KR20140139618A - ＩＬ-１β 결합성 항체 및 그의 단편 - Google Patents

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린다 마사트
메리 하크-프렌드쇼
강 첸
아놀드 호르위츠
마리나 뢸
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조마 (유에스) 엘엘씨
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Abstract

본원에는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 IL-1β 결합성 항체 또는 그의 IL-1β 결합성 단편, 및 관련 핵산, 벡터, 세포 및 조성물 뿐만 아니라 질병을 치료 또는 예방하기 위해 상기를 사용하는 방법, 및 친화성 성숙된 IL-1β 결합성 폴리펩티드의 제조 방법이 기재되어 있다. 목적하는 친화성과 효력을 지닌 IL-1β 결합성 항체 또는 그의 IL-1β 결합성 단편이 제공된다.

Description

ＩＬ-１β 결합성 항체 및 그의 단편 {IL-1β Binding antibodies and fragments thereof}
관련 출원에 관한 참고
본 출원은 2005년 6월 21일자로 출원된 미국 가특허원 제60/692,830호 (그의 전문이 본원에 참고로 도입된다)를 우선권으로 청구하고 있다.
본 발명은 IL-1β 결합성 항체 및 그의 단편, 및 이러한 항체를 코딩하는 핵산 뿐만 아니라 상기 항체 또는 핵산을 포함하는 벡터, 세포 및 조성물, 및 그의 용도에 관한 것이다.
인터루킨-1 (IL-1) 계열의 사이토킨은 류마티스성 관절염 (RA), 골관절염, 크론병 (Crohn's disease), 궤양성 결장염 (UC), 패혈성 쇼크, 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD), 천식, 이식편 대 숙주 질병, 아테롬성 경화증, 성인 T-세포 백혈병, 다발성 골수종, 다발성 경화증, 뇌졸중 및 알츠하이머병 (Alzheimer's disease)과 같은 질병 상태에 밀접한 영향을 끼쳐 왔다. IL-1 계열 구성원에는 IL-1α, IL-1β 및 IL-1Ra가 포함된다. 이들 사이토킨이 IL-1 수용체 (IL-1R1 및 IL-1R2)와 결합할 수 있는 능력을 지니고 있다는 측면에서는 서로 관련이 있긴 하지만, 이들 각각은 상이한 유전자에 의해 발현되고 상이한 일차 아미노산 서열을 지니고 있다. 더우기, 이들 사이토킨의 생리적 활성은 명백히 구별될 수 있다.
IL-1 수용체 신호 전달을 붕괴시키는 화합물이 IL-1 매개된 질환을 치료하기 위한 치료제로서 연구 조사되어 왔다. 이들 화합물에는 재조합 IL-1Ra (공급처: Amgen Inc., Thousand Oaks, CA) 및 IL-1 수용체 "포착 (trap)" 펩티드 (공급처: Regeneron Inc., Tarrytown, NY)이 포함된다. IL-1 사이토킨과 결합하는 동물-유래된 모노클로날 항체가 또한 연구 조사되어 왔다. 그러나, 그들의 임상적 가치는 그들의 면역원성으로 인해 제한될 수 있다. 예를 들어, 마우스 모노클로날 항체를 투여한 인간 대상체는 인간 항-마우스 항체 (HAMA)를 생산하는 것으로 공지되어 왔다. HAMA는 모노클로날 항체 요법의 효능을 저하시키고 신장 손상과 같은 부작용을 유발시키는 것으로 보고되었다. 기타 IL-1β 항체들도 그들의 결합 친화성 및/또는 효력에 의해 제한될 수 있다. 따라서, IL-1 수용체 신호 전달을 붕괴시키는 부가의 화합물이 요망된다. 본 발명은 이러한 화합물을 제공할 뿐만 아니라 이의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
본 발명은 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 IL-1β 결합성 항체 또는 그의 IL-1β 결합성 단편을 제공한다. 또한, 본원에는 상기 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 핵산 뿐만 아니라 이러한 핵산을 포함하는 벡터, 상기 핵산 또는 벡터를 포함하는 세포, 및 상기 항체, 핵산 또는 벡터를 포함하는 조성물이 제공된다.
본 발명은 추가로, 유효량의 본 발명의 항체 또는 항체 단편, 핵산 또는 벡터를, 이를 필요로 하는 포유류에게 투여함으로써 질환을 치료 또는 예방하는 것을 포함하는, 상기 포유류에게서 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명은 (a) 서열 1 내지 26 중의 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 IL-1β 결합성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 핵산과, 1개 이상의 뉴클레오티드가 제1 핵산 서열과는 상이한 핵산 서열을 포함하는 제2 핵산을 제공하는 단계; (b) 핵산 셔플링 (shuffling)을 수행하여 2개 이상의 돌연변이된 핵산을 제공하는 단계; (c) (i) 제1 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드보다 더 큰 친화도로 IL-1β과 결합하거나, (ii) IL-1α에 비해 IL-1β에 대한 선택도가, 제1 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드보다 더 크거나, (iii) IL-1β에 대한 평형 결합 해리 상수 (KD)가 제1 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드보다 더 낮거나 또는 (iv) 제1 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드보다 더 큰 정도로, 동물에서 IL-1β 유도된 혈청 IL-6 발현을 억제하는 폴리펩티드를 코딩하는 돌연변이된 핵산을 선별하는 단계; 및 (d) 이와 같이 선별된 돌연변이된 핵산을 발현시킴으로써, 친화성 성숙된 IL-1β 결합성 폴리펩티드를 생성시키는 단계를 포함하는, 친화성 성숙된 IL-1β 결합성 폴리펩티드의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 3 pM 미만, 또 다른 한편 약 2 pM 이하, 바람직하게 약 1 pM 이하의 해리 상수로 인간 IL-1β와 결합하는 신규한 IL-1β 결합성 항체 또는 그의 IL-1β 결합성 단편을 제공한다. 이러한 고 친화성 항체는 IL-1 관련 질병 또는 질환을 치료 또는 예방하는 각종 방법에 유용한 것으로 고려된다. 또 다른 한편 또는 부가적으로, IL-1β 결합성 항체 또는 IL-1β 결합성 단편은 IL-1β 에피토프와 결합하여 이와 같이 결합된 항체 또는 단편은 IL-1β가 IL-1 수용체 유형 I과 결합하는 것을 실질적으로 막지 않는다. 또 다른 한편 또는 부가적으로, IL-1β 결합성 항체 또는 IL-1β 결합성 단편은 본원에 기재된 예시 항체들 중의 하나 이상, 예를 들어 중쇄 가변 영역을 포함하고 AB7로 지정된 항체와 실질적으로 동일한 에피토프와 결합한다. 또 다른 한편 또는 부가적으로, IL-1β 결합성 항체 또는 IL-1β 결합성 단편은 서열 11의 경쇄 가변 영역과 서열 15의 중쇄 가변 영역을 갖는 항체와 결합을 놓고 경쟁한다. 또 다른 한편 또는 부가적으로, 본 발명은 서열 ESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIE (서열 36) 내에 포함된 에피토프와 결합하는 IL-1β 결합성 항체 또는 IL-1β 결합성 단편을 포괄한다. 예시되는 IL-1β 결합성 항체에는 본원에서 AB5 및 AB7로 지정된 항체가 포함된다.
본 발명은 또한, 해리 상수가 3 pM 미만, 또 다른 한편 1 pM 이하, 또 다른 한편 본원에 기재된 기타 해리 상수들 중의 어느 하나이고, 서열 12, 13, 21, 23 또는 24의 아미노산 서열, 또는 또 다른 한편 서열 12, 13 또는 21의 아미노산 서열, 또는 또 다른 한편 서열 13 또는 21의 아미노산 서열, 또는 또 다른 한편 서열 8, 14 또는 15의 아미노산 서열, 또는 또 다른 한편 서열 8 또는 15의 아미노산 서열 중의 하나를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 IL-1β 결합성 항체 또는 그의 IL-1β 결합성 단편을 제공한다. IL-1β 결합성 항체 또는 IL-1β 결합성 단편은 또한, 서열 9, 서열 10 또는 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 약 6 pM 내지 약 50 pM, 또 다른 한편 약 13 pM 내지 약 25 pM, 또 다른 한편 약 19 pM의 해리 상수로 IL-1β와 결합하는 신규한 IL-1β 결합성 항체 또는 그의 IL-1β 결합성 단편이 제공되는데, 이러한 항체 또는 단편은 인간 섬유아세포로부터의 IL-1β 자극된 IL-6 방출을 억제하기 위한 IC50이 0.5 nM (500 pM) 미만, 또 다른 한편 약 5 pM 내지 약 200 pM, 또 다른 한편 약 10 pM 내지 약 100 pM, 또 다른 한편 약 30 pM이다. 인간 섬유아세포로부터의 IL-1β 자극된 IL-6 방출을 억제하기 위한 IC50은 인간 섬유아세포의 IL-1β 자극에 의해 방출된 IL-6을 50% 억제하는데 요구되는 농도를 지칭한다. 예시되는 항체에는 본원에서 AB1로 지정된 항체가 포함된다.
본 발명은 또한, 해리 상수가 약 6 내지 약 50 pM이고 서열 4, 5 또는 6의 아미노산 서열 중의 하나, 또 다른 한편 서열 4 또는 5의 아미노산 서열 중의 하나, 또 다른 한편 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 IL-1β 결합성 항체 또는 그의 IL-1β 결합성 단편을 제공한다. 몇몇 상황 하에서는, 해리 상수가 비교적 보다 높은 IL-1β 결합성 항체 또는 IL-1β 결합성 단편이, 예를 들어 비교적 보다 낮은 친화도가 요망되는 IL-1 관련 질병 또는 질환을 치료 또는 예방하는 몇몇 방법에 요망될 수 있는 것으로 고려된다.
예시되는 항체에는 AB1, AB2, AB3, AB4, AB5, AB6, AB7, AB8, 및 AB9로 지정된 항체가 포함된다. AB1은 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. AB2는 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. AB3은 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. AB4는 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. AB5는 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. AB6은 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. AB7은 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. AB8은 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. AB9는 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명은 서열 2, 4-8, 12-15, 21, 23-26, 28-35, 또는 42-57에 제시된 서열들 중의 어느 하나, 또 다른 한편 서열 21에 제시된 서열들 중의 어느 하나, 또 다른 한편 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7 또는 서열 8에 제시된 서열들 중의 어느 하나, 또 다른 한편 서열 12 또는 서열 13에 제시된 서열들 중의 어느 하나, 또 다른 한편 서열 14, 서열 15, 서열 25 또는 서열 26에 제시된 서열들 중의 어느 하나를 포함하는 중쇄 가변 영역을 갖는 IL-1β 결합성 항체 또는 IL-1β 결합성 단편을 포괄한다.
본 발명은 또한, 서열 1, 9-11 또는 27에 제시된 서열들 중의 어느 하나, 또 다른 한편 서열 1에 제시된 서열들 중의 어느 하나, 또 다른 한편 서열 9에 제시된 서열들 중의 어느 하나, 또 다른 한편 서열 10 또는 서열 11에 제시된 서열들 중의 어느 하나를 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 IL-1β 결합성 항체 또는 IL-1β 결합성 단편을 포괄한다.
본 발명은 또한, 서열 2, 4-8, 12-15, 21, 23-26, 28-35, 또는 42-57에 제시된 서열의 중쇄 가변 영역 중의 하나와, 서열 1, 9-11, 또는 27에 제시된 서열의 경쇄 가변 영역 중의 하나를 포함하는 IL-1β 결합성 항체 또는 IL-1β 결합성 단편을 포괄한다.
본 발명은 또한, IL-1β와 결합하지는 않지만, 대신 기타 기능, 예를 들어 순환성 반감기, 직접적인 세포독성 효과, 검출 가능한 표지화, 또는 수용자의 내인성 보체 케스케이드 또는 내인성 세포성 세포독성의 활성화에 대해 책임이 있는 부분을 포함하는 IL-1β 결합성 항체 또는 IL-1β 결합성 단편을 포괄한다. 본 발명의 항체는 항체의 불변 영역의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 불변 영역은 IgA (예: IgA1 또는 IgA2), IgD, IgE, IgG (예: IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4), 또는 IgM을 포함한 모든 이소형 중에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 IgG2 영역을 포함할 수 있다. 불변 영역을 포함하는 것 이외에 또는 불변 영역을 포함하는 것 대신, 본 발명의 항체 및 단편에는 에피토프 태그, 재이용 수용체 에피토프, 진단 또는 정제용 표지 부분, 또는 세포독성 부분, 예를 들어 방사성핵종 또는 독소가 포함될 수 있다.
본 발명은 또한, IL-1β 결합성 항체 또는 IL-1β 결합성 단편 중의 어느 하나와, 제약상 적합한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물을 포괄한다. 바람직하게, 본 발명의 항체 및 화합물은 표적 단백질 발현과 연관된 질환 또는 장애의 임상적 징후 또는 증상을 개선시키기에 충분한 양인 치료적 유효량으로, 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여할 수 있다. 관련 양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 제2 활성제를 추가로 포함한다. 또 다른 관련 양태에서, 제2 활성제가 성장 인자에 대한 항체 또는 길항제, 또는 사이토킨인 제약 조성물이 제공된다. 또 다른 양태에서는, 제2 활성제가 또 다른 항체이다.
본 발명의 또 다른 양태에서는, IL-1과 연관된 질환 또는 장애를 예방하거나 저하시키기 위한 약물을 제조하는데 있어서의, IL-1β 결합성 항체 또는 IL-1β 결합성 단편의 용도가 고려된다. 어느 용도에 있어서도 상기 약물은 제2 활성제를 이용한 치료와 연계할 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태에서는, 해당 약물을 제2 활성제를 이용한 치료와 연계하는, 본원에 기재된 IL-1 관련 질환 또는 장애 증상을 나타내는 환자를 치료하기 위한 약물을 제조하기 위한 본 발명의 항체의 상승적 조합물의 용도가 고려된다. 관련 양태에서는, 제2 활성제가 사이토킨에 대한 항체 또는 길항제, 또는 성장 인자이다. 약물 중의 IL-1β 결합성 항체 또는 단편의 양이 치료 효과를 달성하는데 요구되는 제2 활성제의 투여량을 감소시키는데 유효한 용량인, 전술된 모든 용도 양태가 고려된다.
키트가 또한 본 발명에 의해 고려된다. 한 양태에서, 키트는 특정 용기 (예를 들어, 바이알 또는 병) 내에 패키지된 치료적 또는 예방적 유효량의 본 발명의 화합물 또는 조성물 (예를 들어, 항체, 단편, 핵산, 벡터 또는 세포)을 포함하고, 상기 용기에 부착되거나 이와 패키지된 표지를 추가로 포함하는데, 이러한 표지는 용기의 내용물을 설명해주고 표적 단백질 발현과 연관된 질환 또는 질병을 예방 또는 저하시키기 위해 용기의 내용물을 사용하는 것에 관한 지시 사항 및/또는 적응증을 제공한다.
도 1은 본원에 기재된 몇몇 항체의 가변 영역의 경쇄 및 중쇄에 상응하는 아미노산 서열 쌍이다. 아미노산 서열의 밑줄친 부분은 상보성 결정 영역 (CDR)을 나타낸다.
도 2는 항체 AB1, AB2, AB3, 및 AB4의 경쇄 및 중쇄 가변 영역에 상응하는 아미노산 서열 세트이다. 아미노산 서열의 밑줄친 부분은 상보성 결정 영역 (CDR)을 나타낸다.
도 3은 항체 AB5, AB5.1 및 AB5.2의 경쇄 및 중쇄 가변 영역에 상응하는 아미노산 서열 세트이다. 아미노산 서열의 밑줄친 부분은 상보성 결정 영역 (CDR)을 나타낸다.
도 4는 항체 AB5.3 및 AB5.4의 경쇄 및 중쇄 가변 영역에 상응하는 아미노산 서열 세트이다. 아미노산 서열의 밑줄친 부분은 상보성 결정 영역 (CDR)을 나타낸다.
도 4a는 항체 AB6 및 AB7의 경쇄 및 중쇄 가변 영역에 상응하는 아미노산 서열 세트이다. 아미노산 서열의 밑줄친 부분은 상보성 결정 영역 (CDR)을 나타낸다.
도 4b는 항체 AB8 및 AB9의 경쇄 및 중쇄 가변 영역에 상응하는 아미노산 서열 세트이다. 아미노산 서열의 밑줄친 부분은 상보성 결정 영역 (CDR)을 나타낸다.
도 5는 시험관내 IL-1β 자극 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 6은 생체내 IL-1β 자극 실험 결과를 도시한 히스토그램이다.
도 7은 AB1로 지정된 항체에 대한 역학 배제 검정 결과를 도시한 그래프이다.
도 8은 AB5로 지정된 항체에 대한 역학 배제 검정 결과를 도시한 그래프이다.
도 9는 AB7로 지정된 항체에 대한 역학 배제 검정 결과를 도시한 그래프이다.
도 10은 AB1, AB2 및 AB3으로 지정된 항체에 대한 시험관내 IL-1β 자극 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 11은 AB1 및 AB7로 지정된 항체에 대한 시험관내 IL-1β 자극 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 12는 AB5 및 AB7로 지정된 항체 뿐만 아니라 키네레트 (Kineret®)에 대한 시험관내 IL-1β 자극 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 13은 AB5 및 AB1로 지정된 항체에 대한 생체내 IL-1β 자극 실험 결과를 도시한 히스토그램이다.
도 14는 AB5 및 AB7로 지정된 항체에 대한 생체내 IL-1β 자극 실험 결과를 도시한 히스토그램이다.
도 15는 시노몰구스 (cynomolgus) 원숭이 및 붉은털 원숭이 (rhesus macaque)로부터의 IL-1β를 이용한, AB7로 지정된 항체에 대한 교차-반응성 실험 결과를 도시한 웨스턴 블롯 (Western blot)이다.
도 16은 개, 기니아 피그 (guinea pig), 및 토끼로부터의 IL-1β를 이용한, AB7로 지정된 항체에 대한 교차-반응성 실험 결과를 도시한 웨스턴 블롯이다.
도 17은 재조합 인간, 마우스 및 랫트 IL-1β를 이용한, AB7로 지정된 항체에 대한 교차-반응성 실험 결과를 도시한 웨스턴 블롯이다.
도 18은 AB7로 지정된 항체 및 IL-1 유도된 IL-8 생성에 관여한 키네레트에 대한 시험관내 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 19는 본 발명의 항체가 IL-1β가 IL-1 수용체 유형 I과 결합하지 못하게 하는지를 조사하기 위한 검정 결과를 도시한 그래프이다.
도 20은 본 발명의 항체가 IL-1β가 IL-1 수용체 유형 I과 결합하지 못하게 하는지를 조사하기 위한 검정을 예시한 것이다.
본 발명은 목적하는 친화성과 효력을 지닌 신규한 IL-1β 항체 및 단편을 포괄한다. 본 발명의 한 국면으로서, 공지된 IL-1β 결합성 항체와 비교해서 예상치 못한 수준으로 높은 친화성과 낮은 해리 상수 (예를 들어, 3 pM 미만, 또 다른 한편 약 1 pM 이하)를 갖는 IL-1β 결합성 항체가 제공된다. 예시되는 항체에는 본원에서 AB5 및 AB7로 지정된 항체가 포함된다. 본 발명의 또 다른 국면으로서, 목적하는 해리 상수 (예를 들어, 약 6 pM 내지 약 50 pM)와, 인간 섬유아세포로부터의 IL-1β 자극된 IL-6 방출을 억제하는데 바람직한 IC50 (예를 들어, 500 pM 미만)을 나타내는 IL-1β 결합성 항체가 제공된다. 예시되는 항체에는 본원에서 AB1로 지정된 항체가 포함된다.
본 발명은 또한, 기타 항원보다 더 큰 친화도로 IL-1β와 결합한다는 점에서 IL-1β와 선택적으로 결합하는 IL-1β 결합성 항체 또는 IL-1β 결합성 단편을 포괄한다. IL-1β 결합성 항체 또는 IL-1β 결합성 단편은 인간 IL-1β와 선택적으로 결합할 수 있을 뿐만 아니라 비-인간 IL-1β와도 검출 가능한 수준으로 결합할 수 있다. 또 다른 한편 또는 부가적으로, 본 발명의 항체 또는 단편은 인간 IL-1β 및 적어도 하나의 기타 포유류 (제1 포유류)의 IL-1β와는 결합할 수 있지만, 적어도 하나의 기타 포유류 (제2 포유류)의 IL-1β와는 결합할 수 없다. 예를 들어, 상기 항체 또는 단편은 설치류 IL-1β, 영장류 IL-1β, 개 IL-1β 및 토끼 IL-1β 중의 하나 이상과 결합할 수 있고/있거나 기니아 피그 IL-1β와는 결합할 수 없다. 또 다른 한편 또는 부가적으로, 상기 항체 또는 단편은 마우스 IL-1β와는 랫트 IL-1β보다 높은 친화도로 결합할 수 있다. 또 다른 한편 또는 부가적으로, IL-1β 결합성 항체 또는 IL-1β 결합성 단편은 인간 IL-1β과 영장류 IL-1β에 대항하여 동일하거나 실질적으로 동일한 효력을 지닐 수 있다. 또 다른 한편 또는 부가적으로, IL-1β 결합성 항체 또는 IL-1β 결합성 단편은 재조합 인간 IL-1β와 내인성 인간 IL-1β에 대항하여 동일하거나 실질적으로 동일한 효력을 지닐 수 있다. 또 다른 한편 또는 부가적으로, IL-1β 결합성 항체 또는 IL-1β 결합성 단편은 마우스 IL-1β를 중화시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 표적 항원과 특이적으로 결합하는 항체 또는 단편은 유사한 항원보다 더 큰 친화도로 표적 항원과 결합하는 항체를 지칭한다. 예를 들어, 특정 항체 또는 단편은 이러한 항체 또는 단편의 가변 영역이 그의 동족 항원을 검출 가능한 선호도 (계열 구성원들 간에 국한성 서열 동일성, 상동성 또는 유사성이 존재할 가능성에도 불구하고, 결합 친화도 측면에서 측정 가능한 차이를 통하여 해당 항원을 동일한 계열의 기타 공지된 폴리펩티드와 구별시켜 준다)로 인식하고 이와 결합하는 경우에, 상기 항체 또는 단편은 그의 동족 항원에 대해 특이적이다. 특이적 항체 또는 단편은 이러한 항체의 가변 영역을 벗어난 서열과의 상호 작용을 통하여, 및 특히 항체 또는 단편의 불변 영역 내에서, 기타 단백질 [예를 들어, 에스. 아우레우스 (S. aureus) 단백질 A 또는 ELISA 기술 내의 기타 항체]와 상호 작용할 수도 있다. 항체의 결합 특이성을 결정하기 위한 스크리닝 검정은 당해 분야에 널리 공지되어 있고 통상적으로 실시되고 있다. 이러한 검정에 대한 포괄적인 논의는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Harlow et al. (Eds), Antibodies A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY (1988), Chapter 6].
본 발명의 국면은 예상치 못하게 낮은 해리 상수 (KD), 예를 들어 3 pM 미만, 또 다른 한편 2 pM 이하, 또 다른 한편 1 pM 이하, 또 다른 한편 0.8 pM 이하, 또 다른 한편 0.74 pM 이하, 또 다른 한편 0.72 pM 이하, 또 다른 한편 0.7 pM 이하, 또 다른 한편 0.6 pM 이하, 또 다른 한편 0.56 pM 이하, 또 다른 한편 0.5 pM 이하, 또 다른 한편 0.3 pM 이하, 또 다른 한편 0.26 pM 이하, 또 다른 한편 0.24 pM 이하, 또 다른 한편 0.2 pM 이하를 갖는 IL-1β 결합성 항체 및 그의 IL-1β 결합성 단편을 포괄한다. 따라서 본 발명의 몇몇 양태에서는, IL-1β 결합성 항체 및 단편이 일정 범위 해리 상수의 상한치를 참고로 하여 서술될 수 있다. 또 다른 한편 또는 부가적으로, 본 발명의 몇몇 양태에서는 IL-1β 결합성 항체 및 단편이 일정 범위 해리 상수의 하한치를 참고로 하여 서술될 수 있는데, 예를 들어 본 발명의 항체 또는 단편은 0.07 pM 이상, 또 다른 한편 0.1 pM 이상, 또 다른 한편 0.11 pM 이상, 또 다른 한편 0.15 pM 이상, 또 다른 한편 0.2 pM 이상, 또 다른 한편 0.24 pM 이상, 또 다른 한편 0.26 pM 이상, 또 다른 한편 0.3 pM 이상, 또 다른 한편 0.5 pM 이상, 또 다른 한편 0.7 pM 이상의 해리 상수를 갖는다. 상기 명시된 바와 같은 보다 높은 해리 상수와 보다 낮은 해리 상수를 합하여 일정 범위 해리 상수를 규정할 수 있는데, 단 선택된 하한치는 선택된 상한치 이하여야 한다.
본 발명의 또 다른 국면은 6 pM 초과 50 pM 이하, 또 다른 한편 약 13 pM 내지 약 25 pM의 해리 상수로 IL-1β와 결합하고, 인간 섬유아세포로부터의 IL-1β 자극된 IL-6 방출을 억제하기 위한 IC50이 0.5 nM (500 pM) 미만, 또 다른 한편 약 5 pM 내지 약 200 pM, 또 다른 한편 약 10 pM 내지 약 100 pM, 또 다른 한편 약 30 pM인 신규한 IL-1β 결합성 항체 및 그의 IL-1β 결합성 단편을 제공한다. IL-1β 매개된 질환 또는 질병을 치료 또는 예방하는 몇몇 방법에 대해 전술된 결합 친화성과 효력을 지닌 IL-1β 결합성 항체 또는 단편을 제공하는 것이 요망될 수 있는 것으로 고려된다. 예시되는 항체에는 본원에서 AB1로 지정된 항체가 포함된다.
본 발명의 항체 및 단편은 본원에 제시된 해리 상수로써 표시된 바와 같은 높은 친화도로 IL-1β와 결합한다. 항원에 대한 항체의 친화도에 있어서 특징적인 친화도 상수는 항원-항체 복합체 형성 역학으로써 측정된 연합 상수일 수 있다. 또 다른 한편, 결합 친화도는 연합 상수의 역수인 해리 상수로써 특징지워질 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 KD는 항체-항원 상호 작용의 해리 상수를 지칭한다.
본 발명은 또한, IL-1β의 생물학적 활성을 중화시키기 위해 IL-1β와 결합하는 중화 항체 또는 그의 중화 항체를 포괄한다. IL-1β의 생물학적 활성 중화는 IL-1β 생물학적 활성의 한 가지 이상 지표, 예를 들어 인간 섬유아세포 또는 기타 세포로부터의 IL-1β 자극된 IL-6 방출, 혈액 세포로부터의 IL-1β 유도된 IL-8 방출, 또는 IL-1 유도된 T 조력 세포 증식에 관해 검정함으로써 평가할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 IL-1β 결합성 단편 및 단편은 IL-1β에 의해 결합된 IL-1 수용체 유형 I (IL-1RI)의 신호 전달 기능과 연계된 IL-1β의 생물학적 활성을 중화시킨다.
일반적으로, 본 발명의 중화 항체 및 단편은 IL-1 수용체 유형 I에 대한 IL-1β의 결합이 차단되는지에 상관없이 IL-1β의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있다. 보다 바람직하게, IL-1β 결합성 항체 또는 IL-1β 결합성 단편은 IL-1 수용체 유형 I에 대한 결합된 IL-1β의 결합을 실질적으로 막지 않으면서, IL-1β와 결합함으로써 IL-1β의 생물학적 활성을 중화시킨다. 이러한 항체 및 단편의 잠재적 이점은 IL-1β가 여전히 IL-1RI와 결합할 수 있도록 해주면서도 IL-1β와 결합하여 이를 중화시킬 수 있다는 것이다. 이로써, IL-1β 생물학적 활성 뿐만 아니라 IL-1α 생물학적 활성도 유효하게 저하시킬 수 있는데, 이는 IL-1α와 결합하기 위해 결합되지 않은 채로 있는 IL-1RI 부위가 보다 적어지기 때문이다. 따라서, 본 발명의 IL-1β 결합성 항체 및 단편은 시험관내 및 생체 내에서 IL-1 생물학적 활성을 중화시키고자 하는 방법에 유용하다.
본 발명의 항체 또는 단편은 IL-1β의 생물학적 활성에 영향을 미치는 IL-1β 에피토프와 특이적으로 결합하는 중화 항체 또는 단편일 수 있다. 본 발명의 항체 또는 단편은 IL-1β의 중화-민감성 에피토프와 결합할 수 있다. IL-1β의 중화-민감성 에피토프가 본 발명의 항체 또는 단편 중의 하나에 의해 결합되는 경우에는, 이러한 에피토프를 포함하는 IL-1β의 생물학적 활성이 상실되는 결과가 초래한다.
몇몇 양태에서, IL-1β 결합성 항체 또는 IL-1β 결합성 단편은 혈액 세포로부터의 IL-1β 자극된 IL-8 방출을 억제하기 위한 IC50이 50 pM 미만, 또 다른 한편으론 약 25 pM 이하, 또 다른 한편으론 약 10 pM 이하, 또 다른 한편으론 약 2 pM 이하일 수 있다. 혈액 세포로부터의 IL-1β 자극된 IL-8 방출을 억제하기 위한 IC50은 혈액 세포를 IL-1β 자극시킴으로써 방출된 IL-8을 50% 억제시키는데 요구되는 농도를 지칭한다. 예시되는 항체에는 본원에서 AB7로 지정된 항체가 포함된다.
본 발명은 또한, 변화된 아미노산 서열을 포함하는 IL-1β 결합성 항체 또는 그의 IL-1β 결합성 단편을 포괄하는데, 이러한 변화된 아미노산은 서열 27 또는 서열 28 중에서 선택된 출발 아미노산 서열 (또는 본원에 기재된 기타 서열 모두)로부터의 하나 이상의 치환, 부가 또는 결실을 지니고 있고, 이로써 변화된 항체 또는 단편은 출발 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 친화성과 에피토프 결합 특이성을 지니고 있다. 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가로 인해서도, 출발 항체 또는 단편과 동일하거나 실질적으로 동일한 친화성과 에피토프 결합 특이성을 유지하면서 서열 28 및/또는 서열 27을 포함하는 항체 또는 단편과 같이 본원에 제공된 IL-1β 결합성 항체 또는 IL-1β 결합성 단편을 만들 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 본 발명은 변화된 아미노산 서열을 포함하는 IL-1β 결합성 항체 또는 그의 IL-1β 결합성 단편을 포괄하는데, 이러한 변화된 아미노산은 서열 8을 포함하는 출발 아미노산 서열 (또는 본원에 기재된 기타 서열 모두가 출발 서열로서 사용될 수 있다)로부터의 하나 이상의 치환, 부가 또는 결실을 지니고 있고, 이로써 변화된 항체 또는 단편은 서열 8을 포함하는 출발 아미노산 서열 (또는 출발 아미노산 서열로서 사용되는 특정한 서열)과 동일하거나 실질적으로 동일한 친화성과 에피토프 결합 특이성을 지니고 있다. "실질적으로 동일한" 친화성이란, 본원의 교시에 의해 결정된 바와 같은 친화도 또는 해리 상수가 서열 28 또는 서열 27을 포함하는 항체 또는 단편에 대한 검정에 있어서의 고유 편차, 예를 들어 이러한 검정을 3회 이상 독립적으로 수행하는 경우에 관찰되는 편차보다 더 증가하거나 감소하지 않는다는 것을 의미한다. "실질적으로 동일한" 에피토프 특이성이란, 본원의 교시에 의해 결정된 바와 같이 에피토프를 포함하는 아미노산 서열에 대한 결합도가 서열 28 또는 서열 27을 포함하는 항체 또는 단편에 대한 검정에 있어서의 고유 편차, 예를 들어 이러한 검정을 3회 이상 독립적으로 수행하는 경우에 관찰되는 편차 내에 있는 것을 의미한다. 서열 28 또는 27을 포함하는 항체 또는 단편을 비교하는 경우에는, 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가가 이루어진 출발 아미노산 서열 (이러한 출발 서열은 기타 모든 아미노산에서 동일하다)과 변화된 아미노산 서열 간을 비교해야 한다.
항체, 인간화 항체 및 인간 유전자조작 항체
본 발명의 IL-1β 결합성 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 (mAb), 재조합 항체, 키메라 항체, CDR-이식화 항체, 완전한 인간 항체, 단일쇄 항체, 및/또는 이중-특이적 항체 뿐만 아니라 그의 단편 (변이체 및 유도체 포함)으로서 제공될 수 있는데, 이들은 효소적 절단, 펩티드 합성 또는 재조합 기술을 포함하지만 이에 제한되지 않는 공지된 기술에 의해 공급된다.
항체는 일반적으로, 2개의 중쇄 폴리펩티드와 2개의 경쇄 폴리펩티드를 포함하긴 하지만, 1개의 중쇄와 1개의 경쇄를 갖는 단일 도메인 항체 및 경쇄가 없는 중쇄 항체도 또한 고려된다. 중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로 하여 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 지칭되는 5가지 유형의 중쇄가 있다. 이들 상이한 유형의 중쇄는 각각 5가지 부류의 항체, 즉 IgA (IgA1 및 IgA2 포함), IgD, IgE, IgG 및 IgM을 발생시키는데, 이에는 IgG의 4가지 아부류, 즉 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4가 포함된다. 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로 하여 카파 (κ) 또는 람다 (λ)로 지칭되는 2가지 유형의 경쇄가 있다. 완전한 길이의 항체는 불변 도메인과 가변 도메인을 포함한다. 불변 영역은 항체의 항원 결합성 단편에 존재하지 않아도 된다. 본원에 기재된 항체의 항원 결합성 단편에는 Fab, Fab', F(ab')2 및 F(v) 항체 단편이 포함될 수 있다. 다음에 보다 상세히 논의되는 바와 같이, IL-1β 결합성 단편은 IL-1β와 결합하게 될 항체 단편 및 항원-결합성 폴리펩티드를 포괄한다.
