MXPA04001301A - Inhibidores de la ruta del complemento que se unen a c5 y c5a son evitar la formacion de c5b. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona con inhibidores que se unen a C5 y C5a, pero que no previenen la activacion de C5 y no previenen la formacion de o inhiben la actividad de C5b. Un ejemplo de tales moleculas de inhibidores es el anticuerpo monoclonal designado Mab 137-26, que se une a un epitope compartido de C5 y C5a humanos. Estos inhibidores se pueden usar para inhibir la actividad de C5a, para tratar enfermedades y condiciones mediadas por una produccion excesiva o no controlada de C5a. Las moleculas de los inhibidores son tambien utiles para la deteccion diagnostica de la presencia/ausencia o la cantidad de C5 o C5a.

Description

INHIBIDORES DE LA RUTA DEL COMPLEMENTO QUE SE UNEN A C5 Y C5A SIN EVITAR LA FORMACIÓN DE C5B REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica la prioridad a la Solicitud Provisional de EE.UU. No. 60/313,137, presentada el 17 de agosto de 2001, y se incorpora en la presente como referencia .

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con inhibidores de inflamación, que se unen a C5 y C5a del complemento sin inhibir la formación de complejos de ataque de membrana (membrane attac complexes o MAC) de C5b y C5b- 9.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El sistema del complemento desempeña un papel central en la eliminación de complejos inmunitarios y en las respuestas inmunitarias' ante agentes infecciosos, antígenos externos, células infectadas -con virus y células tumorales. Sin embargo, la activación no apropiada o excesiva del sistema del complemento puede dar lugar a consecuencias dañinas, y aun potencialmente amenazadoras para la vida, debido a una inflamación severa y la destrucción resultante del tejido. Estas consecuencias se manifiestan clínicamente en diversos trastornos que incluyen choque séptico, lesión por isquemia/reperfusión del miocardio e intestinal, rechazo de injertos, insuficiencia de órganos, nefritis, inflamación patológica y enfermedades autoinmunes . La sepsis, por ejemplo, es una causa principal de mortalidad que resulta en más de 200,000 muertes por año en los Estados Unidos de América solamente. A pesar de los grandes avances en los últimos años en el tratamiento de infecciones serias, la incidencia y mortalidad de la sepsis continúa elevándose. Por lo tanto, la inhibición de la activación excesiva o no controlada de la cascada del complemento podría proporcionar un beneficio clínico a pacientes con tales enfermedades y condiciones. El sistema del complemento está compuesto de un grupo de proteínas que normalmente están presentes en el suero, en un estado inactivo. La activación del sistema del complemento incluye principalmente dos rutas distintas, designadas las rutas clásica y la alternativa (V. . Holers, en Clinical Immunology: Principies and Practice, ed. R. R. Rich, Mosby Press; 1996, 363-391) . La ruta clásica es una cascada dependiente de calcio/magnesio, que normalmente se activa por la formación de complejos de antígeno-anticuerpo . También puede ser activada de una manera independiente del anticuerpo, por la unión de proteína C-reactiva, complejada con ligando, y por muchos agentes patógenos, que incluyen bacterias gram-negativas . ' La ruta alternativa es una cascada dependiente de magnesio, que se activa por la deposición y activación de C3 sobre ciertas superficies susceptibles (por ejemplo polisacáridos de la pared celular de levaduras y bacterias, y ciertos materiales de biopolímero) . Estudios recientes han demostrado que el complemento también se puede activar a través de la ruta de la lectina, que involucra la unión inicial de lectina que se une a mañosa y la activación subsecuente de C2 y C4, que son comunes a la ruta clásica (Matsushita, M. et al., ¡J. Exp. Med. 176: 1497-1502 (1992); Suankratay, C. et al., J". Immunol. 160: 3006-3013 (1998)). La evidencia acumulada indica que la ruta alternativa participa en la amplificación de la actividad de ambos, la ruta clásica y la ruta de la lectina (Suankratay, C. , ibid; Farries, T. C. et al., Mol. Immunol., 27: 1155-1161 (1990)). La activación de la ruta del complemento genera fragmentos biológicamente activos de proteínas del complemento, por ejemplo anafilatoxinas de C3a, C4a y C5a y complejos de ataque de membrana (MAC) de C5b-9, que median respuestas inflamatorias a través del involucramiento de quimiotaxis · de leucocitos, activación de macrófagos, neutrófilos, plaquetas, mastocitos y células endoteliales , permeabilidad vascular incrementada, histolisis, y lesión de tejidos. C5a del complemento es uno de los mediadores proinflamatorios más potentes del sistema de complemento. C5a es la forma activada de C5. C5 del complemento (peso molecular de 190 kD) está presente en el suero humano en aproximadamente 80 ug/ml (Kohler, P. F. et al., J\ Inimunol . 99: 1211-1216 (1967)). Está compuesto de dos cadenas polipeptidicas, y ß, con pesos moleculares aproximados de 115 kD y 75 kD, respectivamente (Tack, B. F. et al., Biochemistry 18: 1490-1497 1979)) . Biosintetizado como una pro-molécula de una cadena, C5 es clivada enzimáticamente en una estructura de dos cadenas durante su procesamiento y secreción. Después del clivaje o escisión, las dos cadenas se mantienen juntas por al menos un enlace de disulfuro, asi como interacciones monovalentes (Ooi, Y. . , et al . , J.

Immunol. 124: 2494-2498 (1980)). Las estructuras primarias de aminoácido de C5 humano y mutante se obtuvieron de datos de determinación de secuencias de ADNc (Wetsel, R: A. et al., Biochemistry 27: 1474-1482 (1988); Haviland, D. L. et al., J. Inmuno1. 146: 362-368 (1991); Wetsel, R. A. et al., Biochemistry 26 : 737-743 (1987) ) . La secuencia deducida de aminoácido del precursor humano pre-pro-C5 tiene 1676 aminoácido. Las cadenas a y ß de C5 maduro tienen 999 y 655 aminoácido, respectivamente. C5 es glicosilado en la cadena C5 , en particular la asparagina en el residuo 64. C5 se escinde en los fragmentos C5a y C5b durante la activación de las rutas del complemento. Las enzimas convertasas responsables de la activación de C5 son complejos de subunxdades múltiples de C4b, C2a, y C3b para la ruta clásica, y de (C3b)2/ Bb, y P para la ruta alternativa (Goldlust, M. B. et al., J". Jmmunol . 113: 998-1007 (1974); Schreiber, R. D. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 75: 3948-3952 (1978)). C5 se activa por clivaje en la posición 74-75 (Arg-Leu) en la cadena a. Después de la activación, se libera el péptido C5a de 74 aminoácido de 11.2 kD de la porción del término de amino de la cadena a. Este péptido de C5a comparte propiedades similares de anafilatoxina con aquellas exhibidas por C3a, pero es 100 veces más potente, sobre una base molar, para producir respuestas inflamatorias. Ambos C5a y C3a son estimuladores potentes de neutrófilos y monocitos (Schindler, . et al., Blood 76: 1631-1638 (1990); Haeffner-Cavailldn, N. et al., J". Iim nol. 138: 794-700 (1987); Cavaillon, J. M. et al., Sur. J. Im unol. 20: 253-257 (1990) ).. Además , se demostró recientemente que el receptor de C3a es importante para la protección contra el choque inducido por endotoxinas en un modelo de ratón (Kildsgaard, J. et al., J". Immunol . 165: 5406-5409 (2000) ) . Además de sus propiedades anafilatóxicas, C5a induce la migración quimiotáctica de neutrófilos (Ward, P. A. et al., J. Immunol. 102: 93-99 (1969)), eosinófilos (Kay, A. B. et al., Immunol. 24: 969-976 (1973)), basófilos (Lett-Brown, M. A. et al., J. Immunol. 117: 246-252 (1976)), y monocitos (Snyderman, R. et al., Proc . Soc . Exp.

