BRPI0211953B1 - Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno que se liga a C5 e C5a sem a prevenção da formação de C5b, linhagem celular, composição farmacêutica, bem como método in vitro para inibir a atividade de C5a e método de diagnóstico in vitro - Google Patents

Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno que se liga a C5 e C5a sem a prevenção da formação de C5b, linhagem celular, composição farmacêutica, bem como método in vitro para inibir a atividade de C5a e método de diagnóstico in vitro Download PDF

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BRPI0211953B1 BRPI0211953-6A BRPI0211953A BRPI0211953B1 BR PI0211953 B1 BRPI0211953 B1 BR PI0211953B1 BR PI0211953 A BRPI0211953 A BR PI0211953A BR PI0211953 B1 BRPI0211953 B1 BR PI0211953B1
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Abstract

"inibidores de rota complementar ligando-se a cs e csa sem prevenção da formação de csb". a invenção refere-se a inibidores que se ligam a c5 e c5a, mas que não impedem a ativação de c5 e não impedem a formação ou inibem a atividade de c5b. um exemplo de uma tal molécula de inibidores é o anticorpo monoclonal designado mab 137-26, que se liga a um epítopo partilhado de c5 e c5a humanos. estes inibidores podem ser usados para inibir a atividade de c5a no tratamento de doenças e condições mediadas por produção excessiva ou descontrolada de c5a. as moléculas dos inibidores são também úteis para a detecção diagnóstica da presença/ausência ou da quantidade de c5 ou c5a.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ANTICORPO MONOCLONAL OU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO QUE SE LIGA A C5 E C5a SEM PREVENÇÃO DA FORMAÇÃO DE C5b, LINHAGEM CELULAR, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, BEM COMO MÉTODO IN VITRO PARA INIBIR A ATIVIDADE DE C5a E MÉTODO DIAGNÓSTICO IN VITRO'. REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS
Este pedido de patente reivindica a prioridade do pedido de patente provisório U.S. 60/313.137, depositado em 17 de agosto de 2001, e é aqui incorporado por referência.
CAMPO DA INVENÇÃO
Esta invenção refere-se a inibidores de inflamação que se ligam para complementar C5 e C5a, sem inibir a formação de complexos de ataque de membrana (MAC) C5b e C5b-9.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
O sistema complementar desempenha um papel central na liberação de complexos imunes e nas respostas imunes para agentes infecciosos, antígenos estranhos, células infectadas por vírus e células tumorosas. No entanto, a ativação inadequada ou excessiva do sistema complementar pode provocar conseqüências nocivas e mesmo potencialmente de ameaça de vida, devido à grave inflamação e à destruição de tecido resultante. Estas conseqüências são clinicamente manifestadas em vários distúrbios incluindo choque séptico, lesão do miocárdio bem como de isquemia/reperfusão intestinal, rejeição de enxerto, falha de órgão, nefrite, inflamação patológica e doenças auto-imunes. A sépsis é, por exemplo, uma causa importante de mortalidade, resultando em mais de 200.000 mortes por ano apenas nos Estados Unidos. A despeito do grandes avanços nos últimos anos no tratamento de infecções sérias, a incidência e a mortalidade da sépsis continuam a aumentar. Portanto, a inibição de ativação excessiva ou descontrolada da cascata de complemento pode proporcionar benefício clínico para pacientes com tais doenças e condições.
O sistema complementar é composto de um grupo de proteínas que estão normalmente presentes no soro em um estado inativo. A ativação do sistema complementar abrange, basicamente, duas rotas distintas, designadas as rotas clássica e alternativa (V. M. Holers, in Clinicai Immunology:
Petição 870180132737, de 21/09/2018, pág. 9/18
Principies and Practice, ed. R. R. Rich, Mosby Press; 1996, 363-391). A rota clássica é uma cascata dependente de cálcio/magnésio, que é normalmente ativada pela formação de complexos de antígeno-anticorpo. Também pode ser ativada de uma maneira independente de anticorpo pela ligação da pro5 teína C-reativa, complexada com ligante, e por muitos patógenos, incluindo bactérias gram-negativas. A rota alternativa é uma cascada dependente de magnésio, que é ativada por deposição e ativação de C3 em determinadas superfícies suscetíveis (por exemplo, polissacarídeos de paredes celulares de levedura e bactérias e determinados materiais biopoliméricos).
Estudos recentes mostraram que o complemento também pode ser ativado pela rota da lectina, que envolve a ligação inicial de lectina de ligação com manose e a ativação subseqüente de C2 e C4, que são comuns para a rota clássica (Matsushita, M. et al., J. Exp. Med. 176:1797-1502 (1992); Suankratay, C. et al., J. Immunol. 160:3006-3013 (1998)). A evidên15 cia de acúmulo indica que a rota alternativa participa na amplificação da atividade de ambas a rota clássica e a rota da lectina (Suankratay, C.» ibid; Farries, T. C. et al., Mol. Immunol. 27:1155-1161 (1990)). A ativação da rota complementar gera fragmentos biologicamente ativos de proteínas complementares, por exemplo, anafilatoxinas C3a, C4a e C5a e complexos de ata20 que de membrana (MAC) C5b-9, que mediam as respostas inflamatórias por meio do envolvimento de quimiotaxia de leucócitos, ativação de macrófagos, neutrófilos, plaquetas, células da mama e células endoteliais, maiores permeabilidade vascular, citólise e dano a tecido.
O complemente C5a é um dos mediadores pró-inflamatórios 25 mais potentes do sistema complementar. C5a é a forma ativada de C5. O complemento C5 (peso molecular de 190 kD) está presente em soro humano a aproximadamente 80 gg/ml (Kohler, P. F. et al., J. Immunol. 99:1211-1216 (1967)). É composto de duas cadeias de polipeptídios, α e β, com pesos moleculares aproximados de 115 kD e 75 kD, respectivamente (Tack, B. F.
et al., Biochemistry 18:1490-1497 (1979)). Biossintetizado como uma prómolécula de cadeia única, C5 é decomposto enzimaticamente em uma estrutura de cadeia dupla, durante processamento e secreção. Após decompo-
sição, as duas cadeias são unidas por pelo menos uma cadeia de dissulfeto, bem como interações não-covalentes (Ooi, Y. M. et al., J. Immunol. 124:2494-2498 (1980)).
As estruturas de aminoácidos primárias de C5 de seres huma5 nos e murinos foram obtidas de dados de seqüenciamento de cDNA (Wetsel, R. A. et al., Biochemistry 27:1474-1482 (1988); Haviland, D.L. et al., J. Immunol. 146:362-368 (1991); Wetsel, R. A. et al., Biochemistry 26:737-743 (1987)). A seqüência de aminoácidos deduzida de pré-pró-C5 humano precursor tem 1.676 aminoácidos. As cadeias α e β de C5 maduro têm 999 e 10 655 aminoácidos, respectivamente. C5 é glicosilado na cadeia α de C5, em particular a asparagina no resíduo 64.
C5 é decomposto nos fragmentos C5a e C5b, durante ativação das rotas complementares. As enzimas convertase responsáveis pela ativação de C5 são complexos de subunidades múltiplas de C4b, C2a e C3b para 15 a rota clássica e de (C3b)2, Bb e P para a rota alternativa (Goldlust, Μ. B. et w al., J. Immunol. 113:998-1007 (1974); Schreiber, R. D. et al., Proc. Natl.
Acad. Sei. 75:3948-3952 (1978)). C5 é ativado por decomposição na posição 74-75 (Arg-Leu) na cadeia a. Após ativação, o peptídio de 74 aminoácidos de 11,2 kD C5a da parte terminal de amino da cadeia α é liberado. O peptí20 dio C5a partilha propriedades de anafilatoxina similares com aquelas apresentadas por C3a, mas é 100 vezes mais potente, em uma base molar, na elicitação de respostas inflamatórias. Ambos os C5a e C3a são estimuladores potentes de neutrófilos e monócitos (Schindler, R. et al., Blood 76:16311638 (1990); Haeffner-Cavaillon, N. et al., J. Immunol. 138:794-700 (1987);
Cavaillon, J. M. et al., Eur. J. Immunol. 20:253-257 (1990)). Além do mais, mostrou-se recentemente que o receptor C3a é importante para proteção contra choque induzido por endotoxina em um modelo de camundongo (Kildsgaard, J. etal., J. Immunol. 165:5406-5409 (2000)).
Além das suas propriedades anafilatóxicas, o C5a induz migra30 ção quimiotática de neutrófilos (Ward, P. A. et al., J. Immunol. 102:93-99 (1969)), eosinófilos (Kay, A. B. et al., Immmunol. 24:969-979 (1973)), basófilos (Lett-Brown, Μ. A. et al., J. Immunol. 117:246-252 (1976)), e monócitos
o2ü (Snyderman, R. et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 138:387-390 (1971)). A atividade do C5a é regulada pela carboxipeptidase da enzima do plasma N (E. C. 3.4.12.7), que remove a arginina de terminal carbóxi do C5a formando o derivado de C5a des Arg (Goetzi, E. J. et al., J. Clin. Invest. 53:591-599 5 (1974)). Em uma base molar, o C5a des Arg apresenta apenas 1% da atividade anafilática (Gerard, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 78:1833-1837 (1981)) e atividade quimiotática polimorfonuclear como C5a não-modificado (Chenoweth, D. E. et al., Mol. Immunol. 17:151-161 (1980)). Ambos o C5a e o C5b-9 ativam as célula endoteliais para expressar as moléculas de adesão 10 essenciais para seqüestro de leucócitos ativados, que mediam inflamação e dano de tecido (Foreman, K. E. et al., J. Clin. Invest. 94:1147-1155 (1994); Foreman, K. E. et al., Inflammation 20:1-9 (1996); Rollins, S. A. et al., Transplantation 69:1959-1967 (2000)). O C5a também media as reações inflamatórias por provocar contração de músculo liso, aumentar a permeabilidade 15 vascular, induzir a desgranulação de basófilos e células da mama e induzir a ♦ liberação de proteases lipossomais e radicais livres oxidantes (Gerard, C. et al., Ann. Rev. Immunol. 12:775-808 (1994)). Além do mais, o C5a modula a expressão de gene de fase aguda hepática e aumenta a resposta imune global por aumento da produção de TNFa, IL-1 β, IL-6 e IL-8 (Lambris, J. D.
et al., em: The Human Complement System in Health and Disease, Volanakis, J. E. ed., Marcei Dekker, New York, pp. 83-118).
