤滑劑、香料、防腐劑、釋放劑、鹽、溶劑、穩定劑、甜味劑、表面活性劑、潤濕劑等等。
例示性緩衝劑包括檸檬酸鹽緩衝劑、琥珀酸鹽緩衝劑、酒石酸鹽緩衝劑、富馬酸鹽緩衝劑、葡萄糖酸鹽緩衝劑、草酸鹽緩衝劑、乳酸鹽緩衝劑、乙酸鹽緩衝劑、磷酸鹽緩衝劑、組胺酸緩衝劑、及三甲胺鹽。
例示性防腐劑包括苯酚、苄醇、間-甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯化十八烷基二甲基苄銨、鹵化苄二甲羥銨、氯化己烷雙胺、對羥基苯甲酸烷酯、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、及3-戊醇。
用於眼用溶液之防腐劑之更特定實例包括氯化苄二甲羥銨 (0.025%)、山梨酸、氯化苄乙氧銨(0.01%)、氯丁醇(0.5%)、乙酸苯汞(0.004%)、硝酸苯汞(0.004%)、硫柳汞(0.01%)、對羥基苯甲酸甲酯(0.1至0.2%)及對羥基苯甲酸丙酯(0.04%)。其他防腐劑亦可充作經由破壞角膜上皮之疏水障壁之滲透促進劑及因此在眼科醫藥組合物中發揮雙重作用。可使用的其他防腐劑包括汞衍生物、醇、對羥基苯甲酸酯、四級銨化合物、聚四級銨鹽化合物、氯己啶、PURITE®(Allergan,Inc.，加州爾灣市)及SOFZIA®(Alcon,Inc.，瑞士休倫堡(Hünenberg))防腐劑系統。防腐劑之包含在將醫藥組合物製備呈包裝於多劑量容器中之眼用溶液之情況下可尤其有益地防止污染(例如，細菌污染)。
例示性等滲劑包含多元糖醇、三元糖醇、或高碳數糖醇，諸如甘油、赤蘚糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇、及甘露醇。
例示性穩定劑包括有機蔗糖、多元糖醇、聚乙二醇、含硫還原劑、胺基酸、低分子量多肽、蛋白質、免疫球蛋白、親水性聚合物、及多醣。
例示性抗氧化劑包括α-生育酚、抗壞血酸、抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基化羥基茴香醚(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、檸檬酸、半胱胺酸鹽酸鹽、乙二胺四乙酸(EDTA)、卵磷脂、金屬螯合劑、甲硫胺酸、油可溶性抗氧化劑、磷酸、棓酸丙酯、亞硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、山梨糖醇、酒石酸、及維他命E。抗氧化劑之更特定的實例/量包括乙二胺四乙酸(0.1%)、亞硫酸氫鈉(0.1%)、偏亞硫酸氫鈉(0.1%)、及硫脲(0.1%)。
例示性潤滑劑包括月桂基硫酸鈉及硬脂酸鎂。
例示性醫藥上可接受之鹽包括無機及有機加成鹽，諸如乙酸鹽、苯甲酸鹽、檸檬酸鹽、富馬酸鹽、鹽酸鹽、羥乙基磺酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、丙酸鹽、水楊酸鹽、琥珀酸鹽、 硫酸鹽、酒石酸鹽、茶鹼乙酸鹽、及三氟乙酸鹽。亦可使用低碳數烷基四級銨鹽。
於特定的實施例中，可添加黏度增強劑至醫藥組合物，以使醫藥組合物留存在眼睛中更久些並延長藥物與眼組織接觸之時間繼而增進藥物滲透眼組織。於各種實施例中，在眼用溶液中之期望黏度介於25與50釐泊之間。例示性黏度增強劑包括羧甲基纖維素(1%)、羥乙基纖維素(0.8%)、羥丙基甲基纖維素(1%)、甲基纖維素(2%)、聚乙烯醇(1.4%)、聚卡波菲、結蘭膠、黃原膠、卡波(carbopol)、聚(苯乙烯-二乙烯苯)磺酸、及聚乙烯吡咯啶酮(1.7%)。
適於與本文所述之基於毒素之治療性肽併用之滲透促進劑可包括可依照述於Tommaso等人，Investigative Ophthalmology & Visual Science，53(4),2292-2299(2012年4月)中之方法建構之基於經甲氧基聚乙二醇-己基取代之聚乳酸交酯(MPEG-hexPLA)之膠束調配物。亦可使用二乙二醇單乙醚(Transcutol P)作為滲透促進劑。
可於醫藥組合物中使用增溶劑，包括泊洛沙姆-407(Poloxamer-407)、普尼克F68(Puronic F68)、普洛尼克F127(Pluronic F127)、聚山梨醇酯、聚乙烯-35-蓖麻油、羥丙基-β-環糊精、甲基-β環糊精、正辛烯基琥珀酸澱粉、其他環糊精、秦洛沙泊(tyloxapol)、琥珀酸α-生育酚聚乙二醇酯、中等鏈三酸甘油酯、芝麻油、花生油、紅花子油、芥子油、大豆油、向日葵油、其他油、磷脂、表面活性劑、羅芬類(rofams)、及含增溶劑之水包油型乳液。
基於奈米顆粒及奈米乳液之系統可用於遞送基於毒素之治療性肽，包括彼等基於聚ε己內酯、N-異丙基丙烯醯胺、乙烯基吡咯烷酮、丙烯酸、Eudragit RS 100、Eudragit RL100、聚(乳酸/乙醇酸)、及NovasorbTM者。塗佈聚-L-離胺酸、藻酸鹽或甲殼素之陽離子奈米乳液可使奈米乳液穩定並促使其與角膜相互作用。適用於基於毒素之 治療性肽奈米乳液之其他陽離子脂質及賦形劑包括硬脂醯胺、油醯胺、聚乙烯亞胺、N-(1-(2,3-二油醯基氧基)丙基)-N,N,N三甲銨(DOTAP)、二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)、西曲溴胺(cetrimide)、氯化苄二甲羥銨、氯化苄乙氧銨、氯化苯甲十六烷胺(cetalkonium chloride)、苯度氯銨(benzododecinium chloride)、及十六烷基吡啶(cetylpyridinium)。可用於醫藥組合物中之其他奈米-或微米乳液組分包括滲透劑(甘露醇、甘油、山梨糖醇、丙二醇、右旋糖)；油(中等鏈三酸甘油酯、三乙酸甘油酯、礦物油及植物油)；及表面活性劑(聚山梨醇酯、克林莫佛類(cremephores)、泊洛沙姆、秦洛沙泊、維他命-E-TPGS)。
可藉由使用基於結蘭膠或聚丙烯酸聚合物之經離子活化之原位膠凝系統來增加基於毒素之治療性肽之角膜前滯留時間。基於毒素之治療性肽於眼表面之暴露可進一步藉由使用卡波(cardopol)凝膠、纖維素衍生物、海藻糖、羥甲基纖維素、泊洛沙姆407、聚山梨醇酯80、丙二醇、聚乙烯醇、及聚乙烯吡咯啶酮作為醫藥組合物之組分來增進。
可將多相分散載劑溶液用於醫藥組合物，包括SophisenTM、3A OftenoTM、及Modusik-A OftenoTM。
脂質體調配物(包括陽離子脂質體)可用作用於基於毒素之治療性肽之載劑，及包括1-α-二肉豆蔻醯磷脂醯甘油、磷脂、膽固醇、Span 40、硬脂胺、及脫氧膽酸。
基於毒素之治療性肽亦可經調配為儲積製劑(depot preparation)。儲積製劑可藉由適宜聚合或疏水物質(例如，呈在可接受油中之乳液形式)或離子交換樹脂調配、或可經調配為可微溶衍生物(例如，呈可微溶鹽形式)。該等長效醫藥組合物可以任何適宜方式投與。
適於眼睛投與基於毒素之治療性肽之醫藥組合物亦包含可增進 藥物接觸且吸收進入眼表面之軟膏。眼用軟膏可包含礦物油、白礦脂、或羊毛脂且可具有接近體溫之熔化溫度。
可使用生物可降解聚合物達成基於毒素之治療性肽之持續釋放。實例包括明膠、白蛋白、聚原酸酯、聚酐、聚乙烯醇、聚酯、D-、L-及DL-乳酸之聚合物、及乳酸及乙醇酸之共聚物。該等聚合物可用於結膜下及眼內植入物。
另外，可使用固體聚合物之半滲透基質將基於毒素之治療性肽調配為持續釋放型系統。已確立各種持續釋放型材料且是為熟習此項技藝者所熟知的。持續釋放型系統可基於其化學性質在投與後釋放出基於毒素之治療性肽達數週至超過100天。
揭示於本文中之醫藥組合物亦可利用微膠囊化(參見：例如，美國專利案第4,352,883號、第4,353,888號、及第5,084,350號)；連續釋放型聚合物植入物(參見：例如，美國專利案第4,883,666號)；及大膠囊化(參見：例如，美國專利案第5,284,761號、第5,158,881號、第4,976,859號、及第4,968,733號及經公開之PCT專利申請案WO92/19195、WO95/05452)。
於特定的實施例中，醫藥組合物可經製備為滴眼劑、結膜下植入物、眼內植入物、眼內注射液、玻璃體內注射液、玻璃體內植入物、眼球筋膜囊下(sub-Tenon’s)膠囊注射液及淚管栓塞(punctual plug)。
用於眼睛投與之適宜醫藥組合物包括溶液及懸浮液。溶液為無菌且不含顆粒。懸浮液為包含固體顆粒之水性調配物。該等顆粒尺寸一般為小於10微米以防止刺激作用，為諸如(例如)10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1微米、或小於1微米。於各種實施例中，該等顆粒尺寸為大於10微米。於一個實施例中，顆粒尺寸均等。於另一個實施例中，所有該等顆粒係在平均顆粒尺寸之1微米範圍內。於另一個實施 例中，所有該等顆粒係在平均顆粒尺寸之2微米範圍內。對於直接投與眼睛而言，醫藥組合物可為滴眼劑。
用於注射之醫藥組合物可以單位劑型(例如)以玻璃安瓿或多劑量容器(例如玻璃小瓶)呈現。用於注射之醫藥組合物可採用諸如懸浮液、溶液或在油性或水性媒劑中之乳液之該等形式，且可包含諸如懸浮劑、穩定劑、防腐劑、及/或分散劑之調配劑。
基於毒素之治療性肽及/或醫藥組合物可呈適於在遞送時複水之粉末形式。於另一個實施例中，基於毒素之治療性肽之單位劑型可為在滅菌、氣密式密封安瓿或滅菌針筒中之含於適宜稀釋劑中之基於毒素之治療性肽之溶液。
於另一個實施例中，凍乾醫藥組合物包含小於5%水含量。於另一個實施例中，凍乾醫藥組合物包含小於4.0%水含量。於另一個實施例中，凍乾醫藥組合物包含小於2%水含量。於一個實施例中，凍乾醫藥組合物包含8至12%乙酸鹽含量(以重量計)。於另一個實施例中，凍乾醫藥組合物包含10至11%乙酸鹽含量(以重量計)。
就非經腸投與而言，可使基於毒素之治療性肽溶解於醫藥上可接受之載劑中及呈溶液或懸浮液形式投與。例示性醫藥上可接受之載劑包括水、鹽水、右旋糖溶液、果糖溶液、乙醇、或動物油、植物油、或合成油。載劑亦可包含其他成分，例如，防腐劑、懸浮劑、增溶劑、緩衝劑、及類似。
就口服投與而言，基於毒素之治療性肽可經調配為諸如膠囊、丸劑、錠劑、口含錠、顆粒、熔體、粉末、懸浮液、或乳液之固體或液體製劑。於呈口服劑型之組合物之製備中，可使用任何常見醫藥上可接受之載劑，諸如，例如，就口服固體製劑(諸如(例如)粉末、膠囊及錠劑)而言，載劑，諸如，澱粉、糖、稀釋劑(諸如蔗糖、乳糖、或澱粉)、粒化劑、潤滑劑(諸如硬脂酸鎂)、黏結劑、崩解劑、緩衝劑、 及類似；或就口服液體製劑(諸如(例如)乳液、糖漿、懸浮液、酏剂、及溶液)而言，水、二醇、油、醇、防腐劑、著色劑、懸浮劑、及類似。該等組合物亦可包含佐劑，諸如潤濕劑、甜味劑、矯味劑、及香料。錠劑及膠囊因為其於投與中之方便性而可代表有利的口服單位劑量，於該情況中，顯然可使用固體醫藥載劑。若需要，則錠劑可藉由標準技術進行糖塗佈或腸衣塗佈。
用於口服投與之製劑可經過適宜調配以提供基於毒素之治療性肽之可控釋放。舉例言之，基於毒素之治療性肽可經囊封使其穩定以通過胃腸道而於某些實施例中同時容許越過血腦障壁。參見(例如)WO96/11698。
就經頰內投與而言，組合物可採行以習知方法調配之錠劑或口含錠之形式。
就經鼻或經肺投與或任何其他經吸入投與而言，基於毒素之治療性肽可方便地在使用適宜推進劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳、或其他適宜氣體或氣體混合物下呈用於加壓包裝或噴霧器之噴霧劑特徵之形式遞送。
在經鞘內投與基於毒素之治療性肽之情況下，亦可將其溶解於腦脊髓液中。亦可使用移植至CNS之裸或未經囊封之細胞移植物。參見：例如，美國專利案第5,082,670號及第5,618,531號。
諸如pH、滲透壓、及黏度之醫藥組合物屬性可經調整，以使基於毒素之治療性肽穩定；以可有效遞送至眼睛及其結構；及可改善個體舒適度。可添加緩衝劑至醫藥組合物以調整pH為介於4.5與11.5之間之範圍，且一般係在6.5至8.5範圍內。
呈眼用溶液之包含基於毒素之治療性肽之例示性醫藥組合物包含磷酸鹽作為緩衝劑，其中pH係經調整為6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、或6.5。溶液之滲透壓可藉由添加0.9%氯化鈉(可接受濃度範圍為自0.6 至1.8%氯化鈉)達成與淚液等滲或等張。
「呈單位劑型之醫藥組合物」意指適於醫療投與之物理離散相干單位，各單位可併與醫藥上可接受之載劑一起包含治療有效量、或倍數(多達四倍)或分數(低至四十分之一)治療有效量之基於毒素之治療性肽。醫藥組合物是否包含日劑量、或(例如)一半、三分之一或四分之一日劑量將取決於醫藥組合物是否分別每天投與一次或(例如)兩次、三次或四次。
醫藥組合物中基於毒素之治療性肽之量及濃度可基於臨床相關因素、該基於毒素之治療性肽在載劑中之溶解度、該基於毒素之治療性肽之效價及活性、及該醫藥組合物之投與方式來選擇。僅需要該基於毒素之治療性肽構成治療有效量，換言之，使得適宜有效劑量將與以單或多單位劑量使用之劑型一致。
醫藥組合物一般將包含以總體組合物重量計0.0001至99重量%、較佳0.001至50重量%、更佳0.01至10重量%之基於毒素之治療性肽。
於各種實施例中，基於毒素之治療性肽可以自0.001mg/ml至500mg/ml含量存在。於其他實施例中，基於毒素之治療性肽可以0.001、0.01、0.1、0.5、0.75、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、150、200、250、300、350、400、450或500mg/ml含量提供。
用於本文所揭示方法中之具有最佳穩定性及溶解度之一種例示性醫藥組合物包含顯示於表3中之組分：
其他基於毒素之治療性肽可與相同、或類似調配物併用。
除了基於毒素之治療性肽之外，醫藥組合物亦可包含其他藥物或生物活性劑。其他藥物或生物活性劑之實例包括鎮痛劑、細胞激素、及在所有重要臨床藥物領域之治療劑。混合液(cocktail)為任何一種基於毒素之治療性肽與另一種藥物或生物活性劑之混合物。於該種實施例中，常見投藥媒劑(例如，丸劑、錠劑、植入物、泵、注射溶液等等)可包含與其他藥物或生物活性劑組合之基於毒素之治療性肽兩者。
使用方法
本發明之醫藥組合物適用於治療眼科病症之方法。該等方法包括投與有需要之個體治療有效量之包含基於毒素之治療性肽之醫藥組合物。於一個特定的實施例中，醫藥上可接受之鹽可為乙酸鹽，諸如乙酸鉀或乙酸鈉，及該醫藥組合物係於水性載劑中提供。
