FI121339B - Geneettisesti muunnetut hiiret ihmisen vasta-aineiden tuottamiseen, ja menetelmät niiden valmistamiseksi - Google Patents

Geneettisesti muunnetut hiiret ihmisen vasta-aineiden tuottamiseen, ja menetelmät niiden valmistamiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI121339B
FI121339B FI950277A FI950277A FI121339B FI 121339 B FI121339 B FI 121339B FI 950277 A FI950277 A FI 950277A FI 950277 A FI950277 A FI 950277A FI 121339 B FI121339 B FI 121339B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
locus
chain locus
human
heavy chain
human immunoglobulin
Prior art date
Application number
FI950277A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI950277A (fi
FI950277A0 (fi
Inventor
Raju Kucherlapati
Aya Jakobovits
Sue Klapholz
Daniel G Brenner
Daniel J Capon
Original Assignee
Amgen Fremont Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/031,801 external-priority patent/US6673986B1/en
Application filed by Amgen Fremont Inc filed Critical Amgen Fremont Inc
Publication of FI950277A0 publication Critical patent/FI950277A0/fi
Publication of FI950277A publication Critical patent/FI950277A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI121339B publication Critical patent/FI121339B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • C07K16/1282—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Clostridium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/248—IL-6
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2812—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C07K16/2854—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72 against selectins, e.g. CD62
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

Geneettisesti muunnetut hiiret ihmisen vasta-aineiden tuottamiseen, ja menetelmät niiden valmistamiseksi Tämä keksintö koskee ksenogeenisia, spesifisesti sitoutuvia 5 proteiineja elävässä hiiri-isännässä.
Kyky valmistaa siirtogeenisiä eläimiä on saatu aikaan siten, että on kyetty viljelemään hiiren alkion kantasoluja ja siirtämään geneettisiä muunnoksia näihin soluihin myöhempää siir-10 toa varten hiiren iturataan. On siis mahdollisuus modifioida endogeenisia geenejä eläinkantojen tuottamiseksi, jotka kykenevät valmistamaan uusia tuotteita, siirtämällä vieraita geenejä isäntään, erityisesti ihmisen geenejä ksenogeenisten si-toutumisproteiinien tuottamiseksi. Sellaisten geenien ilmen-15 täminen in vivo eläinkohteessa voi mahdollistaa geenitoiminnan tutkimisen, geenin ilmentymisen säätelyn, sen prosessoinnin, vasteen erilaisille aineille ja vastaavaa. Lisäksi voidaan tuottaa fenotyypiltään uusia eläimiä, mukaan lukien sellaiset, jotka jäljittelevät useita sairauksia. Kiinnostusta 20 on esimerkiksi saada aikaan dominoiva mutaatio tai täydentää resessiivistä mutaatiota. Kyseessä olevasta geenistä riippuen, vaikeus saada aikaan toivottu mutaatio vaihtelee suuresti. Vaikka jotkut geenikohteet ovat osoittautuneet verrattain mukautuviksi modifiointiin, toiset kohteet ovat osoit-25 tautuneet äärimmäisen resistenteiksi modifikaatioon.
Johtuen mahdollisuudesta luoda siirtogeenisiä eläimiä, kiinnostus uusien menetelmien aikaansaamiseen on huomattava, jotka lisäävät siirtogeenisten eläinten tuotannon onnistumista. 30 Varsinkin silloin, kun halutaan siirtää suuria DNA-fragment-teja, jotka käsittävät satoja kiloemäksiä (kb), on huomattava merkitys kyvyllä siirtää suuria fragmentteja intaktissa muodossa nisäkässoluihin, integraatiotehokkuudella, fragmentin sisältämän geenin (geenien) toimintakyvyllä ja siirtämisellä 35 ituradassa jälkeläisiin. Sellaiset suurten DNA-fragmenttien siirtomenetelmät mahdollistavat lisäksi meneillään olevassa ihmisen perimäprojektissa identifioitujen suurten DNA-frag-menttien toiminnan määrittämisen.
2
Erityisen kiinnostavaa on saada aikaan ksenogeenisia, spesifisesti sitoutuvia proteiineja, esimerkiksi ihmisen mono-klonaalisia vasta-aineita, pienissä laboratorioeläimissä 5 kuten hiirissä. Monoklonaalisilla vasta-aineilla on käyttöä sekä diagnostiikassa että terapiassa. Johtuen kyvystä tarttua määrättyyn epitooppiin, niitä voidaan ainutlaatuisesti käyttää molekyylien identifiointiin, jotka sisältävät kyseisen epitoopin, tai ne voidaan kohdistaan itsessään tai yhdessä 10 toisen osan kanssa määrättyyn kohteeseen diagnoosia tai hoitoa varten.
Monoklonaaliset vasta-aineet käsittävät raskas- ja kevytket-juja (H-ketju, 'heavy' ja L-ketju, 'light'), jotka liittyvät 15 yhteen määräten tarttumisalueen epitoopille. Kumpikin ketjuista sisältää vaihtelevan (muuntelevan, variaabelin) alueen ja muuttumattoman (vakioisen, konstantin) alueen. Muuttumat-tomattoman alueen aminohapposekvenssi on spesifinen tietyn isotyypin suhteen samoin kuin isännälle, joka vasta-aineen 20 muodostaa.
Johtuen yhteydestä muuttumattoman alueen sekvenssin ja lajin välillä, josta vasta-aine valmistuu, ksenogeenisen vasta-aineen joutuminen isännän verenkiertoon voi aiheuttaa immuuni-25 vasteen. Silloin kun ksenogeeninen vasta-aine viedään järjestelmään toistuvasti, kun kysymyksessä ovat krooniset sairaudet, on epäkäytännöllistä antaa vasta-ainetta, koska se tuhoutuu nopeasti ja voi vaikuttaa haitallisesti. Siitä johtuen on monesti yritetty saada aikaan syngeeninen tai allogeeninen 30 vasta-ainelähde. Yksi tekniikka on käsittänyt yhdistelmä-DNA-tekniikan käytön, jossa H- ja L-ketjujen geenit isännästä identifioitiin ja muuttumatonta aluetta koodittavat alueet eristettiin. Nämä alueet yhdistettiin sen jälkeen vaihtelevaa aluetta koodittavaan osaan muissa immunoglobuliinigeeneissä 35 toisista lajeista, jotka oli kohdistettu spesifiseen epitooppiin.
3
Vaikka tuloksena saatava kimeerinen, osittain ksenogeeninen vasta-aine on olennaisesti käyttökelpoisempi kuin käytettäessä täysin ksenogeenista vasta-ainetta, siihen liittyy silti joitakin haittoja. Vaihtelevien ja muuttumattomien alueiden 5 identifiointi, eristäminen ja yhdistäminen edellyttävät huo-mattavsti työtä. Yhden lajin muuttumattoman alueen liittäminen toisen lajin vaihtelevaan alueeseen voi lisäksi muuttaa vaihtelevien alueiden spesifisyyttä ja affiniteettia niin, että vaihtelevan alueen toivotut ominaisuudet menetetään. 10 Vaihtelevassa alueessa on myös lajispesifisiä runko- ja hy-pervariaabelisekvenssejä. Nämä runko- ja hypervariaabe-lisekvenssit voivat johtaa ei-toivottuihin antigeenivastei-siin.
15 Olisi sen vuoksi edullisempaa tuottaa allogeenisia vasta-aineita annettavaksi isännälle, immunisoimalla isäntä kiinnostuksen kohteena olevalla immunogeenilla. Kädellisillä, erityisesti ihmisillä, tämä lähestymistapa ei ole käytännöllinen. Tuotetut ihmisen vasta-aineet ovat pohjautuneet saata-20 villa olevan pernan satunnaiseen läsnäoloon isännästä, joka oli aikaisemmin immunisoitu kiinnostuksen kohteena olevalle epitoopille. Vaikka ihmisen perifeerisen veren lymfosyyttejä voidaan käyttää monoklonaalisten vasta-aineiden tuottamiseen, nämä eivät ole olleet erityisen onnistuneita fuusioissa ja 25 ovat tavallisesti johtaneet vain IgM:ään. Sen lisäksi on erityisen vaikeaa saada aikaan ihmisen vasta-ainevaste ihmisen proteiinia vastaan, haluttu kohde monissa terapeuttisissa ja diagnostisissa sovelluksissa. Sen vuoksi esiintyy huomattavaa kiinnostusta löytää vaihtoehtoisia reittejä allogeenis-30 ten vasta-aineiden tuottamiselle ihmisille.
Asiaan liittyvää kirjallisuutta 35 Thomas ja Capecchi (1987), Cell, _51_: 503—512 ja Roller ja Smithies (1989), Proc. Natl. Acad. Sei USA, 86:8932-8935 kuvailevat β2-mikroglobuliinin inaktivointia homologisen rekombinaation avulla alkiovaiheen kantasoluissa. Berman et 4 ai., (1988), EMBO J. 2:727-738 kuvailevat ihmisen Ig VH - lokusta. Burke et ai., (1987), Science, 236:806-812 kuvailevat hiivan keinotekoisen kromosomin sisältäviä vektoreita. Lähemmin myös, Garza et ai., (1989), Science, 246:641-646 ja 5 Brownstein et ai., (1989), Science, 244:1348-1351. Sakano et ai., kuvailevat immunoglobuliinin raskasketjugeenien monimuo-toisuusosaa julkaisussa Sakano et ad., (1981), Nature, 290:562-565. Tucker et ai., (1981), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 7_8.: 7684-7688 kuvailevat hiiren IgA:n raskasket jun geenin 10 sekvenssiä. Blankenstein ja Kruwinkel (1987), Eur. J. Immunol., 22:1351-1357 kuvailevat hiiren raskasketjun vaihtele-vaa aluetta. Lähemmin myös, Joyner et ai., (1989), Nature, 338:153-155, Traver et ai., (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82:5898-5902, Pachnis et ai., (1990), Proc. Natl. Acad. 15 Sei. USA, 82:5109-5113 ja PCT-hakemus PCT/US91/00245. Brugge-mann et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA; 8_6.: 6709-6713 (1989);
Behring Inst. Mitt. QJ_:21-2A (1990); Eur. J. Immunol.
22:1323-1326 (1991), kuvailevat monoklonaalisia vasta-ainei ta, jotka sisältävät ihmisen raskasketjuja. Albertsen et ai., 20 Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82:4256-4260 (1990), kuvailevat hiivan keinotekoisia kromosomeja sisältävän kirjaston konstruointia, jotka sisältävät ihmisen DNA-fragmentteja. Burke et ai., Science 236:806-812 (1987) kuvailevat hiivan keinotekoi sia kromosomeja sisältäviä vektoreita. Pavan et ai., Mol. and 25 Cell. Biol. 1_0 (8) : 4163-4169 (1990) kuvailevat neomysiinire- sistenssikasetin liittämistä hiivan keinotekoisten kromosomien ihmisperäiseen inserttiin käyttäen homologista rekombinaa-tiota ja siirtoa alkiovaiheen karsinoomasolulinjaan käyttäen polyetyleeniglykolivälitteistä sferoplastifuusiota. Pachnis 30 et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82*5109-5113 (1990) ja
Gnirke et ad., EMBO Journal 1_0 (7) : 1629-1634 (1991), kuvaile vat ihmisen DNA:ta sisältävän hiivan keinotekoisen kromosomin siirtämistä nisäkässoluihin. Eliceiri et ad., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 8_8.: 2179-2183 (1991), kuvailevat ihmisen gee- 35 nejä sisältävien hiivan keinotekoisten kromosomien ilmentämistä hiirisoluissa. Huxley et ad., Genomics 9_: 742-750 (1991) kuvailevat ihmisen HPRT-geenin sisältävien hiivan keinotekoisten kromosomien ilmentämistä hiirisoluissa. Mortensen et 5 ai., Mol. and Cell. Biol. 1_2 (5) : 2391-2395 (1992) kuvailevat G418:n korkeiden pitoisuuksien käyttämistä heterotsygoottisten alkiovaiheen kantasolujen kasvatukseen homotsygoottisten, mutaation kautta muutettujen solujen seulomiseksi. Hiivan 5 proplastien fuusiota hiiren fibroblastien kanssa kuvailevat Traver et ad., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86:5898-5902 (1989) ja Pachnis et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 8_7:5109-5113 (1990). Davies et ai., Nucl. Acids Res. 20; 2693-2698 (992) kuvailevat kohdennettuja muutoksia YAC:ssä.
10 Zachau, Biol. Chem. 371:1-6 (1990) kuvailee ihmisen immunog- lobuliinin kevytketjun (kappa) (IgK) lokusta; Matsuda et ai., Nature Genetics 3_:8-94 (1993) ja Shin et ai., EMBO J.
1_0:3641-3645 (1991) kuvailevat ihmisen immunoglobuliinin ras-kasketjun (IgH) lokuksen kloonausta YAC:ssä.
15
Ksenogeenisia spesifisesti sitoutuvia proteiineja valmistetaan elinkykyisessä hiiri-isännässä immunisoimalla isäntä sopivalla immunogeenilla.
20 Edulliselle hiiri-isännälle on tunnusomaista: (1) kyvyttömyys tuottaa endogeenista immunoglobuliinin raskasketjua; (2) olennainen kyvyttömyys tuottaa endogeenisia immunoglobuliinin kevytketjuja ja (3) kykenevyys tuottaa ksenogeenisia immunoglobuliinin kevyt- ja raskasketjuja ksenogeenisen immunoglo- 25 buliinin tai immunoglobuliinianalogin tuottamiseksi. Isännässä voi siten olla kokonainen immunoglobuliinilokus, joka on substituoitu osaksi tai kokonaan ksenogeenisella im-munoglobuliinilokuksella, tai sillä voi olla ksenogeeninen immunoglobuliinilokus liitettynä isäntäsolun kromosomiin ja 30 inaktivoitu immunoglobuliinialue. Nämä erilaiset vaihtoehdot saadaan aikaan ainakin osaksi käyttämällä homologista rekom-binaatiota inaktivaation ja korvaamisen suorittamiseksi immu-noglobuliinilokuksessa raskas- ja kevytketjujen osalta.