O receptor de C5a humano (C5aR) foi clonado (Gerard, N. P. et al., Nature 349:614-617 (1991); Boulay, F. et al., Biochemistry 30:2993-2999 (1991)). Pertence a uma superfamília de receptores acoplados com proteína
G de domínio de sete transmembranas. C5aR é expresso em neutrófilos, monócitos, basófilos, eosinófilos, hepatócitos, células de músculo liso do pulmão e endoteliais, e tecidos glomerulares renais (Van-Epps, D. E. et al.,
J. Immunol. 132:2862-2867 (1984); Haviland, D. L. et al., J. Immunol. 154:1861 - 1869 (1995); Wetsel, R. A., J. Immunol. Lett. 44:183-187 (1995);
Buchner, R. R. et al., J. Immunol. 155:308-315 (1995); Chenoweth, D. E. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 75:3943-3947 (1978); Zwirner, J. et al., Mol. Immunol. 36:877-884 (1999)). O local de ligação do ligante do C5aR é comple5
xo e consiste em pelo menos dois domínios de ligação separáveis fisicamente. Um liga o término de amino (aminoácidos 1-20) C5a e o núcleo ligado ao dissulfeto (aminoácidos 21-61), enquanto o segundo liga a extremidade terminal carbóxi C5a (aminoácidos 62-74) (Wetsel, R. A., Curr. Opin. Im5 munol. 7:48-53 (1995)).
O C5a desempenha papéis importantes em inflamação e lesão de tecido. Em desvio e hemodiálise cardiopulmonar, o C5a é formado em conseqüência da ativação da rota complementar alternativa, quando o sangue humano faz contato com a superfície artificial da máquina coração10 pulmão ou máquina de diálise de rim (Howard, R. J. et al., Arch. Surg. 123:1496-1501 (1988); Kirklin, J. K. et al., J. Cardiovasc. Surg. 86:845-857 (1983); Craddock, P. R. et al., N. Engl. J. Med. 296:769-774 (1977)). O C5a provoca maiores permeabilidade e edema capilar, broncoconstrição, vasoconstrição pulmonar, ativação de leucócitos e plaquetas e infiltração em te15 cidos, em particular o pulmão (Czermak, B. J. et al., J. Leukoc. Biol. 64:40-48 p (1998)). A administração de um anticorpo monoclonal anti-C5a foi mostrada reduzir o desvio cardiopulmonar e a disfunção endotelial coronária induzida por cardioplegia (Tofukuji, M, et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 116:10601068(1998)).
O C5a é também envolvido em síndrome da angústia respiratória do adulto (ARDS) e falha de órgãos múltipla (MOF) (Hack, C. E. et al., Am. J. Med. 1989, 86:20-26; Hammerschmidt D. E. et al., Lancet 1980; 1:947-949; Heideman M. et al. J. Trauma 1984, 4:1038-1043). O C5a aumenta a produção de monócitos de duas importantes citocinas pró25 inflamatórias importantes, TNFa e IL-1. O C5a também mostrou desempenhar um papel importante no desenvolvimento de lesão de tecido e, particularmente, lesão pulmonar, em modelos animais de choque séptico (Smedegard G. et al., Am. J. Pathol. 1989; 135:489-497). Em modelos de sépsis usando ratos, porcos e primatas não-humanos, os anticorpos anti-C5a admi30 nistrados aos animais, antes do tratamento com endotoxina ou E. coli, resultou em uma menor lesão do tecido, bem como uma menor produção de IL-6 (Smedegard G. et al., Am. J. Pathol. 135:489-497 (1989); Hopken, U. et
al., Eur. J. Immunol. 26:1103-1109 (1996); Stevens, J. H. et al., J. Clin. Invest. 77:1812-1816 (1986)). Significativamente, o bloqueio de C5a com anticorpos policlonais anti-C5a mostrou aperfeiçoar sobremaneira as taxas de sobrevivência em um modelo de ligação/perfuração cecal de sépsis em ratos (Czermak, B. J. et al., Nat. Med. 5:788-792 (1999)). Este modelo partilha muitos aspectos da manifestação clínica de sépsis em seres humanos (Parker, S. J. et al., Br. J. Surg. 88:22-30 (2001)). No mesmo modelo de sépsis, os anticorpos anti-C5a mostraram inibir apoptose de timócitos (Guo, R. F. et al., J. Clin. Invest. 106:1271-1280 (2000)) e impedem MOF (Huber-Lang, M. et al., J. Immunol. 166:1193-1199 (2001)). Os anticorpos anti-C5a também foram protetores em um modelo de fator de veneno de cobra de lesão de pulmão em ratos e em lesão de pulmão induzida por complexo imune (Mulligan, M. S. et al. J. Clin. Invest. 98:503-512 (1996)). A importância do C5a em lesão de pulmão medida por complexo imune foi posteriormente confirmada em camundongos (Bozic, C. R. et al., Science 26:1103-1109 (1996)).
Verificou-se que o C5a é um importante mediador em lesão por isquemia-reperfusão miocárdica. A depleção do complemento reduziu a dimensão do infarto miocárdico em camundongos (Weisman, H. F. et al., Science 249:146-151 (1990)), e o tratamento com anticorpos anti-C5a reduziu a lesão em um modelo de rato de isquemia-reperfusão de membro posterior (Bless, Ν. M. et al., Am. J. Physiol. 276:L57-L63 (1999)). A lesão por reperfusão durante infartação miocárdica foi também significativamente reduzida em porcos, que foram retratados com um IgG anti-C5a monoclonal (Amsterdam, E. A. et al., Am. J. Physiol. 268:H448-H457 (1995)). Um antagonista C5aR humano recombinante reduz o grau de infarto em um modelo porcino de revascularização cirúrgica (Riley, R. D. et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 120:350-358 (2000)).
Os níveis de complemento são elevados em pacientes com artrite reumatóide e lúpus eritematoso sistêmico. Os níveis de C5a se correlacionam com a gravidade do estado da doença (Jose, P. J. et al., Ann.
Rheum. Dis. 49:747-752 (1989); Porcel, J. M. et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 74:283-288 (1995)). Portanto, a inibição de C5a e/ou receptor de C5a
(C5aR) pode ser útil no tratamento dessas doenças crônicas.
A expressão de C5aR é supra-regulada em astrócitos, micróglia e células endoteliais reativos em um sistema nervoso central humano inflamado (Gasque, P. et al., Am. J. Pathol. 150:31-41 (1997)). O C5a pode ser envolvido em doenças neurodegenerativas, tal como doença de Alzheimer (Mukherjee, P. et al., J. Neuroimmunol. 105:124-130 (2000)). A ativação de C5aR neuronal pode induzir apoptose (Farkas I. et al., J. Physiol. 1998; 507:679-687). Portanto, a inibição de C5a e/ou C5aR pode ser também útil no tratamento de doenças neurodegenerativas.
A psoríase é agora conhecida como sendo uma doença mediada por célula T (Gottlieb, E. L. et al., Nat. Med. 1:442-447 (1995)). No entanto, os neutrófilos e células da mama também podem ficar envolvidos na patogênese da doença (Terui, T. et al., Exp. Dermatol. 9:1-10, 2000); Werfel, T. et al., Arch. Dermatol. Res. 289:83-86 (1997)). Altos níveis de C5a des Arg são encontrados em escalas psoriáticas, indicando que a ativação do complemento está envolvida. As células T e os neutrófilos são atraídos quimicamente pelo C5a (Nataf, S. et al., J. Immmunol. 162:4018-4023 (1999); Tsuji, R. F. et al., J. Immunol. 165:1588-1598 (2000); Cavaillon, J. M. et al., Eur. J. Immunol. 20:253-257 (1990)). Portanto, o C5a pode ser um alvo terapêutico
importante para o tratamento de psoríase.
Os complexos imunes (IC) contendo imunoglobulina G contribuem para a patofisiologia em várias doenças auto-imunes, tais como lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatóide, síndrome de Goodpasture e pneumonite de hipersensibilidade (Madaio, Μ. P., Semin. Nephrol. 19:48-56 25 (1999); Korganow, A. S. et al., Immunity 10:451-459 (1999); Bolten; W. K.,
Kidney Int. 50:1754-1760 (1996); Ando, M. et al., Curr. Opin. Pulm. Med.
3:391-399 (1997)). O modelo animal clássico para a resposta inflamatória nestas doenças IC é a reação de Arthus, que apresenta a infiltração de células polimorfonucleares, hemorragia e exsudação do plasma (Arthus, M., C.
