JP2007332151A

JP2007332151A - ＨＩＶｇｐ１２０の加水分解を触媒する組成物および方法

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Publication number: JP2007332151A
Application number: JP2007193476A
Authority: JP
Inventors: Sudhir Paul; サドヒル・ポール; Ravishankar Kalaga; ラビシャンカー・カラガ
Original assignee: Nebraskaboard Of Regents, University of; University of Nebraska
Current assignee: Nebraskaboard Of Regents, University of; University of Nebraska
Priority date: 1995-07-21
Filing date: 2007-07-25
Publication date: 2007-12-27
Anticipated expiration: 2016-07-19
Also published as: JPH11510047A; WO1997003696A1; JP4185151B2; CN1197394A; CN1165344C; EP0871485B1; ATE354374T1; EP0871485A1; US6156541A; ES2283005T3; CA2223914A1; EP0871485A4

Abstract

【課題】今日までに利用可能なHIV感染症の治療は、疾病の潜伏期間を延長させるためのウイルス複製の阻害に指向されているのに対して、AIDS患者に使用して体内のHIVおよび可溶性gp120のレベルを低下させ得る方法および組成物を提供する。
【解決手段】gp120を不活性サブフラグメントに効率的に切断する、患者の血清から単離した加水分解性抗-gp120抗体およびL鎖抗体コンポーネント（component）を含む、gp120の加水分解を仲介（mediate）する触媒性抗体および抗体コンポーネントの単離方法および精製方法。
【選択図】なし

Description

本発明はHIV感染症および関連する病理の治療に関する。特に、HIV gp120蛋白質の加水分解を触媒する触媒性（蛋白質加水分解性）抗体またはその誘導体を提供する。

HIV‐１のエンベロープ糖蛋白質は単一の160kD前駆であるgp160として最初に合成され、これは、細胞性プロテアーゼによってArg511-Ala512の結合で切断されて、gp120と内在性膜蛋白質gp41とを生成する（Kido，H．ら、J．Biol．Chem．268：13406-13413(1993)）。ｇp120の生物活性は、HIV-1による宿主細胞への初期結合、該ウイルスの増殖、および非感染ニューロンおよび他の細胞に対するその毒性における鍵要因である（Kieber-Emmons，T．ら、Biochim．Biophys．Acta．989：281-300(1987)；Caponら、Ann．Rev．Immunol．9：649-678）。

従って、gp120はAIDSに対する受動免疫および能動免疫の標的となる（Kahn，Ｊ．Ｏ．ら、Ｊ．Infec．Dis．170：1288-1291（1994）；Birx，D．L．ら、Curr．Opin．Immunol．5：600-607（1993）；Berman，P．W．ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85：5200-5204（1988））。宿主細胞上のCD4受容体へのgp120の立体エピトープの結合が、HIV-１感染の最初の工程である。このエピトープを構成する個々のアミノ酸は、第２（Ｃ２）、第３（Ｃ３）、および第４（Ｃ４）の保存gp120セグメントに位置するようである（Olshevsky，Ｔ．J．ら、J．Virol．64：5701-5705（1990））。これらは、gp120残基256、257、368-370、421-427および457に存在する。CD4結合サイトに結合するモノクローナル抗体は記載されている（Thali，M．ら、J．Virol．65：6188-6193（1991）；Thali，M．ら、J．Virol．66：5635-5641(1992)）。CD4結合サイトは立体エピトープであるため、それ自体はエピトープの構成物ではない遠位の残基もCD４結合能を維持するのに重要となり得る。他の宿主細胞蛋白質とgp120との相互作用もウイルス増殖に必須である。例えば、カルモジュリンによるgp120の結合も、カルモジュリン・アンタゴニストの阻害作用によって表れるように、HIV-１感染力に関与し得る（Srinivas，R．V．ら、AIDS Res．Hum．Retroviruses 108：1489-1496（1994））。gp120のV1領域とV2領域との間に位置するAsp180はウイルス複製に重要である（Wang，W-K．ら、J．Virol．69：538-542（1995））。同様にして、V3ループも感染力に必須である（Ivanoff，L．A．ら、Virology 187：423-432（1992））。従って、CD4結合サイトを構成するもの以外のgp120中の構造決定因子がウイルスゲノム複製、コート蛋白質合成、およびウイルス粒子パッケージングに必要らしいことは明らかである。

ウイルス粒子および感染細胞によるgp120の分かち合い（shedding）がAIDSの病原性における因子として提唱されている（Gelderblom，H．R．ら、Lancettii：1016-1017（1985））。精製したgp120は、培養ニューロンに対して毒性である（Brenneman，D．E．ら、Nature 335：639-642（1988）；Muller，Ｗ．E．G．ら、Eur．J．Pharmacol．226：209-214（1992））。gp120でコートした非感染T-リンパ球は、抗体‐依存性単球によって消化され得る（Hober，D．ら、FEMS Immunol．Med．Microbiol．10：83-92（1995））。非感染CD４^＋細胞は、gp120-gp41複合体の結合がアポトーシスを誘導するために死ぬかもしれない（Laurent-Crawford，A．G．ら、Res．Virol．146：5-17（1995））。gp120は補体因子にも結合する（Stoiber，H．ら、AIDS 9：19-26（1995））。