35 Keksintö koskee lisäksi uusia menetelmiä suurten, vähintään 100 kb:tä sisältävien ksenogeenisten DNA-osien liittämiseksi hiiri-isäntiin, toimittamalla hiivan keinotekoinen kromosomi (YAC), joka sisältää vähintään 100 kb:tä sisältävän ksenogee- 6 nisen DNA-osan, hiiren alkiovaiheen kantasoluun kantasolun genomiin integroitumista varten, kantasolujen valikoimiseksi, jotka sisältävät integroidun YAC:n YACrssä läsnäolevan mark-kerin avulla, YAC:n sisältävien ES-solujen siirtämiseksi 5 hiiren alkioihin ja kimeeristen hiirten synnyttämiseksi alkioista. Kimeeriset eläimet voidaan pariuttaa eläinten aikaansaamiseksi, jotka ovat YAC:n suhteen heterotsygootteja. Heterotsygoottiset eläimet voidaan pariuttaa integroidun YAC: n suhteen homotsygoottisten jälkeläisten synnyttämiseksi.
10
Kuvio 1 on diagrammi inaktivointivektorista hiiren raskasket-jun J-alueelle kuten esimerkissä I jäljempänä kuvaillaan.
Kuvio 2 on diagrammi DNA:n restriktiokartasta plasmidille 15 pmH5J ja kohdistetuille hiiren raskasketjun J-geeneille kuten esimerkissä II jäljempänä on kuvailtu.
Kuvio 3 on graafinen esitys vasta-aineen virtaussytometrias-ta, joka värjäytyy IgM-allotyyppien suhteen hiirikannoissa 20 kuten esimerkissä II jäljempänä on kuvailtu.
Kuvio 4 on vasta-aineen virtaussytometriahistogramini, joka värjäytyy IgM-allotyyppien suhteen hiirikannoissa kuten esimerkissä II jäljempänä on kuvailtu.
25
Kuvio 5 esittää diagrammia inaktivaatiovektorista hiiren im-munoglobuliinin kappa muuttumattoman alueen geeneille kuten esimerkissä III jäljempänä on kuvailtu.
30 Kuvio 6 on diagrammi plasmidin pK.TK/Neo konstruoinnista kuten esimerkissä III jäljempänä on kuvailtu.
Kuvio 7 on kevytketjun kohdistetun lokuksen restriktiokartan diagrammi kuten esimerkissä III jäljempänä on kuvailtu.
Kuvio 8 on diagrammi kohdentuvasta vektorista kappa-kevytket-jun J- ja vakioalueiden inaktivaatiolle ja kohdistuskokeen toteutusmalli kuten esimerkissä IV jäljempänä on kuvailtu.
35 5 7
Kuvio 9 on diagrammi vektoreiden konstruoinnista kappa-kevyt-ketjun J- ja vakioalueiden inaktivoimiseksi kuten esimerkissä IV jäljempänä on kuvailtu.
Kuvio 10 on diagrammi lopullisista deleetiovektoreista kappa-kevytketjun J- ja vakioalueiden inaktivoimiseksi kuten esimerkissä IV jäljempänä on kuvailtu.
10 Kuvio 11 kuvaa Southern-analyysiä soluista, joista on poistettu kevytketjun J- ja vakioalueet kuten esimerkissä IV jäljempänä on kuvailtu.
Kuvion 12 A-E esittävät valokuvia Southern blot -analyysin 15 tuloksista ES-klooneihin integroituneen yHPRT:n ja hiivan genomisen DNA:n karakterisoimiseksi kuten esimerkissä VI jäljempänä on kuvailtu, (A = ihmisen repetitiivinen Alu-sekvenssi; B,C = pBR322-spesifiset sekvenssit YAC:n oikeanpuoleiselle (B) ja vasemmanpuoleiselle (C) käsivarrelle; (D) 20 = hiivan repetitiivinen Ty-sekvenssi; (E) = hiivan yksikopi- oinen geeni LYS2. Alu- ja Ty-sekvensseillä tutkitun yHPRT:n lyhyemmät altistusajat (12 tuntia II:ssa verrattuna 48 tuntiin I:ssä) on myös esitetty. Molekyylipainomarkkereiden paikat on myös osoitettu. Kaaviot vektorin oikeanpuoleiselle (a) 25 ja vasemmanpuoleiselle (b) käsivarrelle ja pBR322-peräisten YAC-vektorifragmenttien paikat on esitetty ( = telomeeri; = hiivaperäiset sekvenssit; O = hiivan sentromeeri; = pBR322-peräiset sekvenssit; = ihmisen insertti; = EcoRI-kloonaus-kohta; H = HindiII-kohdat).
30
Kuvion 13 A-D ovat valokuvia in situ -hybridisaation tuloksista yHPRT:n ja hiivan genomisten sekvenssien integroitumisen ilmaisemiseksi ES-solun kromosomeihin kuten esimerkissä VI jäljempänä on kuvailtu (A, B = metafaasilevitteet ESY 8-7 35 -soluista hybridisoituneina ihmisen biotinyloituihin genomi-siin sekvensseihin ja C = metafaasilevitteet tai D = inter-faasitumat ESY 8-6 -soluista hybridisoituneina hiivan biotinyloituihin repetitiivisiin DNA-sekvensseihin).
8
Kuvio 14, A, B, C osoittaa yHPRT:n pysyvän retention ES-solun in vitro -erilaistumisen ja siirtymisen aikana hiiren ituradan läpi kuten esimerkissä VI jäljempänä on kuvailtu, (A: a, 5 b = alkiovaiheen rakkuloita; ja erilaistuneita solutyyppejä; c = verisaarekkeita; d = supistuva lihas; e = hermosoluja; f = neuraalisia tiehyitä ESY-kloonien muodostamina; B: Southern blot -analyysi DNA:sta, joka on uutettu erilaistuneesta ESY
5-2:sta, 3-6:sta, 8-5:stä ja 8-6:sta (20 pg) ja yHPRT:stä 10 AB1380:ssä (40 ng) käyttäen a = ihmisen Alu-koetin; b = hiivan Ty-sekvenssit; C = Southern blot -analyysi häntä-DNA:sta (20 pg) kahdesta agouti-jälkeläisestä (4-2 ja 4-3), jotka ovat peräisin kimeerisestä ESY-koiraasta 394/95-2, käyttäen a = ihmisen Alu ja b = Ty-sekvenssit; 8-6:n ja yHPRT:n lyhyem-15 mät altistukset (12 tuntia), Ty:n kanssa tutkittuna, on esitetty (II) .
Kuviot 15 A ja B esittävät valokuvaa elektroforeesigeelistä, joka osoittaa ihmisen HPRT-geenin ilmentymisen erilaisissa 20 hiirikudoksissa kuten esimerkissä I jäljempänä on kuvailtu (15 A = ihmisen HPRT mRNA:n ilmaiseminen käyttäen käänteis-transkriptio-PCR:ää ES-, ESY 3-1 - ja Hut 78 -soluissa, pernassa ja maksassa kontrollihiiristä tai ESY 4-3 agouti-jälkeläisissä; 15 B = hiiren γ-interferonireseptorin mRNA:n il-25 maiseminen RT-PCR:n avulla näytteissä kohdasta 15 A; M = kokomarkkeri).
Kuvio 16 on diagrammi ihmisen immunoglobuliinin raskasketju-kokuksesta ja ihmisen kevytketjun YAC-vaihtovektorista kuten 30 esimerkissä VII jäljempänä on kuvailtu.
Kuvio 17 on diagrammi hiiren risteytyskaaviosta kuten esimerkissä VIII jäljempänä on kuvailtu.
35 Kuvio 18 esittää joidenkin keksinnön mukaisilla menetelmillä tuotettujen isäntäeläinten genotyyppejä.
9
Keksintö koskee uusia siirtogeenisiä hiiri-isäntiä, jolloin isäntä kykenee saamaan aikaan immuunivasteen immunogeenille, jolloin vaste synnyttää vasta-aineita, jotka sisältävät ihmisen konstantteja (vakio-) ja variaabeleita alueita. "Siir-5 togeenisellä" tarkoitetaan hiirtä, joka sisältää geneettisesti muokatun modifikaation, erityisesti tämän keksinnön osalta, ihmisen immunoglobuliinigeenin siirtämisen sen kaikkiin soluihin. Isännille on tunnusomaista se, että ne kykenevät tuottamaan ksenogeenisia immunoglobuliineja tai niiden 10 analogeja seurauksena endogeenisen immunoglobuliinin alayksikköä koodittavan lokuksen inaktivaatiosta ja ihmisen DNA:n, esimerkiksi ihmisen immunoglobuliinia koodittavan DNA:n liittämisestä. Modifikaatiot voivat sisältää vähintään osan ihmisen konstanteista alueista, jotka vastaavat variaabelialueen 15 sitoutumiskohdan kokoonpanosta, joka on sitoutunut C-päässä toiminnalliseen peptidiin. Vasta-aineet voivat olla mitä tahansa isotyyppiä, esim., IgA, D, E, G tai M tai isotyypin sisäisiä alatyyppejä.
20 Ensimmäisessä toimintamallissa, yksittäisissä vaiheissa, kse-nogeeniset, so. ihmisen raskas- ja kevytketjujen immunoglo-buliinigeenit toimitetaan hiiri-isännän iturataan (esim. spermaan tai varhaismunasoluihin), ja erillisissä vaiheissa vastaavat isäntägeenit tehdään ei-funktionaalisiksi inakti-25 voimalla käyttäen homologista rekombinaatiota. Ihmisen raskas- ja kevytketjujen immunoglobuliinigeenit rekonstruoidaan sopivassa eukaryoottisessa tai prokaryoottisessa mikro-organismissa, ja tuloksena saatavat DNA-fragmentit voidaan toimittaa sopivaan hiiri-isäntään, esimerkiksi hiiren hedel-30 möittyneiden munasolujen esitumiin tai alkiovaiheen kantasoluihin. Isännän endogeenisten immunoglobuliinilokusten inaktivaatio saadaan aikaan sopivien lokusten kohdennetulla osittamisella homologisen rekombinaation avulla hiiri-isäntä-soluissa, erityisesti hiiren alkiovaiheen kantasoluissa tai 35 hiiren hedelmöittyneiden varhaismunasolujen esitumissa. Kohdennettu osiin jakaminen voi käsittää vaurion tai deleetion aiheuttamisen kohdelokukseen, tai deleetion kohdelokuksen sisällä, johon liittyy samalla insertion sijoittaminen lokuk- 10 seen, esimerkiksi valikoitavan markkerin liittäminen. Hiiren alkiovaiheen kantasolujen ollessa kysymyksessä muodostuu kimeerisiä hiiriä, jotka ovat osaksi peräisin modifioiduista hiiren alkiovaiheen kantasoluista ja kykenevät siirtämään ge-5 neettisiä modifikaatioita ituradan kautta. Ihmisestä siirrettyjä immunoglobuliinilokuksia sisältävien isäntien pariutta-minen kantojen kanssa, joiden endogeeniset lokukset on inaktivoitu, saa aikaan eläimiä, joiden vasta-ainetuotanto on täysin ksenogeenista, so. ihmisperäistä.
10
Toisessa, vaihtoehtoisessa toimintamallissa ainakin osia ihmisen raskas- ja kevytketjujen immunoglobuliinilokuksista käytetään suoraan korvaamaan vastaavia endogeenisia immunoglobuliinilokuksia homologisen rekombinaation avulla hiiren 15 alkiovaiheen kantasoluissa. Tästä seuraa endogeenisen immuno-globuliinin samanaikainen inaktivoituminen ja korvautuminen. Tätä seuraa kimeeristen hiirten synnyttäminen, joissa hiiren alkiovaiheen kantasoluista peräisin olevat solut voivat vaikuttaa iturataan.
20 Nämä toimintamallit perustuvat immunoglobuliiniketjulokusten tunnettuun rakenteeseen muutamissa eläimissä, koska rakennelma, yksittäisiä domeeneja koodittavien eksonien suhteellinen sijainti ja silmukointikohtien ja transkriptionaalisten ele-25 menttien sijainti tunnetaan vaihtelevassa määrin. Ihmisessä immunoglobuliinin raskasketjun (IgHhu) lokus sijaitsee kromosomissa 14. Transkription 5'-3'-suunnassa lokus käsittää suuren rypäleen variaabelialueen geenejä (VH) , diversiteetti (D) -alueen geenejä, joita seuraavat liitos (Jh) -alueen gee-30 nit ja konstantti (CH) -geenirypäle. Lokuksen koon arvioidaan olevan noin 1500 - noin 2500 kiloemästä (kb) . B-solujen kehittymisen aikana epäjatkuvat geeniosat ituradan IgH-lokuk-sesta asetetaan vierekkäin DNA:n fysikaalisen uudelleenjärjestelyn avulla. Jotta muodostuisi toiminnallinen raskasket-35 jun Ig-polypeptidi, kolme epäjatkuvaa DNA-osaa, VH-, D- ja JH-alueista on liitettävä yhteen määrätyssä järjestyksessä; ensin D —> JH:hon, sitten VH —> DJH:hon, jolloin muodostuu toiminnallinen VHDJH-yksikkö. Kun VHDJH on muodostettu, spesi- 11 fisiä raskasketjuja muodostetaan noudattamalla Ig-lokuksen transkriptiota, käyttämällä templaattina eksoneja ja introne-ja sisältävää spesifistä VHDJHCH-yksikköä.