可依本文所揭示方法治療之眼科病症包括乾眼、葡萄膜炎、鞏膜炎、及其他發炎性眼睛疾病，諸如眼內炎、瘢痕性類天皰瘡、莫倫氏潰瘍(Mooren’s ulcer)、巨大細胞病毒介導之視網膜炎及其他病毒介導之發炎性眼睛疾病。本發明進一步提供用於治療全身性自體免疫疾病之眼睛表現(諸如表層鞏膜炎、角膜炎、視網膜血管炎、或其他涉 及角膜、視網膜、鞏膜、及眼窩之發炎之疾病)之方法。具有眼睛表現之全身性自體免疫疾病之實例包括全身性紅斑狼瘡、顯微鏡下多血管炎、結節性多動脈炎、韋格納氏肉芽腫病(Wegener's granulomatosis)(肉芽腫病合併多血管炎)、類肉瘤病、貝塞特氏症候群、伏格特-小柳-原田病(Vogt-Koyanagi-Harada disease)、高安氏動脈炎(Takayasu's arteritis)、類風濕關節炎、休格連氏症候群(Sjorgen’s syndrome)、復發性多軟骨炎、僵直性脊椎炎、銀屑病、及徹奇-斯全司症候群(Churg-Strauss syndrome)。所治療的乾眼可能係因局部性或全身性免疫反應所致，或可具有其他病因。
在不限制前述下，可依本文所揭示方法治療之發炎性眼科病症包括與T細胞浸潤及活化相關聯之眼睛疾病或眼科病症及亦包括與局部性及/或全身性自體免疫疾病相關聯之眼科病症。發炎性眼科病症為眼科病症之子組。例示性發炎性眼科病症包括以下及/或係與(例如，係因)以下相關聯(引起)：棘阿米巴蟲感染、急性視網膜色素上皮炎、過敏、幹細胞移植中表現為移植物抗宿主疾病之同種異體移植、僵直性脊椎炎、關節炎、細菌感染、貝賽特氏病、與貝賽特氏病相關之視網膜炎、瞼炎、瘢痕性類天皰瘡、化學品暴露、脈絡膜炎、脈絡膜視網膜發炎、徹奇-斯全司症候群、克羅恩氏病、結膜炎、巨大細胞病毒介導之視網膜炎、糖尿病性視網膜病變、乾眼、眼內炎、表層鞏膜炎、眼睛瘀傷、眼睛創傷、食物過敏、異物暴露、真菌感染、蕁麻疹、虹膜睫狀體炎、虹膜炎、幼年特發性關節炎、川崎病、角膜炎、乾燥性角膜結膜炎、狼瘡、顯微鏡下多血管炎、莫倫氏潰瘍、分枝桿菌感染、視神經視網膜炎、寄生蟲感染、小兒葡萄膜炎、結節性多動脈炎、手術後病變、後部睫狀體炎、銀屑病、反應性關節炎、復發性多軟骨炎、視網膜血管炎、視網膜炎、類風濕關節炎、類肉瘤病、與類肉瘤病相關之視網膜炎、季節性過敏、鞏膜炎、休格連氏症 候群、螺旋體感染、史蒂芬-瓊森症候群、全身性紅斑狼瘡、高安氏動脈炎、毒素暴露、潰瘍性結腸炎、葡萄膜炎、病毒感染、伏格特-小柳-原田病、及韋格納氏肉芽腫病(肉芽腫病合併多血管炎)。
揭示於本文中之方法包括利用揭示於本文中之醫藥組合物治療個體(人、獸類動物(狗、貓、爬行動物、鳥類等等)、活家畜(馬、牛、山羊、豬、雞等等)、及研究動物(猴、大鼠、小鼠、魚等等)。治療個體包括遞送治療有效量之醫藥組合物。治療有效量包括彼等可提供有效量、預防性治療、及/或治療性治療之治療有效量。
「有效量」為在個體中達成所預期生理改變所需的醫藥組合物量。有效量通常係出於研究目的投與。揭示於本文中之有效量達成意欲研究醫藥組合物於治療眼科病症中之有效性之研究試驗中所預期之生理改變。有效量可減少TEM群體(換言之，減低增殖)；減低TEM之活化，如藉由細胞激素生成(例如，IFN-γ；IL-2；IL-4；IL-10；IL-17及IL-21)及/或穿孔蛋白生成測得；及/或減低Kv1.3通道之表現。可基於與源自相同個體之先前測量之參考程度或相較於從群體資料庫獲得之參考程度的比較來觀察該等減低情況。
「預防性治療」包括投與給未呈現眼科病症之徵兆或症狀或僅呈現眼科病症之早期徵兆或症狀之個體之治療使得基於消除、預防、或降低進一步發展出眼科病症之風險之目的投與該治療。因此，預防性治療係作為針對於眼科病症之預防性治療之功能。作為一實例，針對諸如乾眼之發炎性眼科病症之預防性治療可消除、預防、或降低發展出諸如以下之會導致乾眼診斷之症狀之風險：眼睛刺痛或灼傷；好像有東西在眼睛中之沙粒感；於嚴重乾眼期後過量流淚之發作；眼睛絲黏分泌物；眼睛疼痛及泛紅；視力障礙發作；及/或沉重眼瞼，此乃是熟習此項技藝者所明瞭的。個體存在發展出會導致乾眼診斷之症狀之風險，假若其極大機率地暴露於會導致乾眼之條件，諸如季節性 改變、自體免疫疾病之發展或突發、暴露於病毒或受病毒感染、暴露於花粉或導致季節性過敏之其他刺激、及類似。作為另一實例，針對諸如葡萄膜炎之發炎性眼科病症之預防性治療可消除、防止、或降低發展出諸如以下之會導致葡萄膜炎診斷之症狀之風險：眼睛泛紅；眼睛疼痛；對光敏感；視力障礙；視野暗、漂浮點(漂浮性黑影(floater))；視力下降；及/或於眼睛內側在眼睛著色區域下部(虹膜)前方的略帶白色區域(前房積膿)，此乃是熟習此項技藝者所明瞭的。如熟習此項技藝者所明瞭，可藉由為人所熟知之客觀及/或主觀測量法來評估各種該等所述參數。
「治療性治療」包括投與給呈現眼科病症症狀或徵兆之個體之治療且係基於減輕或消除其等眼科病症徵兆或症狀之目的而投與。治療性治療可減低、控制、或消除眼科病症之呈現或活性且/或減低、控制或消除眼科病症之副作用。作為一實例，對諸如乾眼之發炎性眼科病症之治療性治療可減低、控制、或消除會導致乾眼診斷之症狀，諸如眼睛刺痛或灼傷；好像有東西在眼睛中之沙粒感；於嚴重乾眼期後過量流淚之發作；眼睛絲黏分泌物；眼睛疼痛及泛紅；視力障礙發作；及/或沉重眼瞼，此乃是熟習此項技藝者所明瞭的。作為另一實例，對諸如葡萄膜炎之發炎性眼科病症之治療性治療可減低、控制、或消除會導致葡萄膜炎診斷之症狀，諸如眼睛泛紅；眼睛疼痛；對光敏感；視力障礙；漂浮性黑影；視力下降；及/或於眼睛內側在虹膜下部前方的前房積膿，此乃是熟習此項技藝者所明瞭的。如熟習此項技藝者所明瞭，可藉由為人所熟知之客觀及/或主觀測量法來評估各種該等所述參數。
對於投藥而言，有效量及治療有效量(於本文中亦稱為劑量)可在一開始時基於活體外分析及/或動物模型研究結果進行估計。例如，劑量可經過在動物模型中調配以達成循環濃度範圍，該循環濃度範圍 包括如在抗活化、增殖、細胞激素生成、及/或TEM之穿孔蛋白生成細胞培養中測得之IC50。該資訊可用於更準確地確定在受關注個體中之有用劑量。
以治療有效量投與給特定個體的實際量可由醫師、獸醫、或研究人員考量諸如物理及生理因素(包括標靶、體重、病症嚴重度、眼科病症類型、先前治療性干預或併用的治療性干預、個體自發病、及投藥途徑)之參數來確定。
劑量可經過適當調整以在局部或全身獲得所預期的基於毒素之治療性肽含量。典型地，本發明之基於毒素之治療性肽在自0.001mg/kg至250mg/kg，較佳自0.01mg/kg至100mg/kg基於毒素之治療性肽，更佳自0.05mg/kg至75mg/kg基於毒素之治療性肽之劑量範圍下展現其療效。一適宜劑量可以每天分多次子劑量投與。典型地，劑量或子劑量可包含0.1mg至500mg基於毒素之治療性肽/單位劑型。一種更佳的劑量將包含0.5mg至100mg基於毒素之治療性肽/單位劑型。
其他有用的劑量常在0.001至10,000微克(μg)基於毒素之治療性肽/公斤(kg)身體質量範圍，在1至5,000μg/kg身體質量範圍內、在1至1,000μg/kg身體質量範圍內或在1至100μg/kg身體質量範圍內。通常，劑量可在自0.1至5μg/kg或自0.5至1μg/kg範圍內。於其他實例中，劑量可包括1μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、15μg/kg、20μg/kg、25μg/kg、30μg/kg、35μg/kg、40μg/kg、45μg/kg、50μg/kg、55μg/kg、60μg/kg、65μg/kg、70μg/kg、75μg/kg、80μg/kg、85μg/kg、90μg/kg、95μg/kg、100μg/kg、150μg/kg、200μg/kg、250μg/kg、300μg/kg、350μg/kg、400μg/kg、450μg/kg、500μg/kg、550μg/kg、600μg/kg、650μg/kg、700μg/kg、750μg/kg、800μg/kg、850μg/kg、900μg/kg、950μg/kg、1,000μg/kg、1,500 μg/kg、2,000μg/kg、2,500μg/kg、3,000μg/kg、3,500μg/kg、4,000μg/kg、5,000μg/kg、6,000μg/kg、7,000μg/kg、8,000μg/kg、9,000μg/kg、10,000μg/kg、0.1至5mg/kg或0.5至1mg/kg。於其他實例中，劑量可包括1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、或50mg/kg。
當使用混合物時，常見投與媒劑(例如，丸劑、錠劑、植入物、泵、可注射溶液等等)可同時包含基於毒素之治療性肽及其他藥物或藥劑。該混合物之個別組分可個別地以治療有效量投與或以可提供治療有效量之其組合投與。
於特定的實施例中，該等劑量可以較低水平開始接著增加直到達成所預期效果。如果在該等劑量下個體中之反應過低，則可在個體耐受性容許的程度上使用甚至更高的劑量(或有效較高劑量，藉由不同、較局部遞送途徑)。預期在例如24小時連續給藥或每天多次劑量以達成適宜全身性或組織特異性基於毒素之治療性肽含量。
治療有效量可藉由在治療療程中投與單次或多次劑量(例如，每天一次、每天兩次、每天三次、每天四次、每天五次、每天六次、每天七次、每天八次、每天九次、每天十次、每2天一次、每3天一次、每4天一次、每5天一次、每6天一次、每週一次、每2週一次、每3週一次、每月一次、每2個月一次、每3個月一次、每4個月一次、每5個月一次、每6個月一次、每7個月一次、每8個月一次、每9個月一次、每10個月一次、每11個月一次、或每年一次)來達成。
醫藥組合物可結合與一或多種可緩解眼科病症症狀之全身或局部用產品諸如人工淚液、抗生素、環孢黴素、或腎上腺皮質類固醇投與。
可採行多種投藥途徑。所選的特定模式可取決於遞送的特定醫藥組合物、所治療眼科病症的嚴重度、及提供治療有效量所需要的劑 量。可使用醫學上可接受之任何投藥模式，意指可提供治療有效量之基於毒素之治療性肽而不會產生超過根據合理醫學判斷之投藥效益的臨床上不可接受副作用之任何模式。例示性投藥途徑包括動脈內、皮內、病竃內、淋巴內、肌肉內、鼻內、淋巴結內、眼內、非經腸式、腹膜內、前列腺內、直腸內、鞘內、瘤內、陰道內、靜脈內、囊泡內、玻璃體內、經口、皮下、舌下、及/或經局部投與且更特定言之係藉由動脈內、皮內、病竃內、淋巴內、肌肉內、鼻內、淋巴結內、眼內、非經腸式、腹膜內、前列腺內、直腸內、鞘內、瘤內、陰道內、靜脈內、囊泡內、玻璃體內、經口、皮下、及/或舌下注射。
醫藥組合物可以呈滴眼劑、結膜下植入物、眼內植入物、眼內注射液、玻璃體內注射液、玻璃體內植入物、眼球筋膜囊下膠囊注射液及淚管栓塞經局部遞送至眼睛及附器。醫藥組合物之遞送亦可藉由超音或離子導入來促進。
對於醫藥組合物之投與而言，一種適宜途徑為注射。執業醫師根據個體及諸如皮下、靜脈內等等之注射類型當可明瞭經由注射之投藥方法。美國專利案第7,918,824號揭示適用於個體使用之針筒。
基於毒素之治療性肽之投與亦可使用泵來達成(參見：例如，Luer等人，The Annals of Pharmacotherapy，27,912(1993)，Zimm等人，Cancer Research，44,1698(1984)及Ettinger等人，Cancer，41,1270(1978))。
或者，可使用靶向治療，以藉由使用諸如抗體或細胞特異性配體之靶向系統將基於毒素之治療性肽遞送，更特定言之係遞送至特定細胞類型。
醫藥組合物亦可在基於細胞之遞送系統中進行投與，其中引入編碼基於毒素之治療性肽之核苷酸序列至設計用於植入個體體內(例如，植入眼睛中)之細胞中。於其他實施例中，可投與核苷酸序列並 經轉染進入個體細胞中。
適宜之核苷酸序列可基於各別基於毒素之治療性狀以所揭示序列及已知基因碼為基礎合成製得。簡言之，術語「基因」係指編碼基於毒素之治療性肽之核酸序列。該定義包括各種序列多態性、突變、及/或序列變體，其中該等改變不會影響經編碼之基於毒素之治療性肽之功能。術語「基因」可不僅包括編碼序列而且包括諸如啟動子、增強子及終止區域之調控區域。該術語可進一步包括自mRNA轉錄接合之所有內含子及其他DNA序列、及起因於替代接合位點之變體。編碼基於毒素之治療性肽之核酸序列可為引導基於毒素之治療性肽之表現之DNA或RNA。該等核酸序列可為轉錄為RNA之DNA序列或轉譯為蛋白質之RNA序列。核酸序列包括全長核酸序列及衍生自全長蛋白質之非全長序列。該等序列亦包括天然序列或可經引入以於特定細胞類型中優先提供密碼子之序列之簡併密碼子。編碼本文所揭示的基於毒素之治療性肽之基因序列可於可公開取得的資料庫及公開案中取得。
於一些實施例中，多核苷酸包括質體、cDNA、或mRNA，其可包括(例如)用於表現基於毒素之治療性肽之序列(例如，基因)。適宜之質體包括可用於將基因轉移至細胞之標準質體載體及微環(minicircle)質體。多核苷酸(例如，微環質體)可進一步包括任何其他序列資訊以促使遺傳物質(例如，編碼基於毒素之治療性肽之序列)轉移至細胞。例如，多核苷酸可包括啟動子，諸如一般啟動子、組織特異性啟動子、細胞特異性啟動子、及/或對細胞核或細胞質具特異性之啟動子。啟動子及質體(例如，微環質體)為相關技藝熟知且可使用習知技術製得。如此處進一步所述，多核苷酸可用於轉染細胞。除非另作指明，否則術語轉染、經過轉染、或使...轉染可用於指示細胞中存在外源多核苷酸或由其表現之肽。已知許多種載體能夠介導基因至 細胞之轉移，正如相關技藝所知。
於特定的實施例中，該種遞送方法可用於脊髓區域。適宜之遞送系統述於美國專利案第5,550,050號及經公開之PCT申請案號WO 92/19195、WO 94/25503、WO 95/01203、WO 95/05452、WO 96/02286、WO 96/02646、WO 96/40871、WO 96/40959、及WO 97/12635中。
本發明亦提供篩選罹患乾眼或其他眼科病症之個體以評估本文所揭示方法於所篩選個體中之潛在治療效益之方法。於一個實施例中，Kv1.3通道於個體之T-細胞群體中之表現程度係使用偵測該通道之表面表現之抗體來評估。可實施該等方法的抗鉀通道Kv1.3(細胞外)抗體可自Alomone(以色列)購得；抗體亦可自LifeSpan Biosciences,Inc.(美國華盛頓州西雅圖)購得。Kv1.3通道水平可指示可有效藉由本文所揭示的基於毒素之治療性肽來治療之眼科病症。
為識別出將自本文所揭示方法獲益之個體，將個體Kv1.3通道水平與從資料庫獲得之參考水平進行比較。來自資料庫之參考水平可源自相同個體中先前測量或可衍生自群體。「群體」為具有類似指定特徵之個體之任何分組。可根據(例如)臨床參數、臨床評估、治療性療法、疾病狀態(健康或患有本文所揭示的眼科病症)、眼科病症之嚴重度等等來分組。
「資料庫」如本文中使用為自在期望之條件下評估樣本(或樣本群體)所獲得的數字數值集。資料庫數值可(例如)藉由以實驗方式自樣本獲得測量值及由該等測量值建構資料庫來獲得。如熟習此項技藝者所明瞭，參考水平可係基於(例如)本技藝中有用並已知之用於從個別資料點集；例如，平均值、中位數、平均值中位數等等達成有意義匯總參考水平之任何數學或統計公式。或者，參考水平或可建立參考水平之資料庫可從諸如實驗室之服務提供場所、或從資料庫或已儲存資 料庫的伺服器獲得。