Biol. Med. 138: 387-390 (1971)). La actividad de C5a es regulada por la enzima plasmática carboxipeptidasa N (E. C, 3.4.12.7) que elimina la arginina de la terminal de carboxi de la C5a que forma el derivado C5a des Arg (Goetzi, E. J. et al., J. Clin. Invest. 53: 591-599 (1974) ) . Sobre una base molar, el C5a des Arg humano exhibe solamente 1% de' la actividad anafiláctica (Gerard, C. et al., Proc. Nati. Acad. Sel. 78: 1833-1837 (1981)) y actividad quimiotáctica polimorfonuclear como C5a no modificada (Chenoweth, D. E. et al., Mol. Immunol. 17: 151- 161 (1980)). Ambos, C5a y C5b-9 activan células endoteliales para que expresen moléculas de adhesión esenciales para el secuestro de leucocitos activados, que median la inflamación de tejidos y la lesión (Foreman, K. E. et al., J". Clin. Invest. 94: 1147-1155 (1994); Foreman, K. E. et al., Inflamation 20: 1-9 (1996); Rollins, S. A. et al., Transplantation 69: 1959-1967 (2000)). C5a también media reacciones de inflamación provocando contracción del músculo liso, incrementando la permeabilidad vascular, induciendo la desgranulación de basófilos y mastocitos e induciendo la liberación de proteasas lisosoraales y radicales libres oxidantes (Gerard, C. et al., Aran. Rev. Immunol. 12: 775-808 (1994)). Además, C5a modula la expresión génica de fase aguda hepática y aumenta la respuesta inmune general incrementando la producción de TNFoc, IL-?ß, IL-6, e IL-8 (Lambris, J. D. et al., en: The Human Complement System in Health and Disease, Volanakis , J. E. ed. , Marcel Drekker, New York, páginas 83-118) . El receptor C5a humano (C5a ) ha sido clonado (Gerard, N. P. et al., Nature 349: 614-617 (1991); Boulay, F. et al., Biochemistry 30: 2993-2999 (1991)). Pertenece a una superfamilia de receptores de siete dominios transmembrana, acoplados a la protelna G. C5aR se expresa sobre neutrófilos, monocitos, basófilos, eosinófilos, hepatocitos, músculo liso de pulmón y células endoteliales, y tejidos glomerulares renales (Van-Epps, D. E. et al., J. Immunol. 132: 2862-2867 (1984); Haviland, D. L. et al., J. Immunol. 154: 1861-1869 (1995); etsel, R. A., Immunol. Lett. 44: 183-187 (1995); Buchner, R. R. et al., J. Immunol. 155: 308-315 (1995); Chenoweth, D. E. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 75: 3943-3947 (1978): Zwimer, J. et al., Mol. Immunol. 36: 877-884 (1999)). El sitio de unión al ligando de C5aR es complejo, y consiste de al menos dos dominios de unión separables físicamente. Uno se une al término de amino de C5a (aminoácido 1-20) y el núcleo unido d por disulfuro (aminoácido 21-61) , mientras que el segundo se une al extremo del término de carboxi de C5a (aminoácido 62-74) (Wetsel, R. A., Curr. Opin. Immunol . , 7: 48-53 (1995) ) . C5a desempeña papeles importantes en la inflamación y en la lesión de tejidos. En la derivación cardiopulmonar y en la hemodiálisis, C5a se forma como resultado de la activación de la ruta alternativa del complemento, cuando la sangre humana hace contacto con la superficie artificial del dispositivo corazón-pulmón o el dispositivo para diálisis de riñon (Howard, R. J. et al., Arch. Surg. 123: 1496-1501 (1988); Kirklin, J. K. , J". Caxdlova.se. Surg. 86: 845-857 (1983); Craddock, P. R. et al., N. Engl. J. Med. , 296: 769-774 (1977)). C5a provoca una permeabilidad capilar incrementada y edema, broncoconstricción, vasoconstricción pulmonar, activación de leucocitos y de plaquetas e infiltración a tejidos, en particular los pulmones (Czemak, B. J. et al., J. Leukoc. Biol. 64: 40-48 (1998)). Se demostró que la administración de un anticuerpo monoclonal anti-C5a reduce la derivación cardiopulmonar y la disfunción endotelial coronaria inducida por cardioplegia (Tofukuji, M. et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 116: 1060-1068 (1998)). C5a también está involucrado en el síndrome de sufrimiento respiratorio agudo (Acute Respiratory Distress Syndrome o AKDS) y la insuficiencia múltiple de órganos {Múltiple Organ Failure o MOF) (Hack, C. E., et al., Am. J. Med. 1989: 86: 20-26; Hammerschmidt , DE. et al., Lancet 1980; 1: 947-949; Heideman, M. et al., J". Trauma 1984; 4: 1038-1043). C5a aumenta la producción de monocitos de dos importantes citocinas pro- inflamatorias, TNFot e IL-1. Se ha demostrado también que C5a desempeña un papel importante en el desarrollo de la lesión de tejidos, y particularmente lesión pulmonar, en modelos .animales de choque séptico, (Smedegard, G. et al., Am. J. Pathol . 1989; 135: 489-497).

En modelos de sepsis que usan ratas, cerdos y primates no humanos, los anticuerpos anti-C5a administrados a los animales antes de su tratamiento con endotoxina o E. Coli resultó en una lesión a tejido disminuida, así como una producción disminuida de IL-6 (Smedegard, G, . et al., Am.

J. Pathol. 135: 489-497 (1989); Hopken, U. et al., Eur. J.

Immunol. 26: 1103-1109 (1996); Stevens, J. H. et al., J".