5 Immunoglobuliinin kevytketjut (IgL) käsittävät kaksi lokusta, kappalokuksen ihmisen kromosomissa 2 ja lambda-lokuksen kromosomissa 22. IgL-lokusten rakenne vastaa IgH-lokuksen rakennetta, paitsi että D-alue puuttuu. IgH:n uudelleenjärjestelyn jälkeen kevytketjun lokuksen uudelleenjärjestely suoritetaan 10 vastaavalla tavalla kappa- ja lambdaketjujen VL —> JL-lii-toksen avulla. Sekä lambda- että kappalokusten koot ovat suunnilleen 1000 kb - 2000 kb. Uudelleenjärjestellyn IgH:n ja IgK- tai IgÄ-kevytketjujen ilmentäminen tietyssä B-solussa mahdollistaa vasta-ainemolekyylien muodostumisen.
15
IgHhu-lokuksen eristämiseksi, kloonaamiseksi ja siirtämiseksi voidaan käyttää hiivan keinotekoista kromosomia eli "YAC":tä. Ihmisen DNA:ta sisältävä YAC voidaan toimittaa hiiren ES-so-luihin tai hiiren oosyytteihin usealla menetelmällä, mukaan 20 lukien sferoplasti:ES-solu -fuusio, mikroruiskutus ja lipo-fektio. YAC integroituu sattumanvaraisesti (so. ei-homologi-sesti) hiiri-isännän genomiin. Jos hiivan sferoplasti:ES-solu -fuusiota käytetään ihmisen DNA:ta sisältävän YAC:n toimittamiseen hiiri-isännän ES-soluihin, silloin kaksi tai useampia 25 YAC:tä yhdessä hiivaisäntäsolussa voidaan toimittaa samanaikaisesti samaan hiiri-isännän ES-soluun. Tämän toimintatavan etu on se, että monta YAC:tä, joista jokainen sisältää ihmisen DNA:ta, esimerkiksi ihmisen raskas- ja kevytketjun immu-noglobuliinilokuksia, voidaan toimittaa yhteen kromosomiin 30 hiiri-isäntäsolussa. Tämä eliminoi tarpeen eläinten risteyttämiseksi, jotka sisältävät yksittäisiä Ig-geenejä, isännän synnyttämiseksi, joka kykenee tuottamaan täysin ihmisperäisiä immunoglobuliineja. Esimerkiksi hiivakanta, joka sisältää yhden YAC:n, kohdistetaan vektoriin kuten pLUTOroon (kuvailtu 35 jäljempänä) ihmisen valikoitavan markkerin kuten HPRT:n, ja hiivan valikoitavan markkerin kuten LYS2:n sisällyttämiseksi YAC:n käsivarteen. Kromosomaalista DNA:ta kohdennetusta kannasta käytetään sitten toisen, tavallisesti haploidisen, 12 lys2-mutanttihiivakannan transformointiin, joka sisältää toisen, erilaisen YAC:n. Lys+-pesäkkeitä analysoidaan sen jälkeen pulssikenttägeelielektroforeesin (PFGE) avulla mainitut kaksi YAC:ta sisältävien kloonien identifioimiseksi ja 5 sen varmistamiseksi, että niiden koko ei ole muuttunut. Transformaation avulla voidaan myöhemmin lisätä ylimääräisiä YAC-kromosomeja, erilaisten valikoitavien markkereiden kanssa, esimerkiksi APE2:n kanssa (jos isäntä on ade2-mutantti). YAC: n sisältävä hiivakanta kohdistetaan vaihtoehtoisesti 10 vektorin kuten pLUTO:n kanssa nisäkkään valikoitavan markke-rin (esim. HPRT:n) toimittamiseksi, kuten edellä, ja pariute-taan sen jälkeen toisen, YAC:n sisältävän kannan kanssa, joka on vastakkaista mating-tyyppiä. Kahden YAC:n läsnäolo varmistetaan sen jälkeen diploidisissa hiivasoluissa kuten edellä 15 on kuvailtu. Diploidista hiivakantaa käytetään suoraan fuusioon tai toteutetaan meioosi ja askosporogeneesi (sporulaatio) käyttäen tavanomaisia menetelmiä. Meioosituotteet seulotaan sen jälkeen kaksi YAC:ta sisältävän haploidisen kloonin identifioimiseksi. Jommallakummalla edellä kuvaillulla lähesty-20 mistavalla toinen YAC voidaan kohdistaa HPRT:n kanssa tai toisen valikoitavan markkerin kanssa ennen ensimmäisen YAC:n toimittamista. Niin ikään, jos kumpikin YAC sisältää erilaisen valikoitavan hiivamarkkerin, YAC:n säilyminen hiivan lisääntymisen aikana voidaan geneettisesti seuloa. Fuusio 25 hiiren ES-solujen kanssa suoritetaan sen jälkeen samalla tavalla kuin yhden YAC:n sisältävien hiivasolujen kanssa. Koska monet hiivakromosomit voivat integroitua yhdessä YAC:n kanssa, on odotettavissa, että huomattava osa ES-klooneista, jotka ilmentävät yhdessä YAC:ssä olevan valikoitavan markke-30 rin (esim. HATR-kloonit, jos YAC-markkeri on HPRT, ja hiiren ES-solut ovat HPRT”), on integroinut kummankin YAC:n. Menetelmiä kuten Southern-analyysi ja/tai PCR voidaan käyttää sellaisten kloonien identifiointiin, ja Southern-analyysiä, jossa käytetään pulssikenttägeelielektroforeesia, käytetään 35 karakterisoitaessa YAC:n integraation laajuus.
Kokonainen IgHhu-lokus voi sijaita yhdessä tai muutamassa YAC-kloonissa yhdessä nisäkäsmarkkerin kuten Neo:n, HPRT:n, 13 GPT:n, β-galrn jne. kanssa. Sama koskee Ig:n kevytketjun lokusta. Intaktin ituradan Ig-lokusten uudelleen kokoaminen homologisella rekombinaatiolla YAC:iden välillä, joiden homo-logia-alueet peittävät toisiaan, voidaan saada aikaan hiivas-5 sa. Tällä tavalla saadaan aikaan ihmisen Ig-ketjua kooditta-vien DNA-fragmenttien eristäminen. Koskematon ituratalokus voidaan vaihtoehtoisesti kloonata suoraan yhteen YAC:hen.
Jotta saataisiin aikaan laajaspektrisiä, affiniteetiltaan 10 korkeita vasta-aineita, ei ole välttämätöntä ottaa mukaan koko V-aluetta. Erilaiset V-alueen geeniperheet ovat sijoittuneet V-alueryhmittymän sisään ihmisillä. Aikaansaamalla siten alaryhmä, joka sisältää ihmisen raskas- ja kevytketju-jen Ig-lokusten tunnettuja V-aluegeenejä (Berman et ai., EMBO 15 J. (1988) 7;727-738) ennemmin kuin kokonainen V-aluekomple- mentti, siirtogeeninen hiiri-isäntä voidaan immunisoida ja siihen aiheuttaa voimakas immuunivaste ja tuottaa affiniteetiltaan korkeita vasta-aineita. Tällä tavalla voidaan käyttää verrattain pieniä kromosomin DNA-fragmentteja. Esimerkiksi 20 Ighu-lokuksen raportoitu 670 kb fragmentti sijaitsee Not I-
NotI-restriktiofraqmentissa, joka toimisi aikaansaaden useita V-alueita (Berman et ai., edellä). Lisääntynyt diversiteetti saadaan aikaan myös rekombinaatiolla erilaisten D- ja J-alueiden ja somaattisen mutaation yhteydessä.
25
Hiiri-isännän immunoglobuliinilokusten tekemiseksi ei-funk-tionaalisiksi voidaan käyttää homologista rekombinaatiota, jossa DNA:ta toimitetaan isännän endogeenisiin immunoglo-buliinin raskas- ja kevytketjun lokuksiin, mikä estää endo-30 geenisen immunoglobuliinin muodostumisen. Koska on olemassa kaksi raskasketjualleelia ja kaksi kevytketjulokusta, kappa ja lambda, käsittäen kumpikin kaksi alleelia, ja vaikka voidaan tehdä valinta välittämättä lambda-lokuksista, on suoritettava useita transformointeja, jotka johtavat kunkin allee-35 Iin inaktivaatioon. Homologista rekombinaatiota voidaan käyttää kunkin lokuksen toiminnalliseen inaktivointiin toimittamalla homologista DNA:ta rakenteen välityksellä, joka voi jakaa kohdelokuksen osiin tai poistaa sen, hiiren alkiovai- 14 heen kantasoluihin, jota seuraa modifioitujen solujen toimittaminen vastaanottaviin hiiren alkiorakkuloihin (blastokys-teihin). Myöhempi risteytys mahdollistaa inaktivoidun lokuk-sen siirtymisen ituradassa. Siksi voidaan valita heterotsy-5 goottisten jälkeläisten synnyttäminen ja seuloa homotsygoot-tiset jälkeläiset heterotsygoottisista vanhemmista.
Toisessa vaihtoehtoisessa, edellä kuvaillussa toimintamallissa vaiheiden lukumäärää voidaan vähentää toimittamalla ihmi-10 sen immunoglobuliinilokuksesta vähintään fragmentti homologiseen rekombinaatioon käytettävään rakenteeseen analogisen endogeenisen immunoglobuliinin kanssa niin, että ihmisen lo-kus korvaa ainakin osan isännän immunoglobuliinilokuksesta, josta seuraa isännän immunoglobuliinialayksikkölokuksen inak-15 tivoituminen. Erityisen kiinnostavaa on transformaation käyttö yksinkertaiseen inaktivointiin, jota seuraa heterotsygoottisten jälkeläisten risteyttäminen homotsygoottisten jälkeläisten tuottamiseksi. Silloin kun ihmisen lokusta käytetään korvaamiseen tai liittämiseen hiiri-isännän lokukseen 20 inaktivaatiota varten, transformaatioiden määrä voidaan rajoittaa kolmeen transformaatioon ja kuten jo on osoitettu, voidaan valita välittämättä vähemmän käytetystä lokuksesta ja rajoittaa transformaatiot kahteen transformaatioon. Vaihtoehtoisesti voidaan valita inaktivointi erillisenä vaiheena kun-25 kin lokuksen osalta käyttäen hiiren alkiovaiheen kantasoluja jälkeläistöstä, jossa aikaisemmin oli ollut yksi tai useampi lokus inaktivoituneena. Tapauksessa, jossa käytetään vain transformaatiota ja ihmisen lokus integroituu hiiri-isännän genomiin sattumanvaraisesti, voidaan tarvita kaikkiaan kah-30 deksan tai useampia transformaatioita.
Inaktivaatiota varten voidaan käyttää mitä tahansa vauriota kohdelokuksessa, josta seuraa kyseisen lokuksen immunoglobu-liinialayksikön ilmentymisen estyminen. Vaurio voi olla siten 35 alueella, joka sisältää tehostussekvenssejä, esim., 5'- tai 3'-tehostajia, tai intronin V-, J- tai C-alueilla, ja raskas-ketjun yhteydessä mahdollisuus piilee D-alueella, tai niiden yhdistelmissä. Tärkeä tekijä on se, että ituradan immunoglo- 15 buliinigeenin uudelleenjärjestely estyy, tai että endogeenis-ta immunoglobuliinia koodittavaa toiminnallista viestiä ei voida tuottaa johtuen joko transkription epäonnistumisesta, viestin prosessoinnin epäonnistumisesta tai vastaavasta ta-5 pahtumasta. Sellainen vaurio voi esiintyä deleetiomuotoisena kohdegeenissä, vieraan geenin insertiona, insertion ja delee-tion yhdistelmänä tai korvautumisena käytettäessä kse-nogeenisia sekvenssejä joko deleetion ohella tai ilman sitä endogeenisessa geenissä.
10
Kun kiinnostus kohdistuu immunoglobuliinialayksikkölokuksen inaktivointiin, vaurio aiheutetaan edullisesti immunoglobu-liinialayksikkölokuksessa sijaitsevaan yhteen tai useampaan eksoniin, esimerkiksi lokuksen konstantti- tai J-alueella. 15 Tuotetaan siis kohdentuva rakenne, josta puuttuvat toiminnalliset eksonit tältä alueelta, ja joka voi käsittää sekvenssejä J- ja/tai C-alueiden vieressä ja niiden ylä- ja/tai alapuolella, tai sisältää kokonaan tai osaksi alueen, jonka J-tai C-eksoneissa on inaktivoiva insertti. Insertti voi käsit-20 tää 50 emäsparia (bp) tai enemmän, jolloin sellainen insertti aiheuttaa osiin jakautumista toiminnallisen mRNA:n muodostumisessa. Tavoitteena on, että tavallisesti vähintään noin 75 % eksonisekvenssistä, edullisesti vähintään noin 90 % eksoni-sekvenssistä puuttuu.
25
Merkkigeeniä käytetään edullisesti kohdennettavassa rakenteessa korvaamaan puuttuvia sekvenssejä. Erilaisia markkerei-ta voidaan käyttää, erityisesti sellaisia, jotka mahdollistavat positiivisen valikoinnin. Erityisen kiinnostavaa on käyt-30 tää G418-resistenssiä, joka on seurausta neomysiinifosfo-transferaasin geenin ("neo") ilmentymisestä.
Kohdentuvassa rakenteessa kohdegeenin ylä- ja/tai alapuolella voi olla geeni, jonka avulla on mahdollista identifioida, 35 onko homologinen kaksinkertainen tekijäinvaihdunta tapahtunut (negatiivinen valikointi). Tähän tarkoitukseen voidaan käyttää herpes simplex -viruksen tymidiinikinaasin geeniä, koska solut, jotka ilmentävät tymidiinikinaasigeeniä, voidaan tuho- 16 ta käyttämällä nukleosidianalogeja kuten asikloviiriä tai gansikloviiriä niiden sytotoksisten vaikutusten kautta soluihin, jotka sisältävät HSV-tk:n (Mansour et ai., Nature 336:348-352 (1988)). Herkkyyden puuttuminen näille nukleo- 5 sidianalogeille osoittaa HSV-tymidiinikinaasigeenin poissaolon ja sen vuoksi silloin, kun kaksinkertainen rekombinaatio on tapahtunut, että myös kaksinkertainen tekijäinvaihdunta on tapahtunut.