R. Soc. Biol. 55:817-824 (1903)). Estudos recentes mostraram que os camundongos deficientes em C5aR são protegidos de lesão de tecido induzida por IC (Kohl, J. et al., Mol. Immunol. 36:893-903 (1999); Baumann, U. et al.,
J. Immunol. 164:1065-1070 (2000)). Os resultados são consistentes com a observação de que um pequeno antagonista anti-C5aR peptídico inibe a resposta inflamatória provocada pela deposição IC (Strachan, A. J. et al., J. Immunol. 164:6560-6565 (2000)). Juntamente com esse receptor, o C5a de5 sempenha um papel importante na patogênese de doenças IC. Os inibidores de C5a e C5aR podem ser úteis para tratar essas doenças.
O pedido de patente internacional WO 01/15731A1 discute composições e métodos de tratamento de sépsis usando anticorpos para C5a. Estes anticorpos reagem apenas com a região N-terminal do peptídio C5a e 10 não reagem em cruzamento com C5.
O pedido de patente internacional WO 86/05692 discute o tratamento de síndrome da angústia respiratória do adulto (ARDS) com um anticorpo específico para C5a ou o seu derivado des Arg. Também descreve o tratamento de sépsis por administração deste anticorpo. Este anticorpo foi 15 produzido em resposta ao derivado C5a des Arg, porque é mais imunogênico, mas vai elicitar anticorpos reativos em cruzamento com C5a. A patente U.S. 5.853.722 discute os anticorpos anti-C5, que bloqueiam a ativação de C5 e desse modo a formação de C5a e C5b.
A patente U.S. 6.074.642 discute o uso de anticorpos anti-C5 20 para tratar glomerulonefrite. Estes anticorpos também bloqueiam a geração de C5a e C5b, inibindo o efeito de ambos o C5a e a formação de C5b-9. A patente U.S. 5.562.904 discute os anticorpos anti-C5, que bloqueiam completamente a formação de MAC.
Em outras discussões de anticorpos anti-C5, os anticorpos des25 critos bloqueiam a ativação de C5 e a sua decomposição para formar C5a e C5b (Vakeva, A. P. et al., Circulation 97:2259-2267 (1998); Thomas, T. C. et al., Mol. Immunol. 33:1389-1401 (1996); Wang, Y et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93:8563-8568 (1996); Kroshus, T. et al., Transplantation 60:1194-1202 (1995); Frei, Y. et al., Mol. Ce// Probes 1:141-149 (1987)).
Os anticorpos monoclonais reativos em cruzamento com C5,
C5a ou C5a des Arg foram relatados (SChuIze, M. et al., Complement 3:2539 (1986); Takeda, J. et al., J. Immunol. Meth. 101:265-270 (1987); Inoue,
K., Complement Inflamm. 6:219-222 (1989). Também relatou-se que os anticorpos monoclonais reativos em cruzamento com os C5 e C5a inibem a liberação de ATP mediada por C5a de plaquetas de porcos-da-índia (Klos, A. et al., J. Immunol. Meth. 111:241-252 (1988); Oppermann, M. et al., Comple5 ment Inflamm. 8:13-24 (1991)).
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A ativação de C5 normalmente resulta na decomposição de C5 em C5a e C5b. As moléculas de inibidores da presente invenção se ligam, com grande afinidade, aos C5 e C5a, não inibem a ativação do C5 e não 10 impedem a formação ou inibem a atividade de C5b. Um exemplo desse inibidor é o anticorpo monoclonal designado MAb 137-26, que se liga a um epítopo compartilhado em C5 e C5a humanos. O hibridoma que produz o anticorpo monoclonal 137-26 foi depositado em American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, com o número 15 de acesso PTA-3650 em 17 de agosto de 2001.
As moléculas de inibidores da invenção também incluem: (i) outros anticorpos ou seus fragmentos, peptídeos, oligonucleotídeos ou peptidomiméticos que se ligam a C5 e C5a com grande afinidade, mas não inibem a ativação de C5 e não impedem a formação ou inibição da atividade 20 de C5b, ou (ii) qualquer anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo monoclonal 137-26. Os fragmentos de anticorpos incluem Fab, F(ab')2, Fv ou Fv de cadeia única, e os anticorpos monoclonais e fragmentos da invenção incluem anticorpos ou fragmentos quiméricos, Delmmunized®, humanizados ou humanos, e outras formas aceitáveis para uso humano. As 25 moléculas de inibidores podem ser incluídas como parte de uma composição farmacêutica.
As moléculas de inibidores da invenção são úteis no tratamento de doenças e condições envolvendo a produção excessiva ou descontrolada de C5a, ou para uso diagnóstico na detecção da presença ou quantificação de C5a.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
A Figura 1 mostra a ligação de MAb 137-26 (anti-C5a, quadrados fechados) e MAb 137-76 (anti-C5 de cadeia β, círculos abertos) em C5 humano purificado em ELISA. Um anticorpo monoclonal irrelevante seme5 lhante a um isotipo foi usado como um controle negativo. O eixo Y representa a reatividade dos MAbs com C5a expressa como a densidade óptica (OD) a 450 nm e o eixo X representa a concentração dos MAbs. O MAb 13726 reagiu com C5a humano, enquanto que o MAb 137-76 e o anticorpo de controle irrelevante não.
A Figura 2 mostra a ligação de MAb 137-26 (quadrados fechados) e MAb 137-76 (círculos abertos) em C5 purificado humano em ELISA. Um anticorpo monoclonal irrelevante semelhante a um isotipo foi usado como um controle negativo. O eixo Y representa a reatividade dos MAbs com C5a expressa como a densidade óptica (OD) a 450 nm e o eixo X re15 presenta a concentração dos MAbs. Ambos o MAb 137-26 e o MAb 137-76 » reagiram com C5a humano, enquanto que o anticorpo de controle irrelevante não.
A Figura 3 mostra a incapacidade do MAb 137-26 anti-C5a de inibir a hemodiálise medida por complemento de células de sangue vermelho
de frangos, através da rota clássica (CP). O MAb 175-62 anti-C2 inibiu efetivamente a hemodiálise. Um anticorpo monoclonal irrelevante semelhante a
A Figura 5 mostra a inibição da ligação de C5a humano radioioum isotipo não teve qualquer efeito. O eixo Y representa o percentual de inibição de hemodiálise, como já descrito no texto. O eixo X representa a concentração dos anticorpos monoclonais.
A Figura 4 mostra a incapacidade do MAb 137-26 anti-C5a de inibira hemodiálise medida por complemento de células de sangue vermelho de coelhos, através da rota alternativa (AP). O MAb 166-32 antifator D inibiu efetivamente a hemodiálise. Um anticorpo monoclonal irrelevante semelhante a um isotipo não teve qualquer efeito. O eixo Y representa o percen30 tual de inibição de hemodiálise, como já descrito no texto. O eixo X representa a concentração dos anticorpos monoclonais.
Λγ * 10
dado (125l) em neutrófilos humanos purificados. O controle positivo, C5a humano recombinante purificado (rHuC5a), inibiu a ligação. Um anticorpo monoclonal irrelevante semelhante a um isotipo não mostrou qualquer efeito. O eixo Y representa a inibição percentual de ligação 125l-C5a, como já descrito no texto. O eixo X representa a concentração dos agentes competitivos.
A Fiaura 6 mostra o eDÍtoDO de liaacão de MAb 137-26 em C5a v Λ humano mapeado por peptídios sintéticos sobrepostos em membrana de celulose.
A Figura 7A mostra a expressão CD11 b em neutrófilos humanos estimulados por E. coli opsonizado em modelo de sangue integral anticoagulado de lepirudina. O MAb 137-26 anti-C5/C5a (círculos fechados) inibiu a expressão CD11b mais efetivamente do que o MAb561 anti-C5a (Dr. Jurg Kohl, quadrados fechados) e o MAb 137-30 anti-C5 (triângulos fechados). Este anticorpo inibiu a ativação de C5. O Mab irrelevante (triângulos invertidos fechados) não teve qualquer efeito. O eixo Y representa a intensidade de fluorescência média (MFI) medida por imunofluorocitometria. O eixo X representa a concentração dos anticorpos (pg/ml). T-0 = amostra de sangue integral da linha de base no tempo 0 min. T-10 = sangue integral incubado apenas com PBS por 10 min sem E. coli. Outras amostras, com ou sem inibores, tinham E. coli adicionado.
A Figura 7B mostra a expressão de CD11b em neutrófilos humanos estimulados por E. coli opsonizado em um modelo de sangue integral anticoagulado de lepidurina. O MAb 137-26 anti-C5/C5a (círculos fechados) inibiu, mais efetivamente, a expressão de CD11b do que um antagonista peptídico C5aR (Dr. Stephen Taylor) (quadrados fechados). O peptídio irrelevante não teve qualquer efeito (triângulos invertidos fechados). O eixo Y representa uma intensidade de fluorescência média (MFI) medida por imunofluorocitometria. O eixo X representa a concentração dos anticorpos/peptídio (pg/ml). T-0 = amostra de sangue integral da linha de base no tempo 0 min. T-10 = sangue integral incubado apenas com PBS por 10 min sem E. coli. Outras amostras, com ou sem inibores, tinham E. coli adicionado.