AIDS患者に認められたニューロン障害にgp120が起因する可能性が、かなり注目されている（Everall，I．P．ら、J．Neuropathol．Exp．Neurol．52：561-566（1993））。脳における増殖性の感染は比較的少数の細胞で起こり、その細胞には小グリア細胞、多核化巨細胞、および血液由来のマクロファージが包含される（Epstein，L．G．ら、Ann．Neurol．33：429-436（1993））。しかし、ウイルスに感染していない領域にも広範な脳障害が存在する。このことは、ウイルスによって放出された可溶性gp120と感染細胞によって産生されたサイトカインとが障害に寄与し得るという示唆に通じる（Lipton，S．A．，Brain Pathol．１：193-199（1991）、Guilian，D．ら、Science 250：1593-1595（1990）；Benos，D．J．ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91：494-498（1994））。gp120の神経毒性作用は間接的であり得、NMDA受容体の刺激（Benos，D．J．ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91：494-498（1994））またはサイトカインの誘導（Yeung，M．C．ら、AIDS ９：137-143（1995））に関与しているかもしれない。gp120は単球からの神経毒の放出も刺激し（Guilian，D．ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90：2769-2773（1993））、このことは、その神経毒作用がこの細胞型の関与を要し得ることを示唆している。可溶性gp120の神経毒性についての証拠には：
（ａ）脳中にgp120を発現しているトランスジェニックマウスが広範なニューロン障害を示すこと（Toggas，S．M．ら、Nature 367：188-193（1994））；
（ｂ）サブピコモル濃度の精製gp120で培養神経星状細胞および大脳皮質細胞が殺されること（Brenneman，D．E．ら、Nature 335：639-642（1988）；Muller，W．E．G．ら、Eur．J．Pharmacol．226：209-214（1992））；
（ｃ）精製gp120をイン・ビボ（in vivo）で注射すると脳障害を生じること（Hill，J．Ｍ．ら、Brain Res．603：222-223（1993））；
（ｄ）脊髄液中に存在するgp120-様の神経毒活性が記載されていること（Buzy，J．ら、Brain Res．598：10-18（1992））；および
（ｅ）gp120のセグメントに対応し、かつ神経ペプチドVIPに幾分かの相同性を有するオクタペプチドであるペプチド−Tが、AIDS患者における神経不全症を緩和し得ること（Ｂridge，Ｔ．Ｐ．ら、Psychopharmacol．Bull 27：237‐245(1991))が包含される。

p120は、それに対して抗体が生成する多くの線状のおよび立体抗原性エピトープを発現している。これらには、HIV-感染患者によって生成される、V3ループに対する中和抗体が包含される(Dreyer，E．B．ら、Science 248：364‐367(1990)；Meylan，P．R．ら、AIDS 6：128‐130(1992)；Pollard，S．ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88：11320‐11324(1991))。V3ループは超可変領域であるために、この抗体は、初期感染に寄与するウイルス株と同様なV3配列を有するHIV変異株に対してのみ指向される中和活性を有し、タイプ-特異的である。一方、疾病の後期ステージで生成する抗体は、イン・ビトロ（in vitro）で感受性細胞系に対する、および初代リンパ様細胞培養物に対する種々のHIV-1株の感染能の阻害によって測定されるごとく、広範に保護し得る。これらの保護抗体のサブセットは、CD4受容体の結合およびウイルス増殖に必須であるgp120の保存領域に対して指向されている(Hattori，T．ら、FEBS Lett．248：48-52(1989)；Schulz，T．ら、AIDS Res．Hum．Retroviruses 9：159-166(1993)；Clements，G．J．ら、AIDS Res．Hum．Retroviruses 7：3-16(1991))。gp120の保存領域に対する中和抗体応答の補充がAIDSに対する効果的なワクチン注射に必要であろうと広く考えられている。同様にして、抗体を用いた受動免疫の成功は、保存gp120領域を認識するその能力に依存するであろう。

他には、全身紅斑エリテマトーゼス患者において見出された自己抗体がgp120に結合し得ることが認められている(Gu，R．ら、AIDS Res．Hum．Retroviruses 9：1007-1015(1993)；Callebaut，C．ら、Science 262：2045-2050(1993))。gp120に対する抗体とHLAクラスI重鎖(H-鎖)に対する抗体との間の交差反応が示唆されている(Sattentau，Q．J．ら、J．Virol．67：7383-7393(1993))。AIDS患者がDNAを加水分解する触媒性抗体を発現することも記載されている(Woolley，D．W．ら、John Wiley & Sons，Inc．社、（1952）pp82)。

抗体が触媒活性を発現し得るという推論は、十分に長期間抗原に暴露すると免疫系が触媒性抗体を合成し得るということを1952年に示唆したWoolleyまでさかのぼる(Gao，Q．S．ら、J．Biol．Chem．269：32389-32393(1994))。検出可能な配列相同性が、抗体L-鎖とセリンプロテアーゼとの間に存在する(Sun，M．ら、J．Biol．Chem．269：734-738(1994))。Kohenらは、キャリアー蛋白質にコンジュゲートしたステロイドまたはジニトロフェノールで免疫化するとエステラーゼ活性を有する抗体が形成されることを報告している(Sun，M．ら、J．Immunol．153：5121-5126(1994)；Paul，S．ら、Appl．Biochem．Biotechnol．47：241-255(1994))。神経ペプチドVIPを加水分解するヒト自己抗体が立証されている(Li，L．ら、Mol．Immunol．（1996）印刷中)。VIPの自己抗体-触媒加水分解は再現されている(Li，L．ら、J．Immunol．154：3328-3332(1995))。他のグループは、DNAの自己抗体が介在する加水分解を示している(Tyutyulkova，S．ら、Biochimica Biophysica Acta （1996）印刷中；Kalaga，R．ら、J．Immunol．155：2695-2702(1995))。

