JPH03285695A - 腫瘍に対してマクロファージの働きを活発化する方法とそのための組成 - Google Patents
腫瘍に対してマクロファージの働きを活発化する方法とそのための組成Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は、特に哺乳動物の細胞(以下「受容体」という
)の浄化細菌リポ多糖類(以下[LPSJという)結合
ファクタのたんばく成分に結合するモノクローナル抗体
の使用と、これらモノクローナル抗体を含有する組成に
関する。
)の浄化細菌リポ多糖類(以下[LPSJという)結合
ファクタのたんばく成分に結合するモノクローナル抗体
の使用と、これらモノクローナル抗体を含有する組成に
関する。
その使用は、腫瘍シトトキシティを緩和させるとともに
、エンドトキシンショックに対処するにあたってLPS
受容体に対するアゴニストとして作用するマクロファー
ジの活性化を含む。
、エンドトキシンショックに対処するにあたってLPS
受容体に対するアゴニストとして作用するマクロファー
ジの活性化を含む。
(従来の技術)
菌血症、敗血症、敗血性ショック症候群の原因となり得
る細菌は通常の体内の細菌群の一部であるのが普通であ
る。しかし、患者の中には細菌が増殖する主要環境にな
っている場合かある。これらの患者は、コルチコステロ
イド療法または放射線療法を継続的に受けている患者、
手術後の高齢患者、糖尿病や肝臓病などの慢性疾患を持
つ患者、ひどい火傷を負った患者、髄膜炎菌性感染に冒
された幼児等、免疫系の弱い患者を含む。手術またはカ
テーテルの使用などによって細菌かこれらの患者の血液
に侵入すると敗血性ショックを起こす。
る細菌は通常の体内の細菌群の一部であるのが普通であ
る。しかし、患者の中には細菌が増殖する主要環境にな
っている場合かある。これらの患者は、コルチコステロ
イド療法または放射線療法を継続的に受けている患者、
手術後の高齢患者、糖尿病や肝臓病などの慢性疾患を持
つ患者、ひどい火傷を負った患者、髄膜炎菌性感染に冒
された幼児等、免疫系の弱い患者を含む。手術またはカ
テーテルの使用などによって細菌かこれらの患者の血液
に侵入すると敗血性ショックを起こす。
ダラム陰性の細菌の細胞壁に存在するエンドトキシン、
リポ多糖−たんばく化合物が敗血性ショックを誘発する
確かな証拠がある。研究者らは、ダラム陰性の細菌によ
って放たれるエンドトキシンがホストターゲット細胞の
細胞膜上の具体的受容箇所に結合すると理論づけている
。
リポ多糖−たんばく化合物が敗血性ショックを誘発する
確かな証拠がある。研究者らは、ダラム陰性の細菌によ
って放たれるエンドトキシンがホストターゲット細胞の
細胞膜上の具体的受容箇所に結合すると理論づけている
。
毒素は、プロスタグランジン、リューコトリエンおよび
血小板活性因子をはじめ、腫瘍神経症因子(T N F
) / chachectin、インターフェロン1
.2および3、インターフェロン、C3、プロコアギュ
ラント活動(組織因子活動)を含む多数の媒介をつくり
出す。体か過剰な細菌および/またはエンドトキシンを
取り除こうとする際に現れる症状は、発熱、ショック、
結節性維管束的凝血、補体活性化、白血球増多症をもた
らす一過性白血病、多系統器官不全および死亡を含む。
血小板活性因子をはじめ、腫瘍神経症因子(T N F
) / chachectin、インターフェロン1
.2および3、インターフェロン、C3、プロコアギュ
ラント活動(組織因子活動)を含む多数の媒介をつくり
出す。体か過剰な細菌および/またはエンドトキシンを
取り除こうとする際に現れる症状は、発熱、ショック、
結節性維管束的凝血、補体活性化、白血球増多症をもた
らす一過性白血病、多系統器官不全および死亡を含む。
アメリカ国内で1年間に敗血性ショックの症例が約20
万件あり、その80%かダラム陰性の有機体によって起
こされている。
万件あり、その80%かダラム陰性の有機体によって起
こされている。
患者を48時間で死亡させ得る症候群である敗血性ショ
ックの治療は、通常抗生物質、バソプレッザおよびイノ
トロープの組合せからなる。
ックの治療は、通常抗生物質、バソプレッザおよびイノ
トロープの組合せからなる。
抗麻酔剤であるナロクソン(Naloxone)(Na
rcan。
rcan。
デュポン社)も使用される。しかし、その効果はこれま
で少数の患者にしか現れず、ききめのある薬剤も発表さ
れていない。
で少数の患者にしか現れず、ききめのある薬剤も発表さ
れていない。
治療の標準化と改善の助けになる効果的な薬剤が必要と
される。
される。
エンドトキシンを中和しようとする試みは、約1,00
0〜10.000もあるエンドトキシンの化学形態の問
題にぶつかる。これらの毒素は構造が似ているが、これ
ら毒素用に製造された主な種類の抗体と反応するに十分
像ていないのが普通である。媒介用のモノクローナル抗
体も、多くの媒介物がその製造および/または増幅のた
めの相互依存パスに寄与し、増殖するので、同じ問題が
起きる。
0〜10.000もあるエンドトキシンの化学形態の問
題にぶつかる。これらの毒素は構造が似ているが、これ
ら毒素用に製造された主な種類の抗体と反応するに十分
像ていないのが普通である。媒介用のモノクローナル抗
体も、多くの媒介物がその製造および/または増幅のた
めの相互依存パスに寄与し、増殖するので、同じ問題が
起きる。
エンドトキシンに対処するための特別なモノクローナル
抗体の使用は、エンドトキシンに保持されるある種の構
造的特徴とのごくわずかな交差反応によって可能である
。そのような抗体はエンドトキシンを中和するか、受容
体と結合するか細胞生成物と反応してTNFのようなシ
ョックを起こすエンドトキシン箇所を封じることが考え
られる。
抗体の使用は、エンドトキシンに保持されるある種の構
造的特徴とのごくわずかな交差反応によって可能である
。そのような抗体はエンドトキシンを中和するか、受容
体と結合するか細胞生成物と反応してTNFのようなシ
ョックを起こすエンドトキシン箇所を封じることが考え
られる。
本件出願のアメリカでの親出願およびその親出願である
第404.266号および第376、704号には、特
にLPS結合因子(受容体)と結合するモノクローナル
抗体の製造が開示されている。
第404.266号および第376、704号には、特
にLPS結合因子(受容体)と結合するモノクローナル
抗体の製造が開示されている。
この受容体は分子量が約80キロダルトンの糖たんばく
として、そしてその作用的性質に特徴がある。上記出願
では特にモノクローナル抗体(mAb)5D3および3
D7が記載され、それは受容体のたんばくおよび炭水化
物成分とそれぞれ結合する。両モノクローナル抗体とも
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに加え
られている。
として、そしてその作用的性質に特徴がある。上記出願
では特にモノクローナル抗体(mAb)5D3および3
D7が記載され、それは受容体のたんばくおよび炭水化
物成分とそれぞれ結合する。両モノクローナル抗体とも
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに加え
られている。
記載されたmAbの性質の中に、LPSが受容体と結合
するのを防止することによって、この化合による通常の
結果を阻止する能力がある。
するのを防止することによって、この化合による通常の
結果を阻止する能力がある。
上記アメリカ出願に記載された効果として、生体内にお
ける抗敗血性ショック剤としてのmAbの薬効かある。
ける抗敗血性ショック剤としてのmAbの薬効かある。
また、受容体のたんばく成分に対するモノクローナル抗
体が以前は予期されなかった効果を更に生じることが判
明している。つまり、mAbはそれ自体で、または例え
ばガンマインターフェロンとの組合せで、マクロファー
ジで緩和された腫瘍シトトキシティをもたらし、体内お
よび体外における受容体に対するアゴニストとして作用
することが判明した。
体が以前は予期されなかった効果を更に生じることが判
明している。つまり、mAbはそれ自体で、または例え
ばガンマインターフェロンとの組合せで、マクロファー
ジで緩和された腫瘍シトトキシティをもたらし、体内お
よび体外における受容体に対するアゴニストとして作用
することが判明した。
(実施例)
特に哺乳動物細胞の細菌ポリ多糖エンドトキシン結合受
容体(以下rLPS受容体」という)用のモノクローナ
ル抗体はハイブリッドマスと呼ばれるハイブリッドセル
ラインてあり得る抗体生成セルラインによって生成され
る。ハイブリッド細胞は、抗LPS受容体抗体生成細胞
と、ハイブリッド細胞の長期組織培養安定性を与えるセ
ルラインである永続性セルラインとの融合によって形成
される。ハイブリッドセルラインの形成において、一方
の融合材である抗LPS受容体抗体生成細胞はLPS受
容体陽性B細胞で免疫された動物から取ったひ臓細胞、
またはLPS受容体用に濃縮された生化学調剤でもよい
。他方の融合材である永続性細胞は、リンパプラストイ
ド細胞、またはそれ自体が非抗体分泌器だが悪性のもの
として選択された抗体生成細胞の前駆物質である骨髄腫
細胞などのプラズマシトーマ細胞でもよい。
容体(以下rLPS受容体」という)用のモノクローナ
ル抗体はハイブリッドマスと呼ばれるハイブリッドセル
ラインてあり得る抗体生成セルラインによって生成され
る。ハイブリッド細胞は、抗LPS受容体抗体生成細胞
と、ハイブリッド細胞の長期組織培養安定性を与えるセ
ルラインである永続性セルラインとの融合によって形成
される。ハイブリッドセルラインの形成において、一方
の融合材である抗LPS受容体抗体生成細胞はLPS受
容体陽性B細胞で免疫された動物から取ったひ臓細胞、
またはLPS受容体用に濃縮された生化学調剤でもよい
。他方の融合材である永続性細胞は、リンパプラストイ
ド細胞、またはそれ自体が非抗体分泌器だが悪性のもの
として選択された抗体生成細胞の前駆物質である骨髄腫
細胞などのプラズマシトーマ細胞でもよい。
LPS受容体用のモノクローナル抗体を生成するねずみ
、りす、ビーバーなどのハイブリッドマスは、LPS受
容体陽性B細胞、浄化L PS受容体、またはLPS受
容体からなるその他の生物調剤に対して免疫されたねず
み等の骨髄腫細胞およびひ臓細胞の融合によって形成さ
れる。ねずみ等を免疫にするには種々のプロトコールに
従う。例えば、ねずみ類かLPS受容体陽性B細胞また
は部分的に浄化されたLPS受容体の第一および補充免
疫を受けてもよい。融合は免疫学の当事者に周知の標準
的工程で行われる。コーラ−アンドミルスタイン、ネイ
チャ、256+495〜497(+975) (Ko
hler and Milstein、 Nature
、 256:495−497 (1975))およびケ
ネット、モノクローナル抗体(Kennet、 Mon
oclonalAntibodies)(Kennet
et al、、 Eds、 pp、 365367
、 Plenum Press、 N、Y、 1980
)参照。
、りす、ビーバーなどのハイブリッドマスは、LPS受
容体陽性B細胞、浄化L PS受容体、またはLPS受
容体からなるその他の生物調剤に対して免疫されたねず