Μ
Α Figura 7C mostra a explosão oxidante de neutrófilos humanos estimulada por E. coli opsonizado em um modelo de sangue integral anticoagulado de lepirudina. Ambos os MAb 137-26 anti-C5/C5a (círculos fechados) e MAb 137-30 anti-C5 (triângulos fechados) inibiram, mais efetivamen5 te, a explosão oxidante do que o MAb561 anti-C5a (quadrados fechados). O anticorpo irrelevante (triângulos invertidos fechados) não teve qualquer efeito. O eixo Y representa uma intensidade de fluorescência média (MFI) medida por imunofluorocitometria. O eixo X representa a concentração dos anticorpos/peptídio (gg/ml). T-0 = amostra de sangue integral da linha de base 10 no tempo 0 min. T-10 = sangue integral incubado apenas com PBS por 10 min sem E. coli. Outras amostras, com ou sem inibores, tinham E. coli adicionado.
A Figura 7D mostra a explosão oxidante de neutrófilos humanos estimulada por E. coli opsonizado em um modelo de sangue integral antico15 agulado de lepirudina. O MAb 137-26 anti-C5/C5a foi mais efetivo do que um antagonista C5aR peptídico (quadrado fechado) na inibição de explosão oxidante. O peptídio irrelevante não teve qualquer efeito. O eixo Y representa uma intensidade de fluorescência média (MFI) medida por imunofluorocitometria. O eixo X representa a concentração dos anticorpos/peptídio (gg/ml). 20 T-0 = amostra de sangue integral da linha de base no tempo 0 min. T-10 = sangue integral incubado apenas com PBS por 10 min sem E. coli. Outras amostras, com ou sem inibores, tinham E. coli adicionado.
A Figura 8 mostra o extermínio mediado por MAC de Neisseria meningitides em um modelo de sangue integral anticoagulado de lepidurina. 25 As bactérias foram exterminadas efetivamente com o sangue integral humano, na presença de MAb 137-26 anti-C5/C5a (círculos fechados), um MAb irrelevante (triângulos fechados), ou PBS (quadrados abertos). Em contraste, as bactérias não foram exterminadas, quando o sangue integral foi tratado com MAb 137-30 anti-C5 (losangos abertos), que inibiu a ativação de C5 e, 30 desse modo, a formação de MAC. O eixo Y representa as unidades de formação de colônia (CFU) por 100 μΙ de sangue integral incubado por 24 horas a 37°C em ágar-sangue. O eixo X representa os diferentes pontos de • · tempo de coleta de amostra de sangue do experimento de cultura de sangue integral.
DESCRIÇÃO DETALHADA
1. Vantagens da Invenção
Os inibidores da invenção, incluindo o anticorpo monoclonal MAb 137-26, são vantajosos em relação aos inibidores de anticorpos monoclonais para o tratamento de inflamação e dano de tecido medidos por complemento. O MAb 137-26 é capaz de se ligar ao C5, antes de ser ativado. Após ativação do C5, para formar o C5a, o anticorpo pode neutralizar o C5a, que é uma anafilatoxina. Normalmente, uma vez que o C5a é formado, ligase rapidamente ao C5aR nas células, disparando, desse modo, a cascata de transdução do sinal provocando inflamação. O MAb 137-26 não inibe a decomposição de C5, para formar C5a e C5b, mas o C5a se mantém ligado ao MAb 137-26, após ser produzido, e inibe a ligação de C5a em C5aR. A formação de C5b-9, no entanto, não é afetada e, visto que o C5b-9 é necessário para a formação de MAC, que é envolvido no extermínio de bactérias, a manutenção da produção de C5b-9 é importante para uma resposta imune protetora.
O MAb 137-26 pode neutralizar efetivamente os efeitos inflamatórios do C5a, mas ainda outros componentes da cascata complemento, incluindo C3 e C5b-9, para mediar as funções antibacterianas. A propriedade farmacológica é excepcionalmente importante com relação ao tratamento de sépsis bacteriana, doenças IC crônicas e psoríase.
2. Produção e uso da invenção
A. Anticorpos monoclonais
Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos por uso do processo de hibridoma descrito primeiro por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), ou podem ser produzidos por métodos de DNA recombinante (patente U.S. 4.816.567).
No método de hibridoma, um camundongo ou outro animal hospedeiro adequado é neutralizado como descrito acima para elicitar os linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos, que vão se ligar,
especificamente, à proteína usada para imunização. Os animais também podem ser imunizados com constructos de DNA, para expressar as proteínas de codificação ex vivo, para induzir anticorpos específicos. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Os linfócitos são então 5 fundidos com células de mieloma, usando um agente de fusão adequado, tal como polietileno glicol para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).
As células de hibridoma assim preparadas são semeadas e 10 crescidas em um meio de cultura adequado, que contém, de preferência, uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência das células de mieloma parentais, não-fundidas. Por exemplo, se as células de mieloma parentais carecem da enzima de hipoxantina guanina fosforibosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas vai 15 incluir, tipicamente, hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), cujas substâncias impedem o crescimento de células deficientes em HGPRT.
As células de mieloma preferidas são aquelas que fundem eficientemente, suportam produção em alto nível estável de anticorpo pelas células produtoras de anticorpos selecionadas, e são sensíveis a um meio, tal 20 como meio HAT. Entre essas linhas de células de mieloma estão as linhas de mieloma de murino, tais como aquelas derivadas de tumores de camundongo MOPC-21 e MPC-11 disponíveis do Centro de Distribuição de Células do Instituto Salk, San Diego, Calif., EUA e as células SP2/0 ou X63-Ag8-653 disponíveis da Coleção de Culturas do Tipo Norte-Americano, Rockville, Md., 25 EUA. As linhas celulares de mieloma e de heteromieloma de camundongohumana foram também descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcei Dekker, Inc., New York, 1987)). A linha celular de mieloma de camundongo 30 NSO também pode ser usada (European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido).
O meio de cultura no qual as células de hibridoma são crescidas é ensaiado para a produção de anticorpos monoclonais contra o antígeno. A especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais produzidos pelas células de hibridoma pode ser determinada por imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA).
Após as células de hibridoma serem identificadas, que produzem anticorpos de especificidade, afinidade e/ou atividade desejada, os clones podem ser subclonados por limitação dos procedimentos de diluição e crescidos por métodos usuais (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Os meios de cultura adequados para esta finalidade incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser crescidas in vivo, como tumores de ascite em um animal.
Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones são separados adequadamente do meio de cultura, fluido de ascite ou soro por procedimentos de purificação de imunoglobulina convencionais, tais como, por exemplo, proteína A-Sepharose, cromatografia de hidroxiapatita, eletroforese de gel, diálise ou cromatografia de afinidade.
O DNA codificando os anticorpos monoclonais é facilmente isolado e seqüenciado, usando-se procedimentos convencionais (Innis M. et al. In PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic, San Diego, CA (1990), Sanger, F. S., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 74;5463-5467 (1977)). As células de hibridoma servem como uma fonte de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado nos vetores de expressão, que são depois transfectados para as células hospedeiras, tais como células de E. coli, células COS símias, células de ovário de hamster chinês (CHO), ou células de mieloma que não produzem de outro modo proteína de imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. A produção recombinante de anticorpos vai ser descrita em mais detalhes abaixo.
Em uma outra concretização, os anticorpos ou fragmentos de anticorpos podem ser isolados das bibliotecas de fagos de anticorpos gera16
das por uso de técnicas descritas por McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) e Marks, et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991) descrevem o isolamento de anticorpos de murino e humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fagos. Publicações sub5 seqüentes descrevem a produção de anticorpos humanos de alta afinidade (faixa nM) por embaralhamento de cadeias (Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992), bem como infecção combinatória e recombinação in vivo, como uma estratégia para construção de bibliotecas de fagos muito grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993)). Desse modo, 10 estas técnicas são alternativas viáveis para as técnicas de hibridoma de anticorpos monoclonais para o isolamento dos anticorpos monoclonais.
O DNA também pode ser modificado, por exemplo, por substituição da seqüência de codificação para domínios constantes de cadeias leves e pesadas, em lugar das seqüências de murinos homólogas (patente U.S.
4.816.567; Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci., EUA 81:6851 (1984)), ou por ligação covalente à seqüência de codificação de imunoglobulina, toda ou uma parte da seqüência de codificação para um polipeptídio nãoimunoglobulina.
Tipicamente, esses polipeptídios não-imunoglobulina são subs-
tituídos por domínios constantes de um anticorpo, ou são substituídos pelos domínios variáveis de um sítio em combinação com antígeno de um anticorpo, para criar um anticorpo bivalente quimérico, compreendendo um sítio de combinação com antígeno tendo especificidade para um antígeno ou um outro sítio de combinação com antígeno tendo especificidade para um antí25 geno diferente.
Outra alternativa é o uso de fusão elétrica em vez de fusão química, para a formação de hibridomas. Esta técnica é bem-estabelecida. Em vez de fusão, pode-se também transformar uma célula B, para torná-la imortal, usando, por exemplo, um Vírus Epstein-Barr ou um gene de trans30 formação. (Consultar, por exemplo, Continuously Proliferating Human Cell Lines Synthesizing Antibody of Predetermined Specificity, Zurawaki, V. R. et al., in Monoclonal Antibodies, ed. por Kennett R. H. et al., Plenum Press,
Ν.Υ., 1980, pp. 19-33).
B. Anticorpos humanos e humanizados
Um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos nele de uma fonte, que não é humana. Estes resíduos de 5 aminoácidos não-humanos são freqüentemente referidos como resíduos de importação, que são tipicamente de um domínio variável de importação. A humanização pode ser feita essencialmente seguindo o processo de Winter e colaboradores (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 10 (1988)), por substituição de CDRs ou seqüências de CDRs para as seqüências correspondentes de um anticorpo humano. Conseqüentemente, nesses anticorpos humanizados, um domínio substancialmente menor do que o variável humano intacto foi substituído pela seqüência correspondente de uma espécie não-humana. Na prática, anticorpos humanizados são, tipica15 mente, anticorpos humanos, nos quais alguns resíduos CDR e, possivelmente, alguns resíduos FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores.