酵素活性を有する抗体は、特異的な、非常に効率的なリガンドの触媒化学変換の可能性を提供する。多くの生物メディエーターはペプチドか、または蛋白質であり、これらには、病原生物の抗原、ホルモン、神経伝達物質、および腫瘍特異的抗原が包含される。免疫系が包含する特異性の膨大なレパートリーを利用すれば、天然に発生する酵素の範囲には入らない化学反応を触媒することが可能である。抗体特異性と酵素の触媒力との組み合わせは、強力な治療剤、すなわち鍵ウイルス・エンベロープ蛋白質を特異的に加水分解し得る触媒性抗体、を生成する能力を有する。

HIV感染症の治癒法は未だ開発されていない。今日までに利用可能な治療は、疾病の潜伏期間を延長させるためのウイルス複製の阻害に指向されている。

本発明は、AIDS患者に使用して体内のHIVおよび可溶性gp120のレベルを低下させ得る方法および組成物を提供する。これらの組成物を患者に投与すると、AIDS関連痴呆を患う患者の神経学的な症候を緩和することができる。

本発明は、gp120を不活性サブフラグメントに効率的に切断する、患者の血清から単離した加水分解性抗-gp120抗体およびL鎖抗体コンポーネント（component）を含む。gp120の加水分解を仲介（mediate）する触媒性抗体および抗体コンポーネントの単離方法および精製方法も提供する。

本発明の好ましい具体例は、組換え法を用いて作製した抗体および抗体コンポーネントである。gp120切断活性について血清をスクリーニングした後に、末梢血液リンパ球を単離し、これを、ｃDNAライブラリー生成用の活性をコードするmRNAの供給源として用いる。本発明の触媒性抗体および抗体コンポーネントをコードする遺伝子の単離は、当業者によく知られている方法を用いて行う。L鎖を発現しているクローンを単離するための本発明のL鎖のファージ提示が意図されている。また、IgG遺伝子の保存領域に対するプライマーを用いてHIV-１およびSLE患者から単離したリンパ球からの免疫レパートリーのクローニングも構想されている。

組換えgp120加水分解性抗体または抗体コンポーネントの単離、発現、および精製の後に、HIV-感染患者への投与方法が提供される。触媒性gp120切断抗体またはそのコンポーネントは、適当な医薬調製物中でｉ．ｖ．投与することができる。別法として、本発明のgp120加水分解性抗体は、カニューレを介して脳室内に投与することもできる。本発明の触媒性L鎖は、トランスフェリンに翻訳的に融合させて、HIV-１に感染した患者の血液脳関門の通過を仲介させることもできる。

正常なヒトの蛋白質がgp120を特異的に認識し、かつgp120中のペプチド結合の消化を触媒し得るという予期せぬ知見は、後天性免疫不全症候群（AIDS）における新規の治療介入を開発する可能性を開く。抗-gp120加水分解性抗体は、AIDS患者の治療、例えばAIDS-関連痴呆の治療に薬理学的に使用し得る。予備的なデータは、抗-gp120蛋白質加水分解がgp120-仲介神経毒性を排除することを示唆した。もう1つのおよびさらなる直接的な適用は、gp120受容体結合サイトを破壊するか、またはウイルス受容体結合サイトを不安定化するかのいずれかによってHIV感染力を減じる、gp120に結合してそれを切断する注射性蛋白質溶液としてであろう。該加水分解性gp120抗体は、免疫系補充物として用いて、疾病を制御するための身体の自然機構の能力を向上することができる。この適用に例示されるgp120加水分解活性を有するL-鎖のうちの１つは、多発性骨髄腫患者（Lay2）から単離された。骨髄腫（ミエローマ）L-鎖の特異性に寄与する元の抗原刺激物質は知られていない。L-鎖とgp120との反応は、結合サイトとgp120との間の構造適合性を起こすことにより、交差反応現象を反映し得る。この患者が死んだ当時は、AIDSは認識された臨床的な実体ではなく、患者がHIV-１抗体につき陽性であったか否かは知られていない。多発性骨髄腫は、AIDS患者においては高い頻度で起こり得る（Erhan，S．ら、Nature 251：353-355（1974））が、触媒性L-鎖の供与者がAIDSを患っていたという事実はない。

最近の報告では、HIV感染症が、迅速なHIV複製とCD４ T-細胞の速い代謝回転との間のバランスを含むことが立証されている（Weiら、Nature 373：117-122，1995；Hoら、Nature 373：123-126（1995））。このステージでの積極的なウイルス-特異的な蛋白質加水分解処理は、免疫系がなお強力であって感染を含んでいる場合には、感染を排除する可能性を高めるか、または潜伏期間を延ばす可能性を高めるであろう。
以下の例は、より詳細に本発明を説明するために提供される。それは、如なる場合においても本発明を限定することを意図するものではない。