10 Vaikka merkkigeenin läsnäolo genomissa osoittaa, että integraatio on tapahtunut, on silti välttämätöntä määrittää, onko homologista integroitumista tapahtunut. Tämä voidaan toteuttaa useilla tavoilla. Useimmissa tapauksissa käytetään DNA-analyysiä Southern-blottaus-hybridisaation avulla integraali tiopaikan osoittamiseksi. Käyttämällä koettimia insertille ja sekvenssejä 5'- ja 3'-alueilla, jotka vierustavat aluetta, jossa homologista integroitumista voisi tapahtua, voidaan osoittaa, että homologinen kohdentuminen on tapahtunut.
20 Myös PCR:ää voidaan käyttää edullisesti ilmaistaessa homologisen rekombinaation läsnäolo. PCR-alukkeita voidaan käyttää, jotka ovat komplementaarisia kohdennettavan rakenteen sekvenssin suhteen ja komplementaarisia rakenteen ulkopuolisen sekvenssin suhteen ja kohdelokuksessa. Tällä tavalla voidaan 25 saada aikaan vain DNA-molekyylejä, jotka sisältävät kummankin alukkeen, jotka ovat läsnä komplementaarisissa juosteissa, jos homologista rekombinaatiota on tapahtunut. Osoittamalla odotetunkokoiset fragmentit, esim. käyttäen Southern-blot-taus-analyysiä, homologisen rekombinaation esiintyminen var-30 mistetaan.
Kohdentuva rakenne voi sisältää lisäksi replikaatiosysteemin, joka on toiminnallinen hiiri-isäntäsolussa. Nämä replikaa-tiosysteemit käsittävät enimmäkseen virusten replikaatio-35 systeemejä, kuten Simian 40 -viruksen, Epstein-Barr-viruksen, polyoomaviruksen, papilloomaviruksen ja vastaavien virusten systeemejä. Erilaisia transkriptionaalisia aloitussysteemejä voidaan käyttää, joko viruksista tai nisäkäsgeeneistä, kuten 17 SV-40:n, metallotioneiini-I ja -ΙΙ-geeneistä, β- aktiinigeenistä, adenoviruksen aikaisista ja myöhäisistä geeneistä, fosfoglyseraattikinaasigeenistä, RNA-polymeraasi II -geenistä tai vastaavista lähteistä. Promoottoreiden li-5 säksi voidaan käyttää villityypin tehostajia merkkigeenin ilmentymisen lisäämiseksi edelleen.
Valmistettaessa kohdennettavia rakenteita homologista rekom-binaatiota varten, prokaryoottien, erityisesti E. colin rep-10 likaatiosysteemi voidaan sisällyttää kohdennettavan rakenteen valmistukseen, subkloonaamalla haluttu sekvenssi jokaisen manipuloinnin jälkeen, analysoiden restriktiokartoituksella tai sekvensoimalla, laajentamisella ja eristämisellä. Vaihto-toimintamallin ollessa kysymyksessä, kun ksenogeeninen DNA-15 insertti on suuri, ollen yleensä enemmän kuin noin 50 ki-loemäsparia, tavallisesti enemmän kuin 100 kbp, eikä tavallisesti enempää kuin noin 1000 kbp, hiivan keinotekoista kromosomia (YAC) voidaan käyttää kohdennettavan rakenteen kloonaukseen.
20
Kun kohdennettava rakenne on valmistettu ja epäedulliset sekvenssit, esim., prokaryoottiset sekvenssit poistettu, rakenne voidaan sitten toimittaa kohdesoluun, esimerkiksi hiiren ES-soluun. Mitä tahansa sopivaa tekniikkaa voidaan 25 käyttää DNA:n toimittamiseen kohdesoluihin. Menetelmiä ovat protoplastifuusio, esim. hiivan sferoplasti:solu -fuusio, lipofektio, elektroporaatio, kalsiumfosfaatti-välitteinen DNA:n siirto tai suora mikroruiskutus.
30 Kohdesolujen transformaation tai transfektion jälkeen koh-desolut voidaan valikoida positiivisten ja/tai negatiivisten markkereiden avulla, kuten edellä on kuvailtu, neomysiini-resistenssin ja asikloviiri- tai gansikloviiriresistenssin avulla. Ne, solut, joissa ilmentyy haluttu fenotyyppi, voi-35 daan jatkoanalysoida restriktioanalyysillä, elektroforeesilla, Southern-analyysillä, PCR:llä tai vastaavilla menetelmillä. Identifioimalla fragmentit, joissa esiintyy vaurio(itä) kohdelokuksessa, voidaan identifioida solut, joissa homolo- 18 gista rekombinaatiota on tapahtunut kohdelokuksen kopion inaktivoimiseksi.
Edellä kuvailtu prosessi voidaan suorittaa ensin raskasketju-5 lokuksen inaktivoimiseksi hiiren alkiovaiheen kantasolussa, jolloin solut mikroruiskutetaan hiiri-isännän alkiorakkuloi-hin, joista kehittyy kimeerinen eläin. Kimeeriset eläimet risteytetään, jotta saadaan heterotsygoottisia isäntiä. Sen jälkeen, risteyttämällä heterotsygoottiset isännät, voidaan 10 saada aikaan homotsygoottinen isäntä, tai hiiren alkiovaiheen kantasoluja voidaan eristää ja transformoida toisen IgH-lokuksen inaktivoimiseksi ja prosessi toistaa kunnes kaikki halutut lokukset on inaktivoitu. Kevytketjun lokus voi vaihtoehtoisesti olla ensimmäinen inaktivoitava lokus. Kevytket-15 jun immunoglobuliinin tuottokyvyn eliminoimiseksi kokonaan on edullista inaktivoida sekä lambda- että kappakevytketjuim-munoglobuliinilokukset. Ksenogeeniset lokukset voidaan toimittaa missä tahansa vaiheessa.
20 Kuten jo on esitetty, kohdelokus voidaan korvata analogisella ksenogeenisella, so. ihmisen lokuksella. Tällä tavalla kseno-geeninen lokus sijoitetaan olennaisesti samalle alueelle kuin analoginen isäntälokus niin, että lokuksen sijaintiin liittyvä säätely on olennaisesti sama ksenogeenisen immunoglobulii-25 nilokuksen osalta. Esimerkiksi, eristämällä ihmisen IgH-lokuksen variaabelialue (mukaan lukien V-, D- ja J-sekvenssit), tai sen osia, ja sijoittamalla ihmisen lokus hiirilokuksen sekvenssien viereen, edullisesti sekvenssien, jotka ovat isäntälokuksessa erillään vähintään noin 5 kbp:tä, 30 edullisesti vähintään noin 10 kbp:tä erillään isäntälokuksessa, ihmisen fragmentti voidaan liittää tähän alueeseen rekom-binaatiotapahtumassa (-tapahtumissa), korvaamalla isännän immunoglobuliinilokuksen endogeeninen variaabelialue ihmisen immunoglobuliinilokuksella. Tällä tavalla voidaan keskeyttää 35 isännän mahdollisuus tuottaa endogeenista immunoglobulii-nialayksikköä sallien samalla ihmisen immunoglobuliinilokuksen promoottorin aktivoitua isännän tehostajan vaikutuksesta ja tulevan säädellyksi isännän säätelysysteemillä.
19
Jotta saataisiin aikaan ksenogeenisten sitoutumisproteiinien tuotanto hiiri-isännässä, on välttämätöntä, että isäntä kykenee tuottamaan tarpeelliset entsyymit ja muut tekijät, jotka 5 tulevat kysymykseen vasta-ainetuotannossa, ja isännästä puuttuvat samalla toimivat endogeeniset geenit immunoglobuliinien raskas- ja kevytketjujen alayksikköjen ilmentämiseen. Ne entsyymit ja muut tekijät, jotka liittyvät ituradan uudelleenjärjestelyyn, silmukointiin, somaattiseen mutaatioon ja 10 vastaaviin toimintoihin, ovat siten toiminnallisia isännässä. Puuttuva osa on toiminnallinen luonnollinen alue, joka käsittää erilaisia eksoneja, jotka liittyvät endogeenisen immunog-lobuliinin tuotantoon.
15 Toimitetun ksenogeenisen, so. ihmisen DNA:n integroituminen voi olla sattumanvarainen tai homologinen riippuen kyseisestä käytettävästä toimintamallista. Käyttämällä transformaatiota, käyttäen toistettavia vaiheita tai yhdessä risteytyksen kanssa voidaan siten saada siirtogeenisiä hiiriä, jotka kykenevät 20 tuottamaan sitoutumisproteiineja kevyen tai raskaan endogeenisen immunoglobuliinin olennaisesti puuttuessa. Transformaatiolla tarkoitetaan mitä tahansa tekniikkaa DNA:n toimittamiseksi elinkykyiseen soluun, kuten konjugaatiota, PEG-välitteistä solufuusiota, transformaatiota, transfektiota, 25 transduktiota, elektroporaatiota, lipofektiota, biolistiikkaa tai vastaavia tekniikoita.
Sen jälkeen kun ksenogeeniset lokukset on toimitettu hiiri-isännän genomiin, joko homologisen rekombinaation tai sat-30 tumanvaraisen integraation avulla, ja hiiri-isäntiä on tuotettu, joiden endogeeniset immunoglobuliinilokukset on inaktivoitu risteyttämällä sopivasti erilaisia siirtogeenisiä hiiriä tai kimeerisistä hiiristä polveutuvia hiiriä, voidaan tuottaa isäntä, josta puuttuu natiivi kyky tuottaa endo-35 geenistä immunoglobuliinia, mutta jolla on kyky tuottaa kse-nogeenisia immunoglobuliineja, jotka sisältävät vähintään merkittävän osan ksenogeenisen lähteen valikoimasta.
20
Kahden kopion toiminnallinen inaktivointi kustakin kolmesta isännän Ig-lokuksesta (raskas, kappa ja lambda), jolloin isäntä sisältää ihmisen IgH:n lokuksen ja ihmisen Ig:n kappa-ja/tai lambdalokukset, mahdollistaisi puhtaasti ihmisen vas-5 ta-ainemolekyylien tuottamisen, ilman että tuotetaan isännän vasta-aineita tai isännän/kimeerisiä vasta-aineita. Sellainen isäntäkanta reagoisi immunisoitaessa spesifisillä antigeeneillä tuottamalla ihmisen spesifisiä vasta-aineita tuottavia hiiren B-soluja, jotka B-solut voitaisiin sulauttaa hiiren 10 myeloomasolujen kanssa tai tehdä jatkuvasti lisääntyviksi jollain muulla tavalla ihmisen monoklonaalisten vasta-aineiden tuottamiseksi pysyvästi jatkuvatoimisesti. Alalla tunnetaan hyvin menetelmiä monoklonaalisten vasta-aineiden jatkuvan pysyvän tuotannon aikaansaamiseksi.
15
Kohteena olevien menetelmien ja toimintamallien ei tarvitse olla rajattuja tuottamaan kokonaisia immunoglobuliineja vaan ne voivat antaa mahdollisuuden tuottaa alueita, jotka ovat yhdistyneet osaan konstantista alueesta, esim., CHi, CH2, CH3 20 tai CH4 tai niiden yhdistelmät. Vaihtoehtoisesti yksi tai useampi CH- ja CK- tai Cx-alueiden eksoneista voidaan korvata tai yhdistää sekvenssiin, joka koodittaa erilaista proteiinia kuten entsyymiä, esim., plasminogeenin aktivaattoria, super-oksididismutaasia, jne.; toksiinia, esim., risiiniä, abrii-25 nia, difteriatoksiinia jne.; kasvutekijää; sytotoksista ainetta, esim., TNF:ää; reseptorin ligandia tai vastaavaa proteiinia. Lähemmin esimerkiksi, WO 89/07142; WO 89/09344 ja WO 88/03559. Liittämällä kiinnostuksen kohteena oleva proteiini konstanttialueen eksoniin ja aikaansaamalla variaabelialueen 30 silmukoituminen modifioituun konstanttialueen eksoniin, tuloksena olevalla sitoutumisproteiinilla voi olla erilainen C-terminaalinen alue kuin immunoglobuliinilla. Toimittamalla lopetussekvenssi liitetyn geenin yhteyteen, proteiinituotteessa on inserttiproteiini C-terminaalisena alueena. Kons-35 tanttialue voidaan haluttaessa kokonaan korvata toisella proteiinilla tuottamalla rakenne, joka sisältää sopivat sil-mukointikohdat variaabelialueen yhdistämiseksi toiseen proteiiniin .
21
Immunoglobuliinia tai immunoglobuliinin analogia tuottavan siirtogeenisen hiiri-isännän B-soluja voidaan käyttää fuusioon hiiren myeloiseen soluun hybridoomien tuottamiseksi tai 5 tehdä jatkuvasti lisääntyviksi muulla tavanomaisella menetelmällä, esim., transfektiolla onkogeenien kanssa. Näitä immor-talisoituja soluja voidaan sitten kasvattaa jatkuvatoimisessa viljelmässä tai ne voidaan siirtää yhteensopivan isännän vatsakalvoon askiitesnesteen tuottamiseksi.
10 Tämä keksintö koskee ihmisen polyklonaalisen antiseerumin tai ihmisen monoklonaalisten vasta-aineiden tai vasta-aine-analogien tuottamista. Silloin kun hiiri-isäntä on immunisoitu immunogeenilla, tuloksena saatavat ihmisen vasta-ai-15 neet voidaan eristää muista proteiineista käyttäen affini-teettikolonnia, joka sisältää Fc:n sitoutumisosan kuten proteiini A:n tai vastaavan osan.