於特定的實施例中，個體可基於Kv1.3通道水平在統計上與源自過去曾自所揭示治療獲益之群體之參考水平無明顯差異選擇為將自本文所揭示治療獲益者。於其他實施例中，個體可基於Kv1.3通道水平與源自罹患本文所揭示眼科病症之群體之參考水平無統計顯著差異選擇為將自本文所揭示治療獲益者。於其他特定的實施例中，個體可基於Kv1.3通道水平統計上明顯高於源自健康群體之參考水平選擇為將自本文所揭示治療獲益者。
Kv1.3通道水平無明顯差異，假若該差異係在將預期僅基於改變發生的程度範圍內。相對地，統計顯著差異或增加為大於將預期僅根據改變所發生者。統計顯著性或無統計顯著性可藉由相關技藝中熟知的任何多種方法來確定。統計顯著性之常用量度之一個實例為p-值。p-值表示獲得與特定資料點相當之特定結果之機率，其中該資料點係基於僅隨機改變之結果。一結果在小於或等於0.05之p-值下通常被視為顯著(而非隨機改變)。
所述篩選方法可用於指導個體治療。例如，假若個體Kv1.3通道水平將個體識別為將自本文所揭示方法獲益者，則可對該個體開立或提供治療有效量之本文所揭示醫藥組合物。篩選方法之該等結果亦可(例如)用於提供臨床決策支持，諸如決定是否延長干預或治療時間，用於推薦對處在風險狀態的患者進行預防性體檢，用於推薦提高就診頻率，用於推薦增加測試次數，且/或用於推薦干預。該等方法之結果亦可用於治療篩選，確定對治療、調整及治療給藥之反應，監測持續性治療效率，及指示治療療法之變動。
製造方法
基於毒素之治療性肽可利用重組DNA技術來製造。基於毒素之治療性肽亦可利用Merrifield固相合成法製得，然而，亦可利用相關 技藝中已知之其他相當的化學合成。固相合成法係自基於毒素之治療性肽的C-端藉由使受保護α-胺基酸與適宜樹脂偶聯開始。該種起始物質可藉由使α-胺基受保護之胺基酸經酯鍵附接至氯甲基化樹脂或羥甲基樹脂、或經醯胺鍵附接至二苯甲基胺(BHA)樹脂或對甲基二苯甲基胺(MBHA)樹脂製得。Bodansky等人，Chem.Ind.(London)38,1597(1966)描述羥甲基樹脂之製法。氯甲基化樹脂可自Bio Rad Laboratories(加州裡奇蒙)及自Lab.Systems,Inc獲得。Stewart及Young，Solid phase peptide synthesis.W.H.Freeman,Kent，英國(1969)描述該種樹脂之製法。BHA及MBHA樹脂擔體可商業購得，且一般係在合成的所期望基於毒素之治療性肽在C-端具有未經取代之醯胺時使用。因此，固體樹脂擔體可係任何為相關技藝所熟知的其等固體樹脂擔體，諸如，具有式-O-CH2-樹脂擔體、-NH BHA樹脂擔體、或-NH-MBHA樹脂擔體者。當需要未經取代之醯胺時，使用BHA或MBHA樹脂可能有利，此乃因裂解可直接提供醯胺。若需要N-甲基醯胺，則可自N-甲基BHA樹脂生成。當需要其他經取代之醯胺時，可使用美國專利案第4,569,967號之教示，或當在C-端需要除游離酸外之再其他基團時，可較佳利用如Houben及Weyl，Methoden der organischen Chemie，Georg Theime，斯圖加特(1974)中所述的傳統方法來合成基於毒素之治療性肽。
在意欲合成在C-端具有游離酸之基於毒素之治療性肽之情況下，經Boc或Fmoc及經側鏈保護基保護之C-端胺基酸若適宜則可先依照述於Horiki等人，Chem.Lett.,165-168(1978)中之程序在攪拌下使用含於二甲基甲醯胺(DMF)中之KF於約60℃與氯甲基化樹脂偶聯24小時。在使BOC受保護之胺基酸偶聯至樹脂擔體之後，可(例如)藉由使用在二氯甲烷中之三氟乙酸(TFA)或僅使用TFA來將α-胺基保護基脫去。保護基之脫去可在介於0℃與室溫之間之溫度下進行。可依 Schroeder及Lubke,The Peptides,Academic Press：紐約(1965)中所述來使用其他標準裂解試劑(諸如，含於二噁烷中之HCl)及用於將特異性α-胺基保護基脫去之條件。
在將α-胺基保護基脫去之後，殘留的α-胺基-及側鏈-受保護之胺基酸可依所期順序逐步進行偶聯以獲得中間化合物，或作為在合成中分開地添加各別胺基酸之替代，其中一些可在添加至固相反應器之前彼此相偶聯。適宜偶聯試劑之選擇係屬於本技藝中之技術。例示性偶聯試劑包括N,N'-二環己基碳二亞胺(於HoBt或HoAt存在下之DCC、DIC、HBTU、HATU、TBTU)。
相關技藝中熟知用於包括基於毒素之治療性肽之肽之固相合成中之活化劑。適宜活化劑之實例包括碳二亞胺，諸如N,N'-二異丙基碳二亞胺及N-乙基-N'-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺。Schroeder及Lubke，The Peptides，Academic Press：紐約(1965)及Kapoor,J.Pharm.Sci.,59(1),1-27(1970)描述其他活化劑及其於肽偶聯中之用途。
各經保護之胺基酸或胺基酸序列可以過量兩倍或更多倍方式引入固相反應器中，及偶聯可在DMF：CH2Cl2(1：1)或僅在DMF或CH2Cl2介質中進行。於中間偶聯發生之情況中，可在下一個胺基酸偶聯前將α-胺基保護基脫去之前重複偶聯程序。在合成各階段之偶聯反應之成功在人工進行情況下可如Kaiser等人，Anal.Biochem.第34(2)卷，595-8(1970)所述藉由茚三酮反應來監測。
偶聯反應可如在Beckman 990自動合成儀上利用諸如Rivier等人，Biopolymers，17(8),1927-1938(1978)中所報告的程式以自動化進行。
在已完成所期望的胺基酸序列之後，可經諸如液態氟化氫或TFA(假若使用Fmoc化學品)之試劑處理自樹脂擔體將中間肽移去，該 試劑不僅可自樹脂裂解肽而且可裂解所有殘留的側鏈保護基及N-端處未在前面步驟脫去的α-胺基保護基以獲得呈游離酸形式之肽。假若序列中存在Met，則可在自樹脂利用HF裂解肽之前先使用TFA/乙二硫醇使Boc保護基脫去以消除可能S-烷基化。在使用氟化氫或TFA來裂解之情況下，可於反應容器中包含一或多種諸如苯甲醚、甲酚、二甲基硫醚及甲基乙基硫醚之清除劑。
直鏈基於毒素之治療性肽之環化會受到影響，此與使基於毒素之治療性肽環化同時使肽-樹脂之一部分之環化相反，可在Cys殘基之間形成鍵。為使該雙硫環化鍵發揮作用，完全受保護之基於毒素之治療性肽可自羥甲基化樹脂或氯甲基化樹脂擔體藉由相關技藝中熟知的氨解裂解以獲得可接著適宜地環化及脫去保護基之完全受保護之醯胺中間物。或者，脫去保護基、以及基於毒素之治療性肽自上述樹脂或二苯甲基胺(BHA)樹脂或甲基二苯甲基胺(MBHA)之裂解可於0℃下利用氫氟酸(HF)或TFA接著如上所述氧化來進行。
基於毒素之治療性肽亦可使用自動合成儀來合成。於該等實施例中，胺基酸可使用Advanced Chemtech 357自動肽合成儀於C-端開始依序偶聯至MBHA Rink樹脂(通常係100mg樹脂)。偶聯係使用含於N-甲基吡咯啶酮(NMP)中之1,3-二異丙基碳二亞胺或藉由六氟磷酸2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓(HBTU)及二乙基異丙基乙胺(DIEA)來進行。Fmoc保護基可經含於二甲基甲醯胺(DMF)中之哌啶之20%溶液處理脫去。樹脂於隨後用DMF洗滌(兩次)接著用甲醇及NMP洗滌。
例示性實施例
1.一種治療有需要之個體之眼科病症之方法，該方法包括投與該個體治療有效量之包含具有相對SEQ ID NO：1至256中任一者至少80%序列一致性之基於毒素之治療性肽之醫藥組合物。
2.如實施例1之方法，其中該基於毒素之治療性肽具有相對SEQ ID NO：1至256中任一者至少85%的序列一致性。
3.如實施例1或2之方法，其中該基於毒素之治療性肽具有相對SEQ ID NO：1至256中任一者至少90%的序列一致性。
4.如實施例1至3中任一種實施例之方法，其中該基於毒素之治療性肽具有相對SEQ ID NO：1至256中任一者至少95%的序列一致性。
5.如實施例1至4中任一種實施例之方法，其中該基於毒素之治療性肽具有相對SEQ ID NO：1至256中任一者至少96%的序列一致性。
6.如實施例1至5中任一種實施例之方法，其中該基於毒素之治療性肽具有相對SEQ ID NO：1至256中任一者至少97%的序列一致性。
7.如實施例1至6中任一種實施例之方法，其中該基於毒素之治療性肽具有相對SEQ ID NO：1至256中任一者至少98%的序列一致性。
8.如實施例1至7中任一種實施例之方法，其中該基於毒素之治療性肽具有相對SEQ ID NO：1至256中任一者至少99%的序列一致性。
9.如實施例1之方法，其中該基於毒素之治療性肽為具有相對SEQ ID NO：225至256中任一者至少80%序列一致性之基於毒素之肽。
10.如實施例9之方法，其中該基於毒素之肽具有相對SEQ ID NO：225至256中任一者至少85%的序列一致性。
11.如實施例9或10之方法，其中該基於毒素之肽具有相對SEQ ID NO：225至256中任一者至少90%的序列一致性。
12.如實施例9至11中任一種實施例之方法，其中該基於毒素之肽具有相對SEQ ID NO：225至256中任一者至少95%的序列一致性。
13.如實施例9至12中任一種實施例之方法，其中該基於毒素之肽具有相對SEQ ID NO：225至256中任一者至少96%的序列一致性。
14.如實施例9至13中任一種實施例之方法，其中該基於毒素之肽具有相對SEQ ID NO：225至256中任一者至少97%的序列一致性。
15.如實施例9至14中任一種實施例之方法，其中該基於毒素之肽具有相對SEQ ID NO：225至256中任一者至少98%的序列一致性。
16.如實施例9至15中任一種實施例之方法，其中該基於毒素之肽具有相對SEQ ID NO：225至256中任一者至少99%的序列一致性。
17.如實施例1之方法，其中該基於毒素之治療性肽為具有相對SEQ ID NO：1至224中任一者至少80%序列一致性之基於ShK之肽。
18.如實施例17之方法，其中該基於ShK之肽具有相對SEQ ID NO：1至224中任一者至少85%的序列一致性。
19.如實施例17或18之方法，其中該基於ShK之肽具有相對SEQ ID NO：1至224中任一者至少90%的序列一致性。
20.如實施例17至19中任一種實施例之方法，其中該基於ShK之肽具有相對SEQ ID NO：1至224中任一者至少95%的序列一致性。
21.如實施例17至20中任一種實施例之方法，其中該基於ShK之肽具有相對SEQ ID NO：1至224中任一者至少96%的序列一致性。
22.如實施例17至21中任一種實施例之方法，其中該基於ShK之肽具有相對SEQ ID NO：1至224中任一者至少97%的序列一致性。
23.如實施例17至22中任一種實施例之方法，其中該基於ShK之肽具有相對SEQ ID NO：1至224中任一者至少98%的序列一致性。
24.如實施例17至23中任一種實施例之方法，其中該基於ShK之肽具有相對SEQ ID NO：1至224中任一者至少99%的序列一致性。
25.如實施例1及17至20中任一種實施例之方法，其中該基於ShK之肽具有相對SEQ ID NO：1至少95%的序列一致性。
26.如實施例1及17至20中任一項之方法，其中該基於ShK之肽具有相對SEQ ID NO：2至少95%的序列一致性。
27.如實施例1及17至20中任一種實施例之方法，其中該基於ShK之肽具有相對SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：210、 SEQ ID NO：217、及/或SEQ ID NO：218至少95%的序列一致性。
28.如實施例1、17至20、及27中任一種實施例之方法，其中該基於ShK之肽具有相對SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：210、SEQ ID NO：217、及/或SEQ ID NO：218至少96%的序列一致性。
29.如實施例1、17至20、27、及28中任一種實施例之方法，其中該基於ShK之肽具有相對SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：210、SEQ ID NO：217、及/或SEQ ID NO：218至少97%的序列一致性。
30.如實施例1、17至20、及27至29中任一種實施例之方法，其中該基於ShK之肽具有相對SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：210、SEQ ID NO：217、及/或SEQ ID NO：218至少98%的序列一致性。
31.如實施例1、17至20、及27至30中任一種實施例之方法，其中該基於ShK之肽具有相對SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：210、SEQ ID NO：217、及/或SEQ ID NO：218至少99%的序列一致性。
32.如實施例1至31中任一種實施例之方法，其中該基於毒素之治療性肽係天然或合成的。
33.如實施例1至32中任一種實施例之方法，其中該基於毒素之治療性肽係附接至具有陰離子電荷之有機或無機化學實體。
34.如實施例1至33中任一種實施例之方法，其中該基於毒素之治療性肽的C-端為酸或醯胺。
35.如實施例1至34中任一種實施例之方法，其中該醫藥組合物係經局部投與眼睛。
36.如實施例1至35中任一種實施例之方法，其中該醫藥組合物係 藉由非經腸及/或腸內途徑投與。
37.如實施例1至36中任一種實施例之方法，其中該醫藥組合物係經局部或藉由非經腸及/或腸內途徑投與。
38.如實施例1至37中任一種實施例之方法，其中該醫藥組合物係經玻璃體內注射投與。
39.如實施例1至38中任一種實施例之方法，其中該醫藥組合物係依每天六次、每天五次、每天四次、每天三次、每天兩次、每天一次、每週一次、每月一次、每兩個月一次、每三個月一次、或每六個月一次投與。
40.如實施例1至39中任一種實施例之方法，其中該眼科病症為乾眼、葡萄膜炎、小兒葡萄膜炎、乾燥性角膜結膜炎、表層鞏膜炎、角膜炎、視網膜血管炎、鞏膜炎、眼內炎、瘢痕性類天皰瘡、莫倫氏潰瘍、及/或巨大細胞病毒介導之視網膜炎。
41.如實施例1至40中任一種實施例之方法，其中該眼科病症係因全身性紅斑狼瘡、顯微鏡下多血管炎、結節性多動脈炎、韋格納氏肉芽腫病(肉芽腫病合併多血管炎)、類肉瘤病、貝賽特氏症候群、伏格特-小柳-原田病、高安氏動脈炎、類風濕關節炎、休格連氏症候群、復發性多軟骨炎、僵直性脊椎炎、銀屑病、及/或徹奇-斯全司症候群引起。
42.如實施例1至41中任一種實施例之方法，其中該個體為成人、兒童或青少年。
43.如實施例1至42中任一種實施例之方法，其中該醫藥組合物包含防腐劑。
44.如實施例43之方法，其中該防腐劑為氯化苄二甲羥銨(0.025%)、抗壞血酸、氯化苄乙氧銨(0.01%)、氯丁醇(0.5%)、乙酸苯汞(0.004%)、硝酸苯汞(0.004%)、硫柳汞(0.01%)、對羥基苯 甲酸甲酯(0.1至0.2%)、及/或對羥基苯甲酸丙酯(0.04%)。