実施例Ｉ
gp120の抗体L鎖-仲介加水分解
多発性骨髄腫を患う患者から精製した２９種のモノクローナル抗体L鎖が記載されており（Solomon，A．、Meth．Enzym．116：101-121（1985）；試料はUniversity of TennesseeのDr．Solomonから寄贈頂いた）、VIP加水分解活性を有する組換えL-鎖（Gao，Q-S．ら、J．Biol．Chem．269：32389-32393（1994））およびポリクローナル抗-VIP抗体（Paul，S．ら、J．Biol．Chem．266：16128-16134（1991））を、その¹²⁵I-標識gp120を加水分解する能力についてスクリーニングした。電気泳動的に純粋なgp120の放射性同位元素標識化（IIIB；AIDS Research and Reference Reagent Program，NIH）は、クロラミン-T法によって行い、続いてゲル濾過によって¹²⁵I-gp120を精製した。SDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーによって、120ｋDに放射性同位元素標識gp120の単一バンドが認められた。図１は、L鎖調製物の純度を示す銀染色SDS-PAGEゲルである。L鎖を¹²⁵I-gp120とインキュベートし、その反応混合物をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動および定量性オートラジオグラフィーによって分析した（Brugger，C．ら、J．Biol．Chem．266：18358-18362（1991））。gp120加水分解活性を有する１種のヒトモノクローナルL-鎖（Lay2）が同定された。残りのL鎖および抗-VIP抗体は活性を欠いていた。gp120加水分解活性は、L-鎖蛋白質ピークと共にゲル濾過カラムから溶出された。Lay2によるgp120のほぼ同等の切断が、生理緩衝液および栄養培地（リン酸緩衝液セーライン（PBS）、ハンク緩衝セーライン溶液（HBSS）およびRPMI 1640）で認められた。ほぼ80ｋDの分子量の４種の放射性同位元素標識gp120切断産物、50ｋD、20ｋD、および＜6ｋD付近のスメアが、非還元電気泳動によって明らかになった（図２Ａを参照されたし）。80ｋDのバンドが還元条件下でフラグメント化するようであることは、それがジスルフィド結合したフラグメントを含むことを示唆している。同等の産物特性が、HIV-１のIIIB、SF2およびMN株由来の¹²⁵I-gp120調製物を用いても認められた。放射性同位元素標識80ｋDのバンドは、36時間までインキュベートを延長するとさらに消化するようであった。非標識gp120および放射性同位元素標識gp120の切断特性は、個々のバンドの強度が異なる以外は同様であり、このことは、恐らくは、２種のタイプの基質を検出するために用いた方法を反映している（銀染色-対-Tyr残基の¹²⁵I-標識につづくオートラジオグラフィー）。HIV-１のIIIB、SF2、およびMN株から単離した非標識gp120をLay2（250nＭ；６時間）によって同様のレベル（各々、50、44、および60％）まで加水分解し、バンドの強度を定量的にスキャンすることによって概算した。

蛋白質の加水分解した分解産物を認識する抗-gp120抗体を用いた還元性ゲルのイムノブロッティング（Pollard，S．ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88：11320-11324（1991））により、Lay2によって生成する明確にされた産物のバンドが得られた（図２Bを参照されたし）。120ｋD基質バンドの強度の低下として概算した図３に示されるごとく、Lay2濃度が上昇するにつれてgp120の加水分解が上昇することが明らかとなった。このことは、80ｋDおよび他の切断産物の蓄積の増加を伴っていた。

20ｎMのLay2と上昇する濃度のLay2（10-300ｎM）とのインキュベートによって得られた反応の動力学の予備的な測定により、ミカエリス-メンテン式に適合し得る初期速度が判明した。反応の見かけのKm値は30ｎＭであって、Vmaxは0．06nmol gp120／nmol lay２／ｈであった。平行反応で分析したトリプシン-触媒加水分解が１μMまでの濃度で非飽和であったという知見によって、Lay2に対するgp120の比較的高い親和性が示され、このことは、120ｋDに対するトリプシンのKmがLay２のものよりも実質的に大きいことを示唆している。

Lay2による¹²⁵I-アルブミンの加水分解が全く存在しなかったことは、認められたgp120加水分解が非特異的な現象ではないことを示唆している（図２Aを参照されたし）。VIPの濃度を上昇してゆくと、Lay2による¹²⁵I-gp120の加水分解が阻害された（VIPの見かけのKi、620ｎM）。Lay2は144ｎMのKmで、放射性同位元素標識VIPも加水分解した。gp120に対するそのKmとVIPに対するKi／Kmとの比較に基づくと、Lay2はVIPよりも約５-２１倍より強くgp120に結合するようである。gp120はVIPと相同性を有する２つの短い領域を有しており（LaRosa，G．J．ら、Science 149：932-935（1990）；Gorny，M．ら、J．Immunol．150：635-643（1993））、これにはLay２と両方のポリペプチドの反応性が存在し得る。

Lay2によるgp120加水分解の至適ｐHは図４に図示するごとく中性範囲であり、このことは、中性pKa値を有するアミノ酸残基（Ser、Thr、Tyr、His）が触媒性残基として関与していることを示唆している。セリンプロテアーゼ・インヒビター存在下（0．3ｍMのフルオロリン酸ジイソプロピル）において、Lay２-触媒加水分解は実質的に完全に阻害された。比較すると、メタロプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、および酸性プロテアーゼのインヒビター（EDTA、ヨードアセトアミド、ペプスタチンA）は何ら反応に影響しなかった。これらの知見は、Ser残基がgp120加水分解に関与し得るということを示唆している。