み等の骨髄腫細胞およびひ臓細胞の融合によって形成さ
れる。ねずみ等を免疫にするには種々のプロトコールに
従う。例えば、ねずみ類かLPS受容体陽性B細胞また
は部分的に浄化されたLPS受容体の第一および補充免
疫を受けてもよい。融合は免疫学の当事者に周知の標準
的工程で行われる。コーラ−アンドミルスタイン、ネイ
チャ、256+495〜497(+975) (Ko
hler and Milstein、 Nature
、 256:495−497 (1975))およびケ
ネット、モノクローナル抗体(Kennet、 Mon
oclonalAntibodies)(Kennet
et al、、 Eds、 pp、 365367
、 Plenum Press、 N、Y、 1980
)参照。
その結果生成されるクローンは、LPS受容体陽性B細
胞またはLPS受容体からなる生物調剤の製造用にふる
いにかけられる。反応性抗体を分泌するものはクローン
される。
胞またはLPS受容体からなる生物調剤の製造用にふる
いにかけられる。反応性抗体を分泌するものはクローン
される。
モノクローナル抗LPS受容体抗体生成する人間のバイ
ブリドマスは、抗LPS受容体抗体を生成する個人から
採取されたひ臓細胞と、人間のリンパプラストロイドセ
ルラインとの融合によって形成される。あるいは、骨髄
腫細胞用の融合材はリンパ球を生成する周辺血液抗LP
S受容体でもよい。融合およびふるい分は技術は、ハム
スターの抗LPS受容体発生バイブリドマスの生成・選
択に使用されるものと本質的に同じである。
ブリドマスは、抗LPS受容体抗体を生成する個人から
採取されたひ臓細胞と、人間のリンパプラストロイドセ
ルラインとの融合によって形成される。あるいは、骨髄
腫細胞用の融合材はリンパ球を生成する周辺血液抗LP
S受容体でもよい。融合およびふるい分は技術は、ハム
スターの抗LPS受容体発生バイブリドマスの生成・選
択に使用されるものと本質的に同じである。
抗LPS受容体生成セルラインの他の形成方法は抗体生
成細胞の変換による。例えば、永続性抗LPS受容体生
成細胞を生じるBリンパ球の場合、抗LPS生成りリン
パ球はエプスタイン−バール(Epstein−Bar
r)ビールス等のビールスで感染され、変換される。例
えば、コズバー・アンド・ローダの今日の免疫学、4(
3)ニア2〜79(1983)(Kozbor and
Roder、 Immunology Today、
4(3)ニア2−79(1983))参照。あるいは、
Bリンパ球を変換遺伝子または変換遺伝子生成物で変換
してもよい。
成細胞の変換による。例えば、永続性抗LPS受容体生
成細胞を生じるBリンパ球の場合、抗LPS生成りリン
パ球はエプスタイン−バール(Epstein−Bar
r)ビールス等のビールスで感染され、変換される。例
えば、コズバー・アンド・ローダの今日の免疫学、4(
3)ニア2〜79(1983)(Kozbor and
Roder、 Immunology Today、
4(3)ニア2−79(1983))参照。あるいは、
Bリンパ球を変換遺伝子または変換遺伝子生成物で変換
してもよい。
LPS受容体用モノクローナル抗体は、抗LPS受容体
抗体生成バイブリドマスをねずみ等の腹腔に注入し、適
当な時間の経過後に高力価の均質抗体を含有する腹水を
取り出し、モノクローナル抗LPS受容体抗体を分離す
ることによって大量に生成する。異種個体内で発生した
バイブリドマスを照射された、またはアシミックのヌー
ドマウスに注入すべきである。あるいは、抗体は、抗L
PS受容体生成細胞を体外培養し、細胞培養媒体から分
泌モノクローナル抗LPS受容体抗体を分離することに
よって生成してもよい。
抗体生成バイブリドマスをねずみ等の腹腔に注入し、適
当な時間の経過後に高力価の均質抗体を含有する腹水を
取り出し、モノクローナル抗LPS受容体抗体を分離す
ることによって大量に生成する。異種個体内で発生した
バイブリドマスを照射された、またはアシミックのヌー
ドマウスに注入すべきである。あるいは、抗体は、抗L
PS受容体生成細胞を体外培養し、細胞培養媒体から分
泌モノクローナル抗LPS受容体抗体を分離することに
よって生成してもよい。
キメラ抗LPS受容体抗体は、LPS受容体用の非人間
抗体の重軽鎖可変領域をコード化す0 るDNAセグメントをクローンし、これらのDNAセグ
メントを人間の重軽鎖不変領域をコード化するDNAセ
グメントに結合させてキメラ免疫グロブリンを生成する
ことによって生成される。重軽鎖をコード化する融合遺
伝子構造は表現ベクトルに組み付けられるか挿入される
。
抗体の重軽鎖可変領域をコード化す0 るDNAセグメントをクローンし、これらのDNAセグ
メントを人間の重軽鎖不変領域をコード化するDNAセ
グメントに結合させてキメラ免疫グロブリンを生成する
ことによって生成される。重軽鎖をコード化する融合遺
伝子構造は表現ベクトルに組み付けられるか挿入される
。
遺伝子は、免疫グロブリンたんばくが合成され、組み合
わされ、分泌される場合は、リンパ性愛は細胞(例えば
骨髄腫細胞)に共トランスフェクトされる。トランスフ
ェクトされた受は細胞は培養され、明確な免疫プロプリ
ンが収拾される。
わされ、分泌される場合は、リンパ性愛は細胞(例えば
骨髄腫細胞)に共トランスフェクトされる。トランスフ
ェクトされた受は細胞は培養され、明確な免疫プロプリ
ンが収拾される。
例1
80 kD LPS結合蛋白(等電点6.5)、紫
外線放射によってクロスリンクしたradiodina
tedの光活性バクテリアLPSトドキシン誘導剤によ
って飽和したネズミの5enocytes (T −V
Chen etFASEB ジャーナル 3
No、4A082 4969 1989)から部分純
化し細胞を、超音波処理し、スフローズグラブイエ処理
した。LPS結合蛋白濃縮留分を、摂氏4ブタノールの
水様液と、遠心分離機によって分た二相混合物と、水相
の受容LPS複合par titionsとによって処
理した。透析展縮後、前記水様抽出物を、予備5DS−
PAGよって濃縮し、分別した。
外線放射によってクロスリンクしたradiodina
tedの光活性バクテリアLPSトドキシン誘導剤によ
って飽和したネズミの5enocytes (T −V
Chen etFASEB ジャーナル 3
No、4A082 4969 1989)から部分純
化し細胞を、超音波処理し、スフローズグラブイエ処理
した。LPS結合蛋白濃縮留分を、摂氏4ブタノールの
水様液と、遠心分離機によって分た二相混合物と、水相
の受容LPS複合par titionsとによって処
理した。透析展縮後、前記水様抽出物を、予備5DS−
PAGよって濃縮し、分別した。
前記ゲルから、単放射性同位元素を電解溶離した。そし
て、二次元ポリアクリルアミドにて再実行したところ、
単放射性同位元素スポットが生成された。この蛋白のア
ミノ酸組成が表1に示されている。
て、二次元ポリアクリルアミドにて再実行したところ、
単放射性同位元素スポットが生成された。この蛋白のア
ミノ酸組成が表1に示されている。
この受容体のキャラクタライゼイション(charac
ter 1zat 1on)、アミノ酸sequenc
ing及びcDNA分子クローン化が可能になった。活
性結合部位を特定することにより、LPSの前記受容体
と結合する能力を阻害したり、あるいは、LPSが細胞
活動を行うことなく前記活性部位ときつこう的に結合す
る能力を阻害する傾向のある活性受容体1 】 2 部位類似体の形成及び合成が可能となる。
ter 1zat 1on)、アミノ酸sequenc
ing及びcDNA分子クローン化が可能になった。活
性結合部位を特定することにより、LPSの前記受容体
と結合する能力を阻害したり、あるいは、LPSが細胞
活動を行うことなく前記活性部位ときつこう的に結合す
る能力を阻害する傾向のある活性受容体1 】 2 部位類似体の形成及び合成が可能となる。
例2
上記例1によって得たLPS結合蛋白を前記ゲルから摘
出し、アジュバント中において均質化し、これによって
3歳のアルメニアハムスターを免疫化した。
出し、アジュバント中において均質化し、これによって
3歳のアルメニアハムスターを免疫化した。
細胞及び組織培養媒体
細胞ラインSp210−Ag14 (Sp2)を、融合
パートナ−として使用した。前述のLPS結合蛋白受容
体によって免疫化したアルメニアハムスターから得た5
plenocyteSを、抗体生成細胞源として使用し
た。無菌ハムスター肺臓を、3ccの注射器の針を使用
したステンレスの網を通過させることにより、5ple
nocytesの単細胞けん濁液を得た。
パートナ−として使用した。前述のLPS結合蛋白受容
体によって免疫化したアルメニアハムスターから得た5
plenocyteSを、抗体生成細胞源として使用し
た。無菌ハムスター肺臓を、3ccの注射器の針を使用
したステンレスの網を通過させることにより、5ple
nocytesの単細胞けん濁液を得た。
次に、この5plenocytesけん濁液とSp2細
胞とを、培養媒体(Fetal CaIf Ser
umなし)にてそれぞれ別に洗浄し、遠心処理にて収集
した(500xg、10m1n)。尚、基礎媒体として
は、グルタミン(4mM)、ペニシリンストレプトマイ
シン(2%)、非必須アミノ酸(1%)、ナトリウムピ
ルビン酸(1mM)及びウシ胎児血清(15%)を追加
したRPMI 1640を使用した。
胞とを、培養媒体(Fetal CaIf Ser
umなし)にてそれぞれ別に洗浄し、遠心処理にて収集
した(500xg、10m1n)。尚、基礎媒体として
は、グルタミン(4mM)、ペニシリンストレプトマイ
シン(2%)、非必須アミノ酸(1%)、ナトリウムピ
ルビン酸(1mM)及びウシ胎児血清(15%)を追加
したRPMI 1640を使用した。
被験動物
12週令の雌のアルメニアンハムスター(Cytoge
n)を免疫化に使用した。
n)を免疫化に使用した。
抗原
溶解分離したはつかねずみの5plenocytesか
ら得たLPS結合蛋白濃縮画分を添加したSDSゲルの
80kDa蛋白から溶離した蛋白。
ら得たLPS結合蛋白濃縮画分を添加したSDSゲルの
80kDa蛋白から溶離した蛋白。
免疫化
ハムスターに、250ulのフロインドアジュバント中
においてエマルジョン化した250ulのPBS中の抗
原10ugを皮下注射することによって免疫化した。1
4日後、これらハムスターに、250ulのPBS中の
10ugのアジュバントと250ulの不完全フロイン
3 4 ドアシュバントによって追加抗原刺激処理した。
においてエマルジョン化した250ulのPBS中の抗
原10ugを皮下注射することによって免疫化した。1
4日後、これらハムスターに、250ulのPBS中の
10ugのアジュバントと250ulの不完全フロイン
3 4 ドアシュバントによって追加抗原刺激処理した。
更に、28日目において、不完全フロインドアジュバン
トの抗原により追加抗原刺激処理した。
トの抗原により追加抗原刺激処理した。
そして、最後の追加抗原刺激処理は、細胞融合の3日前
の第648目に、500ulのPBSの20ugの抗原
を腹膜注射することによって行った。
の第648目に、500ulのPBSの20ugの抗原
を腹膜注射することによって行った。