Clin. Invest. 77: 1812-1816 (1986)). Más importante, se ha demostrado que el bloqueo de C5a con anticuerpos policlonales anti-C5a mejora significativamente las tasas de supervivencia en un modelo de sepsis de ligado/punción cecal en ratas (Czermak, B. J. et al., Wat. Med. 5: 788-792 (1999) ) . Este modelo comparte muchos aspectos de la manifestación clínica de la sepsis en humanos. (Parker, S. J. et al., Br. J. Surg. 88: 22-30 (2001)). En el mismo modelo de sepsis, se demostró que los anticuerpos anti-C5a inhiben la apoptosis de timocitos (Guo, R. F. et al., J. Clin. Invest. 106: 1271-1280 (2000)) y previenen la MOF (Huber-Lang, M. et al., J. Immunol . , 166: 1193-1199 (2001) ) . Los anticuerpos anti-C5a también fueron protectores en un modelo de factor de veneno de cobra de lesión pulmonar en ratas, y en la lesión pulmonar inducida por complejo inmune (Muíligan, M. S. et al., J. Clin. Invest. 98: 503-512 (1996)). La importancia de C5a en la lesión pulmonar mediada por complejo inmune se confirmó más tarde en ratones (Bozic, C. R. et al., Science 26: 1103- 1109 (1996) ) . Se encuentra que C5 es un modulador principal en la lesión por isquemia-repérfusión del miocardio. La disminución del complemento redujo el tamaño del infarto al miocardio (Weisman, H. F. et al., Science 249: 146-151 (1990) ) , y el tratamiento con anticuerpos anti-C5a redujo la lesión en un modelo de rata de isquemia-reperfusión de miembro posterior (Bless, N. M. et al., Am. J. Physiol. 276: L57-L63 (1999)). La lesión por reperfusión durante el infarto al miocardio también se edµjo marcadamente en cerdos que se volvieron a tratar con una IgG anti-C5a monoclonal (Amsterdam, E. A. et al., Am. J. Physiol. 268: H 48-H457 (1995) ) . Un antagonista de C5aR humano recombinante reduce el tamaño del infarto en un modelo porcino de revascularización quirúrgica (Riley, R . D. et al., ¡J. Thorac. Ca.rdlovs.se. Surg. 120: 350-358 (2000)). Los niveles de complemento están elevados en pacientes con artritis reumatoide y lupus eritematoso sistémico. Los niveles de C5a correlacionan con la severidad del estado patológico (José, P. J. et al., Ann. Rheum. Dis. 49: 747-752 (1989); Porcel, J. M. et al., Clin. Immunol . Immunopathol . 74: 283-288 (1995)). Por lo tanto, la inhibición de C5a y/o del receptor de C5a (C5aR) podría ser útil para tratar estas enfermedades crónicas. La expresión de C5aR está sobrerregulada sobre astrocitos reactivos, microglia, y células endoteliales en un sistema nervioso central humano inflamado (Gasque, P. et al., Am. J. Pathol. 150: 31-41 (1997)). C5a puede estar involucrado en enfermedades neurodegenerativas, tales como la enfermedad de Alzheimer (Mukherjee, P. et al., J. Neuroimmunol . 105: 124-130 (2000)). La activación de C5aR neuronal puede inducir apoptosis (Farkas I. et al. J. Physiol. 1998; 507: 679-S87) . Por lo tanto, la inhibición de C5a y/o C5aR podría ser útil para tratar enfermedades neurodegenerativas . Ahora se sabe que la soriasis es una enfermedad mediada por células T (Gottlieb, E. L. et al., Nat. Med. 1: 442-447 (1995) ) . Sin embargo, los neutrófilos y los mastocitos . también pueden estar involucrados en la patogénesis de la enfermedad (Terui, T. et al., Exp. Dermatol. 9: 1-10; 2000); Werfel, T. et al., Arch. Dexmatol. Res. 289: 83-86 (1997)). Altos niveles de C5a des Arg se encuentran en escalas psoriáticas, indicando que est involucrada la activación del complemento. Las células T y los neutrófilos son quimio-atraídos por C5a (Nataf, S. et al., J. Immunol. 162: 4018-4023 (1999); Tsuji, R. F. et al-, J. Immunol. 165: 1588-1598 (2000); Cavaillon, J. M. et al., Bur. J. Immunol. 20: 253-257 (1990)). Por lo tanto C5a podría ser un objetivo terapéutico importante para el tratamiento de soriasis. Los complejos inmuhitarios (CI) que contienen inmunoglobulina G contribuyen a la patofisiología en un número de enfermedades autoinmunitarios , tales como el lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, síndrome de Goodpasture, y neumonitis por hipersensibilidad (Madalo, M. P., Semin. Nephrol . 19: 48-56 (1999); Korganow, A. S. et al., Immunity 10: 451-459 (1999); Bolten, W. . , Kidney Int. 50: 1754-1760 (1996); Ando, M. et al., Curr. Opln. Pulm. Med. 3: 391-399 (19.97)). El modelo animal clásico para la respuesta inflamatoria en estas enfermedades del CI es la reacción de Arthus, que resalta la infiltración de células polimorfonucleares, -hemorragia, y exudación de plasma (Arthus, M . , C. R. Soc. Biol . 55: 817-824 (1903)). Estudios recientes muestran que ratones deficientes en C5aR son protegidos de lesión en tejidos inducida por CI (Kohl, J. et al., 2¾ol. Inmuno1. 36: 893-903 (1999); Baumann, U. et al., J. I munol. 164: 1065-1070 (2000)) . Los resultados son consistentes con la observación de que un antagonista an i- C5aR peptidico pequeño inhibe la respuesta inflamatoria provocada por deposición de CI (Strachan, A. J. et al., J. Immunol. 164: 6560-6565 (2000)) . Junto con su receptor, C5a desempeña un papel importante en la patogénesis de enfermedades por CI . .Los inhibidores de C5a y C5aR podrían ser útiles para tratar estas enfermedades. WO 01/15731A1 describe composiciones y métodos de tratamiento de la sepsis usando anticuerpos para C5a. estos anticuerpos reaccionan solamente con la región N-terminal del péptido de C5a, y no reaccionan de forma cruzada con C5. WO 86/05692 describe el tratamiento del .síndrome de sufrimiento respiratorio agudo (ARDS) con un anticuerpo especifico para C5a o el derivado des Árg del mismo. También describe el tratamiento de la sepsis por administración de este anticuerpo. Este anticuerpo se produjo en respuesta al •derivado C5a des Arg debido a que es más inmunogénico, pero producirá anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con C5a. La Patente de los EE.UU. No. 5,853,722 describe anticuerpos anti-C5 que bloquean la activación de C5 y así, la formación de C5a y C5b.

La Patente de los EE.UU. No. 6,074,642 describe el uso de anticuerpos anti-C5 para tratar la glomerulonefritis . Estos anticuerpos también bloquean la generación C5a y C5b, inhibiendo el efecto de ambos, C5a y la formación de C5b-9. La Patente de los EE.UU. No. 5,562,904 describe anticuerpos anti~C5 que bloquean completamente la formación de MAC. En otras discusiones de anticuerpos an i-C5, I03 anticuerpos descritos bloquean la activación de C5 y su escisión o clivaje para formar C5a y C5b (Vakeva, A. P. et al., Círc-alation 97: 2259-2267 (1998); Thomas , T. C. et al., Mol. I munol. 33: 1389-1401 (1996); Wang, Y. et al., Proc. Nati. Acad. Sci . 93: 8563-8568 (1996); Kroshus, T. et al., Transplantation 60: 1194-1202 (1995); Frei, Y. et al., Mol. Cell Probes 1: 141-149 (1987)) . Los anticuerpos monoclonales que reaccionan de forma cruzada con C5, C5a, o C5a des Arg han sido reportados (Schulze, M. et al., Complement 3: 25-39 (1986); Takeda, J. et al., J. Immunol. Meth. 101: 265-270 (1987); Inoue, K. , Complement Inflamm. 6: 219-222 (1989)). Se ha reportado también que los anticuerpos monoclonales que reaccionan de forma cruzada con C5 y C5a inhibieron la liberación de ATP mediada por C5a de plaquetas de cobayo (Klos, A. et al., J. Immunol. Meth. 111: 241-252 (1988); Oppermann, M. et al., Complement Inflamm. 8: 13-24 (1991)).

SütlARIO DE LA INVENCIÓN La activación de C5 normalmente resulta en clivaje de.C5 a C5a y C5b. Las moléculas inhibidoras de la presente invención se unen a C5 y a C5a con alta afinidad, no inhiben la activación de C5, y no previenen la formación de o inhiben la actividad de C5b. un ejemplo de tales inhibidores es el anticuerpo monoclonal designado MAb 137-26, que se une a un epitope compartido sobre C5 y C5a humanos. El hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal 137-26 se ha depositado en la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd. , Manassas, VA 20110-2209, bajo el No. de acceso PTA-3650 el 17 de agosto de 2001. Las moléculas inhibidoras de la invención también incluyen: (i) otros anticuerpos o fragmentos de los mismos, péptidos, oligonucleótidos, o peptidomiméticos que se unen a C5 y a C5a con alta afinidad, pero no inhiben la activación de C5, y no previenen la formación de o inhiben la actividad de C5b, o (ii) cualquier anticuerpo que se una al mismo epitope que el anticuerpo monoclonal 137-26. Los fragmentos de anticuerpo incluyen Fab, F(ab')2, Fv, o Fv de una cadena, y los anticuerpos monoclonales y fragmentos de la invención incluyen anticuerpos y fragmentos quiméricos, Delmmunized™, humanizados o humanos, y otras formas aceptables para uso humano . Las moléculas inhibidoras se pueden incluir como parte de una composición farmacéutica. Las moléculas de inhibidos de la invención son útiles para el tratamiento de enfermedades y condiciones que involucran la producción excesiva o no controlada de C5a, o para uso en diagnóstico al detectar la presencia de C5a, o la cuantificación de C5a.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra la unión de MAb 137-26 (anti-C5a, cuadrados rellenos) y MAb 137-76 (anti-C5, cadena ß, círculos sin rellenar) a C5a purificada humana en ELISA. Un anticuerpo monoclonal irrelevante de isotipo equiparado se usó como control negativo. El eje Y representa la reactividad de los MAb con C5a representada como densidad óptica (DO) a 450 nm, y el eje X representa la concentración de los MAb. MAb 137-26 reaccionó con C5a humano, mientras que MAb 137-76 y el anticuerpo de control irrelevante no lo hicieron. La Figura 2 muestra la unión de MAb 137-26 (cuadrados rellenos) y MAb 137-76 (círculos sin rellenar) a C5 humano purificado en ELISA. Un anticuerpo monoclonal irrelevante de isotipo equiparado se usó como control negativo. El eje Y representa la reactividad de los MAb con C5, representada como densidad óptica (DO) a 450 nm, y el eje X representa la concentración de los anticuerpos monoclonales . Arabos, el MAb 137-26 y MAb 137-75 reaccionaron con C5 humano, mientras que el anticuerpo de control irrelevante no lo hizo. La Figura 3 muestra la incapacidad de MAb 137-26 anti-C5a para inhibir la hemolisis mediada por complemento de células sanguíneas rojas de ???,?? sensibilizadas vía la ruta clásica (classical pathway o CP) . El MAb 175-62 anti-C2 inhibió de manera eficaz la hemolisis . Un anticuerpo monoclonal irrelevante de isotipo equiparado no tuvo efecto. El eje Y representa el porcentaje de inhibición de hemolisis, como se describe adicionalmente en el texto. El eje X representa la concentración de los anticuerpos monoclonales. La Figura 4 muestra- la incapacidad de MAb 137-26 anti-C5a para inhibir la hemolisis mediada por complemento de células sanguíneas rojas de conejo vía la ruta alternativa (al ternative pathway o AP) . MAb 166-32 antifactor D inhibió de forma eficaz la hemolisis. Un anticuerpo monoclonal irrelevante de isotipo equiparado no tuvo efecto. El eje Y representa el porcentaje de inhibición de hemolisis, como se describe adicionalmente en el texto. El eje X representa la concentración de anticuerpo monoclonal . La Figura 5 muestra la inhibición de la unión de C5a radioyodada (12SI) -humana a neutrófilos humanos purificados. El control positivo, C5a humana recombinante purificada (rHuC5a) , inhibió la unión. Un anticuerpo monoclonal irrelevante de isotipo equiparado no mostró ningún efecto. El eje Y representa el porcentaje de inhibición de la unión de 12SI-C5a, como se describe adicionalmente en el texto. El eje X representa la concentración de los agentes de competencia. La Figura 6 muestra el epitope de unión de MAb 137-26 sobre C5a . humano cartografiado „ superponiendo peptidos sintéticos sobre membrana de celulosa. La Figura 7A muestra la expresión de CDllb sobre neutrófilos humanos estimulados por E. Col! opsonizado en un modelo de sangre completa anti-coagulada con lepirudina. MAb 137-26 anti-C5/C5a (círculos rellenos) inhibió la expresión de CDllb más eficazmente qúe MAb 561 anti-C5a (Dr. Jurg Kohl , cuadrados rellenos) y MAb 137-30 anti-C5 (triángulos rellenos) . El último anticuerpo inhibió la activación de C5. El MAb irrelevante (triángulos invertidos llenos) no tuvo efecto. El eje Y representa la intensidad de fluorescencia promedio {Mean Fluorescence Intensity o MFI) medida por inmunofluorocitometria . El eje X representa la concentración de los anticuerpos ^g/ml) . T-0 = línea base de muestra de sangre entera en el tiempo 0 minutos. T-10 = sangre entera incubada solamente con PBS por 10 minutos, sin E. ¦ col!. A otras muestras, con o sin inhibidores, se les agregó E. coli.