Lay２の配列はすでに決定されている。Lay2はκIIｃサブグループのメンバーである。このL-鎖のCDR中のSer／Thr残基の数は、異常に多い。触媒性抗-VIP L-鎖を部位特異的突然変異導入すると、そのSer27aおよびHis93が触媒性残基であることが示された。Ser残基は、Lay2中のポジション27aにも存在する。Lay2中のポジション93は（抗-VIP L-鎖中のHisの代わりに）Gluによって占められている。コンピュータ・プログラムAbMを用いて生成したLay2の予備的なモデルにおいては（Martin，A．C．R．ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86：9268-9272（1989））、Ser27aおよびGlu93は水素結合を形成する距離（2．9オングストローム）の範囲内に存在する。これらの残基が水素結合を形成すると、その結果生じるSer残基の求核性が上昇することにより、セリンプロテアーゼ触媒作用で起こるものに類似した機構によるペプチド結合加水分解へのその関与が可能となり得る。

対照gp120およびLay2で処理したgp120（10μM、30時間）の培養マウス大脳皮質細胞の生存性に対する効果を比較した。以前に報告されているごとく（Brenneman，D．E．ら、Nature 335：639-642（1988））、サブピコモル濃度の対照gp120はこの細胞に対して毒性であった。簡単には、大脳皮質細胞は、組織をばらばらにするための0．25％のトリプシンを用いて新生Wistarラットから調製した。細胞は、10％ウシ胎児血清を補充したMEM培地中で培養した。２日後、細胞の約80％はニューロンであり、約20％はグリア繊維状酸性蛋白質陽性神経星状細胞である。Lay2処理後には、gp120の能力は10倍より大きく低下し、これは、加水分解のレベルに直接的に対応していた（図５を参照されたし）。Lay2-処理gp120の電気泳動および銀染色は、蛋白質の約85％が消化されていることを示した。gp120なしの対照Lay2は神経毒性作用を示さなかった。

Lay２を、HIV-１感染力を阻害するその能力についてアッセイした。無血清条件下において、この触媒性L鎖で前処理すると、細胞変性作用（シンシチウム形成）用の顕微鏡観察、および２，３-ビス（２-メトキシ-４-ニトロ-５-スルホフェニル）５-［(フェニルアミノ)-２H-テトラゾリウムヒドロオキシドを用いた微小培養テトラゾリウム（MTA）アッセイによって測定されるごとく、HIV-１（IIIB）によるMT-２細胞、T-細胞系の感染が実際に阻害された（図６を参照されたし）。この実験における感染多重度（MOI）は３．２であった。より低いMOI値では、L鎖はなおより良好な活性を示すようである。HIV-１不存在下で細胞をL鎖で処理すると、細胞変性作用を生じなかった。これらの結果は、L鎖が天然gp120を認識し、かつそれを切断し得ることを示している。

実施例ＩＩ
組換えLay2 V_Lの調製
以前に言及したごとく、Lay２と命名したヒト・ベンス・ジョーンズ蛋白質はUniversity of TennesseeのDr．Solomonから寄贈頂いたものであって、それは、死亡した患者から採取されたものである。触媒の補充可能な供給に対する要望は、細菌発現系でLay2の組換え形を構築することによって合致した。このことは、改善された触媒特性を有するLay2の誘導体を設計し得ると期待される。

血管作用性小腸ペプチドに対して活性を有する触媒性L鎖の首尾よいクローニングおよび単離が、（すべて出展明示して本発明の一部とみなす）米国特許第5，229，272号に記載されている。
Lay2 L-鎖の可変ドメインの配列は、Dr．Solomonの研究室で以前に決定されている。V-エクソンコード部分は、６のポジションでヒトII L-鎖ファミリーをコードする３種の生殖系列遺伝子（Ol1-01）のうちの１種のものから変化している（Klein，R．ら、Eur．J．Immunol．23：3248-3271（1993））。恐らくは体細胞突然変異を反映しているこれらの相違のうちの１つは、CDRポジションを含んでいる。CDR3中のポジション92に、Lay2はIleの代わりにLeu残基を有する。Lay2蛋白質と生殖系列遺伝子Ol1-01との間の残りの５つの相違には、CDRセグメントから離れたFRサイトが含まれ；Lay2は、知られていない意味を有する７番目の変化を表すさらなる残基Gluをもポジション０に有している。Lay2配列とOl1-01生殖系列配列とが同様なことは、それが、この生殖系列遺伝子由来の他のV_Lドメインがgp120に結合し、それを加水分解する能力を反映し得る点で注目される。

Lay2 V_Lドメイン蛋白質をコードするｃDNAは反復性PCRによって合成した（図７を参照されたし）。蛋白質の完全に機能的な組換え形は以下に記載するごとく発現させ得る。これらの方法は以前に用いられて、ヒト可変ドメインをコードする遺伝子が首尾よく構築されている（Wilkins-Stevens，P．ら、Prot．Science 4：421-432（1995））。簡単には、V_LドメインｃDNAの構築には、反復性PCRを用いて（Prodromou，C．ら、Prot．Eng．5：827-829（1992））、V_Lドメイン全体に広がるコドンを供する８つの重複する合成オリゴヌクレオチド、N-末端シグナル配列、およびSfiIおよびNotI制限部位を含むフランキング配列を連結させて、発現ベクターへの挿入を可能ならしめることが含まれる。該ｃDNAはFvを構築するのに用いる短鎖C-末端リンカーセグメントも含まれる。