融合
−つのハムスター肺臓から、約7.5x 107の5p
lenocytesが生成された。洗浄した5plen
ocytesをプールし、1.5xlo7sp210ユ
ニツトの細胞と遠心分離処理した。50mLの円錐管中
の沈澱した細胞に、1mLの50%PEG 1450
(RPM11640中)を2分間に渡って添加した。こ
の細胞けん濁液を、血清(serum)を含有していな
い1mLの媒体で滴下にて希釈した。この希釈は、4分
目で2mL、5分目で4mL、6分目で8mLを滴下し
て行った。このけん濁液を、すぐに、ペレット化しく5
00xg、5m1n)、Fe2とHATとを添加した基
礎媒体中にて再けん濁化し、更に、1x105の生育細
胞/100ul/ウエルて96のウェル板に分配した。
lenocytesが生成された。洗浄した5plen
ocytesをプールし、1.5xlo7sp210ユ
ニツトの細胞と遠心分離処理した。50mLの円錐管中
の沈澱した細胞に、1mLの50%PEG 1450
(RPM11640中)を2分間に渡って添加した。こ
の細胞けん濁液を、血清(serum)を含有していな
い1mLの媒体で滴下にて希釈した。この希釈は、4分
目で2mL、5分目で4mL、6分目で8mLを滴下し
て行った。このけん濁液を、すぐに、ペレット化しく5
00xg、5m1n)、Fe2とHATとを添加した基
礎媒体中にて再けん濁化し、更に、1x105の生育細
胞/100ul/ウエルて96のウェル板に分配した。
陽バイブリドマスを得るための濾過
各ウェルからの培養上清を、70Z/3細胞全部と、5
%g/mLの部分的に純化した80kDaLPSレセプ
タ抗源で、ELISAにより濾過した。結合したハムス
ター抗原体か、ペルオキシダーゼ−1abeleclラ
ビット抗ハムスタIg plus TMB(テトラ
−メチル−ベンジダイン)を基質として有する状態で検
出された。光学密度は430nmであった。
%g/mLの部分的に純化した80kDaLPSレセプ
タ抗源で、ELISAにより濾過した。結合したハムス
ター抗原体か、ペルオキシダーゼ−1abeleclラ
ビット抗ハムスタIg plus TMB(テトラ
−メチル−ベンジダイン)を基質として有する状態で検
出された。光学密度は430nmであった。
80 kDa LPSレセプタ抗源抗隠士溝を、−
元ウニスターン法(western bolts)に
より濾過した。
元ウニスターン法(western bolts)に
より濾過した。
サブクローン化
目的のバイブリドマスを、補充媒体中の0.6%のアガ
ロース(SeaPrep、FMC)を使用した軟寒天中
にてサブクローン化した。免5 6 痩化プロトコル(腹膜注射)に基づいて、二つのモノク
ローナル抗原体が分離された。これらのモノクローナル
抗原体(3D7及び5D3)は、IgMでその分子の大
きさは19Sである。
ロース(SeaPrep、FMC)を使用した軟寒天中
にてサブクローン化した。免5 6 痩化プロトコル(腹膜注射)に基づいて、二つのモノク
ローナル抗原体が分離された。これらのモノクローナル
抗原体(3D7及び5D3)は、IgMでその分子の大
きさは19Sである。
これらの二つのモノクローナル抗原体を、80kD
LPS−結合レセプタグリコプロティンの二つの異なっ
たエピトープに向けた。即ち、一つの抗原体は、炭水化
物部分に、もう一つの抗原体はプロティン決定子に向け
られた(表2)。
LPS−結合レセプタグリコプロティンの二つの異なっ
たエピトープに向けた。即ち、一つの抗原体は、炭水化
物部分に、もう一つの抗原体はプロティン決定子に向け
られた(表2)。
その予備結果は、モノクロール5D3抗源による前処理
によって、ねずみの致死性が抑制されたことを示した。
によって、ねずみの致死性が抑制されたことを示した。
(表3)
モノクローナル抗原及び/又はこの抗原の組成物(例え
ばFab)をエンドトキシン受容体に使用することで、
受容体と結合するエンドトキシンと競合することが可能
であり、従って、白血球細胞又はエンドセリアル細胞活
動を要請することが出来る。又、モノクローナルは、エ
ンドトキシンを結合しこれが目標細胞と反応することを
防止するために使用可能な抗イデイオタイプの抗原体を
生成するための免疫源としても使用可能である。
ばFab)をエンドトキシン受容体に使用することで、
受容体と結合するエンドトキシンと競合することが可能
であり、従って、白血球細胞又はエンドセリアル細胞活
動を要請することが出来る。又、モノクローナルは、エ
ンドトキシンを結合しこれが目標細胞と反応することを
防止するために使用可能な抗イデイオタイプの抗原体を
生成するための免疫源としても使用可能である。
エンドトキシンリポポリサッカライドの潜在的免疫性刺
激特性から鑑みて、モノクローナル抗原体を、更に、ア
ジュバン1へ組織に組み込んて無関係の抗原体の免疫発
生能力を促進するのに使用することも可能である。
激特性から鑑みて、モノクローナル抗原体を、更に、ア
ジュバン1へ組織に組み込んて無関係の抗原体の免疫発
生能力を促進するのに使用することも可能である。
例3
上記例2によって得たモノクローム抗原体3D7の、そ
のエンドトキシンLPSの80 kDa LPS受
容体に対する結合力抑制能力を評価した。(第1図参照
)ねずみの肺臓に、徐々に多量の抗原体(レーン8−5
)と、無関係のモノクローム抗原体(レーン4−1)と
を添加した。摂氏37度で5分間放置後、I −ASD
−LPSを添加し、通常のプロセスにより細胞を光クロ
スリンクした。次に、可溶化細胞抽出物を、5DS−P
AGEを使用して分析、放射能写真をとった。LSPの
80kDa受容体に対するコントロール結合力は、レー
ン9に示7 8 されている。
のエンドトキシンLPSの80 kDa LPS受
容体に対する結合力抑制能力を評価した。(第1図参照
)ねずみの肺臓に、徐々に多量の抗原体(レーン8−5
)と、無関係のモノクローム抗原体(レーン4−1)と
を添加した。摂氏37度で5分間放置後、I −ASD
−LPSを添加し、通常のプロセスにより細胞を光クロ
スリンクした。次に、可溶化細胞抽出物を、5DS−P
AGEを使用して分析、放射能写真をとった。LSPの
80kDa受容体に対するコントロール結合力は、レー
ン9に示7 8 されている。
例4
LPSか、モノクローナルmAb 3D7の5ple
nocytesに対して結合することを抑制することは
第2図に示されている。肺臓細胞を、ミクロタイター(
microtiter)板に張り付け、種々のLPS濃
縮物により処理した。次に、これらの細胞を、洗浄し、
モノクローナルmAb3D7又は無関係モノクローナル
(antila)をこれに添加した。この結合した抗原
体をElf、ISAによって評価した。
nocytesに対して結合することを抑制することは
第2図に示されている。肺臓細胞を、ミクロタイター(
microtiter)板に張り付け、種々のLPS濃
縮物により処理した。次に、これらの細胞を、洗浄し、
モノクローナルmAb3D7又は無関係モノクローナル
(antila)をこれに添加した。この結合した抗原
体をElf、ISAによって評価した。
例5
約6連合のCRI雌のねずみに対する餌投与を、実験前
の夜の約11時30分に中止した。
の夜の約11時30分に中止した。
そして、次の日の正午に、これらのねずみにmAb
5D3、又は、100ulの無菌ピロゲンフリー塩にノ
ーマルハムスターIgGを入れて皮下注射した。1時間
15分後、すべてのねずみに12ngのS、enter
itidisLPS エンドトキシンと18mgのD
−gaIactosamineを水に溶かしたものを投
与し、その後、餌の投与を再開した。最初の10時間に
毎時間ねずみの致死率をモニターし、これに続く36時
間はモニターを間隔をおいて行った。
5D3、又は、100ulの無菌ピロゲンフリー塩にノ
ーマルハムスターIgGを入れて皮下注射した。1時間
15分後、すべてのねずみに12ngのS、enter
itidisLPS エンドトキシンと18mgのD
−gaIactosamineを水に溶かしたものを投
与し、その後、餌の投与を再開した。最初の10時間に
毎時間ねずみの致死率をモニターし、これに続く36時
間はモニターを間隔をおいて行った。
これらの実験により、mAbによる前処理がgalac
tosamineに対する感覚モデルにおけるエンドト
キシン致死性に対してねずみを保護すること、及び、僅
か7.5ugのmAb 5D3によっても100%保
護できることが明かとなった。(表4参照) 例に の実験の方法は、MoAb 5D3の投与量を15u
gに制限したこととLPSの投与量を1100nにした
こととの他は、実験例10と全く同じである。
tosamineに対する感覚モデルにおけるエンドト
キシン致死性に対してねずみを保護すること、及び、僅
か7.5ugのmAb 5D3によっても100%保
護できることが明かとなった。(表4参照) 例に の実験の方法は、MoAb 5D3の投与量を15u
gに制限したこととLPSの投与量を1100nにした
こととの他は、実験例10と全く同じである。
この実験によって、15ngのMoAb 5D3の投
与が、ten LD+ooのLPSエンドキシンの投
与に対してほぼ完全な保護を提供9 0 することが明かになった。(表5参照)例7 約4−6月令のC3He b / F e J雌ねずみ
に、無菌塩又は250ugのMoAb 5D3による
前処理を行った。−時間後、すべてのねずみに、250
ugのE、coli 01llLPS エンドキシ
ンを投与した。そして72時間に渡って毎日致死率をモ
ニターした。
与が、ten LD+ooのLPSエンドキシンの投
与に対してほぼ完全な保護を提供9 0 することが明かになった。(表5参照)例7 約4−6月令のC3He b / F e J雌ねずみ
に、無菌塩又は250ugのMoAb 5D3による
前処理を行った。−時間後、すべてのねずみに、250
ugのE、coli 01llLPS エンドキシ
ンを投与した。そして72時間に渡って毎日致死率をモ
ニターした。
これらの二つの実験の結果か表6に示されている。これ
らの実験は、mAb 5D3がノーマル(non−g
alaCtosaminesensitized)のね
ずみをL P Sエンドキシンの致死作用からをも保護
することが明かになった。
らの実験は、mAb 5D3がノーマル(non−g
alaCtosaminesensitized)のね
ずみをL P Sエンドキシンの致死作用からをも保護
することが明かになった。
例8
6週令のCFIねすみ(表7の実験例1)又は100週
令CFIねずみ(表7の実験例2)に、無菌塩又はS、
enteritidisLPS又は、mAb 5D3
(実験例1においては75ng、実験例2においては
750ug)を投与した。そしてその例5に記載の方法
で致死率をモニターした。
令CFIねずみ(表7の実験例2)に、無菌塩又はS、
enteritidisLPS又は、mAb 5D3
(実験例1においては75ng、実験例2においては
750ug)を投与した。そしてその例5に記載の方法
で致死率をモニターした。
これらの実験により、galactosamine
5ensitization assayにおいて決
定されるmAb 5D3のエンドキシン活動が、0.