La Figura 7B muestra la expresión de CDllb sobre neutrófilos humanos estimulados por E. coli opsonizado en un modelo de sangre completa anti-coagulada con lepirudina. MAb 137-26 anti-C5/C5a (circuios rellenos) inhibió la expresión de CDllb más eficazmente que un antagonista de C5aR peptídico (Dr. Stephen Taylor) (cuadrados rellenos) . El péptido irrelevante no tuvo efecto (triángulos invertidos llenos) . El eje Y representa la intensidad de fluorescencia promedio (MFI) medida por inmunofluorocitometría . El eje X representa la concentración de los anticuerpos/péptído ^g/ml) . T-0 = línea base de muestra de sangre entera en el tiempo 0 minutos. T-10 = sangre entera incubada solamente con PBS por 10 minutos sin E. coli. A otras muestras, con o sin inhibidores, se les agregó E. coli. La Figura 7C muestra la explosión oxidativa de neutrófilos humanos estimulados por E. coli opsonizada en un modelo de sangre completa anti-coagulada con lepirudina. Ambos MAb 137-26 anti-C5/C5a (círculos rellenos) y MAb 137-30 anti-C5 (triángulos rellenos) inhibieron la explosión oxidativa más eficazmente que MAb 561 anti-C5a (cuadrados rellenos) . El péptido irrelevante (triángulos invertidos rellenos) no tuvo efecto. El eje Y representa la intensidad de fluorescencia promedio (MFI) medida por inmunofluorocitometría . El eje X representa la concentración de los anticuerpos [µg/ml) . T-0 = línea base de muestra de sangre entera en el tiempo 0 minutos. T-10 = sangre entera incubada solamente con PBS por 10 minutos sin E. coli. A otras muestras, con o sin inhibidores, se les agregó E. col!. La Figura 7D muestra la explosión oxidativa de neutrófilos humanos estimulados por E. coli opsonizada1 en un modelo de sangre completa anti-coagulada con lepirudina. Ab 137-26 anti-C5/C5a fue más eficaz que -un antagonista de C5aR peptídico (cuadrados rellenos) para inhibir la explosión oxidativa. El péptido irrelevante no tuvo efecto.

El eje Y representa la intensidad de fluorescencia promedio (MFI) medida por inmunofluorocitometri . El eje X representa la concentración de los anticuerpos en nM. T-0 = linea base de muestra de sangre entera en el tiempo 0 minutos. T-10 = sangre entera incubada solamente con PBS por 10 minutos sin E. coli. A otras muestras, .con o sin inhibidores, se les agregó E. coli. La Figura 8 muestra la destrucción mediada por MAC de Neisseria meningitides en un modelo de sangre completa anti-coagulada con lepirudina. La bacteria se destruyó eficazmente por incubación con la sangre entera humana en presencia de MAb 137-26 anti-C5/C5a (círculos rellenos) , un MAb irrelevante (triángulos rellenos) , o PBS (cuadrados sin rellenar) . En contraste, las bacterias no se destruyeron cuando la sangre entera se trató con MAb 137-30 anti-C5 (diamantes sin rellenar) que inhibió la activación de C5 y asi la formación de MAC. El eje Y representa unidades formadoras de colonias (UFC) por 100 µ? de sangre entera incubada por 24 horas a 37° C sobre agar con sangre. El eje X representa puntos de tiempo diferentes de colección de muestras de sangre del experimento de cultivo de sangre entera.