45.如實施例1至44中任一種實施例之方法，其中該醫藥組合物包含黏度增強劑。
46.如實施例45之方法，其中該黏度增強劑為羧甲基纖維素(1%)、羥乙基纖維素(0.8%)、羥丙基纖維素(1%)、甲基纖維素(2%)、聚乙烯醇(1.4%)、聚卡波菲、結蘭膠、黃原膠、卡波、聚(苯乙烯-二乙烯苯)磺酸、及/或聚乙烯吡咯烷酮(1.7%)。
47.如實施例1至46中任一種實施例之方法，其中該醫藥組合物包含抗氧化劑。
48.如實施例47之方法，其中該抗氧化劑為乙二胺四乙酸(0.1%)、亞硫酸氫鈉(0.1%)、偏亞硫酸氫鈉(0.1%)、及/或硫脲(0.1%)。
49.如實施例1至48中任一種實施例之方法，其中該醫藥組合物包含緩衝劑、滲透調節劑、及表面活性劑。
50.如實施例1至49中任一種實施例之方法，其中該醫藥組合物包含10mM磷酸鈉；0.8% w/v NaCl；及於0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、或4 w/v%下之聚山梨醇酯20，其中該組合物具有5.0、5.5、6.0、6.5、7、7.5、或8之pH。
51.如實施例1至50中任一種實施例之方法，其中該醫藥組合物包含於0.05 w/v%下之聚山梨醇酯20，及其中該組合物具有6.0之pH。
52.如實施例1至49中任一種實施例之方法，其中該醫藥組合物包含10mM磷酸鈉；0.8% w/v NaCl；及於0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、或4 w/v%下之聚山梨醇酯80，其中該組合物具有5.0、5.5、6.0、6.5、7、7.5、或8之pH。
53.如實施例1至49或52中任一種實施例之方法，其中該醫藥組合物包含於0.05 w/v%下之聚山梨醇酯80，及其中該組合物具有6.0之 pH。
54.如實施例1至53中任一種實施例之方法，其中該治療有效量可增進淚液形成；減輕眼睛刺痛或灼傷感覺；減少眼睛絲黏分泌物生成；減輕眼睛疼痛；減輕眼睛泛紅；減少視力障礙發作之頻率及/或持續時間；降低光敏感性；減少個體視野中暗、漂浮點發作之頻率及/或持續時間；提高個體視力；減輕眼睛中沙粒感覺；減輕沉重眼瞼感覺；減輕嚴重乾眼期後過量流淚之發作；及/或縮小於眼睛內側在虹膜前方的略帶白色區域。
55.一種評估個體以預測藉由實施例1至54中任一種實施例之方法治療之結果的方法，該方法包括：分析來自該個體生物樣本之T-細胞之Kv1.3通道表現程度；其中Kv1.3通道表現程度相對健康參考或參考群體增加指示患者可接受以具有相對SEQ ID NO：1至224中任一者至少80%序列一致性之基於ShK之肽治療。
56.一種篩選可自如實施例1至54中任一種實施例之方法的治療獲益之個體的方法，該方法包括：測量來自該個體生物樣本之T-細胞及/或巨噬細胞之Kv1.3通道表現程度；將該個體之Kv1.3通道表現程度與健康對照或參考群體之Kv1.3通道表現程度進行比較；及假若該個體中Kv1.3通道表現水平相較於健康對照或參考群體增加，則確定該個體將自如實施例1至54中任一種實施例之方法的治療獲益。
57.一種篩選用於臨床試驗之個體的方法，該方法包括：測量來自該個體生物樣本之T-細胞及/或巨噬細胞之Kv1.3通道表現程度；將該個體之Kv1.3通道表現程度與健康對照或參考群體之Kv1.3通道表現程度進行比較；及假若該個體具有相較健康對照或參考群體提高的Kv1.3通道表現程度，則選擇該個體用於臨床試驗，或假若該個體具有相較健康對照或參考群體減低或不變的Kv1.3通道表現程度，將該個體自臨床試驗排除，。
58.一種篩選針對於個體之眼科病症之可能治療之方法，該方法包括：測量來自該個體生物樣本之T-細胞及/或巨噬細胞之Kv1.3通道表現程度；將該個體之Kv1.3通道表現程度與健康對照或參考群體之Kv1.3通道表現程度進行比較；及假若該個體具有相較健康對照或參考群體增加之Kv1.3通道表現程度，則確定如實施例1至54中任一種方法為針對於個體之治療。
59.如實施例56至58中任一種實施例之方法，其中該Kv1.3通道表現程度係利用檢測來測量。
60.如實施例55之方法，其中該Kv1.3通道表現程度係利用檢測來分析。
61.如實施例55至60中任一種實施例之方法，該方法進一步包括藉由前發炎免疫刺激因子或T-細胞活化劑在基於毒素之治療性肽的存在下激發T-細胞。
62.如實施例61之方法，其中該基於毒素之治療性肽為基於ShK之肽。
63.如實施例62之方法，其中該基於ShK之肽具有相對SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：210、SEQ ID NO：217、及/或SEQ ID NO：218至少95%的序列一致性。
64.如實施例55至63中任一種實施例之方法，該方法進一步包括測量前發炎細胞激素生成。
65.如實施例64之方法，其中所測得細胞激素為干擾素(IFN)-γ、介白素(IL)-1a、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-17F、IL-17A/F、IL-21、IL-22、IL-23、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)-α、金屬蛋白酶(MMP)3、及/或MMP9。
66.如實施例55至65中任一種實施例之方法，該方法進一步包括利用眼抗原於存在或不存在基於毒素之治療性肽下激發T-細胞。
67.如實施例66之方法，其中該基於毒素之治療性肽為基於ShK之肽。
68.如實施例67之方法，其中該基於ShK之肽具有相對SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：210、SEQ ID NO：217、及/或SEQ ID NO：218至少95%的序列一致性。
69.如實施例68之方法，其中該基於ShK之肽具有式SEQ ID NO：217。
70.一種如實施例1至69中任一種實施例之例示性實施例，其中該眼科病症為發炎性眼科病症。
下文實例描述揭示於本文中之方法之最佳化。包含該等實例以證實本發明之特定實施例。熟習此項技藝者根據本發明當知曉可在不脫離本發明之精神及範疇下對本文所揭示的特定實施例做出許多種改變而仍舊達成類似或相似結果。
實例
實例1。藉由基於毒素之治療性肽抑制發炎性細胞激素生成。本實例描述如本文所揭示的基於毒素之治療性肽是否可調節造成組織損傷及與眼科病症相關之發炎結果之細胞激素水平之評估。
產生細胞激素IL-17-A、-F、-A/F、IL-21、及IL22之Th17細胞、及產生IL-17-A、-F、-A/F、及IFN-γ之Th1/Th17細胞日益與各種自體免疫疾病包括使眼睛受到影響之自體免疫疾病(諸如葡萄膜炎之各種形式)及乾眼疾病之病理相關聯。類似IFN-γ，藉由增加趨化細胞激素生成，IL-17致使單核細胞/巨噬細胞及嗜中性粒細胞募集至發炎部位。IL-17之早期來源包括常駐於眼表面組織中之γδ T細胞、及累積於 眼表面組織諸如於乾燥性壓力誘發之乾眼早期之結膜中之自然殺手(NK)T-細胞。NK T-細胞亦為與減小之杯狀細胞密度、改變之角膜上皮黏蛋白、及角膜上皮屏障功能障礙相關聯之IFN-γ的早期來源。
CD4+ Th1、Th17、及Th1/Th17 T-細胞在乾眼及其他眼科病症之抗原特異性慢性階段期間之組織損傷中發揮主要作用。活化CD4+ T-細胞位於乾眼患者之眼表面上且是造成疾病進展的原因。總言之，Th1及Th17衍生之細胞激素造成乾眼及其他眼科病症中大部分組織損傷結果及為用於治療人類該等疾病之症狀及潛伏性病理過程之適宜標靶。此包括葡萄膜炎之各種形式，包括慢性葡萄膜炎，諸如在幼年特發性關節炎、休格倫氏症候群、及貝賽特氏症候群中所觀察到的慢性葡萄膜炎，其中IFN-γ及IL-17同時與增加之發炎及腺體功能障礙相關聯。因此，乾眼及葡萄膜炎之局部性及全身性病因之共同機轉可靶向於利用揭示於本文中之方法及醫藥組合物之治療。
本實例研究包含本文所揭示基於毒素之治療性肽之醫藥組合物減低因毒胡蘿蔔素引起之前發炎細胞激素分泌之能力(Sigma-Aldrich，美國密蘇裡州聖路易斯)。毒胡蘿蔔素藉由抑制微粒體之肌漿網及內質網中細胞內膜之Ca2+離子泵蛋白來刺激前發炎細胞激素釋放。此種抑制作用會導致快速釋放Ca2+存儲及於隨後活化血漿膜鈣通道。
初代血液細胞之製造。使用全血及周邊血液單核細胞(PBMC)以測試如本文所揭示的基於ShK之治療性肽於治療罹患包括乾眼之眼科病症之個體之適合性。全血可不作任何額外處理地直接分成細胞培養等分試樣以進行實驗分析。
PBMC可如下藉由密度梯度離心自供者血液單離。將血液收集於裝納作為抗凝血劑之肝素鈉及包含聚酯凝膠及一密度梯度之液體之細胞分離介質的收集管(BD Vacutainer CPT)中。該等樣本在室溫下以 1500 RCF離心20分鐘。包含單核細胞及血小板之細胞層正好位於血漿層下方及使用巴斯德吸管(Pasteur Pipette)收集於單獨的15mL圓錐管。用PBS洗滌該等細胞兩次及藉由離心粒化以移去上清液。將經純化之PBMC再懸浮於全RPMI(cRPMI)細胞培養基中及經接種達成用於該分析之適宜密度。
可自其測定細胞激素分泌之其他細胞包括人巨噬細胞/單核細胞、大鼠血液細胞、淋巴結、及脾細胞。
原代血液細胞之處理。將ShK-186在cRPMI中連續稀釋為4X最終濃度工作儲液。每種基於ShK之肽濃度取50μL工作儲液添加至96-孔細胞培養板中的6個孔。使用不含基於ShK之肽之50μL cRPMI作為在陽性對照(不含基於ShK之肽，毒胡蘿蔔素刺激)及陰性對照(不含基於ShK之肽，無毒胡蘿蔔素刺激)孔中之對照處理。將在全RPMI中之100μL全血或200,000 PBMC添加至96-孔細胞培養板中的各個孔。於37℃及5% CO2下培養細胞與基於ShK之肽或培養基對照一小時。於一小時後，將50μL 40uM毒胡蘿蔔素刺激物添加至除陰性對照孔以外之所有孔，該陰性對照孔接收50μL 0.4% DMSO至0.1%最終濃度。將細胞培養48小時。
經處理及經毒胡蘿蔔素刺激之細胞之基於ShK之肽之分析。在藉由毒胡蘿蔔素刺激48小時後，將96孔板以2000RPM離心5分鐘。小心地將上清液轉移至滅菌96-孔板以供樣本分析。使用與磁珠結合之特異性抗體及與鏈黴親和素/藻紅素反應產生螢光信號之二級抗體來偵測細胞激素。偵測到經結合之珠粒並使用Magpix儀器(Luminex Corp.，美國德克薩斯州奧斯汀)定量，然而，如相關技藝中已知的類似技術可用於測量蛋白質生成，諸如(例如)ELISA，使用包括螢光及比色法的偵測方法。
使用上述方法，證實ShK-186(SEQ ID NO：217)可抑制已證實造成 乾眼結果之發炎性細胞激素(包括IL-17、及IFN-γ)。ShK-186抑制在藉由毒胡蘿蔔素刺激之前經ShK-186處理之全血中發炎性細胞激素IL-2、IL-17、IL-4、及IFN-γ水平。IC50值在皮莫耳範圍內，如圖1中所顯示。
ShK-186亦抑制在藉由毒胡蘿蔔素刺激之前經ShK-186處理之PBMC中發炎性細胞激素IL-2、IL-17、IL-4、及IFN-γ水平。IC50值在皮莫耳範圍內，如圖2中所顯示。
該等結果證實包含本文所揭示基於ShK之治療性肽之醫藥組合物可減少與諸如自體免疫眼睛疾病(包括葡萄膜炎)及乾眼之眼科病症相關聯之前發炎細胞激素之分泌。
實例2。在乾眼及對照患者中藉由TEM之Kv1.3通道表現。本實例描述藉由存於乾眼患者中之TEM相較來自健康患者對照之TEM之Kv1.3通道表現的評估，及特徵分析乾眼患者樣本對經本發明之基於毒素之治療性肽(諸如ShK-186)治療反應性。
為了實施功能檢測，從葡萄膜炎或乾眼患者及健康對照單離PBMC。於本實例之第一階段中，細胞係在無活體外刺激下活化後不久進行測試或係在活體外經抗-CD3及抗-CD28抗體或絲裂原活化且接著進行免疫染色及多色流式細胞計數以研究CD4及CD8+ T-細胞子組中TEM表面上Kv1.3通道之表現程度。預期從患者單離的細胞之無活體外刺激下Kv1.3之表現為高，但該表現可能在活體外活化後增加。為驗證Kv1.3是治療標靶，取自乾眼或葡萄膜炎患者之結膜活體組織檢查標本接受藉由以抗-CD3+、-CD4+、及-Kv1.3抗體染色之免疫組織化學分析來識別Kv1.3之表現程度提高的CD3+/CD4+ T-細胞群體。類似地，針對CD40、CD68、CD163、iNOS等等之抗體及抗-Kv1.3抗體組合可用於識別經活化之巨噬細胞。預期取自罹患乾眼或諸如慢性葡萄膜炎之其他自體免疫眼睛疾病之患者的樣本對活化標記及Kv1.3高T 細胞及巨噬細胞為陽性。於第三階段中，利用細胞等分試樣之匹配以研究基於ShK之肽阻斷來自乾眼患者或葡萄膜炎患者相對對照之TEM之前發炎及增殖潛力之能力。包括IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、IL-21、及IL-22、穿孔蛋白、及顆粒酶B之細胞激素係藉由在休眠或活化細胞中於基於毒素之治療性肽存在或不存在下之細胞內染色及流式細胞計數來偵測。另外，其等可藉由諸如所收集上清液之多重ELISA之分析法定量。於該等實驗中，如由一種或任一種所述方法在未受刺激或經活化之T細胞或巨噬細胞中均測得，ShK-186之活體外添加明顯地減低前述細胞激素之表現。ShK-186之添加亦明顯地減低T細胞或巨噬細胞於活體外活化期間之活體外增殖。這種減低可尤其藉由定量[3H]胸苷併入或螢光染料CFSE之標準免疫學方法來測定。
實例3。藉由局部投與來局部遞送基於毒素之治療性肽。本實例描述投與本發明之基於毒素之治療性肽(諸如ShK-186或ShK-198)後局部性及全身性藥物含量之評估。
三隻雌性6至8週齡Sprague-Dawley大鼠(美國印第安納州印第安納波里斯)每天三次以局部投與左眼(LE)10μL P6N(磷酸鈉(10mM)、氯化鈉(0.8%)、及聚山梨醇酯20(0.05%)，pH 6.0)及右眼(RE)含於P6N中之10μL 0.5% ShK-186之方式給藥21天。在第3天、第7天、第12天、第14天、第17天、及第21天採集血液並經處理為血漿。在第21天，除了血漿之外，從各隻眼睛收集玻璃體液。利用標準直接ELISA方法來測量所收集樣本中之ShK-186含量。
圖3A及3B提供局部投與ShK-186至右眼(RE)相較於投與媒劑之左眼(LE)21天後所收穫的局部房水(圖3A及圖3B)及血漿(圖3A)樣本中ShK-186之定量。於RE之房水中發現呈顯著濃度之經局部投與之ShK-186，指明藥物之眼內遞送(圖3A、3B)。在來自未經處理之LE或血漿之樣本中未檢出ShK-186，指明係最小全身暴露於藥物(圖3A及B)。