2ngのLPS等価物(実験例1)又は、約0.03n
、gのLPS等価物(実験例2)よりも少ないことが明
かになった。(表7参照) 例9 mAb 5D3又はE、coli O]IILPS
の連続希釈物を、ピロゲンフリーガラスの12x75m
m試験管にて生成し、次に、50U1のlimulus
amoebocyte 1ysate (LA
L)(、LohnL、Ryan、工−−ル大学、New
Haven コネチカッI・州)を添加した。これら
の試験管を一時間摂氏37度にて保温し、次にゲル化評
価した。 (Limulus Iysate a
ssyは、小量のL P Sエンドキシンの2 ] 2 存在を検出するためのきわめて敏感かつ、比較的特定的
なテストである。) これらのデータは、1マイクログラムのmAbに対して
約0.3ngのLPSのmAb 5D3製剤における
エンドキシン活動の相対量を示すものである。(表8参
照) 例10 C3HeB/FeJ牌臓細胞を、無菌状態で分離し、こ
れを96のウェルミクロタイター板で、1ミリリットル
当り2.5x106個の細胞の濃度で組織培養に配置し
た。200ulの細胞に対して(RPMI l 640
媒体含有グルタミン及び抗原体中)、様々な濃度のE、
c。
5ensitization assayにおいて決
定されるmAb 5D3のエンドキシン活動が、0.
2ngのLPS等価物(実験例1)又は、約0.03n
、gのLPS等価物(実験例2)よりも少ないことが明
かになった。(表7参照) 例9 mAb 5D3又はE、coli O]IILPS
の連続希釈物を、ピロゲンフリーガラスの12x75m
m試験管にて生成し、次に、50U1のlimulus
amoebocyte 1ysate (LA
L)(、LohnL、Ryan、工−−ル大学、New
Haven コネチカッI・州)を添加した。これら
の試験管を一時間摂氏37度にて保温し、次にゲル化評
価した。 (Limulus Iysate a
ssyは、小量のL P Sエンドキシンの2 ] 2 存在を検出するためのきわめて敏感かつ、比較的特定的
なテストである。) これらのデータは、1マイクログラムのmAbに対して
約0.3ngのLPSのmAb 5D3製剤における
エンドキシン活動の相対量を示すものである。(表8参
照) 例10 C3HeB/FeJ牌臓細胞を、無菌状態で分離し、こ
れを96のウェルミクロタイター板で、1ミリリットル
当り2.5x106個の細胞の濃度で組織培養に配置し
た。200ulの細胞に対して(RPMI l 640
媒体含有グルタミン及び抗原体中)、様々な濃度のE、
c。
1i 0111 LPS及び/又はmAb 5D
3を添加した。そして、細胞を、湿気を有する二酸化炭
素5%含有の雰囲気中において24時間に渡り摂氏37
度にて培養した。更に16時間培養した後、細胞を取り
出し、3Hチミジン混合率を評価した。
3を添加した。そして、細胞を、湿気を有する二酸化炭
素5%含有の雰囲気中において24時間に渡り摂氏37
度にて培養した。更に16時間培養した後、細胞を取り
出し、3Hチミジン混合率を評価した。
これらのデータによって、純化されたmAb5D3は僅
かに細胞分裂促進性を有してはいるが、50ug/ul
のmAbの促進性は16ng/mlのLPSの促進性よ
りも低いことが明かとなった。又、更にmAbの濃度を
高めれば、mur ine lymphocytes
のLPS刺激を部分的に抑制するか、この抑制作用はL
PSの濃度を高めることによってもっとも効果的に現れ
ることかわかった。(第3図参照)例11 これは表7及び8と第3図のデータのまとめである。こ
れらのデータをまとめると、mAb5D3の相対的エン
ドキシン活動が、■マイクログラムのmAb 5D3
に対して約0.1ngのLPS活動に相当することが明
らかとなった。(表9参照) 例12 6−8週令のCFIねすみに、15ugのmAb 5
D3又は種々の投与量のS、enteritidis
LPSエンドキシンを0.1m1の量で腹膜注射によ
り投与した。
かに細胞分裂促進性を有してはいるが、50ug/ul
のmAbの促進性は16ng/mlのLPSの促進性よ
りも低いことが明かとなった。又、更にmAbの濃度を
高めれば、mur ine lymphocytes
のLPS刺激を部分的に抑制するか、この抑制作用はL
PSの濃度を高めることによってもっとも効果的に現れ
ることかわかった。(第3図参照)例11 これは表7及び8と第3図のデータのまとめである。こ
れらのデータをまとめると、mAb5D3の相対的エン
ドキシン活動が、■マイクログラムのmAb 5D3
に対して約0.1ngのLPS活動に相当することが明
らかとなった。(表9参照) 例12 6−8週令のCFIねすみに、15ugのmAb 5
D3又は種々の投与量のS、enteritidis
LPSエンドキシンを0.1m1の量で腹膜注射によ
り投与した。
3
4
約1時間後、すへてのねずみに、15ngのLPS (
表10の実験例1)又は]OngのLPSを投与した。
表10の実験例1)又は]OngのLPSを投与した。
例13
mAb 5D3を摂氏4度に維持あるいは、60分間
沸騰水浴中にて加熱処理した。次に、連続希釈を行い、
例8に記載した方法てlimulus 1ysate
活動を評価した。
沸騰水浴中にて加熱処理した。次に、連続希釈を行い、
例8に記載した方法てlimulus 1ysate
活動を評価した。
これらのデータによれば、摂氏100度まで安定してい
るエンドキシンとは異なり、mA、b5D、3のエンド
キシン活動は摂氏100度まで加熱された場合約2オー
ダー減少することか明らかとなった。この実験は、更に
、mAb5D3とLPS エンドトキシンとを区別す
るのに利用出来、又、mAb 5D3製剤に関して観
察されたエンドトキシン活動が、実際には、mAb
5D3によるものであり、汚染エンドトキシン−LPS
の存在によるものではないということを立証するもので
ある。(表11参照)例14 ピロゲンフリー塩の150ug/mlのmAb 5D
3の個々の製剤を、a)摂氏4度で維持、又はb)約6
0分で摂氏100度まて加熱、又はc)500ng/m
l (最終濃度)のE。
るエンドキシンとは異なり、mA、b5D、3のエンド
キシン活動は摂氏100度まで加熱された場合約2オー
ダー減少することか明らかとなった。この実験は、更に
、mAb5D3とLPS エンドトキシンとを区別す
るのに利用出来、又、mAb 5D3製剤に関して観
察されたエンドトキシン活動が、実際には、mAb
5D3によるものであり、汚染エンドトキシン−LPS
の存在によるものではないということを立証するもので
ある。(表11参照)例14 ピロゲンフリー塩の150ug/mlのmAb 5D
3の個々の製剤を、a)摂氏4度で維持、又はb)約6
0分で摂氏100度まて加熱、又はc)500ng/m
l (最終濃度)のE。
coli 0IIILPSを添加して次に摂氏100
度まて加熱、した。更に、500ng/m1LPsのコ
ントロール製剤をも60分間で摂氏100度まで加熱し
た。次に、100u1のこれらの製剤を、8週令のCF
Iねすみに腹膜注射によって投与した。1時間15分後
、18ngのS、enteritidis LPSと
、18mgのD−galactosamineを腹膜注
射によって投与して、例5に記載の方法にてその生存率
を評価した。
度まて加熱、した。更に、500ng/m1LPsのコ
ントロール製剤をも60分間で摂氏100度まで加熱し
た。次に、100u1のこれらの製剤を、8週令のCF
Iねすみに腹膜注射によって投与した。1時間15分後
、18ngのS、enteritidis LPSと
、18mgのD−galactosamineを腹膜注
射によって投与して、例5に記載の方法にてその生存率
を評価した。
これらのデータにより、mAb 5D3の保護能力か
摂氏100度まての加熱によって破壊され、一方、LP
Sの保護能力が摂氏100度においても安定しているこ
とか明かとなった。
摂氏100度まての加熱によって破壊され、一方、LP
Sの保護能力が摂氏100度においても安定しているこ
とか明かとなった。
これらのデータは、可能なエンドトキシン汚染に対する
表11の結論を裏付けさらに、これら2 ′・ 6 を拡張するものである。(表12参照)例15 80 kDa LPS結合蛋白の高度に純化した製
剤を、20 C3Heb/FeJねずみから得たph
otolabelled 5plenocytesの
ブタノール抽出によって調合した。このブタノール抽出
物を、更に、二次元の5DS−PAGEに基づく8基準
1soelectreic focusing ゲ
ルで更に純化した(1988年 Journa ]of
Immunology publtcation
sにおいて記載されている5tandard O’F
arrell 2次元電気泳動工程)次に、分離され
た蛋白を、Immun。
表11の結論を裏付けさらに、これら2 ′・ 6 を拡張するものである。(表12参照)例15 80 kDa LPS結合蛋白の高度に純化した製
剤を、20 C3Heb/FeJねずみから得たph
otolabelled 5plenocytesの
ブタノール抽出によって調合した。このブタノール抽出
物を、更に、二次元の5DS−PAGEに基づく8基準
1soelectreic focusing ゲ
ルで更に純化した(1988年 Journa ]of
Immunology publtcation
sにおいて記載されている5tandard O’F
arrell 2次元電気泳動工程)次に、分離され
た蛋白を、Immun。
bilon−P膜組織上にてelectroblott
edL、放射能グラフによってその80 kDa蛋白
の存在を同定した。前記純化した蛋白を、次に、ピリジ
ンとアセトンニトライト した。この蛋白の二連続希釈物を生成し、これによって
96のウェルミクロタイター板を被覆した。次に、mA
.b 5D3 (20ug)又は、無関係ハムスター
モノクロール抗源体mAb4G2 (20ug)に対す
る反応性を調へた。
edL、放射能グラフによってその80 kDa蛋白
の存在を同定した。前記純化した蛋白を、次に、ピリジ
ンとアセトンニトライト した。この蛋白の二連続希釈物を生成し、これによって
96のウェルミクロタイター板を被覆した。次に、mA
.b 5D3 (20ug)又は、無関係ハムスター
モノクロール抗源体mAb4G2 (20ug)に対す
る反応性を調へた。
これらのデータにより、mAb 5D3か純化した8
0 kDa LPS結合蛋白に結合することか判明
した(第4図参照)。
0 kDa LPS結合蛋白に結合することか判明
した(第4図参照)。
例16
ラビツl(New Zealand White種
)を、5 0ugのmAb 5D3により、完全フロ
インドアジュバントにて免疫化し、更に、二週間後、不