D SCRIPCIÓW DETALLADA 1. Ventajas de la Invención Los inhibidores de la invención, incluyendo el anticuerpo monoclonal MAb 137-26, son ventajosos sobre los inhibidores de anticuerpo monoclonal conocidos para tratar inflamación y daño de tejidos mediados por complemento. MAb 137-26 es capaz de unirse a C5 antes de activarse. Después de que C5 se activa para formar C5a, el anticuerpo puede neutralizar a C5a, que es una anafilatoxina. Normalmente, una vez que se forma C5a, se une rápidamente a C5aR sobre células, desencadenando con esto la cascada de transducción de señales que da lugar a la inflamación. MAb 137-26 no inhibe el clivaje de C5 para formar C5a y C5b, pero C5a permanece unido a MAb 137-26 después de que se produce, e inhibe la unión de C5a a C5aR. La formación de C5b-9, sin embargo, no se afecta, y, puesto que C5b-9 es necesario para la formación de MAC, que está involucrado en la destrucción de bacterias, mantener la producción de C5b-9 es importante para una respuesta inmune protectora. MAb 137-26 puede neutralizar de forma eficaz los efeetos inflamatorios de C5a, pero todavía permite que otros componentes de la cascada de complemento, incluyendo C3 y C5b-9, medien funciones anti-bacterianas . Esta propiedad farmacológica es excepcionalmente importante con respecto al tratamiento de sepsis bacteriana, enfermedades crónicas del CI y soriasis. 2. Síntesis y Uso de la Invención A. Anticuerpos monoclonales Los anticuerpos monoclonales se pueden sintetizar usando el método del hibridoma descrita primero por Kohler et al., Na.tu.re, 256: 495 (1975), o se pueden sintetizar por métodos de ADN recombinante (Patente de los EE.UU. No. 4,816,567) . En el método del hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado se inmuniza como se describe arriba para producir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína usada para inmunización. Los animales también se pueden inmunizar con constructos de ADN para que expresen las proteínas de codificación ín vivo para inducir anticuerpos específicos. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. Los linfocitos se fusionan luego con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol , para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies -. Principies and Practice , páginas 59-103 (Academic Press, 1986) ) . Las células de hibridoma preparadas de esta manera se siembran y se cultivan en un medio de cultivo adecuado, que preferiblemente contiene una o más substancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma de origen no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma de origen carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas normalmente incluirá hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT) , estas substancias previenen el crecimiento de células deficientes en HGPRT. Las células de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan la producción estable en altos niveles del anticuerpo por las células seleccionadas que producen el anticuerpo, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Entre estas líneas de células de mieloma están las líneas de mieloma murino, tales como aquellas derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11, disponibles del Salk Institute Cell Distrihution Cente , San Diego, Calif. EE.UU., y células SP2/0 o X63-Ag8-653 disponibles de la American Type Culture Collectlon, Rockville, Md. , EE.UU. Las líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano se han descrito también para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, <J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al . , Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications , páginas 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987) ) . La linea celular de mieloma de ratón NSO se puede usar también (European Collectlon of Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire UK) . El medio de cultivo en el cual se cultivan las células de hibridoma se ensaya para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. La especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se puede determinar por inmunopreci i ación o por un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de inmunosorbente unido a enzima (ELISA) . Después de que se identifican las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones se pueden subclonar por procedimientos de dilución limitantes y cultivo por métodos estándar {Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, páginas 59-103 (Academic Press, 1986)). Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio D- EM o RPMI-1640. además, las células de hibridoma se pueden cultivar in vivo como tumores de ascites en un animal. Los anticuerpos monoclonales segregados por los subclones se separan convenientemente del medio de cultivo, fluido de · ascites, o suero por procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales tales como, por ejemplo, Sefarosa-A para proteína , cromatografía sobre hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad. El ADN que codifica para los anticuerpos monoclonales se aisla fácilmente y se le determina la secuencia usando procedimientos convencionales (Innis, M. et al., ' en PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications , Academic, San Diego, CA (1990); Sanger, F. S. et al., Proc. Nati. Acad. Sci . 74:5463-5467 (1977)). Las células de hibridoma sirven como una fuente de tal ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que son luego transfectados en células huésped tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) , o células de miéloma que no producen de otra manera proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en la células huésped recombinantes . La producción recombinante de anticuerpos se describirá en más detalle abajo. En una modalidad adicional, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo se pueden aislar de bibliotecas de fagos de anticuerpos generados usando las técnicas descritas en McCafferty, et al., Nature 348: 552-554 (1990) . Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol . , 222: 581-597 (1991) describe el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fagos. La publicación subsecuente describe la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo de nM) por redistribución de cadena (Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992)), así como infección combinatoria y recombinación in vivo como una estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse et al., Nucí. Acids Res. 21: 2265-2266 (1993)) . Así, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas de hibridoma de anticuerpos monoclonales tradicionales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales. El ADN también se puede modificar, por ejemplo, substituyendo la secuencia de codificación para los dominios constantes de la cadena pesada y ligera en lugar de las secuencias murinas homologas (Patente de los EE.UU. No. 4,816,567; Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sel. USA 81: 6851 (1984)), o uniendo covalentemente a la secuencia de codificación de la inmunoglobulina toda o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido que no es inmunoglobulina . Normalmente, tales polipéptidos que no son inmunoglobulinas se substituyen por los dominios constantes de un anticuerpo, o se substituyen por los dominios variables de un sitio que combina antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio que combina antígeno específicamente para un antígeno y otro sitio que combina antigeno que tiene especificidad por un antígeno diferente . Otra alternativa es usar fusión eléctrica más que fusión química para formar los hibridomas . Esta técnica está bien establecida. En vez de fusión, uno puede también transformar una célula B para hacerla inmortal usando, por ejemplo, un Virus de Epstein Barr, o un gen de transformación. (Ver, por ejemplo, "Continuously Proliferating Human Cell Lines Synthesizing Antibody of Predetermined Specificity" Zurawaki, V. R. et al., en Monoclonal Antibodies , ed. por Kennett R. H. et al., Plenum Press, N. Y. 1980, páginas 19-33) .

B . Anticuerpos Humanizados y Humanos Un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido introducidos en él desde una fuente, que no es humana. Estos residuos de aminoácido no humanos son frecuentemente referidos como residuos de "importación" , los cuales se toman normalmente de un dominio variable de "importación" . La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-327 (1388); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988), substituyendo secuencias de CDR de roedor o CDR por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, en tales anticuerpos "humanizados", un dominio variable substancialmente menos que intacto ha sido substituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son normalmente anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR se substituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de ratón. La selección de dominios variables humanos, ambos ligeros y pesados, que se va a usar para sintetizar los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo al así llamado método de "ajuste óptimo" , la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se selecciona contra la biblioteca completa de secuencias de dominios variables humanos conocidos. La conocidos . La secuencia humana que está más cercana a aquella del roedor se "acepta entonces como la infraestructura humana (fraiework o FR) para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol . , 151: 2296 (1993); Chothia et al., J". Mol. Biol . , 196: 901 (1987)) . Otro método utiliza una- infraestructura particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas . La misma inf aestructura se puede usar para varios anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Nati. Acad.

Sel. USA, 89·. 4285 (1992); Presta et al., J". Immunol . 151: 2623 (1993) ) . Es además importante que los anticuerpos sean humanizados con retención de su alta afinidad por el antigeno y otras propiedades biológicas favorables . Para lograr esta meta, de acuerdo con un método preferido, los anticuerpos humanizados se preparan por un proceso de análisis de las secuencias de origen y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias de origen y humanizados. Los modelos de inmunoglobulinas tridimensionales están disponibles comúnmente, y sen familiares para aquellos de ordinario expertos en la técnica. Están disponibles programas computacionales , que ilustran y exhiben estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de las inmunoglobulinas candidatas seleccionadas . La inspección de estas visualizaciones permite el análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los residuos que influencian la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antigeno. De esta manera, los residuos de F se pueden seleccionar y combinar del ?-ecipiente y secuencias de importación, de modo que la característica deseada del anticuerpo, tal como una afinidad incrementada por el o los antígenos objetivo, se logren. En general, los residuos de CDR están directamente y más substancialmente involucrados en influenciar la unión al antígeno. Alternativamente, el investigador experto puede producir animales transgénicos (por ejemplo ratones) que son capaces, con la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de la producción de inmunoglobulinas endógenas . Tales ratones transgénicos están disponibles de Abgenix, Inc., Fremont, California, y Medarex, Inc., Annandale, New Jersey. Se ha descrito que la supresión homocigótica del gen de la región que une (JH) la cadena pesada en ratones quiméricos y mutantes de linea germinal resulta en una inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos . La transferencia del arreglo del gen de inmunoglobulina de linea germinal humana en tales ratones mutantes de línea germinal resultará en la producción de anticuerpos humanos con el desafío con antígeno. Ver, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol. 7: 33 (1993); y Duchosal et al., Nature 355: 258 (1992) . Los anticuerpos humanos también se pueden derivar de bibliotecas de visualización de fagos (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol . 227: 381 (1991); Marks et al., J". Mol. Biol. 222: 581-597 (1991); Vaughan et al., Mature Bxotech. 14: 309 (1996).).

C; Anticuerpos Delromunized.™ Los anticuerpos Delmmunized™ son anticuerpos en los cuales se han eliminado epitopes de células T potenciales, como se describe en la Solicitud Internacional de Patente PCT/GB98/01473. por lo tanto, se espera que la inmunogenicidad en humanos se elimine o se reduzca substancialmente cuando se aplican in vivo. Adicionalmente, los anticuerpos se pueden modificar químicamente por conjugación covalente a un polímero, para incrementar su vida media en circulación, por ejemplo. Los polímeros preferidos, y los métodos para unirlos a los péptidos, se muestran en las Patentes de los EE.UU. Nos. 4,765,106; 4,179,337; 4,495,285; y 4,609,546, las cuales están incorporadas en la presente como referencia íntegramente. Los polímeros preferidos, son' los polioles polioxietilados y el polietilen glicol (PEG) . El PEG es soluble en agua a temperatura ambiente, y tiene un peso molecular promedio preferido entre 1,000 y 40,000, más preferentemente entre 2,000 y 20,000, aun más preferentemente entre 3,000 y 12,000.