另外，雌性8至14週齡LEWIS大鼠(查爾斯河(Charles River))每天三次以局部投與鹽水或0.1% ShK-186(動物3-1至3-3)或1% ShK-186(動物4-1至4-4)方式給藥(10μL)(圖3C)。如圖D所示，ShK-198以0.1%(動物5-1至5-4)或1%提供；動物2-1至2-4接受媒劑P6N(圖3D)。圖3C提供局部投與ShK-186 7天後所收穫的局部房水中ShK-186之定量。於前房房水中發現呈顯著濃度之經局部投與之ShK-186，指明藥物之眼內遞送。在血漿樣本中未檢出ShK-186，指明係最小全身暴露於藥物(未顯示)。圖3D提供局部投與ShK-198 7天後所收穫的前房房水或血漿中ShK-198之定量。於房水中發現呈顯著濃度之經局部投與之ShK-198，指明藥物之眼內遞送。在血漿樣本中未檢出ShK-198，指明係最小全身暴露於藥物(未顯示)。
實例4。ShK-186及ShK-198於自體免疫眼睛疾病中治療效應之評估。本實例描述局部遞送本發明之基於毒素之治療性肽(諸如ShK-186)之治療效應之評估。
一種用於評估ShK-186於自體免疫眼睛疾病(諸如葡萄膜炎)中治療潛力之模型為黑色素相關抗原(MAA)誘發之實驗自體免疫前部葡萄膜炎(EAAU)。於該模型中，雄性路易士大鼠(Lewis rat)5至10週齡(查爾斯河)經皮下利用乳化於弗氏完全佐劑(complete Freund’s adjuvant)(CFA)中之MAA免疫且亦接受單次腹膜內注射百日咳毒素(0.2至1mcg/隻動物)。到第10天開始出現疾病症狀且到免疫接種18天後達到峰值。該等動物通常到第25天可康復。
製備MAA。MAA係遵循由Simpsom等人，Eye 11,206-208(1997)所述的程序結合部分修改來製備。從25隻剛著色的牛眼睛切下虹膜及睫狀體結構。取組織切成小試片且接著於冷PBS中均質化。均質物以4000g旋轉10分鐘，用PBS洗滌三次且接著接受以2% Triton X-100之洗滌劑萃取，於室溫下旋轉3小時。所得材料再次旋轉及用PBS洗滌 三次及此次使用2% SDS再次接受洗滌劑萃取，於37℃下旋轉3小時。用PBS洗滌該材料三次接著用H2O洗滌三次及最後用70%乙醇洗滌。將MAA粒置於真空下維持約15min，獲得乾燥抗原材料，-20℃下冷凍儲藏。
製備MAA：CFA乳液。就用於結果顯示於圖4中之實驗之乳液而言，將50毫克MAA再懸浮於3.8mL PBS中，及在使該懸浮液短暫渦轉之後，進行30秒音波處理三次，於各次之間在冰上培養30秒。使該漿液通過100μm細胞過濾器，用針筒推進器加壓使較稠材料通過。使用市售BCA套組(Pierce 23225)測得懸浮液之蛋白質含量為3.27mg/mL，及在使用前冷凍儲藏於-20℃。在免疫接種的當天(第0天)，讓儲備MAA於室溫下融溶及短暫地渦轉，再進行600μg/mL之作業稀釋。接著使該溶液逐滴與CFA 1：1混合同時渦轉，達成300μg/mL(或30μg/隻動物)之最終抗原濃度。乳液在加載至針筒中並輸入通過18G乳化橋(emulsifying bridge)之前容許再渦轉5分鐘直至極稠。於同一天注射該等乳液，每個足墊經皮下注射50μL，依組別每隻動物總計100μL。圖4A至D顯示與該疾病模型相關聯之病理及ShK-186之局部投與對疾病之發生及嚴重度上之效應。
圖4A顯示在誘發EAAU後第11天、第13天、第15天、及第18天使用狹縫燈臨床觀測每隻動物之數據。基於瞳孔功能(縮小)、虹膜結構、前房中細胞之存在、及前房中蛋白質之存在(光斑)來指定眼睛個別得分。接著將得分轉換為每天的綜合臨床得分。發現相較於經媒劑處理之其等動物，每天三次地從第0至第8天經0.1% ShK-186及從第9至第18天經1% ShK-186對眼睛局部處理之動物之綜合得分明顯更低。
由圖4B可見，ShK-186之局部投與使得該模型中總病理減少。(左側小圖(3-2 RE))動物每天三次以媒劑(P6N)給藥。在免疫接種後第 18天，觀測到動物3-2具有13之綜合臨床得分：縮小瞳孔完全佈滿蛋白質(得分值=4)，虹膜血管充盈部分損傷(得分=3)，在前房中存在諸多浸潤細胞(得分=4；未顯示)，及輕微光斑(得分=2；未顯示)。於(右側小圖，4-8 RE)描繪的動物在免疫接種誘發EAAU後接受局部投與0.1% ShK-186持續9天及再局部投與1% ShK-186持續10天。於免疫接種後第18天，觀測到動物4-8具有0之綜合臨床得分：正常瞳孔(得分=0)，正常虹膜血管及結構(得分=0)，前房中不存在人眼可見細胞或蛋白質(各者得分=0；未顯示)。
由總病理觀測預期，ShK-186之局部投與亦減輕組織病理，如圖4C所顯示。就該分析而言，依照Kim等人(如前述)(1997)所述疾病參數，對事先在10%福馬林中固定的眼睛切片基於虹膜及睫狀體結構及發炎性細胞浸潤至虹膜及/或睫狀體及前房之基質之程度評分；此可由獨立獸醫病理學家進行。於圖4C(1.)中，顯示對照健康眼睛(10X)；(2.)與(4.)顯示取自經媒劑處理之動物之眼睛(得分為2)(10X、40X)；(3.)與(5.)顯示取自每天三次經0.1% ShK-186處理8天接著經1% ShK-186處理10天之動物之眼睛(指定組織病理學得分為0)(10X、40X)。圖4C(6.)顯示基於對取自媒劑處理組(P6N)或如所指示之ShK-186處理組(1% ShK-186)之四隻眼睛組織病理學分析的綜合臨床得分。
圖4D顯示證實ShK-198局部投與減輕EAAU大鼠模型之臨床症狀之資料。在經輔助之MAA乳液免疫接種誘發EAAU後第13天使用狹縫燈對每隻動物進行臨床觀察。在經輔助之MAA乳液免疫接種誘發EAAU後第13天使用狹縫燈對每隻動物進行臨床觀察。基於前房中細胞之存在(頂部小圖)、或前房中蛋白質之存在或光斑(底部小圖)指定眼睛個別得分。大鼠每天三次經P6N媒劑或1% ShK-198局部處理眼睛。N=10隻大鼠/20隻眼睛。
用於評估ShK-186、ShK-198、或相關肽對葡萄膜炎疾病之預防 性及治療性潛力之其他模型包括其等藉由視網膜抗原誘發之模型。該等實驗自體免疫葡萄膜炎或視網膜炎模型(EAU)亦為器官特異性T-細胞介導之疾病，其中認為效應子記憶CD4+及CD8+ T-細胞(通常是指Th1(IFN-γ生成)、Th17(IL-17生成)、或Th1/Th17(IFN-γ/IL-17)共生成細胞)扮演主要致病原角色。於該等模型中，不論是來自光感受器蛋白質之牛、嚙齒動物、或人視網膜可溶性抗原(S-Ag，亦稱為抑制蛋白)、或來自在涉及維生素A衍生物輸送之光感受器間基質中發現之光感受器間類視色素結合蛋白質(包括衍生自該蛋白質之R14及R16肽)之抗原均在CFA中乳化。在添加或不添加經純化之百日咳毒素下使用該等乳液以使同時提供的小鼠(B10.RIII；C57.BL/6)、大鼠(Lewis、F344、CAR、BN、PVG)、或天竺鼠感受性菌株具免疫力。可使用的其他抗原來源包括視紫質(rhodopsin)、恢復蛋白(recoverin)、及光導蛋白(phosducin)。(參見Agarwal等人，(2012)；Andras Perl(編輯)，Autoimmunity：Methods and Protocols,Methods in Molecular Biology，第900卷.Springer Science+Business Media，紐約)。
實例5。乾眼疾病模型中ShK-186及ShK類似物之治療效應之評估。本發明之ShK-186及其他肽之預防性及治療性效應之評估可藉由分析乾燥性角膜結膜炎(KCS)來進行。可在動物中於切除眼窩及瞬淚腺後在雙側誘發KCS(Moore等人，Invest Ophthalmol Vis Sci.，42(3),653-659(2001))。淚腺之切除會導致在手術後約2至3週誘發包括大鼠、兔、及狗之動物中疾病，此點可藉由希默氏淚液測試(STT)值之顯著減小來確定。細胞內黏蛋白庫亦可經定量及在取自發病動物之結膜樣本中減少。於誘發KCS之後，ShK-186、ShK-198、或分別列於表1及2中之基於毒素或基於ShK之肽中任一者可以0.05至5%含於P6N或另一種媒劑中之濃度範圍以一次、兩次、三次、或更多次/天施用。可於腺體切除前(基線)及在誘發後第2、第4、及第6週收集腹部膜穹 窿結膜之活體組織檢查標本切片。在每次取樣時，拍攝眼睛照片及於隨後基於結膜炎之程度及眼分泌物之特徵進行色彩分級。
本發明之ShK-186及其他肽之預防性及治療性效應之評估可在休格倫氏症候群之實驗自體免疫乾眼疾病模型中進行。該種模型述於Jiang等人，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,50,2245-2254(2009)之教示中。於該模型中，路易士大鼠經皮下以包含500μg淚腺及唾腺提取物或200μg重組小鼠Klk1b22及500μg結核分枝桿菌H37Ra(Difco，密歇根州底特律)於弗氏不完全佐劑(Sigma，密蘇裡州聖路易斯)中之0.2mL乳液免疫，分佈在尾基及翼上的4個點。在同一天經腹膜內注射200、500、750、或1000毫微克之百日咳毒素之單劑量作為抗原乳液。
用於評估ShK-186藥效之另一種模型為抗原特異性T-細胞過繼轉移模型。於該模型中，自事先經過免疫的大鼠之引流淋巴結或脾臟製備經純化之T-細胞。接著將該等細胞與淚腺提取物(或自提取物純化獲得的餾分VII；或Klk1b22)混合並共同培養。於2、3、4、5、或7天後，含於0.5mL PBS中之T-細胞經腹膜內注射至未免疫的路易士接受者中(5百萬個細胞/隻大鼠)。
實驗乾眼疾病之其他模型包括防腐劑氯化苄二甲羥銨之局部投與(Xiong等人，Invest Ophthalmol Vis Sci,49,1850-1856(2008))。
於上述模型中，可在免疫接種或T-細胞轉移之前或之後的不同時間點開始基於毒素之治療性肽(諸如ShK-186)或媒劑治療以評估該等肽之預防性或治療性效應。
除非另作指明，否則本發明之操作係使用習知化學、分子生物學、微生物學、重組DNA、遺傳學、免疫學、細胞生物學、細胞培養及轉殖基因生物學技術，其等均係屬於本技藝技術範圍。參見：例如，Maniatis等人，Molecular Cloning(冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，紐約冷泉港，1982)；Sambrook等人，Molecular Cloning，第2版(冷泉港實驗室出版社，紐約冷泉港，1989)；Sambrook及Russell，Molecular Cloning，第3版(冷泉港實驗室出版社，紐約冷泉港，2001)；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons，更新到2005)；Glover,DNA Cloning(IRL Press，牛津市，1985)；Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes(Academic Press，紐約，1992)；Guthrie與Fink，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology(Academic Press，紐約，1991)；Harlow及Lane，Antibodies(冷泉港實驗室出版社，紐約冷泉港，1998)；Jakoby及Pastan，1979；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames及S.J.Higgins編輯1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames及S.J.Higgins編輯1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss,Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；the treatise,Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.，紐約)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller及M.P.Calos編輯，1987，冷泉港實驗室出版社)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer及Walker編輯，Academic Press，倫敦市，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，第I-IV卷(D.M.Weir與C.C.Blackwell編輯，1986)；Riott,Essential Immunology，第6版(Blackwell Scientific Publications，牛津市，1988)；Hogan等人，Manipulating the Mouse Embryo(冷泉港實驗室出版社，紐約冷泉港，1986)；Westerfield,M.，The zebrafish book.A guide for the laboratory use of zebrafish(Danio rerio)，第4版(Univ.of Oregon Press，俄勒崗州尤金，2000)。
如熟習此項技藝者所明瞭，揭示於本文中之各個實施例可包括(基本上由或由以下組成)其特定陳述的要素、步驟、組分、或元件。因此，術語「包括(include)」或「包括(including)」應理解為(例如)：「包括、由...組成、或基本上由...組成」。如本文所用，過渡術語「包括(comprise)」或「包括(comprises)」意指包括(但不限於)，及容許包含甚至大量的未明示的要素、步驟、組分、或元件。過渡詞語「由...組成」不包含任何未明示的要素、步驟、組分、或元件。過渡詞語「基本上由...組成」使得本實施例之範疇受限於特定的要素、步驟、組分、或元件及不顯著影響本實施例之其等。如本文所用，材料效應將導致本文所揭示基於毒素之治療性肽治療發炎性眼科病症之能力統計上顯著減低。
除非另作指明，否則用於本說明書及申請專利範圍中之所有數值在所有實例中應理解為由術語「約」修飾。因此，除非指出相反情況，否則述於本說明書及附隨申請專利範圍中之數字參數為可根據企圖藉由本發明獲得之所欲性質變化之近似值。至少且非嘗試限制均等論應用於申請專利範圍之範疇，各數字參數應至少根據所記錄有效位數的位數及藉由應用捨入法來理解。在要求進一步明確的情況下，術語「約」具有在與所述數值或範圍結合使用時由熟習此項技藝者針對其所合理指定的含義，換言之，表示比所述值或範圍稍微較大或稍微較小，其範圍在所述值±20%；所述值±19%；所述值±18%；所述值±17%；所述值±16%；所述值±15%；所述值±14%；所述值±13%；所述值±12%；所述值±11%；所述值±10%；所述值±9%；所述值±8%；所述值±7%；所述值±6%；所述值±5%；所述值±4%；所述值±3%；所述值±2%；或所述值±1%。
儘管記述本發明寬廣範疇之數字範圍及參數為近似值，但述於特定實例中之數值係儘可能精確地報告。然而，任何數值固有地包含 必然會因其各別測試測量中存在的標準偏差所致之特定誤差。