특정 항체 또는 그의 항원 결합성 단편의 중쇄 및 경쇄 서열 각각에는 3개의 상보성 결정 영역 (CDR) 뿐만 아니라 비-CDR 골격 영역 (FR)을 수반한 가변 영역이 포함된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "중쇄" 및 "경쇄"는 달리 언급되지 않는 한 각각 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 의미한다. 중쇄 CDR은 본원에서 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3으로서 지칭된다. 경쇄 CDR은 본원에서 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3으로서 지칭된다. 항체 서열 중의 가변 영역과 CDR은 (i) 당해 분야에서 개발된 일반적 규칙에 따라서 확인할 수 있거나 또는 (ii) 공지된 가변 영역의 데이터베이스에 대항하여 해당 서열을 정렬함으로써 확인할 수 있다. 이들 영역을 확인하는 방법은 문헌 [참고: Kontermann and Dubel, eds., Antibody Engineering, Springer, New York, NY, 2001, and Dinarello et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons Inc., Hoboken, NJ, 2000]에 기재되어 있다. 항체 서열의 데이터베이스는 "카바트만 (Kabatman)" 데이터베이스 [웹사이트: www.bioinf.org.uk/abs; 관리자: A.C. Martin in the Department of Biochemistry & Molecular Biology University College London, London, England] 및 문헌 [참고: Retter et al., Nucl. Acids Res., 33 (Database issue): D671-D674 (2005)]에 기재된 바와 같은 VBASE2 (웹사이트: www.vbase2.org)를 통하여 평가할 수 있다. "카바트만" 데이터베이스 웹사이트에는 CDR을 확인하기 위한 일반적인 경험적 상식이 포함된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "CDR"은 달리 표시되지 않는 한 다음 문헌에 정의되어 있다 [참고: Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5th ed., U.S. Department of Health and Human Services, 1991].
본 발명은 2개의 완전한 길이의 중쇄와 2개의 완전한 길이의 경쇄를 포함하는 IL-1β 결합성 항체를 포괄한다. 또 다른 한편, IL-1β 결합성 항체는 IL-1β에 대한 결합 활성을 보유하고 있는 단일쇄 항체 또는 "미니" 항체 등으로 구축할 수 있다. 이러한 구조물은 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들어 이. 콜라이 (E. coli)에서의 발현을 위한 단일쇄 항체의 어셈블리 및 PCR 매개된 클로닝에 의해 제조할 수 있다 [참고: Antibody Engineering, The practical approach series, J. McCafferty, H. R. Hoogenboom, and D. J. Chiswell, editors, Oxford University Press, 1996]. 이러한 유형의 구조물에서는, 항체 분자의 중쇄 및 경쇄의 가변 부분을 cDNA로부터 PCR 증폭시킨다. 이어서, 이로써 생성된 앰플리콘 (amplicon)을, 예를 들어 아미노산 Gly 및 Ser으로 구성된 가요성 단백질 링커를 코딩하는 링커 DNA를 통하여 제2 PCR 단계에서 어셈블리한다. 이러한 링커는 가변 중쇄 부분과 경쇄 부분이, 항원 결합성 포켓이 재생되고 항원이 완전한 길이의 모 (parent) 이량체성 면역글로불린 분자와 종종 필적하는 친화도로 결합되는 방식으로 폴딩될 수 있게 해준다.
본 발명의 IL-1β 결합성 항체 및 단편은 본원에 기재된 예시 항체, 단편 및 서열의 변이체를 포괄한다. 변이체에는 본원에 기재된 예시 항체, 단편 및 서열들 중의 하나 이상과 동일하거나 실질적으로 동일한 친화성과 에피토프 결합 특이성을 지닌 하나 이상의 아미노산 서열 치환, 결실 및/또는 부가를 포함하는 펩티드 및 폴리펩티드가 포함된다. 따라서, 변이체에는 친화성과 에피토프 결합 특이성 측면에서 실질적인 변화를 유발시키지 않는, 본원에 기재된 예시 항체, 단편 및 서열에 대한 하나 이상의 아미노산 서열 치환, 결실 및/또는 부가를 포함하는 펩티드 및 폴리펩티드가 포함된다. 예를 들어, 항체 또는 단편의 변이체는 서열 1-35 또는 42-57의 아미노산 서열 중의 하나 이상을 포함하는 항체 또는 단편에 대한 한 가지 이상의 변화로부터 비롯될 수 있는데, 이로써 변화된 항체 또는 단편은 출발 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 친화성과 에피토프 결합 특이성을 지닌다. 변이체는 천연 발생적, 예를 들어 대립 유전자성 또는 스플라이스 변이체이거나, 또는 인공적으로 구축할 수 있다. 변이체는 이러한 변이체를 코딩하는 상응하는 핵산 분자로부터 제조할 수 있다. 본 발명의 항체 및 IL-1β 결합성 단편의 변이체는 천연 발생적이거나 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 본래 서열을 시험관내 유전자조작함으로써 도입되는 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열 상의 변화물일 수도 있다. 천연 발생적 변이체에는 외래 항원에 대한 항체 반응 발생 동안에 상응하는 생식세포계 뉴클레오티드 서열 내에서 생체내 생성되는 "체세포" 변이체가 포함된다.
IL-1β 결합성 항체 및 IL-1β 결합성 단편의 변이체는 돌연변이 유발 기술에 의해 제조할 수도 있다. 예를 들어, 아미노산 변화를 항체 코딩 영역 전반에 걸쳐 무작위로 도입할 수 있고, 이로써 생성된 변이체를 대상으로 하여 IL-1β에 대한 결합 친화성이나 또 다른 특성에 대해 스크리닝할 수 있다. 또 다른 한편, 아미노산 변화를 IL-1β 항체의 선별된 영역, 예를 들어 경쇄 및/또는 중쇄 CDR, 및/또는 골격 영역에 도입할 수 있고, 이로써 생성된 항체를 대상으로 하여 IL-1β에 대한 결합성이나 기타 몇몇 활성에 대해 스크리닝할 수 있다. 아미노산 변화에는 단일 아미노산 차이에서부터 소정의 CDR (예를 들어, CDR3) 내에 다수의 아미노산 순열을 도입하는 것까지 다양한, CDR 내에서의 하나 이상의 아미노산 치환이 포괄된다. 또 다른 방법에서, 특정 CDR 내의 각 잔기가 IL-1β 결합에 일조하는지는 이러한 CDR 내의 1개 이상의 잔기를 알라닌으로 치환시킴으로써 평가할 수 있다 [참고: Lewis et al. (1995), Mol. Immunol. 32: 1065-72]. 이어서, 보다 최적의 서열을 결정하기 위해서는 IL-1β에 대한 결합성 측면에서 최적이지 않은 잔기를 변화시킬 수 있다. 또한, CDR (예를 들어, CDR3)의 크기를 증가시키는 아미노산을 삽입함으로써 생성된 변이체가 포괄된다. 예를 들어, 대부분의 경쇄 CDR3 서열은 길이가 9개 아미노산이다. 9개 잔기보다 짧은 항체 내의 경쇄 서열은 해당 CDR의 길이를 증가시키기에 적당한 아미노산을 삽입함으로써 IL-1β에 대한 결합성을 최적화시킬 수 있다.
변이체는 경쇄 또는 중쇄를 "쇄 셔플링"함으로써 제조할 수도 있다 [참고: Marks et al. (1992), Biotechnology 10: 779-83]. 단일 경쇄 (또는 중쇄)를, 중쇄 (또는 경쇄) 레퍼토리 (repertoire)를 갖는 라이브러리와 조합할 수 있고, 이로써 생성된 집단을 대상으로 하여 목적하는 활성, 예를 들어 IL-1β에 대한 결합성에 대해 스크리닝할 수 있다. 이로써, 중쇄와 경쇄 둘 다의 레퍼토리를 포함하는 라이브러리를 이용하는 경우에 가능한 것보다 더 큰, 단일 경쇄 (또는 중쇄)와 조합한 상이한 중쇄 (또는 경쇄) 샘플을 스크리닝할 수 있게 된다.
본 발명의 IL-1β 결합성 항체 및 단편은 본원에 기재된 예시 항체, 단편 및 서열의 유도체를 포괄한다. 유도체에는 화학적으로 변형시킨 폴리펩티드 또는 펩티드, 또는 그의 변이체, 단편 또는 유도체가 포함된다. 이의 예에는 하나 이상의 중합체, 예를 들어 수용성 중합체, N-연결형 또는 O-연결형 탄수화물, 당, 인산염, 및/또는 기타 상기 분자의 공유 부착물이 포함된다. 이러한 유도체는 부착된 분자의 유형이나 위치 면에서 천연 발생적 또는 출발 펩티드 또는 폴리펩티드와 상이한 방식으로 변형시킨다. 유도체에는 상기 펩티드 또는 폴리펩티드 상에 천연상 존재하는 하나 이상의 화학 기의 결실이 추가로 포함된다.
본 발명의 IL-1β 결합성 항체 및 단편은 이중-특이적일 수 있다. 이중-특이적 항체 또는 단편은 몇 가지 형상일 수 있다. 예를 들어, 이중-특이적 항체는 단일 항체 (또는 항체 단편)와 유사할 수 있지만 2개의 상이한 항원 결합 부위 (가변 영역)을 갖는다. 이중-특이적 항체는 화학적 기술 [참고: Kranz et al. (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 5807], "폴리오마 (polyoma)" 기술 [참고: 미국 특허 제4,474,893호] 또는 재조합 DNA 기술에 의해 생성시킬 수 있다. 본 발명의 이중-특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프 (이중 적어도 하나는 IL-1β의 에피토프이다)에 대한 결합 특이성을 지닐 수 있다. 본 발명의 IL-1β 결합성 항체 및 단편은 이종-항체일 수도 있다. 이종-항체는 함께 연결된 2개 이상의 항체, 또는 항체 결합성 단편 (Fab)인데, 각 항체 또는 단편은 상이한 특이성을 지니고 있다.
모노클로날 항체 생성을 우회하는 항체 분자의 항원-결합성 영역의 재조합 DNA 버젼을 창출시키는 기술이 본 발명의 IL-1β 결합성 항체 및 단편에 대해 고려된다. DNA를 세균성 발현 시스템 내로 클로닝한다. 본 발명의 실시에 적합한 상기 기술의 한 가지 예는 발현된 Fab 단백질이 주변세포질 공간 (세균성 세포막과 세포벽 사이)으로 이동할 수 있게 하거나 분비할 수 있게 하는 리더 서열을 갖는 박테리오파아지 (bacteriophage) 람다 벡터 시스템을 이용한다. IL-1β와 결합하는 것을 알아보기 위해 다수의 기능적 Fab 단편을 신속하게 생성시키고 스크리닝할 수 있다. 이러한 IL-1β 결합제 (IL-1β 폴리펩티드에 대한 특이성을 지닌 Fab 단편)가 본 발명의 IL-1β 결합성 항체 및 단편 내에 구체적으로 포괄된다.
본 발명의 IL-1β 결합성 항체 및 단편은 인간화 또는 인간 유전자조작 항체일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 인간화 항체 또는 그의 항원 결합성 단편은 비-인간 항체로부터의 항원 결합 부위 일부와 인간 항체의 골격 및/또는 불변 영역 일부를 포함하는 재조합 폴리펩티드이다. 인간 유전자조작 항체 또는 항체 단편은 인간 내에서 변형된 항체의 검출 가능한 모든 면역원성을 저하시키거나 없애기 위해 특이적 위치에서의 아미노산을 변형 (예를 들어, 결실, 삽입 또는 치환)시킴으로써 유전자조작한 비-인간 (예: 마우스) 항체이다.
인간화 항체에는 키메라 항체 및 CDR-이식화 항체가 포함된다. 키메라 항체는 인간 불변 영역과 연결된 비-인간 항체 가변 영역을 포함하는 항체이다. 따라서, 키메라 항체에서는 가변 영역이 주로 비-인간 영역이고, 불변 영역이 인간 영역이다. 키메라 항체 및 이를 제조하는 방법이 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6841-6855 (1984), Boulianne, et al., Nature, 312: 643-646 (1984), and PCT Application Publication WO 86/01533]. 이들 항체가 마우스 모노클로날 항체보다 덜 면역원성일 수 있지만, 키메라 항체의 투여는 항체의 비-인간 부분에 대한 인간 면역 반응 (HAMA)과 연관되었다. 키메라 항체는 적당한 항원 결합 특이성의 마우스 항체 분자로부터의 유전자를 적당한 생물학적 활성, 예를 들어 인간 보체를 활성화시키고 ADCC를 매개할 수 있는 능력의 인간 항체 분자로부터의 유전자와 함께 스플라이싱함으로써 생성시킬 수도 있다 [참고: Morrison et al. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 6851; Neuberger et al. (1984), Nature, 312: 604]. 한 가지 예는 Fc 영역을 상이한 이소형의 영역으로 대체하는 것이다.
CDR-이식화 항체는 인간 "수용자" 항체로부터의 골격 영역과 연결된 비-인간 "공여자" 항체로부터의 CDR을 포함하는 항체이다. 일반적으로, CDR-이식화 항체에는 키메라 항체보다 더 많은 인간 항체 서열이 포함되는데, 이는 상기 항체가 인간 항체로부터의 불변 영역 서열과 가변 영역 (골격) 서열 둘 다를 포함하기 때문이다. 따라서, 예를 들어 본 발명의 CDR-이식화 인간화 항체는 인간 항체의 골격 영역 (예를 들어, 인간 항체의 FR-1, FR-2 또는 FR-3)으로부터의 연속되는 아미노산 서열 (예를 들어, 약 5개 이상, 10개 이상, 또는 심지어 15개 이상 연속되는 아미노산 잔기)을 포함하거나, 임의로는 인간 항체의 전체 골격 영역의 대부분 또는 전부를 포함하는 중쇄를 포함할 수 있다. CDR-이식화 항체 및 그의 제조 방법은 문헌 [참고: Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986), Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988), and Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)]에 기재되어 있다. 인간화 항체를 생성시키기 위해 사용될 수 있는 방법이 또한 미국 특허 제4,816,567호, 제5,721,367호, 제5,837,243호 및 제6,180,377호에 기재되어 있다. CDR-이식화 항체는 비-인간 항체 부분에 대항하여 면역 반응을 유도시키는 경향이 키메라 항체보다는 덜한 것으로 간주된다. 그러나, 공여자 항체로부터의 골격 서열이 공여자 항체의 결합 친화성 및/또는 특이성에 요구되는데, 이는 아마도 이들 골격 서열이 공여자 항체의 항원 결합성 부분의 폴딩에 영향을 미치기 때문인 것으로 보고되었다. 따라서, 공여자 비-인간 CDR 서열을 변경되지 않은 인간 골격 서열 상으로 이식시킨 경우에는, 이로써 생성된 CDR-이식화 항체가 몇몇 경우에는 본래의 비-인간 공여자 항체와 비교해서 결합 활성도 상실을 나타낼 수 있다 [참고: 예를 들어, Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988), and Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)].
인간 유전자조작 항체에는 "베니어 (veneered)" 항체, 및 HUMAN ENGINEERING™ 기술 (공급처: XOMA (US) LLC, Berkeley, CA)을 이용하여 제조한 항체가 포함된다. HUMAN ENGINEERING™ 기술은 상업적으로 이용 가능하고, 이는 인간에게서 면역원성 저하를 수반하면서도 본래의 비-인간 항체의 목적하는 결합 특성은 보유하고 있는 변형된 항체를 생성시키도록 항체의 아미노산 서열에 대한 특이적 변화를 유도시킴으로써 비-인간 항체 또는 항체 단편, 예를 들어 마우스 또는 키메라 항체 또는 항체 단편을 변경시키는 것을 포함한다. 일반적으로, 상기 기술은 비-인간 (예: 마우스) 항체의 아미노산 잔기를 "저 위험", "중간 수준의 위험" 또는 "고 위험" 잔기로서 분류하는 것을 포함한다. 이러한 분류는 위험에 대항하여 (예를 들어, 인간에게서 면역원성을 위한) 특별한 치환을 만든는 경우에 예상되는 이익을 평가하는 포괄적인 위험/보상 계산법을 이용하여 수행하는데, 이러한 치환은 이로써 생성되는 항체의 폴딩 및/또는 항원 결합 특성에 영향을 미칠 것이다. 따라서, 저 위험 위치는 항원 결합 특성에 상당한 영향을 미치지 않으면서도 면역원성을 저하시키는 것으로 예측되기 때문에 유익할 것으로 예상되는 치환이 이루어진 곳이다. 중간 수준의 위험 위치는 면역원성을 저하시키는 것으로 예측되긴 하지만 단백질 폴딩 및/또는 항원 결합성에 보다 더 영향을 미칠 것으로 예상되는 치환이 이루어진 곳이다. 고 위험 위치는 적당한 폴딩이나 항원 경합성에 가장 많이 관여할 것으로 예상되는 잔기를 포함한다. 일반적으로, 비-인간 항체 중의 저 위험 위치는 인간 잔기로 치환시키고, 고 위험 위치는 거의 치환시키지 않으며, 중간 수준의 위험 위치에서의 인간화 치환이 종종 이루어지긴 하지만, 무차별적이지 않다. 비-인간 항체 가변 영역 서열 중의 프롤린을 수반한 위치는 통상적으로, 적어도 중간 수준의 위험 위치로서 분류된다.
비-인간 (예: 마우스) 항체 서열의 소정의 저 위험 위치 또는 중간 수준의 위험 위치에서 치환될 특정한 인간 아미노산 잔기는 비-인간 항체의 가변 영역으로부터의 아미노산 서열을 특이적 또는 컨센서스 인간 항체 서열의 상응하는 영역과 정렬시킴으로써 선별할 수 있다. 이러한 정렬에 따라서 인간 항체 서열 중의 상응하는 영역을 비-인간 서열 중의 저 위험 또는 중간 수준의 위험 위치에서의 아미노산 잔기로 치환시킬 수 있다. 인간 유전자조작 단백질을 제조하기 위한 기술은 다음 문헌에 보다 상세히 기재되어 있다 [참고: Studnicka et al., Protein Engineering, 7: 805-814 (1994), 미국 특허 제5,766,886호, 제5,770,196호, 제5,821,123호 및 제5,869,619호, 및 PCT 공개공보 WO 93/11794].
"베니어" 항체는 면역원성을 추가로 저하시키거나 기능을 추가로 증강시키기 위해 특정의 용매-노출된 아미노산 잔기를 대체시키도록 유전자조작한 비-인간 또는 인간화 항체 (예를 들어, 키메라 또는 CDR-이식화 항체)이다. 키메라 항체의 표면 잔기는 적당한 항체 폴딩에 영향을 미치는 정도가 덜하고 면역 반응을 유도시키는 경향이 더 많은 것으로 추정되기 때문에, 키메라 항체를 배니어링 (veneering)하는 것에는, 예를 들어 키메라 항체의 비-인간 골격 영역 중의 용매-노출된 잔기를 확인하고, 이들 중의 적어도 하나를 인간 골격 영역으로부터의 상응하는 표면 잔기로 대체시키는 것이 포함될 수 있다. 베니어링은 상기 언급된 HUMAN ENGINEERING™ 기술의 사용을 포함한 적합한 모든 공학 기술에 의해 달성할 수 있다.
상이한 접근법에서는, CDR-이식화 항체를 "탈인간화"함으로써 결합 활성도 회복을 성취할 수 있다. 탈-인간화에는 공여자 항체의 골격 영역으로부터의 잔기를 CDR 이식화 항체로 복원시킴으로써 적당한 폴딩을 복원시키는 것이 포함될 수 있다. 유사한 "탈-인간화"는 (i) "공여자" 골격 영역의 일부를 "수용자" 항체에 포함시키거나 또는 (ii) "공여자" 항체 골격 영역의 일부를 수용자 항체 내로 (이식화 공여자 CDR과 함께) 이식함으로써 달성할 수 있다.
항체, 인간화 항체, 인간 유전자조작 항체, 및 이들의 제조 방법에 관한 추가의 논의는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Kontermann and Dubel, eds., Antibody Engineering, Springer, New York, NY, 2001].
예시되는 인간화 또는 인간 유전자조작 항체에는 IgG, IgM, IgE, IgA, 및 IgD 항체가 포함된다. 본 발명의 항체는 어떠한 부류 (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD 등) 또는 이소형일 수도 있으며 카파 또는 람다 경쇄를 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간 항체는 IgG 중쇄 또는 규정 단편, 예를 들어 이소형 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중의 적어도 하나를 포함할 수 있다. 추가의 예로서, 본 발명의 항체 또는 단편은 IgG1 중쇄 및 IgG1 경쇄를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 및 단편은 인간 항체, 예를 들어 인간 생식세포계 면역글로불린 핵산 서열의 천연 발생적 체세포 변이체인 핵산 서열에 의해 코딩되고 IL-1β 폴리펩티드와 결합하는 항체, 및 그의 단편, 합성 변이체, 유도체 및 융합물일 수 있다. 이러한 항체는 당해 분야에 공지된 모든 방법, 예를 들어 본래의 면역글로불린 레퍼토리를 포유류 염색체 중의 인간 V-유전자로 대체시킨 트랜스제닉 (transgenic) 포유류 (예를 들어, 트랜스제닉 마우스)를 사용함으로써 생성시킬 수 있다. 이러한 포유류는 인간 생식세포계 항체 유전자의 체세포 초변이와 VDJ 재조합을 정상적인 방식으로 수행하는 것으로 여겨지므로, 완전한 인간 서열을 지닌 고 친화성 항체를 생성시킨다.
인간 항체는 파아지 디스플레이 (phage display) 항체 라이브러리를 시험관내 스크리닝함으로써 생성시킬 수도 있다 [참고: Hoogenboom et al. (1991), J. Mol. Biol. 227: 381; and Marks et al. (1991), J. Mol. Biol. 222: 581]. 각종 항체-함유 파아지 디스플레이 라이브러리가 보고되었고 용이하게 제조할 수 있다. 라이브러리는 적당한 표적에 대항하여 스크리닝할 수 있는 다양한 인간 항체 서열, 예를 들어 인간 Fab, Fv, 및 scFv 단편을 포함할 수 있다. 파아지 디스플레이 라이브러리는 IL-1β의 선택적 결합제를 확인하기 위해 스크리닝할 수 있는 항체 이외의 펩티드 또는 단백질을 포함할 수 있다.
IL-1β 결합성 항체 및 단편은 IL-1β와는 결합하지 않지만 대신 기타 기능, 예를 들어 순환성 반감기, 직접적인 세포독성 효과, 검출 가능한 표지화, 또는 수용자의 내인성 보체 케스케이드 또는 내인성 세포성 세포독성의 활성화에 대해 책임이 있는 하나 이상의 부분을 포함할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 단편은 불변 영역의 전부 또는 일부를 포함할 수 있고 모든 이소형, 예를 들어 IgA (예: IgA1 또는 IgA2), IgD, IgE, IgG (예: IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4), 또는 IgM일 수 있다. 불변 영역을 포함하는 것 이외에 또는 불변 영역을 포함하는 것 대신, 본 발명의 항원-결합성 화합물은 에피토프 태그, 재이용 수용체 에피토프, 진단 또는 정제용 표지 부분, 또는 세포독성 부분, 예를 들어 방사성핵종 또는 독소를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 및 단편의 불변 영역 (존재하는 경우)은 γ1, γ2, γ3, γ4, μ, β2 또는 δ 또는 ε 유형, 바람직하게 γ 유형, 보다 바람직하게 y 유형일 수 있는 반면, 인간 경쇄의 불변 부분은 κ 또는 λ 유형 (이에는 λ1, λ2 및 λ3 아유형이 포함된다)일 수 있는데, 바람직하게는 κ 유형이다.
변이체에는 또한, 변형된 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 단편이 포함되는데, 이러한 변형된 Fc 영역은 야생형 Fc 영역과 비교해서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 변이체 Fc 영역은 Fc 수용체와 보다 크거나 적은 친화도로 결합하도록 하기 위해, 야생형 Fc 영역을 포함하는 거의 동등한 수준의 분자를 기준으로 하여 설계할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 IL-1β 결합성 항체 및 단편은 변형된 Fc 영역을 포함할 수 있다. Fc 영역은 IgG의 파파인 분해시 생성되는 IgG C-말단 도메인과 상동성인 천연 발생적 또는 합성 폴리펩티드를 지칭한다. IgG Fc는 분자량이 대략 50 kD이다. 본 발명의 항체 및 단편에서는, 전체 Fc 영역을 사용할 수 있거나 또는 단지 반감기 증강 부분 만을 사용할 수 있다. 또한, 아미노산 서열 상의 많은 변형이 허용 가능한데, 이는 본래의 활성이 모든 경우에 있어 반드시 필요하거나 요망되지 않기 때문이다.
Fc 영역은 경우에 따라, 보체를 고정시킬 수 있고 Fc 수용체와 고 친화도로 결합할 수 있는 그의 능력을 억제하기 위해 돌연변이시킬 수 있다. 뮤린 IgG Fc의 경우에, Glu 318, Lys 320, 및 Lys 322를 Ala 잔기로 치환시키면 해당 단백질은 ADCC를 지시할 수 없게 된다. Leu 235를 Glu로 치환시키면 Fc 수용체와 고 친화도로 결합할 수 있는 단백질의 능력이 억제된다. 인간 IgG에 대한 각종 돌연변이는 공지되어 있다 [참고: 예를 들어, Morrison et al., 1994, The Immunologist 2: 119 124 and Brekke et al., 1994, The Immunologist 2: 125].
몇몇 양태에서는, 생물학적 환경 하에 본 발명의 항체 또는 단편의 반감기, 예를 들어 혈청 반감기 또는 시험관내 검정에 의해 측정된 반감기를 증가시키도록 천연 발생적 Fc 영역을 변형시킨 변형된 Fc 영역을 수반하는 본 발명의 항체 또는 단편이 제공된다. IgG의 Fc 영역의 본래 형태를 변경시키는 방법이 또한 미국 특허 제6,998,253호에 기재되어 있다.
특정 양태에서는, 혈청 반감기를 증가시키기 위해 본 발명의 항체 또는 단편을 변형시키는 것이 요망될 수도 있는데, 예를 들어 PEG와 같은 분자 또는 기타 수용성 중합체 (다당류 중합체 포함)를 항체 단편에 가하여 반감기를 증가시킬 수 있다. 이는 또한 예를 들어, 재이용 수용체 결합성 에피토프를 항체 단편 내로 혼입함으로써 (예를 들어, 상기 항체 단편 중의 적당한 영역을 돌연변이시키거나 또는 에피토프를 펩티드 태그 내로 혼입한 다음, 이를 어느 한 말단이나 중앙에서, 예를 들면 DNA 또는 펩티드 합성에 의해 항체 단편과 융합시킴으로써) 달성할 수도 있다 [참고: 국제공개공보 WO 96/32478]. 재이용 수용체 결합성 에피토프는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는데 책임이 있는 IgG 분자 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 지칭한다.
재이용 수용체 결합성 에피토프에는 Fc 도메인의 1개 또는 2개 루프로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기를 항체 단편의 유사한 위치에 전이시킨 영역이 포함될 수 있다. 보다 더 바람직하게, Fc 도메인의 1개 또는 2개 루프로부터의 3개 이상의 잔기를 전이시킨다. 보다 더 바람직하게, 상기 에피토프는 (예를 들어, IgG의) Fc 영역의 CH2 도메인로부터 취하고, 이를 항체의 CH1, CH3, 또는 VH 영역, 또는 이러한 영역 하나 이상에 전이시킨다. 또 다른 한편, 상기 에피토프는 Fc 영역의 CH2 도메인으로부터 취하고, 항체 단편의 CL 영역 또는 VL 영역, 또는 이들 둘 다에 전이시킨다. Fc 변이체 및 이와 재이용 수용체와의 상호 작용에 관해 기재한 국제공개공보 WO 97/34631 및 WO 96/32478을 참고할 수 있다.
Fc 수용체 결합 부위 내의 잔기를 돌연변이시키면 효과기 기능이 변경될 수 있는데, 예를 들어 ADCC 또는 CDC 활성이 변경될 수 있거나 반감기가 변경될 수 있다. 잠재적 돌연변이에는 하나 이상의 잔기의 삽입, 결실 또는 치환, 예를 들어 알라닌으로의 치환, 보존적 치환, 비-보존적 치환, 또는 상이한 IgG 아부류로부터의 동일한 위치에서의 상응하는 아미노산 잔기로의 대체 (예를 들어, IgG1 잔기를 상기 위치에서 상응하는 IgG2 잔기로 대체시킴)가 포함된다. 예를 들어, IgG4 중의 아미노산 위치 241에서의 세린을 프롤린 (IgG1 및 IgG2 중의 동일 위치에서 발견됨)으로 돌연변이시키면 동질적 항체가 생성될 뿐만 아니라 본래의 키메라 IgG4와 비교해서 조직 분포도가 개선되고 혈청 반감기가 연장되는 것으로 보고되었다 [참고: Angal et al, Mol. Immunol. 30:105-8, 1993].
바람직하게, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 IL-1β 이외의 어떠한 표적과도 교차-반응하지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 항체 및 단편은 바람직하게, IL-1α와 검출 가능한 수준으로 결합하지 않는다.
IL-1β 결합성 항체 또는 항체 단편
항체 단편은 완전한 길이의 본래 항체의 일부, 예를 들어 본래 항체의 항원 결합성 또는 가변 영역이다. 항체 단편의 예에는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아보디 (diabody); 선형 항체; 단일쇄 항체 분자 (예: scFv); 다중-특이적 항체 단편, 예를 들어 이중-특이적, 삼중-특이적 및 다중-특이적 항체 [예: 디아보디, 트리아보디 (triabody), 테트라보디 (tetrabody)]; 미니보디 (minibody); 킬레이트 재조합 항체; 트리보디 또는 바이보디; 인트라보디 (intrabody); 나노보디 (nanobody); 소형 모듈 면역약제 (SMIP), 결합성-도메인 면역글로불린 융합 단백질; 카멜화 (camelized) 항체; VHH 함유 항체; 및 항체 단편으로부터 형성된 기타 모든 폴리펩티드가 포함된다.
본 발명은 서열 2를 포함하는 IL-1β 결합성 항체 또는 그의 IL-1β 결합성 단편을 제공한다. 도 1은 서열 2의 아미노산 서열을 예시하고 있다. 바람직하게, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 서열 21의 아미노산 서열을 포함하고, 보다 바람직하게 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7 또는 서열 8의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 항체는 또한, 서열 12 또는 서열 13의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 바람직하게 서열 14 또는 서열 15의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열 2의 아미노산 서열 (예를 들어, 서열 4-8, 12-15, 또는 21의 아미노산 서열을 포함한다)을 포함한다. 항체의 경쇄는 바람직하게, 서열 1의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열 1의 아미노산으로 필수적으로 이루어지거나 또는 서열 1의 아미노산으로 이루어진다. 따라서 예를 들어, 항체의 경쇄는 서열 9, 서열 10 또는 서열 11의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들 서열의 아미노산으로 필수적으로 이루어지거나 또는 이들 서열의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 항체 단편의 중쇄 가변 영역이 서열 23 또는 서열 24 (예를 들어, 서열 25 또는 서열 26)의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들 서열의 아미노산으로 필수적으로 이루어지거나 또는 이들 서열의 아미노산으로 이루어진 항체 또는 항체 단편이 또한 바람직하다.
본 발명은 서열 2, 23 또는 24의 아미노산 서열 중의 하나, 또 다른 한편 서열 12, 13, 21, 23 또는 24의 아미노산 서열 중의 하나, 또 다른 한편 서열 12, 13 또는 21의 아미노산 서열 중의 하나, 또 다른 한편 서열 13 또는 21의 아미노산 서열 중의 하나, 또 다른 한편 서열 8, 14 또는 15의 아미노산 서열 중의 하나, 또는 또 다른 한편 서열 8 또는 15의 아미노산 서열 중의 하나를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 IL-1β 결합성 항체 또는 그의 IL-1β 결합성 단편을 제공한다. 전형적으로, 상기 항체 또는 항체 단편은 바람직하게 서열 9, 서열 10 또는 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 가지 예로서, 바람직한 항체는 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명은 또한, 서열 28의 아미노산 서열 중의 하나를 포함하는 IL-1β 결합성 항체 또는 그의 IL-1β 결합성 단편을 제공한다. 바람직하게, 상기 항체 또는 단편은 서열 27의 아미노산 서열 중의 하나를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한, 서열 29를 포함하거나, 서열 29로 필수적으로 이루어지거나 또는 서열 29로 이루어진 IL-1β 결합성 항체 또는 그의 IL-1β 결합성 단편을 제공한다. 바람직하게, 상기 항체 또는 항체 단편은 서열 31-35의 아미노산 서열, 또 다른 한편 서열 31, 32 또는 33의 아미노산 서열, 또는 또 다른 한편 서열 32 또는 33의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들 서열의 아미노산으로 필수적으로 이루어지거나 또는 이들 서열의 아미노산으로 이루어진다. 바람직하게, 상기 항체 또는 항체 단편은 서열 27의 아미노산 서열 중의 하나, 또 다른 한편 서열 9, 서열 10 또는 서열 11의 아미노산 서열 중의 하나를 포함하는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함한다.
도 2, 3 및 4에는 본 발명의 예시 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 제시되어 있는데, 이들 서열은 본원에서 AB1, AB2, AB3, AB4, AB5, AB5.1, AB5.2, AB5.3, 및 AB5.4로서 지칭된 항체에 상응한다. AB5.1, AB5.2, AB5.3, 및 AB5.4 서열은 중쇄 CDR3 영역에 X1 및 X2로 지정된 가변 위치를 포함한다. 이들 가변 위치는 표시된 아미노산 중의 어느 하나일 수도 있다. 바람직하게, X1과 X2는 각각 알라닌과 아르기닌, 발린과 아르기닌, 페닐알라닌과 아르기닌, 리신과 리신, 또는 아스파라긴과 아르기닌이다.