完全フロインドアジューバントにて追加抗原刺激処理し
た。次に、更に2週間の後、ラビットから採血して、標
準ELISAによって、mAb 5D3 (第5a図
)及びpre B 細胞70Z/3(第5b図)に
対する血清反応を評価した。
)を、5 0ugのmAb 5D3により、完全フロ
インドアジュバントにて免疫化し、更に、二週間後、不
完全フロインドアジューバントにて追加抗原刺激処理し
た。次に、更に2週間の後、ラビットから採血して、標
準ELISAによって、mAb 5D3 (第5a図
)及びpre B 細胞70Z/3(第5b図)に
対する血清反応を評価した。
これらの実験から引き出される結論は、mAb 5D
3に対して強化されたラビットの抗血清が、mAb
5D3に対する高い親和性と結7 8 合するということである。ラビットの抗血清が、又、p
re B 細胞70Z/3に対しても結合するどい
こことは予期せぬ結果であった。
3に対して強化されたラビットの抗血清が、mAb
5D3に対する高い親和性と結7 8 合するということである。ラビットの抗血清が、又、p
re B 細胞70Z/3に対しても結合するどい
こことは予期せぬ結果であった。
(第5図参照)
例17
ねずみの肺臓細胞を、前述したように、I−ASD−L
PSによってphotolaballedした。次に、
ブタノールの抽出物(Western blots)
又はホール・セル抽出物(免疫沈降)を用意した。ブタ
ノール抽出物を、アクリルアミドゲルにてelectr
ophasedL、ニトロセルロースにてblotte
dし、結合第2抗源体(第6図のレーンA)又は第2抗
源体(第6図のレーンB)のみに基づくラビット抗 5
D3 抗血清でプローブした。一方、ホールセル抽出
物を、ラビット抗 5D3 抗血清又は緩衝剤によっ
て潜伏させ、次に、Igsorbにより免疫沈降させた
。ペレットと上清との両方が、electrophor
esed又はポリアクリルアミドゲルであり、その後ゲ
ルの放射能写真を取った。
PSによってphotolaballedした。次に、
ブタノールの抽出物(Western blots)
又はホール・セル抽出物(免疫沈降)を用意した。ブタ
ノール抽出物を、アクリルアミドゲルにてelectr
ophasedL、ニトロセルロースにてblotte
dし、結合第2抗源体(第6図のレーンA)又は第2抗
源体(第6図のレーンB)のみに基づくラビット抗 5
D3 抗血清でプローブした。一方、ホールセル抽出
物を、ラビット抗 5D3 抗血清又は緩衝剤によっ
て潜伏させ、次に、Igsorbにより免疫沈降させた
。ペレットと上清との両方が、electrophor
esed又はポリアクリルアミドゲルであり、その後ゲ
ルの放射能写真を取った。
レーン1はホールセル抽出物、レーン2はラビット抗
5D3 抗血清プラスIgsorb、レーン3はラビ
ット抗 5D3 抗血清プラスIgsorbの免疫沈
降物、レーン4はIgsOrbコントロールの上清、レ
ーン5は■gSorbコントロールのペレットである。
5D3 抗血清プラスIgsorb、レーン3はラビ
ット抗 5D3 抗血清プラスIgsorbの免疫沈
降物、レーン4はIgsOrbコントロールの上清、レ
ーン5は■gSorbコントロールのペレットである。
これらの結果により、ラビットのmAb 5D3によ
る免疫化によって、Westernblot 分析と
特定免疫沈降との両方によって、80 kDa L
PS結合蛋白畳容体に反応するポリクローナル抗原の生
成が可能であることがわかった。(第6図参照) ハイブリドマセルライン分泌モノクローナル抗原 3D
7及び5D3は、カンサス大学医療センター、医学部、
マイクロバイオロジー、分子遺伝免疫学課(39th
ancl Rainbow Blvd,、カンサ
ス市カンサス州66 1 0 3)と、1989年5月
4日以降においては、American Type
Cult9 0 ure Co11ection (ATCC)12
301 Prklawn Drive、
Rockville MD 20852に おい
て、3D7 (I(B101214)及び5D3(I−
(BIO125)のタイトルのもとに保管されている。
る免疫化によって、Westernblot 分析と
特定免疫沈降との両方によって、80 kDa L
PS結合蛋白畳容体に反応するポリクローナル抗原の生
成が可能であることがわかった。(第6図参照) ハイブリドマセルライン分泌モノクローナル抗原 3D
7及び5D3は、カンサス大学医療センター、医学部、
マイクロバイオロジー、分子遺伝免疫学課(39th
ancl Rainbow Blvd,、カンサ
ス市カンサス州66 1 0 3)と、1989年5月
4日以降においては、American Type
Cult9 0 ure Co11ection (ATCC)12
301 Prklawn Drive、
Rockville MD 20852に おい
て、3D7 (I(B101214)及び5D3(I−
(BIO125)のタイトルのもとに保管されている。
例18
mAb 5D3のみの効果と、マイクロファージか媒
介となる腫瘍細胞毒の誘導剤としての他の物質との組合
せによる効果とを調べるために実験を行った。
介となる腫瘍細胞毒の誘導剤としての他の物質との組合
せによる効果とを調べるために実験を行った。
6−9週令の雄のC3H/HeN及びC3H/ He
Jねずみから骨髄細胞を採取した。ねずみの脛骨及び大
腿骨から骨髄を除去し、これらを、Leung et
al、cell Ti5sue Res、239
: 693 (1985)に基づきバクチリアルgr
ade Petriデイシュにて培養した。
Jねずみから骨髄細胞を採取した。ねずみの脛骨及び大
腿骨から骨髄を除去し、これらを、Leung et
al、cell Ti5sue Res、239
: 693 (1985)に基づきバクチリアルgr
ade Petriデイシュにて培養した。
この文献の開示内容はこの明細書に含まれている。14
−18日令の培養から得たマイクロファージを実験に使
用した。
−18日令の培養から得たマイクロファージを実験に使
用した。
非粘着性細胞を、前記培養の上溝媒体から除去した。弱
く粘着している細胞を、20分間PBSて摂氏4度にて
保温し、次にラバー・ポリスマン(rubber p
oliceman)て取り外した。この後、約6xlO
’のマイクロファージを、96のウェルで、各ウェルご
とに接種した。
く粘着している細胞を、20分間PBSて摂氏4度にて
保温し、次にラバー・ポリスマン(rubber p
oliceman)て取り外した。この後、約6xlO
’のマイクロファージを、96のウェルで、各ウェルご
とに接種した。
前記細胞を、摂氏37度で、二酸化炭素5%含有雰囲気
中にて、2時間、10%のFBSを含有したH−MEM
で粘着させた。このように生成したマイクロファージ単
層を、使用直前のFBS 10%含有の新しいH−ME
Mで2回清浄した。
中にて、2時間、10%のFBSを含有したH−MEM
で粘着させた。このように生成したマイクロファージ単
層を、使用直前のFBS 10%含有の新しいH−ME
Mで2回清浄した。
次に、層状の細胞を複製サンプルを、FB810%含有
H−M E Mにて希釈した100ulの刺激剤で6時
間処理した。より詳述すると、種々の濃度のmAb
5D3のみと、3U/m1のIFN−γとの絹合せとを
使用した。又、様々な濃度のE、coli 0111
:B2S3 2 LPSも使用した。
H−M E Mにて希釈した100ulの刺激剤で6時
間処理した。より詳述すると、種々の濃度のmAb
5D3のみと、3U/m1のIFN−γとの絹合せとを
使用した。又、様々な濃度のE、coli 0111
:B2S3 2 LPSも使用した。
刺激剤による潜伏化の次に、2xlO’”Cr 1a
belled P815 肥満細胞腫を、100u
lの媒体r1月こて各ウェルで接種した。16時間後、
最も上方の0,1mlの上溝媒体を、各ウェルからゆっ
くりと吸引し、ガンマスペクトロメータによってその放
射能活動を分析評価した。培養中への5ICrの放出は
、細胞の死亡を測定する目安となる(RusseII、
in Adams et al、Methods
For Studying Mo1eclear
Phagocytes (AcademicPres
s N、Y、1980)第793頁。この結果は次の
式によって表される。
belled P815 肥満細胞腫を、100u
lの媒体r1月こて各ウェルで接種した。16時間後、
最も上方の0,1mlの上溝媒体を、各ウェルからゆっ
くりと吸引し、ガンマスペクトロメータによってその放
射能活動を分析評価した。培養中への5ICrの放出は
、細胞の死亡を測定する目安となる(RusseII、
in Adams et al、Methods
For Studying Mo1eclear
Phagocytes (AcademicPres
s N、Y、1980)第793頁。この結果は次の
式によって表される。
%5pecific 51Cr放出
実験放出−自然放出X総放出カウント−自然放出
ここで、「総放出カウント」とは、低浸透圧媒体中にて
凍結及び解凍されたターゲット細胞から放出された数と
定義する。「自然放出」とは、非刺激単層の単層で培養
されたターゲット細胞から放出された5ICrと定義す
る。
凍結及び解凍されたターゲット細胞から放出された数と
定義する。「自然放出」とは、非刺激単層の単層で培養
されたターゲット細胞から放出された5ICrと定義す
る。
結果は、第7図の種々のパネルに示されている。第7a
図に示すように、mAbのみで、細胞毒マイクロファー
ジの約60%までの放出が可能であった。IFN−γを
添加した場合は、第7b図に示すように、mAbの活動
は増加し、これはより低い濃度のmAbにたいして毒性
が60%増加していることによって証明されている。こ
こでは示さない比較実験において、同じ濃度におけるI
F N−γのみの使用では全く効果がなかった。
図に示すように、mAbのみで、細胞毒マイクロファー
ジの約60%までの放出が可能であった。IFN−γを
添加した場合は、第7b図に示すように、mAbの活動
は増加し、これはより低い濃度のmAbにたいして毒性
が60%増加していることによって証明されている。こ
こでは示さない比較実験において、同じ濃度におけるI
F N−γのみの使用では全く効果がなかった。
第70に示されているように、LPSの予期された効果
か証明された。
か証明された。
例19
以前の作業により、C3H/HeJねずみからのマイク
ロファージは、LPSによる刺激に対しては比較的無反
応である一方、例えば、熱殺菌したりLi5teria
monocyto g e n e s (” H
KLM” )によって免疫刺4 激することが可能であることがわかっている。