除非另外於本文中指明或者內容明顯矛盾，否則用於描述本發明之上下文中(尤其用於隨後申請專利範圍之上下文中)之術語「一」、「一個」、「該」及類似指示應理解為包含單數形式及複數形式。本文中數值範圍之述僅欲用作個別提及落在該範圍中之各別數值之速記方法。除非另外於本文中指明，否則各個別的數值係經併入本說明書中如同其於本文中個別地引用般。除非另外於本文中指明或者內容明顯矛盾，否則述於本文中之所有方法可以任何適宜順序進行。任何及所有實例、或本文所提供例示性語言(例如，「諸如」)之使用僅欲更佳地闡述本發明而不對另作聲明的本發明範疇造成限制。本說明書中之語言不應被理解為表示為實施本發明所必需之任何非主張要素。
本文所揭示的本發明之替代要素或實施例之分組不應被理解為限制。可能會個別地提及各組成員或與該組其他成員或於其中發現之其他要素任意組合地提及並主張。預期一個組別的一或多個要素可基於方便性及/或專利性原因包含為一組別、或從一組別移除。在任何該種包含或移除發生之情況下，認為本說明書包含經修飾因而實現於隨附申請專利範圍中使用的所有馬庫西群組(Markush group)之書面論述之群組。
於本文中描述本發明之某些實施例，包括為發明者已知可用於實施本發明之最佳模式。當然，熟習此項技藝者在閱讀上述說明後當可明瞭關於該等所述實施例之改變。本發明者預期熟習此項技藝者可適宜地使用該等改變，及本發明者意圖將本發明以除本文明確所述之外方式實施。因此，本發明包括如適用法律容許之本說明書附屬之申請專利範圍中所列舉標的之所有修改及等效物。除此之外，除非另外於本文中指明或者內容明顯矛盾，否則本發明包含其所有可能變化中 上述要素之任何組合。
另外，已在本說明書中多次引用公開案、專利案、及/或專利申請案(統稱為「參考文獻」)。引述之各參考文獻個別地以基於其特定引述教示引用方式併入本文中。
總言之，咸應明瞭揭示於本文中之本發明實施例為本發明原理的示例。可使用的其他修改係屬於本發明範疇。因此，舉例然非限制性地，本發明之替代組態可依照本文教示進行使用。因此，本發明不受限於所精確顯示並論述者。
於本文中顯示之特定情況係舉例言之且僅係基於說明論述本發明較佳實施例之目的及係為提供據認為是本發明各種實施例之原理及概念性態樣之最有用且可輕易明瞭的說明者而提出的。就此而言，尚未嘗試較基本理解本發明所需更詳細地顯示本發明之結構細節，可實際上呈現結合附圖及/或實例進行讓熟習此項技藝者明瞭本發明若干種形式為何之描述。
除非於實例中進行清楚並明確修改或在應用該含義使得任何構造無意義或基本上無意義之情況下，否則於本發明中使用的定義及解釋意欲並計劃以任何未來構造進行控制。於術語之構造將使其無意義或基本上無意義之情況中，定義應採取韋氏辭典(Webster's Dictionary)(第3版)或熟習此項技藝者已知的字典(諸如牛津生物化學及分子生物學字典(Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology)(編輯Anthony Smith，牛津大學出版社(Oxford University Press)，牛津市，2004))。
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<223> 任何非官能性胺基酸殘基
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<223> 高瓜胺酸
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<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(22)
<223> 二胺基丙酸
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> 任何非官能性胺基酸殘基
<400> 61
<210> 62
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> 硝基苯丙胺酸
<400> 62
<210> 63
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> 胺基苯丙胺酸
<400> 63
<210> 64
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> 苄基苯丙胺酸
<400> 64
<210> 65
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 65
<210> 66
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 66
<210> 67
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 67
<210> 68
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 68
<210> 69
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 69
<210> 70
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (27)..(27)
<223> 任何非官能性胺基酸殘基
<400> 70
<210> 71
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 71
<210> 72
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 72
<210> 73
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 73
<210> 74
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 74
<210> 75
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 75
<210> 76
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 76
<210> 77
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 77
<210> 78
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 78
<210> 79
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 79
<210> 80
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 80
<210> 81
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 81
<210> 82
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 82
<210> 83
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 83
<210> 84
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 84
<210> 85
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 85
<210> 86
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 86
<210> 87
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 87
<210> 88
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 88
<210> 89
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 89
<210> 90
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 90
<210> 91
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 任何非官能性胺基酸殘基
<400> 91
<210> 92
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 92
<210> 93
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 93
<210> 94
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 94
<210> 95
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 95
<210> 96
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 96
<210> 97
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 97
<210> 98
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 98
<210> 99
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 99
<210> 100
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 100
<210> 101
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> 任何非官能性胺基酸殘基
<400> 101
<210> 102
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Nle
<400> 102
<210> 103
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 103
<210> 104
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 104
<210> 105
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 105
<210> 106
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> 任何非官能性胺基酸殘基
<400> 106
<210> 107
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> Nle
<400> 107
<210> 108
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> Orn
<400> 108
<210> 109
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> 高瓜胺酸
<400> 109
<210> 110
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(21)
<223> 二胺基丙酸
<400> 110
<210> 111
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 111
<210> 112
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 112
<210> 113
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 113
<210> 114
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (22)..(22)
<223> 任何非官能性胺基酸殘基
<400> 114
<210> 115
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (22)..(22)
<223> 硝基苯丙胺酸
<400> 115
<210> 116
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (22)..(22)
<223> 胺基苯丙胺酸
<400> 116
<210> 117
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (22)..(22)
<223> 苄基苯丙胺酸
<400> 117
<210> 118
<211> 34
<2112> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 118
<210> 119
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 119
<210> 120
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 120
<210> 121
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 121
<210> 122
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 122
<210> 123
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (26)..(26)
<223> 任何非官能性胺基酸殘基
<400> 123
<210> 124
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 124
<210> 125
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 125
<210> 126
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 126
<210> 127