D . Generació de M¾b Anti-C5/C5a Los anticuerpos de la presente invención se pueden generar por técnicas tradicionales de hibridoma muy conocidos en la técnica. Brevemente, los ratones son inmunizados con C5 purificado de suero humano como un inmunógeno emulsificado en adyuvante completo de Freund, e inyectado subcutáneamente o intraperitonealmente en cantidades en el intervalo de' 10-100 µg. De diez a quince días más tarde, los animales inmunizados son reforzados con C5 adicional emulsificado en adyuvante incompleto de Freund. Los ratones se refuerzan periódicamente después de esto en un programa de inmunización semanal a quincenal. Para cada fusión, se prepararon suspensiones individuales de células a partir del bazo de un ratón inmunizado, y se usaron para la fusión con células de mieloma SP2/0. Las células SP2/0 (lxlO8) y células de bazo (lxlO8) se fusionaron en un medio que contenía 50% de polietilen glicol (P.M. 1450) (Kodak, Rochester, Y) y 5% de dimetilsulfóxido (Sigma Chemical Co., St. Louis, O) . Las células se ajustaron luego a una concentración de 1.7 x 105 células de bazo/ml de la suspensión en medio DMEM (Gibco, Grand Island, NY) , suplementado con 5% de suero de bovino fetal y HAT (hipoxantina sódica 10 n , aminopterina 40 µ?, y timidina 1.6 mM) . Doscientos cincuenta microlitros de la suspensión de células se agregaron a cada pozo de aproximadamente cincuenta placas de microvaloracion de 96 pozos. Después de aproximadamente diez días de cultivo los sobrenadantes se retiraron para analizarlos para determinar la reactividad con C5 humano purificado por ELISA. Se revistieron pozos de placas de microvaloración de Immulon II (Dynatech Laboratories, Chantilly, VA) con C5 humano en 0.1 µg/ml (50 µ?/????) . Los sitios de unión no específica en los pozos se saturaron luego por incubación con 200 µ? de BLOTTO al 5% (leche en polvo sin grasa) en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) por una hora. Los pozos se lavaron luego con solución amortiguadora PBST (PBS que contenía 0.05% de TWEEl 20) . Cincuenta microlitros del sobrenadante de cultivo de cada pozo de fusión se agregaron al pozo revestido, junto con 50 µ? de BLOTTO por una hora a temperatura ambiente. Los pozos se lavaron con PBST. Los anticuerpos unidos se detectaron luego por reacción con IgG anti-ratón de cabra (específico de Fe) conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) diluido (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) por una hora a temperatura ambiente . Los pozos se lavaron luego con PBST. Se agregó a los pozos una solución de substrato para peroxidasa que contenía 0.1% de 3,3,5,5-tetrametil bencidina (Sigma, St . Louis, MO) y 0.003% de peróxido de hidrógeno (Sigma, St . Louis, MO) en acetato de sodio 0.1 M, pH 6.0 para el desarrollo del color por 30 minutos. La reacción se terminó por adición de 50 µ? de H2S04 2 M por pozo. La densidad óptica (DO) se leyó a 450 nm con un lector de ELISA (Dynatec Laboratories, Chantilly, VA) . Los hibridomas en los pozos positivos para reactividad con C5 células individuales clonadas por un método de dilución limitante. Los hibridomas monoclonales se expandieron' luego y se colectaron los sobrenadantes de cultivo, para su purificación por cromatografía sobre proteína A. Los anticuerpos purificados se caracterizaron luego para determinar la reactividad con C5 y C5a humanos por ELISA, para la determinación de las constantes de afinidad y cinética de unión por BIAcore, para los efectos de hemolisis mediada por complemento vía ambas rutas, clásica y alternativa, y para la inhibición de la unión de 125I-C5a a neutrófilos humanos purificados. Los anticuerpos también se pueden seleccionar panoramizando una biblioteca de scFv humano para encontrar aquellos que se unen a C5 (Griffiths et al., E BO J. 12: 725-734 (1993)). La especificidad y actividad de clones específicos se pueden evaluar usando ensayos conocidos (Griffiths et al.; Clarkson et al., Nature, 352: 642-648 (1991) ) . Después de una primera etapa de panoramización, uno obtiene una biblioteca de fagos que contienen una pluralidad de diferentes anticuerpos de una cadena exhibidos sobre fagos que tienen una unión mejorada a C5. las etapas de panoramización subsecuentes proporcionan bibliotecas adicionales con afinidades de unión más altas. Cuando los efectos de avidez son un problema, se pueden usar bibliotecas que exhiben fagos monovalentes, en las cuales menos de 20%, menos de 10%, o menos de 1% de los fagos exhiben más de una copia de un anticuerpo sobre la superficie del fago. La exhibición monovalente se puede acompañar con el uso de fagémidos y fagos auxiliares . Los fagos adecuados incluyen M13, y los fagos filamentosos fl y fd. La exhibición de proteína de fusión con proteínas de revestimiento de virus también se conocen y se pueden usar en la presente invención. MAb 137-26, que se une a ambos C5 y C5a con afinidad comparable, se caracterizó adicionalmente , MAb 137-26 no inhibe la activación de C5, pero inhibe con potencia muy alta la unión de C5a a C5aR sobre neutrófilos humanos purificados. Los experimentos que demuestran estas propiedades se explican adicionalmente en los Ejemplos de abaj o . Para seleccionar anticuerpos que se unen a un epitope particular sobre el antígeno de interés (por ejemplo, aquellos que bloquean la unión de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente a C5) , se puede realizar un ensayo de rutina de bloqueo cruzado tal como aquel descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed. Harlow and David Lañe (1988) .

Alternativamen e, se puede realizar la cartografía del epitope, por ejemplo como se describe en Champe et al., J. Biol. Chem. , 270: 1388-1394 (1995), para determinar si el • anticuerpo se une con un epitope de interés .

E: Síntesis de Otros Inhibidores de la Invención Otras moléculas adecuadas para usarse en la presente invención se pueden aislar o seleccionar de bibliotecas de compuestos por medios convencionales, por ejemplo determinando si se unen a C5/C5a, y luego haciendo una selección funcional para determinar si inhiben la actividad de C5b. Un sistema automatizado para generar y seleccionar una biblioteca de .compuestos se describe en las Patentes de los EE.UU. Nos. 5,901,069 y 5,463,564. Las aproximaciones más enfocadas involucran una selección competitiva contra el MAb 137-26, o hacer un modelo tridimensional del sitio de unión, y luego hacer una familia de moléculas, que se ajusten al modelo. Estas se seleccionan luego para determinar aquellas con características de unión óptimas. Además, otras moléculas se pueden identificar por ensayos de competencia, o una selección funcional para determinar inhibidores con las mismas propiedades que MAb 137-26.

E\. Uso de los Inhibidores de la Invención Las moléculas de la presente invención se pueden administrar por cualquiera de un número de rutas, y se administran en una concentración que es terapéuticamente eficaz en la indicación, o para los propósitos buscados. Para lograr este objetivo, los anticuerpos se pueden formular usando una variedad de excipientes aceptables conocidos en la técnica. Normalmente, los anticuerpos se administran por . inyección. Los métodos para lograr esta administración son conocidos para aquellos de ordinario expertos en la técnica. También puede ser posible obtener composiciones que se pueden administrar tópicamente u oralmente, o que pueden ser capaces de transmitirse a través de membranas mucosas . La dosificación y el modo de administración dependerán del individuo y del agente que se va a administrar. La dosificación se puede determinar por experimentación de rutina, en prueba clínicas o extrapolación de modelos animales en los cuales fue eficaz el anticuerpos . Los anticuerpos de la presente invención se pueden usar en el tratamiento de enfermedades y condiciones mediadas por la producción excesiva o no controlada de C5a. La evidencia de la utilidad de los inhibidores de la invención para tratar estas enfermedades y condiciones se expone aba o .

