JPH03285695A - 腫瘍に対してマクロファージの働きを活発化する方法とそのための組成 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、特に哺乳動物の細胞（以下「受容体」という
）の浄化細菌リポ多糖類（以下［ＬＰＳＪという）結合
ファクタのたんばく成分に結合するモノクローナル抗体
の使用と、これらモノクローナル抗体を含有する組成に
関する。

その使用は、腫瘍シトトキシティを緩和させるとともに
、エンドトキシンショックに対処するにあたってＬＰＳ
受容体に対するアゴニストとして作用するマクロファー
ジの活性化を含む。

（従来の技術） 菌血症、敗血症、敗血性ショック症候群の原因となり得
る細菌は通常の体内の細菌群の一部であるのが普通であ
る。しかし、患者の中には細菌が増殖する主要環境にな
っている場合かある。これらの患者は、コルチコステロ
イド療法または放射線療法を継続的に受けている患者、
手術後の高齢患者、糖尿病や肝臓病などの慢性疾患を持
つ患者、ひどい火傷を負った患者、髄膜炎菌性感染に冒
された幼児等、免疫系の弱い患者を含む。手術またはカ
テーテルの使用などによって細菌かこれらの患者の血液
に侵入すると敗血性ショックを起こす。

ダラム陰性の細菌の細胞壁に存在するエンドトキシン、
リポ多糖−たんばく化合物が敗血性ショックを誘発する
確かな証拠がある。研究者らは、ダラム陰性の細菌によ
って放たれるエンドトキシンがホストターゲット細胞の
細胞膜上の具体的受容箇所に結合すると理論づけている
。

毒素は、プロスタグランジン、リューコトリエンおよび
血小板活性因子をはじめ、腫瘍神経症因子（Ｔ　Ｎ　Ｆ
　）　／　ｃｈａｃｈｅｃｔｉｎ、インターフェロン１
．２および３、インターフェロン、Ｃ３、プロコアギュ
ラント活動（組織因子活動）を含む多数の媒介をつくり
出す。体か過剰な細菌および／またはエンドトキシンを
取り除こうとする際に現れる症状は、発熱、ショック、
結節性維管束的凝血、補体活性化、白血球増多症をもた
らす一過性白血病、多系統器官不全および死亡を含む。

アメリカ国内で１年間に敗血性ショックの症例が約２０
万件あり、その８０％かダラム陰性の有機体によって起
こされている。

患者を４８時間で死亡させ得る症候群である敗血性ショ
ックの治療は、通常抗生物質、バソプレッザおよびイノ
トロープの組合せからなる。

抗麻酔剤であるナロクソン（Ｎａｌｏｘｏｎｅ）（Ｎａ
ｒｃａｎ。

デュポン社）も使用される。しかし、その効果はこれま
で少数の患者にしか現れず、ききめのある薬剤も発表さ
れていない。

治療の標準化と改善の助けになる効果的な薬剤が必要と
される。

エンドトキシンを中和しようとする試みは、約１，００
０〜１０．０００もあるエンドトキシンの化学形態の問
題にぶつかる。これらの毒素は構造が似ているが、これ
ら毒素用に製造された主な種類の抗体と反応するに十分
像ていないのが普通である。媒介用のモノクローナル抗
体も、多くの媒介物がその製造および／または増幅のた
めの相互依存パスに寄与し、増殖するので、同じ問題が
起きる。

エンドトキシンに対処するための特別なモノクローナル
抗体の使用は、エンドトキシンに保持されるある種の構
造的特徴とのごくわずかな交差反応によって可能である
。そのような抗体はエンドトキシンを中和するか、受容
体と結合するか細胞生成物と反応してＴＮＦのようなシ
ョックを起こすエンドトキシン箇所を封じることが考え
られる。

本件出願のアメリカでの親出願およびその親出願である
第４０４．２６６号および第３７６、７０４号には、特
にＬＰＳ結合因子（受容体）と結合するモノクローナル
抗体の製造が開示されている。

この受容体は分子量が約８０キロダルトンの糖たんばく
として、そしてその作用的性質に特徴がある。上記出願
では特にモノクローナル抗体（ｍＡｂ）５Ｄ３および３
Ｄ７が記載され、それは受容体のたんばくおよび炭水化
物成分とそれぞれ結合する。両モノクローナル抗体とも
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに加え
られている。

記載されたｍＡｂの性質の中に、ＬＰＳが受容体と結合
するのを防止することによって、この化合による通常の
結果を阻止する能力がある。

上記アメリカ出願に記載された効果として、生体内にお
ける抗敗血性ショック剤としてのｍＡｂの薬効かある。

また、受容体のたんばく成分に対するモノクローナル抗
体が以前は予期されなかった効果を更に生じることが判
明している。つまり、ｍＡｂはそれ自体で、または例え
ばガンマインターフェロンとの組合せで、マクロファー
ジで緩和された腫瘍シトトキシティをもたらし、体内お
よび体外における受容体に対するアゴニストとして作用
することが判明した。

（実施例） 特に哺乳動物細胞の細菌ポリ多糖エンドトキシン結合受
容体（以下ｒＬＰＳ受容体」という）用のモノクローナ
ル抗体はハイブリッドマスと呼ばれるハイブリッドセル
ラインてあり得る抗体生成セルラインによって生成され
る。ハイブリッド細胞は、抗ＬＰＳ受容体抗体生成細胞
と、ハイブリッド細胞の長期組織培養安定性を与えるセ
ルラインである永続性セルラインとの融合によって形成
される。ハイブリッドセルラインの形成において、一方
の融合材である抗ＬＰＳ受容体抗体生成細胞はＬＰＳ受
容体陽性Ｂ細胞で免疫された動物から取ったひ臓細胞、
またはＬＰＳ受容体用に濃縮された生化学調剤でもよい
。他方の融合材である永続性細胞は、リンパプラストイ
ド細胞、またはそれ自体が非抗体分泌器だが悪性のもの
として選択された抗体生成細胞の前駆物質である骨髄腫
細胞などのプラズマシトーマ細胞でもよい。

ＬＰＳ受容体用のモノクローナル抗体を生成するねずみ
、りす、ビーバーなどのハイブリッドマスは、ＬＰＳ受
容体陽性Ｂ細胞、浄化Ｌ　ＰＳ受容体、またはＬＰＳ受
容体からなるその他の生物調剤に対して免疫されたねず
み等の骨髄腫細胞およびひ臓細胞の融合によって形成さ
れる。ねずみ等を免疫にするには種々のプロトコールに
従う。例えば、ねずみ類かＬＰＳ受容体陽性Ｂ細胞また
は部分的に浄化されたＬＰＳ受容体の第一および補充免
疫を受けてもよい。融合は免疫学の当事者に周知の標準
的工程で行われる。コーラ−アンドミルスタイン、ネイ
チャ、２５６＋４９５〜４９７（＋９７５）　　（Ｋｏ
ｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｎａｔｕｒｅ
、　２５６：４９５−４９７　（１９７５））およびケ
ネット、モノクローナル抗体（Ｋｅｎｎｅｔ、　Ｍｏｎ
ｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（Ｋｅｎｎｅｔ
　ｅｔ　　ａｌ、、　Ｅｄｓ、　ｐｐ、　３６５３６７
、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ、Ｙ、　１９８０
）参照。

その結果生成されるクローンは、ＬＰＳ受容体陽性Ｂ細
胞またはＬＰＳ受容体からなる生物調剤の製造用にふる
いにかけられる。反応性抗体を分泌するものはクローン
される。

モノクローナル抗ＬＰＳ受容体抗体生成する人間のバイ
ブリドマスは、抗ＬＰＳ受容体抗体を生成する個人から
採取されたひ臓細胞と、人間のリンパプラストロイドセ
ルラインとの融合によって形成される。あるいは、骨髄
腫細胞用の融合材はリンパ球を生成する周辺血液抗ＬＰ
Ｓ受容体でもよい。融合およびふるい分は技術は、ハム
スターの抗ＬＰＳ受容体発生バイブリドマスの生成・選
択に使用されるものと本質的に同じである。