Hiiri-isännät voivat olla seuraavia (ks. myös kuvio 18): 20 I. Hiiret, jotka ovat heterotsygoottisia inaktiivisen endo-geenisen kevytketjuimmunoglobuliinigeenin suhteen (homotsy-goottisia eläimiä saadaan risteyttämällä); 25 II. Hiiret, jotka ovat heterotsygoottisia inaktiivisen endo-geenisen raskasketjuimmunoglobuliinigeenin suhteen (homotsy-goottisia eläimiä saadaan risteyttämällä); III. Hiiret, jotka ovat homotsygoottisia toiminnallisten 30 endogeenisten kevyt- ja raskasketjuimmunoglobuliinigeenien suhteen ja hemitsygoottisia (so. sisältäen yhden kopion) vieraiden, edullisesti ihmisen raskasketjuimmunoglobuliinigeenien suhteen (homotsygoottisia eläimiä saadaan risteyttämällä) ; 35 IV. Hiiret, jotka ovat homotsygoottisia toiminnallisten endogeenisten kevyt- ja raskasketjun immunoglobuliinigeenien suhteen ja hemitsygoottisia vieraan, edullisesti ihmisen ke- 22 vytketjun immunoglobuliinigeenien suhteen (homotsygoottisia eläimiä saadaan risteyttämällä); V. Hiiret, jotka ovat heterotsygoottisia inaktiivisten endo-5 geenisten raskas- ja kevytketjun immunoglobuliinigeenien suhteen, jotka on saatu risteyttämällä ryhmän I eläimiä ryhmään II kuuluvien eläinten kanssa (homotsygoottisia eläimiä saadaan risteyttämällä); 10 VI. Hiiret, jotka ovat heterotsygoottisia inaktiivisten endo-geenisten raskas- ja kevytketjun immunoglobuliinigeenien suhteen ja hemitsygoottisia vieraiden, edullisesti ihmisen raskasketjun immunoglobuliinigeenien suhteen, jotka on saatu risteyttämällä ryhmän III eläimiä ryhmään V kuuluvien eläin-15 ten kanssa (eläimiä, jotka ovat homotsygoottisia inaktiivisten endogeenisten lokusten suhteen ja homo- tai hemitsygoottisia vieraan geenin suhteen, saadaan risteyttämällä); VII. Hiiret, jotka ovat heterotsygoottisia inaktiivisten 20 endogeenisten raskas- ja kevytketjun immunoglobuliinigeenien suhteen ja hemitsygoottisia vieraiden, edullisesti ihmisen kevytketjun immunoglobuliinigeenien suhteen, jotka on saatu risteyttämällä ryhmän IV eläimiä ryhmään V kuuluvien eläinten kanssa (eläimiä, jotka ovat homotsygoottisia inaktiivisten 25 endogeenisten lokusten suhteen ja homo- tai hemitsygoottisia vieraan geenin suhteen, saadaan risteyttämällä); VIII. Hiiret, jotka ovat homotsygoottisia tai heterotsygoottisia inaktiivisten endogeenisten raskas- ja kevytketjun 30 immunoglobuliinigeenien suhteen ja hemitsygoottisia vieraiden, edullisesti ihmisen raskasketjun immunoglobuliinigeenien suhteen, jotka on saatu risteyttämällä ryhmän VI ja VII eläimiä keskenään (eläimiä, jotka ovat homotsygoottisia inaktiivisten endogeenisten lokusten suhteen ja homo- tai hemitsy-35 goottisia vieraan geenin suhteen, saadaan risteyttämällä);
Ryhmään VIII kuuluvia homotsygoottisia hiiriä voidaan käyttää ihmisen vasta-ainetuotantoon.
23 IX. Hiiret, jotka ovat homotsygoottisia toiminnallisten endo-geenisten raskas- ja kevytketjun immunoglobuliinigeenien suhteen ja hemitsygoottisia vieraiden, edullisesti ihmisen 5 kevyt- ja raskasketjun immunoglobuliinigeenien suhteen, jotka on saatu risteyttämällä ryhmiin III ja IV kuuluvia eläimiä keskenään (homotsygoottisia eläimiä saadaan risteyttämällä); X. Hiiret, jotka ovat heterotsygoottisia inaktiivisen endo- 10 geenisen raskasketjun immunoglobuliinigeenin suhteen ja hemitsygoottisia vieraiden, edullisesti ihmisen raskas- ja kevyt-ketjun immunoglobuliinigeenien suhteen, jotka on saatu risteyttämällä ryhmän II eläimiä ryhmään IX kuuluvien eläinten kanssa (eläimiä, jotka ovat homotsygoottisia inaktiivisten 15 endogeenisten lokusten suhteen ja homo- tai hemitsygoottisia vieraan geenin suhteen, saadaan risteyttämällä); XI. Hiiret, jotka ovat heterotsygoottisia inaktiivisen endo-geenisen kevytketjun immunoglobuliinigeenin suhteen ja hemi- 20 tsygoottisia vieraiden, edullisesti ihmisen raskas- ja kevyt-ketjun immunoglobuliinigeenien suhteen, jotka on saatu risteyttämällä ryhmän I eläimiä ryhmään IX kuuluvien eläinten kanssa (eläimiä, jotka ovat homotsygoottisia inaktiivisten endogeenisten lokusten suhteen ja homo- tai hemitsygoottisia 25 vieraan geenin suhteen, saadaan risteyttämällä);
Suurten, yhtenäisten, ksenogeenisten DNA-sekvenssien toimittamiseksi hiiri-isäntään sekvenssit käsittävät tavallisesti vähintään 100 kb:tä, tavallisemmin vähintään noin 200 kb:tä, 30 yleensä alueella noin 200-1000 kb:tä. Voidaan siis toivoa, että siirtymisen kohteena ovat kiinnostuksen kohteena oleva lokus kuten immunoglobuliinilokus; ksenogeenisen, so. ihmisen kromosomin alueet, jotka voivat sisältää yhden tai useamman kiinnostuksen kohteena olevan geenin, jotka on ehkä tai ei 35 ole karakterisoitu, kuten pienitiheyksisen lipoproteiinin (LDL) reseptorin, apolipoproteiini (Apo) B:n apo E:n, kysti-sen fibroosin transmembraanisen konduktanssin säätelijän, dystrofiinin geenit, tai ksenogeenisen kromosomin alueet, 24 jotka voivat olla osallisina osittaisessa kromosomitrisomias-sa (esim. kromosomit 21, 7 ja 10); ja virukset.
Keksintö koskee menetelmää hiiren alkiovaiheen kantasolun 5 (ES) tuottamiseksi, joka sisältää ainakin osan ihmisen immu-noglobuliinin raskasketjun lokusta ja ainakin osan ihmisen immunoglobuliinin kevytketjun lokusta, jotka on integroitu pysyvästi kyseisen hiiren alkiovaiheen kantasolun genomiin, jolloin mainittu ihmisen immunoglobuliinin raskasketjun lo-10 kuksen osa on riittävä koodaamaan ihmisen immunoglobuliinin raskasketjua ja mainittu ihmisen immunoglobuliinin kevytketjun lokuksen osa on riittävä koodaamaan ihmisen immunoglobuliinin kevytketjua, jossa menetelmässä (a) mainittuja hiiren alkiovaiheen kantasoluja ja hiiva-15 sferoplasteja yhdistetään fuusio-olosuhteissa, jolloin hiiva- sferoplastit sisältävät yhtä tai useampaa hiivan keinotekoista kromosomia (YAC), joka käsittää mainitun ihmisen immunoglobuliinin raskasketjun lokuksen osan, ja mainitun ihmisen immunoglobuliinin kevytketjun lokuksen osan, jolloin mainitut 20 YAC:t sisältävät geenin, joka koodaa valikoitavaa markkeria, jolloin mainitut ihmisen immunoglobuliinilokusten osat integroituvat pysyvästi mainittujen alkiovaiheen kantasolujen genomiin; ja (b) alkiovaiheen kantasolut, joiden genomi sisältää 25 mainitut ihmisen immunoglobuliinin lokukset, valikoidaan mainitun markkerin tai markkerien avulla.
Keksintö koskee myös hiiren alkiovaiheen kantasolua (ES) , joka sisältää ainakin osan ihmisen immunoglobuliinin raskas-30 ketjun lokusta ja ainakin osan ihmisen immunoglobuliinin kevytketjun lokusta, jotka on integroitu pysyvästi sen genomiin, jolloin mainittu ihmisen immunoglobuliinin raskasketjun lokuksen osa on riittävä koodaamaan ihmisen immunoglobuliinin raskasketjua ja mainittu ihmisen immunoglobuliinin kevytket-35 jun lokuksen osa on riittävä koodaamaan ihmisen immunoglobuliinin kevytketjua, ja joka on tuotettu keksinnön mukaisella menetelmällä hiiren alkiovaiheen kantasolun (ES) tuottamiseksi .
25 YAC:tä käyttäen toimitettavaksi tarkoitettu ksenogeeninen DNA on peräisin ihmisestä. Isännälle voidaan siten antaa lukuisia uusia mahdollisuuksia synnyttää geneettisiä vasteita, jotka 5 liittyvät DNA:n ksenogeeniseen, so. ihmislähteeseen, saada aikaan vasta-ainetuotanto, järjestää dominoivia mutaatioita tai komplementoivia resessiivisiä mutaatioita. Ksenogeenista, so. ihmisen DNA:ta voidaan modifioida sen ollessa YACrssä. Koska homologinen rekombinaatio on tehokasta hiivassa, aihe-10 uttaen homologisen DNA:n paikkakohdennetun integraation korkean tason, jolloin homologinen DNA sijaitsee toisen kiinnostavan DNA:n vieressä, ksenogeenista, so. ihmisen DNA:ta on mahdollista modifioida ennen sen toimittamista hiiren ES-soluun. Tällä tavoin voidaan toimittaa vajavaisia geenejä 15 hiiri-isäntään, jotka ilmentävät vajavaisia proteiineja, ksenogeenisen isännän tautitilojen jäljittelemiseksi, erilaisten mekanismien tutkimiseksi koskien vajavaisten proteiinien vuorovaikutusta muiden ksenogeenisten proteiinien tai endogeenisten proteiinien kanssa, tai geenien tai geenisys-20 teemien tutkimiseksi.
YAC-kromosomeja käytetään yleisesti ottaen suurten DNA-osien siirtämiseen, jotka sisältävät hiivan sentromeerin, replikaa-tion aloituskohdan ja telomeerejä, jotka sitovat kiinnostuk-25 sen kohteena olevaa DNA:ta. Useita erilaisia sentromeerejä tai telomeerejä voidaan käyttää, erityisesti sentromeerejä hiivakromosomeista 4 ja 5. YAC sisältää markkerin, joka mahdollistaa solujen valikoinnin tai seulonnan, joihin YAC integroituu. Kaikki markkerit eivät mahdollista tehokasta va-30 likointia. Erityisesti HPRT-geenin, erityisemmin ihmisen HPRT:n on havaittu mahdollistavan HPRT-negatiivisten, YAC: n sisältävien hiiren ES-solujen tehokkaan valikoinnin. Muita tunnettuja valikoitavia tai seulottavia markkereita ovat hygromysiini, neomysiini, β-gal ja GTP. ES-solu voi olla 35 peräisin mistä tahansa hiiri-isännästä, joista ES-soluja on saatavissa, ja sitä voidaan kasvattaa viljelmässä, joka pysyy elinkykyisenä ja toiminnallisena, ja jolle valikoitava mark-keri on olemassa, ja silloin kun ES-solu voidaan toimittaa 26 hiiren alkioon ja se voi sijoittua hiiri-isäntään, mukaan lukien iturata. Suurimmaksi osaksi tämä kyvykkyys on osoitettu jyrsijöillä, esim. hiirillä ja rotilla, ja vähemmässä määrin marsuilla. Hiiriä on käytetty vasta-ainetuotantoon tai 5 B-lymfosyyttien immortalisointiin vasta-ainetuotantoa varten. Koska hiiriä on helppo käsitellä, niitä voidaan tuottaa suurina määrinä ja niillä tiedetään olevan laajaperäinen im-muunivalikoima, hiiret ovat usein kohteeksi valittu eläinryhmä. Hiiren ES-soluissa voi olla yksi tai useampia mutaa-10 tioita, esimerkiksi tietyn aktiivisuuden puuttuminen. Erityisen kiinnostavia tämän keksinnön kannalta ovat ES-solut, jotka ovat epätäydellisiä HPRT:n suhteen. Hiiren hedelmöityneillä munasoluilla voi lisäksi olla käyttöä keksinnön mukaisesti .
15 YAC voidaan saada seulomalla olemassaolevia ihmisen YAC-kir-jastoja kuten niitä, joita on saatavissa the Centre d'Etude du Polymorphisme Human'sta (C.E.P.H.), Pariisi, Ranska, ja Washingtonin yliopistosta, St. Louis, MO, käyttäen vakiome-20 netelmiä. Vaihtoehtoisesti YAC on helposti valmistettavissa, kuten tässä yhteydessä on yksityiskohtaisesti kuvailtu, liittämällä hiivan reunasegmentit, jotka sisältävät yhden käsivarren, sentromeerin ja telomeerin kanssa, ja toisen käsivarren telomeerin kanssa, yhteen kiinnostuksen kohteena olevaan 25 DNA:han. Tavallisesti läsnä on myös yksi tai useampi markke-ri, joiden avulla on mahdollista valikoida hiivaisäntäsoluja. Hiivavalikoinnissa ovat erityisen kiinnostavia markkerit, jotka täydentävät hiivaisännän mutaatioita kuten geenejä, jotka osallistuvat aminohappojen, puriinien tai pyrimi-30 diinien, URA3:n, TRPl:n, LYS2:n, ADE2:n tuotantoon YAC:ssa, ura3-, trpl-, lys2- ja ade2-mutaatioiden täydentämiseksi. Toteuttamalla komplementaatio, suurimmaksi osaksi vain ne hiivasolut, jotka sisältävät kokonaisen YAC:n, kykenevät elämään valikoivassa alustassa. Geneettisen varmistuksen 35 lisäksi, että molemmat YAC:n käsivarret ovat säilyneet, on edullista varmistaa YAC:n eheys käyttäen menetelmänä esim. pulssikenttägeelielektroforeesia.