Ejemplo 1: Reactividad de MAb 137-26 con C5 y C5a Humano Se probó MAb 137-26 para determinar su reactividad con C5 purificado humano y C5a recombinante (Sigma, St . Louis, MO) . Los procedimientos de la ELISA se describen arriba. MAb 137-26 se une a C5a de una manera dependiente de la dosis con alta potencia (Figura 1) . Otro MAb 137-76 anti-C5, especifico para la cadena ß de C5 humano, no se une a C5a, debido a residuos de C5a sobre la cadena de C5. Un anticuerpo irrelevante de isotipo equiparado usado como un control negativo tampoco reacciona con C5a. Por otro lado, ambos MAb 137-26 y 137-76 se unen a C5 (Figura 2) . La constante de afinidad en equilibrio y las constantes de cinética de unión (asociación y disociación) de MAb 137-26 con C5a y C5 se determinaron también por un BIAcore Instrument (Pharmacia. Biosensor AB, Uppsala, Suiza) . Todas las mediciones de unión se realizaron en solución salina amortiguada con HEPES (HBS) (HEPES 10 mM, pH 7.4, NaCl 150 mM, EDTA 3.4 mM, 0.005% de surfactante P20) a 25° C. Para medir las constantes de velocidad de unión de C5 y C5a a MAb 137-26, se inmovilizaron anticuerpos de IgG (Fe) anti-ratón de conejo sobre un circuito integrado de CM5 por acoplamiento de amina usando N-hidroxisuccinimida y N-etil-N' - (3 -dietilaminopropil) - carbodiimida . MAb 137-26 se capturó- entonces sobre el circuito integrado revestido antes de la inyección de C5 en diferentes concentraciones . Los datos están sumarizados en la Tabla 1. MAb 137-26 tiene una alta afinidad de unión por ambos C5a y C5 en fase de solución. Los resultados también indican que MAb 137-26 se une a un epitope compartido por ambos, C5a y C5.

Tabla 1. Constantes de la Cinética de la Unión de C5 y C5a a MAb 137-26 Kon, constante de asociación cinética off constante de disociación cinética KD, constante de disociación en equilibrio = o£f/Kon Ejemplo 2: Hemolisis Mediada por Complemento Para estudiar los efectos de MAb 137-26 sobre la activación de C5 en suero humano, el anticuerpo se probó para determinar la inhibición de la hemolisis mediada por las rutas del complemento clásica y alternativa. Para los experimentos de la ruta clásica, RBC de pollo (5 x 107 células/ml) en solución salina amortiguada con gelatina/veronal (GVB++) que contenía MgCl2 0.5 mM y CaCl2 0.15 mM se sensibilizaron con inmunoglobulinas de RBC anti-pollo de conejo purificados en 8 µg/ml (Inter-Cell Technologies, Hoperwell, NJ) por 15 minutos a 4°C. las células se lavaron entonces con GVB++. Las células lavadas se volvieron a suspender en la misma solución amortiguadora én 1.7 x 108 células/ml. En cada pozo de una placa de microvaloración de 96 pozos de fondo redondo, 50 µ? de suero humano normal (5.2%) se mezclaron con 50 µ? de GVB++ de MAb 137-26 diluido en serie o un MAb 175-62 anti-C2 como un control positivo. Luego se agregaron a los pozos que contenían las mezclas 30 µ? de la suspensión de RBC de pollo sensibilizados y lavados. Cincuenta microlitros de suero humano normal (5.2%) se mezclaron con 80 µ? de GVB++ para proporcionar el fondo de color de suero. Un MAb de gp 120 anti-HIV-1 de isotipo equiparado se usó como control negativo. La concentración final de suero humano usada fue de 2%. La mezcla se incubó a 37°C por 30 minutos. La placa se agitó sobre un agitador de placas de microvaloración por 15 segundos. La placa se sometió luego a centrifugación a 300 x g por 3 minutos. Los sobrenadantes (80 µ?) se colectaron y se transfirieron a pozos en una placa de microvaloración de 96 pozos de fondo plano para la medición de DO a 405 nm por un lector de placas de ELISA. El porcentaje de inhibición de la hemolisis se define como: 100 X [ (DOsin M¾b — DOfondo de color de suero ) - (DOcon MAb-DO fondo de color de suero) ] / (DOs - DOfondo de color de suero) · La Figura 3 muestra que MAb 137-26 y el MAb de control irrelevante G3-519 no inhiben la hemolisis de la ruta clásica de E.BC de pollo sensibilizados, mientras que el control positivo, MAb 175-62 anti-C2 inhibe eficazmente la hemolisis. C2 está involucrado específicamente en la ruta clásica del complemento. Para la ruta alternativa, RBC de conejo no sensibilizados se lavaron tres veces con solución salina amortiguada con gel tina/ eronal (GVB/Mg-EGTA) que contenía MgCl2 2 mM y EGTA 1.6 mM. EGTA en una concentración de 10 mM se usó para inhibir la ruta clásica (K. Whaley et al., en A. W. Dodds (Ed.) Complement: A Practical Approach. Oxford University Press, Oxford, 1997, páginas 19-47). Los procedimientos del ensayo son similares a -aquellos del ensayo de hemolisis de la ruta clásica descrito arriba. La concentración final de suero humano usada en el ensayo fue de 10%. MAb 166-32 anti-factor D se usó como control positivo. El mismo MAb de gp 120 anti-HIV-1 de isotipo equiparado se usó como control negativo. La Figura 4 muestra que MAb 137-26 no inhibe la hemolisis por la ruta alternativa de RBC de conejo no sensibilizados, mientras que MAb 166-32 anti-factor . D inhibe fuertemente la hemolisis. El factor D es específico para la ruta alternativa del complemento. El anticuerpo del control negativo no tiene efecto. Tomados juntos, los resultados verifican que MAb 137-26 no inhibe la activación de C5, y por lo tanto la formación de C5a y C5b-9 no se inhiben. MAb 137-26 no inhibe la activación de las rutas del complemento clásica y alternativ .

Ejemplo 3: Inhibición de la Unión de 15I-C5a a Neutrófilos Humanos Purificados por MAb 137-26 Se purificaron neutrófilos humanos a parir de sangre completa humana y se diluyeron con Dextrán T-500/solución salina. La mezcla se incubó a temperatura ambiente por aproximadamente 20 minutos, o hasta que apareció una capa superficial definida claramente. Esta capa superficial se transfirió a un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 mi. Siguiendo a la centrifugación, el pelet de células se suspendió en 30 mi de PBSB frió (1% de BSA en PBS) . La suspensión de células se depositó sobre la parte superior de 10 mi de Histopague-1077 (Sigma, St . Louis, MO) en un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 mi. Siguiendo a otra centrifugación, el pelet de células se volvió a suspender en 20 mi de NaCl al 0.2% frío por 30 segundos para lisar a RBC. Luego, 20 mi de NaCl al 1.6% frío se agregaron a la suspensión de células, se volvieron a someter a centrifugación, y. los neutrófilos se volvieron a suspender en PBSB. Los neutrófilos se mantuvieron sobre hielo hasta que se usaron para la unión a 12SI-C5a. MAb 137-26 se diluyó en serie en tubos para centrífuga Eppendorf de 1.5 mi con una solución amortiguadora de unión (1% de BSA en medio RPMI 1640) para dar concentraciones finales en el intervalo de 640 nM a 0.04 nM. Cuatro microlitros de 12I-C5a 4 nM (NEN Life Science Products, Inc., Boston, ??) se agregaron a 36 µ? de MAb 137-26 diluido para incubación a temperatura ambiente por 15 minutos. C5a humana recombinante purificada (Sigma, St. Louis, MO) se usó como control positivo, mientras que un anticuerpo monoclonal irrelevante de isotipo equiparado se usó como control negativo. Para la unión máxima de 125i-C5a, se usaron en cambio 36 µ? de la solución amortiguadora de unión sin los anticuerpos o C5a. Cincuenta microlitros de la suspensión de neutrófilos se agregaron a cada tubo para incubación sobre hielo. Al final del periodo de incubación de 40 minutos, la mezcla de cada tubo se transfirió a la parte superior de 800 µ? de una solución amortiguadora de separación (6% de BSA en PBS) en otro tubo de Eppendorf. Los tubos se sometieron luego a centrifugación a 2,000 x g por 3 minutos a temperatura ambiente. Después se aspiró el sobrenadante, el pelet de células se volvió a s-uspender en 0.5 mi de agua desionizada para lisar las células. El material lisado de células se mezcló luego con 3 mi de fluido de escintilación Ultima Gold (Packard Instruments, Meriden, CT) para el conteo radioactivo . El porcentaje de inhibición de la unión de 125i- C5a se define como: [Cpmmax-Cpmbkg] ~ [ Cpmca-Cpmbicg] / [Cpmmax-Cpmbkg] X 100 en donde : Cpmmax = conteo máximo por minuto sin agentes de competencia Cpnibkg = cpm de fondo sin adición de 125I-C5a; y Cpmca = cpm con agentes de competencia. La Figura 5 muestra la inhibición de C5a (125I)-humano radioyodado a neutrófilos humanos purificados. MAb 137-26 es más potente que C5a no marcado para inhibir la unión de I-C5a a neutrófilos humanos purificados. La dosis para un 50% de inhibición (ID50) para MAb 137-26 fue de 0.45 nM comparado a C5a 30 nM.