抗ＬＰＳ受容体生成セルラインの他の形成方法は抗体生
成細胞の変換による。例えば、永続性抗ＬＰＳ受容体生
成細胞を生じるＢリンパ球の場合、抗ＬＰＳ生成りリン
パ球はエプスタイン−バール（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒ
ｒ）ビールス等のビールスで感染され、変換される。例
えば、コズバー・アンド・ローダの今日の免疫学、４（
３）ニア２〜７９（１９８３）（Ｋｏｚｂｏｒ　ａｎｄ
　Ｒｏｄｅｒ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ、
４（３）ニア２−７９（１９８３））参照。あるいは、
Ｂリンパ球を変換遺伝子または変換遺伝子生成物で変換
してもよい。

ＬＰＳ受容体用モノクローナル抗体は、抗ＬＰＳ受容体
抗体生成バイブリドマスをねずみ等の腹腔に注入し、適
当な時間の経過後に高力価の均質抗体を含有する腹水を
取り出し、モノクローナル抗ＬＰＳ受容体抗体を分離す
ることによって大量に生成する。異種個体内で発生した
バイブリドマスを照射された、またはアシミックのヌー
ドマウスに注入すべきである。あるいは、抗体は、抗Ｌ
ＰＳ受容体生成細胞を体外培養し、細胞培養媒体から分
泌モノクローナル抗ＬＰＳ受容体抗体を分離することに
よって生成してもよい。

キメラ抗ＬＰＳ受容体抗体は、ＬＰＳ受容体用の非人間
抗体の重軽鎖可変領域をコード化す０ るＤＮＡセグメントをクローンし、これらのＤＮＡセグ
メントを人間の重軽鎖不変領域をコード化するＤＮＡセ
グメントに結合させてキメラ免疫グロブリンを生成する
ことによって生成される。重軽鎖をコード化する融合遺
伝子構造は表現ベクトルに組み付けられるか挿入される
。

遺伝子は、免疫グロブリンたんばくが合成され、組み合
わされ、分泌される場合は、リンパ性愛は細胞（例えば
骨髄腫細胞）に共トランスフェクトされる。トランスフ
ェクトされた受は細胞は培養され、明確な免疫プロプリ
ンが収拾される。

例１ ８０　　ｋＤ　　ＬＰＳ結合蛋白（等電点６．５）、紫
外線放射によってクロスリンクしたｒａｄｉｏｄｉｎａ
ｔｅｄの光活性バクテリアＬＰＳトドキシン誘導剤によ
って飽和したネズミの５ｅｎｏｃｙｔｅｓ　（Ｔ　−Ｖ
　　Ｃｈｅｎ　　ｅｔＦＡＳＥＢ　　ジャーナル　３　
　Ｎｏ、４Ａ０８２　４９６９　１９８９）から部分純
化し細胞を、超音波処理し、スフローズグラブイエ処理
した。ＬＰＳ結合蛋白濃縮留分を、摂氏４ブタノールの
水様液と、遠心分離機によって分た二相混合物と、水相
の受容ＬＰＳ複合ｐａｒ　ｔｉｔｉｏｎｓとによって処
理した。透析展縮後、前記水様抽出物を、予備５ＤＳ−
ＰＡＧよって濃縮し、分別した。

前記ゲルから、単放射性同位元素を電解溶離した。そし
て、二次元ポリアクリルアミドにて再実行したところ、
単放射性同位元素スポットが生成された。この蛋白のア
ミノ酸組成が表１に示されている。

この受容体のキャラクタライゼイション（ｃｈａｒａｃ
ｔｅｒ　１ｚａｔ　１ｏｎ）、アミノ酸ｓｅｑｕｅｎｃ
ｉｎｇ及びｃＤＮＡ分子クローン化が可能になった。活
性結合部位を特定することにより、ＬＰＳの前記受容体
と結合する能力を阻害したり、あるいは、ＬＰＳが細胞
活動を行うことなく前記活性部位ときつこう的に結合す
る能力を阻害する傾向のある活性受容体１ 】　２ 部位類似体の形成及び合成が可能となる。

例２ 上記例１によって得たＬＰＳ結合蛋白を前記ゲルから摘
出し、アジュバント中において均質化し、これによって
３歳のアルメニアハムスターを免疫化した。

細胞及び組織培養媒体 細胞ラインＳｐ２１０−Ａｇ１４　（Ｓｐ２）を、融合
パートナ−として使用した。前述のＬＰＳ結合蛋白受容
体によって免疫化したアルメニアハムスターから得た５
ｐｌｅｎｏｃｙｔｅＳを、抗体生成細胞源として使用し
た。無菌ハムスター肺臓を、３ｃｃの注射器の針を使用
したステンレスの網を通過させることにより、５ｐｌｅ
ｎｏｃｙｔｅｓの単細胞けん濁液を得た。

次に、この５ｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓけん濁液とＳｐ２細
胞とを、培養媒体（Ｆｅｔａｌ　　ＣａＩｆ　　Ｓｅｒ
ｕｍなし）にてそれぞれ別に洗浄し、遠心処理にて収集
した（５００ｘｇ、１０ｍ１ｎ）。尚、基礎媒体として
は、グルタミン（４ｍＭ）、ペニシリンストレプトマイ
シン（２％）、非必須アミノ酸（１％）、ナトリウムピ
ルビン酸（１ｍＭ）及びウシ胎児血清（１５％）を追加
したＲＰＭＩ　　１６４０を使用した。

被験動物 １２週令の雌のアルメニアンハムスター（Ｃｙｔｏｇｅ
ｎ）を免疫化に使用した。

抗原 溶解分離したはつかねずみの５ｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓか
ら得たＬＰＳ結合蛋白濃縮画分を添加したＳＤＳゲルの
８０ｋＤａ蛋白から溶離した蛋白。

免疫化 ハムスターに、２５０ｕｌのフロインドアジュバント中
においてエマルジョン化した２５０ｕｌのＰＢＳ中の抗
原１０ｕｇを皮下注射することによって免疫化した。１
４日後、これらハムスターに、２５０ｕｌのＰＢＳ中の
１０ｕｇのアジュバントと２５０ｕｌの不完全フロイン
３ ４ ドアシュバントによって追加抗原刺激処理した。

更に、２８日目において、不完全フロインドアジュバン
トの抗原により追加抗原刺激処理した。

そして、最後の追加抗原刺激処理は、細胞融合の３日前
の第６４８目に、５００ｕｌのＰＢＳの２０ｕｇの抗原
を腹膜注射することによって行った。

融合 −つのハムスター肺臓から、約７．５ｘ　１０７の５ｐ
ｌｅｎｏｃｙｔｅｓが生成された。洗浄した５ｐｌｅｎ
ｏｃｙｔｅｓをプールし、１．５ｘｌｏ７ｓｐ２１０ユ
ニツトの細胞と遠心分離処理した。５０ｍＬの円錐管中
の沈澱した細胞に、１ｍＬの５０％ＰＥＧ　１４５０　
（ＲＰＭ１１６４０中）を２分間に渡って添加した。こ
の細胞けん濁液を、血清（ｓｅｒｕｍ）を含有していな
い１ｍＬの媒体で滴下にて希釈した。この希釈は、４分
目で２ｍＬ、５分目で４ｍＬ、６分目で８ｍＬを滴下し
て行った。このけん濁液を、すぐに、ペレット化しく５
００ｘｇ、５ｍ１ｎ）、Ｆｅ２とＨＡＴとを添加した基
礎媒体中にて再けん濁化し、更に、１ｘ１０５の生育細
胞／１００ｕｌ／ウエルて９６のウェル板に分配した。