A seleção de domínios variáveis humanos, tanto leves quanto pesados, a ser usada na produção dos anticorpos humanizados é muito im20 portante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o método denominado melhor ajustamento, a seqüência do domínio variável de um anticorpo de roedor é avaliada contra toda a biblioteca de seqüências de domínios variáveis humanos conhecidos. A seqüência humana, que é mais próxima daquela do roedor, é então aceita como o esqueleto humano (FR) para o anti25 corpo humanizado (Sims et al., J. Immunol. 151:296 (1993); Chothia et al., J.
Mol. Biol. 196:901 (1987)). Outro processo usa um esqueleto particular derivado da seqüência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves ou pesadas. O mesma esqueleto pode ser usado para vários diferentes anticorpos humanizados (Carter et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. EUA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)).
É ainda importante que os anticorpos sejam humanizados com
retenção de alta afinidade para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objetivo, de acordo com um processo preferido, os anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das seqüências parentais e de vários produtos humanizados conceituais usando 5 modelos tridimensionais das seqüências parentais e humanizadas são comumente disponíveis e são familiares para aqueles versados na técnica. Programas de computador são disponíveis, que ilustram e exibem prováveis estruturas conformacionais tridimensionais de seqüências de imunoglobulina candidatas selecionadas. A inspeção dessas exibições permite a análise do 10 provável papel dos resíduos no funcionamento da seqüência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise do resíduo que influencia a capacidade da imonoglobulina candidata em ligar-se ao antígeno. Desse modo, os resíduos FR podem ser selecionados e combinados das superfícies recipientes e importadas, de modo que a característica do anticorpo desejada, tal como mai15 or afinidade para o(s) antígeno(s) alvo, é obtida. Em geral, os resíduos CDR são direta e mais substancialmente envolvidos na influência da ligação do antígeno.
Alternativamente, um pesquisador versado na técnica pode produzir animais transgênicos (por exemplo, camundongos), que são capazes, 20 após imunização, de produzir um repertório integral de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Esses camundongos transgênicos são disponíveis da Abgenix, Inc., Fremont, Califórnia e da Medarex, Inc., Annandale, Nova Jersey. Descreveu-se que a deleção homozigota do gene da região de união (JH) de cadeia pesada de anticorpo em 25 camundongos quiméricos e mutantes da linha de germes resulta na inibição completa da produção de anticorpos endógenos. A transferência da disposição de genes de imunoglobulina da linha de germes humanos nesses camundongos mutantes da linha de germes vai resultar na produção de anti-* corpos humanos por desafio com antígenos. Consultar, por exemplo, Jako30 bovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al.,
Nature 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); e Duchosal et al. Nature 355:258 (1992). Os anticorpos humanos
podem ser também derivados de bibliotecas de exibição de fagos (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol.
222:581-597 (1991); Vaughan etal., Nature Biotech 14:309 (1996)).
C. Anticorpos Delmmunised®
Os anticorpos Delmmunised® são anticorpos nos quais os epítopos de células T foram eliminados, como descrito no pedido de patente internacional PCT/GB98/01473. Portanto, a imunogenicidade em seres humanos é esperada ser eliminada ou substancialmente reduzida, quando são aplicados in vivo.
Adicionalmente, os anticorpos podem ser modificados quimicamente por conjugação covalente a um polímero, para aumentar, por exemplo, a meia-vida circulante deles. Os polímeros preferidos e os processos de fixação deles em peptídios são apresentados nas patentes U.S. 4.766.106, 4.179.337. 4.495.285 e 4.609.546, que são todas aqui inteiramente incorpo15 radas por referência. Os polímeros preferidos são os polióis polioxietilados e poli (glicol etilênico) (PEG). PEG é solúvel em água à temperatura ambiente e tem um peso molecular ponderai médio entre 1.000 e 40.000, particularmente, entre 2.000 e 20.000, particularmente, entre 3.000 e 12.000.
D. Geração de MAbs anti-C5/C5a
Os anticorpos da presente invenção podem ser gerados por técnicas de hibridoma tradicionais bem-conhecidas na técnica. Sucintamente,
M. 1450) (Kodak, Rochester, NY) e 5% de dimetilsulfóxido (Sigma Chemical os camundongos são imunizados com C5 purificado de soros humanos, como um imunogênio emulsificado em auxiliar de Freund completo, e injetado subcutaneamente em quantidades variando de 10-100 pg. Dez a quinze 25 dias depois, os animais imunizados são reforçados com mais C5 emulsificado em auxiliar de Freund incompleto. Os camundongos são periodicamente reforçados depois em um plano de imunização semanal a bissemanal.
Para cada fusão, suspensões de células únicas foram preparadas do baço de um camundongo imunizado e usadas para fusão com célu30 Ias de mieloma SP2/0. As células SP2/0 (1 x 108) e as células do baço (1 x
108) foram fundidas em um meio contendo 50% de poli (glicol etilênico) (P.
Co., St. Louis, MO). As células foram depois ajustadas a uma concentração de 1,7 x 105 células do baço/ml da suspensão em meio DMEM (Gibco, Grand Island, NY), suplementado com 5% de soro bovino fetal e HAT (10 mM de hipoxantina sódica, 40 μΜ de aminopterina e 1,6 mM de timidina).
Duzentos e cinqüenta microlitros da suspensão celular foram adicionados a cada cavidade de cerca de cinqüenta placas de microtestes de 96 cavidades. Após cerca de dez dias de cultura, os sobrenadantes foram retirados
para triagem para reatividade com C5 humano purificado por ELISA.
Cavidades de placas de microteste de Immulon II (Dynatech La10 boratories, Chantilly, VA) foram revestidos de um dia para o outro com C5 humano a 0,1 pg/ml (50 μΙ/cavidade). Os sítios de ligação não-específicos nas cavidades foram depois saturados por incubação com 200 μΙ de BLOTTO (leite seco desnatado) 5% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por uma hora. As cavidades foram depois lavados com tampão PBST (PBS contendo TWEEN® 20 0,05%). Cinqüenta microlitros de sobrenadante de cultura de cada cavidade de fusão foram adicionados à cavidades, juntamente com 50 μΙ de BLOTTO por uma hora à temperatura ambiente. As cavidades foram lavadas com PBST. Os anticorpos ligados foram depois detectados por reação com IgG (específico Fc) anticamundongo de bode con20 jugado com peroxidase de rábano-silvestre (HRP) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA), por uma hora à temperatura ambiente. As cavidades foram depois lavadas com PBST. A solução do substrato de peroxidase, contendo 0,1% de 3,3,5,5-tetrametil benzidina (Sigma, St. Louis, MO) e 0,003% de peróxido de hidrogênio (Sigma, St. Louis, MO) em acetato 25 de sódio 0,1 M a pH 6,0, foi adicionada às cavidades para desenvolvimento de cor por 30 minutos. A reação foi terminada por adição de 50 μΙ de H2SO4 2 M por cavidade. A densidade óptica (OD) foi lida a 450 nm com leitora de ELISA (Dynatech Laboratories, Chantilly, VA).
Os hibridomas nas cavidades positivas para reatividade de C5 foram clonados em célula única por um processo de difusão limitada. Os hibridomas monoclonais foram depois expandidos e os sobrenadantes da cultura coletados para purificação por cromatografia de proteína A. Os anti21
corpos purificados foram depois caracterizados para reatividade com C5 e C5a humanos por ELISA, para determinação das constantes de afinidade e ligação cinética por BIAcore, para efeitos na hemólise mediada por complemento, via ambas as rotas clássica e alternativa, e para inibição de ligação 5 de 125l-C5a em neutrófilos humanos purificados.
Os anticorpos podem ser também selecionados por triagem de uma biblioteca de scFv humano para aqueles que se ligam ao C5 (Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)). A especificidade e a atividade dos clones específicos podem ser determinadas usando ensaios conhecidos (Griffiths et 10 al.; Clarkson et al., Nature 352:642-648 (1991)). Após uma primeira etapa de triagem, obtém-se uma biblioteca de fago contendo uma pluralidade de diferentes anticorpos de cadeia única apresentados no fago, tendo ligação aperfeiçoada para C5. As etapas de triagem subseqüentes proporcionam outras bibliotecas com maiores afinidades de ligação. Quando os efeitos de 15 avidez são um problema, as bibliotecas de exibição de fagos monovalentes podem ser usadas, nas quais menos de 20%, menos de 10% ou menos de 1 % de fago apresentam mais de uma cópia de um anticorpo na superfície do fago. A exibição monovalente pode ser feita com o uso de fagemida e auxiliar de fago. Os fagos adequados incluem M13, fl e fago filamentoso fd. A exi-
bição da proteína de fusão com as proteínas de revestimento do vírus é também conhecida e pode ser usada nesta invenção.
MAb 137-26, que se liga a ambos o C5 e o C5a com afinidade comparável, foi caracterizado adicionalmente. O MAb 137-26 não inibe a ativação do C5, mas inibe com potência muito alta a ligação de C5a em 25 C5aR em neutrófilos humanos purificados. Os experimentos demonstrando estas propriedades são explicados adicionalmente nos exemplos abaixo.