AB5.1은 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. AB5.2는 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. AB5.3은 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. AB5.4는 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명은 전술된 중쇄 또는 경쇄 서열 중의 어느 하나를 포함하고 IL-1β와 결합하는 IL-1β 결합성 항체 단편을 포괄한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 단편은 해당 항체의 3개 이상의 연속되는 아미노산 (예를 들어, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 8개 이상, 또는 심지어 10개 이상의 연속되는 아미노산)을 지칭하고, Fab, Fab', F(ab')2 및 F(v) 단편, 또는 개별적 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 또는 그의 일부를 포괄한다. IL-1β 결합성 단편에는 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 및 scFv가 포함된다. 이들 단편에는 본래 항체의 Fc 단편이 결여되어 있고, 순환시 보다 신속하게 제거되며, 본래 항체보다 덜한 비-특이적 조직 결합성을 지닐 수 있다 [참고: Wahl et al. (1983), J. Nucl. Med., 24: 316-25]. 이들 단편은 널리 공지된 방법, 예를 들어 파파인 (Fab 단편을 생성시키기 위함) 또는 펩신 [F(ab')2 단편을 생성시키기 위함]과 같은 효소를 사용하여 단백질 분해적 절단시킴으로써 본래 항체로부터 생성시킬 수 있다.
본 발명은 IL-1β 리간드와 선택적으로 결합하지만, 이와 같이 결합된 IL-1β 리간드가 IL-1 수용체 유형 I (IL-1RI)와 결합할 수 있도록 허용하거나 실질적으로 허용하는 IL-1β 결합성 항체 및 그의 IL-1β 결합성 단편을 포괄한다 (실시예 14 및 도 19 및 20 참고). 몇 가지 공지된 IL-1β 결합성 항체를 포함한 많은 항체와는 달리, AB5 및 AB7로 지정된 항체는 IL-1β 리간드와 선택적으로 결합하지만, 실시예 14에서 입증된 바와 같이 IL-1β가 IL-1RI와 결합하는 것을 차단하지 않거나 실질적으로 차단하지 않는다. 예를 들어, AB7로 지정된 항체는 IL-1β 에피토프와 결합하지만, 결합된 IL-1β가 IL-1RI와 결합하도록 허용해준다. 따라서, 본 발명은 IL-1β 에피토프와 결합하는 IL-1β 결합성 항체 또는 단편을 포괄하는데, 이와 같이 결합된 항체 또는 단편은 IL-1β가 IL-1 수용체 I (IL-1RI)와 결합하도록 허용해주거나 실질적으로 허용해주고 이러한 항체 또는 단편은 인간 IL-1β와 3 pM 미만의 해리 상수로 결합한다.
시험관내 및 세포에 의거한 검정은 IL-1 수용체 유형 I에 대한 IL-1β의 결합성을 결정하는데 사용하도록 당해 분야에 널리 보고되었는데, 이에는 IL-1β 또는 IL-1RI와 결합하는 분자 (예를 들어, 항체, 길항제 또는 기타 억제제)의 존재를 결정하는데 사용하기 위한 검정이 포함된다 [참고: 예를 들어, Evans et al., (1995), J. Biol. Chem. 270:11477-11483; Vigers et al., (2000), J. Biol. Chem. 275:36927-36933; Yanofsky et al., (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7381-7386; Fredericks et al., (2004), Protein Eng. Des. Sel. 17:95-106; Slack et al., (1993), J. Biol. Chem. 268:2513-2524; Smith et al., (2003), Immunity 18:87-96; Vigers et al., (1997), Nature 386:190-194; Ruggiero et al., (1997), J. Immunol. 158:3881-3887; Guo et al., (1995), J. Biol. Chem. 270:27562-27568; Svenson et al., (1995), Eur. J. Immunol. 25:2842-2850; Arend et al., (1994), J. Immunol. 153:4766-4774]. 상기 검정에 사용하기 위한 재조합 IL-1 수용체 유형 I (인간 IL-1 수용체 유형 I 포함)은 각종 상업적 공급처 [예를 들어, R&D Systems, SIGMA]로부터 용이하게 입수 가능하다. IL-1 수용체 유형 I은 당해 분야에 공지된 표준 분자 생물학 및 형질감염 기술을 사용하여 적당한 숙주 세포 내로 도입된 발현 구조물 또는 벡터로부터 발현시킬 수도 있다. 이어서, 이와 같이 발현된 IL-1 수용체 유형 I을 결합 검정에 사용하도록 분리 및 정제할 수 있거나, 또 다른 한편으론 세포 연합된 형태로 직접 사용할 수도 있다.
예를 들어, IL-1 수용체 유형 I에 대한 IL-1β의 결합성은 IL-1β 결합성 항체를 고정화시키는 단계, 이와 같이 고정화시킨 항체를 IL-1β와 접촉시킨 다음 IL-1β가 상기 항체와 결합하였는지를 결정하는 단계, 가용성 형태의 IL-1RI를 상기 결합된 IL-1β/항체 복합체와 접촉시키는 단계, 및 가용성 IL-1RI이 상기 복합체와 결합하였는지를 결정하는 단계에 의해 결정할 수 있다. 이러한 프로토콜은 또한, 가용성 IL-1RI를 IL-1β와 접촉시키기 전에 상기 고정화 항체와 접촉시켜, 가용성 IL-1RI이 고정화 항체와 결합하지 않는다는 것을 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 프로토콜은 결합 상호 작용을 역학적으로 분석하기 위한 비아코어 (Biacore®) 기기를 사용하여 수행할 수 있다. 상기 프로토콜을 이용하여 특정 항체 또는 기타 분자가 IL-1 수용체 유형 I에 대한 IL-1β의 결합을 허용하는지 아니면 차단시키는지를 결정할 수도 있다.
기타 IL-1β/IL-1RI 결합 검정의 경우, IL-1 수용체 유형 I에 대한 IL-1β의 결합 허용성 또는 차단성은 IL-1β 항체 또는 그의 IL-1β 결합성 단편의 존재 또는 부재 하에 IL-1RI에 대한 IL-1β의 결합성을 비교함으로써 결정할 수 있다. 차단성은 검정 정보판독에서, 상응하는 완충제 또는 희석제는 함유하지만 IL-1β 항체 또는 그의 IL-1β 결합성 단편은 함유하지 않는 대조군 샘플과 비교해서, 항-IL-1β 항체 또는 그의 IL-1β 결합성 단편의 존재 하에서의 IL-1 수용체 유형 I에 대한 지정된 IL-1β 결합성 저하로서 확인된다. 이러한 검정 정보판독은 차단성의 존재 또는 부재를 표시하는 것으로서 정성적으로 관찰될 수 있거나, 또는 항체 또는 단편의 존재로 인한 결합성 저하 % 또는 저하 배수를 표시하는 것으로서 정량적으로 관찰될 수 있다.
또 다른 한편, 또는 부가적으로, IL-1β 결합성 항체 또는 IL-1β 결합성 단편이 IL-1RI에 대한 IL-1β 결합을 실질적으로 차단시킨 경우에는, IL-1RI에 대한 IL-1β 결합성이 상기 항체 또는 단편의 부재 하에서 동일한 농도의 IL-1β와 IL-1RI의 결합성과 비교해서 10배 이상, 또 다른 한편 약 20배 이상, 또 다른 한편 약 50배 이상, 또 다른 한편 약 100배 이상, 또 다른 한편 약 1000배 이상, 또 다른 한편 약 10000배 이상 저하된다. 또 다른 예로서, IL-1β 결합성 항체 또는 IL-1β 결합성 단편이 IL-1RI에 대한 IL-1β 결합을 실질적으로 허용하는 경우에는, IL-1RI에 대한 IL-1β 결합성이 상기 항체 또는 단편의 부재 하에서 동일한 농도의 IL-1β와 IL-1RI의 결합성의 약 90% 이상, 또 다른 한편 약 95% 이상, 또 다른 한편 약 99% 이상, 또 다른 한편 약 99.9% 이상, 또 다른 한편 약 99.99% 이상, 또 다른 한편 약 99.999% 이상, 또 다른 한편 약 99.9999% 이상, 또 다른 한편 실질적으로 동일하다.
본 발명은 본원에 기재된 예시 항체 중의 하나 이상과 동일한 에피토프 또는 실질적으로 동일한 에피토프와 결합하는 IL-1β 결합성 항체 또는 IL-1β 결합성 단편을 포괄한다. 또 다른 한편 또는 부가적으로, IL-1β 결합성 항체 또는 IL-1β 결합성 단편은 서열 11의 경쇄 가변 영역과 서열 15의 중쇄 가변 영역을 갖는 항체와 결합을 놓고 경쟁한다. 또 다른 한편 또는 부가적으로, 본 발명은 AB5 및 AB7로 지정된 항체와 결합하는 에피토프인, 아미노산 서열 ESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIE (서열 36)에 포함된 에피토프와 결합하는 IL-1β 결합성 항체 및 단편을 포괄한다. 본원에 고려된 바와 같이, IL-1β 결합성 항체 또는 단편이 당해 분야에 공지된 몇 가지 방법을 사용하여 예시 항체 중의 하나 이상, 예를 들어 AB7로 지정된 항체와 동일한 에피토프 또는 실질적으로 동일한 에피토프와 결합하는 지를 용이하게 결정할 수 있다.
예를 들어, IL-1β 결합성 항체 또는 단편에 의해 결합된 주요 아미노산 잔기 (에피토프)는 실시예 11에 기재된 방법과 유사한 펩티드 어레이를 사용하여 결정할 수 있다. 펩티드 어레이, 예를 들어 PepSpot™ 펩티드 어레이 (공급처: JPT Peptide Technologies, Berlin, Germany) [여기서는, 12개 아미노산 펩티드 스캔이 전체 IL-1β 아미노산 서열에 걸쳐 있고, 각 펩티드는 앞서의 것과 11개 아미노산이 중복된다]는 막 상에서 직접 합성한다. 이어서, 이러한 펩티드를 수반하는 막을, 예를 들어 2 ㎍/ml의 농도로 실온 하에 2시간 동안 에피토프 결합성 정보를 얻고자 하는 항체로 프로빙한다. 막 결합된 펩티드에 대한 항체의 결합은 이차 HRP-접합된 염소 항-인간 (또는 경우에 따라, 마우스) 항체를 사용한 다음 증강 화학발광 (ECL)을 이용하여 탐지할 수 있다. 성숙한 IL-1β 단백질의 특별한 아미노산 잔기 또는 서열에 상응하고 항체 결합에 대해 양성인 것으로 기록되는 펩티드 스폿(들)은 특별한 항체에 의해 결합된 에피토프의 지표이다.
또 다른 한편 또는 또한, 항체 경쟁 실험을 수행할 수 있고 이러한 검정은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 항체 또는 단편이 성숙한 IL-1β 단백질의 잔기 83-105에 상응하는 아미노산 ESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIE을 포함하는 펩티드 서열 내에 포함된 에피토프와 결합하는지를 결정하기 위해, 공지되지 않은 특이성의 항체를 상기 서열 내에 포함된 에피토프와 결합하는 것으로 공지되어 있는 본 발명의 예시 항체 (예: AB7)와 비교할 수 있다. 예를 들어, 결합 상호 작용을 역학적 분석하기 위한 비아코어® 기기를 사용하거나 ELISA에 의해 결합 경쟁 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정에서는, 공지되지 않은 에피토프 특이성의 항체를 대상으로 하여, 공지된 비교인자 항체 (예: AB7)에 대항하여 결합하는 것을 놓고 경쟁할 수 있는 능력에 관하여 평가한다. 특별한 에피토프에 대한 결합을 놓고 경쟁하는 것은 IL-1β 에피토프에 대한 결합성이 공지된 비교인자 항체 (예: AB7) 경우의 약 50% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 99% 이상 또는 약 100% 저하됨으로써 결정되는데, 이는 실질적으로 동일한 에피토프에 대한 결합성의 지표이다.
이와 같이 기재한 예시 항체 내의 IL-1β 결합성 영역 및/또는 이러한 항체에 의해 인식된 에피토프를 확인한다는 측면에서 보면, 유사한 결합 특징과 치료적 또는 진단적 유용성을 지닌 부가의 항체가 상기 언급된 양태와 병행해서 생성될 수 있는 것으로 고려된다.
더우기, 본 발명의 IL-1β 항체 및 단편은 하나 이상의 보존적 치환 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 보존적 치환)을 수반한 전술된 경쇄 또는 중쇄의 아미노산 서열을 포괄한다. 본 명세서 측면에서 보면, 보존적 치환 대상 후보인 아미노산 서열의 위치를 결정할 수 있고, 특별한 모든 아미노산에 대한 보존적 치환을 수행하는 합성 및 천연 발생적 아미노산을 선택할 수 있다. 보존적 치환을 선택하는 경우에 고려할 사항으로는 특별한 아미노산 치환이 이루어지는 정황, 측쇄의 소수성 또는 극성, 측쇄의 일반적 크기, 및 생리적 조건 하에 산성 또는 염기성 특성을 지닌 측쇄의 pK 값이 있다. 예를 들어, 리신, 아르기닌 및 히스티딘이 서로 치환되는 것이 종종 적합하다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 이는 3개 아미노산 모두가 염기성 측쇄를 갖고 있는 반면, 리신과 아르기닌의 측쇄에 대한 pK 값은 히스티딘 (약 6)에 대해서 보다도 서로 (약 10 및 12)에 대해 훨씬 더 근접하기 때문이다. 유사하게, 글리신, 알라닌, 발린, 루이신 및 이소루이신이 서로 치환되는 것이 종종 적합한데, 단 글리신은 해당 군의 기타 구성원과 자주 치환되긴 하지만 적합하지는 않다. 이는 이들 아미노산 각각은 폴리펩티드 내로 혼입되는 경우에 비교적 소수성이지만, 글리신은 α-탄소가 결여되어 (이러한 α-탄소 주변에) 파이 (phi) 및 사이 (psi) 회전각을 허용함으로써 많은 입체 형태적 자유을 제공하여 기타 아미노산이 서로 치환되는 경우에는 종종 발생하지 않는 입체 형태 또는 이차 구조 상의 변화를 글리시닐 잔기가 촉발시킬 수 있기 때문이다. 서로 자주 적합하게 치환되는 기타 아미노산 군에는 글루탐산 및 아스파르트산으로 이루어진 군; 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판으로 이루어진 군; 및 세린, 트레오닌, 및 임의로 티로신으로 이루어진 군이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다.
아미노산 서열에 대한 보존적 변형 또는 코딩 뉴클레오티드에 대한 상응하는 변형을 만듬으로써, 본원에 기재된 예시 항체 및 단편과 유사한 기능적 및 화학적 특징을 지닌 IL-1β 결합성 항체 또는 IL-1β 결합성 단편을 생성시킬 수 있다. 이와는 달리, IL-1β 결합성 항체 또는 IL-1β 결합성 단편의 기능적 및/또는 화학적 특징 면에서의 상당한 변형은 (a) 치환 부위에서의 분자 골격 구조를, 예를 들어 시트 또는 나선형 입체 형태로서 유지하는 것에 대한 그들의 효과, (b) 표적 부위에서의 해당 분자의 전하 또는 소수성을 유지하는 것에 대한 그들의 효과, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는 것에 대한 그들의 효과 면에서 상당히 상이한 치환을 선택함으로써 달성할 수 있다.
항체의 항원 결합성 단편에는 일반적으로 항체의 항원 결합성 부분을 보유함으로써 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있는 단편이 포함된다. 항체의 항원 결합 기능은 완전한 길이의 항체에 의해 수행될 수 있는 것으로 널리 확립되어 있다. 항원 결합성 부분의 예에는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 (hinge) 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인인 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암 (arm)의 VL 및 VH 도메인인 Fv 단편; (v) VH 도메인인 dAb 단편 [참고: Ward et al., (1989) Nature 341:544-546]; 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역 (CDR)이 포함된다. 단일쇄 항체가 또한, 용어 항체의 항원 결합성 부분 내에 포괄된다. 본 발명의 IL-1β 결합성 항체 및 단편은 또한, 스캐폴드 (scaffold) (예를 들어, 단백질 또는 탄수화물 스캐폴딩)를 수반하거나 수반하지 않는, 1가 또는 다가, 또는 단량체성 또는 다량체성 (예: 사량체성) CDR-유래된 결합성 도메인을 포괄한다.
본 발명의 IL-1β 결합성 항체 또는 단편은 항체 또는 항체 일부와 하나 이상의 기타 단백질 또는 펩티드와의 공유적 또는 비공유적 연합에 의해 형성된 보다 큰 면역부착 분자의 일부일 수 있다. 이러한 면역부착 분자의 예에는 스트렙타비딘 코어 영역을 사용하여 사량체성 scFv 분자를 제조하는 것 [참고: Kipriyanov, S. M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101]과 시스테인 잔기, 마커 펩티드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그를 사용하여 2가 및 바이오티닐화 scFv 분자를 제조하는 것 [참고: Kipriyanov, S. M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058]이 포함된다. 면역부착 분자를 포함하는 항체 및 단편은 본원에 기재된 바와 같은 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 수득할 수 있다. 바람직한 항원 결합성 부분은 완전한 도메인 또는 완전한 도메인 쌍이다.
본 발명의 IL-1β 결합성 항체 및 단편은 또한, VH 도메인으로 이루어진 도메인 항체 (dAb) 단편 [참고: Ward et al, Nature 341:544-546, 1989]을 포괄한다. 본 발명의 IL-1β 결합성 항체 및 단편은 또한 디아보디를 포괄하는데, 이는 동일한 쇄 상에서 VH 도메인과 VL 도메인 간에 쌍을 형성시키기에는 너무 짧은 링커를 사용하여 이들 두 도메인을 단일 폴리펩티드 쇄 상에서 발현시킴으로써, 이들 도메인이 또 다른 쇄의 상보성 도메인과 쌍을 형성하도록 하고 2개의 항원 결합 부위를 창출시키는 2가 항체이다 [참고: 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993, and Poljak et al., Structure 2: 1121-1123, 1994]. 디아보디는 이중-특이적 또는 단일-특이적일 수 있다.
본 발명의 IL-1β 결합성 항체 및 단편은 또한, IL-1β와 결합하는 단일쇄 항체 단편 (scFv)을 포괄한다. scFv는 항체 경쇄 가변 영역 (VL)과 작동적으로 연결된 항체 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하는데, 이러한 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역은 함께 또는 개별적으로, IL-1β와 결합하는 결합 부위를 형성한다. scFv는 아미노 말단에 VH 영역을 포함할 수 있고 카복시 말단에 VL 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 한편, scFv는 아미노 말단에 VL 영역을 포함할 수 있고 카복시 말단에 VH 영역을 포함할 수 있다. 더우기, Fv 단편의 두 도메인 VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 코딩되긴 하지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여 이들을 단일 단백질 쇄로 만들 수 있게 해주는 합성 링커에 의해 연결될 수 있는데, 여기서 VL 영역과 VH 영역은 쌍을 형성하여 (단일쇄 Fv (scFv)로서 공지된) 1가 분자를 형성한다 [참고: 예를 들어, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883].
scFv는 임의로, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 폴리펩티드 링커는 일반적으로, 1 내지 50개 아미노산, 또 다른 한편 3 내지 12개 아미노산, 또 다른 한편 2개 아미노산을 포함한다. scFv 중의 중쇄와 경쇄를 연결하기 위한 링커 펩티드의 한 가지 예는 5개 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (서열 37)을 포함한다. 기타 예는 링커를 창출시키기 위한 상기 서열의 하나 이상의 직렬식 반복 서열을 포함한다 [예를 들어, 폴리펩티드는 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (서열 37)의 2개 내지 4개 반복 서열을 포함한다].
본 발명의 IL-1β 결합성 항체 및 단편은 또한, 중쇄 항체 (HCAb)를 포괄한다. 통상적인 항체의 H2L2 구조에 대한 예외는 낙타과 동물 (낙타, 단봉 낙타 및 라마) [참고: Hamers-Casterman et al., 1993 Nature 363: 446; Nguyen et al., 1998 J. Mol. Biol. 275: 413], 우베공 상어 (wobbegong shark) [참고: Nuttall et al., Mol. Immunol. 38:313-26, 2001], 너스 상어 (nurse shark) [참고: Greenberg et al., Nature 374:168-73, 1995; Roux et al., 1998 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95: 11804], 및 반점형 은상어 [참고: Nguyen, et al., "Heavy-chain antibodies in Camelidae; a case of evolutionary innovation," 2002 Immunogenetics 54(1): 39-47]에서 발견된 면역글로불린의 몇몇 이소형에서 일어난다. 이들 항체는 이들 기능적 항체가 중쇄 만의 이량체 ("중쇄 항체" 또는 "HCAb"로서 지칭됨)란 점에서 단지 중쇄 가변 영역 만을 사용하여 항원 결합성 영역을 명백하게 형성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 IL-1β 결합성 항체 및 단편의 몇몇 양태는 IL-1β와 특이적으로 결합하는 중쇄 항체 (HCAb)일 수 있다. 예를 들어, IgG의 한 부류이고 경쇄가 결핍된 중쇄 항체는 낙타, 단봉 낙타 및 라마 [참고: Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993)]를 포함하는 카멜리대 (Camelidae) 속 동물에 의해 생성된다. HCAb는 통상적인 IgG 항체의 약 160 kDa 분자량 대신 약 95 kDa 분자량을 갖는다. 그들의 결합성 도메인은 중쇄 가변 도메인으로만 이루어지는데, 이는 통상적인 VH와 구별하기 위해 종종 VHH로서 지칭된다 [참고: Muyldermans et al., J. Mol. Recognit. 12:131-140 (1999)]. 중쇄 항체의 가변 도메인은 종종 나노보디로서 지칭된다 [참고: Cortez-Retamozo et al., Cancer Research 64:2853-57, 2004]. 나노보디 라이브러리는 문헌 [참고: Conrath et al., Antimicrob Agents Chemother 45: 2807-12, 2001]에 기재된 바와 같이 또는 재조합 방법을 사용하여 면역화 단봉 낙타로부터 생성시킬 수 있다.
제1 불변 영역 (CH1)이 존재하지 않기 때문에 (스플라이스 컨센서스 신호 상실로 인해 mRNA 프로세싱 동안에 스플라이싱 제거됨), 가변 도메인 (VHH) 바로 다음에 힌지 영역, CH2 및 CH3 도메인이 존재한다 [참고: Nguyen et al,, Mol. Immunol. 36:515-524 (1999); Woolven et al., Immunogenetics 50:98-101 (1999)]. 보고된 바에 따르면 낙타과 동물 VHH는 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하고 CH1 도메인이 결여된 IgG2 및 IgG3 불변 영역과 재조합한다 [Hamers-Casterman et al., 상기 참고]. 예를 들어, 라마 IgG1은 VH가 힌지, CH1, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 불변 영역과 재조합하는 통상적인 (H2L2) 항체 이소형인 반면, 라마 IgG2 및 IgG3은 CH1 도메인이 결여되고 경쇄를 포함하지 않는 중쇄 만의 이소형이다.
HCAb에 경쇄가 결여되긴 하지만, 이는 항원 결합성 레퍼토리를 갖고 있다. HCAb의 유전적 발생 기전이 다음 문헌에 고찰되었다 [참고: Nguyen et al. Adv. Immunol 79:261-296 (2001) and Nguyen et al., Immunogenetics 54:39-47 (2002). Sharks, including the nurse shark, display similar antigen receptor-containing single monomeric V-domains. Irving et al., J. Immunol. Methods 248:31-45 (2001); Roux et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:11804 (1998)].
VHH는 소형의 본래 항원 결합성 단편 (예를 들어, 약 15 kDa, 118-136 잔기인 단편)을 포함한다. 낙타과 동물 VHH 도메인은 항원과 고 친화도로 결합하는 것으로 밝혀졌는데 [참고: Desmyter et al., J. Biol. Chem. 276:26285-90, 2001], VHH 친화도는 전형적으로 나노몰 범위이고 Fab 및 scFv 단편의 친화도와 비교 가능하다. VHH는 고도로 가용성이고 scFv 및 Fab 단편의 상응하는 유도체보다 더 안정적이다. VH 단편은 가용성 형태로 생성시키는 것이 비교적 곤란하였지만, 골격 잔기를 보다 VHH와 유사하게 변경시킨 경우에는 용해도와 특이적 결합성 측면에서의 개선을 획득할 수 있다 [참고: 예를 들어, Reichman et al., J Immunol Methods 1999, 231:25-38]. VHH는 L-쇄에 의해 전위될 때까지는 폴딩 및 어셈블리 동안에 내형질 세망 (ER) 내의 H-쇄와 통상적으로 결합하는 BiP (면역글로불린 중쇄 결합성 단백질)과의 장기간 상호 작용을 방지시키고 보다 친수성이 되도록 해주는 아미노산 치환을 수반한다. VHH의 친수성이 증가하였기 때문에, ER로부터의 분비가 개선된다.
기능적 VHH는 재조합 VHH를 생성시키는 면역된 낙타과 동물의 B-세포로부터, 또는 타고난 본래의 또는 합성 라이브러리로부터 VHH 유전자를 직접 클로닝함으로써, 면역된 낙타과 동물의 HCAb를 단백질 분해적 절단시킴으로써 수득할 수 있다. 목적하는 항원 특이성을 지닌 VHH는 파아지 디스플레이 방법론을 통하여 수득할 수도 있다. VHH를 파아지 디스플레이에 사용하는 것은 Fab 또는 scFv와 비교해서 훨씬 더 간단하고 보다 더 효율적인데, 이는 기능적 항원 결합성 단편을 수득하기 위해서는 단지 1개의 도메인 만이 클로닝 및 발현에 필요하기 때문이다 [참고: Muyldermans, Biotechnol. 74:277-302 (2001); Ghahroudi et al., FEBS Lett. 414:521-526 (1997); and van der Linden et al., J. Biotechnol. 80:261-270 (2000)]. 낙타과 동물 중쇄를 갖는 항체를 생성시키는 방법이 또한 미국 특허공개공보 제20050136049호 및 제20050037421호에 기재되어 있다.
리보솜 디스플레이 방법을 사용하여 목적하는 결합 활성과 친화성을 지닌 scFv 및/또는 VHH 분자를 확인 및 분리할 수 있다 [참고: Irving et al., J. Immunol. Methods 248:31-45 (2001)]. 리보솜 디스플레이 및 선별은 대형 라이브러리 (1014)를 생성하고 디스플레이할 수 있는 잠재력을 지니고 있다.
기타 양태는 비-카멜리대 VH, 예를 들어 인간 VHH를 변형시켜 그들의 용해도를 개선시키고 비-특이적 결합을 방지시킴으로써, 카멜화 공정을 통하여 생성된 VHH-유사 분자를 제공한다. 이는 VH의 VL 측면 상의 잔기를 VHH-유사 잔기로 대체시켜 보다 가용성인 VHH 단편을 모방함으로써 달성된다. 카멜화 VH 단편, 특히 인간 골격에 기초한 단편은 환자에게 생체내 투여되는 경우에 상당히 저하된 면역 반응을 나타내는 것으로 예상되므로, 치료적 적용에 상당히 유리한 것으로 예상된다 [참고: Davies et al., FEBS Lett. 339:285-290 (1994); Davies et al., Protein Eng. 9:531-537 (1996); Tanha et al, J. Biol. Chem. 276:24774-24780 (2001); and Riechmann et al., Immunol. Methods 231:25-38 (1999)].
광범위한 발현 벡터가 Fab 단편, scFv, 및 VHH를 포함한 IL-1β 단편을 생성시키는데 이용 가능하다. 예를 들어, 원핵성 기원과 진핵성 기원 둘 다의 발현 시스템을 항체 단편 및 항체 융합 단백질의 대규모 생성에 사용할 수 있다. 다량의 항체 단편을 배양 배지 내로 분비시켜 주는 발현 시스템이 특히 유리하다.
이중-특이적 Fab-scFv ("바이보디") 및 삼중-특이적 Fab-(scFv)(2) ("트리보디")의 생성 방법이 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Schoonjans et al. (J Immunol 165:7050-57, 2000) and Willems et al. (J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 786:161-76, 2003)]. 바이보디 또는 트리보디의 경우에는, scFv 분자를 VL-CL (L) 및 VH-CH1 (Fd) 쇄 중의 하나 또는 둘 다와 융합시켜, 예를 들어 2개의 scFv를 Fab의 C-말단과 융합시킨 트리보디를 생성시키는 반면, 바이보디에서는 1개의 scFv를 Fab의 C-말단과 융합시킨다. 펩티이드 링커 (힌지 없음)를 통하여 또는 IgG 힌지를 통하여 CH3과 융합시킨 scFv로 이루어진 "미니보디"가 다음 문헌에 보고되었다 [참고: Olafsen, et al., Protein Eng Des Sel. 2004 Apr;17(4):315-23].
인트라보디는 세포내 발현을 입증해주고 세포내 단백질 기능을 조작할 수 있는 단일쇄 항체이다 [참고: Biocca, et al., EMBO J. 9:101-108, 1990; Colby et al., Proc Natl Acad Sci USA. 101:17616-21, 2004]. 세포내 영역에 항체 구조물을 보유하고 있는 세포 신호 서열을 포함하는 인트라보디는 다음 문헌에 기재된 바와 같이 생성시킬 수 있다 [참고: Mhashilkar et al., EMBO J 14: 1542-51, 1995 and Wheeler et al., FASEB J. 17:1733-5. 2003]. 트랜스보디 (transbody)는 단백질 형질도입 도메인 (PTD)을 단일쇄 가변 단편 (scFv) 항체와 융합시킨 세포-투과성 항체이다 [참고: Heng et al., Med Hypotheses. 64:1105-8, 2005].
본 발명의 IL-1β 결합성 항체 및 단편은 또한, 표적 단백질에 대해 특이적인 SMIP 또는 결합성 도메인 면역글로불린 융합 단백질인 항체를 포괄한다. 이들 구조물은 항체 효과기 기능을 수행하는데 필요한 면역글로불린 도메인과 융합된 항원 결합성 도메인을 포함하는 단일쇄 폴리펩티드이다 [참고: 예를 들어, WO 03/041600, 미국 특허공개공보 제20030133939호 및 미국 특허공개공보 제20030118592호].
본 발명의 IL-1β 결합성 항체 및 단편은 또한, 면역부착인자를 포괄한다. 하나 이상의 CDR을 특정 분자 내로 공유적 또는 비공유적으로 혼입하여 이를 면역부착인자로 만들 수 있다. 면역부착인자는 보다 큰 폴리펩티드 쇄의 일부로서 CDR을 혼입시킬 수 있거나, CDR을 또 다른 폴리펩티드 쇄에 공유적으로 연결시킬 수 있거나, 또는 CDR을 비공유적으로 혼입시킬 수 있다. 본원에 기재된 CDR은 면역부착인자가 IL-1β와 특이적으로 결합할 수 있게 해준다.
본 발명의 IL-1β 결합성 항체 및 단편은 또한, 유기 또는 분자상 스캐폴드 (예를 들어, 단백질 또는 탄수화물 스캐폴드) 상에 구축된 하나 이상의 IL-1β 결합성 부분을 포함하는 항체 모의체를 포괄한다. 단백질 스캐폴드로서 통상 지칭된 비교적 한정된 3차원 구조를 갖는 단백질을 항체 모의체 설계용 시약으로서 사용할 수 있다. 이들 스캐폴드는 전형적으로, 특이적 또는 무작위 서열 변이가 적용될 수 있는 하나 이상의 영역을 포함하고, 이러한 서열 무작위화는 목적 생성물을 선별할 수 있는 단백질 라이브러리를 생성시키기 위해 종종 수행된다. 예를 들어, 항체 모의체는 모 항체에 의해 결합된 리간드를 향한 선택적 결합 활성을 나타내고 각 루프 내로 삽입된 모 항체와 상이한 CDR을 포함하는 2개 이상의 용매 노출된 루프를 갖는 스캐폴드를 포함하는 면역글로불린-유사 도메인을 갖는 키메라 비-면역글로불린 결합성 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 신규한 결합 특성을 지닌 단백질을 수득하기 위한 비-면역글로불린 단백질 스캐폴드가 제안되었다 [참고: Tramontano et al., J. Mol. Recognit. 7:9, 1994; McConnell and Hoess, J. Mol. Biol. 250:460, 1995]. 기타 단백질이 골격으로서 시험되었고 이를 사용하여 알파 나선 표면 상의 무작위화 잔기 [참고: Nord et al., Nat. Biotechnol. 15:772, 1997; Nord et al., Protein Eng. 8:601, 1995], 알파 나선 다발 중의 알파 나선들 간의 루프 [참고: Ku and Schultz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6552, 1995], 및 디설파이드 브릿지에 의해 제한된 루프, 예를 들어 소형 프로테아제 억제제의 루프 [참고: Markland et al., Biochemistry 35:8045, 1996; Markland et al., Biochemistry 35:8058, 1996; Rottgen and Collins, Gene 164:243, 1995; Wang et al., J. Biol. Chem. 270:12250, 1995]를 디스플레이하였다. 항체 모의체용 스캐폴드를 이용하는 방법이 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: 미국 특허 제5,770,380호, 및 미국 특허공개공보 제2004/0171116호, 제2004/0266993호 및 제2005/0038229호].
따라서, 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 1개, 2개 및/또는 3개의 CDR (바람직하게는, 서열 1-26의 하나 이상의 CDR)을 포함하는 각종 IL-1β 결합성 항체 및 단편을 생성시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 항체 또는 단편은 (i) 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 결정된 바와 같이, 약 0.5 nM 이하 (예를 들어, 약 0.4 이하, 약 0.3 이하, 또는 심지어 약 0.2 이하)의 IC50으로 IL-1β와 결합하고/하거나, (ii) IL-1α와의 결합과 비교해서 약 100배 이상 (예를 들어, 약 150배 이상, 약 200배 이상, 또는 심지어 약 250배 이상) 더 큰 친화도로 IL-1β와 결합하고/하거나 [즉, IL-1β에 대한 선택도가 IL-1α에 비해 약 100배 이상 (예를 들어, 약 150배 이상, 약 200배 이상, 또는 심지어 약 250배 이상) 더 크다], (iii) IL-1β에 대한 평형 결합 해리 상수 (KD) 약 20 pM 이하 (예를 들어, 약 15 pM 이하, 약 10 pM 이하, 또는 심지어 약 5 pM 이하)로 IL-1β와 결합한다. 본 발명의 항체 또는 단편을 투여하지 않은 IL-1β 자극된 동물에게서의 혈청 IL-6의 수준과 비교해서 동물 중에서의 IL-1β 유도된 혈청 IL-6 발현을 50% 이상 (예를 들어, 60% 이상, 70% 이상, 또는 심지어 80% 이상) 억제할 수 있는 본 발명의 항체 또는 단편이 또한 바람직하다. 따라서, 본 발명은 관련 양태에서, 전술된 특징들 중의 한 가지 이상을 지닌 IL-1β 결합성 항체 또는 IL-1β 결합성 항체 단편을 제공한다.