27
Niitä hiivaisäntiä, jotka sisältävät YAC:n, voidaan sitten käyttää YAC-lähteenä toimitettavaksi hiiren ES-soluihin. YAC:n siirto saadaan tehokkaasti aikaan valmistamalla hiivan sferoplasteja tavanomaisilla menetelmillä. Rikkomalla ulompi 5 seinämä lievissä olosuhteissa isotonisessa alustassa sfero-plasteja saadaan aikaan korkealla saannolla. Eksponentiaalisesti kasvavia hiiren ES-soluja käsitellään proteaasilla, esim. trypsiinillä, ja ne yhdistetään sferoplastien kanssa. Hiivasieroplastipelletti voidaan valmistaa tavanomaisesti ja 10 hiiren ES-solut sentrifugoida pelletin kanssa ja altistaa sulauttavalle aineelle kuten PEG:lie 1-2 minuutin ajaksi. Solut suspendoidaan sen jälkeen uudelleen ja inkuboidaan sopivassa seerumivapaassa alustassa. Solut maljataan sen jälkeen syöttösolujen (feeder cells) päälle, jota seuraa 15 valikointi valikoitavan markkerin mukaan. HPRT-geenin osalta voidaan valikointiin käyttää HAT-alustaa. Sen jälkeen eloonjääneet fuusiopesäkkeet poimitaan, kasvatetaan ja analysoidaan. Analysointi voidaan suorittaa restriktioentsyymi-analyysin avulla, yhdistettynä Southern-blottaukseen tai 20 pulssikenttägeelielektroforeesiin, tai polymeraasiketjureaktion (PCR) avulla käyttäen sopivia alukkeita, joista vähintään yksi on komplementaarinen DNA-insertin kanssa, ja tutkimalla ksenogeenisessa DNA:ssa läsnäolevien repetitiivisten sekvenssien kanssa kuten Alu:n kanssa, ihmisen DNA- 25 sekvenssien ilmaisemiseksi. Ty-, Y'-, rDNA-, delta-sekvenssejä käytetään koettimina hiivasekvensseille. YAC:n päiden koettimia käytetään YAC:n eheyden varmistamiseksi. Niitä soluja, jotka osoittautuvat intaktiksi tai olennaisesti in-taktiksi YAC DNA:ksi integroituneena isäntägenomiin, käyte-30 tään sen jälkeen seuraavissa vaiheissa. Joissakin klooneissa vain osa tai vähän tai ei yhtään hiivan DNA:sta integroituu hiiren genomiin. Integroituneen DNA:n osuus on välillä enemmän kuin noin 90 % alkuperäisestä hiivagenomista - alle noin 10 %.
Siirtogeenisten hiiri-isäntien tehokas tuotanto voidaan saada aikaan käyttäen prosessia, jonka avulla integroituu suuria, vähintään 100 kb:tä sisältäviä ksenogeenisia DNA-fragmentteja 35 28 olennaisesti intaktissa muodossa hiiri-isännän alkiovaiheen kantasoluun (ES) tai hiiren hedelmöityneeseen munasoluun (tsygoottiin). Ksenogeenisen DNA:n toimittaminen saadaan tehokkaasti aikaan fuusioimalla ES-solu hiivan sferoplastei-5 hin, jotka sisältävät YAC:n, joka sisältää 100 kb DNA:ta ja valikoitavan markkerin, olosuhteissa, jotka mahdollistavat markkerin sisältävän YAC DNA:n integroitumisen hiiren ES-solun genomiin, tai puhdistetun YAC:n transfektion avulla ES-soluihin. Genomiin integroituneen YAC:n sisältävät hiiren ES-10 solut valikoidaan sen jälkeen markkerin avulla, joka on toiminnallinen hiiren ES-solussa. Esimerkiksi hypoksantiinifos-foribosyylitransferääsi (HPRT) -geeniä voidaan käyttää mark-kerina HPRT-negatiivisissa (HPRT-) soluissa. Eläinten tuottamista varten hiiren alkiovaiheen kantasoluista transformaati-15 on jälkeen, solut voidaan maljata syöttösolukerroksen (feeder cells) päälle sopivaan alustaan, esim. sikiövaiheisen naudan seerumilla täydennettyyn DMEM:ään. Hiiren ES-solu voi sisältää yhden kohdistetun lokuksen (heterotsygootti) tai sitä voidaan manipuloida homogenointiprosessin avulla sisältämään 20 molemmat lokukset kohdistettuina (homotsygootti) . Homogenoin-tiprosessissa (homotsygoottien valmistuksessa) käytetään valintapainetta, jotta esiinkasvaisivat ne solut, jotka sisältävät geenikohdistustapahtuman kummassakin kromosomissa. Solut, jotka sisältävät kaksi kohdistettua alleelia, voidaan 25 todeta käyttämällä valikoivaa alustaa, ja pesäkkeiden riittävän kasvuajan jälkeen ne voidaan poimia ja niistä voidaan analysoida integroituminen tai homologinen rekombinaatio. Kuten edellä on kuvailtu, PCR:ää voidaan käyttää alukkeiden ollessa rakennesekvenssin alueella tai ulkopuolella mutta 30 kohdelokuksessa.
Tämä keksintö koskee myös menetelmää kimeerisen hiiren tuottamiseksi, joka sisältää ainakin osan ihmisen immunoglobulii-nin raskasketjun lokusta ja ainakin osan ihmisen immunoglobu-35 liinin kevytketjun lokusta, jotka on integroitu pysyvästi ainakin joidenkin sen solujen genomiin, jolloin mainittu ihmisen immunoglobuliinin raskasketjun lokuksen osa on riittävä koodaamaan ihmisen immunoglobuliinin raskasketjua ja 29 mainittu ihmisen immunoglobuliinin kevytketjun lokuksen osa on riittävä koodaamaan ihmisen immunoglobuliinin kevytketjua, jossa menetelmässä (a) tuotetaan tämän keksinnön mukainen hiiren alkiovai-5 heen kantasolu, ja (b) siirretään mainittu hiiren alkiovaiheen kantasolu hiiri-isännän blastokystiin kimeerisen hiiren tuottamiseksi siitä.
10 Keksintö koskee edelleen kimeeristä hiirtä, joka sisältää ainakin osan ihmisen immunoglobuliinin raskasketjun lokusta ja ainakin osan ihmisen immunoglobuliinin kevytketjun lokusta, jotka on integroitu pysyvästi ainakin joidenkin sen solujen genomiin, jolloin mainittu ihmisen immunoglobuliinin 15 raskasketjun lokuksen osa on riittävä koodaamaan ihmisen immunoglobuliinin raskasketjua ja mainittu ihmisen immunoglobuliinin kevytketjun lokuksen osa on riittävä koodaamaan ihmisen immunoglobuliinin kevytketjua, ja joka on tuotettu keksinnön mukaisella menetelmällä kimeerisen hiiren tuottami-20 seksi.
Niitä pesäkkeitä, jotka rekombinoivat homologisesti, voidaan sitten käyttää hiiren alkion manipulointiin ja hiiren blasto-kystin ruiskuttamiseen. Valikoidut hiiren ES-solut toimite-25 taan sen jälkeen hiiren alkioihin mikroruiskutuksella tai muilla menetelmillä sopivaan hiiri-isäntään. Hiiren blasto-kystejä voidaan esimerkiksi saada aikaan naaraseläimistä huuhtelemalla kohtu 3,5 päivää ovulaation jälkeen. Modifioituja hiiren ES-soluja käsitellään sen jälkeen trypsiinillä ja 30 vähintään yksi ja enintään viisitoista solua voidaan ruiskuttaa hiiren blastokystin blastoseeliin. Ruiskuttamisen jälkeen vähintään 1 eikä enempää kuin noin 10 blastokystiä palautetaan valeraskaiden naaraiden kuhunkin kohdunsarveen. Naaraat etenevät synnytyshetkeen ja tuloksena saatavista kimeerisistä 35 hiiristä voidaan analysoida YAC:n läsnäolo niiden somaattisissa soluissa. "Kimeerisellä" tarkoitetaan hiirtä, joka sisältää soluja, jotka ovat peräisin useammasta kuin yhdestä lähteestä, esim. isännästä ja toisesta eläimestä. Esimerkiksi 30 tässä keksinnössä kimeerinen hiirieläin sisältää geneettisesti manipuloidun modifikaation, erityisesti ihmisen geenin, joissakin soluissaan, esim. soluissa, jotka kehittyvät modifioiduista alkiovaiheen kantasoluista. Integroituneen YAC: n 5 läsnäolo syntyneissä kimeerisissä isännissä analysoidaan sitten. Kimeerisistä isännistä arvioidaan ES-solugenomin siirtyminen ituradassa pariuttamisen avulla, kimeerisiä hiiriä pariutetaan esimerkiksi C57BL/6J-hiirten kanssa. Kimeerisiä hiiriä voidaan risteyttää ei-kimeeristen isäntien kanssa, 10 joko syngeenisten tai allogeenisten, kimeerien seulomiseksi, jotka sisältävät YAC:n itusoluissaan. Geneettisen modifikaation suhteen heterotsygoottiset jälkeläiset risteytetään sen jälkeen jälkeläisten tuottamiseksi, jotka ovat homotsygootti-sia modifikaation suhteen, ja siirtävät pysyvästi toimivan 15 YAC-rakenteen jälkeläisilleen.
Keksinnön mukainen menetelmä kimeerisen hiirieläimen tuottamiseksi saa aikaan DNA:n pysyvän integroitumisen. Liitetyn DNA:n sisältämien geenien on todettu olevan toiminnallisia ja 20 kimeeriset hiiri-isännät kykenevät siirtämään integroituneen DNA:n ituradassa. Kimeerisen isännän risteyttämisen jälkeen muodostuu siirtogeenisiä heterotsygoottisia hiiri-isäntiä ja ne pariutetaan homotsygoottisen hiiren tuottamiseksi, jota voidaan käyttää useaan eri tarkoitukseen, mukaan lukien tuot-25 teiden muodostaminen kuten, sitoutumisproteiinit, esimerkiksi immunoglobuliinit, erilaisten lääkeaineiden seulontaan, geeniterapiaan, esimerkiksi resessiivisten geneettisten häiriöiden korjaamiseksi, erilaisten tautien tutkimiseksi, heikosti kartoitettujen suurten DNA-fragmenttien toiminnan ja säätelyn 30 tutkimiseksi.
Keksintö koskee myös menetelmää siirtogeenisen hiiren ja sen jälkeläisten tuottamiseksi, joka sisältää ainakin osan ihmisen immunoglobuliinin raskasketjun lokusta ja ainakin osan 35 ihmisen immunoglobuliinin kevytketjun lokusta, jotka on integroitu pysyvästi sen somaattisten ja itusolujen genomiin, jolloin mainittu ihmisen immunoglobuliinin raskasketjun lo-kuksen osa on riittävä koodaamaan ihmisen immunoglobuliinin 31 raskasketjua ja mainittu ihmisen immunoglobuliinin kevytket-jun lokuksen osa on riittävä koodaamaan ihmisen immunoglobuliinin kevytketjua, jossa menetelmässä (a) tuotetaan tämän keksinnön mukainen kimeerinen hiiri, 5 ja (b) kasvatetaan mainittua kimeeristä hiirtä siirtogeeni-sen hiiren ja sen jälkeläisten tuottamiseksi.
Vielä keksintö koskee siirtogeenistä hiirtä tai sen jälke-10 Iäistä, joka sisältää ainakin osan ihmisen immunoglobuliinin raskasketjun lokusta ja ainakin osan ihmisen immunoglobuliinin kevytketjun lokusta, jotka on integroitu pysyvästi sen somaattisten solujen ja itusolujen genomiin, jolloin mainittu ihmisen immunoglobuliinin raskasketjun lokuksen osa on riit-15 tävä koodaamaan ihmisen immunoglobuliinin raskasketjua ja mainittu ihmisen immunoglobuliinin kevytketjun lokuksen osa on riittävä koodaamaan ihmisen immunoglobuliinin kevytketjua, ja joka on tuotettu tämän keksinnön mukaisella menetelmällä siirtogeenisen hiiren ja sen jälkeläisten tuottamiseksi.
20 Tämän keksinnön mukaisten menetelmien edullisessa toteutus-muodossa ihmisen immunoglobuliinin raskasketjun lokuksen osa on DNA-sekvenssi, joka on identtinen ihmisen kromosomin 14 iturata-DNA-sekvenssin kanssa alkaen ihmisen immunoglobulii-25 nin raskasketjun lokuksen D-segmentin geeneistä jatkuen läpi J-segmentin geenien ja vakioalueen geenien tämän lokuksen Cp:n kautta, jossa mainittu DNA-sekvenssi ei sisällä gammava-kioaluetta, ja jossa mainittu DNA-fragmentti on liitetty toiminnallisesti vähintään yhteen ihmisen V-segmentin gee-30 niin.
Toisessa tämän keksinnön mukaisten menetelmien edullisessa toteutusmuodossa hiiren ES-solun genomi sisältää ainakin yhden inaktivoidun endogeenisen immunoglobuliinin raskasket-35 jun lokuksen, jolloin kyseinen lokus on inaktivoitu lokuksen uudelleenjärjestymisen estämiseksi ja immunoglobuliinin raskasketjun uudelleen järjestyneen lokuksen transkriptin muodostumisen estämiseksi.
32
Keksinnön mukaisten menetelmien vielä edullisemmassa toteutusmuodossa hiiren ES-solun genomi sisältää lisäksi ainakin yhden inaktivoidun endogeenisen immunoglobuliinin kevytketjun 5 lokuksen, jolloin kyseinen lokus on inaktivoitu lokuksen uudelleenjärjestymisen estämiseksi ja immunoglobuliinin kevytketjun uudelleen järjestyneen lokuksen transkriptin muodostumisen estämiseksi.