Para avaliar os anticorpos que se ligam a um epítopo particular no antígeno de interesse (por exemplo, aqueles que bloqueiam a ligação de quaisquer dos anticorpos aqui descritos em C5), um ensaio de bloqueio cru30 zado rotineiro, tal como aquele descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory, Ed. Harlow e David Lane (1988), pode ser conduzido. Alternativamente, o mapeamento do epítopo, por exemplo, como
descrito por Champe et al., J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995), pode ser conduzido para determinar se o anticorpo se liga a um epítopo de interesse.
E. Produção de outros inibidores da invenção
Outras moléculas adequadas para uso na invenção podem ser isoladas ou avaliadas das bibliotecas de compostos por meios convencionais, por exemplo, por determinação se ligam-se aos C5/C5a, e depois fazendo um ensaio funcional para determinar se inibem a atividade do C5b.
Um sistema automatizado para gerar e avaliar uma biblioteca de compostos é descrito nas patentes U.S. 5.901.069 e 5.463.564. Abordagens mais foca10 lizadas envolvem um ensaio competitivo contra o MAb 137-26, ou produzindo um modelo tridimensional do sítio de ligação, e depois produzindo uma família de moléculas, que ajustam o modelo. Essas são depois avaliadas para aquelas com ótimas características de ligação. Além disso, outras moléculas podem ser identificadas por ensaio de competição, ou um ensaio 15 funcional para inibores com as mesmas propriedades que o MAb 137-26.
F. Uso dos inibidores da invenção
As moléculas da presente invenção podem ser administradas por qualquer uma de várias rotas e são administradas a uma concentração que é efetiva terapeuticamente, na identificação ou com a finalidade preten-
dida. Para atingir este objetivo, os anticorpos podem ser formulados usando vários excipientes aceitáveis conhecidos na técnica. Tipicamente, os anticorpos são administrados por injeção. Os processos para fazer esta administração são conhecidos daqueles versados na técnica. Também pode ser possível obter composições que podem ser administradas topicamente ou 25 oralmente, ou que podem ser capazes de transmissão por membranas mucosas.
A dosagem e o modo de administração vão depender do indivíduo e do agente a ser administrado. A dosagem pode ser determinada por experimentação rotineira em ensaios clínicos ou extrapolação de modelos animais nos quais o anticorpo foi efetivo.
Os anticorpos da presente invenção podem ser usados no tratamento de doenças e de condições mediadas por produção excessiva ou
descontrolada de C5a. A evidência da utilidade dos inibidores da invenção no tratamento dessas doenças e condições é apresentada abaixo.
Exemplo 1: Reatividade de MAb 137-26 com C5 e C5a humanos
O MAb 137-26 foi testado para reatividade com C5 e C5a re5 combinante humanos (Sigma, St. Louis, MO). Os procedimentos do ELISA são descritos abaixo. O MAb 137-26 se liga ao C5a de uma maneira dependente de dose com alta potência (Figura 1). Outro MAb 137-76 anti-C5, específico para a cadeia β de C5 humano, não se liga ao C5a, porque o C5a reside na cadeia α do C5. Um anticorpo irrelevante comparável com o isoti10 po, usado como um controle negativo, não reage com o C5a. Por outro lado, ambos os MAbs 137-26 e 137-76 se ligam ao C5 (Figura 2).
A constante de equilíbrio de afinidade e as constantes cinéticas de ligação (associação e dissociação) do MAb 137-26 com C5a e C5 foram também determinadas por um instrumento BIAcore (Pharmacia Biosensor 15 AB, Uppsala, Suécia). Todas as medidas de ligação foram feitas em solução salina tamponada com HEPES (HBS) (10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCI, 3,4 mM EDTA, 0,005% Tensoativo P20) a 25°C. Para medir as constantes da taxa de ligação de C5 e C5a em MAb 137-26, os anticorpos IgG (Fc) anticamundongo de coelho foram imobilizados em um sensorchip CM5
por acoplamento de amina usando N-hidroxissuccinimida e N-etil-N'-(3dietilaminopropil) carbodiimida. O MAb 137-26 foi depois capturado no sensorchip revestido, antes da injeção de C5 em diferentes concentrações. Os dados estão resumidos na Tabela 1. O MAb 137-26 tem uma alta afinidade de ligação por ambos o C5a e o C5 em fase de solução. Os resultados tam25 bém indicam que o MAb 137-26 se liga a um epítopo partilhado por ambos o C5a e o C5.
Tabela 1-Constantes cinéticas da ligação de C5 e C5a em MAb 137-26
KOn (M’1s1) Koff (S1) KD (M)
C5 1,42 χ 105 6,97 x 10'5 4,92 x 10’10
C5a 3,7 x 106 2,25 x 10-4 6,09 x 10‘11
kon, constante de associação cinética koff, constante de dissociação cinética kD, constante de dissociação de equilíbrio = koff/k0n
Exemplo 2: Hemodiálise mediada por complemento
Para estudar os efeitos do MAb 137-26 na ativação de C5 em soro humano, o anticorpo foi testado para inibição de hemodiálise mediada pelas rotas de complemento clássica e alternativa.
Para os experimentos de rota clássica, RBCs de frangos (5 χ 107 células/ml) em solução salina tamponada com gelatina/veronal (GVB++) 10 contendo MgCI2 0,5 mM e CaCI2 0,15 mM foram sensibilizados com imonoglobulinas RBC antifrangos de coelho purificadas a 8 pg/ml (Inter-Cell Technologies, Hoperwell, NJ) por 15 minutos a 4°C. As células foram depois lavadas com GVB++. As células lavadas foram ressuspensas no mesmo tampão a 1,7 χ 108 células/ml. Em cada cavidade de uma placa de micro15 teste de 96 cavidades de fundo redondo, 50 μΙ de soro humano normal (5,2%) foram misturados com 50 μΙ de GVB++ de MAb 137-26 ou um anticorpo MAb 137-26 anti-C2 diluído em série, como um controle positivo. Depois, 30 μΙ da suspensão de RBCs de frangos sensibilizada lavada foram adicionados às cavidades contendo as misturas. Cinqüenta microlitros de soro 20 humano normal (5,2%) foram misturados com 80 μΙ de GVB++, para gerar o fundo de cor de soro. Um MAb anti-HIV-1 gp120 comparável com o isotipo foi usado como controle negativo. A concentração de soro humano final usada foi de 2%. A mistura foi incubada a 37°C por 30 minutos. A placa foi sacudida em um sacudidor de placas de microteste por 15 segundos. A placa 25 foi depois centrifugada a 300 x g por 3 minutos. Os sobrenadantes (80 μΙ) foram coletados e transferidos para as cavidades em placas de microteste de 96 cavidades de fundo chato, para medida de OD a 405 nm por uma leitora de placas ELISA. O percentual de inibição de hemólise é definido como:
100 X [(ODSem MAb“ODfUndo de cor de soro)“(ODcom MAb_ODfuncjo de cor de soro)]/(ODSem 30 MAb“ODfundo de cor de soro)
A Figura 3 mostra que o MAb 137-26 e o MAb G3-519 de controle irrelevante não inibem a hemólise de rota clássica de RBCs de frangos ♦ 10
sensibilizados, enquanto que o controle positivo, MAb 175-62 anti-C2, inibe, efetivamente, a hemólise. C2 é envolvido especificamente na rota de complemento clássica.
Para a rota alternativa, os RBCs de coelhos não-sensibilizados foram lavados três vezes com solução salina tamponada com gelatina/veronal (GVB/Mg-EDTA) contendo MgCI2 2 mM e EGTA 1,6 mM. EGTA a uma concentração de 10 mM foi usado para inibir a rota clássica (K. Whaley et al., em A. W. Dodds (Ed.), Complement: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford, 1997, pp. 19-47). Os procedimentos do ensaio são similares àqueles do ensaio de hemólise da rota clássica descrito acima. A concentração final de soro humano usada no ensaio foi de 10%. O MAb 16632 antifator D foi usado como controle positivo. O mesmo MAb anti-HIV-1gp 120 irrelevante comparável com o isotipo descrito acima foi usado como controle negativo.
A Figura 4 mostra que o MAb 137-26 não inibe a hemólise de rota alternativa de RBCs de coelho não-sensibilizados, enquanto que o antifator D MAb 166-32 inibe fortemente a hemólise. O Fator D é específico para a rota de complemento alternativa. O anticorpo de controle negativo não teve qualquer efeito.
Considerados conjuntamente, os resultados mostraram que o MAb 137-26 não inibe a ativação de C5 e, portanto, a formação de C5a e C5b-9 não é inibida. O MAb 137-26 não inibe a ativação das rotas de complemento clássica e alternativa.
Exemplo 3: Inibição de ligação de 125l-C5a em neutrófilos humanos purificados por MAb 137-26
Os neutrófilos humanos foram purificados de sangue integral e diluídos com Dextran Τ-500/solução salina. A mistura foi incubada à temperatura ambiente por cerca de 20 minutos ou até que aparecesse uma camada superficial definida claramente. Esta camada superficial foi transferida para um tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml. Depois da centrifugação, o pélete celular foi suspenso em 30 ml de PBSB (1% de BSA em PBS) frio. A suspensão celular foi estratificada na parte de topo de 10 ml de Histo30
paque-1077 (Sigma, St. Louis, MO) em tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml. Seguinte a uma outra centrifugação, o pélete celular foi depois ressuspenso em 20 ml de NaCI 0,2% frio por 30 segundos para lisar os RBCs. Depois, 20 ml de NaCI 1,6% frio foram adicionados à suspensão ce5 lular, recentrifugados e os neutrófilos foram ressuspensos em PBSB. Os neutrófilos foram mantidos em gelo até usados para ligação de 125l-C5a.