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 127
<210> 128
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 128
<210> 129
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 129
<210> 130
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 130
<210> 131
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 131
<210> 132
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 132
<210> 133
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 133
<210> 134
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 134
<210> 135
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 135
<210> 136
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 136
<210> 137
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 137
<210> 138
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 138
<210> 139
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 139
<210> 140
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 140
<210> 141
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 141
<210> 142
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 142
<210> 143
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 143
<210> 144
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 144
<210> 145
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 145
<210> 146
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 146
<210> 147
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 147
<210> 148
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 148
<210> 149
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 149
<210> 150
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 150
<210> 151
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 151
<210> 152
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 152
<210> 153
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 153
<210> 154
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 154
<210> 155
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 155
<210> 156
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 156
<210> 157
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 157
<210> 158
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 158
<210> 159
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 159
<210> 160
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 160
<210> 161
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 161
<210> 162
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 162
<210> 163
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 163
<210> 164
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 164
<210> 165
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 165
<210> 166
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 166
<210> 167
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 167
<210> 168
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 168
<210> 169
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 169
<210> 170
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 170
<210> 171
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 171
<210> 172
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 172
<210> 173
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 173
<210> 174
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 174
<210> 175
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 175
<210> 176
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 176
<210> 177
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 177
<210> 178
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 178
<210> 179
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 179
<210> 180
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 180
<210> 181
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 181
<210> 182
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 182
<210> 183
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 183
<210> 184
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 184
<210> 185
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 185
<210> 186
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 186
<210> 187
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 187
<210> 188
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 188
<210> 189
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 189
<210> 190
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 190
<210> 191
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 191
<210> 192
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 192
<210> 193
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 193
<210> 194
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 194
<210> 195
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 195
<210> 196
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 196
<210> 197
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 197
<210> 198
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 198
<210> 199
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 199
<210> 200
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 200
<210> 201
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 201
<210> 202
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 202
<210> 203
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 203
<210> 204
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 204
<210> 205
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 205
<210> 206
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 206
<210> 207
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 207
<210> 208
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> L-磷酸酪胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 胺基乙基氧基乙基氧基乙酸
<400> 208
<210> 209
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> L-酪胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 胺基乙基氧基乙基氧基乙酸
<400> 209
<210> 210
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> L-酪胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 胺基乙基氧基乙基氧基乙酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (37)..(37)
<223> 醯胺化
<400> 210
<210> 211
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 211
<210> 212
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 212
<210> 213
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(22)
<223> 二胺基丙酸
<400> 213
<210> 214
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 214
<210> 215
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<400> 215
<210> 216
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(22)