본 발명이 IL-1β 결합성 항체 및 그의 단편 (예를 들어, 경쇄 및 중쇄를 포함한다)과 관련하여 본원에 기재되었지만, 본 발명은 또한 IL-1β 결합성 항체 또는 항체 단편 이외의 폴리펩티드, 예를 들어 단일쇄 폴리펩티드 (융합 폴리펩티드, 키메라 폴리펩티드, 접합체 등을 포함함)를 제공한다. 따라서, 본 발명은 이와 관련하여, 서열 1-26 중의 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 그의 기능적 등가 단편 또는 변이체를 제공한다. 본 발명은 또한, 서열 27-35 또는 42-57 중의 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 그의 기능적 등가 단편 또는 변이체를 제공한다.
본원에 기재된 항체 및 항체 단편은 적합한 어떠한 방법에 의해서도 제조할 수 있다. 이러한 항체 및 항체 단편을 제조하는데 적합한 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 항체 및 항체 단편을 제조하는 기타 방법은 본 발명의 일부로서 본원에 기재된 바와 같다. 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 항체, 항체 단편, 또는 폴리펩티드는 어떠한 정도로도 분리 또는 정제할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 분리된 화합물은 그의 천연 환경으로부터 제거시킨 화합물이다. 정제된 화합물은 순도를 증가시킨 화합물이기 때문에, 이러한 화합물은 (i) 그의 천연 환경에 존재하는 경우보다 더 순수하거나 또는 (ii) 실험실 조건 하에 초기 합성 및/또는 증폭시킨 경우 더 순수한 형태로 존재하는데, "순도"는 상대적 용어이고 반드시 "절대 순도"를 의미하지는 않는다.
전술된 본 발명의 항체, 항체 단편 또는 폴리펩티드 모두는 본원에 기재된 바와 같이 인간화, 또는 인간 유전자조작할 수 있다.
IL-1β 항체 또는 단편의 제조 방법
본 발명은 (a) 서열 1 내지 26 중의 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 IL-1β 결합성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 핵산과, 1개 이상의 뉴클레오티드가 제1 핵산 서열과는 상이한 핵산 서열을 포함하는 제2 핵산을 제공하는 단계; (b) 핵산 셔플링을 수행하여 2개 이상의 돌연변이된 핵산을 제공하는 단계; (c) (i) 제1 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드보다 더 큰 친화도로 IL-1β과 결합하거나, (ii) IL-1α에 비해 IL-1β에 대한 선택도가, 제1 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드보다 더 크거나, (iii) IL-1β에 대한 평형 결합 해리 상수 (KD)가 제1 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드보다 더 낮거나 또는 (iv) 제1 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드보다 더 큰 정도로, 동물에서 IL-1β 유도된 혈청 IL-6 발현을 억제하는 폴리펩티드를 코딩하는 돌연변이된 핵산을 선별하는 단계; 및 (d) 이와 같이 선별된 돌연변이된 핵산을 발현시켜 친화성 성숙된 IL-1β 폴리펩티드를 제공하는 단계를 포함하는, 친화성 성숙된 IL-1β 결합성 폴리펩티드, 예를 들어 항체 또는 항체 단편 [이에는 항체 영역, 예를 들어 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 또는 그의 모든 일부 (예: CDR)가 포함된다]의 제조 방법을 제공한다. 바람직하게, 상기 폴리펩티드는 항체 또는 항체 단편, 예를 들어 본 발명의 일부로서 본원에 기재된 항체 또는 항체 단편이다.
친화성 성숙된 IL-1β 폴리펩티드의 제조 방법은 임의로, 단계 (b)와 (c)를 1회 이상 반복하는 것을 추가로 포함하는데, 단계 (b)의 핵산 셔플링은 (i) 단계 (c)의 하나 이상의 선별된 돌연변이된 핵산을 사용하고 (ii) 1개 이상의 뉴클레오티드가 상기 선별된 돌연변이된 핵산과 상이한 핵산 서열을 갖는 하나 이상의 핵산을 사용하여 수행한다. 바람직하게, 단계 (b)와 (c)는 최적화 핵산이 선별될 때까지 반복한다. 최적화 핵산은 기존에 선별된 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드에 비해 탁월한 IL-1β와 관련된 결합 특징 [예를 들어, 단계 (c)의 특징 (i)-(iv)]을 지닌 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 선별하는 것이 더 이상 가능하지 않은 경우에 선별된다.
바람직하게는, 다음 특성들 중의 한 가지 이상을 지닌 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 선별될 때까지 단계 (b)와 (c)를 반복한다: (i) 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 결정된 바와 같이, 약 0.5 nM 이하 (예를 들어, 약 0.4 이하, 약 0.3 이하, 또는 심지어 약 0.2 이하)의 IC50으로 IL-1β와 결합하는 특성, (ii) IL-1α와의 결합과 비교해서 약 100배 이상 (예를 들어, 약 150배 이상, 약 200배 이상, 또는 심지어 약 250배 이상) 더 큰 친화도로 IL-1β와 결합하는 특성 [즉, IL-1β에 대한 선택도가 IL-1α에 비해 약 100배 이상 (예를 들어, 약 150배 이상, 약 200배 이상, 또는 심지어 약 250배 이상) 더 크다], (iii) IL-1β에 대한 평형 결합 해리 상수 (KD) 약 20 pM 이하 (예를 들어, 약 15 pM 이하, 약 10 pM 이하, 약 5 pM 이하, 약 3 pM 이하, 2 pM 이하, 1 pM 이하, 0.7 pM 이하, 0.5 pM 이하, 0.3 pM 이하, 또는 0.2 pM 이하)로 IL-1β와 결합하는 특성, (iv) 본 발명의 항체 또는 단편을 투여하지 않은 IL-1β 자극된 동물에게서의 혈청 IL-6의 수준과 비교해서 동물 중에서의 IL-1β 유도된 혈청 IL-6 발현을 50% 이상 (예를 들어, 60% 이상, 70% 이상, 또는 심지어 80% 이상) 억제시키는 특성.
목적하는 특성을 지닌 폴리펩티드를 코딩하는 돌연변이된 핵산에 대해 선별하는 것은 적합한 모든 방법에 의해 수행할 수 있다. 코딩된 폴리펩티드를 발현하는 과정, 및 결합 친화도, 결합 선택도, 평형 결합 상수, 및 IL-1β 유도된 IL-6 발현의 억제를 알아보기 위해 폴리펩티드를 검정하는 과정은 본원에 기재되어 있다 (실시예 참고). 기타 적합한 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 단계 (b)에 의해 제공된 돌연변이된 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드가 항체 또는 완전한 항체 단편 (예: Fab)이 아닌 경우에는, 해당 폴리펩티드가 선별 기준을 충족시키는지를 결정하기 위해 이러한 폴리펩티드를 포함하는 항체를 제공하는 것이 필요할 수 있다. 따라서, 친화성 성숙된 IL-1β 폴리펩티드를 제조하는 방법은 돌연변이된 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드를 포함하는 항체를 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있는데, 목적하는 특성을 지닌 폴리펩티드를 코딩하는 돌연변이된 핵산을 선별하는 단계는 항체를 검정함으로써 수행한다.
본원에 사용된 바와 같은 핵산 셔플링은 2개 이상의 핵산 서열을 단편화하여 무작위 핵산 단편 풀을 제공하고, 이들 단편을 재어셈블링하여 2개 이상의 돌연변이된 핵산을 창출시키는 것을 의미한다. 이와 관련하여, 돌연변이된 핵산은 단지, 변화시킨 핵산 서열을 갖는 핵산일 뿐이다. 핵산 셔플링은 적합한 모든 방법에 의해 수행할 수 있다. 적합한 많은 방법이 당해 분야에 공지되어 있는데, 예를 들어 미국 특허 제6,489,145호; 제6,773,900호; 제6,764,835호; 제6,740,506호; 제6,713,282호; 제6,713,281호; 제6,713,279호; 제6,709,841호; 제6,696,275호; 제6,677,115호; 제6,673,552호; 제6,656,677호; 제6,605,449호; 제6,566,050호; 제6,562,594호: 제6,555,315호; 제6,537,776호; 제6,528,249호; 제6,479,258호; 제6,455,254호; 제6,440,668호; 제6,368,798호; 제6,361,974호; 제6,358,709호; 제6,352,842호; 제6,344,328호; 제6,335,179호; 제6,280,926호; 제6,238,884호; 제6,174,673호; 제6,171,820호; 제6,168,919호; 제6,057,103호; 제6,054,267호; 제6,030,779호; 제6,001,574호; 제5,965,408호; 제5,958,672호; 제5,939,250호; 제5,763,239호; 제6,395,547호; 제6,376,246호; 제6,372,497호; 제6,368,861호; 제6,365,408호; 제6,365,377호; 제6,358,740호; 제6,358,742호; 제6,355,484호; 제6,344,356호; 제6,337,186호; 제6,335,160호; 제6,323,030호; 제6,319,714호; 제6,319,713호; 제6,303,344호; 제6,297,053호; 제6,291,242호; 제6,287,861호; 제6,277,638호; 제6,180,406호; 제6,165,793호; 제6,132,970호; 제6,117,679호; 제5,834,252호; 제5,830,721호; 제5,811,238호; 제5,605,793호에 기재되어 있다.
핵산
본 발명의 항체, 항체 단편 및 폴리펩티드는 단일 핵산 (예를 들어, 항체의 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일 핵산)에 의해 코딩되거나, 또는 2개 이상의 별개의 핵산 (이들 각각은 항체 또는 항체 단편의 상이한 일부를 코딩한다)에 의해 코딩될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명은 전술된 항체, 항체 단편 또는 폴리펩티드 (예를 들어, 전술된 경쇄 또는 중쇄 가변 영역) 중의 어느 것을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 제공한다.
본 발명의 한 국면에 따르면, 본 발명은 항체 또는 그의 일부의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산을 제공한다. 예시되는 핵산 서열은 서열 39 및 40에 제공되는데, 이들 각각은 서열 15의 중쇄 가변 영역, 및 서열 11의 경쇄 가변 영역을 코딩한다. 이와 관련하여, 본 발명은 서열 2의 아미노산 서열, 또 다른 한편 서여 28의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 (예를 들어, 항체의 중쇄 가변 영역)을 코딩하고, 바람직하게는 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 (예를 들어, 서열 4-8의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드)를 코딩하는 핵산을 제공한다. 서열 12 또는 서열 13의 아미노산 서열 (예를 들어, 서열 14-15의 아미노산 서열)을 포함하거나, 또는 서열 23 또는 서열 24의 아미노산 서열 (예를 들어, 서열 25 또는 서열 26의 아미노산 서열)을 포함하는 폴리펩티드 (예를 들어, 중쇄 가변 영역)를 코딩하는 핵산 서열이 보다 바람직하다.
또 다른 한편, 또는 또한, 본 발명의 핵산은 항체 또는 그의 일부의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명은 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 (예를 들어, 경쇄 가변 영역)를 코딩하는 핵산을 제공한다. 예를 들어, 이러한 핵산 서열은 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 핵산은 서열 10 또는 11의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 (예를 들어, 경쇄 가변 영역)을 코딩한다.
또한 본 발명에 포괄되는 것은 본 발명의 항체 및 항체 단편과 관련하여 논의된 바와 같은 하나 이상의 보존적 치환 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 보존적 치환)을 포함하는 경쇄 또는 중쇄의 전술된 아미노산 서열 중의 어느 것을 코딩하는 핵산인데, 상기 치환을 포함하는 항체 또는 단편은 본원에 기재된 예시 항체, 단편 및 서열 중의 하나 이상과 동일하거나 실질적으로 동일한 친화성과 에피토프 결합 특이성을 지니고 있다.
핵산 서열은 본원에 기재된 항체, 항체 단편, 및 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열로부터 적합한 모든 방법에 의해, 예를 들어 이들 아미노산 서열을 유전자 암호를 이용하여 상응하는 핵산 서열로 전환시킴으로써 결정할 수 있다. 이들 아미노산 서열 (예를 들어, 본원에 기재된 아미노산 서열)을 코딩하는 핵산은 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들어 문헌 [참고: Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratoiy Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, NY, 1994; and Herdewijn, ed., Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications (Methods in Molecular Biology), Humana Press, Totowa, NJ, 2004]에 기재된 방법을 사용하여 제조할 수 있다 (예를 들어, 핵산 서열을 분리 또는 합성하였다). 본원에 기재된 핵산은 어떠한 정도로도 분리 또는 정제할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 분리된 화합물은 그의 천연 환경으로부터 제거시킨 화합물이다. 정제된 화합물은 순도를 증가시킨 화합물이기 때문에, 이러한 화합물은 (i) 그의 천연 환경에 존재하는 경우보다 더 순수하거나 또는 (ii) 실험실 조건 하에 초기 합성 및/또는 증폭시킨 경우 더 순수한 형태로 존재하는데, "순도"는 상대적 용어이고 반드시 "절대 순도"를 의미하지는 않는다.
본 발명의 핵산은 분취 겔 전기영동 또는 등전점 전기영동, 친화, 면역친화 또는 이온 교환 크로마토그래피, 분자 체 크로마토그래피, 크로마토분획, 또는 고압 액체 크로마토그래피를 포함하지만 이에 제한되지 않는 각종 기술을 이용하여 정제할 수 있다.
벡터
본원에 기재된 핵산을 벡터, 예를 들어 핵산 발현 벡터 및/또는 표적화 벡터 내로 삽입할 수 있다. 이러한 벡터는, 예를 들어 IL-1β 결합성 항체 또는 항체 단편을 특정 세포 또는 트랜스제닉 동물에게서 발현하기 위한 각종 방식에 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 핵산 중의 어느 하나 이상을 포함하는 벡터를 제공한다. "벡터"는 코딩된 폴리펩티드의 합성이 일어날 수 있는 적합한 숙주 세포 내로 핵산 서열을 운반할 수 있는 능력을 지닌 모든 분자 또는 조성물이다. 전형적으로 및 바람직하게, 벡터는 목적하는 핵산 서열 (예를 들어, 본 발명의 핵산)을 혼입시키는 것으로 당해 분야에 공지되어 있는 재조합 DNA 기술을 사용하여 유전자조작한 핵산이다. 바람직하게, 벡터는 DNA로 구성된다. 적합한 DNA-이용 유전자 전이 벡터에는 플라스미드 및 바이러스성 벡터가 포함된다. 적합한 바이러스성 벡터에는, 예를 들어 파보바이러스-이용 벡터 [예: 아데노 관련 바이러스 (AAV)-이용 벡터], 레트로바이러스성 벡터, 단순 포진 바이러스 (HSV)-이용 벡터, AAV-아데노바이러스성 키메라 벡터, HIV 바이러스-이용 벡터, 및 아데노바이러스-이용 벡터가 포함된다. 이들 벡터 모두는, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., 상기 참고, 및 Ausubel et al., 상기 참고]에 기재된 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 그러나, 핵산에 기초하지 않은 벡터, 예를 들어 리포솜 또한 당해 분야에 공지되어 있고 본 발명과 연계해서 사용할 수 있다. 본 발명의 벡터는 단일 유형의 핵산 (예: 플라스미드) 또는 비-핵산 분자 (예: 지질 또는 중합체)에 기초할 수 있다. 또 다른 한편, 벡터는 핵산과 비-핵산의 조합물 (즉, "키메라" 벡터)일 수 있다. 예를 들어, 핵산을 정착시킨 플라스미드는 전달 비히클로서 지질 또는 중합체를 이용하여 제형화할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "플라스미드-지질 복합체" 및 "플라스미드-중합체" 복합체로서 각각 지칭된다. 본 발명의 유전자 전이 벡터는 숙주 세포 게놈 내로 통합시킬 수 있거나 숙주 세포 내에 에피솜 형태로 존재할 수 있다.
본 발명의 핵산은 면역글로불린 발현 벡터, 예를 들어 문헌 [참고: McLean et al., Mol. Immunol., 37: 837-45 (2000); Walls et al., Nucleic Acids Res., 21: 2921-9 (1993); and Norderhaug et al., J. Immunol. Meth., 204: 77-87 (1997)]에 기재된 벡터 내로 삽입할 수 있다.
벡터는 전형적으로, 이러한 벡터가 사용될 숙주 세포에서 기능적이도록 선택한다 (이 벡터는 숙주 세포 기구와 화합성이어서 유전자의 증폭 및/또는 유전자의 발현이 일어날 수 있다). IL-1β 결합성 항체 또는 단편을 코딩하는 핵산 분자는 원핵성, 효모, 곤충 (바쿨로바이러스 시스템) 및/또는 진핵성 숙주 세포에서 증폭/발현시킬 수 있다. 숙주 세포의 선별은 부분적으로, IL-1β 결합성 항체 또는 단편이 전이 후에 변형 (예를 들어, 당화 및/또는 인산화)되어야만 하는지에 따라서 결정될 것이다. 그렇다면, 효모, 곤충 또는 포유류 숙주 세포가 바람직하다. 발현 벡터에 관한 추가 정보는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Meth. Enz. v. 185 (1990; Goeddel, ed.), Academic Press Inc., San Diego, Calif].
발현 벡터는 전형적으로, 다음 성분들 중의 하나 이상을 포함한다: 프로모터, 하나 이상의 증강인자 서열, 복제 기점, 전사 종결 서열, 공여자 및 수용자 스플라이스 부위를 포함하는 완전한 인트론 서열, 분비를 위한 리더 서열, 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 서열, 발현시키고자 하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 삽입하기 위한 폴리링커 영역, 및 선별성 마커 요소.
벡터 성분은 정상적으로 면역글로불린 발현을 조절하는 기능을 하는 상동성 (숙주 세포와 동일한 종 및/또는 균주로부터 유래함), 이종 (숙주 세포 종 또는 균주 이외의 종으로부터 유래함), 하이브리드 (한 가지 이상 공급원으로부터의 상이한 서열 조합물), 합성 또는 본래 서열일 수 있다. 벡터 성분의 공급원은 모든 원핵성 또는 진핵성 유기체, 모든 척추동물 또는 무척추동물 유기체, 또는 모든 식물일 수 있는데, 단 이들 성분은 숙주 세포 기구에서 기능적이고 숙주 세포 기구에 의해 활성화될 수 있어야 한다.
복제 기점은 발현을 위해 사용되는 숙주 세포의 유형에 기초하여 선별한다. 예를 들어, 플라스미드 pBR322 (제품 번호 303-3s, 공급처: New England Biolabs, Beverly, Mass.)로부터의 복제 기점은 대부분의 그람-음성 세균에 유용하지만, SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, 수포성 구내염 (vesicular stomatitis) 바이러스 (VSV) 또는 유두종 바이러스 (예: HPV 또는 BPV)는 포유류 세포에서 벡터를 클로닝하는데 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 성분이 반드시 포유류 발현 벡터에 필요하지 않는다 (예를 들어, SV40 기점이 종종 사용되는데, 이는 초기 프로모터를 포함하기 때문이다).
전사 종결 서열은 전형적으로, 폴리펩티드 코딩 영역 말단의 3'에 위치하고 전사를 종결시키는 역할을 한다. 원핵성 세포 중의 전사 종결 서열은 종종, G-C 풍부 단편에 이어 폴리 T 서열을 포함한다. 전사 종결 서열은 벡터의 일부로서 상업적으로 구입한 라이브러리로부터 클로닝할 수 있거나, 또는 상기 언급된 바와 같은 핵산 합성 방법을 사용하여 합성할 수 있다.
선별성 마커 유전자 요소는 선택적 배양 배지에서 성장시킨 숙주 세포의 생존과 성장에 필요한 단백질을 코딩한다. 전형적인 선별 마커 유전자는 (a) 원핵성 숙주 세포에 대해 항생제 또는 기타 독소, 예를 들어 앰피실린, 테트라사이클린 또는 카나마이신에 대한 내성을 부여해 주거나, (b) 세포의 영양요구 결핍성을 보충해 주거나 또는 (c) 복합 배지로부터는 입수 가능하지 않은 중요한 영양분을 공급해 주는 단백질을 코딩한다. 바람직한 선별성 마커는 카나마이신 내성 유전자, 앰피실린 내성 유전자, 및 테트라사이클린 내성 유전자이다. 네오마이신 내성 유전자는 원핵성 및 진핵성 숙주 세포에서 선별을 위해 사용할 수도 있다.
기타 선별 유전자를 사용하여 발현하게될 유전자를 증폭시킬 수도 있다. 증폭은 성장에 있어 중요한 단백질을 생성시키는데 더 많이 요구되는 유전자를 재조합 세포의 다음 세대 염색체 내에 직렬식으로 반복시키는 공정이다. 포유류 세포용 선별성 마커의 예에는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 및 티미딘 키나제가 포함된다. 포유류 세포 형질전환체는 이러한 형질전환체 만이 해당 벡터 내에 존재하는 마커를 통하여 생존하도록 독특하게 적응시킨 선별 압력 하에 놓아 둔다. 선별 압력은 배지 중의 선별제 농도가 계속적으로 변화되는 조건 하에 형질전환된 세포를 배양함으로써, IL-1β 항체 또는 단편을 코딩하는 DNA와 선별 유전자 둘 다를 증폭시킴으로써 부가한다. 그 결과, 상기와 같이 증폭된 DNA로부터 증가 량의 항체를 합성한다.
리보솜 결합 부위는 일반적으로, mRNA 해독을 개시하기 위해 존재한다. 예를 들어, 이러한 부위는 샤인-달가르노 (Shine-Dalgarno) 서열 (원핵 생물) 또는 코작 (Kozak) 서열 (진핵 생물)을 특징으로 한다. 상기 요소는 전형적으로, 발현시키고자 하는 폴리펩티드의 코딩 서열에 대해 5' 및 프로모터에 대해 3'에 위치한다. 샤인-달가르노 서열은 변화되지만, 전형적으로 폴리퓨린 (고 함량의 A-G를 갖는다)이다. 수 많은 샤인-달가르노 서열을 확인하였는데, 이들 각각은 상기 제시된 방법을 사용하여 용이하게 합성할 수 있고 원핵성 벡터에 사용할 수 있다.
리더, 또는 신호 서열을 사용하여 폴리펩티드의 분비를 지시할 수 있다. 신호 서열은 폴리펩티드 코딩 영역의 5' 말단 내에 위치하거나 5' 말단에 직접 위치할 수 있다. 많은 신호 서열이 확인되었으며, 이는 발현을 위해 사용된 숙주 세포에 기초하여 선별할 수 있다. 신호 서열은 발현될 단백질 (예를 들어, 항체 또는 항원 결합성 단편)을 코딩하는 핵산 서열에 대해 상동성 (천연 발생적) 또는 이종일 수 있다. 선별된 이종 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱 (신호 펩티다제에 의해 절단됨)되는 것이어야 한다. 본래의 항체 신호 서열을 인식 및 프로세싱하지 않는 원핵성 숙주 세포의 경우에는, 신호 서열을 예를 들어, 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제 또는 열 안정한 엔테로톡신 II 리더 군 중에서 선택된 원핵성 신호 서열에 의해 치환시킨다. 효모 분비를 위해서는, 본래의 항체 신호 서열을 효모 전화효소, 알파 인자, 또는 산 포스파타제 리더에 의해 치환시킬 수 있다. 포유류 세포 발현에서는 본래의 신호 서열이 일반적으로 만족할 만하지만, 기타 포유류 신호 서열도 적합할 수 있다.
대부분의 경우, 항체 또는 항원 결합성 단편이 숙주 세포로부터 분비되면 신호 펩티드가 이러한 항체 또는 단편으로부터 제거될 것이다. 따라서, 성숙한 항체 또는 단편에는 모든 리더 또는 신호 서열이 결여될 것이다.
몇몇 경우, 예를 들어 당화가 진핵성 숙주 세포 발현 시스템에 요망되는 경우에는, 당화 또는 수율을 개선시키기 위해 각종 프리서열을 조작할 수 있다. 예를 들어, 신호 펩티드의 펩티다제 절단 부위를 변경시키거나 또는 당화에 영향을 미칠 수도 있는 프로서열을 부가할 수 있다. 최종 항체 또는 단편은 (성숙한 단백질의 제1 아미노산과 비교해서) -1 위치에, 완전히 제거되지 않을 수도 있었던 발현되기 쉬운 하나 이상의 부가 아미노산을 가질 수 있다. 예를 들어, 최종 항체 또는 단편은 N-말단에 부착된, 펩티다제 절단 부위에 발견된 1개 또는 2개의 아미노산을 가질 수 있다. 또 다른 한편, 효소가 성숙한 항체 또는 단편 내의 해당 부위를 절단하는 경우에, 이러한 몇몇 효소 절단 부위를 사용하면 약간 절단된 형태의 목적 항체 또는 단편이 생성될 수 있다.
발현 벡터는 전형적으로, 숙주 유기체에 의해 인식되고 IL-1β 결합성 항체 또는 항원 결합성 단편을 코딩하는 핵산 분자와 작동적으로 연결되는 프로모터를 포함할 것이다. 목적하는 수율과 발현을 위해 사용된 숙주 세포에 따라서 본래 프로모터를 사용하거나 이종 프로모터를 사용할 수 있다.
원핵성 숙주와 함께 사용하기 위한 프로모터에는 베타-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템; 알칼리성 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템; 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 프로모터가 포함된다. 공지된 기타 세균성 프로모터도 또한 적합하다. 이들의 서열은 공개되었고, 제한 부위를 공급하기 위해 경우에 따라 링커 또는 적응인자를 사용하여 이들 서열을 목적하는 핵산 서열(들)에 연결시킬 수 있다.
효모 숙주와 함께 사용하기 위한 프로모터가 또한 당해 분야에 공지되어 있다. 효모 증강인자를 효모 프로모터와 함께 사용하는 것이 유리하다. 포유류 숙주 세포와 함께 사용하는데 적합한 프로모터는 널리 공지되어 있고, 이에는 폴리오마 바이러스, 조류폭스 (fowlpox) 바이러스, 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 및 보다 바람직하게 원숭이 바이러스 40 (SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터 수득된 것이 포함된다. 기타 적합한 포유류 프로모터에는 이종 포유류 프로모터, 예를 들어 열-쇼크 프로모터 및 악틴 프로모터가 포함된다.
본 발명의 선택적 결합제를 발현하기 위해 사용될 수 있는 부가의 프로모터에는 다음이 포함되지만 그에 제한되지 않는다: SV40 초기 프로모터 영역 [참고: Bernoist and Chambon, Nature, 290:304-310, 1981]; CMV 프로모터; 라우스 (Rous) 육종 바이러스의 3' 장 말단 반복 서열 내에 포함된 프로모터 [참고: Yamamoto et al. (1980), Cell 22: 787-97]; 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터 [참고: Wagner et al. (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1444-5]; 메탈로티오닌 유전자의 조절성 서열 [참고: Brinster et al, Nature, 296; 39-42, 1982]; 원핵성 발현 벡터, 예를 들어 베타-락타마제 프로모터 [참고: Villa-Kamaroff, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75; 3727-3731, 1978]; 또는 tac 프로모터 [참고: DeBoer, et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 21-5]. 또한 관심있는 것은 조직 특이성을 나타내고 트랜스제닉 동물에게서 활용되어 온 다음 동물 전사 제어 영역이다: 췌장 선방 세포에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 제어 영역 [참고: Swift et al. (1984), Cell 38: 639-46; Ornitz et al. (1986), Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald (1987), Hepatology 7: 425-515]; 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 제어 영역 [참고: Hanahan (1985), Nature 315: 115-22]; 림프계 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 제어 영역 [참고: Grosschedl et al. (1984), Cell 38; 647-58; Adames et al. (1985), Nature 318; 533-8; Alexander et al. (1987), Mol. Cell. Biol. 7: 1436-44]; 고환, 유방, 림프계 및 비만 세포에서 활성인 마우스 유방 종양 바이러스 제어 영역 [참고: Leder et al. (1986), Cell 45: 485-95], 간에서 활성인 알부민 유전자 제어 영역 [참고: Pinkert et al. (1987), Genes and Devel. 1: 268-76]; 간에서 활성인 알파페토프로테인 유전자 제어 영역 [참고: Krumlauf et al. (1985), Mol. Cell. Biol. 5: 1639-48; Hammer et al. (1987), Science, 235: 53-8]; 간에서 활성인 알파 1-항트립신 유전자 제어 영역 [참고: Kelsey et al. (1987), Genes and Devel. 1: 161-71]; 골수 세포에서 활성인 베타-글로빈 유전자 제어 영역 [참고: Mogram et al., Nature, 315 338-340, 1985; Kollias et al. (1986), Cell 46: 89-94]; 뇌 중의 희돌기아교세포에서 활성인 미엘린 염기성 단백질 유전자 제어 영역 [참고: Readhead et al. (1987), Cell, 48: 703-12]; 골격근에서 활성인 마이오신 경쇄-2 유전자 제어 영역 [참고: Sani (1985), Nature, 314: 283-6]; 및 시상하부에서 활성인 성선자극 방출 호르몬 유전자 제어 영역 [참고: Mason et al. (1986), Science 234: 1372-8].
증강인자 서열을 벡터 내로 삽입하여 진핵성 숙주 세포 내에서의 전사를 증가시킬 수 있다. 포유류 유전자로부터 입수 가능한 몇 가지 증강인자 서열 (예를 들어, 글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파-페토-프로테인 및 인슐린)이 공지되어 있다. 그러나 전형적으로, 바이러스로부터의 증강인자를 사용할 것이다. SV40 증강인자, 시토메갈로바이러스 초기 프로모터 증강인자, 폴리오마 증강인자, 및 아데노바이러스 증강인자가 진핵성 프로모터를 활성화시키는 것으로 예시되는 증강성 요소이다.
증강인자를 폴리펩티드 코딩 영역의 위치 5' 또는 3'에서 벡터 내로 스플라이싱할 수도 있지만, 이는 전형적으로 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다.
핵산을 발현하기 위한 벡터에는 세균, 곤충 및 포유류 숙주 세포와 화합성인 벡터가 포함된다. 이러한 벡터에는 특히, pCRII, pCR3, 및 pcDNA3.1 (공급처: Invitrogen Company, San Diego, Calif.), pBSII (공급처: Stratagene Company, La Jolla, Calif.), pET15 (공급처: Novagen, Madison, Wis.), pGEX (공급처: Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.), pEGFP-N2 (공급처: Clontech, Palo Alto, Calif.), pETL (공급처: BlueBacII; Invitrogen), pDSR-알파 (참고: PCT 공개공보 WO 90/14363) 및 pFastBacDual (공급처: Gibco/BRL, Grand Island, N.Y.)이 포함된다.
부가의 가능한 벡터에는 코스미드 (cosmid), 플라스미드 또는 변형된 바이러스가 포함되지만 그에 제한되지 않은데, 벡터 시스템은 선택된 숙주 세포와 화합성이어야만 한다. 이러한 벡터에는 플라스미드, 예를 들어 Bluescript® 플라스미드 유도체 [고 카피 수 ColE1에 의거한 파아지미드; 공급처: Stratagene Cloning Systems Inc., La Jolla Calif.], Taq-증폭시킨 PCR 생성물을 클로닝하도록 설계된 PCR 클로닝 플라스미드 [예를 들어, TOPO™, TA Cloning® Kit, PCR2.1 플라스미드 유도체; 공급처: Invitrogen, Carlsbad, Calif.], 및 포유류, 효모 또는 바이러스 벡터, 예를 들어 바쿨로바이러스 발현 시스템 [pBacPAK 플라스미드 유도체; 공급처: Clontech, Palo Alto, Calif.]가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 재조합 분자는 형질전환, 형질감염, 감염, 전기천공, 또는 기타 공지된 기술을 통하여 숙주 세포 내로 도입할 수 있다.
숙주 세포 및 그의 용도
본 발명은 추가로, 본 발명의 핵산 또는 벡터를 포함하는 세포 (예를 들어, 분리되거나 정제된 세포)를 제공한다. 세포는 본 발명의 핵산 또는 벡터를 이용하여 형질전환시켜 이로써 코딩된 폴리펩티드를 생성시킬 수 있는 모든 유형의 세포일 수 있다. 세포는 바람직하게 포유류 (예: 인간) 세포, 보다 바람직하게 하이브리도마 세포, 배아 줄기 세포, 또는 수정란이다.
IL-1β 결합성 항체 또는 단편을 발현시키기 위해, 상기 언급된 바와 같이 수득한 부분적 또는 완전한 길이의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 발현 벡터 내로 삽입하여 유전자가 전사 및 해독 제어 서열과 작동적으로 연결되도록 한다. 이러한 맥락에서, 용어 "작동적으로 연결된"이란 특정 벡터 내의 전사 및 해독 제어 서열이 그의 의도된 항체 유전자 전사 및 해독 조절 기능을 제공하도록 항체 유전자가 상기 벡터 내로 연결된다는 것을 의미한다. 발현 벡터와 발현 제어 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 화합성이도록 선택한다. 항체 경쇄 유전자와 항체 중쇄 유전자를 별개의 벡터 내로 삽입할 수 있거나, 또는 보다 전형적으로는 양 유전자를 동일한 발현 벡터 내로 삽입한다. 항체 유전자는 표준 방법에 의해 발현 벡터 내로 삽입한다 (예를 들어, 상보성 제한 부위를 항체 유전자 단편 및 벡터 상에 연결시키거나, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우에는 평활 말단 연결시킨다). 경쇄 또는 중쇄 서열을 삽입하기에 앞서, 발현 벡터는 항체 불변 영역 서열을 이미 수반할 수도 있다. 예를 들어, 선택된 VH 및 VL 서열을 완전한 길이의 항체 유전자로 전환시키기 위한 한 가지 접근방식은 이들을 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역 각각을 이미 코딩하고 있는 발현 벡터 내로 삽입하여, VH 절편이 이러한 벡터 내의 CH 절편(들)과 작동적으로 연결되도록 하고 VL 절편이 벡터 내의 CL 절편과 작동적으로 연결되도록 하는 것이다. 부가적으로 또는 또 다른 한편, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 쇄의 분비를 촉진시키는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 항체 쇄 유전자를 벡터 내로 클로닝하여 신호 펩티드가 동일계 프레임 내에서 항체 쇄 유전자의 아미노 말단과 연결되도록 할 수 있다. 이러한 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드 (즉, 비-면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.