O MAb 137-26 foi diluído em série em tubos de centrífuga de Eppendorf de 1,5 ml com um tampão de ligação (1% de BSA em meio de RPMI1640), para produzir concentrações finais variando de 640 nM a 0,04 10 nM. Quatro microlitros de 4 nM 125l-C5a (NEN Life Science Products, Inc., Boston, MA) foram adicionados a 36 gl de MAb 137-26, para incubação à temperatura ambiente por 15 minutos. C5a humano recombinante purificado (Sigma, St. Louis, MO) foi usado como controle positivo, enquanto que um anticorpo monoclonal irrelevante comparável com isotipo foi usado como 15 controle negativo. Para a ligação máxima de 125l-C5a, 36 gl do tampão de ligação sem os anticorpos ou C5a foram usados no lugar. Cinqüenta microlitros da suspensão de neutrófilos foram adicionados a cada tubo para incubação em gelo. Ao final do período de incubação de 40 minutos, a mistura de cada tubo foi transferida para a parte de topo dos 800 μΙ de um tampão 20 de separação (6% de BSA em PBS) em outro tubo de Eppendorf. Os tubos foram depois centrifugados a 2.000 x g por 3 minutos à temperatura ambiente. Após o sobrenadante ter sido aspirado, o pélete celular foi ressuspensa em 0,5 ml de água deionizada para lisar as células. O lisado celular foi depois misturado com 3 ml de fluido de cintilação Ultima Gold (Packard Ins25 trument, Meriden, CT) para contagem radioativa.
O percentual de inibição da ligação 125l-C5a é definido como:
[Cpmmax-CpmbkgJ-tCpmca-Cpmbkgl/tCpmrnax-Cpmbkg] X 100 em que:
Cpirimax = contagem máxima por minuto sem agentes competidores;
Cprribkg = cpm de fundo sem adição de 125l-C5a; e
Cpmca = cpm com agentes competidores.
A Figura 5 mostra a inibição da ligação de (125l)-C5a humano
radioiodado em neutrófilos humanos purificados. O MAb 137-26 é mais potente do que o C5a não-marcado na inibição de 125l-C5a em neutrófilos humanos purificados. A dose para inibição de 50% (ID50) para MAb 137-26 foi de 0,45 nM, comparado com 30 nM de C5a.
Exemplo 4: Mapeamento do epítopo de ligação de MAb 137-26 em C5a humano por peptídios SPOTs em membrana de celulose
O epítopo de ligação de MAb 137-26 em C5a humano foi mapeado por uma técnica que usa peptídios SPOTs sintetizados pela Sigma Genosys (Woodlans, TX). Os peptídios de sobreposição (12-mer) abrangendo 10 todo o C5a humano foram sintetizados com uma solução de bloqueio de TBSTB (10 mmM cloreto de Tris, 250 mM de cloreto de sódio, 1% de albumina serosa bovina e 0,05% de TWEEN®20) por 1 hora à temperatura ambiente, para saturar todos os sítios de ligação não específicos. O MAb 137-26 a 1 pg/ml na solução de bloqueio foi depois adicionado à membrana por 1 15 hora à temperatura ambiente. A membrana foi depois lavada intensamente com um tampão de lavagem TBST (10 mmM cloreto de Tris, 250 mM de cloreto de sódio e 0,05% de TWEEN®20). A membrana foi depois tratada com anticorpo IgG (Fc) anticamundongo de bode conjugado com HRP (diluído 1:5.000 no tampão de bloqueio) (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) 20 por 1 hora à temperatura ambiente. A membrana foi depois lavada novamente. A ligação de MAb 137-26 com os peptídios SPOTs individuais de C5a foi detectada por incubação com substrato quimioluminescente Supersignal West Pico (Pierce, Rockford, IL). A intensidade da quimioluminescência foi depois detectada por exposição a um filme Kodak X-OMAT AR (Ro25 chester, NY). A Figura 6 mostra a seqüência do epítopo ligado pelo MAb 137-26.
Exemplo 5: Um modelo de sangue integral humano ex vivo para estudar inflamação mediada por complemento: Efeito de MAb 137-26 na ativação de neutrófilos por E. coli e no extermínio de Neisseria meningiti30 dis
Para investigar o papel do complemento na rede inflamatória complexa, todos os mediadores em fase fluida e celulares potenciais preci28
sam estar presentes e são, portanto, capazes de interagir simultaneamente.
Para arquitetar uma condição de experimento in vitro, usou-se sangue integral humano. Neste modelo, lepidurina (REFLUDAN®), um análogo de hirudina específico de trombina, foi usado como um anticoagulante em vez de 5 heparina. Diferentemente da heparina, a lepidurina não interfere com a ativação do complemento.
Neste sistema modelo, o MAb 137-26 bloqueou os efeitos infla-
matórios do C5a formado em conseqüência da ativação do complemento por
E. coli. O anticorpo não inibiu o extermínio mediado por MAC de N. meningi10 tidis. Portanto, o MAb 137-26 neutraliza o C5a, sem inibir a ativação de C5 e a formação subseqüente do MAC. Este é um aspecto importante dos anticorpos monoclonais da presente invenção.
Sangue integral foi coletado em tubos de polipropileno contendo lepidurina (50 pg/ml). O sangue integral anticoagulado foi pré-incubado com
PBS ou inibidores anti-C5 por 4 minutos a 37°C. Para os estudos da expressão de CD11 b e da explosão oxidante em neutrófilos, cepa de E. coli opsonizada LE392 (ATCC 33572) foi adicionada às amostras de sangue integral por 10 minutos a 37°C. A concentração de E. coli era de 1 x 107/ml de sangue nos experimentos CD11b e 1 x 108/ml nos experimentos de explosão oxidante. A amostra da linha de base T-0 foi processada imediatamente. Após incubação, 100 μΙ de amostra foram usados para medida de expressão de CD11b em neutrófilos por imunoflurocitometria. A explosão oxidante de neutrófilos ativados foi medida usando o substrato diidroodamina 123 e conPara os ensaios bactericidas, N. menigitidis H44/76-1 foi cresci duzida como descrito no processo do teste de explosão (ORPEGEN Phar25 ma, Heidelberg, Alemanha).
As Figuras 7A-7D ilustram os resultados dos ensaios citométricos de fluxo de ativação de neutrófilos para expressão de CD11b e explosão oxidante. O MAb 137-26 anti-C5/C5a inibiu, efetivamente, a ativação de neutrófilos induzida por E. coli no modelo de inflamação de sangue integral.
Nestes ensaios, o MAb 137-26 é mais potente do que o MAb 561 anti-C5a (Dr. Jurg Kohl) e um antagonista C5aR (Dr. Stephen Taylor).
da de um dia para o outro em BHI-ágar, subcultivada e crescida em fase cepo por 4 horas. 5.000-10.000 unidades formadoras de colônias (CFUs) foram adicionadas a 1,1 ml de amostras de sangue integral anticoaguladas com lepirudina pré-incubadas com PBS ou anticorpo. Em cada período de tempo, 100 μΙ de sangue integral foram cultivados em placas microbiológicas de Petri contendo ágar-sangue e incubados por 24 horas a 37°C. O crescimento bacteriano foi expresso como CFU/100 μΐ de sangue integral adicionados. A amostra T-0 foi obtida imediatamente após adição das bactérias.
A Figura 8 mostra que o MAb 137-26 não inibiu o extermínio mediado por MAC de Neisseria meningitides. Em contraste, o MAb 137-26 inibiu o extermínio de Neisseria meningitides por sangue humano integral. Este anticorpo inibe a ativação de C5.
Deve-se entender que os termos e expressões usados nas seções acima são apenas exemplificativos e não limitantes e que o âmbito da 15 invenção é definido apenas nas reivindicações que se seguem e inclui todos os equivalentes do objeto dessas reivindicações.

Claims (10)

  1. reivindicações
    1. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que se liga a C5 e C5a, mas que não impede a ativação de C5 e não impede a formação ou inibe a atividade de C5b, em que o anticorpo monoclonal é produzido a partir do hidridoma depositado com o ATCC e designado PTA-3650.
  2. 2. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que se liga a C5a livre, com afinidade igual ou melhor do que a C5.
  3. 3. Anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que inibe a ligação de C5a em C5aR.
  4. 4. Fragmento de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fragmento é selecionado do grupo que consiste em Fab, F(ab')2t Fv, e Fv de cadeia única.
  5. 5. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo quimérico, deimunizado, humanizado ou humano.
  6. 6. Linhagem celular, caracterizada pelo fato de que é de hidridoma como definido na reivindicação1.
  7. 7. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno como definido na reivindicação 1, e um veículo, excipiente, estabilizador ou diluente farmaceuticamente aceitável.
  8. 8. Método para inibir a atividade de C5a, caracterizado pelo fato de que compreende a ligação do anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno como definido na reivindicação 1 a C5a in vitro.
  9. 9. Método diagnóstico in vitro, caracterizado pelo fato de que compreende a detecção da quantidade de C5 ou C5a presente em uma amostra com não anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno como definido na reivindicação 1.
  10. 10. Método diagnóstico in vitro de acordo com a reivindicação 9,
    Petição 870190019970, de 27/02/2019, pág. 8/9
    2/2 caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal é monoclonal 137-36.