ロファージは、LPSによる刺激に対しては比較的無反
応である一方、例えば、熱殺菌したりLi5teria
monocyto g e n e s (” H
KLM” )によって免疫刺4 激することが可能であることがわかっている。
Ruco et al、J、Tmmuno1120
: 329 (1978)参照。この目的のために、
コントロール(C3H/He N)レスポンダと低レス
ポンダ(C3H/HeJ)骨髄由来マイクロファージと
の両方におけるmAb5D3の腫瘍細胞減殺活動の導入
に対するmAb 5D3の効果を調べるために実験を
行った。
: 329 (1978)参照。この目的のために、
コントロール(C3H/He N)レスポンダと低レス
ポンダ(C3H/HeJ)骨髄由来マイクロファージと
の両方におけるmAb5D3の腫瘍細胞減殺活動の導入
に対するmAb 5D3の効果を調べるために実験を
行った。
例18のプロトコルにほぼ従い、HeN細胞をコントロ
ールレスポンダに使用し、HeJを低レスポンダとして
使用した。mAb 5D3、L P Sさ及びHKL
Mを、10u/mlのハッカネズミIFN−γと組み合
わ、6時間後の51 Cr放出値を測定した。その結果
、第8図に示すように、L P Sに対して反応性のな
いマイクロファージは、mAb 5D3に対する反応
性も無かった。即ち、HeJ細胞には腫瘍減殺活動の大
幅な増加は認められなかった。
ールレスポンダに使用し、HeJを低レスポンダとして
使用した。mAb 5D3、L P Sさ及びHKL
Mを、10u/mlのハッカネズミIFN−γと組み合
わ、6時間後の51 Cr放出値を測定した。その結果
、第8図に示すように、L P Sに対して反応性のな
いマイクロファージは、mAb 5D3に対する反応
性も無かった。即ち、HeJ細胞には腫瘍減殺活動の大
幅な増加は認められなかった。
例20
mAb 5D3かLPSに質的に類似した行動を示し
たので、観察されたmAb活動が例13及び14にて記
載した問題に類似した汚染エンドトキシンの結果ではな
いことを示す必要が生じた。この点に関して、エンドト
キシンは、摂氏100度で長時間加熱した後ではその生
物学的活動の大部分をまだ保持することか知られている
。一方、言うまでもなく、抗原体においてはそうではな
い。この例は、エンドトキシンによる汚染の可能性がい
かになくなったかを示すものである。その結果を、前述
の例において記載した結果と比較する必要がある。
たので、観察されたmAb活動が例13及び14にて記
載した問題に類似した汚染エンドトキシンの結果ではな
いことを示す必要が生じた。この点に関して、エンドト
キシンは、摂氏100度で長時間加熱した後ではその生
物学的活動の大部分をまだ保持することか知られている
。一方、言うまでもなく、抗原体においてはそうではな
い。この例は、エンドトキシンによる汚染の可能性がい
かになくなったかを示すものである。その結果を、前述
の例において記載した結果と比較する必要がある。
様々な濃度の非加熱又は加熱(摂氏100度で1時間)
したmAb 5D3を、3U/m1IFN−γの存在
のもとで上述したH e N細胞に使用した。これらの
結果は、パネル9aに示すように、前の実験、前述した
細胞毒のテスト結果に近似したものである。加熱処理し
たものは活動を示さず、これはエンドトキシン汚染が無
いことを示すものである。
したmAb 5D3を、3U/m1IFN−γの存在
のもとで上述したH e N細胞に使用した。これらの
結果は、パネル9aに示すように、前の実験、前述した
細胞毒のテスト結果に近似したものである。加熱処理し
たものは活動を示さず、これはエンドトキシン汚染が無
いことを示すものである。
例21
5
6
エンドトキシン汚染が発生しなかったことを更に裏付け
るために、マイクロファージにたいするLPS活動の強
力な抑制剤として知られているポリミキシン Bを使用
して実験を行った。Chio et al J、
InfectDis、159:872 (1989)、
St。
るために、マイクロファージにたいするLPS活動の強
力な抑制剤として知られているポリミキシン Bを使用
して実験を行った。Chio et al J、
InfectDis、159:872 (1989)、
St。
kes et al J Tnfect D
is、160:52 (1989)Morris。
is、160:52 (1989)Morris。
n et al Immuncchem13:8
13 (1976)参照。
13 (1976)参照。
これらの実験において、前述した例において記載したプ
ロトコル及びパラメータを再び使用して、mAb 5
D3をポリミキシンBと共に潜伏させた。第9B図に示
すように、刺激活動は僅かだけ抑制された。これに対し
て、LPSを同量のポリミキシンBと混合した場合にお
いては、その活動は完全になくなった。事実、僅か1
u g/m lのポリミキシンBを10ng/ml
LPSと使用した場合においても、活動は”Cr放出が
5893から1.3%まで減少した。従って、mAb
5D3の活動は熱によって影響を受けるが、ポリミキ
シンBに対しては無反応であり、従って、エンドキシン
汚染から生じたものではない。
ロトコル及びパラメータを再び使用して、mAb 5
D3をポリミキシンBと共に潜伏させた。第9B図に示
すように、刺激活動は僅かだけ抑制された。これに対し
て、LPSを同量のポリミキシンBと混合した場合にお
いては、その活動は完全になくなった。事実、僅か1
u g/m lのポリミキシンBを10ng/ml
LPSと使用した場合においても、活動は”Cr放出が
5893から1.3%まで減少した。従って、mAb
5D3の活動は熱によって影響を受けるが、ポリミキ
シンBに対しては無反応であり、従って、エンドキシン
汚染から生じたものではない。
例22
mAb 5D3の活動に対するLPSの効果をテスト
した。マイクロファージをIFN−γによって、次に加
熱又は非加熱mAb 5D3によって、LPSのいち
値以下のトリガ濃縮物の存在又は不在下において、充満
させた。
した。マイクロファージをIFN−γによって、次に加
熱又は非加熱mAb 5D3によって、LPSのいち
値以下のトリガ濃縮物の存在又は不在下において、充満
させた。
(0,1ng/ml)これらの結果は第10図に示され
ている。再び前述した例の方法により、C3H/HeN
マイクロフアージをテスl−した。
ている。再び前述した例の方法により、C3H/HeN
マイクロフアージをテスl−した。
ある程度の濃度の5D3のもとでは、LPSを0.1/
ng/m]添加することによって活動がほとんど3倍に
増加したことがわかる。これは約7ug/m1以上に濃
度を増加させた場合には起こらなかった。加熱処理され
たmAb5D3はなんら活動を示さず、これはLPSを
添加しても変わらなかった。
ng/m]添加することによって活動がほとんど3倍に
増加したことがわかる。これは約7ug/m1以上に濃
度を増加させた場合には起こらなかった。加熱処理され
たmAb5D3はなんら活動を示さず、これはLPSを
添加しても変わらなかった。
8
これらの結果は、LPSとmAb 5D3との組合せ
が単なる追加的効果以上のものを有することを示すもの
である。
が単なる追加的効果以上のものを有することを示すもの
である。
例23
以前の作業により、培養媒体中におけるanti I
NF−α/β かL P Sによって誘導されたマイク
ロファージ腫瘍減殺活動を抑制するものであることがわ
かっている。Leuet al、Immunobio
logy 171:220 (1986)参照。これ
はLPS刺激マイクロファージによってトリガされた1
FN−a/β のautocrine/paracri
ne充満効果が無くなることが原因であることがわかっ
ている。mAb 5D3の効果に対するanti−I
FN α/β 抗原体の効果を調べるために、C3H
/HeNマクロフア一ジ単層を、羊のanti−IFN
α/β 抗原体又はノーマルの羊IgGの存在下におい
て刺激処理した。ここでも、活動がいかにテストされた
かについては前述した分析評価文献を参照されたい。第
11図は、antiIFN α/β 抗原体が、LP
Sに対してと同様の効果を5D3に対しても有している
ことを示すものである。
NF−α/β かL P Sによって誘導されたマイク
ロファージ腫瘍減殺活動を抑制するものであることがわ
かっている。Leuet al、Immunobio
logy 171:220 (1986)参照。これ
はLPS刺激マイクロファージによってトリガされた1
FN−a/β のautocrine/paracri
ne充満効果が無くなることが原因であることがわかっ
ている。mAb 5D3の効果に対するanti−I
FN α/β 抗原体の効果を調べるために、C3H
/HeNマクロフア一ジ単層を、羊のanti−IFN
α/β 抗原体又はノーマルの羊IgGの存在下におい
て刺激処理した。ここでも、活動がいかにテストされた
かについては前述した分析評価文献を参照されたい。第
11図は、antiIFN α/β 抗原体が、LP
Sに対してと同様の効果を5D3に対しても有している
ことを示すものである。
例18ないし23は、mAb 5D3が認識する80
キロダルトン膜LPS結合蛋白受容体が、その活動によ
って腫瘍の減殺が制御される物質の少なくとも−っであ
ることをはっきりと示すものである。
キロダルトン膜LPS結合蛋白受容体が、その活動によ
って腫瘍の減殺が制御される物質の少なくとも−っであ
ることをはっきりと示すものである。
Mab 5D3は、マクロファージによる腫瘍減殺性
の仲裁に関してLSPの活動を忠実に再現するが、同様
の毒性効果は有していない。
の仲裁に関してLSPの活動を忠実に再現するが、同様
の毒性効果は有していない。
従って、その蛋白組成物を介して80キロダルトンLP
S受容体に特定的に結合するmAbかマイクロファージ
活動を表す指標であるということが出来る。
S受容体に特定的に結合するmAbかマイクロファージ
活動を表す指標であるということが出来る。
これらの結果は、前述したLPS受容体の蛋白質に結合
するmAbであるmAb 5D3がマイクロファージ
を刺激して腫瘍に対する減殺作用を発生させることを示
すものである。これ9 0 はIFN−γとの組合せによっても又効果的であるが、
但し、インクフェロンは必ずしもこの効果を発生させる
ための必須物質ではない。
するmAbであるmAb 5D3がマイクロファージ
を刺激して腫瘍に対する減殺作用を発生させることを示
すものである。これ9 0 はIFN−γとの組合せによっても又効果的であるが、
但し、インクフェロンは必ずしもこの効果を発生させる
ための必須物質ではない。
前述した以前の実験に示されているように、mAb
5Dはそのホストに対して毒性を有するものではない。
5Dはそのホストに対して毒性を有するものではない。