10 Keksinnön edullisessa toteutusmuodossa hiiren ES-solun tai hiiren sisältämä ihmisen immunoglobuliinin raskasketjun lokuksen osa on DNA-sekvenssi, joka on identtinen ihmisen kromosomin 14 iturata-DNA-sekvenssin kanssa alkaen ihmisen immu-noglobuliinin raskasketjun lokuksen D-segmentin geeneistä 15 jatkuen läpi J-segmentin geenien ja vakioalueen geenien tämän lokuksen Cp:n kautta, jossa mainittu DNA-sekvenssi ei sisällä gammavakioaluetta, ja jossa mainittu DNA-fragmentti on liitetty toiminnallisesti vähintään yhteen ihmisen V-segmentin geeniin.
20 Tämän lisäksi keksinnön toisessa edullisessa toteutusmuodossa hiiren alkiovaiheen kantasolun genomi sisältää vähintään yhden inaktivoidun endogeenisen immunoglobuliinin raskasketjun lokuksen, jolloin kyseinen lokus on inaktivoitu lokuksen 25 uudelleenjärjestymisen estämiseksi ja immunoglobuliinin raskasketjun uudelleen järjestyneen lokuksen transkriptin muodostumisen estämiseksi.
Tämän keksinnön vielä edullisemmassa toteutusmuodossa hiiren 30 alkiovaiheen kantasolun genomi sisältää lisäksi vähintään yhden inaktivoidun endogeenisen immunoglobuliinin kevytketjun lokuksen, jolloin kyseinen lokus on inaktivoitu lokuksen uudelleenjärjestymisen estämiseksi ja immunoglobuliinin kevytketjun uudelleen järjestyneen lokuksen transkriptin muo-35 dostumisen estämiseksi.
Keksinnön vielä eräässä edullisessa toteutusmuodossa kimeeri-sessä hiiressä niiden solujen genomi, jotka sisältävät maini- 33 tun ihmisen immunoglobuliinin raskasketjun lokuksen osan ja mainitun ihmisen immunoglobuliinin kevytketjun lokuksen osan, sisältää lisäksi vähintään yhden inaktivoidun endogeenisen immunoglobuliinin raskasketjun lokuksen, jolloin kyseinen 5 inaktivoitu endogeeninen immunoglobuliinin raskasketjun lokus on inaktivoitu lokuksen uudelleenjärjestymisen estämiseksi ja immunoglobuliinin raskasketjun uudelleen järjestyneen lokuksen transkriptin muodostumisen estämiseksi.
10 Keksinnön vielä edullisemmassa toteutusmuodossa kimeerisessä hiiressä niiden solujen genomi, jotka sisältävät mainitun ihmisen immunoglobuliinin raskasketjun lokuksen osan ja mainitun ihmisen immunoglobuliinin kevytketjun lokuksen osan, sisältää lisäksi vähintään yhden inaktivoidun endogeenisen 15 immunoglobuliinin kevytketjun lokuksen, jolloin kyseinen inaktivoitu endogeeninen immunoglobuliinin kevytketjun lokus on inaktivoitu lokuksen uudelleenjärjestymisen estämiseksi ja immunoglobuliinin kevytketjun uudelleen järjestyneen lokuksen transkriptin muodostumisen estämiseksi.
20
Vielä eräässä edullisessa toteutusmuodossa siirtogeenisen hiiren somaattisten solujen ja itusolujen genomi sisältää vähintään yhden inaktivoidun endogeenisen immunoglobuliinin raskasketjun lokuksen, jolloin kyseinen inaktivoitu endogee-25 ninen immunoglobuliinin raskasketjun lokus on inaktivoitu lokuksen uudelleenjärjestymisen estämiseksi ja immunoglobuliinin raskasketjun uudelleen järjestyneen lokuksen transkriptin muodostumisen estämiseksi.
30 Vielä edullisemmassa toteutusmuodossa siirtogeenisen hiiren somaattisten solujen ja itusolujen genomi sisältää lisäksi vähintään yhden inaktivoidun endogeenisen immunoglobuliinin kevytketjun lokuksen, jolloin mainittu inaktivoitu endogeeninen immunoglobuliinin kevytketjun lokus on inaktivoitu lokuk-35 sen uudelleenjärjestymisen estämiseksi ja immunoglobuliinin kevytketjun uudelleen järjestyneen lokuksen transkriptin muodostumisen estämiseksi.
34
Vielä eräässä edullisessa keksinnön, ja keksinnön mukaisten menetelmien, toteutusmuodossa vähintään yksi hiiren ES-solun tai hiiren endogeeninen immunoglobuliinin raskasketjun lokus on inaktivoitu poistamalla kaikki J-segmentin geenit.
5
Lisäksi eräässä edullisessa keksinnön, ja keksinnön mukaisten menetelmien, toteutusmuodossa vähintään yksi hiiren ES-solun tai hiiren endogeeninen immunoglobuliinin kappakevytketjun lokus on inaktivoitu poistamalla CK-geeni.
10
Seuraavat esimerkit esitetään valaisun vaan ei rajoituksen vuoksi.
Esimerkki I
15 I. Hiiren raskasketjun J (JH) geenien inaktivointi A. Kohdennettavan inaktivointivektorin konstruointi 6,4 kb EcoRI-fragmentti, joka sisältää hiiren raskasketjun J-20 alueen geenit ja viereiset sekvenssit, kloonataan Balb/c-hiiren alkion genomisesta kirjastosta käyttäen koettimia, joita Sakano et ai. on kuvaillut, (1981), Nature 290:562-565. Tämä fragmentti (mDJ) liitetään EcoRI-pilkottuun pUC19-plas-midiin (pmDJ). 2,9 kb fragmentti, joka sisältää 4 J-geeniä, 25 poistetaan XhoI-Scal-pilkonnalla (pmDöJNeo, kuvio 1). 1150 bp
XhoI-BamHI-fragmentti, joka sisältää neomysiiniresistenssi-geenin, jota ohjaavat herpes simplex -viruksen tymidiiniki-naasigeenin (HSV-tk) promoottori ja polyoomatehostaja, eristetään pMClNeo:sta (Thomas ja Capecchi (1987), Cell 5_1, 503- 30 512). Synteettinen adaptori lisätään tähän fragmenttiin Bam- HI-pään muuntamiseksi Scal-pääksi ja tuloksena saatava fragmentti liitetään Xhol-Scal pmD5J:hin, jolloin muodostuu inaktivoint ivektori (pmDöJ.Neo), jossa neomysiinin ja raskas-ketjun promoottoreiden orientaatio 5' —> 3'-suunnassa on 35 identtinen. Tämä plasmidi tehdään lineaariseksi Ndel-pil-konnalla ennen transfektiota ES-soluihin. Homologista rekom-binaatiotapahtumaa ohjaavat sekvenssit ovat 3 kb ja 0,5 kb 35 fragmentteja, sijaiten neomysiinigeenin 5'- ja vastaavasti 3'-puolella.
B. ES-solujen viljely, elektroporaatio ja valikointi 5 ES-solulinjaa E14TG2a (Hooper et ai., (1987), Nature, 326:292-295) viljellään mitomysiinillä käsitellyn primaarisen alkiovaiheen kantasolun/syöttösolun käsittävillä kerroksilla olennaisesti kuten on kuvailtu (Doetschman et ai., (1985), J. 10 Embryol. Exp. Morphol. _8_7_:27-45) . Alkiovaiheen kantasolut valmistetaan C57BL/6-naaraiden alkioista, jotka naaraat on pariutettu 14-17 päivää aikaisemmin uroksen kanssa, joka on homotsygoottinen neomysiinisiirtogeenin suhteen (Gossler et ai., (1986), PNAS 8_3 : 90 65-9 06 9) . Nämä solut kykenevät kasva- 15 maan alustoissa, jotka sisältävät G418:aa. Elektroporaation olosuhteita on kuvaillut (Boggs el; ai., (1986), Ex. Hematol. (NY) 149:988-994) . ES-soluja käsitellään trypsiinillä, sus-pendoidaan uudelleen kasvualustoihin pitoisuudessa 4xl07/ml ja elektroporatoidaan kohdennettavan DNA-rakenteen kanssa pitoi-20 suudessa 12 nM ensimmäisessä kokeessa ja 5 nM toisessa kokeessa. 300 V jännite ja 150-250 pF kapasitanssi on todettu optimaaliseksi elektroporaatiokyvetissä, jonka pituus on 5 mm ja poikkipinta-ala 100 mm2. 5xl06 elektroporatoitua solua maljataan mitomysiinillä käsiteltyjen fibroblastien päälle 25 100 mm:n maljoille Dulbeccon modifioiduilla Eaglen alustoilla (DMEM), jotka sisältävät lisäksi 15 % naudan sikiön seerumia (FBS) ja 0,1 M 2-merkaptoetanolia. Alustat korvataan 24 tuntia elektroporaation jälkeen alustoilla, jotka sisältävät 200 pg/ml G418:a.
30
Elektroporaation jälkeen 10-14 päivän kuluttua tuloksena saatavat ES-pesäkkeet poimitaan pasteurpipeteillä analysointia varten käyttäen PCR:ää. Puolet kustakin pesäkkeestä säästetään 24-kaivoisiin levyihin, jotka on jo siirrostettu mito-35 mysiinillä käsitellyillä syöttösoluilla. Toinen puoli pesäkkeistä, yhdistettynä 3-4:ään koosteeseen, siirretään eppen-dorfputkiin, jotka sisältävät suunnilleen 0,5 ml PBS:ää, ja homologinen rekombinaatio analysoidaan PCR:n avulla. PCR:n 36 reaktio-olosuhteet ovat olennaisesti sellaiset kuin on kuvailtu (Kim ja Smithies (1988), Nucleic Acids Res. 16:8887-8893). Pelletoinnin (sentrifugoinnin) jälkeen ES-solut sus-pendoidaan uudelleen 5 pl:aan PBS:ää ja hajotetaan lisäämällä 5 55 μΐ H20:ta kuhunkin putkeen. DNAasit inaktivoidaan kuumenta malla kutakin putkea 95°C:ssa 10 min. ajan. Proteinaasi K -käsittelyn jälkeen 55°C:ssa 30 min. ajan 30 μΐ kutakin lysaattia siirretään putkeen, joka sisältää 20 μΐ reaktioseosta, joka sisältää PCR-puskuria: 1,5 pg kutakin aluketta, 3 U Taq- 10 polymeraasia, 10 % DMSOtta ja dNTPtitä kutakin pitoisuudessa 0,2 mM. PCR-monistuksessa käytetään 55 jaksoa käyttämällä lämpöjaksolaitetta 65 sekuntia sulattaen 92°C:ssa ja 10 min. pariuttaen ja monistaen 65°C:ssa. Kaksi alukeoligonukleotidiä ovat TGGCGGACCGCTATCCCCCAGGAC ja TAGCCTGGGTCCCTCCTTAC, jotka 15 vastaavat vastaavasti aluetta 650 emästä neomysiinigeenin aloituskohdan 3'-puolella ja sekvenssejä, jotka sijaitsevat hiiren raskasketjugeenissä, 1100 emästä insertiokohdan 3'-puolella. 20 μΐ reaktioseosta elektroforesoidaan agaroosi-geeleillä ja siirretään nailonmembraaneille (Zeta Bind). 20 Suodinkalvot tutkitaan J-C-alueen 991 bp Xbal-fragmentin 32P-leimatulla fragmentilla.
Esimerkki II
25 II. Hiiren Ig-raskasketjun J (JH) geenien deleetio ES-soluissa A. Kohdentamisvaihtovektorin konstruointi 6,1 kb EcoRI-fragmentti, joka sisälsi hiiren immunoglobulii-nin raskasketjun J-alueen geenit ja sen viereiset sekvenssit, 30 kloonattuna BALB/c-hiiren alkion genomisesta kirjastosta ja liitettynä pUC18-plasmidiin (pJH) , pilkottiin XhoI:llä ja Nael:llä noin 2,3 kb fragmentin poistamiseksi, joka sisälsi neljä J-geeniä (kuvio 2A). Noin 1,1 kb XhoI-BamHI-fragmentti, joka oli tehty tasapäiseksi BamHI-kohdassa, ja joka sisälsi 35 neomysiiniresistenssigeenin herpes simplex -viruksen tymi-diinikinaasigeenin (HSV-tk) promoottorin ja polyoomatehosta-jan ohjauksessa, eristettiin pMClNeo:sta (Thomas ja Capecchi (1987), 5_1:503-512) . Tämä fragmentti liitettiin Xhol-Nael- 37 pilkottuun pJH:hon, jolloin muodostui deleetiovektori (pmHöJ, kuvio 2B) , jossa neomysiinin ja raskasketjun geenien tran-skriptionaalinen orientaatio on sama. Tämä plasmidi tehtiin lineaariseksi Ndel-piikonnalla ennen transfektointia ES-5 soluihin. Homologista rekombinaatiotapahtumaa ohjaavat sekvenssit käsittävät noin 2,8 kb ja noin 1,1 kb fragmentit, jotka sijaitsevat neomysiinigeenin 5'- ja vastaavasti 3'-puolella.