BR0211953-6 2001-08-17 2002-08-17 anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno que se liga a c5 e c5a sem a prevenção da formação de c5b, linhagem celular, composição farmacêutica, bem como método in vitro para inibir a atividade de c5a e método de diagnóstico in vitro BRPI0211953B8 (pt)

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Families Citing this family (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4958387B2 (ja) 2001-08-17 2012-06-20 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｃ５ｂの形成を妨害することなくｃ５及びｃ５ａに結合する補体経路阻害剤
EP1569958B1 (en) 2002-12-02 2009-02-18 Resistentia Pharmaceuticals AB Methods and materials for treating inflammatory conditions using a polypeptide comprising a self-c5 amino acid segment and a non-self amino acid segment
AU2004241069B2 (en) 2003-05-15 2010-09-09 Genentech, Inc. Methods and compositions for the prevention and treatment of sepsis
DK1755674T3 (en) 2004-05-14 2015-02-09 Alexion Pharma Inc PROLONGED SURVIVAL OF A allograft by inhibiting complement activity
US20080076138A1 (en) 2005-03-02 2008-03-27 Astellas Pharma Inc. Novel Pd Marker for Histone Deacetylase Inhibitor
CN101193654A (zh) * 2005-06-14 2008-06-04 赛托斯生物技术公司 抗原偶联物及其用途
US20070292421A1 (en) * 2005-07-28 2007-12-20 Feinberg Bruce B Method for treating preeclampsia
KR20180002911A (ko) * 2005-11-04 2018-01-08 제넨테크, 인크. 안질환 치료를 위한 보체 경로 억제제의 용도
PL1988882T3 (pl) 2006-03-02 2015-04-30 Alexion Pharma Inc Wydłużanie przeżycia alloprzeszczepu poprzez inhibowanie aktywności dopełniacza
DK2359834T5 (en) 2006-03-15 2017-02-06 Alexion Pharma Inc Treatment of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria patients with a complement inhibitor
ES2568436T3 (es) 2006-03-31 2016-04-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Procedimiento para controlar la farmacocinética en sangre de anticuerpos
ZA200900954B (en) * 2006-08-22 2010-05-26 G2 Inflammation Pty Ltd Ant-C5aR antibodies with improved properties
PL2061810T3 (pl) 2006-09-05 2015-05-29 Alexion Pharma Inc Sposoby i kompozycje do leczenia neuropatii zależnych od przeciwciał
KR20160092061A (ko) * 2006-11-02 2016-08-03 제넨테크, 인크. 인간화 항-ｄ 인자 항체
EP3689912A1 (en) 2007-09-26 2020-08-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in cdr
EP4238993A3 (en) 2008-04-11 2023-11-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
CR20170001A (es) 2008-04-28 2017-08-10 Genentech Inc Anticuerpos anti factor d humanizados
WO2010075257A1 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Chemocentryx, Inc. C5ar antagonists
EP2327725A1 (en) 2009-11-26 2011-06-01 InflaRx GmbH Anti-C5a binding moieties with high blocking activity
SG185383A1 (en) 2010-04-30 2012-12-28 Alexion Pharma Inc Anti-c5a antibodies and methods for using the antibodies
PL2585064T3 (pl) 2010-06-24 2017-09-29 Chemocentryx, Inc. Antagoniści C5AR
SG190727A1 (en) 2010-11-30 2013-07-31 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
EP2468295A1 (en) 2010-12-21 2012-06-27 Affiris AG Vaccines based on peptides of the complement protein C5a
DK3798230T3 (en) 2011-06-06 2022-10-31 Novo Nordisk As Terapeutiske antistoffer
WO2013126006A1 (en) * 2012-02-20 2013-08-29 Swedish Orphan Biovitrum Ab (Publ) Polypeptides binding to human complement c5
US9133269B2 (en) 2012-08-24 2015-09-15 Anaptysbio, Inc. Humanized antibodies directed against complement protein C5
CN105392803B (zh) * 2013-05-08 2019-12-06 诺和诺德股份有限公司 C5aR拮抗剂的用途
US20140335546A1 (en) * 2013-05-10 2014-11-13 G J Carroll Pty Ltd Devices and Methods for Determining the Risk of Developing a Serious Infection
CN107318267B (zh) 2013-08-12 2021-08-17 豪夫迈·罗氏有限公司 用于治疗补体相关的病症的组合物和方法
TR201911279T4 (tr) 2013-08-28 2019-08-21 Affibody Ab Mutasyona uğramış bir yapı iskelesine sahip polipeptidlerin bağlanması.
WO2015028558A1 (en) 2013-08-28 2015-03-05 Swedish Orphan Biovitrum Ab (Publ) Stable polypeptides binding to human complement c5
NZ631007A (en) * 2014-03-07 2015-10-30 Alexion Pharma Inc Anti-c5 antibodies having improved pharmacokinetics
US10227397B2 (en) * 2014-03-20 2019-03-12 Inflarx Gmbh Inhibitors of C5a for the treatment of viral pneumonia
BR112016025312A2 (pt) 2014-05-01 2017-10-17 Genentech Inc variantes de anticorpo, anticorpo anti-fator d, formulação farmacêutica, dispositivo de distribuição, utilização da formulação e de uma composição, composição e método de tratamento de uma desordem
CN113121415A (zh) 2014-09-29 2021-07-16 凯莫森特里克斯股份有限公司 制备C5aR拮抗剂的方法和中间体
SG11201607165YA (en) 2014-12-19 2016-09-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-c5 antibodies and methods of use
CN107428823B (zh) 2015-01-22 2021-10-26 中外制药株式会社 两种以上抗-c5抗体的组合与使用方法
TW201718014A (zh) 2015-10-12 2017-06-01 諾華公司 C5抑制劑於移植相關微血管病之用途
JP2018534930A (ja) 2015-10-30 2018-11-29 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｄ因子抗体及びコンジュゲート
CN108472382A (zh) 2015-10-30 2018-08-31 豪夫迈·罗氏有限公司 抗-因子d抗体变体缀合物及其用途
EP3390442B1 (en) 2015-12-18 2023-11-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-c5 antibodies and methods of use
BR112018014222A2 (pt) 2016-01-14 2018-12-11 Chemocentryx, Inc. método de tratamento da glomerulopatia c3
UA124734C2 (uk) 2016-06-14 2021-11-10 Рідженерон Фармасьютікалз, Інк. Антитіло проти с5 і його застосування
AU2017285763B2 (en) 2016-06-17 2024-02-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-C5 antibodies and methods of use
EP3494991A4 (en) 2016-08-05 2020-07-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING DISEASES RELATING TO IL-8
PL3577135T3 (pl) 2017-01-31 2023-12-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Kompozycja farmaceutyczna do stosowania do leczenia lub zapobiegania chorobom związanym z c5
EA201992091A1 (ru) * 2017-03-06 2020-02-04 Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания Анти-c5 антитела и их применение
CA3057146A1 (en) * 2017-03-23 2018-09-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Anti-c5a antibodies and uses thereof
EP3717916A1 (en) 2017-11-29 2020-10-07 H. Hoffnabb-La Roche Ag Target interference suppressed anti-drug antibody assay
JP2021506241A (ja) 2017-12-13 2021-02-22 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 抗ｃ５抗体組み合わせ物およびその使用
EP3829628B1 (en) 2018-08-01 2024-05-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha A pharmaceutical composition for use in the treatment or prevention of a c5-related disease
CN114466660A (zh) 2019-07-31 2022-05-10 豪夫迈·罗氏有限公司 通过使用抗c5抗体可伐利单抗来治疗或预防c5相关疾病的剂量和施用方案
CA3144923A1 (en) 2019-07-31 2021-02-04 Alexandre Antoine Bernard SOSTELLY Dosage and administration regimen for the treatment or prevention of c5-related diseases by the use of the anti-c5 antibody crovalimab
TW202208427A (zh) 2020-05-06 2022-03-01 德商因夫萊亞斯有限公司 人源化抗ｃ５ａ抗體
JP2023530977A (ja) 2020-06-16 2023-07-20 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 試料中の抗体の遊離抗原を決定するための方法
WO2023050233A1 (en) * 2021-09-29 2023-04-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Humanized anti-c5a antibodies and uses thereof

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4686100A (en) * 1985-04-02 1987-08-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method for the treatment of adult respiratory distress syndrome
ES2054667T3 (es) * 1986-04-28 1994-08-16 Cetus Oncology Corp Anticuerpos monoclonales contra c5a y des-arg74-c5a, su produccion y uso.
US5260203A (en) † 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US5256766A (en) * 1991-02-19 1993-10-26 The Regents Of The University Of California Recombinant thrombin receptor and related pharmaceuticals
CA2186108A1 (en) * 1994-03-23 1995-09-28 Scott A. Rollins Method for reducing immune and hemostatic dysfunctions during extracorporeal circulation
US6074642A (en) * 1994-05-02 2000-06-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Use of antibodies specific to human complement component C5 for the treatment of glomerulonephritis
US5562904A (en) 1994-07-21 1996-10-08 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Retroviral transduction of cells using soluble complement inhibitors
AU3729295A (en) * 1994-09-23 1996-04-09 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for the treatment of inflammatory joint disease
US5572904A (en) * 1995-01-05 1996-11-12 Minculescu; Mihai C. Oscillation lever arm engine
US6673346B1 (en) * 1999-08-31 2004-01-06 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for the treatment of sepsis
JP4958387B2 (ja) 2001-08-17 2012-06-20 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｃ５ｂの形成を妨害することなくｃ５及びｃ５ａに結合する補体経路阻害剤

Also Published As

Publication number Publication date
MXPA04001301A (es) 2004-07-08
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WO2003015819A1 (en) 2003-02-27
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DE60219801T3 (de) 2016-06-16
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US8372404B2 (en) 2013-02-12
HK1071304A1 (en) 2005-07-15

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