陽バイブリドマスを得るための濾過 各ウェルからの培養上清を、７０Ｚ／３細胞全部と、５
％ｇ／ｍＬの部分的に純化した８０ｋＤａＬＰＳレセプ
タ抗源で、ＥＬＩＳＡにより濾過した。結合したハムス
ター抗原体か、ペルオキシダーゼ−１ａｂｅｌｅｃｌラ
ビット抗ハムスタＩｇ　　ｐｌｕｓ　　ＴＭＢ（テトラ
−メチル−ベンジダイン）を基質として有する状態で検
出された。光学密度は４３０ｎｍであった。

８０　　ｋＤａ　　ＬＰＳレセプタ抗源抗隠士溝を、−
元ウニスターン法（ｗｅｓｔｅｒｎ　　ｂｏｌｔｓ）に
より濾過した。

サブクローン化 目的のバイブリドマスを、補充媒体中の０．６％のアガ
ロース（ＳｅａＰｒｅｐ、ＦＭＣ）を使用した軟寒天中
にてサブクローン化した。免５ ６ 痩化プロトコル（腹膜注射）に基づいて、二つのモノク
ローナル抗原体が分離された。これらのモノクローナル
抗原体（３Ｄ７及び５Ｄ３）は、ＩｇＭでその分子の大
きさは１９Ｓである。

これらの二つのモノクローナル抗原体を、８０ｋＤ　　
ＬＰＳ−結合レセプタグリコプロティンの二つの異なっ
たエピトープに向けた。即ち、一つの抗原体は、炭水化
物部分に、もう一つの抗原体はプロティン決定子に向け
られた（表２）。

その予備結果は、モノクロール５Ｄ３抗源による前処理
によって、ねずみの致死性が抑制されたことを示した。

（表３） モノクローナル抗原及び／又はこの抗原の組成物（例え
ばＦａｂ）をエンドトキシン受容体に使用することで、
受容体と結合するエンドトキシンと競合することが可能
であり、従って、白血球細胞又はエンドセリアル細胞活
動を要請することが出来る。又、モノクローナルは、エ
ンドトキシンを結合しこれが目標細胞と反応することを
防止するために使用可能な抗イデイオタイプの抗原体を
生成するための免疫源としても使用可能である。

エンドトキシンリポポリサッカライドの潜在的免疫性刺
激特性から鑑みて、モノクローナル抗原体を、更に、ア
ジュバン１へ組織に組み込んて無関係の抗原体の免疫発
生能力を促進するのに使用することも可能である。

例３ 上記例２によって得たモノクローム抗原体３Ｄ７の、そ
のエンドトキシンＬＰＳの８０　　ｋＤａ　　ＬＰＳ受
容体に対する結合力抑制能力を評価した。（第１図参照
）ねずみの肺臓に、徐々に多量の抗原体（レーン８−５
）と、無関係のモノクローム抗原体（レーン４−１）と
を添加した。摂氏３７度で５分間放置後、Ｉ　−ＡＳＤ
−ＬＰＳを添加し、通常のプロセスにより細胞を光クロ
スリンクした。次に、可溶化細胞抽出物を、５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥを使用して分析、放射能写真をとった。ＬＳＰの
８０ｋＤａ受容体に対するコントロール結合力は、レー
ン９に示７ ８ されている。

例４ ＬＰＳか、モノクローナルｍＡｂ　　３Ｄ７の５ｐｌｅ
ｎｏｃｙｔｅｓに対して結合することを抑制することは
第２図に示されている。肺臓細胞を、ミクロタイター（
ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）板に張り付け、種々のＬＰＳ濃
縮物により処理した。次に、これらの細胞を、洗浄し、
モノクローナルｍＡｂ３Ｄ７又は無関係モノクローナル
（ａｎｔｉｌａ）をこれに添加した。この結合した抗原
体をＥｌｆ、ＩＳＡによって評価した。

例５ 約６連合のＣＲＩ雌のねずみに対する餌投与を、実験前
の夜の約１１時３０分に中止した。

そして、次の日の正午に、これらのねずみにｍＡｂ　　
５Ｄ３、又は、１００ｕｌの無菌ピロゲンフリー塩にノ
ーマルハムスターＩｇＧを入れて皮下注射した。１時間
１５分後、すべてのねずみに１２ｎｇのＳ、ｅｎｔｅｒ
ｉｔｉｄｉｓＬＰＳ　　エンドトキシンと１８ｍｇのＤ
−ｇａＩａｃｔｏｓａｍｉｎｅを水に溶かしたものを投
与し、その後、餌の投与を再開した。最初の１０時間に
毎時間ねずみの致死率をモニターし、これに続く３６時
間はモニターを間隔をおいて行った。

これらの実験により、ｍＡｂによる前処理がｇａｌａｃ
ｔｏｓａｍｉｎｅに対する感覚モデルにおけるエンドト
キシン致死性に対してねずみを保護すること、及び、僅
か７．５ｕｇのｍＡｂ　　５Ｄ３によっても１００％保
護できることが明かとなった。（表４参照） 例に の実験の方法は、ＭｏＡｂ　　５Ｄ３の投与量を１５ｕ
ｇに制限したこととＬＰＳの投与量を１１００ｎにした
こととの他は、実験例１０と全く同じである。

この実験によって、１５ｎｇのＭｏＡｂ　　５Ｄ３の投
与が、ｔｅｎ　　ＬＤ＋ｏｏのＬＰＳエンドキシンの投
与に対してほぼ完全な保護を提供９ ０ することが明かになった。（表５参照）例７ 約４−６月令のＣ３Ｈｅ　ｂ　／　Ｆ　ｅ　Ｊ雌ねずみ
に、無菌塩又は２５０ｕｇのＭｏＡｂ　　５Ｄ３による
前処理を行った。−時間後、すべてのねずみに、２５０
ｕｇのＥ、ｃｏｌｉ　　０１ｌｌＬＰＳ　　エンドキシ
ンを投与した。そして７２時間に渡って毎日致死率をモ
ニターした。

これらの二つの実験の結果か表６に示されている。これ
らの実験は、ｍＡｂ　　５Ｄ３がノーマル（ｎｏｎ−ｇ
ａｌａＣｔｏｓａｍｉｎｅｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ）のね
ずみをＬ　Ｐ　Ｓエンドキシンの致死作用からをも保護
することが明かになった。

例８ ６週令のＣＦＩねすみ（表７の実験例１）又は１００週
令ＣＦＩねずみ（表７の実験例２）に、無菌塩又はＳ、
ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓＬＰＳ又は、ｍＡｂ　　５Ｄ３
　（実験例１においては７５ｎｇ、実験例２においては
７５０ｕｇ）を投与した。そしてその例５に記載の方法
で致死率をモニターした。

これらの実験により、ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ　　
５ｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ　　ａｓｓａｙにおいて決
定されるｍＡｂ　　５Ｄ３のエンドキシン活動が、０．
２ｎｇのＬＰＳ等価物（実験例１）又は、約０．０３ｎ
、ｇのＬＰＳ等価物（実験例２）よりも少ないことが明
かになった。（表７参照） 例９ ｍＡｂ　　５Ｄ３又はＥ、ｃｏｌｉ　　Ｏ］ＩＩＬＰＳ
の連続希釈物を、ピロゲンフリーガラスの１２ｘ７５ｍ
ｍ試験管にて生成し、次に、５０Ｕ１のｌｉｍｕｌｕｓ
　　ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ　　１ｙｓａｔｅ　　（ＬＡ
Ｌ）（、ＬｏｈｎＬ、Ｒｙａｎ、工−−ル大学、Ｎｅｗ
Ｈａｖｅｎ　　コネチカッＩ・州）を添加した。これら
の試験管を一時間摂氏３７度にて保温し、次にゲル化評
価した。　　（Ｌｉｍｕｌｕｓ　　Ｉｙｓａｔｅ　　ａ
ｓｓｙは、小量のＬ　Ｐ　Ｓエンドキシンの２　］ ２ 存在を検出するためのきわめて敏感かつ、比較的特定的
なテストである。） これらのデータは、１マイクログラムのｍＡｂに対して
約０．３ｎｇのＬＰＳのｍＡｂ　　５Ｄ３製剤における
エンドキシン活動の相対量を示すものである。（表８参
照） 例１０ Ｃ３ＨｅＢ／ＦｅＪ牌臓細胞を、無菌状態で分離し、こ
れを９６のウェルミクロタイター板で、１ミリリットル
当り２．５ｘ１０６個の細胞の濃度で組織培養に配置し
た。２００ｕｌの細胞に対して（ＲＰＭＩ　ｌ　６４０
媒体含有グルタミン及び抗原体中）、様々な濃度のＥ、
ｃ。