従って、ここで記載した実験は、in vivo
治療に転用可能であることが予想される。なぜなら、こ
こで使用したモデルがこの効果を予想させるからである
。
治療に転用可能であることが予想される。なぜなら、こ
こで使用したモデルがこの効果を予想させるからである
。
従って、上述の例は、例えばmastocytoma細
胞等の腫瘍細胞に対して、治療を必要とする患者に、m
Ab 5D3のような80キロダルトンLPSグリコ
プロチンのタンパク質に特定的に結合するモノクローナ
ル抗原体を治療上有効な分量だけ投与することによって
、腫瘍細胞に対する減殺効果を達成する方法を提供する
ものである。このモノクローナル抗原体は、ガンマイン
ターフェロンとともに投与することも可能であるが、こ
れは必ずしも必要ではない。
胞等の腫瘍細胞に対して、治療を必要とする患者に、m
Ab 5D3のような80キロダルトンLPSグリコ
プロチンのタンパク質に特定的に結合するモノクローナ
ル抗原体を治療上有効な分量だけ投与することによって
、腫瘍細胞に対する減殺効果を達成する方法を提供する
ものである。このモノクローナル抗原体は、ガンマイン
ターフェロンとともに投与することも可能であるが、こ
れは必ずしも必要ではない。
前記モノクローナル抗原体及びガンマインターフェロン
の投与量は、治療される患者によって異なるであろう。
の投与量は、治療される患者によって異なるであろう。
前述したように、mAbのみを添加した場合には、モノ
クローナル抗原体の濃度は最低10ug/mlであるこ
とが望ましい。約3U/mlの濃度のIFN−γと共に
投与する場合には、mAbの投与濃度はaug/mlに
まで減らすことが出来る。特に好ましい実施例に依れば
、10ug/mlのmAbと3U/mlのIFN−γと
が共に投与される。
クローナル抗原体の濃度は最低10ug/mlであるこ
とが望ましい。約3U/mlの濃度のIFN−γと共に
投与する場合には、mAbの投与濃度はaug/mlに
まで減らすことが出来る。特に好ましい実施例に依れば
、10ug/mlのmAbと3U/mlのIFN−γと
が共に投与される。
この点に関して、前述した文献にはモノクローナル抗原
体とIFN−γとの治療用組成が記載されている。mA
bはマイクロファージの肉腫細胞に対する活動を起こさ
せるに十分な量が存在し、一方、IFN−γは、モノク
ローナル抗原体の効果を強化するのに十分な量か存在す
る。
体とIFN−γとの治療用組成が記載されている。mA
bはマイクロファージの肉腫細胞に対する活動を起こさ
せるに十分な量が存在し、一方、IFN−γは、モノク
ローナル抗原体の効果を強化するのに十分な量か存在す
る。
ここで使用した用語や式は記載の目的においてのみ使用
されたものであって、なんら本発明を限定するものでは
ないことは言うまでもない。
されたものであって、なんら本発明を限定するものでは
ないことは言うまでもない。
1
2
表 1
LPS結合蛋白質のアミノ酸組成物I
アミノ酸2 残留物3
Asp 73
G]u105
Ser 45
Iy46
His 19
Arg 33
Th r a 39Ala
53 Pro 32 Tyr 27 Val 41 Met 5 rleu ]6 L e u 60Phe
31 Lys 81 ■ 二次元ゲルから純化され、イモピロンに吸収されて
酸加水分解およびアミノ酸分析を受けるL P S結合
蛋白質。
53 Pro 32 Tyr 27 Val 41 Met 5 rleu ]6 L e u 60Phe
31 Lys 81 ■ 二次元ゲルから純化され、イモピロンに吸収されて
酸加水分解およびアミノ酸分析を受けるL P S結合
蛋白質。
23回の独立した量定の平均値。
3 80.0OOkDa分子量に基つく。
表2
純化された80kDaのLPS受容体と結合するモノク
ローナル抗体における化学変化の効果MoAbの430
nmにおける吸収度 処理剤1 3D7 5D3なし
0.31 0.16過ヨウ素酸塩1mM
<0.01 0.2310mM <0.
01 0.67プロテアーゼ K O,log/ml 0.29 <0.011
、oug/ml 0.28 <0.0113
7°Cで1時間、過ヨウ素酸塩またはプロテアーゼにで
処理された80kDaのLPS受容体で塗布されたミク
ロタイター板。
ローナル抗体における化学変化の効果MoAbの430
nmにおける吸収度 処理剤1 3D7 5D3なし
0.31 0.16過ヨウ素酸塩1mM
<0.01 0.2310mM <0.
01 0.67プロテアーゼ K O,log/ml 0.29 <0.011
、oug/ml 0.28 <0.0113
7°Cで1時間、過ヨウ素酸塩またはプロテアーゼにで
処理された80kDaのLPS受容体で塗布されたミク
ロタイター板。
3
4
表3
純化された5D3モノクローナルを用いたねずみの抗エ
ンドトキシン死亡率保護 処理剤! 抗原投与 10時間後の残留物塩水
0.01ug LPS 1/10 (
10%)5D3 (75ug) 0.(llug
LPS 10/10 (100%)1 ねすみ(C
R1雌、18−22gm)は、発熱物質を含まない塩水
、または純化された5D3モノクロ一ナル抗体のいずれ
かを、最終容量60μmで腹膜組織内へ投与された。
ンドトキシン死亡率保護 処理剤! 抗原投与 10時間後の残留物塩水
0.01ug LPS 1/10 (
10%)5D3 (75ug) 0.(llug
LPS 10/10 (100%)1 ねすみ(C
R1雌、18−22gm)は、発熱物質を含まない塩水
、または純化された5D3モノクロ一ナル抗体のいずれ
かを、最終容量60μmで腹膜組織内へ投与された。
1時間後、ねずみは、第2回目の腹膜組織内へのS腸炎
LPSと18mgのD−ガラクトサミン注射を受けた。
LPSと18mgのD−ガラクトサミン注射を受けた。
残留物は最初の9時間は1時間毎にモニタされ、その後
は12時間間隔でモニタされた。すべての実験ねずみは
6〜12時間内に死亡した。5D3を投与されたねずみ
は48時間経っても死亡しなかった。
は12時間間隔でモニタされた。すべての実験ねずみは
6〜12時間内に死亡した。5D3を投与されたねずみ
は48時間経っても死亡しなかった。
表4
ガラクトサミン治療されたねずみにおけるMoAb5D
3の保護効力 残留物/総計 前処理剤 抗原投与1 実験l 実験2 総計(
%)塩水 12ng LPS 2/15
8/16 10/31(34%)7.5ug Mo
Ab 5D3 12ng LPS 10/10 10
/10 20/20(100%)7.5ug MoAb
5D3 12ng LPS −10/10 −1
0/10(100%)0.75ug MoAb 5D3
12ng LPS −315315(60%)75
ug IgG 12ng LPS −4/1
0 4/10(40%)塩水 515 515
10/10(100%)■ 同時に18mgのD−
ガラクトサミンの投与量を受けたすべてのねずみ 表5 ガラクトサミン治療された ねずみにおけるMoAb5D3の保護効力LPS抗原投
与量の効果 前処理剤 抗原投与I 残留物/総計塩水
10ng LPS O/
85 15ug MoAb 5D3 10ng LPS1
5ug MoAb 5D3 3ng LPS15u
g MoAb 5D3 1100n LPSl 同時
に18mgのD 与えられたねずみ 表6 通常のC3HeB/FeJにおける MoAb5D3の保護効力 前処理 抗原投与 実験1 実験2塩水
250ug LPS 4/9 7/1
2250ug MoAb 5D3 250ug LPS
8/9 11/11総計(%) ] 1/21 (53%) 0.1 19/20(95%) 表7 MoAb5D3のエンドトキシン活性度の評価ガラクト
サミン感作されたねずみ実験1実験1 抗原投与量 残留物 エンドトキシン均等物塩水
8/8 15ng LPS 115 75ng 5D3 8/8 実験2 抗原投与量 残留物 塩水 8/8 20ng LPS 2/8 750ng5D3 2/8 <0.2ng ”LPS”/ugMoAbエンドトキシ
ン均等物 0.03ng”LPS”/ug MoAb表8 MoAb5D3のエンドトキシン活性度の評価リムルス
属変形細胞分離物検査方法 ゲル化* 量 15ng 3ng 6001)g toopg
1011g l11g O,lpgMoAb 5D3
++ 十LPS 十十
++ 十士 ++ ++
++うろこ状固体ゲル(]++ 毛状凝結 (+) 凝結なし (=) 7 8 エンドトキシン均等物: 0.3ng″LPS”/u
g表9 MoAb5D3のエンドトキシン活性度の評価活性度 実験 方法 B″LPS”/ug MoA
b 5D31 ガラクトサミン死亡率 <0.2n
g2 ガラクトサミン死亡率 −〇、 03ng3
リムルス属(非加熱) −0,3ng4 リム
ルス属(非加熱) <0.20g5 有糸分裂促
進物質 <0.2ng評価平均値 −0,1
ng″LPS”/ug MoAb 5D3表10 ガラクトサン感作されたねずみにおけるLPS死亡率に
対するLPS前処理剤効果実験1 前処理剤 抗原投与* 残留物/総計塩水
15ug LPS 1/815ug M
pAb 5D3 15ug LPS 8/81
00ng LPS 15ugLPS
4/8実験2 前処理剤 抗原投与* 残留物/総計塩水
10ng LPS O/815u(HMo
Ab 5D3 10ng LPS 8/81、
Ong LPS 10ng LPS 2
/88、Ong LPS lOngLPS
4/810ng LPS IOngLSP
8/830ng LPS 10ng
LPS 8/8ネ同時に18mgのD−ガラク
トサミン投与量を与えられたすべてのねずみ 表 11 リムルス属分離物*によるMoAb5D3のエンドトキ
シン活性度の評価 加熱効果 MoAb5D3 非加熱 100°C−60分200
0 B 1士
土士400 ++
+。
3の保護効力 残留物/総計 前処理剤 抗原投与1 実験l 実験2 総計(
%)塩水 12ng LPS 2/15
8/16 10/31(34%)7.5ug Mo
Ab 5D3 12ng LPS 10/10 10
/10 20/20(100%)7.5ug MoAb
5D3 12ng LPS −10/10 −1
0/10(100%)0.75ug MoAb 5D3
12ng LPS −315315(60%)75
ug IgG 12ng LPS −4/1
0 4/10(40%)塩水 515 515
10/10(100%)■ 同時に18mgのD−
ガラクトサミンの投与量を受けたすべてのねずみ 表5 ガラクトサミン治療された ねずみにおけるMoAb5D3の保護効力LPS抗原投
与量の効果 前処理剤 抗原投与I 残留物/総計塩水
10ng LPS O/
85 15ug MoAb 5D3 10ng LPS1
5ug MoAb 5D3 3ng LPS15u
g MoAb 5D3 1100n LPSl 同時