実施例ＩＩＩ
AIDSおよびSLE患者からのgp120触媒性抗体の単離、ならびにその組替体作製
前のセクションで説明したL鎖は、多発性骨髄腫患者のランダムスクリーニングによって単離した。狼そうのような自己免疫疾患においては高レベルで触媒性抗体が形成されることは知られており、gp120結合性抗体はSLE患者において見出されている。この知見により、我々は、gp120に対する触媒性抗体の存在性についてHIV-１陽性患者および狼そう患者の血清を分析することを思い立った。

AIDS患者およびSLE患者の血清（〜0．5ml）から精製したIgG画分は、50mM のトリス-HCl、ｐH7．5、0．002％のアジ化ナトリウム中のDEAE-セルロースクロマトグラフィー（DE52 マトリックス、Whatman社製）またはプロテインG-Sepharose（Pharmacia社製）によって精製した。IgG画分は、DEAE-セルロースカラムからの非結合物質として、およびプロテインGカラムからの酸溶出蛋白質として得た。溶出は100ｍMのグリシン、ｐH2．7を用い、つづいて、１Mのトリス塩基、ｐH9．0でその溶液を中和することによって行った。IgG調製物は少量の遊離L鎖を含むことが知られているため、DEAE-セルロース精製IgGを、50ｍMのトリス-HCl、100mMのグリシン、150mMのNaCl、0．025％のTween-20、0．02％のアジ化ナトリウム、ｐH7．5中の高速ゲル濾過カラム（Superose-12、Pharmacia社製）上のクロマトグラフィー（流速0．5ml／分；画分容積0．5ml）にさらに付した。DEAE-セルロース精製IgG中に存在するL鎖は、既知分子量を有する標準蛋白質を用いたカラム較正に基づいて、分子量25ｋDに溶出される画分として同定された。蛋白質濃度は、280nmの紫外線吸光度を測定することによって得た（0．8mg／ml蛋白質溶液は、１cm光路長のキュベットを用いて280nmで1．0の吸光度の読みとなる）。gp120切断物は、前のセクションで説明したごときSDS-電気泳動およびオートラジオグラフィーによって測定した。

前記の血清はポリクローナルである。個々のL鎖の分離は二次元ゲル元電気泳動を用い、つづいて単一のL鎖の電気溶出を用いて行い得る。モノマーL鎖が単離されたら、アミノ末端ペプチド配列決定を行って、クローニング目的用の特異的なオリゴヌクレオチドを生成する。

図８は、3７℃にて18時間、¹²⁵Ｉ-gp120（2ｎM）とSLE患者（研究所コード番号530）からのプロテインG-Sepharose精製したIgG（3μM）とのインキュベートが約110kDのスメアに対応するgp120の切断産物の出現を生じ、かつ分子量37ｋD、24ｋDおよび10ｋDのバンドを分離することを示している。完全なgp120は120ｋDのバンドとして明らかにされた。110kDのスメアは、ポリペプチドの混合物であるか、あるいはそれは、完全なgp120に分子量が接近しすぎていてこの実験に適用した実験方法によってはきれいに分離することができない単一産物であるかもしれない。

図９は、37℃にて17時間、¹²⁵Ｉ-gp120（２nM）とHIV-陽性患者（研究所コード番号005）から精製したL鎖とをインキュベートすると、90ｋD、25ｋD、12kD、および＜10kDに相当するgp120の切断産物が生じることを示している。HIV陰性対照からの同様なL鎖画分は、gp120切断活性を示さなかった。この実験のゲル濾過に使用したもののように、IgG調製物中のL鎖の濃度が非常に低いことは知られている。SDS-電気泳動および銀染色は、このIgG画分中のL鎖濃度が＜１．５％であったことを示した。したがって、触媒として用いたL鎖の比活性（gp120の％切断物／蛋白質濃度）は、前のセクションで説明したLay2触媒性抗体L鎖の比活性よりも少なくとも112倍大きいと算出することができる。

これらの知見は、gp120切断活性を有するL鎖の合成がHIV-1およびSLEに冒された患者の免疫応答のかなり一般的な因子であり得ることを示している。L鎖の補充可能な供給は、Gaoら、Antibody Engineering Protocols，pp51：286-291，S．Paul編、Humana Press社、Totowa，NJ（1995）に記載されているごとく、喘息患者からのVIP切断性L鎖が首尾よく単離された技術を用いて、前記に引用した患者の免疫レパートリーをクローニングすることによって得ることができる。

希薄な抗体は、遺伝子III融合蛋白質としてその表面に組換え抗体フラグメントを提示するファージ粒子のリガンド-特異的アフィニティークロマトグラフィーによって迅速に単離することができる。V L-鎖ファージ提示ライブラリーは、喘息患者の末梢血液リンパ球から調製されている（Tyutyulkova，S．ら、Appl．Biochem．Biotech．47：191-198（1994）；Tyutyulkova，S．ら、Antibody Engineering Protocols，pp5121：377-394、S．Paul編、Humana Press社、Totowa，NJ（1995））。これらの実験においては、VIP結合活性を有するファージ粒子は、固定化VIP上のアフィニティークロマトグラフィーによって濃縮（enrich）した。2種のVIP結合L鎖をエシェリキア・コリ（Ｅ．coli）中で可溶性形態で発現させ、cDNA配列決定によってその一次構造を推定し、金属錯体化（metal chelating）および蛋白質L-アフィニティークロマトグラフィーによって、電気泳動で均一になるまでその蛋白質を精製した。