항체 쇄 유전자 이외에도, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서의 항체 쇄 유전자의 발현을 제어하는 조절성 서열을 수반할 수 있다. 용어 조절성 서열에는 항체 쇄 유전자의 전사 또는 해독을 제어하는 프로모터, 증강인자 및 기타 발현 제어 요소 (예: 폴리아데닐화 신호)가 포함된다. 이러한 조절성 서열은, 예를 들어 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)]. 조절성 서열의 선별을 포함한 발현 벡터의 설계는 형질전환시키고자 하는 숙주 세포의 선택, 목적하는 단백질의 발현 수준 뿐만 아니라 기타 고려 사항과 같은 요인들에 의해 좌우될 수 있다는 것을 인지해야 할 것이다. 포유류 숙주 세포 발현에 바람직한 조절성 서열에는 포유류 세포에서 고 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스성 요소가 포함된다.
항체 쇄 유전자 및 조절성 서열 이외에도, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 부가의 서열, 예를 들어 숙주 세포에서의 벡터의 복제를 조절해주는 서열 (예: 복제 기점) 및 선별성 마커 유전자를 수반할 수 있다. 선별성 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선별을 촉진시켜 준다 [참고: 미국 특허 제4,399,216호, 제4,634,665호, 제5,179,017호 (Axel et al.)]. 예를 들어 전형적으로, 선별성 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에 약물 (예: G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트)에 대한 내성을 부여해준다. 바람직한 선별성 마커 유전자에는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선별/증폭을 수반한 dhfr- 숙주 세포에서 사용하기 위함) 및 neo 유전자 (G418 선별을 위해 사용함)가 포함된다.
핵산 및 벡터를 분리된 세포 내로 도입하고, 형질전환된 숙주 세포를 시험관 내에서 배양 및 선별하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 이에는 염화칼슘-매개된 형질전환, 형질도입, 접합, 삼조 짝짓기 (triparental mating), DEAE, 덱스트란-매개된 형질감염, 감염, 리포솜과의 막 융합, DNA-피복된 미소발사체를 이용한 고속 충격, 단일 세포 내로의 직접적인 미소주사, 및 전기천공의 사용이 포함된다 [참고: 예를 들어, Sambrook et al., 상기 참고; Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, 2nd ed., McGraw-Hill Professional, 1995; and Neumann et al., EMBO J., 1: 841 (1982)].
본 발명의 핵산 또는 벡터를 포함하는 세포를 사용하여 IL-1β 결합성 항체, 그의 단편, 또는 그의 일부 (예를 들어, 본 발명의 핵산 또는 벡터에 의해 코딩된 중쇄 서열 또는 경쇄 서열)를 생성시킬 수 있다. 본 발명의 핵산 또는 벡터를 세포 내로 도입한 후, 세포를 코딩된 세열을 발현시키는 적합한 조건 하에 배양한다. 이어서, 상기 항체, 항원 결합성 단편, 또는 항체의 일부를 상기 세포로부터 분리할 수 있다.
특정 양태에서는, IL-1β 결합성 항체, 또는 그의 항원 결합성 단편을 함께 코딩하는 2개 이상의 벡터를 세포 내로 도입할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 영역 또는 완전한 중쇄 서열을 코딩하는 제1 벡터를 숙주 세포 내로 도입할 수 있고, 경쇄 가변 영역 또는 완전한 경쇄 서열을 코딩하는 제2 벡터를 또한 숙주 세포 내로 도입한다. 이어서, 상기 세포를 제1 및 제2 벡터에 의해 코딩된 2개 서열을 발현시키는데 적합한 조건 하에 배양하고, 코딩된 폴리펩티드를 숙주 세포로부터 분리할 수 있다. 필요한 경우, 이와 같이 분리된 폴리펩티드를 IL-1β 결합성 항체 또는 그의 항원 결합성 단편으로 연합 및 구성시키는 것를 증진시키는 조건 하에 합할 수 있다. 또 다른 한편, 제1 및 제2 벡터를 별개의 세포 내로 도입할 수 있고, 이들 생성물을 각각의 세포로부터 분리하고 합하여 IL-1β 결합성 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 제공할 수 있다. 항체 구성분을 항원 결합성 폴리펩티드로 연합 및 구성시키는 것을 증진시키는 방법이 당해 분야에 보고되었다. 유사하게, 항체, 그의 항원 결합성 단편, 또는 중쇄 및 경쇄 단편을 분리하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명의 핵산 또는 벡터를 포함하는 배아 줄기 세포 또는 수정란을 사용하여 트랜스제닉 비-인간 동물을 생성시킬 수 있다. 트랜스제닉 동물을 만드는 방법이 문헌 [참고: Hofker et al., Transgenic Mouse: Methods and Portocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press, Clifton, NJ, 2002]에 기재되어 있다. 본원에 기재된 핵산 또는 벡터를 포함하는 트랜스제닉 비-인간 동물을 사용하여, 코딩된 항체, 항원 결합성 단편, 또는 항체 일부를 발현시킬 수 있다. 이어서, 이러한 항체, 항원 결합성 단편 또는 일부를 상기 동물로부터 분리할 수 있다. 항체 일부를 연속해서, (부가의 항체 일부와 조합하여) 본 발명의 IL-1β 결합성 항체 또는 항체 단편으로 재구성할 수 있다.
숙주 세포는 원핵성 숙주 세포 (예: 이. 콜라이) 또는 진핵성 숙주 세포 (예: 효모 세포, 곤충 세포, 또는 척추동물 세포)일 수 있다. 이러한 숙주 세포를 적당한 조건 하에 배양하는 경우, 이는 IL-1β 결합성 항체 또는 단편을 발현하는데, 연속해서 이를 배양 배지로부터 수집할 수 있거나 (숙주 세포가 상기 항체 또는 단편을 배지 내로 분비하는 경우) 또는 이를 생산하는 숙주 세포로부터 직접 수집할 수 있다 (상기 항체 또는 단편을 분비하지 않는 경우). 적당한 숙주 세포의 선별은 목적하는 발현 수준, 활성을 위해 요망되거나 필요한 폴리펩티드 변형 (예를 들어, 당화 또는 인산화), 및 생물학적 활성 분자 내로의 폴딩 용이성과 같은 각종 요인들에 의해 좌우될 것이다. 적합한 수 많은 숙주 세포가 당해 분야에 공지되어 있고, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 [American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Va]으로부터 입수 가능하다. 예로는 포유류 세포, 예를 들어 중국산 햄스터 난소 세포 (CHO) (ATCC No. CCL61) CHO DHFR-세포 [참고: Urlaub et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 4216-4220 (1980)], 인간 배아 신장 (HEK) 293 또는 293T 세포 (ATCC No. CRLl 573), 3T3 세포 (ATCC No. CCL92), 또는 PER.C6 세포가 있다. 적합한 포유류 숙주 세포의 선별, 및 형질전환, 배양, 증폭, 스크리닝 및 생성물 생성 및 정제 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 기타 적합한 포유류 세포주는 원숭이 COS-1 (ATCC No. CRL1650) 및 COS-7 세포주 (ATCC No. CRL1651), 및 CV-1 세포주 (ATCC No. CCL70)이다. 추가로 예시되는 포유류 숙주 세포에는 영장류 세포주, 조류 세포주, 및 설치류 세포주 (형질전환된 세포주 포함)가 포함된다. 정상적인 배수염색체 세포, 일차 조직의 시험관내 배양물로부터 유래된 세포 균주 뿐만 아니라 일차 외식편이 또한 적합하다. 후보 세포는 유전자형적으로 선별 유전자가 결핍될 수 있거나, 또는 우성적으로 작용하는 선별 유전자를 포함할 수 있다. 적합한 기타 포유류 세포주에는 마우스 신경모세포종 N2A 세포, HeLa, 마우스 L-929 세포, 스위스산 Balb-c 또는 NIH 마우스로부터 유래된 3T3 세포주, BHK 또는 HaK 햄스터 세포주 [이들은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (Manassas, Va.)로부터 입수 가능하다]가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 이들 세포주 각각은 단백질 발현 분야의 전문가에게 공지되어 있고 이용 가능하다.
본 발명에 적합한 숙주 세포로서 유사하게 유용한 것은 세균성 세포이다. 예를 들어, 이. 콜라이의 각종 균주 [예: HB1O1 (ATCC No. 33694), DH5α, DH1O, 및 MC1061 (ATCC No. 53338)]가 생명공학 분야에서 숙주 세포로서 널리 공지되어 있다. 비. 서브틸리스 (B. subtilis), 슈도모나스 종 (Pseudomonas spp.), 기타 바실루스 종 (Bacillus spp.), 스트렙토마이세스 종 (Streptomyces spp.) 등의 각종 균주를 본 방법에 이용할 수도 있다.
경쇄 및 중쇄를 발현하기 위해서는, 이러한 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터(들)를 표준 기술에 의해 숙주 세포 내로 형질감염시킨다. 형질감염은 외인성 DNA를 원핵성 또는 진핵성 숙주 세포 내로 도입하는데 통상 사용되고 있는 광범위한 기술, 예를 들어 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포괄한다. IL-1β 결합성 항체 또는 단편을 원핵성 또는 진핵성 숙주 세포에서 발현시키는 것이 이론적으로 가능하긴 하지만, 이러한 항체 또는 단편을 진핵성 세포, 가장 바람직하게는 포유류 숙주 세포에서 발현시키는 것이 가장 바람직한데, 이는 상기 진핵성 세포, 특히 포유류 세포가 적당하게 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 어셈블리 및 분비시키는데 있어 원핵성 세포보다 더 잘할 것으로 예상되기 때문이다. 본 발명의 재조합 항체를 발현하기 위한 포유류 숙주 세포에는 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포 [예를 들어, 문헌 (참고: R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621)에 기재된 바와 같은 DHFR 선별성 마커와 함께 사용된, 문헌 (참고: Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:42164220)에 기재된 dhfr-CHO 세포 포함], NS0 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포가 포함된다. 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터를 포유류 숙주 세포 내로 도입하는 경우에는, 이러한 항체를 상기 숙주 세포에서 발현시킬 수 있거나, 또는 보다 바람직하게 숙주 세포를 성장시킨 배양 배지 내로 상기 항체를 분비시킬 수 있기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 항체를 생성시킨다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수할 수 있다.
당해 분야에 공지된 수 많은 효모 세포 균주가 또한, 항체 및 단편 발현용 숙주 세포로서 이용가능하다. 바람직한 효모 세포에는, 예를 들어 삭카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)가 포함된다. 부가적으로 경우에 따라, 곤충 세포 시스템을 활용할 수도 있다. 이러한 시스템은, 예를 들어 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Kitts et al., Biotechniques, 14, 810-817 (1993), Lucklow Curr. Opin. Biotechnol., 4, 564-572 (1993) and Lucldow et al., J. Virol., 67, 4566-4579 (1993)]. 바람직한 곤충 세포는 Sf-9 및 Hi5 (공급처: Invitrogen, Carlsbad, Calif.)이다.
IL-1β 결합성 항체 또는 단편을 코딩하는 핵산 분자를 선택된 숙주 세포 내로 형질전환 또는 형질감염시키는 것은 염화칼슘 방법, 전기천공 방법, 미소주사 방법, 리포펙션 방법 또는 DEAE-덱스트란 방법을 포함한 널리 공지된 방법에 의해 수행할 수 있다. 선택된 방법는 부분적으로, 사용될 숙주 세포의 유형에 좌우될 것이다. 이들 방법 및 기타 적합한 방법은 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al. 상기 참고]에 제시되어 있다.
트랜스제닉 동물을 또한 사용하여 당화 항체 및 단편을 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 트랜스제닉 유액-생산 동물 (예를 들어, 암소 또는 염소)을 사용할 수 있고 이러한 동물 유액에서 당화 결합제를 수득할 수 있다. 또 다른 한편, 당화 선택적 결합제를 생성시키는 식물을 사용할 수도 있다.
IL-1β 결합성 항체 또는 단편을 코딩하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포는 당해 분야에 공지된 배지를 사용하여 배양할 수 있다. 이러한 배지는 통상적으로, 세포의 성장과 생존에 필요한 모든 영양분을 함유할 것이다. 이. 콜라이 세포를 배양하기 위한 배지의 예에는 루리아 육즙 [Luria Broth (LB)] 및/또는 테리픽 육즙 [Terrific Broth (TB)]이 포함된다. 진핵성 세포를 배양하는데 적합한 배지는 RPMI 1640, MEM, DMEM인데, 이는 특별한 세포주를 배양하기 위해 요망되는 바와 같은 혈청 및/또는 성장 인자를 보충시킬 수 있다. 곤충 배양용으로 예시되는 배지는 필요에 따라 이스톨레이트, 락트알부민 가수분해물, 및/또는 태아 송아지 혈청을 보충시킨 그레이스 (Grace) 배지이다.
형질감염되거나 형질전환된 세포의 선택적 성장에 유용한 항생제 또는 기타 화합물을 배지에 대한 보충물로서 가할 수도 있다. 이 화합물은 숙주 세포를 형질전환시킨 플라스미드 상에 존재하는 선별성 마커 요소를 기초로 하여 선택될 것이다. 예를 들어, 선별성 마커 요소가 카나마이신 내성인 경우에는, 배양 배지에 부가된 화합물이 카나마이신일 것이다. 선택적 성장을 위한 기타 화합물에는 앰피실린, 테트라사이클린 및 네오마이신이 포함된다.
숙주 세포에 의해 생성된 IL-1β 결합성 항체 또는 단편의 양은 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 평가할 수 있다. 이러한 방법에는 웨스턴 블롯 (Western blot) 분석, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 비-변성 겔 전기영동, HPLC 분리, 전기침전 및/또는 활성 검정이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
세포 배지 내로 분비시킨 IL-1β 결합성 항체 또는 단편의 정제는 친화, 면역친화 또는 이온 교환 크로마토그래피, 분자 체 크로마토그래피, 분취 겔 전기영동 또는 등전점 전기영동, 크로마토분획, 및 고압 액체 크로마토그래피를 포함한 각종 기술을 사용하여 달성할 수 있다. 예를 들어, Fc 영역을 포함하는 항체는 이러한 Fc 영역과 선택적으로 결합하는 단백질 A를 이용한 친화 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. 변형된 형태의 항체 또는 항원 결합성 단편은 그의 카복실 또는 아미노 말단에서 친화 태그, 예를 들어 헥사히스티딘 또는 기타 소형 펩티드, 예를 들면 FLAG (공급처: Eastman Kodak Co., New Haven, Conn.) 또는 myc (공급처: Invitrogen)를 사용하여 제조할 수 있고, 1-단계 친화 칼럼에 의해 정제할 수 있다. 예를 들어, 폴리히스티딘은 니켈과 큰 친화도 및 특이성으로 결합하므로, 니켈의 친화 칼럼 [예를 들어, Qiagen® 니켈 칼럼]을 폴리히스티딘-태그화 선택적 결합제의 정제를 위해 사용할 수 있다 [참고: 예를 들어, Ausubel et al, eds., Current Protocols in Molecular Biology, Section 10.11.8, John Wiley & Sons, New York (1993)]. 몇몇 경우에는 1회 이상의 정제 단계를 이용할 수도 있다.
원핵성 숙주 세포에서 발현되는 IL-1β 결합성 항체 또는 단편은 주변세포질 공간이나 세포질에서 가용성 형태로 존재하거나 또는 세포내 봉입체의 일부로서 불용성 형태로 존재할 수 있다. IL-1β 결합성 항체 또는 단편은 당해 분야에 공지된 적당한 모든 기술을 사용하여 숙주 세포로부터 추출할 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포를 용해시켜 프렌치 프레스 (French press), 균질화 및/또는 초음파처리에 이어 원심분리함으로써 주변세포질/세포질 내용물을 방출시킬 수 있다.
세포질에 존재하거나 주변세포질 공간으로부터 방출된 가용성 형태의 IL-1β 결합성 항체 또는 단편은 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 추가로 정제할 수 있는데, 예를 들어 Fab 단편을 삼투압 쇼크 기술에 의해 세균성 주변세포질 공간으로부터 방출시킨다.
항체 또는 단편을 포함하는 봉입체가 형성된 경우, 이는 종종 내부 및/또는 외부 세포성 막과 결합할 수 있으므로, 원심분리 후 주로 펠릿 물질에서 발견될 것이다. 이어서, 이러한 펠릿 물질을 pH 극단에서 처리하거나, 또는 알칼리성 pH에서 환원제 (예: 디티오트레이톨)의 존재 하에 또는 산 pH에서 트리스 카복시에틸 포스핀의 존재 하에 카오트로픽제, 예를 들어 세정제, 구아니딘, 구아니딘 유도체, 우레아 또는 우레아 유도체로 처리하여 상기 봉입체를 방출, 파쇄 분리 및 가용화시킬 수 있다. 이어서, 이러한 가용성 항체 또는 단편은 전기영동, 면역침전 등을 이용하여 분석할 수 있다. 가용화 항체 또는 항원 결합성 단편을 분리시키는 것이 요망되는 경우에는, 다음에 제시된 방법 및 문헌 [참고: Marston et al., Meth. Enz., 182:264-275 (1990)]에 보고된 방법과 같은 표준 방법을 사용하여 분리를 달성할 수 있다.
몇몇 경우에는, IL-1β 결합성 항체 또는 단편이 분리시 생물학적으로 활성이 아닐 수도 있다. 특정 폴리펩티드를 그의 4차 구조로 "재폴딩"하거나 전환시키고 디설파이드 연쇄를 생성시키기 위한 각종 방법을 사용하여 생물학적 활성을 복원시킬 수 있다. 이러한 방법에는 가용화 폴리펩티드를 특별한 농도의 카오트로프 (chaotrope)의 존재 하에 통상 7 이상의 pH로 노출시키는 것이 포함된다. 카오트로프의 선택은 봉입체 가용화를 위해 사용된 선택과 극히 유사하긴 하지만, 통상적으로 카오트로프는 보다 저 농도로 사용되고 가용화를 위해 사용된 카오트로프와 반드시 동일할 필요는 없다. 대부분의 경우에 재폴딩/산화 용액은 또한, 환원제를 함유하거나 또는 환원제 + 그의 산화 형태를 특정한 비율로 함유하여, 디설파이드 셔플링이 단백질의 시스테인 브릿지(들) 형성시 일어날 수 있도록 해주는 특별한 레독스 (redox) 전위를 생성시킬 것이다. 흔히 사용되는 레독스 커플 중의 몇몇에는 시스테인/시스타민, 글루타치온 (GSH)/디티오비스 GSH, 염화제2구리, 디티오트레이톨 (DTT)/디티안 DTT, 및 2-머캅토에탄올(bME)/디티오-b(ME)가 포함된다. 많은 경우에 있어, 조용매를 사용하여 재폴딩 효율을 증가시킬 수 있고, 이를 위해 통상적으로 사용되고 있는 시약에는 글리세롤, 각종 분자량의 폴리에틸렌 글리콜, 아르기닌 등이 포함된다.
본 발명의 IL-1β 결합성 항체 또는 단편은 당해 분야에 공지된 기술, 예를 들어 다음 문헌에 제시된 바와 같은 방법을 사용하여 화학적 합성 방법 (예: 고체 상 펩티드 합성)에 의해 제조할 수도 있다 [참고: Merrifield et al. (1963), J. Am. Chem. Soc, 85: 2149, Houghten et al. (1985), Proc Natl Acad. Sci. USA, 82: 5132, and Stewart and Young (1984), Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, Ill]. 상기 항체 또는 단편은 아미노 말단 상의 메티오닌을 이용하거나 이용하지 않으면서 합성할 수 있다. 화학적으로 합성된 항체 및 항원 결합성 단편은 상기 참고 문헌에 제시된 방법을 사용하여 산화시켜 디설파이드 브릿지를 형성시킬 수 있다. 이로써 제조된 항체 및 단편은 본래 또는 재조합적으로 생성된 IL-1β 결합성 항체 또는 단편과 연관된 한 가지 이상의 생물학적 활성을 보유할 것이다.
제약 조성물
본 발명의 IL-1β 결합성 항체, 항체 단편, 핵산 또는 벡터는 조성물, 특히 제약 조성물로 제형화할 수 있다. 이러한 조성물은 치료적 또는 예방적 유효량의 본 발명의 IL-1β 결합성 항체, 항체 단편, 핵산 또는 벡터를 적합한 담체, 예를 들어 제약상 허용 가능한 작용제와 혼합하여 포함한다. 전형적으로, 본 발명의 IL-1β 결합성 항체, 항체 단편, 핵산 또는 벡터는 제약 조성물로 제형화하기 전에 동물에게 투여하기 충분하도록 정제한다.
본 발명의 제약 조성물에 사용하기 위한 제약상 허용 가능한 작용제에는 담체, 부형제, 희석제, 항산화제, 방부제, 착색제, 향미제 및 희석제, 유화제, 현탁화제, 용매, 충전제, 벌크제, 완충제, 전달 비히클, 등장화제, 조용매, 습윤제, 착화제, 완충제, 항미생물제, 및 계면활성제가 포함된다.
중성 완충 식염수 또는 혈청 알부민과 혼합된 식염수가 적당한 담체로 예시된다. 본 발명의 제약 조성물은 항산화제, 예를 들어 아스코르브산; 저분자량 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트제, 예를 들어 EDTA; 당 알코올, 예를 들어 만니톨 또는 솔비톨; 염-형성성 반대이온, 예를 들어 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 트윈 (Tween), 플루로닉스 (pluronics), 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함할 수 있다. 또한 예를 들어, 적합한 등장성 증강제에는 알칼리 금속 할라이드 (바람직하게, 염화나트륨 또는 염화칼륨), 만니톨, 솔비톨 등이 포함된다. 적합한 방부제에는 벤즈알코늄 클로라이드, 티메로살, 펜에틸 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 등이 포함된다. 과산화수소를 방부제로서 사용할 수도 있다. 적합한 조용매에는 글리세린, 프로필렌 글리콜 및 PEG가 포함된다. 적합한 착화제에는 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-시클로덱스트린 또는 히드록시-프로필-베타-시클로덱스트린이 포함된다. 적합한 계면활성제 또는 습윤제에는 솔비탄 에스테르, 폴리솔베이트, 예를 들어 폴리솔베이트 80, 트로메타민, 레시틴, 콜레스테롤, 틸록사팔 등이 포함된다. 완충제는 통상적인 완충제, 예를 들어 아세테이트, 붕산염, 시트레이트, 인산염, 중탄산염 또는 트리스-HCl일 수 있다. 아세테이트 완충제는 약 pH 4 내지 5.5일 수 있고, 트리스 완충제는 약 pH 7 내지 8.5일 수 있다. 부가의 제약 작용제가 다음 문헌에 제시되어 있다 [참고: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990].
본 발명의 조성물은 액상 형태이거나 또는 동결건조된 형태일 수 있고, 이는 하나 이상의 동결건조 보호제, 부형제, 계면활성제, 고 분자량의 구조적 부가제 및/또는 벌크제 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제6,685,940호, 제6,566,329호, 및 제6,372,716호]를 포함할 수 있다. 한 양태에서는, 비환원 당, 예를 들어 슈크로스, 락토스 또는 트레할로스인 동결건조 보호제가 포함된다. 일반적으로 포함되는 동결건조 보호제의 양은 재구성시 생성되는 제형이 등장성이 되도록 하는 양이지만, 고장성 또는 약간 저장성 제형도 적합할 수 있다. 또한, 동결건조 보호제의 양은 동결건조시 허용 가능하지 않은 양의 단백질 분해 및/또는 응집을 방지시키기에 충분해야 한다. 예비-동결건조시킨 제형 중에서 당 (예를 들어, 슈크로스, 락토스, 트레할로스)에 대해 예시되는 동결건조 보호제 농도는 약 10 mM 내지 약 400 mM이다. 또 다른 양태에서는, 계면활성제, 예를 들어 비이온성 계면활성제 및 이온성 계면활성제, 예를 들면 폴리솔베이트 (예: 폴리솔베이트 20, 폴리솔베이트 80); 폴옥사머 (예: 폴옥사머 188); 폴리 (에틸렌 글리콜) 페닐 에테르 (예: 트리톤); 나트륨 도데실 설페이트 (SDS); 나트륨 라우렐 설페이트; 나트륨 옥틸 글리코시드; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-설포베타인; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-사르코신; 리놀레일-, 미리스틸- 또는 세틸-베타인; 라우로아미도프로필-, 코카미도프로필-, 리놀아미도프로필-, 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아르아미도프로필-베타인 (예: 라우로아미도프로필); 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필- 또는 이소스테아르아미도프로필-디메틸아민; 나트륨 메틸 코코일-, 또는 이나트륨 메틸 오페일-타우레이트; 및 MONAQUAT™ 시리즈 (공급처: Mona Industries, Inc., Paterson, NJ.), 폴리에틸 글리콜, 폴리프로필 글리콜, 및 에틸렌과 프로필렌 글리콜의 공중합체 (예를 들어, 플루로닉스, PF68 등)이 포함된다. 예비-동결건조시킨 제형에 존재할 수 있는 계면활성제의 예시 양은 약 0.001 내지 0.5%이다. 고 분자량의 구조적 부가제 (예: 충전제, 결합제)에는, 예를 들어 아카시아, 알부민, 알진산, 인산칼슘 (2가), 셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스 나트륨, 히드록시에틸셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 미세결정성 셀룰로스, 덱스트란, 덱스트린, 덱스트레이트, 슈크로스, 틸로스, 예비-젤라틴화 전분, 황산칼슘, 아밀로스, 글리신, 벤토나이트, 말토스, 솔비톨, 에틸셀룰로스, 인산수소 이나트륨, 인산이나트륨, 이나트륨 피로설파이트, 폴리비닐 알코올, 젤라틴, 글루코스, 구아 검, 액상 글루코스, 압축성 당, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 말토덱스트린, 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리메타크릴레이트, 포비돈, 나트륨 알지네이트, 트라가칸드 미세결정성 셀룰로스, 전분 및 제인 (zein)이 포함된다. 고 분자량의 구조적 부가제의 예시 농도는 0.1 중량% 내지 10 중량%이다. 기타 양태에서는 벌크제 (예: 만니톨, 글리신)이 포함될 수도 있다.
조성물은 비경구 투여에 적합할 수 있다. 예시되는 조성물은 당업자에게 이용 가능한 모든 경로, 예를 들어 관절내, 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 뇌내 (실질내), 뇌실내, 근육내, 안내, 동맥내, 또는 병변내 경로에 의해 동물에게 주사 또는 주입하기에 적합하다. 비경구 제형은 전형적으로, 제약상 허용 가능한 방부제를 임의로 함유하는, 발열원을 함유하지 않는 멸균성의 등장성 수용액일 것이다.
비-수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예를 들어 올리브유, 및 주사성 유기 에스테르, 예를 들면 에틸 올레에이트이다. 수성 담체에는 물, 알코올성/수성 용액, 에멀션 또는 현탁제 (식염수 및 완충 매질 포함)이 포함된다. 비경구 비히클에는 염화나트륨 용액, 링커 (Ringer) 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 유산을 가한 링커액, 또는 고정유가 포함된다. 정맥내 비히클에는 유체 및 영양분 보충물, 전해질 보충물, 예를 들어 링거 덱스트로스에 의거한 보충물 등이 포함된다. 방부제 및 기타 부가제, 예를 들어 항미생물제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 기체 등이 존재할 수도 있다 [참고: Remington's Pharmaceutical Science, 16th Ed., Mack Eds., 1980; 본원에 참고로 도입된다].
본원에 기재된 제약 조성물은 국소 농도의 생성물 (예: 거환, 데포 효과)을 제공하고/하거나 증가된 안정성이나 반감기를 특별한 국소 환경에 제공하는 방식으로 제어 또는 지속 전달하도록 제형화할 수 있다. 이러한 조성물에는 중합체성 화합물, 예를 들어 폴리락트산, 폴리글리콜산 등의 미립 제제 뿐만 아니라 생분해성 매트릭스, 주사 가능한 미소구, 미소캡슐상 입자, 미소캡슐, 생침식성 입자 비드, 리포솜, 및 이식 가능한 전달 장치 (이는 활성제를 제어 또는 지속 방출시켜 주는데, 데포 주사제로서 전달될 수 있다) 등의 작용제를 수반한 본 발명의 IL-1β 결합성 항체, 항체 단편, 핵산 또는 벡터의 제형이 포함될 수 있다. 이러한 지속 또는 제어식 전달 수단을 제형화하는 기술은 공지되어 있고, 약물을 제어식 방출 및 전달시키기 위한 각종 중합체가 개발되어 사용되어 왔다. 상기 중합체는 전형적으로 생분해성 및 생체적합성이다. 온도 또는 pH 민감 특성을 지닌 히드로겔, 및 에난티오머성 중합체 또는 폴리펩티드 절편을 착화시킴으로써 형성된 것을 포함한 중합체 히드로겔은 생활성 단백질 작용제 (예: 항체)를 포착하는데 관여한 순한 수성 조건으로 인해 약물 데포 효과를 제공하는데 요망될 수도 있다. 예를 들어, 제약 조성물을 전달하기 위한 제어식 방출 다공성 중합체성 미립자에 관한 기재 내용은 PCT 공개공보 WO 93/15722를 참고할 수 있다.
이러한 목적에 적합한 물질에는 폴리락티드 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제3,773,919호], 폴리-(a-히드록시카복실산)의 중합체, 예를 들어 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산 [참고: EP 133,988A], L-글루탐산과 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체 [참고: Sidman et al., Biopolymers, 22: 547-556 (1983)], 폴리 (2-히드록시에틸-메타크릴레이트) [참고: Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981), and Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)], 에틸렌 비닐 아세테이트 또는 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다. 기타 생분해성 중합체에는 폴리(락톤), 폴리(아세탈), 폴리(오르토에스테르), 및 폴리(오르토카보네이트)가 포함된다. 지속식 방출 조성물에는 또한, 당해 분야에 공지된 몇 가지 방법에 의해 제조될 수 있는 리포솜이 포함될 수 있다 [참고: 예를 들어, Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-92 (1985)]. 담체 자체, 또는 그의 분해 산물은 표적 조직에서 무독성이어야 하고 해당 질환을 추가로 악화시키지 말아야 한다. 이는 표적 장애의 동물 모델에서, 또는 이러한 모델이 입수 가능하지 않은 경우에는 정상적인 동물에서 통상적으로 스크리닝함으로써 결정할 수 있다.
지속식 방출을 위해 재조합 단백질을 미소피막화하는 것은 인간 성장 호르몬 (rhGH), 인터페론- (rhIFN--), 인터루킨-2, 및 MN rgpl20을 이용하여 성공적으로 수행하였다 [참고: Johnson et al., Nat. Med., 2:795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27:1221-1223 (1993); Hora et al., Bio/Technologv. 8:755-758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems," in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439-462; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; and U.S. Pat. No. 5,654,010]. 이들 단백질의 지속식 방출 제형은 폴리-락트산-코-글리콜산 (PLGA) 중합체를 사용하여 개발하였는데, 이는 그의 생체적합성과 광범위한 생분해성 특성 때문이다. PLGA의 분해 산물인 락트산과 글리콜산은 인체 내에서 신속하게 제거될 수 있다. 더우기, 이러한 중합체의 분해성은 그의 분자량과 조성에 좌우될 수 있다 [참고: Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer," in: M. Chasin and R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41]. 지속식 방출 조성물의 부가 예에는, 예를 들어 다음 문헌에 기재된 것들이 포함된다 [참고: EP 58,481A, U.S. Pat. No. 3,887,699, EP 158,277A, Canadian Patent No. 1176565, U. Sidman et al., Biopolymers 22, 547 (1983), R. Langer et al., Chem. Tech. 12, 98 (1982), Sinha et al., J. Control. Release 90, 261 (2003), Zhu et al., Nat. Biotechnol. 18, 24 (2000), and Dai et al., Colloids Surf B Biointerfaces 41, 117 (2005)].
생체접착성 중합체가 또한, 본 발명의 조성물에 사용하거나 본 발명의 조성물과 함께 사용하는 것으로 고려된다. 생체접착성 물질은 생물학적 기질과 장시간 동안 접착할 수 있는 합성 및 천연 발생적 물질이다. 예를 들어, 카보폴 (Carbopol)과 폴리카보필은 둘 다 폴리(아크릴산)의 가교 결합된 합성 유도체이다. 천연 발생적 물질에 기초한 생체접착성 전달 시스템에는, 예를 들어 히알루로난으로서 공지되기도 한 히알루론산이 포함된다. 히알루론산은 D-글루쿠론산과 N-아세틸-D-글루코사민의 잔기로 이루어진 천연 발생적 점액성 다당류이다. 히알루론산은 척추동물의 세포외 조직 매트릭스 (결합 조직 포함)에서 발견될 뿐만 아니라 활액과 안구의 유리체액 및 안구 방수에서 발견된다. 히알루론산의 에스테르화 유도체를 사용하여 생체적합성 및 생분해성 전달에 사용하기 위한 미소구를 제조하였다 [참고: 예를 들어, Cortivo et al., Biomaterials (1991) 12:727-730; European Publication No. 517,565; International Publication No. WO 96/29998; Illum et al., J. Controlled Rel. (1994) 29:133-141]. 본 발명의 조성물을 함유하는 예시 히알루론산은 IL-1β 결합성 항체 또는 단편 대 히알루론산 중합체 대략 0.1% 대 약 40% (w/w)의 양으로 히알루론산 에스테르 중합체를 포함한다.