に18mgのD 与えられたねずみ 表6 通常のC3HeB/FeJにおける MoAb5D3の保護効力 前処理 抗原投与 実験1 実験2塩水
250ug LPS 4/9 7/1
2250ug MoAb 5D3 250ug LPS
8/9 11/11総計(%) ] 1/21 (53%) 0.1 19/20(95%) 表7 MoAb5D3のエンドトキシン活性度の評価ガラクト
サミン感作されたねずみ実験1実験1 抗原投与量 残留物 エンドトキシン均等物塩水
8/8 15ng LPS 115 75ng 5D3 8/8 実験2 抗原投与量 残留物 塩水 8/8 20ng LPS 2/8 750ng5D3 2/8 <0.2ng ”LPS”/ugMoAbエンドトキシ
ン均等物 0.03ng”LPS”/ug MoAb表8 MoAb5D3のエンドトキシン活性度の評価リムルス
属変形細胞分離物検査方法 ゲル化* 量 15ng 3ng 6001)g toopg
1011g l11g O,lpgMoAb 5D3
++ 十LPS 十十
++ 十士 ++ ++
++うろこ状固体ゲル(]++ 毛状凝結 (+) 凝結なし (=) 7 8 エンドトキシン均等物: 0.3ng″LPS”/u
g表9 MoAb5D3のエンドトキシン活性度の評価活性度 実験 方法 B″LPS”/ug MoA
b 5D31 ガラクトサミン死亡率 <0.2n
g2 ガラクトサミン死亡率 −〇、 03ng3
リムルス属(非加熱) −0,3ng4 リム
ルス属(非加熱) <0.20g5 有糸分裂促
進物質 <0.2ng評価平均値 −0,1
ng″LPS”/ug MoAb 5D3表10 ガラクトサン感作されたねずみにおけるLPS死亡率に
対するLPS前処理剤効果実験1 前処理剤 抗原投与* 残留物/総計塩水
15ug LPS 1/815ug M
pAb 5D3 15ug LPS 8/81
00ng LPS 15ugLPS
4/8実験2 前処理剤 抗原投与* 残留物/総計塩水
10ng LPS O/815u(HMo
Ab 5D3 10ng LPS 8/81、
Ong LPS 10ng LPS 2
/88、Ong LPS lOngLPS
4/810ng LPS IOngLSP
8/830ng LPS 10ng
LPS 8/8ネ同時に18mgのD−ガラク
トサミン投与量を与えられたすべてのねずみ 表 11 リムルス属分離物*によるMoAb5D3のエンドトキ
シン活性度の評価 加熱効果 MoAb5D3 非加熱 100°C−60分200
0 B 1士
土士400 ++
+。
80 4+
9
0
16 +士
3十
0.6+
* LALの感度: 10pg LPS ++;
1.Opg +; 0.1pg表12 ガラクトサミン治療されたねずみにおけるM o Ab
5D3の抗エンドトキシン死亡率保護効力加熱効果 前処理剤 抗原投与 残留物/総計塩水
18ng LPS 2/8(100°C
60m1n) 18ng LPS 7/85
0ng LPS 100c 18ng LPS
8/8塩水 塩水 4/4*
同時に18mgのD−ガラクトサンの投与量を与えら
れたすへてのねずみ
1.Opg +; 0.1pg表12 ガラクトサミン治療されたねずみにおけるM o Ab
5D3の抗エンドトキシン死亡率保護効力加熱効果 前処理剤 抗原投与 残留物/総計塩水
18ng LPS 2/8(100°C
60m1n) 18ng LPS 7/85
0ng LPS 100c 18ng LPS
8/8塩水 塩水 4/4*
同時に18mgのD−ガラクトサンの投与量を与えら
れたすへてのねずみ
第1図はエントドキシツクLPSが80KDのLPS受
容体と結合することを防止するmAb3D7の能力を示
す図、第2図はmAb3D7のLPSによる5pten
ocytesとの結合の防止を示す図、第3図は浄化M
oAb5D3の制t。 genici tyを示す図、第4図はMoAb5D3
の80KDの浄化LPS結合たんばくに対する反応性を
示す図、第5a図はMoAb5D3に対するうさぎのポ
リクローナル−アンチモノクローナル抗血清の反応性を
示す図、第5b図はプレBセルフ0Z/3に対するうさ
ぎのポリクローナル−アンチモノクローナル抗血清の反
応性を示す図、第6図はMoAb5D3とプレBセルフ
02/3に対するうさぎのポリクローナルアンチモノ
クローナル抗血清のウェスタンプロットと免疫沈降反応
を示す図、第7図はmAb5D3とE、コーリ(E、
Co11 )骨髄誘導マクロファージ媒介腫瘍シ1〜ト
キシティからのLSI 2 PSの効果を示すデータ、第8図はLPSレスポンダお
よびノンレスポンダ誘導マクロファージに対するmAb
5D3の効果を示す図、第9図はマクロファージのmA
b5D3に対する加熱とポリミキシンBの効果を示す図
、第10a図と、第10b図はマクロファージ媒介腫瘍
シ) 1−キシティにおけるE、コーリLPSとmAb
5D3の活性の効果を示す図、第11図はマクロファー
ジ媒介腫瘍シトトキシティにおけるmAb5D3の活性
に対するアンチTFNα/β抗体の効果を示す図である
。 図面の浄書 3 FIG、 2゜ 25 0 00 00 00 00 LPS (ug/rnl) FIG、 3゜ MoAb5D3゜ ug/ml FIG、7A。 1.0 3.0 0 0 00 (vg/ml)
容体と結合することを防止するmAb3D7の能力を示
す図、第2図はmAb3D7のLPSによる5pten
ocytesとの結合の防止を示す図、第3図は浄化M
oAb5D3の制t。 genici tyを示す図、第4図はMoAb5D3
の80KDの浄化LPS結合たんばくに対する反応性を
示す図、第5a図はMoAb5D3に対するうさぎのポ
リクローナル−アンチモノクローナル抗血清の反応性を
示す図、第5b図はプレBセルフ0Z/3に対するうさ
ぎのポリクローナル−アンチモノクローナル抗血清の反
応性を示す図、第6図はMoAb5D3とプレBセルフ
02/3に対するうさぎのポリクローナルアンチモノ
クローナル抗血清のウェスタンプロットと免疫沈降反応
を示す図、第7図はmAb5D3とE、コーリ(E、
Co11 )骨髄誘導マクロファージ媒介腫瘍シ1〜ト
キシティからのLSI 2 PSの効果を示すデータ、第8図はLPSレスポンダお
よびノンレスポンダ誘導マクロファージに対するmAb
5D3の効果を示す図、第9図はマクロファージのmA
b5D3に対する加熱とポリミキシンBの効果を示す図
、第10a図と、第10b図はマクロファージ媒介腫瘍
シ) 1−キシティにおけるE、コーリLPSとmAb
5D3の活性の効果を示す図、第11図はマクロファー
ジ媒介腫瘍シトトキシティにおけるmAb5D3の活性
に対するアンチTFNα/β抗体の効果を示す図である
。 図面の浄書 3 FIG、 2゜ 25 0 00 00 00 00 LPS (ug/rnl) FIG、 3゜ MoAb5D3゜ ug/ml FIG、7A。 1.0 3.0 0 0 00 (vg/ml)
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、抗腫瘍細胞毒効果を発生させるべくマクロファージ
細胞を刺激する方法であって、腫瘍の寄主に、特に前記
抗腫瘍マクロファージの細胞毒性を刺激するに充分な細
菌性リポ多糖類エンドトキシンのための糖蛋白質受容体
の80キロダルトン蛋白部に秘結されたモノクローナル
抗体を含有する任意量の治療組成物を投与することから
なる方法。 2、抗腫瘍マクロファージの細胞毒効果を刺激するに有
効な組成物であって、特に前記抗腫瘍マクロファージの
細胞毒性を刺激するに充分な細菌性リポ多糖類エンドト
キシンのための糖蛋白質受容体の80キロダルトン蛋白
部に秘結された任意量のモノクローナル抗体と、マクロ
ファージへの前記モノクローナル抗体の効果を増強させ
るに充分な任意量のガンマインターフェロンからなる組
成物。 3、哺乳動物に敗血性ショックを起こさせる細菌性リポ
多糖類エンドトキシンの処理方法であって、免疫化に応
じて発生する1つまたは複数の抗体に、哺乳類細胞にあ
る受容体に秘結された細菌性リポ多糖類エンドトキシン
に適したモノクローナル抗体を投与することからなる方
法。
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US376,704 | 1989-07-07 | ||
US07/376,704 US5045466A (en) | 1989-07-07 | 1989-07-07 | Purified mammalian cell binding receptor for bacterial lipopolysaccharide endotoxin and monoclonal antibody |
US40426689A | 1989-09-07 | 1989-09-07 | |
US404.266 | 1989-09-07 | ||
US54344290A | 1990-06-28 | 1990-06-28 | |
US543.442 | 1990-06-28 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH03285695A true JPH03285695A (ja) | 1991-12-16 |
Family
ID=27409313
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2180364A Pending JPH03285695A (ja) | 1989-07-07 | 1990-07-07 | 腫瘍に対してマクロファージの働きを活発化する方法とそのための組成 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0406880A3 (ja) |
JP (1) | JPH03285695A (ja) |
CA (1) | CA2020593A1 (ja) |
-
1990
- 1990-07-06 EP EP19900112928 patent/EP0406880A3/en not_active Withdrawn
- 1990-07-06 CA CA002020593A patent/CA2020593A1/en not_active Abandoned
- 1990-07-07 JP JP2180364A patent/JPH03285695A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0406880A3 (en) | 1991-06-12 |
EP0406880A2 (en) | 1991-01-09 |
CA2020593A1 (en) | 1991-01-08 |
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