L鎖の蛋白質加水分解活性は、（Tyr10-¹²⁵I）VIP基質を用いて測定した。組換えL鎖の濃度が上昇するにしたがって、VIP加水分解の線形の上昇が明らかとなった。両方のL鎖についての反応は、基質濃度に対する飽和動力学を示した。基質としてVIPを用いた動力学的効率（kinetic efficiency）（ｋcat／Km）は、非常によく明らかにされているプロテアーゼであるトリプシンのものよりも良好か、またはそれに匹敵していた。L鎖は、非特異的なプロテアーゼ基質であるレソルフィン（resorufin）の切断は触媒しなかった。モノマー形態のL-鎖はVIPの加水分解に寄与し、このことは、ゲル濾過カラムからの〜26kDに活性が溶出されることによって示された。

同様の方法を、前記のHIVおよびSLE患者のL鎖をクローン化し、発現させるために適用し得る。末梢血液リンパ球を採取し、逆転写酵素-PCR法によってL鎖ｃDNAを調製した。ついで、このPCR産物をファージミドベクターpCANTABhis６にクローン化し、これはファージ粒子の表面上にL鎖を提示することができ、または可溶性蛋白質としてそれを発現することもできる。コンピテントなエシェリキア・コリ（E．coli）TG１細胞をファージミドDNAでエレクトロポレーションに付した後に、プロテイン３に融合したL鎖を提示するファージ粒子を、VCSM13ヘルパーファージで重感染することによって援助し、ポリエチレングリコールで沈殿させ、gp120-Sepharoseカラム上のアフィニティークロマトグラフィーに付した。クローンは、低ｐH溶出によって単離され、ラジオイムノアッセイおよび／またはELISAによってgp120結合性について試験する。該クローンをエシェリキア・コリ（E．coli)細胞中で増殖させ、その培養物をIPTG（１ｍM）で24時間誘導して、可溶性L鎖を上清に分泌させることができた。IPTGで誘導する時間を24時間から3時間まで短くすることによって、L鎖を周辺腔にも発現させることができる。

前に言及したごとく、基質を用いた免疫化に応答して触媒性抗体は合成される。抗体 L-鎖ライブラリーは、VIPで免疫化したマウスからクローン化した。ランダムに選抜したか、またはその抗原-結合活性に基づいて選抜したL-鎖クローンの蛋白質加水分解活性を測定した。選抜は、固定化VIP上のファージのクロマトグラフィーによって行った。（Tyr10-¹²⁵Ｉ）VIPおよび一般的なプロテアーゼ基質（ペプチド-メチルクマリンアミド）を加水分解することができる潜在的な触媒を単離した。そのVIP-結合活性に基づいて選抜したクローンは、１-２桁の大きさの改善された触媒を示した。触媒活性における上昇は、VIP-結合親和性が上昇したことに起因していた。基質としてVIPを用いた代謝回転数は、0．1-２．２／分の範囲であった。10ｎMの蛋白質でアッセイした１５６のランダムに選抜したクローンからのほぼ20％の精製L鎖が、基質として合成ペプチドを用いて触媒活性を示した。１２種のL-鎖クローンの可変領域が配列決定され、触媒活性に関連する共通配列および散在的（spacial）モチーフが現在調べられている。これらの知見は、天然の抗体L-鎖レパートリーによる頻繁な触媒、およびポリペプチドを用いた免疫化による抗原-特異的な触媒活性の発生を示している。このことは、免疫原に対する高親和性の成熟の間の生殖系列活性および維持としての可変領域配列の多様性またはその遺伝に起因する、触媒活性のデ・ノボ（de novo）発生によって起こり得る。
HIV-１の感染は、全身的な免疫応答を誘導する。VIP L鎖クローニング用の本明細書に記載した方法を用いて前記の患者のリンパ球からのL-鎖ライブラリーのクローニングは、抗-gp120加水分解性抗体L-鎖の補充可能な供給を単離することにも首尾よくいくことも明らかになるであろう。

実施例IV
本発明のgp120加水分解L鎖を用いた患者の治療
触媒性抗-gp120 L鎖抗体は、適当な医薬賦形剤中で患者に投与して、体内の可溶性gp120抗原のレベルを低下させることができる。
静脈内投与用のイムノグロブリン（IVIG）の臨床的な使用は詳細に概説されている（例えば、Dietrichら、Blood 79：2946-51（1992）；Rossiら、Immunol．Rev．110：135-149（1989）；Dwyer，J．M．、New Eng．J．Med．326：107-16（1992）；Schwartz，S．A．、J．Clin．Immunol．10：81（1990）を参照されたし）。

本発明の精製gp120加水分解性L鎖は、ｉ．ｖ．によって患者に投与して、体内のHIV-1および可溶性gp120のレベルを低下させることができる。投与量は、患者中のウイルス負荷（burden）に従って調整され、ウイルス負荷の１／１００ないし化学量論レベル（１：１）の範囲とし得る。L鎖は触媒性であるため、ウイルス中和には実質的により低い用量を必要とし得る。0．25-1ｇ／ｋｇ体重の範囲のIgGの投与量が安全であることが知られている。効率は、ELISAによって処理の前後の可溶性gp120のレベルを分析することによって測定する。