Ejemplo 4: Cartografía del Epitope de Union de MAb 137-25 sobre C5a Humano por Péptidos SPOT sobre Membrana de Celulosa El epitope de unión de MAb 137-26 sobre C5a humano se cartografió por una técnica que usa péptidos SPOT sintetizados por Sigma Genosys (the Woodlands, TX) . Se sintetizaron péptidos de superposición (12-mer) que incluían el C5a humano completo sobre una membrana de celulosa. En el ensayo, la membrana se trató primero con una solución de bloqueo TBSTB (cloruro de Tris 10 mM, cloruro de sodio 250 mM, 1% de albúmina de suero de bovino y 0.05% de TWEEN9 20) por 1 hora a temperatura ambiente,, para saturar todos los sitios de unión no específica. Se agregó entonces MAb - 137-26 en 1 µg ml en la solución de bloqueo a la membrana por 1 hora a temperatura ambiente . La membrana se lavó luego completamente con una solución amortiguadora de lavado TBST (cloruro de Tris 10 mM, cloruro de sodio 250 mM y 0.05% de TWEEN® 20). La membrana se trató luego con anticuerpo de IgG (Fe) anti-ratón de cabra conjugado con HRP (diluido 1:5,000 en la solución amortiguadora de bloqueo) (Jackson Immunoresearch, West Grove, ??) por 1 hora a temperatura ambiente. La membrana se lavó luego otra vez. La unión de MAb 137-26 a los péptidos individuales de SPOT de C5a se detectó por incubación con substrato de quimioluminiscencia Supersignal West Pico (Pierce, Rockford, IL) . La intensidad de la quimioluminiscencia se detectó entonces por exposición a una película Kodak X-OMAT AR (Rochester, NY) . La Figura 6 muestra la secuencia del epitope unido por MAb 137-26.

Ejemplo 5: Un modelo de sangre humana completa ex vivo para estudiar la inflamación mediada por complemento: Efecto de MAb 137-26 sobre la activación de neutrófilos por E. coli y sobre la destrucción de Neisseria meningitidis Para investigar el papel del complemento en la compleja red inflamatoria, todos los mediadores celulares y de fase fluida potenciales necesitan estar presentes y por lo tanto son capaces de interactuar simultáneamente. Para diseñar tal condición experimental in vitro, se usó sangre humana completa. En este modelo, se usó lepirudina (REFLUDAN®) , un análogo de hirudina especifico de trombina como anticoagulante, en vez de heparina. A diferencia de la heparina, la lepirudina no interfiere con la activación del complemento . En este sistema modelo, MAb 137-26 bloqueó los efectos inflamatorios de C5a formado como resultado de la activación del complemento por E. coli. El 'anticuerpo no inhibió la destrucción mediada por MAC de N. Meningitidis.. Por lo tanto, MAb 137-26 neutraliza a C5a sin inhibir la activación de C5, y la subsecuente formación de MAC. Este es un aspecto importante de los anticuerpos monoclonales de la presente invención. Se colectó sangre completa en tubos de polipropileno que contenían lepirudina (50 µg/ml) . La sangre completa anti-coagulada se pre-incubó con PBS o inhibidores anti-C5 por 4 minutos a 37 °C. Para los estudios de expresión de CDllb y explosión oxidativa sobre neutrófilos, se agregó la cepa de E. coli LE392 opsonizada (ATCC 33572) a las muestras de sangre completa por 10 minutos a 37 °C. La concentración de E. coli fue de 1 x 10 /ml de sangre en los experimentos de CDllb, y de 1 x 108/ml en los experimentos de explosión oxidativa. La muestra de linea base de T-0 se procesó inmediatamente. Después de incubación, se usaron 100 µ? de las muestras para la medición de la expresión de CDllb sobre neutrófilos por inmunofluorocitometría . La explosión oxidativa de neutrófilos activados se midió usando el substrato dihidrorrodamina 123, y se realizó como se describe en el procedimiento de prueba Burst (ORPEGEN Pharma, Heidelberg, Alemania) .

Las Figuras 7A-7D exhiben los resultados de los ensayos de citometria de flujo de activación de neutrófilos para la expresión de CDllb y explosión oxidativa. MAb 137-26 anti-C5/C5a inhibió eficazmente la activación de neutrófilos inducida por E. coli en el modelo de inflamación de sangre completa humana. En estos ensayos, MAb 137-26 es más potente que MAb 561 anti-C5a (Dr. Jurg Kohl) y un antagonista peptidico de C5aR (Dr. Stephen Taylor) . Para los ensayos bactericidas, se cultivó toda la noche N. meníngitidis H44/76-1 sobre agar-BHI, se subcultivó y se cultivó hasta, la fase log por 4 horas. Se agregaron de 5,000-10,000 unidades formadoras de colonias (ÜFC) a 1.1 mi de muestras de sangre completa anti-coagulada con lepirudina incubadas previamente por 5 minutos con PBS o anticuerpo. En cada periodo de tiempo, se sembraron 100 µ? de sangre completa sobre cajas de Petri microbiológicas que contenían agar de sangre, y se incubaron por 24 horas a 37 °C. el crecimiento bacteriano se expresó como UFC/100 µ? de sangre completa agregada. La muestra de G-0 se obtuvo inmediatamente después de agregar la bacteria. La Figura 8 muestra que MAb 137-26 no inhibió la destrucción mediada por MAC de Neisseria meningítides . En contraste, MAb 137-30 inhibió la destrucción de Neisseria meningitides por sangre humana completa. Este anticuerpo inhibe la activación de C5. Debe entenderse que los términos y expresiones usadas en las secciones anteriores son ejemplos solamente y no limitantes, y que el alcance de la invención está definido solamente en las reivindicaciones que siguen, e incluye todos los equivalentes de la materia de estas reivindicaciones .

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES ; 1. Un inhibidor que se une a C5 y C5a, pero no evita la activación de C5 y no evita la formación de C5b ni inhibe la actividad de C5b.
2. 2. El inhibidor según la reivindicación 1, en donde la molécula se une a C5a libre con una afinidad igual o me or que a C5.
3. 3. El inhibidor según la reivindicación 1, en donde la molécula inhibe la unión de" C5a a C5aR. 4. Un inhibidor que se une al mismo epitope de C5 que el anticuerpo monoclonal 137-26. 5. El inhibidor según la reivindicación 1 o la reivindicación 4, en donde el inhibidor es un anticuerpo o un fragmento del mismo. 6. El inhibidor según la reivindicación 5 , en donde la molécula es un anticuerpo monoclonal. 7. El inhibidor según la reivindicación 5 , en donde el inhibidor es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de Fab, F(ab')2, Fv o Fv de una cadena. 8.. El anticuerpo monoclonal según la reivindicación 6, en donde el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, desinmunizado, humanizado o humano. 9. El anticuerpo monoclonal 137-26, producido a partir del hibridoma depositado en la ATCC y designado PTA- 10. La línea de células de hibridoma según la reivindicación 9. 11. Una composición farmacéutica que comprende el inhibidor según la reivindicación 1 o la reivindicación 4, y un portador, excipiente, estabilizador o diluente farmacológicamente aceptable . 12. Un método para inhibir la actividad de C5a, que comprende administrar el inhibidor según la reivindicación 1 o la reivindicación 4. 13. El método según la reivindicación 12, en donde la inhibición de C5a se determina in vitro. 1 . Un método para tratar una en ermedad o condición que es mediada por la producción excesiva o no controlada de C5a, que comprende administrar, in vivo o ex vivo, el inhibidor según la reivindicación 1, o la reivindicación 4. 15. El método según la reivindicación 12 , en donde la molécula inhibidora se administra por infusión intravenosa, inyección de bolo intravenoso, intraperitoneal, intradérmica, intramuscular, subcutánea, intranasal, intratraqueal , intraespinal, intracraneal, u oralmente. 16. Un método de diagnóstico que comprende la detección de la cantidad de C5 o C5a presente en una muestra con la molécula inhibidora según la reivindicación 1 o la reivindicación
4. 4.