１ｉ　　０１１１　　ＬＰＳ及び／又はｍＡｂ　　５Ｄ
３を添加した。そして、細胞を、湿気を有する二酸化炭
素５％含有の雰囲気中において２４時間に渡り摂氏３７
度にて培養した。更に１６時間培養した後、細胞を取り
出し、３Ｈチミジン混合率を評価した。

これらのデータによって、純化されたｍＡｂ５Ｄ３は僅
かに細胞分裂促進性を有してはいるが、５０ｕｇ／ｕｌ
のｍＡｂの促進性は１６ｎｇ／ｍｌのＬＰＳの促進性よ
りも低いことが明かとなった。又、更にｍＡｂの濃度を
高めれば、ｍｕｒ　ｉｎｅ　　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ
のＬＰＳ刺激を部分的に抑制するか、この抑制作用はＬ
ＰＳの濃度を高めることによってもっとも効果的に現れ
ることかわかった。（第３図参照）例１１ これは表７及び８と第３図のデータのまとめである。こ
れらのデータをまとめると、ｍＡｂ５Ｄ３の相対的エン
ドキシン活動が、■マイクログラムのｍＡｂ　　５Ｄ３
に対して約０．１ｎｇのＬＰＳ活動に相当することが明
らかとなった。（表９参照） 例１２ ６−８週令のＣＦＩねすみに、１５ｕｇのｍＡｂ　　５
Ｄ３又は種々の投与量のＳ、ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ　
　ＬＰＳエンドキシンを０．１ｍ１の量で腹膜注射によ
り投与した。

３ ４ 約１時間後、すへてのねずみに、１５ｎｇのＬＰＳ　（
表１０の実験例１）又は］ＯｎｇのＬＰＳを投与した。

例１３ ｍＡｂ　　５Ｄ３を摂氏４度に維持あるいは、６０分間
沸騰水浴中にて加熱処理した。次に、連続希釈を行い、
例８に記載した方法てｌｉｍｕｌｕｓ　　１ｙｓａｔｅ
活動を評価した。

これらのデータによれば、摂氏１００度まで安定してい
るエンドキシンとは異なり、ｍＡ、ｂ５Ｄ、３のエンド
キシン活動は摂氏１００度まで加熱された場合約２オー
ダー減少することか明らかとなった。この実験は、更に
、ｍＡｂ５Ｄ３とＬＰＳ　　エンドトキシンとを区別す
るのに利用出来、又、ｍＡｂ　　５Ｄ３製剤に関して観
察されたエンドトキシン活動が、実際には、ｍＡｂ　　
５Ｄ３によるものであり、汚染エンドトキシン−ＬＰＳ
の存在によるものではないということを立証するもので
ある。（表１１参照）例１４ ピロゲンフリー塩の１５０ｕｇ／ｍｌのｍＡｂ　　５Ｄ
３の個々の製剤を、ａ）摂氏４度で維持、又はｂ）約６
０分で摂氏１００度まて加熱、又はｃ）５００ｎｇ／ｍ
ｌ　　（最終濃度）のＥ。

ｃｏｌｉ　　０ＩＩＩＬＰＳを添加して次に摂氏１００
度まて加熱、した。更に、５００ｎｇ／ｍ１ＬＰｓのコ
ントロール製剤をも６０分間で摂氏１００度まで加熱し
た。次に、１００ｕ１のこれらの製剤を、８週令のＣＦ
Ｉねすみに腹膜注射によって投与した。１時間１５分後
、１８ｎｇのＳ、ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ　　ＬＰＳと
、１８ｍｇのＤ−ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅを腹膜注
射によって投与して、例５に記載の方法にてその生存率
を評価した。

これらのデータにより、ｍＡｂ　　５Ｄ３の保護能力か
摂氏１００度まての加熱によって破壊され、一方、ＬＰ
Ｓの保護能力が摂氏１００度においても安定しているこ
とか明かとなった。

これらのデータは、可能なエンドトキシン汚染に対する
表１１の結論を裏付けさらに、これら２　′・ ６ を拡張するものである。（表１２参照）例１５ ８０　　ｋＤａ　　ＬＰＳ結合蛋白の高度に純化した製
剤を、２０　　Ｃ３Ｈｅｂ／ＦｅＪねずみから得たｐｈ
ｏｔｏｌａｂｅｌｌｅｄ　　５ｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓの
ブタノール抽出によって調合した。このブタノール抽出
物を、更に、二次元の５ＤＳ−ＰＡＧＥに基づく８基準
１ｓｏｅｌｅｃｔｒｅｉｃ　　ｆｏｃｕｓｉｎｇ　　ゲ
ルで更に純化した（１９８８年　Ｊｏｕｒｎａ　］ｏｆ
　　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　　ｐｕｂｌｔｃａｔｉｏｎ
ｓにおいて記載されている５ｔａｎｄａｒｄ　　Ｏ’Ｆ
ａｒｒｅｌｌ　　２次元電気泳動工程）次に、分離され
た蛋白を、Ｉｍｍｕｎ。

ｂｉｌｏｎ−Ｐ膜組織上にてｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔ
ｅｄＬ、放射能グラフによってその８０　　ｋＤａ蛋白
の存在を同定した。前記純化した蛋白を、次に、ピリジ
ンとアセトンニトライト した。この蛋白の二連続希釈物を生成し、これによって
９６のウェルミクロタイター板を被覆した。次に、ｍＡ
．ｂ　　５Ｄ３　（２０ｕｇ）又は、無関係ハムスター
モノクロール抗源体ｍＡｂ４Ｇ２　（２０ｕｇ）に対す
る反応性を調へた。

これらのデータにより、ｍＡｂ　　５Ｄ３か純化した８
０　　ｋＤａ　　ＬＰＳ結合蛋白に結合することか判明
した（第４図参照）。

例１６ ラビツｌ（Ｎｅｗ　　Ｚｅａｌａｎｄ　　Ｗｈｉｔｅ種
）を、５　０ｕｇのｍＡｂ　　５Ｄ３により、完全フロ
インドアジュバントにて免疫化し、更に、二週間後、不
完全フロインドアジューバントにて追加抗原刺激処理し
た。次に、更に２週間の後、ラビットから採血して、標
準ＥＬＩＳＡによって、ｍＡｂ　　５Ｄ３　（第５ａ図
）及びｐｒｅ　　Ｂ　　細胞７０Ｚ／３（第５ｂ図）に
対する血清反応を評価した。

これらの実験から引き出される結論は、ｍＡｂ　　５Ｄ
３に対して強化されたラビットの抗血清が、ｍＡｂ　　
５Ｄ３に対する高い親和性と結７ ８ 合するということである。ラビットの抗血清が、又、ｐ
ｒｅ　　Ｂ　　細胞７０Ｚ／３に対しても結合するどい
こことは予期せぬ結果であった。