別法として、本発明の抗-gp120加水分解性抗体は、AIDS関連痴呆に冒された患者の脳に直接投与することもできる。脳への治療剤のデリバリーは、文献に記載されている（例えば、Harbaugh，R．E．、Biomed．Pharmacother．43：483-485（1989）；Johnsonら、J．Neurosurg．70：240-248（1989）；Giannone，L．ら、J．Clin．Oncol．4：68-73（1986）を参照されたし）。

gp120加水分解性軽鎖は、カニューレを介して脳室に直接デリバリーするか、または、別法として、トランスフェリン分子にコンジュゲートして、i．v．を介してデリバリーすることもできる。融合蛋白質の構築は当該技術分野でよく知られている。本発明の触媒性L鎖をコードする遺伝子配列を、トランスフェリンをコードする遺伝子配列に作動可能に連結する。トランスフェリンは血液脳関門を通過し得ることが示されており、したがって、本発明のL鎖を脳に有効にデリバリーし得る（Shinら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92：2820-2824（1995））。

本発明のある種の好ましい具体例を説明し、それを特異的に上記に例示してきたが、本発明がかかる具体例に限定されることを意図するものではない。それらには、特許請求の範囲に記載のごとく、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく種々の変形を施し得る。

図１は、還元条件（Ａ）および非還元条件（B）下で泳動させたベンス・ジョーンズ蛋白質およびそれらのV_Lドメインの銀染色ゲルである。図２Aは、37℃にて６時間、Lay2-L鎖と共にインキュベートした放射性同位元素標識gp120の加水分解を図示しているオートラジオグラムである。図２Bは、Lay2 L鎖による非標識gp120の加水分解を図示している銀染色SDS-PAGEゲルである。図３は、上昇する濃度のLay2 L鎖存在下の放射性同位元素標識gp120基質の進行的な枯渇（depletion）を示しているグラフである。図４は、放射性同位元素標識gp120のLay2 L鎖触媒加水分解のｐH依存性を図示しているグラフである。図５は、Lay2 L鎖処理後のニューロン細胞に対するgp120の神経毒性の低下を示しているグラフである。図６は、Lay2 L鎖で前処理することによるHIV-１感染力の阻害を図示しているグラフである。図７は、反復性（recursive）PCRによって合成したLay2 V_LドメインをコードするｃDNAのサイズを示しているゲルである。図８は、SLE患者から単離したL鎖による放射性同位元素標識gp120の加水分解を示しているオートラジオグラムである。図９は、HIV患者から単離したL鎖による放射性同位元素標識gp120の加水分解を示しているオートラジオグラムである。

Claims

ａ）HIVに感染したヒトの末梢血液リンパ球からｍRNAを単離し；
ｂ）逆転写酵素-PCRを用いて該ｍRNAからｃDNAを生成し；
ｃ）適当な制限部位を用いて該ｃDNAをベクターにインサートし；
ｄ）cDNA配列が発現し、かつ、組換え蛋白質がファージ表面に提示されるように、該ベクターをファージに導入し；
ｅ）カラムクロマトグラフィーを介して、該抗-gp120触媒活性を発現しているファージ粒子を単離し；
ｆ）該gp120触媒活性を発現している該ファージでエシェリキア・コリ（Escherichia coli）を形質転換し；ついで、
ｇ）該形質転換エシェリキア・コリ（E．coli）細胞から該抗-gp120触媒性抗体を精製することを含むことを特徴とする、HIVに感染したヒトの血清またはSLE患者から触媒性抗-gp120抗体を産生する方法。
HIV-1陽性患者を治療するための薬物の調製における、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）の糖蛋白質120（gp120）中のペプチド結合の切断を触媒する単離されたヒト触媒性抗体であって、該抗体がHIVに感染したヒトの血清またはSLE患者から得られる該抗体もしくはIgGである該抗体または該抗体をコードする核酸を用いて組換え的に作製したFvの使用であって、ここに該Fvを含む薬物の調製が
ａ）該Fvをコードする遺伝子配列とトランスフェリンをコードする遺伝子配列とを作動可能に連結し；
ｂ）融合蛋白質が合成されるように、該作動可能に連結した遺伝子配列で細胞を形質転換し；
ｃ）該融合蛋白質を精製し；ついで、
ｄ）患者に投与するための該融合蛋白質を適当な医薬担体中に含む薬物を調製することを含む該使用。
（１）ａ）120ｋＤよりも小さな該gp120の切断産物の生成によってアッセイされるごとく、ヒト触媒性抗体の存在についてヒト血清試料をスクリーニングし；ついで、
ｂ）該抗体を精製する工程を含み、ここに該血清試料がHIV-1に感染した患者またはSLE患者からのものであることを特徴とする、gp120の切断を触媒するヒト触媒性抗体を単離する方法；
（２）さらに、
ｃ）該ヒト触媒性抗体の遺伝子配列を決定し；
ｄ）該ヒト触媒性抗体をコードする該配列を細胞にインサートし；ついで、
ｅ）該細胞において該抗体を発現させる
工程を含むことを特徴とする前記の方法；および
（３）請求項１記載の方法；
よりなる群から選択されるいずれか１つの方法であって、該抗体がIgGである該方法。