생분해성 중합체 매트릭스와 비-생분해성 중합체 매트릭스 둘 다를 사용하여 본 발명의 조성물을 전달할 수 있고, 이러한 중합체 매트릭스는 천연 또는 합성 중합체를 포함할 수 있다. 생분해성 매트릭스가 바람직하다. 방출이 전반적으로 일어나는 시간은 중합체 선택에 의거한다. 전형적으로 수 시간 내지 3개월 내지 12개월에 걸쳐 방출되는 것이 가장 요망된다. 생분해성 전달 시스템을 형성하기 위해 사용될 수 있는 합성 중합체의 예에는 다음이 포함된다: 락트산과 글리콜산의 중합체, 폴리아미드, 폴리카보네이트, 폴리알킬렌, 폴리알킬렌 글리콜, 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리알킬렌 테레프탈레이트, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 에테르, 폴리비닐 에스테르, 폴리비닐 할라이드, 폴리비닐피롤리돈, 폴리글리콜리드, 폴리실록산, 폴리무수물, 폴리우레탄 및 그의 공중합체, 폴리(부트산), 폴리(발레산), 알킬 셀룰로스, 히드록시알킬 셀룰로스, 셀룰로스 에테르, 셀룰로스 에스테르, 니트로 셀룰로스, 아크릴 에스테르와 메타크릴 에스테르의 중합체, 메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸 셀룰로스, 히드록시부틸 메틸 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 프로피오네이트, 셀룰로스 아세테이트 부티레이트, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트, 카복시에틸 셀룰로스, 셀룰로스 트리아세테이트, 셀룰로스 설페이트 나트륨 염, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(에틸 메타크릴레이트), 폴리(부틸메타크릴레이트), 폴리(이소부틸 메타크릴레이트), 폴리(헥실메타크릴레이트), 폴리(이소데실 메타크릴레이트), 폴리(라우릴 메타크릴레이트), 폴리(페닐 메타크릴레이트), 폴리(메틸 아크릴레이트), 폴리(이소프로필 아크릴레이트), 폴리(이소부틸 아크릴레이트), 폴리(옥타데실 아크릴레이트), 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 폴리(비닐 알코올), 폴리비닐 아세테이트, 폴리비닐 클로라이드, 폴리스티렌 및 폴리비닐피롤리돈. 예시되는 천연 중합체에는 알지네이트 및 기타 다당류 (이에는 덱스트란 및 셀룰로스가 포함된다), 콜라겐, 그의 화학적 유도체 (화학 기의 치환, 부가, 예를 들어 알킬, 알킬렌, 히드록시화물, 산화물, 및 당업자에 의해 통상적으로 만들어진 기타 변형물), 알부민 및 기타 친수성 단백질, 제인 및 기타 프롤아민 및 소수성 단백질, 그의 공중합체 및 혼합물이 포함된다. 일반적으로, 이들 물질은 효소적 가수분해에 의해, 또는 표면 또는 벌크 침식에 의한 생체내 수분 노출에 의해 분해된다. 이러한 중합체는 임의로, 수 중에서 그의 중량의 약 90% 까지를 흡수할 수 있고 추가로, 다가 이온이나 기타 중합체와 임의로 가교결합되는 히드로겔 형태이다 [참고: 예를 들어, WO 04/009664, WO 05/087201, Sawhney, et al., Macromolecules, 1993, 26, 581-587].
전달 시스템에는 또한 지질, 예를 들어 스테롤, 예를 들면 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르 및 지방산 또는 중성 지방, 예를 들면 모노-, 디- 및 트리-글리세라이드인 비-중합체 시스템; 히드로겔 방출 시스템; 실라스틱 (silastic) 시스템; 펩티드에 의거한 시스템; 왁스 코팅; 통상적인 결합제 및 부형제를 사용하는 압착 정제; 부분적으로 융합된 이식체 등이 포함된다. 구체적인 예에는 다음이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: (a) 생성물이 미국 특허 제4,452,775호, 제4,675,189호 및 제5,736,152호에 기재된 바와 같이, 매트릭스 내에 특정 형태로 함유되어 있는 부식형 시스템 및 (b) 생성물이 미국 특허 제3,854,480호, 제5,133,974호 및 제5,407,686호에 기재된 바와 같이, 중합체로부터 제어 속도로 침투되는 확산형 시스템. 해당 생성물을 함유하는 리포솜은 공지된 방법, 예를 들어 다음 문헌에 기재된 방법에 의해 제조할 수 있다 [참고: DE 3,218,121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; Japanese patent application 83-118008; U.S. Pat. Nos. 4,485,045 and 4,544,545; and EP 102,324].
또 다른 한편 또는 부가적으로, 본 발명의 조성물은 본 발명의 IL-1β 결합성 항체, 항체 단편, 핵산 또는 벡터를 흡착 또는 피막화시킨 막, 스폰지 또는 기타 적당한 물질을 병든 부위 내로 이식함으로써 국소적으로 투여할 수 있다. 이식 장치를 사용하는 경우에는, 이러한 장치를 적합한 모든 조직이나 기관 내로 이식할 수 있고, 본 발명의 IL-1β 결합성 항체, 항체 단편, 핵산 또는 벡터는 거환을 통하여, 지속적인 투여를 통하여, 또는 연속적 주입을 이용한 카테터를 통하여 상기 장치 내로 직접 전달할 수 있다.
본 발명의 IL-1β 결합성 항체, 항체 단편, 핵산 또는 벡터를 포함하는 제약 조성물은 흡입용으로, 예를 들어 건조 분말로서 제형화할 수 있다. 흡입 용액은 에어로솔 전달을 위해 액화 추진체에서 제형화할 수도 있다. 또 다른 제형에서는 용액을 분무시킬 수도 있다. 폐 투여를 위한 부가의 제약 조성물에는, 예를 들어 PCT 공개공보 WO 94/20069에 기재된 것이 포함되는데, 이 공개공보에는 화학적으로 변형된 단백질의 폐 전달이 기재되어 있다. 폐 전달하는 경우에는, 입자 크기가 말단부 폐까지 전달하기에 적합해야 한다. 예를 들어, 입자 크기는 1 ㎛ 내지 5 ㎛일 수 있지만, 각 입자가 상당히 다공성인 경우에는 보다 큰 입자를 사용할 수도 있다.
본 발명의 IL-1β 결합성 항체, 항체 단편, 핵산 또는 벡터를 포함하는 특정 제형을 경구 투여할 수 있다. 이러한 방식으로 투여된 제형은 정제 및 캅셀제와 같은 고형 투여 형태를 조제하는데 통상적으로 사용되고 있는 담체를 수반하거나 수반하지 않으면서 제형화할 수 있다. 예를 들어, 캡슐은 생체내 이용 효율을 최대화시키고 예비-전신성 분해를 최소화시키는 위장관 내에서의 특정 시점에 제형의 활성 부분이 방출되도록 설계할 수 있다. 선택적 결합제의 흡수를 촉진시키는 부가의 작용제가 포함될 수 있다. 희석제, 향미제, 저 융점 왁스, 식물성 오일, 윤활제, 현탁화제, 정제 붕해제, 및 결합제를 이용할 수도 있다.
또 다른 제제는 유효량의 본 발명의 IL-1β 결합성 항체, 항체 단편, 핵산 또는 벡터를 정제 제조에 적합한 비-독성 부형제와 혼합하여 포함할 수 있다. 정제를 멸균수 또는 적당한 또 다른 비히클에 용해시킴으로써, 용액을 단위 투여 형태로 제조할 수 있다. 적합한 부형제에는 불활성 희석제, 예를 들어 탄산칼슘, 탄산나트륨 또는 중탄산나트륨, 락토스, 또는 인산칼슘; 또는 결합제, 예를 들어 전분, 젤라틴 또는 아카시아; 또는 윤활제, 예를 들어 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 또는 탈크가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다.
적합하고/하거나 바람직한 제약 제형은 의도한 투여 경로, 전달 형태, 및 목적하는 투여량에 따라서 본 명세서 및 제형 기술에 관한 일반적인 지식 측면에서 결정할 수 있다. 유효 용량은 투여 방식에 상관없이 환자 체중, 체 표면적 또는 기관 크기에 따라서 계산할 수 있다. 본원에 기재된 각각의 제형과 연관된 처치에 적당한 투여량을 결정하기 위한 계산에 관한 추가의 개선은 당해 분야에서 통상적으로 이루어지고, 이는 당해 분야에서 통상적으로 수행된 과제 범위 내에 있다. 적당한 투여량은 적당한 용량-반응 데이터를 사용함으로써 확인할 수 있다.
본 발명의 IL-1β 결합성 항체, 항체 단편, 핵산 또는 벡터를 한 가지 이상의 기타 치료제와 병용해서 포함하는 제형을 포함한 부가의 제형이 본 명세서 관점에서 명백할 것이다. 예를 들어 몇몇 제형에서는, 본 발명의 IL-1β 결합성 항체, 항체 단편, 핵산 또는 벡터를 IL-1 신호 전달 경로의 제2 억제제와 함께 제형화한다. 대표적인 제2 억제제에는 항체, 항체 단편, 펩티드, 폴리펩티드, 화합물, 핵산, 벡터 및 제약 조성물, 예를 들어 US 6899878, US 2003022869, US 20060094663, US 20050186615, US 20030166069, WO/04022718, WO/05084696, WO/05019259에 기재된 것들이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 예를 들어, 조성물은 본 발명의 IL-1β 결합성 항체, 항체 단편, 핵산 또는 벡터를, IL-1β 결합성 항체, 단편, 또는 이러한 항체 또는 단편을 코딩하는 핵산 또는 벡터와 조합하여 포함할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 IL-1β 결합성 항체 또는 단편을 기타 활성제와 조합하여 포함할 수 있다. 이러한 조합물은 그의 의도한 목적에 유용한 것이다. 다음에 제시된 활성제는 예시 목적이고 이들로 제한되지 않는다. 본 발명의 일부인 상기 조합물은 본 발명의 항체 및 단편과, 다음 목록 중에서 선택된 한 가지 이상의 부가 작용제일 수 있다. 조합물에는 또한, 형성된 조성물이 그의 의도한 기능을 수행할 수 있도록 조합된 경우에는 한 가지 이상의 부가 작용제, 예를 들어 2 가지 또는 3 가지 부가 작용제가 포함될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 단편과의 조합물 또는 활성제에는 비스테로이드계 소염 약물 (NSAID), 예를 들어 아스피린, 이부프로펜, 및 기타 프로피온산 유도체 (알미노프로펜, 베녹사프로펜, 부클록스산, 카르프로펜, 펜부펜, 페노프로펜, 플루프로펜, 플루르비프로펜, 인도프로펜, 케토프로펜, 미로프로펜, 나프록센, 옥사프로진, 피르프로펜, 프라노프로펜, 수프로펜, 티아프로펜산, 및 티옥사프로펜), 아세트산 유도체 (인도메타신, 아세메타신, 알클로페낙, 클리다낙, 디클로페낙, 펜클로페낙, 펜클로즈산, 펜티아작, 푸이로페낙, 이부페낙, 이속세팍, 옥스피낙, 술린닥, 티오피낙, 톨메틴, 지도메타신, 및 조메피락), 페남산 유도체 (플루페남산, 메클로페남산, 메페남산, 니플룸산 및 톨페남산), 비페닐카복실산 유도체 (디플루니살 및 플루페니살), 옥시캄 (이속시캄, 피록시캄, 수독시캄 및 테녹시캄), 살리실레이트 (아세틸 살리실산, 설파살라진) 및 피라졸론 (아파존, 베즈피페릴론, 페프라존, 모페부타존, 옥시펜부타존, 페닐부타존)이 포함된다. 기타 조합물에는 시클로옥시게나제-2 (COX-2) 억제제가 포함된다. 조합되는 기타 활성제에는 스테로이드, 예를 들어 프레드니솔론, 프레드니손, 메틸프레드니솔론, 베타메타손, 덱사메타손, 또는 히드로코르티손이 포함된다. 이러한 조합물이 특히 유리할 수 있는데, 이는 본 발명의 항체 및 단편과 병용해서 환자를 치료하는 경우에 요구되는 스테로이드 용량을 점점 감소시킴으로써 스테로이드의 한 가지 이상 부작용을 저하시키거나 심지어 없앨 수도 있기 때문이다.
류마티스성 관절염 치료를 위해 IL-1β 결합성 항체 또는 단편과 병용되는 활성제에 관한 부가 예에는 사이토킨 억제성 소염 약물 (CSAID); 기타 인간 사이토킨 또는 성장 인자, 예를 들어 TNF, LT, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, 또는 PDGF에 대한 항체 또는 그의 길항제가 포함된다. IL-1β 결합성 항체 및 단편은 세포 표면 분자, 예를 들어 CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90, 또는 그들의 리간드 [CD 154 (gp39 또는 CD40L) 포함]에 대한 항체와 병용할 수 있다.
활성제의 바람직한 조합물은 자가면역 및 후속 염증 케스케이드 중의 상이한 시점에서 방해할 수 있고; 바람직한 예에는 TNF 길항제, 예를 들어 키메라, 인간화 또는 인간 TNF 항체, D2E7, cA2 (Remicade™), CDP 571, 항-TNF 항체 단편 (예: CDP870), 및 가용성 p55 또는 p75 TNF 수용체, 그의 유도체 [p75TNFRIgG (Enbrel™) 또는 p55TNFRIgG (Lenercept)], 가용성 IL-13 수용체 (sIL-13), 및 또한 TNFα 전환 효소 (TACE) 억제제가 포함되고; 유사하게 IL-1 억제제 (예: 인터루킨-1-전환 효소 억제제, 예를 들어 Vx740, 또는 IL-1RA 등)가 동일한 이유로 인해 유효할 수 있다. 기타 바람직한 조합물에는 인터루킨 11, 항-P7 및 p-셀렉틴 당단백질 리간드 (PSGL)가 포함된다. 또 다른 조합물은 IL-1β 기능과 평행하게, 이러한 기능에 좌우되어 또는 이러한 기능과 협력하여 작용할 수 있는 자가면역 반응의 기타 주요 플레이어이다.
항체 또는 항원 결합성 부분과 병용될 수 있는 크론병 치료용 활성제에는 TNF 길항제, 예를 들어 항-TNF 항체, D2E7, cA2 (Remicade™), CDP 571, 항-TNF 항체 단편 (예: CDP870), TNFR-Ig 구조물 [p75TNFRIgG (Enbrel™) 및 p55TNFRIgG (Lenercept)], 항-P7, p-셀렉틴 당단백질 리간드 (PSGL), 가용성 IL-13 수용체 (sIL-13), 및 PDE4 억제제가 포함된다. IL-1β 결합성 항체 또는 단편은 코르티코스테로이드, 예를 들어 부데노시드 및 덱사메타손과 병용할 수 있다. IL-1β 결합성 항체 또는 단편은 설파살라진, 5-아미노살리실산 및 올살라신과 같은 작용제; 및 프로-염증성 사이토킨, 예를 들어 IL-1의 합성이나 작용을 방해하는 작용제, 예를 들면 IL-1 전환 효소 억제제 (예: Vx740) 및 IL-1ra와 병용할 수도 있다. IL-1β 결합성 항체 또는 단편은 T 세포 신호 전달 억제제, 예를 들어 티로신 키나제 억제제 6-머캅토퓨린과 함께 사용할 수도 있다. IL-1β 결합성 항체 또는 단편을 IL-11과 병용할 수 있다.
IL-1β 결합성 항체 또는 단편과 병용될 수 있는 다발성 경화증 치료용 활성제에 관한 기타 예에는 코르티코스테로이드; 프레드니솔론; 메틸프레드니솔론; 아자티오프린; 시클로포스파미드; 시클로스포린; 메토트렉세이트; 4-아미노피리딘; 티자니딘; 인터페론-β1a (Avonex; 공급처: Biogen); 인터페론-β1b (Betaseron; 공급처: Chiron/Berlex); 공중합체 1 (Cop-1; Copaxone; 공급처: Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); 고압 (hyperbaric) 효소; 정맥내 면역글로불린; 클라브리빈; 기타 인간 사이토킨 또는 성장 인자, 예를 들어 TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, 및 PDGF에 대한 항체 또는 그의 길항제가 포함된다. IL-1β 결합성 항체 또는 단편은 세포 표면 분자, 예를 들어 CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90, 또는 그들의 리간드에 대한 항체와 병용할 수 있다. IL-1β 결합성 항체 또는 단편은 메토트렉세이트, 시클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코페놀레이트 모페틸, 레플루노미드, NSAID, 예를 들어 이부프로펜, 코르티코스테로이드 (예: 프레드니솔론), 포스포디에스테라제 억제제, 아데노신 작동제, 항혈전제, 보체 억제제, 아드레날린 작동제, 프로-염증성 사이토킨, 예를 들어 TNFα 또는 IL-1에 의한 신호 전달을 방해하는 작용제 (예: IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나제 억제제), IL-1β 전환 효소 억제제 (예: Vx740), 항-P7, p-셀렉틴 당단백질 리간드 (PSGL), TACE 억제제, T-세포 신호 전달 억제제, 예를 들어 키나제 억제제, 메탈로프로테이나제 억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 안지오텐신 전환 효소 억제제, 가용성 사이토킨 수용체 및 그의 유도체 [예: 가용성 p55 또는 p75 TNF 수용체, sIL-1 RI, sIL-1 RII, sIL-6R, 가용성 IL-13 수용체 (sIL-13)] 및 소염성 사이토킨 (예: IL-4, IL-1O, IL-13 및 TGFβ) 등의 작용제와 병용할 수 있다.
IL-1β 결합성 항체 또는 단편과 병용될 수 있는 다발성 경화증 치료용 활성제에 관한 바람직한 예에는 인터페론-β, 예를 들어 IFNβ1 및 IFNβ1b; 코팍손, 코르티코스테로이드, IL-1 억제제, TNF 억제제, 및 CD40 리간드 및 CD80에 대한 항체가 포함된다.
제약 조성물은 본 발명의 치료적 유효량 또는 예방적 유효량의 본 발명의 IL-1β 결합성 항체 또는 단편을 포함할 수 있다. 치료적 유효량은 필요한 투여량 및 시간 동안 목적하는 치료 결과를 달성시키는데 유효한 양을 지칭한다. 상기 항체 또는 항체 일부의 치료적 유효량은 질병 상태, 개개인의 연령, 성별 및 체중, 및 개개인에게서 목적하는 반응을 유도시킬 수 있는 항체 또는 항체 일부의 능력과 같은 요인들에 따라서 다양할 수 있다. 치료적 유효량은 치료적으로 유리한 효과가 항체 또는 항체 일부의 어떠한 독성이나 해로운 효과도 능가하는 것이기도 하다. 예방적 유효량은 필요한 투여량 및 시간 동안 목적하는 예방 결과를 달성시키는데 유효한 양을 지칭한다. 전형적으로, 예방적 용량은 질병이 발병하기 이전에 또는 질병 초기 단계에서 대상체에게 사용되기 때문에, 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 적을 것이다.
본 발명의 IL-1β 결합성 항체, 항체 단편, 핵산 또는 벡터는 단독으로 이용될 수 있거나, 또는 기타 활성제와 병용해서 이용될 수 있는데, 이는 동일한 제약 조성물에 존재하거나 상이한 제약 조성물에 존재할 수 있다. 예를 들어, 이러한 기타 활성제에는 다음이 포함될 수 있다: (i) IL-I 길항제 (예: 재조합 IL-1Ra 또는 IL-trap), (ii) 인터루킨-1 수용체 길항제, (iii) 가용성 TNF 수용체-1, (iv) 가용성 TNF 수용체-2 [예: 에타네르셉트 (etanercept)], (iv) TNF 억제제 (예: D2E7과 같은 항체), 및/또는 (v) 암 요법제. 따라서 예를 들어, 이들 성분 중의 하나 이상이 본 발명의 IL-1β 결합성 항체, 항체 단편, 핵산 또는 벡터와 함께 본 발명의 조성물에 포함될 수 있다.
몇몇 경우에는 본 발명의 IL-1β 결합성 항체, 항체 단편, 핵산 또는 벡터를 포함하는 제약 조성물을 생체외 방식으로 사용하는 것이 요망될 수 있다. 이러한 경우에는, 환자로부터 꺼낸 세포, 조직 또는 기관을 본 발명의 IL-1β 결합성 항체, 항체 단편, 핵산 또는 벡터를 포함하는 제약 조성물에 노출시킨 후, 이러한 세포, 조직 및/또는 기관을 연속해서 환자에게 다시 이식한다.
특정 상황 하에서, IL-1β 결합성 항체, 항체 단편, 핵산 또는 벡터를 포함하는 조성물은 폴리펩티드, 선택적 결합제, 단편, 변이체 또는 유도체를 발현 및 분비시키도록 본원에 기재된 바와 같이 유전 공학적으로 처리시킨 환자 세포 내로 이식함으로써 전달할 수 있다. 이러한 세포는 동물 또는 인간 세포일 수 있고, 환자 자신의 조직으로부터 유래되거나 또 다른 공급원인 인간 또는 비-인간으로부터 유래될 수 있다. 임의로, 상기 세포는 불멸화 세포일 수 있다. 그러나, 면역학적 반응 기회를 저하시키기 위해서는 세포를 피막화시켜 주변 조직의 침윤을 피하는 것이 바람직하다. 피막화 물질은 전형적으로, 단백질 생성물의 방출은 허용하지만 환자의 면역계에 의한 세포 파괴 또는 주변 조직으로부터의 기타 해로운 인자에 의한 세포 파괴를 방지시켜 주는 생체적합성의 반-투과성 중합체성 봉입체 또는 막이다.
세포의 막 피막화를 위해 사용된 방법은 공지되어 있고, 피막화 세포의 제조 및 이를 환자에게 이식하는 방법은, 예를 들어 미국 특허 제4,892,538호, 제5,011,472호 및 제5,106,627호에 기재되어 있다. 살아있는 세포를 피막화하기 위한 시스템은 PCT 공개공보 WO 91/10425에 기재되어 있다. 각종의 기타 지속식 또는 제어식 전달 수단, 예를 들어 리포솜 운반체, 생침식성 입자 또는 비드를 제형화하기 위한 기술은 당해 분야에 또한 공지되어 있고 보고되었다. 피막화를 수반하거나 수반하지 않은 세포를 환자의 적합한 체 조직이나 기관에 이식할 수 있다.
본 발명의 IL-1β 결합성 항체, 항체 단편, 핵산 또는 벡터를 포함하는 제약 조성물의 치료적 또는 예방적 유효량은, 예를 들어 치료 대상, 예를 들면 조성물이 사용되는 적응증, 투여 경로, 및 대상체의 상태에 좌우될 것이다. 제약 조성물은 IL-1 관련 질환을 치료하는데 있어 치료적 또는 예방적으로 유효한 양으로 투여된다. 본 발명의 IL-1β 결합성 항체, 항체 단편, 핵산 또는 벡터의 "치료적 또는 예방적 유효량"은 특정 대상체에게서 IL-1 관련 질환의 한 가지 이상 증상을 치료 또는 예방할 수 있는 양이다.
따라서, 최적의 치료 효과를 획득하는데 요구되는 바 대로 본 발명의 IL-1β 결합성 항체, 항체 단편, 핵산 또는 벡터의 투여량을 적정시키고 투여 경로를 변형시키는 것이 요망될 수도 있다. 투여량 범위에는 상기 언급된 요인들에 따라서 약 0.1 ng/kg 내지 약 100 mg/kg 이상 (활성제가 투여된 대상체의 체중 단위당 활성제의 양을 기준으로 함)이 포함된다. 기타 양태에서는 투여량이 약 0.1 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg, 약 1 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg, 약 5 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg, 약 0.5 mg/kg 내지 약 100 mg/kg 이하, 또는 약 1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg 이하의 범위이다. 기타 투여량이 적당할 수 있다. 조성물은 단일 용량으로서 투여하거나, 또는 시간 경과에 따라 또는 예를 들어, 이식 장치나 카테터를 통하여 연속 주입제로서 2회분 이상 용량으로서 (이는 동일한 양의 본 발명의 IL-1β 결합성 항체, 항체 단편, 핵산 또는 벡터를 함유하거나 함유하지 않을 수 있다) 투여할 수 있다.
사용 방법
본 발명의 항체, 항체 단편, 핵산, 벡터, 세포 및 조성물 (집합적으로 "본 발명의 화합물 및 조성물")은 어떠한 목적으로도 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물 및 조성물을 사용하여 IL-1 관련 기전을 조사할 수 있을 뿐만 아니라 IL-1 관련 기전과 연관된 질병 및 질환을 조사할 수 있다. 그러나, 본 발명의 화합물 및 조성물은 IL-1 관련 질환, 예를 들어 자가면역 또는 염증 질병 또는 장애를 치료할 필요가 있는 대상체 (예: 포유류 또는 인간)를 치료하는데 특히 유용하다. 따라서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체 또는 항체 단편, 핵산 또는 벡터를, 이를 필요로 하는 포유류에게 투여함으로써 이러한 포유류에게서 질환을 치료 또는 예방하는 것을 포함하는, 상기 포유류에게서 해당 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 용어 "유효량"은 예방 또는 치료 효과를 확립시키는데 필요한 본 발명의 항체 또는 항체 단편, 핵산 또는 벡터의 양을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 특정 질병이나 질환을 치료하는 것은 이러한 질병이나 질환의 증상 또는 진행을 일시적 또는 영구적으로 저하시키거나 없애는 것으로서 정의된다. 유사하게, 특정 질병이나 질환을 예방하는 것은 이러한 질병이나 질환 (또는 질병이나 질환 증상) 발병을 일시적 또는 영구적으로 억제하거나, 느리게 하거나 또는 예방하는 것을 의미한다.
본 발명의 방법을 사용하여 모든 IL-1 관련 질병 또는 질환을 치료 또는 예방할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 및 단편은 IL-1 매개된 질병 또는 의학적 질환, 예를 들어 염증 질환, 알레르기 및 알레르기성 질환, 암, 과민증 반응, 자가면역 질환, 중증 감염, 및 장기 또는 조직 이식 거부를 예방 및 치료하는데 사용하도록 고려된다. IL-1 관련 질환에는 류마티스성 관절염 (RA), 골관절염, 크론병, 궤양성 결장염 (UC), 패혈성 쇼크, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 천식, 이식편 대 숙주 질병, 아테롬성 경화증, 성인 T 세포 백혈병, 다발성 골수종, 다발성 경화증, 뇌졸중, 알츠하이머병 (Alzheimer's disease)이 포함된다. 본 발명의 항체 및 단편을 또한 사용하여 신생아 발병 다기관 염증 장애 (NOMID/CINCA), 전신 발병 유년성 특발성 관절염, 스틸 병 (Stills disease), CAPS, 또는 머클-웰스 (Muckle-Wells) 증후군을 치료 또는 예방할 수 있다.
일반적으로, 특정 질병 또는 질환은 이것이 체액이나 조직에서 상승 수준의 IL-1β와 연관이 있는 경우, 또는 신체로부터 취한 세포 또는 조직이 배양 하에 상승 수준의 IL-1β를 생성시키는 경우에는 IL-1β 관련 질병 또는 질환으로서 간주될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 방법을 사용하여 신생아 발병 다기관 염증 장애 (NOMID/CINCA), 전신 발병 유년성 특발성 관절염, CIASI 관련 주기성 증후군 (CAPS), 스틸 병, 또는 머클-웰스 증후군을 치료 또는 예방할 수 있다.
또 다른 예로서, 본 발명의 방법을 사용하여 류마티스성 관절염, 골관절염, 크론병, 궤양성 결장염, 패혈성 쇼크, 만성 폐쇄성 폐 질환, 천식, 이식편 대 숙주 질병, 아테롬성 경화증, 성인 T 세포 백혈병, 다발성 골수종, 다발성 경화증, 뇌졸중 또는 알츠하이머병을 치료 또는 예방할 수 있다.
또 다른 예로서, 본 발명의 방법을 사용하여 전신 발병 유년성 특발성 관절염, 류마티스성 관절염, 골관절염, 아테롬성 경화증, 또는 중증 근무력증을 치료 또는 예방할 수 있다.
IL-1β 관련 질환의 기타 예는 급성 췌장염; ALS; 악액질/식욕부진 (AIDS-유도된 악액질 포함); 천식 및 기타 폐 질환; 자가면역성 혈관염; CIAS1 관련 주기적 증후군 (CAPS); 만성 피로 증후군; 클로스트리듐 (Clostridium) 관련 질병 (클로스트리듐-관련 설사 포함); 관상 질환 및 적응증, 예를 들어 울혈성 심부전증, 관상 재발 협착증, 심근 경색, 심근 기능이상 (예를 들어, 패혈증과 연관됨), 및 관상 동맥 우회로술 이식; 암, 예를 들어 다발성 골수종, 및 골수성 백혈병 (예: AML 및 CML) 및 기타 백혈병 뿐만 아니라 종양 전이; 당뇨병 (예: 인슐린 당뇨병); 자궁내막증; 가족성 한랭 자가염증 증후군 (FCAS); 가족성 지중해 열 (FMF); 발열; 섬유근육통; 사구체신염; 이식편 대 숙주 질병/이식조직 거부; 출혈성 쇼크; 통각과민; 염증성 장 질환; 관절의 염증 질환, 예를 들어 건선성 관절염 (뿐만 아니라 골관절염 및 류마티스성 관절염); 예를 들어, 각막 이식과 연관될 수 있는 바와 같은 염증성 안과 질환; 허혈증, 예를 들어 뇌 허혈증 (예: 각각 신경변성을 유발시킬 수도 있는 외상, 간질, 출혈 또는 뇌졸중으로 인한 뇌 손상); 가와사키병 (Kawasaki's disease); 학습 장애; 폐 질환 (예: ARDS); 근육병증 (예: 특히 패혈증에서의 근육 단백질 대사); 신경독성 (예를 들어, HIV에 의해 유도된 바와 같음); 골다공증; 통증, 예를 들어 암 관련 통증; 파킨슨병 (Parkinson's disease); 치주 질환; 조기 분만; 건선; 재관류 손상; 방사선 요법으로 인한 부작용; 수면 장애; 측두 하악 관절 질병; 종양 괴사 인자 수용체 관련 주기적 발열 증후군 (TRAPS); 포도막염; 또는 긴장, 염좌, 연골 손상, 외상, 정형외과적 수술, 감염 또는 기타 질병 과정으로부터 비롯되는 염증 질환이다.
본 발명의 항체 및 단편은 또한, 심장, 폐, 심장-폐 동시, 간, 신장, 췌장, 피부 또는 각막 이식조직 수용자를 치료하는데, 예를 들어 동종이식편 거부 또는 이종이식편 거부를 치료하는데 사용하거나, 또는 이식편-대-숙주 질병, 예를 들어 골수 이식 후 또는 장기 이식 관련 동맥경화증을 예방하기 위해 고려된다.
본 발명의 항체 및 단편은 자가면역 질환 또는 염증 질환, 특히 자가면역 성분을 포함한 병인론을 수반한 염증 질환, 예를 들어 관절염, 예를 들면 류마티스성 관절염, 만성 진행성 관절염, 및 골 손실, 염증성 통증, 과민증(기도 과민증과 피부 과민증 둘 다 포함) 또는 알레르기와 관련된 염증 질환 및 류마티스성 질환을 포함한 관절염 및 류마티스성 질환을 치료 또는 예방하는데 사용하는 것으로 고려된다. 본 발명의 항체 및 단편을 이용할 수 있는 구체적인 자가면역 질환에는 자가면역성 혈액학적 장애 (예를 들어, 용혈성 빈혈, 재생불량성 빈혈, 진성 적혈구계 빈혈 및 특발성 혈소판감소증 포함), 전신성 홍반성 루푸스, 다발성 연골염, 피부경화증, 베게너 (Wegener) 육아종증, 만성 활동성 간염, 중증 근무력증, 건선, 스티븐-존슨 (Steven-Johnson) 증후군, 특발성 스프루 (sprue), 자가면역성 염증성 장 질환 (예를 들어, 궤양성 결장염, 크론병, 및 과민성 대장 증후군 포함), 내분비계 그레이브병 (Graves disease), 사르코이드증, 다발성 경화증, 원발성 담즙성 간경변, 유년성 당뇨병 (당뇨병 유형 I), 포도막염 (전방 및 후방), 건성 각막결막염 및 춘계 각막결막염, 간질성 폐 섬유증, 건선성 관절염 또는 사구체신염 (예를 들어 특발성 신 증후군 또는 미소 변화형 신병증을 포함한 신 증후군을 수반하거나 수반하지 않음)이 포함된다.
본 발명의 항체 및 단편은 또한, 천식, 기관지염, 진폐증, 폐기종, 및 기도의 기타 폐쇄성 또는 염증성 질환을 치료, 예방 또는 개선시키는데 사용하도록 고려된다. 본 발명의 항체 또는 단편은 IL-1에 의해 매개되거나 또는 IL-1에 의한 TNF 방출 생성 또는 특히 방출 증진과 관련이 있는 바람직하지 못한 급성 및 초급성 염증 반응, 예를 들어 급성 감염, 예를 들면 패혈성 쇼크 (예: 내독성 쇼크 및 성인 호흡 곤란 장애), 수막염, 폐렴 및 중증 화상을 치료하고; 감염, 암 또는 기관 기능이상에 따른 병적 TNF 방출과 연관된 소모 증후군 또는 악액질, 특히 예를 들어 HIV 감염과 연관되거나 이러한 감염에 간접적인 AIDS 관련 악액질을 치료한다.
본 발명의 항체 및 단편은 또한, 골 대사 질환, 예를 들어 골관절염, 골다공증 및 기타 염증성 관절염, 및 일반적 골 손실, 예를 들어 연령 관련 골 손실, 및 특히 치주 질환을 치료하는데 사용하는 것으로 고려된다.