（第５図参照） 例１７ ねずみの肺臓細胞を、前述したように、Ｉ−ＡＳＤ−Ｌ
ＰＳによってｐｈｏｔｏｌａｂａｌｌｅｄした。次に、
ブタノールの抽出物（Ｗｅｓｔｅｒｎ　　ｂｌｏｔｓ）
又はホール・セル抽出物（免疫沈降）を用意した。ブタ
ノール抽出物を、アクリルアミドゲルにてｅｌｅｃｔｒ
ｏｐｈａｓｅｄＬ、ニトロセルロースにてｂｌｏｔｔｅ
ｄし、結合第２抗源体（第６図のレーンＡ）又は第２抗
源体（第６図のレーンＢ）のみに基づくラビット抗　５
Ｄ３　　抗血清でプローブした。一方、ホールセル抽出
物を、ラビット抗　５Ｄ３　　抗血清又は緩衝剤によっ
て潜伏させ、次に、Ｉｇｓｏｒｂにより免疫沈降させた
。ペレットと上清との両方が、ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒ
ｅｓｅｄ又はポリアクリルアミドゲルであり、その後ゲ
ルの放射能写真を取った。

レーン１はホールセル抽出物、レーン２はラビット抗　
５Ｄ３　　抗血清プラスＩｇｓｏｒｂ、レーン３はラビ
ット抗　５Ｄ３　　抗血清プラスＩｇｓｏｒｂの免疫沈
降物、レーン４はＩｇｓＯｒｂコントロールの上清、レ
ーン５は■ｇＳｏｒｂコントロールのペレットである。

これらの結果により、ラビットのｍＡｂ　　５Ｄ３によ
る免疫化によって、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ　　分析と
特定免疫沈降との両方によって、８０　　ｋＤａ　　Ｌ
ＰＳ結合蛋白畳容体に反応するポリクローナル抗原の生
成が可能であることがわかった。（第６図参照） ハイブリドマセルライン分泌モノクローナル抗原　３Ｄ
７及び５Ｄ３は、カンサス大学医療センター、医学部、
マイクロバイオロジー、分子遺伝免疫学課（３９ｔｈ　
　ａｎｃｌ　　Ｒａｉｎｂｏｗ　　Ｂｌｖｄ，、カンサ
ス市カンサス州６６　１　０　３）と、１９８９年５月
４日以降においては、Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　
　Ｃｕｌｔ９ ０ ｕｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　　（ＡＴＣＣ）１２
３０１　　　Ｐｒｋｌａｗｎ　　　Ｄｒｉｖｅ、　　　
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　　　ＭＤ　　２０８５２に　おい
て、３Ｄ７　（Ｉ（Ｂ１０１２１４）及び５Ｄ３（Ｉ−
（ＢＩＯ１２５）のタイトルのもとに保管されている。

例１８ ｍＡｂ　　５Ｄ３のみの効果と、マイクロファージか媒
介となる腫瘍細胞毒の誘導剤としての他の物質との組合
せによる効果とを調べるために実験を行った。

６−９週令の雄のＣ３Ｈ／ＨｅＮ及びＣ３Ｈ／　Ｈｅ　
Ｊねずみから骨髄細胞を採取した。ねずみの脛骨及び大
腿骨から骨髄を除去し、これらを、Ｌｅｕｎｇ　ｅｔ　
　ａｌ、ｃｅｌｌ　　Ｔｉ５ｓｕｅ　　Ｒｅｓ、２３９
　：　６９３　（１９８５）に基づきバクチリアルｇｒ
ａｄｅ　　Ｐｅｔｒｉデイシュにて培養した。

この文献の開示内容はこの明細書に含まれている。１４
−１８日令の培養から得たマイクロファージを実験に使
用した。

非粘着性細胞を、前記培養の上溝媒体から除去した。弱
く粘着している細胞を、２０分間ＰＢＳて摂氏４度にて
保温し、次にラバー・ポリスマン（ｒｕｂｂｅｒ　　ｐ
ｏｌｉｃｅｍａｎ）て取り外した。この後、約６ｘｌＯ
’のマイクロファージを、９６のウェルで、各ウェルご
とに接種した。

前記細胞を、摂氏３７度で、二酸化炭素５％含有雰囲気
中にて、２時間、１０％のＦＢＳを含有したＨ−ＭＥＭ
で粘着させた。このように生成したマイクロファージ単
層を、使用直前のＦＢＳ　１０％含有の新しいＨ−ＭＥ
Ｍで２回清浄した。

次に、層状の細胞を複製サンプルを、ＦＢ８１０％含有
Ｈ−Ｍ　Ｅ　Ｍにて希釈した１００ｕｌの刺激剤で６時
間処理した。より詳述すると、種々の濃度のｍＡｂ　　
５Ｄ３のみと、３Ｕ／ｍ１のＩＦＮ−γとの絹合せとを
使用した。又、様々な濃度のＥ、ｃｏｌｉ　　０１１１
：Ｂ２Ｓ３ ２ ＬＰＳも使用した。

刺激剤による潜伏化の次に、２ｘｌＯ’”Ｃｒ　　１ａ
ｂｅｌｌｅｄ　　Ｐ８１５　　肥満細胞腫を、１００ｕ
ｌの媒体ｒ１月こて各ウェルで接種した。１６時間後、
最も上方の０，１ｍｌの上溝媒体を、各ウェルからゆっ
くりと吸引し、ガンマスペクトロメータによってその放
射能活動を分析評価した。培養中への５ＩＣｒの放出は
、細胞の死亡を測定する目安となる（ＲｕｓｓｅＩＩ、
ｉｎ　　Ａｄａｍｓ　　ｅｔ　　ａｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｆｏｒ　　Ｓｔｕｄｙｉｎｇ　　Ｍｏ１ｅｃｌｅａｒ　
　Ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ　（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓ
ｓ　　Ｎ、Ｙ、１９８０）第７９３頁。この結果は次の
式によって表される。

％５ｐｅｃｉｆｉｃ　　５１Ｃｒ放出 実験放出−自然放出Ｘ総放出カウント−自然放出 ここで、「総放出カウント」とは、低浸透圧媒体中にて
凍結及び解凍されたターゲット細胞から放出された数と
定義する。「自然放出」とは、非刺激単層の単層で培養
されたターゲット細胞から放出された５ＩＣｒと定義す
る。

結果は、第７図の種々のパネルに示されている。第７ａ
図に示すように、ｍＡｂのみで、細胞毒マイクロファー
ジの約６０％までの放出が可能であった。ＩＦＮ−γを
添加した場合は、第７ｂ図に示すように、ｍＡｂの活動
は増加し、これはより低い濃度のｍＡｂにたいして毒性
が６０％増加していることによって証明されている。こ
こでは示さない比較実験において、同じ濃度におけるＩ
　Ｆ　Ｎ−γのみの使用では全く効果がなかった。

第７０に示されているように、ＬＰＳの予期された効果
か証明された。

例１９ 以前の作業により、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪねずみからのマイク
ロファージは、ＬＰＳによる刺激に対しては比較的無反
応である一方、例えば、熱殺菌したりＬｉ５ｔｅｒｉａ
　　ｍｏｎｏｃｙｔｏ　ｇ　ｅ　ｎ　ｅ　ｓ　（”　Ｈ
ＫＬＭ”　）によって免疫刺４ 激することが可能であることがわかっている。

Ｒｕｃｏ　　ｅｔ　　ａｌ、Ｊ、Ｔｍｍｕｎｏ１１２０
　：　３２９　（１９７８）参照。この目的のために、
コントロール（Ｃ３Ｈ／Ｈｅ　Ｎ）レスポンダと低レス
ポンダ（Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ）骨髄由来マイクロファージと
の両方におけるｍＡｂ５Ｄ３の腫瘍細胞減殺活動の導入
に対するｍＡｂ　　５Ｄ３の効果を調べるために実験を
行った。