<223> 二胺基丙酸
<400> 216
<210> 217
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> L-磷酸酪胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 胺基乙基氧基乙基氧基乙酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (37)..(37)
<223> 醯胺化
<400> 217
<210> 218
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 對-膦醯基-苯丙胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 胺基乙基氧基乙基氧基乙酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> Nle
<220>
<221> MOD_RES
<222> (37)..(37)
<223> 醯胺化
<400> 218
<210> 219
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 膦醯基甲基苯丙胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 胺基乙基氧基乙基氧基乙酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (37)..(37)
<223> 醯胺化
<400> 219
<210> 220
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 膦酸基甲基苯丙胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 胺基乙基氧基乙基氧基乙酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> Nle
<220>
<221> MOD_RES
<222> (37)..(37)
<223> 醯胺化
<400> 220
<210> 221
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 胺基己酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> L-酪胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> 胺基乙基氧基乙基氧基乙酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> 醯胺化
<400> 221
<210> 222
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 對-膦醯基-苯丙胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 胺基乙基氧基乙基氧基乙酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> Nle
<220>
<221> MOD_RES
<222> (37)..(37)
<223> 醯胺化
<400> 222
<210> 223
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 對-膦醯基-苯丙胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 胺基乙基氧基乙基氧基乙酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (37)..(37)
<223> 醯胺化
<400> 223
<210> 224
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於ShK之肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> Nle
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(22)
<223> 二胺基丙酸
<400> 224
<210> 225
<211> 35
<212> PRT
<213> 非洲帝王蠍
<400> 225
<210> 226
<211> 35
<212> PRT
<213> 非洲帝王蠍
<400> 226
<210> 227
<211> 35
<212> PRT
<213> 非洲帝王蠍
<400> 227
<210> 228
<211> 38
<212> PRT
<213> 非洲帝王蠍
<400> 228
<210> 229
<211> 34
<212> PRT
<213> 亞洲雨林蠍
<400> 229
<210> 230
<211> 38
<212> PRT
<213> 以色列金蠍
<400> 230
<210> 231
<211> 38
<212> PRT
<213> 以色列金蠍
<400> 231
<210> 232
<211> 38
<212> PRT
<213> 柱尾蠍
<400> 232
<210> 233
<211> 35
<212> PRT
<213> 黑肥尾蠍
<400> 233
<210> 234
<211> 39
<212> PRT
<213> 中美毒蠍
<400> 234
<210> 235
<211> 39
<212> PRT
<213> 南美沙漠木蠍
<400> 235
<210> 236
<211> 37
<212> PRT
<213> 以色列金蠍
<400> 236
<210> 237
<211> 37
<212> PRT
<213> 巴西殺人蠍
<400> 237
<210> 238
<211> 37
<212> PRT
<213> Bunodosoma granuliferum
<400> 238
<210> 239
<211> 38
<212> PRT
<213> 馬氏正鉗蠍
<400> 239
<210> 240
<211> 37
<212> PRT
<213> 馬氏正鉗蠍
<400> 240
<210> 241
<211> 37
<212> PRT
<213> 劍橋幽靈蠍
<400> 241
<210> 242
<211> 35
<212> PRT
<213> 劍橋幽靈蠍
<400> 242
<210> 243
<211> 36
<212> PRT
<213> 墨西哥蠍子
<220>
<221> MOD_RES
<222> (36)..(36)
<223> 醯胺化
<400> 243
<210> 244
<211> 35
<212> PRT
<213> 公主海葵
<400> 244
<210> 245
<211> 36
<212> PRT
<213> 草莓海葵
<400> 245
<210> 246
<211> 36
<212> PRT
<213> 槽溝海葵
<400> 246
<210> 247
<211> 39
<212> PRT
<213> 墨西哥木蠍
<400> 247
<210> 248
<211> 38
<212> PRT
<213> 北非黑肥尾蠍
<400> 248
<210> 249
<211> 37
<212> PRT
<213> 澳洲黃肥尾蠍
<400> 249
<210> 250
<211> 34
<212> PRT
<213> 中東金蠍
<400> 250
<210> 251
<211> 36
<212> PRT
<213> 印度紅蠍(Mesobuthus tamulus)
<400> 251
<210> 252
<211> 38
<212> PRT
<213> 黑粗尾蠍
<400> 252
<210> 253
<211> 38
<212> PRT
<213> 印度紅蠍(Mesobuthus tamulus sindicus)
<400> 253
<210> 254
<211> 37
<212> PRT
<213> 以色列黃蠍
<400> 254
<210> 255
<211> 38
<212> PRT
<213> 以色列金蠍
<400> 255
<210> 256
<211> 37
<212> PRT
<213> 突尼西亞黃蠍
<400> 256

Claims (27)

  1. 一種治療有需要之個體之發炎性眼科病症的方法，該方法包括投與該個體治療有效量之包含具有式SEQ ID NO：217之基於ShK之肽之醫藥組合物。
  2. 一種治療有需要之個體之發炎性眼科病症的方法，該方法包括投與該個體治療有效量之包含具有具有相對SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：210、SEQ ID NO：217、及/或SEQ ID NO：218至少95%序列一致性之序列之基於ShK之肽之醫藥組合物。
  3. 如請求項1或2之方法，其中該基於ShK之肽係天然或合成的。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該基於ShK之肽係附接至具有陰離子電荷之有機或無機化學實體。
  5. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該基於ShK之肽的C-端為酸或醯胺。
  6. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該投與係經局部投與眼睛。
  7. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該投與係非經腸且/或經腸。
  8. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該投與係經局部投與眼睛及為非經腸及/或經腸途徑。
  9. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該投與係藉由玻璃體內注射進行。
  10. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該投與係每天六次、每天五次、每天四次、每天三次、每天兩次、每天一次、每週一次、每月一次、每兩個月一次、每三個月一次、或每六個月一 次地進行。
  11. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該發炎性眼科病症為乾眼、葡萄膜炎、小兒葡萄膜炎、及/或休格倫氏症候群(Sjogren's syndrome)。
  12. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該個體為人類兒童、青少年、或成人。
  13. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該醫藥組合物進一步包含10mM磷酸鈉；0.8%w/v NaCl；及以0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、或4 w/v%之聚山梨醇酯20，其中該組合物具有5.0、5.5、6.0、6.5、7、7.5、或8之pH。
  14. 如請求項13之方法，其中該醫藥組合物包含以0.05 w/v%之聚山梨醇酯20，及其中該組合物具有6.0之pH。
  15. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該醫藥組合物進一步包含10mM磷酸鈉；0.8% w/v NaCl；及以0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、或4 w/v%之聚山梨醇酯80，其中該組合物具有5.0、5.5、6.0、6.5、7、7.5、或8之pH。
  16. 如請求項15之方法，其中該醫藥組合物包含以0.05 w/v%之聚山梨醇酯80，及其中該組合物具有6.0之pH。
  17. 一種篩選可因藉由如請求項1至19中任一項之方法治療而獲益之個體的方法，該方法包括：測量來自該個體之生物樣本之T-細胞之Kv1.3通道表現程度；將該個體之Kv1.3通道表現程度與從來自無發炎性眼科病症之群體之資料集獲得之參考程度進行比較；及若該個體之Kv1.3通道表現程度相較參考程度增加，則確定該個體將自利用如請求項1至19中任一項之方法治療獲益。
  18. 一種評估個體以預測藉由基於毒素之治療性肽治療之結果的方法，該方法包括：分析來自該個體之生物樣本之T-細胞之Kv1.3 通道表現程度；其中相比從來自無發炎性眼科病症之群體之資料集獲得的參考程度，Kv1.3通道表現程度增加指示將自遞送治療有效量之基於毒素之治療性肽獲益之個體。
  19. 如請求項18之方法，其中該基於毒素之治療性肽為具有相對SEQ ID NO：1至224中任一種序列至少80%序列一致性之基於ShK之肽。
  20. 如請求項18之方法，其進一步包括藉由前發炎免疫刺激因子或T-細胞活化劑在基於ShK之肽的存在下激發T-細胞。
  21. 如請求項18之方法，其進一步包括測量T-細胞之前發炎細胞激素產生。
  22. 如請求項21之方法，其中測得之細胞激素係選自干擾素(IFN)-γ、介白素(IL)-1a、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-6、IL7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21、IL-22、IL-23、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)-α、金屬蛋白酶(MMP)3、及MMP9中之一或多者。
  23. 如請求項18之方法，其進一步包括藉由眼抗原於存在或不存在基於ShK之肽下激發T-細胞。
  24. 如請求項19之方法，其中該基於ShK之肽具有式SEQ ID NO：217。
  25. 如請求項19之方法，其中該基於ShK之肽具有相對SEQ ID NO：1至少95%之序列一致性。
  26. 如請求項19之方法，其中該基於ShK之肽具有相對SEQ ID NO：2至少95%之序列一致性。
  27. 如請求項19之方法，其中該基於ShK之肽具有相對SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：210、SEQ ID NO：217、及/或SEQ ID NO：218至少95%之序列一致性。
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