본 발명의 항체 및 단편은 또한, CIAS1 관련 주기적 증후군 (CAPS), 예를 들어 신생아 발병 다기관 염증 장애 (NOMID), 머클-웰스 증후군 (MWS), 및 가족성 한랭 자가염증 증후군 (FCAS)을 치료 또는 예방하는데 사용하는 것으로 고려된다. 유전자 CIAS1 상의 돌연변이는 다음 세 가지 희귀한 유전적 증후군에 대해 책임이 있는 것으로 현재 인식되고 있다: 신생아 발병 다기관 염증 장애 (NOMID), 머클-웰스 증후군 (MWS), 및 가족성 한랭 자가염증 증후군 (FCAS) [참고: Hoffman et al. 2001 Naure 29:301-305; Feldmann et al. 2002 Am J Hum Genet 71:198-203; Aksentijevich et al. 2002 Arthritis Rheum 46:3340-3348]. 응집체에서는 이들 질환이 "CAPS"로서 공지되어 있다. CIAS1은 카스파제 1의 활성을 조절하는 아세포성 효소 복합체인 "인플라마솜 (inflammasome)"의 한 성분인 NALP3으로 지칭된 단백질을 코딩한다. 카스파제 1은 불활성 프로-형태의 프로-염증성 사이토킨 IL-1을 절단시켜 그의 생물학적 활성 형태로 만드는 효소이다 [Agostini et al. 2004 상기 참고]. CIAS1 상의 돌연변이로 인해 IL-1 생성이 증가한다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편, 핵산 또는 벡터는 전형적으로, 이러한 본 발명의 항체 또는 항체 단편, 핵산 또는 벡터와 제약상 허용 가능한 담체를 포함하는 제약 조성물로서 포유류 또는 인간에게 투여한다. 질환을 치료 또는 예방하는 방법과 연계해서 사용하는데 적합한 제약 조성물은 앞서 본원에 기재된 바와 같다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편, 핵산 또는 벡터는 단독 활성제로서, 또는 IL-1 수용체 신호 전달을 붕괴시키는 한 가지 이상의 기타 작용제와 연계해서 포유류에게 투여할 수 있다. IL-1 수용체 신호 전달을 붕괴시키는 작용제는 IL-1β와 IL-1 수용체 간의 상호 작용을 억제시키는 모든 화합물 또는 조성물일 수 있다. 예를 들어, IL-1 수용체 신호 전달을 붕괴시키는 작용제에는 IL-1β 또는 IL-1 수용체와 결합하는 항체, 재조합 IL-1Ra (공급처: 예를 들어, Amgen Inc., Thousand Oaks, CA), 및 IL-1 수용체 "포착" 펩티드 (공급처: 예를 들어, Regeneron Inc., Tarrytown, NY)가 포함된다. IL-1 수용체 신호 전달을 붕괴시키는 2가지 이상의 작용제를 사용하는 경우에는, 이들을 함께 투여하거나 (예를 들어, 단일 제약 조성물 내에 포함시킨다) 또는 각각 개별적으로 투여할 수 있다 (예를 들어, 별개의 제약 조성물 내에 포함시킨다).
본 발명의 항체, 단편, 핵산 또는 벡터는 상기 제시된 바와 같은 IL-1 매개된 질환 또는 질병을 치료 또는 예방하기 위한 한 가지 이상의 기타 활성제와 병용해서 또는 연계해서 포유류에게 투여할 수 있다.
진단 용도
치료 용도 이외에도, 본 발명의 항체 및 단편은 통상적인 면역검정, 예를 들어 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA), 방사성 면역검정 (RIA) 또는 조직 면역조직화학을 사용하여 (예를 들어, 혈청 또는 혈장과 같은 생물학적 샘플 중에서) IL-1β을 탐지하기 위한 진단 방법에 사용할 수 있다. 생물학적 샘플 중에서 IL-1β를 탐지하는 방법은 생물학적 샘플을 하나 이상의 본 발명의 항체 또는 단편과 접촉시키는 단계; 및 IL-1β와 결합된 항체 또는 단편, 또는 결합되지 않은 항체 또는 단편을 탐지함으로써, 생물학적 샘플 중에서 IL-1β를 탐지하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 항체 또는 단편을 검출 가능한 물질로 직접 또는 간접적으로 표지시켜 결합되거나 결합되지 않은 항체의 탐지를 용이하게 할 수 있다. 검출 가능한 적합한 물질에는 각종 효소, 보결 분자단, 형광성 물질, 발광성 물질 및 방사성 물질이 포함된다. 적합한 효소의 예에는 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제가 포함되고; 적합한 보결 분자단 복합체의 예에는 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴이 포함되며; 적합한 형광성 물질의 예에는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린이 포함되고; 발광성 물질의 예에는 루미놀이 포함되며; 적합한 방사성 물질의 예에는 125I, 131I, 35S 또는 3H이 포함된다.
항체를 표지시키는 것보다는 오히려, IL-1β를 검출 가능한 물질로 표지시킨 IL-1β 표준과 표지시키지 않은 항-IL-1β 항체를 활용하는 경쟁 면역검정에 의해 생물학적 유체에서 검정할 수 있다. 이러한 검정에서는, 생물학적 샘플, 표지시킨 rIL-1β 표준 및 항-IL-1β 항체를 합하고, 표지시키지 않은 항체와 결합된 표지시킨 IL-1β 표준의 양을 결정한다. 생물학적 샘플 중에서의 IL-1β의 양은 항-IL-1β 항체와 결합된 표지시킨 IL-1β 표준 양에 반비례한다.
실시예
다음 실시예는 본 발명을 추가로 예시하고 있지만, 그의 범위가 어떠한 방식으로든 본 실시예에 의해 제한되지 않아야 한다.
다음 실시예에서는 AB1, AB5, 및 AB7로 지정된 항체를 포함한 본 발명의 각종 항체를 참고로 하였다. 상기 언급된 바와 같이, AB1은 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. AB5는 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. AB7은 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
다음 실시예에서 다양하게 비교하기 위해, IL-1β에 대한 친화도가 비교적 높은 시판용 항체인 AB-대조군 항체를 참고하였다. AB-대조군은 서열 40의 서열을 포함하는 중쇄와 서열 41의 서열을 포함하는 경쇄를 갖는 것으로 여겨지는 뮤린 항체이다. 이들 뮤린 서열은 미국 특허 공개공보 제2003/0026806호의 도 6A 및 6B에 제시되어 있다.
다음 몇 가지 실시예에서는, AB5 및 AB7이 AB-대조군보다 인간 IL-1β에 대한 예상치 못하게 높은 친화도를 나타내는 것으로 밝혀졌다.
실시예 1
본 실시예는 IL-1β에 대한 본 발명의 특정 항체의 결합 친화도를 예시하고 있다.
AB1 및 AB5로 지정된 항체를 대상으로 하여 KINEXA™ 장치 (공급처: Sapidyne Instruments Inc., Boise, ID)를 사용하여 IL-1β 결합 특성에 관하여 검정하였다. 항체 AB1 및 AB5의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 도 2 및 3에 제공되었다. 비교를 위해, IL-1β에 대한 친화도가 비교적 높은 시판용 항체 (본원에서의 AB-대조군)를 검정하였다.
IL-1β 결합 검정 결과가 표 1에 요약되었다. KD 값은 각각의 항체-IL-1β 복합체에 대한 결합 해리 상수를 나타낸다. KD는 "이탈 속도" (항체-IL-1β 복합체에 대한 해리 속도) 대 "작동 속도" (항체-IL-1β 복합체에 대한 연합 속도)의 비율로서 계산하였다. 보다 낮은 KD 비율은 항체 친화도가 보다 높다는 지표이다.
IL-1β 결합성 결과
항체 KD (pM)
AB-대조군 3.06
AB1 (본 발명) 18.63
AB5 (본 발명) 0.261
이들 실험 결과는 AB1 및 AB5가 IL-1β와 고 친화도로 결합한다는 것을 나타낸다. 본 발명의 항체의 IL-1β에 대한 친화도는 IL-1β에 대한 AB-대조군의 결합 친화도와 거의 동등한 수준이거나 보다 우수하였다.
실시예 2
본 실시예는 본 발명의 항체를 사용한 IL-1β의 시험관내 억제를 예시하고 있다.
인간 섬유아세포로부터의 IL-1β 자극된 IL-6 방출을 측정하는 생물학적 검정을 사용하여 AB1 및 AB5 항체 (실시예 1 참고)의 IL-1β 억제 효력을 평가하였다. 실시예 1에서와 같이, AB-대조군을 비교 샘플로서 사용하였다. 이러한 검정에 관한 상세 내역이 다음 문헌에 기재되었다 [참고: Dinarello et al., Current Protocols in Immunology, Ch. 6.2.1-6.2.7, John Wiley and Sons Inc., Hoboken, NJ, 2000]. 간단하게 설명하면, 인간 MRC5 인간 섬유아세포 [공급처: American Type Culture Collection (ATCC) Manassas, VA] (ATCC #CCL-171)를 다중-웰 판에서 밀집되게 성장시켰다. 세포를 적정 용량의 AB5 항체로 처리하였다. 세포를 연속해서, (i) 100 pg/ml의 IL-1β 또는 (ii) 100 pg/ml의 IL-1β 및 AB1 또는 AB5 항체 (실시예 1로부터 공급됨)와 접촉시켰다. 음성 대조군 세포는 IL-1β로 자극하지 않았다. 각 군의 처리시킨 세포에서 방출된 IL-6의 양은 제조업자의 지시에 따라서 IL-6 ELISA 키트 [공급처: BD Pharmingen (Franklin Lakes, NJ)]를 사용하여 측정하였다. ELISA 결과가 도 5에 도시되었고 표 2에 요약되었다. IC50은 IL-1β 자극에 의해 방출된 IL-6을 50% 억제시키는데 요구되는 항체의 농도이다.
ELISA 결과
항체 IC50 (nM)
AB-대조군 0.017
AB1 (본 발명) 0.15
AB5 (본 발명) 0.014
이들 결과는 IL-1β를 억제할 수 있는 본 발명의 항체의 시험관내 효력을 입증해준다. 더우기, MRC5에서 IL-1β-자극된 사이토킨 방출 억제가 생체 내에서 IL-1 매개된 활성을 억제할 수 있는 작용제의 능력과 상관이 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이들 결과는 본 발명의 항체가 생체 내에서 IL-1β 억제 효능을 지닐 것이란 사실을 나타낸다.
실시예 3
본 실시예는 본 발명의 항체를 사용한 IL-1β의 생체내 억제를 예시하고 있다.
AB5의 생체내 효능을 확증하기 위해, 인간 IL-1β의 생물학적 활성을 차단시킬 수 있는 그의 능력을 마우스에서 시험하였다. 이러한 검정에 관한 상세 내역이 다음 문헌에 기재되었다 [참고: Economides et al., Nature Med., 9: 47-52 (2003)]. 간략하게 설명하면, 숫컷 C57/B16 마우스 (공급처: Jackson Laboratory Bar Harbor, Maine)에게 적정 용량의 AB5 (실시예 1), AB-대조군 (실시예 1) 또는 대조군 IgG (공급처: Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)를 복강내 주사하였다. 항체 주사한지 24시간 후에, 마우스에게 재조합 인간 IL-1β (rhIL-1β) (공급처: PeproTech Inc., Rocky Hill, NJ)를 1 ㎍/kg의 용량으로 피하 주사하였다. rhIL-1β 주사한지 2시간 후에 (피크 IL-6 반응 시간), 마우스를 희생시키고, 혈액을 수집하여 혈청용으로 가공 처리하였다. 혈청 IL-6 수준을 제조업자의 프로토콜에 따라서 ELISA (공급처: BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ)에 의해 검정하였다. 억제율 (%)은 실험용 동물 혈청에서 탐지된 IL-6 대 대조군에서 탐지된 IL-6의 비율 (X 100)로부터 계산하였다.
그 결과가 도 6에 제시되었다. IL-1β의 생체내 활성을 억제할 수 있는 능력은 혈청 중에서 IL-1β 자극된 IL-6 수준의 함수로서 평가하였다. 도 6에 예시된 바와 같이, AB5 항체는 인간 IL-1β의 생체내 활성을 억제하는데 있어 효과적이긴 하지만, AB-대조군보다 더 효과적이진 않았다. 3 ㎍의 AB5는 본 검정에서 10 ㎍의 AB-대조군과 동일한 수준으로 효과적이었다.
따라서, 이러한 결과는 시험된 항체가 생체 내에서 IL-1β 활성을 억제하는데 유용하다는 지표이다. 이들 결과는 또한, AB5를 단일 주사하는 것이 장기간에 걸쳐 IL-1β 자극에 대한 전신 작용을 차단시킬 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 4
다음 실시예는 본 발명에 따르는 항체의 제조 방법이 예시되어 있다.
문헌 [참고: Studnicka et al., Protein Engineering, 7: 805-814 (1994), 및 미국 특허 제5,766,886호, 제5,770,196호, 제5,821,123호 및 제5,869,619호, 및 PCT 공개공보 WO 93/11794]에 기재된 바와 같은 HUMAN ENGINEERING™ 기술을 사용하여 인간 유전자조작한 수 많은 항체 서열을 생성시켰다. 이로써 생성된 인간 유전자조작 항체 서열에는 AB5.1, AB5.2, AB5.3 및 AB5.4가 포함된다. 도 3 및 4에 도시된 바와 같이, 이들 서열 각각은 X1 및 X2로써 표시된 CDR-3H 영역 내의 2개의 가변 위치를 포함하고 있다. 따라서, 이들 인간 유전자조작 항체 각각의 특정 예에서, CDR3의 X1과 X2는 각각, 알라닌과 아르기닌, 발린과 아르기닌, 페닐알라닌과 아르기닌, 리신과 리신, 또는 아스파라긴과 아르기닌에 상응한다.
실시예 5
AB5 및 AB7 (인간 유전자조작 항체 서열)로 지정된 항체를 대상으로 하여, 실시예 1에 기재된 바와 유사한 방식으로 KINEXA™ 장치 상에서 수행된 역학 배제 검정을 사용하여 IL-1β 결합 특성에 관하여 검정하였다. KINEXA™ 장치에 관한 부가의 설명과 항체 성상 확인에 위한 작동법이 제조업자로부터 입수 가능하고 공개 문헌 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제6,664,114호 (Sapidyne, Inc.); and Darling et al., "Kinetic Exclusion Assay Technology: Characterization of Molecular Interactions." ASSAY and Drug Development Technologies, 2004, 2, 647-657]에 보고되었다. KINEXA™ 장치는 역학 배제 검정을 수행하고, 데이터를 각종 이론적 곡선에 고정시키므로, KD 뿐만 아니라 기타 특성, 예를 들어 KD에 대한 95% 신뢰 간격을 결정해준다. KINEXA™ 장치는 일반적으로, 해리 상수 및 이탈 속도와 같은 친화도 특징을 분석하는데 있어 기타 장치 (예를 들어, BiaCore 장치) 보다 더 민감하다.
AB5 및 AB7의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 도 3 및 4A에 각각 제공되었다. IL-1β 결합 검정 결과는 표 3에 요약되었다. 실시예 1에서와 같이, KD는 "이탈 속도" 대 "작동 속도" 의 비율로서 계산하였고, 보다 낮은 KD 비율은 항체 친화도가 보다 높다는 지표이다.
항체 KD (pM)
AB5 0.24
AB7 0.30
이들 실험 결과는 AB5 (실시예 1에서 관찰된 결과에 부합된다) 및 AB7이 예상치 못하게 높은 친화도로 IL-1β와 결합하다는 것을 보여주는데, 이는 그들의 해리 상수에 대한 예상치 못하게 낮은 값으로써 나타낸다.
도 7, 8 및 9는 KINEXA 분석을 사용하여 각각에 대한 한 가지 대표적 실험으로부터 결정된 바와 같이, AB1, AB5 및 AB7로 각각 지정된 항체의 결합 친화도를 도시한 것이다. 도 7은 표 1에 제시된 결과를 반영하고 있는 반면, 도 8 및 9는 표 3에 제시된 결과를 반영하고 있다.
표 3에 제시된 값 이외에도, KINEXA 검정 결과는 또한, 낮은 및 높은 95% 신뢰 간격 (KD-저 및 KD-고)을 표시한다. AB5의 경우, KD-저는 0.07 pM이고, KD-고는 0.72 pM이었다. AB7의 경우, KD-저는 0.11 pM이고, KD-고는 0.74 pM이었다.
유사한 KD-저 및 KD-고 값이 실시예 1에 제시된 검정에서 밝혀졌다. AB-대조군의 경우, KD-저는 1.61 pM이고, KD-고는 5.23 pM이었다. AB1의 경우, KD-저는 13.38 pM이고, KD-고는 24.84 pM이었다. AB5의 경우, KD-저는 0.11 pM이고, KD-고는 0.56 pM이었다.
KINEXA 검정 결과는 AB5 및 AB7이 AB-대조군보다 예상치 못하게 낮은 해리 상수를 지닌다는 것을 나타낸다.
실시예 6
본 실시예는 IL-1β 자극된 IL-6 방출의 시험관내 억제를 예시하고 있다. 본 발명의 몇 가지 항체를 대상으로 하여, 인간 섬유아세포로부터의 IL-1β 자극된 IL-6 방출을 억제하기 위한 IC50을 다음과 같이 검정하였다.
인간 섬유아세포로부터의 IL-1β 자극된 IL-6 방출을 측정하는 생물학적 검정을 사용하여, 실시예 2에 기재된 바와 유사한 방식으로 AB5 및 AB7의 IL-1β 억제 효력을 평가하였다. 도 10 내지 12는 각종 항체에 대한 개개의 검정에 관한 결합 곡선을 도시한 것이다. 도 10은 AB1, AB2 및 AB3으로 지정된 항체에 의한 인간 섬유아세포로부터의 IL-6 방출 억제를 도시한 것이고, 이들 3가지 개별적 검정 결과는 AB1의 IC50이 0.029 nM (29 pM)이고, AB2의 IC50이 0.076 nM (76 pM)이며, AB3의 IC50이 0.214 nM (214 pM)이란 것을 표시하였다. 도 11은 부가의 검정에서 AB1 및 AB7로 지정된 항체에 의한 인간 섬유아세포로부터의 IL-6 방출 억제를 도시한 것이다. 도 12는 AB5 및 AB7로 지정된 항체 뿐만 아니라 시판용 키네레트 (Kineret®)에 의한 인간 섬유아세포로부터의 IL-6 방출 억제를 도시한 것이다. 그 결과는 해당 검정에서의 IC50 결정치를 근거로 하여, AB5 및 AB7이 IL-1β를 억제하는데 있어서 키네레트보다 실질적으로 더 우수한 효력을 지니고 있다는 것을 나타내었다. 키네레트는 체내에서 발견된 인터루킨-1 수용체 길항제 (IL-1ra)로 불리우는 천연 발생적 단백질과 유사한 합성 단백질이다. 도 10 내지 12는 본 발명의 항체를 사용하지 않는 경우의 IL-6의 억제율 (%) 측면에서 본 발명의 항체 또는 키네레트의 효력에 관한 개별적 검정 결과를 도시한 것이고, 표 4는 이들 개별적 검정으로부터 계산된 IC50을 나타낸다. IC50은 IL-1β 자극에 의해 방출된 IL-6을 50% 억제시키는데 요구되는 항체 또는 키네레트의 농도이다.
항체 IC50 (nM)
AB5 0.0049 (4.9 pM)
AB7 0.0044 (4.4 pM)
키네레트 0.0454 (45.4 pM)
표 2 및 4에 보고되고 도 6, 10, 11 및 12에 도시된 개별적 검정 결과 이외에도, 기타 개별적 검정을 AB1, AB7 및 AB-대조군 각각에 대해 수행하였다. 개별적 검정 결과로부터 평균 IC50을 계산할 수 있다. AB1에 대한 평균 IC50 66.7 pM은 개별적 검정 결과 35 pM, 30 pM, 150 pM (이 값은 표 2에 또한 제시되었다), 및 52 pM으로부터 계산하였다. AB7에 대한 평균 IC50 5.6 pM은 개별적 검정 결과 7.3 pM, 4.2 pM, 4.5 pM, 4.4 pM (이 값은 표 4에 또한 제시되었다), 6.0 pM, 5.0 pM, 및 7.8 pM으로부터 계산하였다. AB-대조군에 대한 평균 IC50 8.9 pM은 개별적 검정 결과 5.0 pM, 17.0 pM (이 값은 표 2에 또한 제시되었다), 및 4.9 pM으로부터 계산하였다.
이들 결과는 IL-1β를 억제할 수 있는 AB1, AB5 및 AB7의 시험관내 효력을 입증하였다. 더우기, 인간 섬유아세포에서 IL-1β-자극된 사이토킨 방출 억제가 생체 내에서 IL-1 매개된 활성을 억제할 수 있는 억제제의 능력과 상관이 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이들 결과는 본 발명의 항체가 생체 내에서 IL-1β 억제 효능을 지닐 것이란 사실을 나타낸다.
실시예 7
본 실시예는 IL-1β 결합성 항체를 사용한 IL-1β의 생체내 억제를 예시하고 있다.
AB5, AB1 및 AB7의 생체내 효능과, 인간 IL-1β의 생물학적 활성을 차단시킬 수 있는 그들의 능력을 실시예 3에 기재된 바와 유사한 방식으로 마우스에서 시험하였다. AB5 및 AB1 시험 결과는 도 13에 제시되었고, AB5 및 AB7 시험 결과는 도 14에 제시되었다. IL-1β의 생체내 활성을 억제할 수 있는 능력은 혈청 중에서 IL-1β 자극된 IL-6 수준의 함수로서 평가하였다. 도 13 및 14에 예시된 바와 같이, AB1, AB5 및 AB7 항체는 인간 IL-1β의 생체내 활성을 억제하는데 있어 유효하였다.
이들 결과는 시험된 항체가 생체 내에서 IL-1β 활성을 억제하는데 유용하다는 사실을 나타낸다.
실시예 8
본 실시예는 본 발명에 따르는 적어도 몇몇 IL-1β 결합성 항체가 인간 이외의 몇몇 포유류로부터의 IL-1β와 교차 반응성이고 기타 비-인간 포유류로부터의 IL-1β와는 교차 반응성이 아니란 사실을 예시하고 있다. AB7로 지정된 항체 (인간 IL-1β와 고 친화도로 결합하는 항체)를 대상으로 하여 비-인간 포유류, 즉 붉은털 원숭이, 시노몰구스 원숭이, 개, 기니아 피그 및 토끼로부터의 IL-1β와 결합하는 것에 관해 검정하였다.
붉은털 원숭이, 시노몰구스 원숭이, 개, 기니아 피그 및 토끼로부터의 헤파린 처리시킨 신선한 전혈을 공급처 (Charles River Labs)로부터 수득하였다. 이 전혈을 피콜 (Ficoll) 밀도 구배 원심분리에 의해 격리시키고, 말초혈 단핵 세포 (PBMC)를 분리하였다. 각 종의 PBMC에 대해, 2.5xlO5개 세포/ml를 50 ng/ml 지질다당류 LPS (이. 콜라이 O55:B5)를 수반하는 말초 RPMI 배지와 이를 수반하지 않는 배지에서 항온 배양하고, 상등액을 자극 후 24시간 째에 수집하였다. LPS는 PBMC에 의한 IL-1β 생성을 자극하기 위한 것이다. 2 ml의 각 상등액을 2 ㎍의 AB7과 함께 3시간 동안 항온 배양한 다음, 50 ㎕의 단백질 A-세파로스 비드 슬러리를 부가하여 AB7/IL-1β 복합체를 면역침전시켰다. 인간 IL-1β (공급처: Peprotech)를 RPMI 내로 스파이킹하고 면역침전/웨스턴 블롯 대조군으로서 수행하였다. 상기 단백질 A-세파로스 비드를 원심분리 및 세척한 후, 모든 샘플을 SDS-PAGE 겔 상으로 부하하고 120 V 하에 1시간 동안 수행하였다. 22 V에서 밤새 임모빌론 (Immobilon)-P 막으로 이전시키고 5% 탈지유로 차단시킨 후, AB7을 상기 막과 함께 2시간 동안 2 ㎍/ml으로 항온 배양하였다. 세척 단계 후 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)와 접합시킨 이차 염소 항-인간 IgG 항체를 가하고, 1 단계 테트라메틸 벤지딘 (TMB) 용액을 사용하여 탐지하였다.
도 15 및 16은 이러한 과정으로부터 수득한 웨스턴 블롯을 도시한 것이다. 도 15에 도시된 블롯의 좌측 (레인 1-3)은 각종 양 (5 ng, 10 ng, 및 20 ng)의 인간 IL-1β를 RPMI 배지에 가한 대조군이다. 블롯의 바닥 근처에서는, 대략 17 kDa의 분자량에 상응하는 영역에서 각각의 레인에 밴드가 관찰될 수 있다. 이들 밴드는 AB7이 인간 IL-1β와 결합한다는 지표이다. 중간 레인 (레인 4)은 RPMI 배지이다. 도 15에 도시된 블롯의 우측 (레인 5-8)에는 시노몰구스 원숭이 및 붉은털 원숭이로부터의 샘플에 대한 결과가 도시되었다. 레인 5 및 6은 각각 LPS를 수반하지 않은 시노몰구스 원숭이 샘플 및 50 ng LPS가 RPMI 배지에 부가된 시노몰구스 원숭이 샘플이다. 레인 7 및 8은 각각 LPS를 수반하지 않은 붉은털 원숭이 샘플 및 50 ng LPS가 RPMI 배지에 부가된 붉은털 원숭이 샘플이다. 웨스턴 블롯의 바닥 근처에서는, 대략 17 kDa의 분자량에 상응하는 영역에서 레인 6 및 8 (LPS가 부가된 샘플)에 밴드가 관찰될 수 있다. 레인 6 및 8에서의 이들 밴드는 AB7과 영장류 IL-1β, 즉 시노몰구스 원숭이 및 붉은털 원숭이로부터의 IL-1β과의 교차 반응성의 지표이다.
도 16은 대조군, 및 개, 기니아 피그 및 토끼의 PBMC로부터의 샘플에 대한 웨스턴 블롯을 도시한 것이다. 도 16에 도시된 블롯의 좌측 (레인 1-4)은 각종 양 (5 ng, 10 ng, 50 ng 및 200 ng)의 인간 IL-1β를 RPMI 배지에 가한 대조군이다. 블롯의 바닥 근처에서는, 대략 17 kDa의 분자량에 상응하는 영역에서 각각의 레인에 밴드가 관찰될 수 있다. 이들 밴드는 AB7이 인간 IL-1β와 결합한다는 지표이다. 도 16의 레인 5는 RPMI 배지이다. 레인 6-8은 각각 LPS를 수반하지 않고, 50 ng LPS를 수반하고, 200 ng LPS를 수반하는 개 PBMC로부터의 샘플에 대한 결과이다. 레인 9 및 10은 각각 LPS를 수반하지 않고, 50 ng LPS를 수반하는 기니아 피그 PBMC로부터의 샘플에 대한 결과이다. 레인 11 및 12는 각각 LPS를 수반하지 않고, 50 ng LPS를 수반하는 토끼 PBMC로부터의 샘플에 대한 결과이다. 웨스턴 블롯의 바닥 근처에서는, 대략 17 kDa의 분자량에 상응하는 영역에서 레인 7, 8 및 12 (LPS가 부가된 개 및 토끼 샘플)에 밴드가 관찰될 수 있다. 레인 7, 8 및 12에서의 이들 밴드는 AB7과 개 IL-1β 및 토끼 IL-1β과의 교차 반응성의 지표이다. 레인 10 (50 ng LPS가 부가된 기니아 피크 PBMC)에 가시적 밴드가 존재하지 않는다는 것은 AB7이 기니아 피그 IL-1β와 교차 반응성이지 않다는 지표이다.
이들 결과는 AB7이 몇 가지 비-인간 포유류, 즉 붉은털 원숭이, 시노몰구스 원숭이, 개 및 토끼로부터의 IL-1β와 교차 반응성이지만, 적어도 하나의 기타 비-인간 포유류, 즉 기니아 피그로부터의 IL-1β와는 교차 반응성이지 않다는 것을 나타낸다.
실시예 9
본 실시예는 본 발명에 따르는 적어도 몇몇 IL-1β 결합성 항체가 기타 비-인간 포유류로부터의 IL-1β와 교차 반응성이란 사실을 추가로 예시하고 있다. 항체 AB7를 대상으로 하여 비-인간 포유류, 즉 마우스 및 랫트로부터의 IL-1β와 결합하는 것에 관해 검정하였다.
재조합 인간, 마우스 및 랫트 IL-1β (공급처: Peprotech)를 환원성 및 비-환원성 조건 하에 SDS-PAGE 겔 상으로 부하하고 120 V 하에 1시간 동안 수행하였다. 22 V에서 밤새 임모빌론-P 막으로 이전시키고 5% 탈지유로 차단시킨 후, AB7을 상기 막과 함께 2시간 동안 2 ㎍/ml으로 항온 배양하였다. 세척 단계 후 이차 염소 항-인간 IgG HRP 접합된 항체를 가하고, 1 단계 TMB 용액을 사용하여 탐지하였다.
도 17은 전술된 과정에 의해 수득한 웨스턴 블롯을 도시한 것이다. 레인 1 및 2는 각각 비-환원 및 환원된 인간 IL-1β에 대한 것이다. 레인 3 및 4는 각각 비-환원 및 환원된 마우스 IL-1β에 대한 것이다. 레인 5 및 6은 각각 비-환원 및 환원된 랫트 IL-1β에 대한 것이다. 블롯의 바닥 근처에서는, 대략 17 kDa의 분자량에 상응하는 영역에서 각각의 레인에 밴드가 관찰될 수 있다. 이들 밴드는 IL-1β가 존재한다는 지표인데, 결국 AB7이 인간 IL-1β, 마우스 IL-1β 및 랫트 IL-1β와 결합한다는 지표이다. 이들 결과는 AB7이 설치류 IL-1β와 교차 반응성이란 사실을 나타낸다.
실시예 10
본 실시예는 본 발명에 따르는 적어도 몇몇 IL-1β 결합성 항체가 인간으로부터의 IL-1β 및 적어도 몇몇 비-인간 포유류로부터의 IL-1β의 억제제라는 사실을 추가로 예시하고 있다. 항체 AB7을 대상으로 하여 인간, 붉은털 원숭이, 마우스 및 랫트 IL-1β에 의해 자극된 D10 세포의 증식을 억제하는 것에 관해 검정하였다.
D10.G4.1 (D10) 세포는 난백으로부터의 콘알부민 항원에 대한 특이성을 지닌 뮤린 T 조력 세포이다. 이 세포주는 AKR/J 마우스 (H-2k MHC 일배체형)로부터 유래되었고, 성장, 증식 및 생존을 위해서는 IL-1 및 항원 수용체 활성화를 필요로 한다. D10 세포주는 IL-1에 대해 고도로 민감하고, IL-1β 결합성 항체 또는 단편 (예: AB7)의 교차 반응성 중화 능력을 시험할 수 있게 허용해 주는 몇 가지 종 (인간, 원숭이, 마우스 및 랫트 포함)으로부터의 IL-1에 대해 반응할 수 있다. D10 증식은 LPS나 대식세포-유래된 사이토킨 (예: IL-6 및 TNF-a)에 의해서는 영향을 받지 않는다. 그 결과, D10 검정을 사용하여 내인성 공급원 (즉, LPS-활성화 대식세포)로부터의 특이적 IL-1 활성을 평가할 수 있다.
D10 세포를 몇 가지 농도의 AB7의 존재 또는 부재 하에 콘카나발린 A (Con A) 및 일정 수준의 IL-1의 재조합 또는 본래 공급원으로 활성화시켰다. 세포를 2xlO4/웰로 도말하고, 2.5 ㎍/ml Con A 및 상이한 농도의 IL-1β로 자극하였다. 세포를 72시간 동안 배양하고, 배양 마지막 8 내지 14시간 동안 레독스 생육성 염료 알라마르 블루 (Alamar Blue)를 가하고 O.D.570-600를 평가함으로써 증식을 측정하였다.
AB7의 효력과 종 교차 반응성을 시험하기 위해, 다음 농도의 재조합 또는 본래의 IL-1β를 사용하여 D10 생물학적 검정을 수행하였다: 10 pg/ml 재조합 인간 IL-1β; 10 pg/ml 재조합 붉은털 원숭이 IL-1β; 10 pg/ml 마우스 IL-1β; 및 100 pg/ml 랫트 IL-1β. 내인성 인간 IL-1β를 이용하는 D10 검정을 위해, LPS-활성화 인간 PBMC로부터의 상등액의 1:360 희석물을 사용하였다. 상이한 농도의 AB7을 각 IL-1β로 처리하였다. IC50 측정치는 그래프패드 프리즘 (Graphpad Prism)을 사용하여 결정하였다. IC50에 대한 평균, 표준 편차 (SD) 및 표준 오차 (SEM)는 마이크로소프트 엑셀을 사용하여 계산하였다.
D10 검정으로부터의 결과가 표 5에 요약되었는데, 이에는 (재조합 인간 IL-1β에 대한 4가지 실험과 기타 공급원으로부터의 IL-1β에 대한 3가지 실험을 기준으로 한) 평균 IC50과 SEM이 포함된다. AB7은 재조합 인간 IL-1β 및 내적으로 생성된 (본래의) 인간 IL-1β를 중화시키는데 있어 상당히 강력하였다. AB7은 또한, 재조합 붉은털 원숭이 IL-1β를 중화시키는 데에도 고도로 효능이 있었다. AB7은 또한, 재조합 마우스 IL-1β를 보다 낮은 효력으로 중화시켰는데, IC50은 인간과 비교해서 1000배 정도 더 높았다. AB7은 본 검정에서 랫트 IL-1β에 대항해서는 상당한 활성을 나타내지 못하였다.
ELISA 결과
IC50 (pM) SEM (pM)
재조합 인간 IL-1β 2.4 ±0.52
내적으로 생성된 (본래의) 인간 IL-1β 2.6 ±0.11
재조합 붉은털 원숭이 IL-1β 2.7 ±0.73
재조합 마우스 IL-1β 2618 ±60.9
이들 결과는 AB7이 재조합 및 본래 형태의 사이토킨에 대항한 효력과 유사하게, 인간 IL-1β에 대항하여 고도로 강력한 중화 항체란 사실을 나타낸다. 비-인간 영장류 붉은털 원숭이 IL-1β에 대항한 활성은 인간 IL-1β에 대항한 활성과 유사하였다. 따라서, 본 발명의 적어도 몇몇 항체 및 단편은 인간 IL-1β와 영장류 IL-1β에 대항하여 실질적으로 동일한 효력을 지니고 있고/있거나 재조합 인간 IL-1β와 내인성 인간 IL-1β에 대항하여 실질적으로 동일한 효력을 지니고 있는 항체 및 단편을 포괄한다. 이들 결과는 또한, AB7이 마우스 IL-1β를 중화시킨다는 사실을 나타낸다.