例１８のプロトコルにほぼ従い、ＨｅＮ細胞をコントロ
ールレスポンダに使用し、ＨｅＪを低レスポンダとして
使用した。ｍＡｂ　　５Ｄ３、Ｌ　Ｐ　Ｓさ及びＨＫＬ
Ｍを、１０ｕ／ｍｌのハッカネズミＩＦＮ−γと組み合
わ、６時間後の５１　Ｃｒ放出値を測定した。その結果
、第８図に示すように、Ｌ　Ｐ　Ｓに対して反応性のな
いマイクロファージは、ｍＡｂ　　５Ｄ３に対する反応
性も無かった。即ち、ＨｅＪ細胞には腫瘍減殺活動の大
幅な増加は認められなかった。

例２０ ｍＡｂ　　５Ｄ３かＬＰＳに質的に類似した行動を示し
たので、観察されたｍＡｂ活動が例１３及び１４にて記
載した問題に類似した汚染エンドトキシンの結果ではな
いことを示す必要が生じた。この点に関して、エンドト
キシンは、摂氏１００度で長時間加熱した後ではその生
物学的活動の大部分をまだ保持することか知られている
。一方、言うまでもなく、抗原体においてはそうではな
い。この例は、エンドトキシンによる汚染の可能性がい
かになくなったかを示すものである。その結果を、前述
の例において記載した結果と比較する必要がある。

様々な濃度の非加熱又は加熱（摂氏１００度で１時間）
したｍＡｂ　　５Ｄ３を、３Ｕ／ｍ１ＩＦＮ−γの存在
のもとで上述したＨ　ｅ　Ｎ細胞に使用した。これらの
結果は、パネル９ａに示すように、前の実験、前述した
細胞毒のテスト結果に近似したものである。加熱処理し
たものは活動を示さず、これはエンドトキシン汚染が無
いことを示すものである。

例２１ ５ ６ エンドトキシン汚染が発生しなかったことを更に裏付け
るために、マイクロファージにたいするＬＰＳ活動の強
力な抑制剤として知られているポリミキシン　Ｂを使用
して実験を行った。Ｃｈｉｏ　　ｅｔ　　ａｌ　　Ｊ、
ＩｎｆｅｃｔＤｉｓ、１５９：８７２　（１９８９）、
Ｓｔ。

ｋｅｓ　　ｅｔ　　ａｌ　　Ｊ　　Ｔｎｆｅｃｔ　　Ｄ
ｉｓ、１６０：５２　（１９８９）Ｍｏｒｒｉｓ。

ｎ　　ｅｔ　　ａｌ　　Ｉｍｍｕｎｃｃｈｅｍ１３：８
１３　（１９７６）参照。

これらの実験において、前述した例において記載したプ
ロトコル及びパラメータを再び使用して、ｍＡｂ　　５
Ｄ３をポリミキシンＢと共に潜伏させた。第９Ｂ図に示
すように、刺激活動は僅かだけ抑制された。これに対し
て、ＬＰＳを同量のポリミキシンＢと混合した場合にお
いては、その活動は完全になくなった。事実、僅か１　
ｕ　ｇ／ｍ　ｌのポリミキシンＢを１０ｎｇ／ｍｌ　　
ＬＰＳと使用した場合においても、活動は”Ｃｒ放出が
５８９３から１．３％まで減少した。従って、ｍＡｂ　
　５Ｄ３の活動は熱によって影響を受けるが、ポリミキ
シンＢに対しては無反応であり、従って、エンドキシン
汚染から生じたものではない。

例２２ ｍＡｂ　　５Ｄ３の活動に対するＬＰＳの効果をテスト
した。マイクロファージをＩＦＮ−γによって、次に加
熱又は非加熱ｍＡｂ　　５Ｄ３によって、ＬＰＳのいち
値以下のトリガ濃縮物の存在又は不在下において、充満
させた。

（０，１ｎｇ／ｍｌ）これらの結果は第１０図に示され
ている。再び前述した例の方法により、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ
マイクロフアージをテスｌ−した。

ある程度の濃度の５Ｄ３のもとでは、ＬＰＳを０．１／
ｎｇ／ｍ］添加することによって活動がほとんど３倍に
増加したことがわかる。これは約７ｕｇ／ｍ１以上に濃
度を増加させた場合には起こらなかった。加熱処理され
たｍＡｂ５Ｄ３はなんら活動を示さず、これはＬＰＳを
添加しても変わらなかった。

８ これらの結果は、ＬＰＳとｍＡｂ　　５Ｄ３との組合せ
が単なる追加的効果以上のものを有することを示すもの
である。

例２３ 以前の作業により、培養媒体中におけるａｎｔｉ　　Ｉ
ＮＦ−α／β　かＬ　Ｐ　Ｓによって誘導されたマイク
ロファージ腫瘍減殺活動を抑制するものであることがわ
かっている。Ｌｅｕｅｔ　　ａｌ、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏ
ｌｏｇｙ　　１７１：２２０　（１９８６）参照。これ
はＬＰＳ刺激マイクロファージによってトリガされた１
ＦＮ−ａ／β　のａｕｔｏｃｒｉｎｅ／ｐａｒａｃｒｉ
ｎｅ充満効果が無くなることが原因であることがわかっ
ている。ｍＡｂ　　５Ｄ３の効果に対するａｎｔｉ−Ｉ
ＦＮ　　α／β　抗原体の効果を調べるために、Ｃ３Ｈ
／ＨｅＮマクロフア一ジ単層を、羊のａｎｔｉ−ＩＦＮ
α／β　抗原体又はノーマルの羊ＩｇＧの存在下におい
て刺激処理した。ここでも、活動がいかにテストされた
かについては前述した分析評価文献を参照されたい。第
１１図は、ａｎｔｉＩＦＮ　　α／β　抗原体が、ＬＰ
Ｓに対してと同様の効果を５Ｄ３に対しても有している
ことを示すものである。

例１８ないし２３は、ｍＡｂ　　５Ｄ３が認識する８０
キロダルトン膜ＬＰＳ結合蛋白受容体が、その活動によ
って腫瘍の減殺が制御される物質の少なくとも−っであ
ることをはっきりと示すものである。

Ｍａｂ　　５Ｄ３は、マクロファージによる腫瘍減殺性
の仲裁に関してＬＳＰの活動を忠実に再現するが、同様
の毒性効果は有していない。

従って、その蛋白組成物を介して８０キロダルトンＬＰ
Ｓ受容体に特定的に結合するｍＡｂかマイクロファージ
活動を表す指標であるということが出来る。

これらの結果は、前述したＬＰＳ受容体の蛋白質に結合
するｍＡｂであるｍＡｂ　　５Ｄ３がマイクロファージ
を刺激して腫瘍に対する減殺作用を発生させることを示
すものである。これ９ ０ はＩＦＮ−γとの組合せによっても又効果的であるが、
但し、インクフェロンは必ずしもこの効果を発生させる
ための必須物質ではない。

前述した以前の実験に示されているように、ｍＡｂ　　
５Ｄはそのホストに対して毒性を有するものではない。

従って、ここで記載した実験は、ｉｎ　　ｖｉｖｏ　　
治療に転用可能であることが予想される。なぜなら、こ
こで使用したモデルがこの効果を予想させるからである
。

従って、上述の例は、例えばｍａｓｔｏｃｙｔｏｍａ細
胞等の腫瘍細胞に対して、治療を必要とする患者に、ｍ
Ａｂ　　５Ｄ３のような８０キロダルトンＬＰＳグリコ
プロチンのタンパク質に特定的に結合するモノクローナ
ル抗原体を治療上有効な分量だけ投与することによって
、腫瘍細胞に対する減殺効果を達成する方法を提供する
ものである。このモノクローナル抗原体は、ガンマイン
ターフェロンとともに投与することも可能であるが、こ
れは必ずしも必要ではない。

前記モノクローナル抗原体及びガンマインターフェロン
の投与量は、治療される患者によって異なるであろう。

前述したように、ｍＡｂのみを添加した場合には、モノ
クローナル抗原体の濃度は最低１０ｕｇ／ｍｌであるこ
とが望ましい。約３Ｕ／ｍｌの濃度のＩＦＮ−γと共に
投与する場合には、ｍＡｂの投与濃度はａｕｇ／ｍｌに
まで減らすことが出来る。特に好ましい実施例に依れば
、１０ｕｇ／ｍｌのｍＡｂと３Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γと
が共に投与される。

この点に関して、前述した文献にはモノクローナル抗原
体とＩＦＮ−γとの治療用組成が記載されている。ｍＡ
ｂはマイクロファージの肉腫細胞に対する活動を起こさ
せるに十分な量が存在し、一方、ＩＦＮ−γは、モノク
ローナル抗原体の効果を強化するのに十分な量か存在す
る。

ここで使用した用語や式は記載の目的においてのみ使用
されたものであって、なんら本発明を限定するものでは
ないことは言うまでもない。

１ ２ 表　　１ ＬＰＳ結合蛋白質のアミノ酸組成物Ｉ アミノ酸２　　　　　　　　残留物３ Ａｓｐ　　　　　　　　　　　７３ Ｇ］ｕ１０５ Ｓｅｒ　　　　　　　　　　　４５ Ｉｙ４６ Ｈｉｓ　　　　　　　　　　　　１９ Ａｒｇ　　　　　　　　　　　３３ Ｔｈ　ｒ　ａ　　　　　　　　　　３９Ａｌａ　　　　
　　　　　　　５３ Ｐｒｏ　　　　　　　　　　　３２ Ｔｙｒ　　　　　　　　　　　　２７ Ｖａｌ　　　　　　　　　　　　４１ Ｍｅｔ　　　　　　　　　　　　　５ ｒｌｅｕ　　　　　　　　　　］６ Ｌ　ｅ　ｕ　　　　　　　　　　　６０Ｐｈｅ　　　　
　　　　　　　３１ Ｌｙｓ　　　　　　　　　　　　８１ ■　二次元ゲルから純化され、イモピロンに吸収されて
酸加水分解およびアミノ酸分析を受けるＬ　Ｐ　Ｓ結合
蛋白質。

２３回の独立した量定の平均値。

３　８０．０ＯＯｋＤａ分子量に基つく。

表２ 純化された８０ｋＤａのＬＰＳ受容体と結合するモノク
ローナル抗体における化学変化の効果ＭｏＡｂの４３０
ｎｍにおける吸収度 処理剤１　　　　　　３Ｄ７　　　　５Ｄ３なし　　　
　　　　　０．３１　　　０．１６過ヨウ素酸塩１ｍＭ
　　　＜０．０１　　　０．２３１０ｍＭ　　　＜０．
０１　　　０．６７プロテアーゼ　Ｋ Ｏ，ｌｏｇ／ｍｌ　　　０．２９　　　　＜０．０１１
、ｏｕｇ／ｍｌ　　　０．２８　　　　＜０．０１１３
７°Ｃで１時間、過ヨウ素酸塩またはプロテアーゼにで
処理された８０ｋＤａのＬＰＳ受容体で塗布されたミク
ロタイター板。

３ ４ 表３ 純化された５Ｄ３モノクローナルを用いたねずみの抗エ
ンドトキシン死亡率保護 処理剤！　　　　抗原投与　　１０時間後の残留物塩水
　　　　　０．０１ｕｇ　ＬＰＳ　　　　１／１０　（
１０％）５Ｄ３　（７５ｕｇ）　　　０．（ｌｌｕｇ　
ＬＰＳ　　　１０／１０　（１００％）１　ねすみ（Ｃ
Ｒ１雌、１８−２２ｇｍ）は、発熱物質を含まない塩水
、または純化された５Ｄ３モノクロ一ナル抗体のいずれ
かを、最終容量６０μｍで腹膜組織内へ投与された。

１時間後、ねずみは、第２回目の腹膜組織内へのＳ腸炎
ＬＰＳと１８ｍｇのＤ−ガラクトサミン注射を受けた。

残留物は最初の９時間は１時間毎にモニタされ、その後
は１２時間間隔でモニタされた。すべての実験ねずみは
６〜１２時間内に死亡した。５Ｄ３を投与されたねずみ
は４８時間経っても死亡しなかった。

表４ ガラクトサミン治療されたねずみにおけるＭｏＡｂ５Ｄ
３の保護効力 残留物／総計 前処理剤　　　　抗原投与１　実験ｌ　実験２　総計（
％）塩水　　　　　　１２ｎｇ　ＬＰＳ　　　２／１５
　　８／１６　１０／３１（３４％）７．５ｕｇ　Ｍｏ
Ａｂ　５Ｄ３　１２ｎｇ　ＬＰＳ　　１０／１０　１０
／１０　２０／２０（１００％）７．５ｕｇ　ＭｏＡｂ
　５Ｄ３　１２ｎｇ　ＬＰＳ　　　−１０／１０　−１
０／１０（１００％）０．７５ｕｇ　ＭｏＡｂ　５Ｄ３
１２ｎｇ　ＬＰＳ　　　−３１５３１５（６０％）７５
ｕｇ　ＩｇＧ　　　　１２ｎｇ　ＬＰＳ　　　−４／１
０　　４／１０（４０％）塩水　　　５１５　　５１５
　　１０／１０（１００％）■　同時に１８ｍｇのＤ−
ガラクトサミンの投与量を受けたすべてのねずみ 表５ ガラクトサミン治療された ねずみにおけるＭｏＡｂ５Ｄ３の保護効力ＬＰＳ抗原投
与量の効果 前処理剤　　　　抗原投与Ｉ　　　　残留物／総計塩水
　　　　　　　１０ｎｇ　ＬＰＳ　　　　　　　　Ｏ／
８５ １５ｕｇ　ＭｏＡｂ　５Ｄ３　　　１０ｎｇ　ＬＰＳ１
５ｕｇ　ＭｏＡｂ　５Ｄ３　　　３ｎｇ　ＬＰＳ１５ｕ
ｇ　ＭｏＡｂ　５Ｄ３　　１１００ｎ　ＬＰＳｌ　同時
に１８ｍｇのＤ 与えられたねずみ 表６ 通常のＣ３ＨｅＢ／ＦｅＪにおける ＭｏＡｂ５Ｄ３の保護効力 前処理　　　　　抗原投与　　　実験１　実験２塩水　
　　　　　２５０ｕｇ　ＬＰＳ　　　４／９　　７／１
２２５０ｕｇ　ＭｏＡｂ　５Ｄ３　２５０ｕｇ　ＬＰＳ
　　　８／９　　１１／１１総計（％） ］　１／２１　（５３％） ０．１ １９／２０（９５％） 表７ ＭｏＡｂ５Ｄ３のエンドトキシン活性度の評価ガラクト
サミン感作されたねずみ実験１実験１ 抗原投与量　　残留物　　エンドトキシン均等物塩水　
　　　８／８ １５ｎｇ　ＬＰＳ　　　　　１１５ ７５ｎｇ　５Ｄ３　　　　８／８ 実験２ 抗原投与量　　残留物 塩水　　　　８／８ ２０ｎｇ　ＬＰＳ　　　　２／８ ７５０ｎｇ５Ｄ３　　　２／８ ＜０．２ｎｇ　”ＬＰＳ”／ｕｇＭｏＡｂエンドトキシ
ン均等物 ０．０３ｎｇ”ＬＰＳ”／ｕｇ　ＭｏＡｂ表８ ＭｏＡｂ５Ｄ３のエンドトキシン活性度の評価リムルス
属変形細胞分離物検査方法 ゲル化＊ 量　　１５ｎｇ　３ｎｇ　６００１）ｇ　ｔｏｏｐｇ　
１０１１ｇ　ｌ１１ｇ　Ｏ，ｌｐｇＭｏＡｂ　　５Ｄ３
　　　＋＋　　　　十ＬＰＳ　　　　　　　　十十　　
＋＋　　　　十士　　　　＋＋　　　　　＋＋　　　　
＋＋うろこ状固体ゲル（］＋＋ 毛状凝結　（＋） 凝結なし　（＝） ７ ８ エンドトキシン均等物：　　０．３ｎｇ″ＬＰＳ”／ｕ
ｇ表９ ＭｏＡｂ５Ｄ３のエンドトキシン活性度の評価活性度 実験　　　方法　　　　　Ｂ″ＬＰＳ”／ｕｇ　ＭｏＡ
ｂ　５Ｄ３１　ガラクトサミン死亡率　　　＜０．２ｎ
ｇ２　ガラクトサミン死亡率　　　−〇、　０３ｎｇ３
　リムルス属（非加熱）　　　　−０，３ｎｇ４　リム
ルス属（非加熱）　　　　＜０．２０ｇ５　有糸分裂促
進物質　　　　　＜０．２ｎｇ評価平均値　　−０，１
ｎｇ″ＬＰＳ”／ｕｇ　ＭｏＡｂ　５Ｄ３表１０ ガラクトサン感作されたねずみにおけるＬＰＳ死亡率に
対するＬＰＳ前処理剤効果実験１ 前処理剤　　　　抗原投与＊　残留物／総計塩水　　　
　　　１５ｕｇ　ＬＰＳ　　　　　１／８１５ｕｇ　Ｍ
ｐＡｂ　５Ｄ３　１５ｕｇ　ＬＰＳ　　　　　８／８１
００ｎｇ　ＬＰＳ　　　　　１５ｕｇＬＰＳ　　　　　
　　４／８実験２ 前処理剤　　　　抗原投与＊　残留物／総計塩水　　　
　　１０ｎｇ　ＬＰＳ　　　　　Ｏ／８１５ｕ（ＨＭｏ
Ａｂ　５Ｄ３　１０ｎｇ　ＬＰＳ　　　　　８／８１、
Ｏｎｇ　ＬＰＳ　　　　１０ｎｇ　ＬＰＳ　　　　　２
／８８、Ｏｎｇ　ＬＰＳ　　　　ｌＯｎｇＬＰＳ　　　
　　４／８１０ｎｇ　ＬＰＳ　　　　　ＩＯｎｇＬＳＰ
　　　　　８／８３０ｎｇ　ＬＰＳ　　　　　１０ｎｇ
ＬＰＳ　　　　　８／８ネ同時に１８ｍｇのＤ−ガラク
トサミン投与量を与えられたすべてのねずみ 表　　１１ リムルス属分離物＊によるＭｏＡｂ５Ｄ３のエンドトキ
シン活性度の評価 加熱効果 ＭｏＡｂ５Ｄ３　　非加熱　１００°Ｃ−６０分２００
０　　Ｂ　　　　　　　　　　１士　　　　　　　　　
　　土士４００　　　　　　　　　　　　　　＋＋　　
　　　　　　　　　　＋。