실시예 11
본 실시예는 본 발명의 적어도 몇몇 항체 (예를 들어, AB7로 지정된 항체)와 결합하는 IL-1β 에피토프의 지도화를 예시한 것이다.
PepSpot™ 펩티드 어레이 (공급처: JPT Peptide Technologies, Berlin, Germany)를 사용하여 AB7의 결합에 관여한 IL-1β 주요 아미노산 잔기 (에피토프)를 확인하였다. 전체 IL-1β 아미노산 서열에 걸쳐 있는 12개 아미노산 펩티드 스캔 (각 펩티드는 앞서의 것과 11개 아미노산이 중복된다)를 막 상에서 직접 합성하였다. 이 펩티드를 수반하는 막을 실온에서 2시간 동안 2 ㎍/ml의 농도로 AB7로 프로빙하였다. 막 결합된 펩티드에 대한 AB7의 결합성은 이차 HRP-접합된 염소 항-인간 항체를 사용한 다음, 증강 화학발광 (ECL)을 사용하여 탐지하였다. IL-1β 잔기 83-105에 상응하는 펩티드 스폿은 AB7에 대한 결합성이 양성인 것으로 기록되었다.
이러한 지도화는 AB7이 성숙한 IL-1β 단백질의 잔기 83-105에 상응하는 서열 내의 에피토프와 결합한다는 것을 나타낸다. 이 서열은 아미노산 ESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIE를 포함하고, AB7은 이러한 서열 내의 에피토프와 결합하는 항체의 한 예이다. AB6, AB8, AB9로 지정된 항체, 및 서열 29의 중쇄와 서열 27의 경쇄를 갖는 항체 또한, 상기 서열 내에 포함된 에피토프와 결합하는 것으로 예상되었다.
실시예 12
본 실시예는 세포에 의거한 검정 IL-8에서 본 발명의 항체를 사용하는 IL-1β의 시험관내 억제를 예시한 것이다.
헤파리 처리시킨 신선한 말초혈을 건강한 공여자로부터 수집하였다. 180 ㎕의 전혈을 96-웰 판에 도말하고, 각종 농도의 항체 AB7 및 100 pM rhIL-1β와 함께 항온 배양하였다. 키네레트-처리시킨 샘플의 경우에는, 혈액과 혼합하기에 앞서 키네레트와 rhIL-1β를 1:1로 합하였다. 샘플을 37℃ 및 5% CO2 하에 6시간 동안 항온 배양하였다. 이어서, 전혈 세포를 50 ㎕ 2.5% 트리톤 X-100으로 용해시켰다. 청정해진 용해물 중의 인터루킨-8 (IL-8)의 농도를 제조업자의 지시에 따라서 ELISA (Quantikine 인간 IL-8 ELISA 키트, 공급처: R&D Systems)에 의해 검정하였다. AB7 및 키네레트 처리시킨 샘플 중의 IL-8 농도를 항-KLH 대조군으로 처리시킨 대조군 샘플과 비교하였다. 그 결과가 도 18에 도시되었고 표 6에 요약되었다. IC50은 IL-1β 자극에 의해 방출된 IL-8을 50% 억제시키는데 요구되는 항체의 농도이다.
IC50 (pM)
AB7 1.9 pM
키네레트 53.4 pM
이들 결과는 IL-1β 자극된 IL-8 방출 억제로써 측정된 바와 같은 AB7의 시험관내 효력을 입증하였다. 키네레트와 비교해서 보다 강력한 효력을 보여주는 이들 결과는 본 발명의 항체가 생체 내에서 IL-1β 억제 효능을 지닐 것이란 사실을 나타낸다.
실시예 13
본 실시예는 본 발명의 항체가 유사한 서열을 지닌 항체와 비교해서 놀라울 정도로 높은 친화도를 지니고 있다는 사실을 예시하고 있다.
AB5를 서열 및 결합 친화도 측면에서 AB-대조군과 비교하였다. AB5는 서열 8에 제시된 중쇄 가변 영역과 서열 9에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다. AB-대조군은 서열 38에 제시된 중쇄 가변 영역과 서열 39에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 것으로 여겨진다. 이들 서열은 미국 특허공개공보 제2003/0026806호의 도 6A 및 6B에 제시되었다. AB5와 AB-대조군은 그들의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역에 동일한 상보성 결정 영역을 갖고 있다. 그들의 중쇄는 서열 8 및 38 중의 위치 68, 74 및 86에 위치한, 골격 영역 3 내의 3개 아미노산 잔기가 상이하다. 그들 각각의 경쇄는 서열 9 및 39 중의 위치 72에 위치한, 골격 영역 3 내의 1개 아미노산 잔기가 상이하다. 동일한 CDR을 포함하여 그들의 중쇄 가변 영역 서열과 경쇄 가변 영역 서열이 유사함에도 불구하고, AB5와 AB-대조군은 그들의 결합 친화도가 예상치 못한 수준으로 상당히 상이하다. 상기 실시예 1 및 5에서 논의된 바와 같이, AB5는 해리 상수가 0.3 pM 미만 (KD-저 0.11 pM 및 KD-고 0.56 pM)인 것으로 밝혀졌고, AB-대조군은 해리 상수가 3 pM (KD-저 1.62 pM 및 KD-고 5.23 pM)인 것으로 밝혀졌다. 아미노산 서열이 유사하다고 가정하면, AB5가 한 자리 크기 정도로 더 높은 친화도를 나타낸다는 것은 놀라운 일이다.
AB7은 실시예 4에 기재된 바와 같은 HUMAN ENGINEERING™ 기술을 사용하여 생성시켰다. AB7의 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 AB5의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 서열 내의 저 위험 위치와 중간 수준의 위험 위치를 포함하고 있다. AB7은 서열 15에 제시된 중쇄 가변 영역과 서열 11에 제시된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
AB7을 서열 및 결합 친화도 측면에서 AB-대조군 및 AB5와 비교하였다. AB7과 AB-대조군은 그들의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 내에 동일한 상보성 결정 영역을 갖고 있다. 그들의 중쇄는 골격 영역 3 내의 3개 위치 중의 2개 위치 (서열 15 및 38 내의 위치 74 및 86)에서 상이한데, 여기서 AB5는 AB-대조군과 상이하지만, 서열 15 내의 위치 68에서는 AB7이 AB-대조군과 동일한 아미노산을 갖는다. AB7의 경쇄에서는, 서열 11 내의 위치 72가 AB-대조군과 AB5 둘 다와 상이하다. AB7은 HUMAN ENGINEERING™ 공정을 통하여 AB-대조군 및 AB5와 비교한 경우에 경쇄 및 중쇄 가변 영역 내에서 몇 가지 기타 차이점을 포함하고 있다. 중간 수준의 위험 위치에서의 변화를 포함함에도 불구하고, 특히 중쇄 가변 영역 내의 위치 68 및 경쇄 가변 영역 내의 위치 72에서 AB5와 비교한 AB7 상의 변화 측면에서 보면, AB7과 AB5는 유사한 해리 상수를 나타내고, AB7은 결합 친화도 측면에서 AB-대조군과 예상치 못하게도 상당히 상이하다. 상기 실시예 5에서 논의된 바와 같이, AB7은 해리 상수가 0.3 pM (KD-저 0.11 pM 및 KD-고 0.74 pM)인 것으로 밝혀졌다. AB5는 해리 상수가 0.24 pM (KD-저 0.07 pM 및 KD-고 0.72 pM)인 것으로 밝혀졌다. 중간 수준의 위험 위치에서 변화가 이루어지고 아미노산 서열, 특히 CDR이 전반적으로 유사하다고 가정하면, AB7이 AB5와 유사한 친화도를 나타내고 AB-대조군보다 한 자리 크기 정도로 더 높은 친화도를 나타낸다는 것은 놀라운 일이다.
실시예 14
본 실시예는 본 발명의 적어도 하나 항체가 IL-1β 에피토프와 결합하여 이와 같이 결합된 항체는 항체-결합된 IL-1β가 IL-1 수용체 유형 I과 결합하는 것을 실질적으로 막지 않는다는 사실을 보여준다. 본 실시예는 비아코어 역학 분석용 기기를 이용하여 본 발명의 항체 중의 하나 (AB7)와 결합된 IL-1β가 여전히 IL-1 수용체 유형 I과 결합할 수 있는지를 조사하였다.
본 실시예의 경우에는, AB7을 다음과 같이 비아코어 기기 중의 CM-5 센서 칩 표면 상에 고정화시켰다. HBS-EP (공급처: Biacore®, Inc.)를 수행 완충액으로서 사용하여, 온도를 25℃로 설정하였고, 유속을 10 ㎕/min으로 설정하였으며 유동 경로는 플로 셀 (flow cell) 2로만 향하였다. 135 ㎕의 각 NHS 및 ECD 용액 (공급처: Biacore®, Inc.)을 혼합하였고, 70 ㎕의 NHS/ECD 용액을 유동 경로에 즉시 주사하였다. 이어서, 91 ㎕의 AB7 용액 (10 mM 나트륨 아세테이트 완충액 중의 약 20 ㎍/ml) (공급처: Biacore®, Inc.)을 주사한 다음, 70 ㎕의 1 M 에탄올아민 (공급처: Biacore®, Inc.)을 주사하였다. 이로써 대략 5650 RU의 AB7을 고정화시켰다. 기준 표면을 제조하기 위해, 유동 경로를 플로 셀 1 로만 변화시켰다. 135 ㎕의 각 NHS 및 ECD 용액 (공급처: Biacore®, Inc.)을 혼합하였고, 70 ㎕의 NHS/ECD 용액을 상기 유동 경로에 즉시 주사한 다음, 70 ㎕의 1 M 에탄올아민 (공급처: Biacore®, Inc.)을 주사하였다.
이어서, AB7과 결합된 IL-1β이 여전히 IL-1 수용체 유형 I과 결합하였는지를 분석하기 위해 비아코어 기기를 준비하였다. 이러한 분석을 위해, 가용성 IL-1 수용체 유형 I (IL-1 sRI)을 사용하였고, AB7/IL-1β의 복합체에 대한 IL-1 sRI의 결합성을 다음과 같이 시험하였다. IL-1 sRI (공급처: RnDSystems cat#269-1R-100/CF) 및 IL-1β (공급처: Peprotech, cat#200-01B)를 개별적으로 희석시켜 HBS--EP 중의 10 ㎍/ml로 만들었다. 유속은 10 ㎕/min으로 설정하였다. 비아코어 기기에 대한 유동 경로를 플로 셀 1 및 2로 설정하였고, 플로 셀 1로부터의 플로 셀 2의 기준 감산을 사용하여 반응 시차를 결정하였다. 도 19는 분석 과정 전반에 걸쳐 비아코어 기기로부터 측정된 반응 시차를 도시하고 있다. 도 20은 분석에 사용된 단계들을 예시하고 있는데, 이는 (A) IL-1 sRI, (B) IL-1β 및 (C) IL-1 sRI의 순서로 플로 셀에 별개로 부가한다는 것을 나타낸다.
200초에서, 20 ㎕의 IL-1 sRI을 주사하여, 고정화시킨 AB7에 대한 직접적인 결합이 존재하지 않는다는 것을 검증하였다 (도 19 및 20에서의 주사 A). 도 19에 도시된 바와 같이, IL-1 sRI은 반응 단위를 증가시키지 않았는데, 이는 IL-1 sRI이 고정화시킨 AB7과 직접적으로 결합하지 않았다는 것을 나타낸다.
600초에서는, 대략 1000 RU의 IL-1β가 AB7에 의해 결합되어, 칩 표면 상에 AB7/IL-1β 복합체가 형성되었다 (도 19 및 20 중의 주사 B). 반응 단위 상의 증가는 IL-1β이 고정화시킨 AB7과 결합하였다는 지표이다. 그 다음, 20 ㎕의 IL-1 sRI을 1200초에서 주사하여 AB7과 IL-1β 복합체에 대한 IL-1 sRI의 결합을 시험하였다. 대략 1500 RU의 IL-1 sRI이 AB7/IL-1β 복합체와 결합하였다 (도 19 및 20 중의 주사 C). 이러한 반응 단위 상의 증가는 IL-1 sRI이 IL-1β/AB7 복합체와 결합하였다는 지표이다.
본 실시예는 IL-1 sRI이 IL-1β와는 결합하지만 AB7과는 결합하지 않고, AB7이 IL-1β 에피토프와 결합하여 이와 같이 결합된 AB7은 IL-1β가 IL-1 sRI과 결합하는 것을 실질적으로 막지 않는다는 것을 나타낸다.
본원에 인용된 공개공보, 특허원 및 특허를 포함한 모든 참고 문헌은 각 참고 문헌이 개별적이고도 구체적으로 본원에 참고로써 도입되고 그의 전문이 본원에 제시된다고 표시한 경우와 동일한 정도로 본원에 참고로 도입된다.
본 발명을 기술하는데 있어서 (특히, 다음 청구의 범위 맥락에서) "특정"이란 용어와, 단수 형태 및 유사한 지시 대상물의 사용은 본원에서 달리 언급하지 않거나 명백하게 반박하지 않는 한은 단수와 복수 둘 다를 포괄하는 것으로 간주되어야 한다. 용어 "포함하는", "갖는", "포함되는" 및 "함유하는"이란 달리 언급되지 않는 한 개방 말단 용어 (즉, "포함되긴 하지만, 그에 제한되지 않는다"를 의미한다)로서 간주되어야 한다. 개방 말단 용어를 사용하여 본 발명의 특징이나 요소를 기재하는 경우는 언제나, 본 발명의 요지와 범위를 벗어나지 않고서도 이러한 개방 말단 용어 대신에 폐쇄 말단 용어를 사용할 수 있다는 것이 구체적으로 고려된다. 본원에서 일정 값의 범위에 관한 언급은 본원에서 달리 표시하지 않는 한은, 이러한 범위 내에 속하는 각각의 별개 값을 개별적으로 지칭하는 간단한 방법으로서 제공되는 것으로만 간주되고, 각각의 별개 값은 이것이 본원에서 개별적으로 언급되는 경우처럼 본 명세서 내로 도입된다. 본원에 기재된 모든 방법은 본원에서 달리 언급하지 않거나 명백하게 반박하지 않는 한은 적합한 어떠한 순서로도 수행할 수 있다. 본원에 제공된 모든 예, 또는 예시 표현 (예: "예를 들어")은 단지 본 발명을 보다 잘 해명하기 위한 것이고 달리 청구되지 않는 한은 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 본 명세서 내의 모든 표현 (용어)이, 청구되지 않은 모든 요소가 본 발명을 실시하는데 필수적인 것으로서 표시하는 것으로 간주되어야 하는 것은 아니다.
본 발명자들에게 공지된 본 발명을 수행하기 위한 가장 우수한 방식을 포함한 본 발명의 바람직한 양태가 본원에 기재되어 있다. 이러한 바람직한 양태에 관한 변동은 전술된 기재 내용 판독시 당업자에게 명백할 수 있다. 본 발명자들은 당업자가 이러한 변동을 적당한 바 대로 이용할 것으로 예상하며, 본 발명자들은 본원에 구체적으로 기재된 것과는 다르게 본 발명을 실시하고자 한다. 따라서, 본 발명에는 적용 가능한 법규에 의해 허용되는 것으로서 본원에 첨부된 청구의 범위에 인용된 주제의 모든 변형물과 등가물이 포함된다. 더우기, 가능한 모든 변동물에 있어서의 상기 언급된 요소들의 모든 조합이, 본원에서 달리 언급하지 않거나 명백하게 반박하지 않는 한은 본 발명에 포괄된다.
SEQUENCE LISTING <110> XOMA Technology Ltd. <120> IL-1 BINDING ANTIBODIES AND FRAGMENTS THEREOF <130> 17646WO02 <160> 57 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> "Xaa" is Thr or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> "Xaa" is Leu or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> "Xaa" is Thr or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(41) <223> "Xaa" is Asp or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (42)..(42) <223> "Xaa" is Gly or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(43) <223> "Xaa" is Thr or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (72)..(72) <223> "Xaa" is Thr or Ser <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Xaa Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Xaa Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Xaa Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Xaa Xaa Xaa Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly 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Ile Gln Met Thr Gln Xaa Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Xaa Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Xaa Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Xaa Xaa Xaa Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Xaa Leu Thr Ile Ser Xaa Leu Xaa Gln 65 70 75 80 Glu Asp Xaa Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln Gly Lys Met Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Xaa Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 28 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> "Xaa" is Thr or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> "Xaa" is Lys or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> "Xaa" is Ile or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> "Xaa" is Leu or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (67)..(67) <223> "Xaa" is Thr or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(68) <223> "Xaa" is Gln or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (74)..(74) <223> "Xaa" is Asp or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(77) <223> "Xaa" is Arg or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (81)..(81) <223> "Xaa" is Phe or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (88)..(88) <223> "Xaa" is Asp or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (89)..(89) <223> "Xaa" is Thr or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(90) <223> "Xaa" is Val or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (94)..(94) <223> "Xaa" is Thr or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (100)..(100) <223> "Xaa" is Ala, Val, Phe, Lys, or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (101)..(101) <223> "Xaa" is Arg or Lys <400> 28 Gln Val Xaa Leu Xaa Glu Ser Gly Pro Gly Xaa Xaa Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Xaa Xaa Leu Thr Ile Ser Lys Xaa Thr Ser Xaa Asn Gln Val 65 70 75 80 Xaa Leu Lys Ile Thr Ser Val Xaa Xaa Xaa Asp Thr Ala Xaa Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Xaa Xaa Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 29 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> "Xaa" is Thr or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> "Xaa" is Lys or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> "Xaa" is Ile or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> "Xaa" is Leu or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (67)..(67) <223> "Xaa" is Thr or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(68) <223> "Xaa" is Gln or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (74)..(74) <223> "Xaa" is Asp or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(77) <223> "Xaa" is Arg or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (81)..(81) <223> "Xaa" is Phe or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (88)..(88) <223> "Xaa" is Asp or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (89)..(89) <223> "Xaa" is Thr or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(90) <223> "Xaa" is Val or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (94)..(94) <223> "Xaa" is Thr or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (100)..(100) <223> "Xaa" is Ala, Val, Phe, Lys, or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (101)..(101) <223> "Xaa" is Arg or Lys, but is not Lys if position (100) is Lys <400> 29 Gln Val Xaa Leu Xaa Glu Ser Gly Pro Gly Xaa Xaa Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Xaa Xaa Leu Thr Ile Ser Lys Xaa Thr Ser Xaa Asn Gln Val 65 70 75 80 Xaa Leu Lys Ile Thr Ser Val Xaa Xaa Xaa Asp Thr Ala Xaa Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Xaa Xaa Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 30 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> "Xaa" is Ala, Val, Phe, Lys, or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> "Xaa" is Arg or Lys, but is not Lys if position (1) is Lys <400> 30 Xaa Xaa Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp 1 5 10 <210> 31 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (100)..(100) <223> "Xaa" is Ala, Val, Phe, Lys, or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (101)..(101) <223> "Xaa" is Arg or Lys, but is not Lys if position (100) is Lys <400> 31 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Xaa Xaa Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 32 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (100)..(100) <223> "Xaa" is Ala, Val, Phe, Lys, or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (101)..(101) <223> "Xaa" is Arg or Lys, but is not Lys if position (100) is Lys <400> 32 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Xaa Xaa Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 33 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (100)..(100) <223> "Xaa" is Ala, Val, Phe, Lys, or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (101)..(101) <223> "Xaa" is Arg or Lys, but is not Lys if position (100) is Lys <400> 33 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Thr Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Val Asp Thr Ala Thr Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Xaa Xaa Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 34 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (100)..(100) <223> "Xaa" is Ala, Val, Phe, Lys, or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (101)..(101) <223> "Xaa" is Arg or Lys, but is not Lys if position (100) is Lys <400> 34 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asn Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Xaa Xaa Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 35 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (100)..(100) <223> "Xaa" is Ala, Val, Phe, Lys, or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (101)..(101) <223> "Xaa" is Arg or Lys, but is not Lys if position (100) is Lys <400> 35 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asn Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Xaa Xaa Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 36 <211> 23 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 36 Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys Arg 1 5 10 15 Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu 20 <210> 37 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker Sequence <400> 37 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 38 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 38 caagtacaac ttcaagaaag cggtccaggc cttgttaaac cctcccaaac tctttctctt 60 acctgttctt tctctggatt ctctctctct acctctggca tgggcgtcgg ctggatacgt 120 caaccaagtg gaaaaggact cgaatggctt gcacatatat ggtgggatgg cgacgaatct 180 tataaccctt ctcttaaatc tcgacttaca atttctaaag acacttccaa aaaccaagtt 240 tccctcaaaa taacctccgt cactgctgca gatactgctg tctatttttg cgcacgaaac 300 agatatgatc ccccctggtt cgttgattgg ggccaaggaa cactcgtaac cgttagctca 360 <210> 39 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 39 gacatccaaa tgactcaatc cacttcctca ctctcagcct ctgtcggaga ccgtgtaact 60 atcacctgcc gtgcttccca agacatctct aattatctct cctggtatca acaaaaacct 120 ggtaaagctg ttaaacttct catttattat acttctaaac ttcactccgg tgtgccttct 180 cgtttctcag gatcaggctc aggaaccgac tatacactca ccatctcctc cctccaacaa 240 gaagacttcg ctacttactt ttgccttcaa ggaaaaatgc tcccctggac tttcggacaa 300 ggaacaaagc tcgaaattaa a 321 <210> 40 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 40 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asn Thr Ser 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Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Ala Arg Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 43 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 43 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Val Arg Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 44 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 44 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Phe Arg Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 45 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 45 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Lys Lys Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 46 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 46 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Ala Arg Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 47 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 47 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Val Arg Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 48 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 48 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Phe Arg Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 49 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 49 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Lys Lys Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 50 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 50 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asn Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Ala Arg Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 51 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 51 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asn Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Val Arg Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 52 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 52 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asn Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Phe Arg Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 53 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 53 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asn Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Lys Lys Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 54 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 54 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asn Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Ala Arg Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 55 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 55 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asn Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Val Arg Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 56 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 56 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asn Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Phe Arg Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 57 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 57 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Gly Asp Glu Ser Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asn Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Ser Leu Lys Ile Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Lys Lys Tyr Asp Pro Pro Trp Phe Val Asp Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

Claims (66)

  1. 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 IL-1β 결합성 항체 또는 그의 IL-1β 결합성 단편.
  2. 제1항에 있어서, 서열 번호 2, 서열 번호 23, 또는 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  3. 인간 IL-1β에 약 1 pM 이하의 해리 상수로 결합하는 IL-1β 결합성 항체 또는 그의 IL-1β 결합성 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IL-1β에 약 0.3 pM 이하의 해리 상수로 결합하는 항체 또는 항체 단편.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IL-1β에 약 0.24 pM의 해리 상수로 결합하는 항체 또는 항체 단편.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IL-1β에 약 0.11 pM의 해리 상수로 결합하는 항체 또는 항체 단편.
  7. IL-1β 에피토프에 결합하여, 결합된 항체 또는 단편이 실질적으로 IL-1β가 IL-1 수용체 I(IL-1RI)에 결합할 수 있게 하고, 인간 IL-1β에 1 pM 미만의 해리 상수로 결합하는 IL-1β 결합성 항체 또는 그의 IL-1β 결합성 단편.
  8. 인간 IL-1β에 1 pM 미만의 해리 상수로 결합하고, 서열 번호 11의 경쇄 가변 영역과 서열 번호 15의 중쇄 가변 영역을 갖는 항체가 결합하는 것과 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 IL-1β 결합성 항체 또는 그의 IL-1β 결합성 단편.
  9. 인간 IL-1β에 1 pM 미만의 해리 상수로 결합하고, 서열 번호 11의 경쇄 가변 영역과 서열 번호 15의 중쇄 가변 영역을 갖는 항체와 결합을 놓고 경쟁하는 IL-1β 결합성 항체 또는 그의 IL-1β 결합성 단편.
  10. 제8항에 있어서, 서열 ESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIE(서열 번호 36) 내에 포함된 에피토프에 결합하는 항체 또는 항체 단편.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화 또는 인간 유전자조작 항체인 항체 또는 항체 단편.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 항체인 항체 또는 항체 단편.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 중화 항체인 항체 또는 항체 단편.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 람다 경쇄를 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, IgG2 영역을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, Fab, F(ab')2, Fv, 단일쇄 항체 단편, 또는 이들 항체 또는 단편 중 어느 하나의 변이체 또는 유도체인 항체 또는 항체 단편.
  17. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 특이적 항체, 디아보디(diabody), 트리아보디(triabody), 테트라보디(tetrabody), 미니보디(minibody), 선형 항체, 킬레이트 재조합 항체, 트리보디(tribody), 바이보디(bibody), 인트라보디(intrabody), 나노보디(nanobody), 소형 모듈 면역약제(small modular immunopharmaceutical; SMIP), 결합성 도메인 면역글로불린 융합 단백질, 카멜화(camelized) 항체, VHH 함유 항체, 또는 이들 항체 또는 단편 중 어느 하나의 변이체 또는 유도체인 항체 또는 항체 단편.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 8, 서열 번호 14 및 서열 번호 15의 아미노산 서열 중 하나를 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호 9, 서열 번호 10 및 서열 번호 11의 아미노산 서열 중 하나를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  20. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  21. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  22. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  23. 제1항 또는 제2항에 있어서, 3 pM 미만의 해리 상수를 갖는 항체 또는 항체 단편.
  24. 제1항 또는 제2항에 있어서, 약 2 pM 이하의 해리 상수를 갖는 항체 또는 항체 단편.
  25. (i) 인간 섬유아세포로부터의 IL-1β 자극된 IL-6 방출을 억제하기 위한 IC50이 약 0.5 nM 이하이고, (ii) IL-1β에 약 1 pM 이하의 해리 상수로 결합하며, (iii) 항체 또는 항체 단편을 투여하지 않은 IL-1β 자극된 동물에게서의 혈청 IL-6의 수준과 비교해서, 항체 또는 항체 단편을 동물에게 유효량으로 투여한 경우에 이 동물 중에서의 IL-1β 유도된 혈청 IL-6 발현을 50% 이상 억제하는 IL-1β 결합성 항체 또는 그의 IL-1β 결합성 단편.
  26. 인간 IL-1β에 약 6 pM 내지 약 50 pM의 해리 상수로 결합하고, 인간 섬유아세포로부터의 IL-1β 자극된 IL-6 방출을 억제하기 위한 IC50이 약 5 pM 내지 약 200 pM인 IL-1β 결합성 항체 또는 그의 IL-1β 결합성 단편.
  27. 제26항에 있어서, 인간 IL-1β에 약 13 pM 내지 약 25 pM의 해리 상수로 결합하는 항체 또는 항체 단편.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 항체 단편.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  30. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, IL-1α에는 검출 가능한 수준으로 결합하지 않는 항체 또는 항체 단편.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, IL-1β 이외의 표적과는 교차 반응하지 않는 항체 또는 항체 단편.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류 IL-1β, 영장류 IL-1β, 개 IL-1β 및 토끼 IL-1β 중 하나 이상에 결합하는 항체 또는 항체 단편.
  33. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 랫트 IL-1β보다 높은 친화도로 마우스 IL-1β에 결합하는 항체 또는 항체 단편.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 기니아 피그 IL-1β에는 결합하지 않는 항체 또는 항체 단편.
  35. 서열 번호 28의 아미노산 서열에 대한 하나 이상의 치환, 결실, 또는 부가를 포함하고, 상기 서열 번호 28에 제시된 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 에피토프 결합 특이성 및 친화성을 갖는 IL-1β 결합성 항체 또는 그의 IL-1β 결합성 단편.
  36. 서열 번호 27의 아미노산 서열에 대한 하나 이상의 치환, 결실, 또는 부가를 포함하고, 상기 서열 번호 27에 제시된 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 에피토프 결합 특이성 및 친화성을 갖는 IL-1β 결합성 항체 또는 그의 IL-1β 결합성 단편.
  37. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 핵산.
  38. 제37항에 있어서, 서열 번호 38의 서열을 포함하는 핵산.
  39. 제37항에 있어서, 서열 번호 39의 서열을 포함하는 핵산.
  40. 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산으로서, 상기 중쇄 가변 영역이 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산.
  41. 제40항에 있어서, 서열 번호 2, 서열 번호 23 또는 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산.
  42. 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산으로서, 상기 경쇄 가변 영역이 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산.
  43. 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 벡터.
  44. 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항의 핵산 또는 제42항의 벡터를 포함하는 세포.
  45. 제44항에 있어서, 배아 줄기 세포 또는 수정란인 세포.
  46. 제44항 또는 제45항의 세포를 포함하는 트랜스제닉(transgenic) 동물.
  47. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체 단편을 생산하는 하이브리도마.
  48. (a) 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체 단편, 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항의 핵산, 또는 제42항의 벡터와, (b) 적합한 담체를 포함하는 조성물.
  49. 제48항에 있어서, 담체가 제약상 허용 가능한 담체인 조성물.
  50. 제49항에 있어서, 관절내, 피하, 정맥내, 복강내, 뇌내(실질내), 뇌실내, 근육내, 안내, 동맥내, 병변내, 경구 또는 흡입 투여에 적합한 형태인 조성물.
  51. 제49항에 있어서, 동결건조 보호제, 계면활성제, 충전제, 결합제 및/또는 벌크제를 포함하는 조성물.
  52. 제49항에 있어서, 제어식 방출 또는 지속식 방출 제약 조성물인 조성물.
  53. 유효량의 (a) 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체 단편, (b) 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항의 핵산, (c) 제42항의 벡터, 또는 (d) 제48항 내지 제54항 중의 어느 한 항의 조성물을, 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 포유류에게 투여함으로써 포유류에게서 질환을 치료 또는 예방하는 것을 포함하는, 상기 포유류에게서 IL-1 관련 질병 또는 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, IL-1 관련 질병 또는 질환이 염증 질환, 자가면역 질환, 또는 암인 방법.
  55. 제53항 또는 제54항에 있어서, IL-1 관련 질병 또는 질환이 류마티스성 관절염, 골관절염, 크론병(Crohn's disease), 궤양성 결장염, 패혈성 쇼크, 만성 폐쇄성 폐 질환, 천식, 이식편 대 숙주 질병, 아테롬성 경화증, 성인 T-세포 백혈병, 다발성 골수종, 다발성 경화증, 뇌졸중 또는 알츠하이머병(Alzheimer's disease) 중에서 선택되는 것인 방법.
  56. 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, IL-1 관련 질병 또는 질환이 신생아 발병 다기관 염증 장애(NOMID/CINCA), 전신 발병 유년성 특발성 관절염, CIASI 관련 주기성 증후군(CAPS), 스틸병(Stills disease), 또는 머클-웰스(Muckle-Wells) 증후군인 방법.
  57. 제53항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, IL-1 관련 질병 또는 질환이 전신 발병 유년성 특발성 관절염, 류마티스성 관절염, 골관절염, 아테롬성 경화증, 또는 중증 근무력증인 방법.
  58. 제53항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류가 인간인 방법.
  59. 제54항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항체 단편의 유효량이 이 항체의 부재 하에서의 혈청 IL-6의 수준과 비교해서, 동물 중에서의 IL-1β 유도된 혈청 IL-6 발현을 50% 이상 억제하는 데 유효한 것인 방법.
  60. (a) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 IL-1β 결합성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 핵산과, 1개 이상의 뉴클레오티드가 제1 핵산 서열과는 상이한 핵산 서열을 포함하는 제2 핵산을 제공하는 단계;
    (b) 핵산 셔플링(shuffling)을 수행하여 2개 이상의 돌연변이된 핵산을 제공하는 단계;
    (c) (i) 제1 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드보다 더 큰 친화도로 IL-1β에 결합하거나, (ii) IL-1α에 비해 IL-1β에 대한 선택도가, 제1 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드보다 더 크거나, (iii) IL-1β에 대한 평형 결합 해리 상수가 제1 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드보다 더 낮거나, 또는 (iv) 제1 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드보다 더 큰 정도로, 동물에서 IL-1β 유도된 혈청 IL-6 발현을 억제하는 폴리펩티드를 코딩하는 돌연변이된 핵산을 선별하는 단계; 및
    (d) 선별된 돌연변이된 핵산을 발현시킴으로써, 친화성 성숙 IL-1β 결합성 폴리펩티드를 생성시키는 단계
    를 포함하는, 친화성 성숙 IL-1β 결합성 폴리펩티드의 제조 방법.
  61. 제60항에 있어서, 항체를 검정함으로써 수행되는 돌연변이된 핵산의 선별 단계에 앞서, 돌연변이된 핵산(들)에 의해 코딩된 폴리펩티드를 포함하는 항체를 제공하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  62. 제60항 또는 제61항에 있어서, 단계 (b)와 (c)를 반복하며, 단계 (b)의 핵산 셔플링을 (i) 단계 (c)의 하나 이상의 선별된 돌연변이된 핵산 및 (ii) 상기 선별된 돌연변이된 핵산과 1개 이상의 뉴클레오티드가 상이한 핵산 서열을 갖는 하나 이상의 핵산을 사용하여 수행하는 것인 방법.
  63. 제60항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 최적화 핵산이 선별될 때까지 단계 (b)와 (c)를 반복하는 것인 방법.
  64. 제60항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 핵산이 서열 번호 1∼26 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 것인 방법.
  65. 제60항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 핵산이 서열 번호 27∼35 또는 42∼57 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 것인 방법.
  66. 제60항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 인간 섬유아세포로부터의 IL-1β 자극된 IL-6 방출을 억제하기 위한 IC50이 약 0.5 nM 이하이고, (ii) IL-1β에 3 pM 미만의 해리 상수로 결합하며, (iii) 항체 또는 단편을 투여하지 않은 IL-1β 자극된 동물에게서의 혈청 IL-6의 수준과 비교해서, 동물 중에서의 IL-1β 유도된 혈청 IL-6 발현을 50% 이상 억제하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 선별될 때까지 단계 (b)와 (c)를 반복하는 것인 방법.
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