８０　　　　　　　　　　　　　４＋ ９ ０ １６　　　　　　　　　　　　　＋士 ３十 ０．６＋ ＊　ＬＡＬの感度：　　１０ｐｇ　ＬＰＳ　＋＋；　　
１．Ｏｐｇ　＋；　　０．１ｐｇ表１２ ガラクトサミン治療されたねずみにおけるＭ　ｏ　Ａｂ
５Ｄ３の抗エンドトキシン死亡率保護効力加熱効果 前処理剤　　　　抗原投与　　　残留物／総計塩水　　
　　　　１８ｎｇ　ＬＰＳ　　　　２／８（１００°Ｃ
６０ｍ１ｎ）　　１８ｎｇ　ＬＰＳ　　　　　７／８５
０ｎｇ　ＬＰＳ　１００ｃ　　　１８ｎｇ　ＬＰＳ　　
　　　８／８塩水　　　　　　　塩水　　　　４／４＊
　同時に１８ｍｇのＤ−ガラクトサンの投与量を与えら
れたすへてのねずみ

【図面の簡単な説明】

第１図はエントドキシツクＬＰＳが８０ＫＤのＬＰＳ受
容体と結合することを防止するｍＡｂ３Ｄ７の能力を示
す図、第２図はｍＡｂ３Ｄ７のＬＰＳによる５ｐｔｅｎ
ｏｃｙｔｅｓとの結合の防止を示す図、第３図は浄化Ｍ
ｏＡｂ５Ｄ３の制ｔ。 ｇｅｎｉｃｉ　ｔｙを示す図、第４図はＭｏＡｂ５Ｄ３
の８０ＫＤの浄化ＬＰＳ結合たんばくに対する反応性を
示す図、第５ａ図はＭｏＡｂ５Ｄ３に対するうさぎのポ
リクローナル−アンチモノクローナル抗血清の反応性を
示す図、第５ｂ図はプレＢセルフ０Ｚ／３に対するうさ
ぎのポリクローナル−アンチモノクローナル抗血清の反
応性を示す図、第６図はＭｏＡｂ５Ｄ３とプレＢセルフ
　０２／３に対するうさぎのポリクローナルアンチモノ
クローナル抗血清のウェスタンプロットと免疫沈降反応
を示す図、第７図はｍＡｂ５Ｄ３とＥ、コーリ（Ｅ、　
Ｃｏ１１　）骨髄誘導マクロファージ媒介腫瘍シ１〜ト
キシティからのＬＳＩ ２ ＰＳの効果を示すデータ、第８図はＬＰＳレスポンダお
よびノンレスポンダ誘導マクロファージに対するｍＡｂ
５Ｄ３の効果を示す図、第９図はマクロファージのｍＡ
ｂ５Ｄ３に対する加熱とポリミキシンＢの効果を示す図
、第１０ａ図と、第１０ｂ図はマクロファージ媒介腫瘍
シ）　１−キシティにおけるＥ、コーリＬＰＳとｍＡｂ
５Ｄ３の活性の効果を示す図、第１１図はマクロファー
ジ媒介腫瘍シトトキシティにおけるｍＡｂ５Ｄ３の活性
に対するアンチＴＦＮα／β抗体の効果を示す図である
。 図面の浄書 ３ ＦＩＧ、　２゜ ２５ ０ ００ ００ ００ ００ ＬＰＳ　（ｕｇ／ｒｎｌ） ＦＩＧ、　３゜ ＭｏＡｂ５Ｄ３゜ ｕｇ／ｍｌ ＦＩＧ、７Ａ。 １．０ ３．０ ０ ０ ００ （ｖｇ／ｍｌ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、抗腫瘍細胞毒効果を発生させるべくマクロファージ
   細胞を刺激する方法であって、腫瘍の寄主に、特に前記
   抗腫瘍マクロファージの細胞毒性を刺激するに充分な細
   菌性リポ多糖類エンドトキシンのための糖蛋白質受容体
   の８０キロダルトン蛋白部に秘結されたモノクローナル
   抗体を含有する任意量の治療組成物を投与することから
   なる方法。 ２、抗腫瘍マクロファージの細胞毒効果を刺激するに有
   効な組成物であって、特に前記抗腫瘍マクロファージの
   細胞毒性を刺激するに充分な細菌性リポ多糖類エンドト
   キシンのための糖蛋白質受容体の８０キロダルトン蛋白
   部に秘結された任意量のモノクローナル抗体と、マクロ
   ファージへの前記モノクローナル抗体の効果を増強させ
   るに充分な任意量のガンマインターフェロンからなる組
   成物。 ３、哺乳動物に敗血性ショックを起こさせる細菌性リポ
   多糖類エンドトキシンの処理方法であって、免疫化に応
   じて発生する１つまたは複数の抗体に、哺乳類細胞にあ
   る受容体に秘結された細菌性リポ多糖類エンドトキシン
   に適したモノクローナル抗体を投与することからなる方
   法。