10 B. ES-solujen viljely, elektroporaatio ja valikointi ES-solulinjaa E14TG2a (Roller ja Smithies (1989), PNAS USA, 8_6: 8932-8935) viljeltiin mitomysiini C:llä käsiteltyjen alkiovaiheen fibroblastisyöttösolujen pinnalla kuten on kuvail-15 tu (Roller ja Smithies (1989), PNAS USA, 8_6:8932-8935) . ES-soluja käsiteltiin trypsiinillä, suspendoitiin uudelleen HBS-puskuriin (pH 7,05; 137 mM NaCl, 5 mM RC1, 2 mM CaCl2, 0,7 mM Na2HP04, 21 mM HEPES pH 7,1) pitoisuudessa 2xl07/ml ja elekt-roporatoitiin, kun läsnä oli 50 pg/ml lineaariseksi tehtyä 20 inaktivointivektoria. Elektroporaatio suoritettiin BioRadin Gene Pulser -laitteella käyttäen 240 voltin jännitettä ja 500 pF kapasitanssia. 5xl06 elektroporatoitua solua maljattiin mitomysiini C:llä käsiteltyjen fibroblastien pinnalle 100 mm maljoilla Dulbeccon modifioiduilla Eaglen alustoilla (DMEM), 25 jotka sisälsivät lisäksi 15 % naudan sikiön seerumia ja 0,1 mM 2-merkaptoetanolia. Alustat vaihdettiin 24 tuntia elektro-poraation jälkeen alustoihin, jotka sisälsivät 200 pg/ml G418:aa. G418-resistenttejä pesäkkeitä, jotka saatiin 12-14
päivää elektroporaation jälkeen, poimittiin pasteurpipeteillä 30 analyysiä varten käyttäen polymeraasiketjureaktiota (PCR). Puolet kustakin poimitusta pesäkkeestä siirrettiin 24-kaivoisen levyn yksittäisiin kaivoihin, joihin jo oli siir-rostettu mitomysiini C:llä käsiteltyjä syöttösoluja. Toinen puolisko pesäkkeistä, yhdistettynä neljään erään, siirrettiin 35 eppendorfputkiin, jotka sisälsivät 0,3 ml PBS:ää, ja solu-lysaatit preparoitiin PCR-analyysiä varten kuten Joyner et ai. on kuvaillut (1989) Nature, 338:153-155. PCR-reaktio sisälsi 5-20 μΐ solulysaattia, 1 μΜ kutakin aluketta, 1,5 U
38
Taq-polymeraasia ja 200 μΜ dNTP:itä. PCR-monistuksessa käytettiin 45 jaksoa käyttäen lämpöjaksolaitetta (Perkin-Elmer Cetus), 1 min. sulattaen 94°C:ssa, 2 min. pariuttaen 55°C:ssa ja 3 min. monistaen 72°C:ssa. Kaksi alukeoligonukleotidiä ovat 5 ACGGTATCGCCGCTCCCGAT ja AGTCACTGTAAAGACTTCCGGGTA, jotka vastaavat vastaavasti noin 120 emästä neomysiinigeenin BamHI-kohdan 5'-puolella, ja sekvenssejä, jotka sijaitsevat hiiren raskasketjugeenissä, noin 160 emästä insertiokohdan 3'-puolella. Onnistuneessa rekombinaatiossa syntyy noin 1,4 kb 10 fragmentti. 20 μΐ reaktioseosta elektroforesoidaan 1 %:isillä agaroosigeeleillä, värjätään etidiumbromidilla ja siirretään nailonmembraaneille (Gene Screen). Suotimet tutkittiin 32P-leimatun, noin 1,4 kb EcoRI-Pstl-fragmentin kanssa, joka sijaitsi hiiren raskasketjun insertiokohdan 3'-puolella (ku-15 vio 2). Jatkoanalyysiä varten genomista DNA:ta preparoitiin ES-soluista, pilkottiin restriktioentsyymeillä valmistajien suositusten mukaisesti ja fragmentit erotettiin 1 %:isillä agaroosigeeleillä. DNA siirrettiin nailonmembraaneille (Gene Screen) ja tutkittiin 32P-leimatun fragmentin avulla kuten 20 edellä on kuvailtu.
C. G418-resistenttien ES-pesäkkeiden analysointi
Ensimmäisessä kokeessa PCR-analyysi kootuista pesäkkeistä 25 ilmaisi yhden positiivisen, odotetunkokoisen (noin 1,4 kb) PCR-signaalin 34:stä koosteesta, jotka edustivat 136:tta G418-resistenttiä pesäkettä. Neljä yksittäistä pesäkettä, jotka olivat vaikuttaneet tähän positiiviseen koosteeseen, analysoitiin yksitellen PCR:n avulla, ja positiivinen klooni 30 ES33D5 identifioitiin. Vastaava analyysi toisessa kokeessa saadusta 540:stä G418-resistentistä pesäkkeestä tuotti neljä positiivista kloonia lisää (ES41-1, ES-61-1, ES-65-1, ES110- 1) .
35 Yhden J-geenikopion kohdennetun osittamisen varmistamiseksi (geeni on autosomaalinen ja siten läsnä kahtena kopiona) PCR-positiivisia klooneja kasvatettiin ja genomista DNA:ta preparoitiin, pilkottiin Hindin: 11a tai Sacl: llä ja analysoitiin 39
Southern-analyysillä kuten on kuvailtu käyttäen EcoRI-PstI-koetinta.
J-geenien vaihtaminen liittämällä neomysiinigeeni homologisen 5 rekombinaatiotapahtuman avulla johtaa HindiII-fragmenttiin, joka on ilmaistavissa EcoRI-Pstl-koettimen avulla, joka on noin 1,9 kb pitempi kuin vastaava fragmentti natiivissa lo-kuksessa, johtuen kahden HindiII-kohdan menetyksestä, jotka sijaitsivat poistetulla J-geenin alueella (kuvio 2C) . Sout-10 hern-analyysi, koskien kutakin viittä positiivista kloonia HindiII-piikonnan avulla, tuotti kuvion, joka osoitti, että toinen kahdesta raskasketjun J-geenikopiosta oli jakaantunut osiin. Kolme leimattua fragmenttia todettiin: yksi fragmentti (noin 760 bp) , joka oli kooltaan samanlainen kuin käsittele-15 mättömissä soluissa läsnäoleva fragmentti samassa intensiteetissä, yksi fragmentti (noin 2,3 kb), joka oli samanlainen kuin käsittelemättömissä soluissa läsnäoleva fragmentti mutta intensiteetiltään vähäisempi PCR-positiivisessa kloonissa, ja vielä yksi noin 4,2 kb fragmentti, jonka koko on ennustettu 20 homologisen rekombinaatiotapahtuman perusteella ja läsnä vain PCR-positiivisissa klooneissa. Vastaavalla tavalla, J-geenien korvaaminen neomysiinigeenillä homologisen rekombinaation avulla johtaa yhden Sacl-kohdan menetykseen ja fragmentin ilmaantumiseen, joka on todettavissa EcoRI-Pstl-koettimen 25 avulla, ja joka on noin 570 bp pienempi kuin vastaava fragmentti natiivissa lokuksessa (kuvio 2C) . Kloonien Southern-analyysissä Sacl-pilkonnan avulla saatiin odotettu kuvio yhdestä natiivista ja yhdestä kohdennetusta alleelista: noin 4,0 kb fragmentti, kooltaan samanlainen kuin käsittelemättö-30 missä soluissa todettu mutta intensiteetiltään vähäisempi viidessä positiivisessa kloonissa, ja lisäksi noin 3,4 kb fragmentti, jonka koko oli arvioitu kohdennetun homologisen rekombinaatiotapahtuman perusteella, ja joka oli läsnä vain identifioiduissa klooneissa. Southern-blottausten uudelleen-35 hybridisointi neomysiinigeenikoettimen kanssa osoitti, että vain 4,2 kb ja 3,4 kb fragmentit, jotka olivat tuloksena Hindlll- ja vastaavasti Sacl-pilkonnasta, hybridisoituivat koettimeen kuten oli ennustettu kohdentamistapahtuman avulla.
40 D. Kimeeristen hiirien synnyttäminen, joissa on JH-deleetioita
Kolme ja puoli päivää vanhoja C57BL/6J (Jackson Laboratories, 5 Bar Harbor, ME) -blastokystejä saatiin 4-5 viikkoa vanhoista superovulaation läpikäyneistä naaraista kuten Roller et ai. on kuvaillut (1989) (edellä). ES-soluja käsiteltiin tryp-siinillä, pestiin kertaalleen tuoreilla DMEM-alustoilla ja laimennettiin pitoisuuteen noin 1 x 106/ml DMEM-alustassa, 10 joka sisälsi 10 % naudan sikiön seerumia ja 20 mM HEPES- puskuria, pH 7,5. 10-15 solua ruiskutettiin kunkin blastokys-tin blastoseeliin. ES-soluja sisältävät blastokystit siirrettiin sen jälkeen kirurgisesti yhteen valeraskaiden C57BL/6J X DBA/2- tai C57BL/6J X CBAF1 naaraiden kohdunsarveen.
15 ES-solujen vaikutus jälkeläistöön arvosteltiin visuaalisesti tarkastelemalla poikasten turkin väriä. C57BL/6J-hiiret ovat täysmustia väriltään. ES-emosolulinja E14TG2a eristettiin 129/Ola-alkioista, jotka sisältävät kolme turkin värigeeniä, 20 dominoivan Aw-alleelin agouti-lokuksessa, resessiivisen vaa-leanpunasilmävaimennetun alleelin p-lokuksessa ja resessiivisen Cch:n c-lokuksessa. Kimeerisillä jälkeläisillä, joissa ES-solut osallistuivat eläimen synnyttämiseen, on turkit, jotka sisältävät agoutikarvoja (harmaanvärisiä) ja ker-25 manvärisiä karvoja.
Kimeeristen hiirten ituradan siirtämiskyky arvioitiin pariut-tamalla C57BL/6J-hiiren kanssa ja arvostelemalla Fl-polvesta agoutiharmaan värin suhteen. 50 %:n näistä agoutihiiristä 30 voisi odottaa perivän mutatoidun raskasketjualleelin, joka voidaan identifioida hännistä eristetyn DNA:n Southern-blot-tausanalyysin avulla.
JH-kohdennettu ES-solulinja ES65-1, joka sisälsi yhden koh-35 dennetun raskasketjualleelin, ruiskutettiin C57BL/6J-hiiren blastokysteihin. Noin 45 % henkiinjääneistä poikasista olivat kimeerisiä. Kaksi kimeeristä naarasta, 238-2 ja 244-3, saivat pariutettaessa C57BL/6J-urosten kanssa aikaan siirtymisen 41 ituradassa frekvenssillä 100 % ja 15 %, määritettynä agouti-jälkeläistöprosentteina. Heterotsygoottisten jälkeläisten DNA:n Southern-blottausanalyysi osoitti kohdennetun raskas-ketjun alleelin läsnäolon yhden natiivin alleelin lisäksi 5 kahdessa viidestä testatusta agouti jälkeläisestä.
Mutaation suhteen homotsygoottisia hiiriä saatiin risteyttämällä uros- ja naarashiiriä, jotka oli identifioitu JH-vajaiksi (5JH) heterotsygooteiksi. Näiden pariutusten jälke-10 läistöstä analysoitiin kahden kohdennetun raskasketjualleelin läsnäolo Southern-blottausanalyysin avulla.
E. B-solujen analysointi kimeerisistä hiiristä 15 Jos JH-alueen deleetio on riittävä inaktivoimaan raskasketju-lokuksen, siitä tulisi silloin olla seurauksena IgM:ää ilmentävien B-solujen kehittyminen ja vasta-ainetuotannon täydellinen estyminen. JH-lokuksen suhteen heterotsygoottiset hiiret sisältävät yhden intaktin ja funktionaalisen raskas-20 ketjualleelin, joka on peräisin C57BL/6J-emosta, ja yhden JH-vajaan raskasketjualleelin, joka on peräisin ES-soluista (129/Ola-kanta). 129- ja B6-kannat eroavat Ig-raskasketjual- leelien osalta. ES-peräiset B-solut (IgMa-allotyyppi) voidaan erottaa B6-peräisistä B-soluista (IgMb-allotyyppi) allotyyp-25 pispesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden avulla käyttäen virtaussytometria-analyysiä vasta-aineen ilmentävästä B:stä.
Näiden vasta-aineiden spesifisyys on esitetty kuviossa 3 (A- C). Perifeerisen veren lymfosyyttejä värjättiin vasta-aineil-30 la B-soluspesifiselle markkerille B220, ja vasta-aineilla IgM-allotyypille. C57BL/6J-hiirten B-solut värjäytyivät vas ta-aineilla, jotka oli kohdistettu IgMb-allotyyppiä vastaan mutta ei IgMa-allotyyppiä vastaan (kuvio 3B). 129/Ola-hiiristä peräisin olevat B-solut värjäytyivät vasta-aineella IgMa-35 allotyyppiä vastaan mutta ei IgMb-allotyyppiä vastaan (kuvio 3A). Heterotsygoottisissa (a/b Fl) hiirissä, jotka sisälsivät yhden intaktin ES-peräisen raskasketjualleelin ja yhden in- 42 taktin C57BL/6J-raskasketjualleelin, molemmat allotyypit olivat läsnä yhtäsuurina määrinä (kuvio 3C).
Kun B-soluja analysoitiin hiiristä, jotka olivat heterotsy-5 gootteja JH-deleetion suhteen, joissa JH-vajaa raskasketju-alleeli oli 129/Ola-emosta, ei läsnä ollut IgMa-allotyypin suhteen positiivisia soluja. Kaikki B-solut olivat IgMb-positiivisia intaktista C57BL/6J-raskasketjualleelista (kuvio 3D) . Nämä tulokset osoittivat, että JH-vajaa raskasketjulokus 10 on inaktivoitunut eikä pysty koodittamaan toiminnallista IgM-vasta-ainetta.
JH-deleetion suhteen homotsygoottisista hiiristä analysoitiin myös kyky tuottaa toiminnallisia vasta-aineita. Perifeerisen 15 veren lymfosyyttejä homotsygoottisista mutanttihiiristä analysoitiin virtaussytometrian avulla käyttäen vasta-aineita B-soluspesifiselle markkerille B220 ja allotyyppispesifisten markkereiden kanssa (kuvio 4). Päinvastaisesti kuin kontrol-lihiirillä (kuvio 4D-F), yhtään B220+-solua eikä IgM:ää tuot-20 tavia soluja voitu todeta mutanttihiirillä (kuvio 4A-C). Mutanttihiirillä ei myöskään ollut ilmaistavaa IgMrää seerumissa. Nämä tulokset osoittavat, että JH-alueen deleetio molemmista raskasketjualleeleista johtaa B-solun kehittymisen täydelliseen estymiseen valmiiksi B-soluiksi ja vasta-aine-25 tuotannon estymiseen.
F. Homotsygoottisten ES-mutanttisolujen muodostaminen JH-deleetion vaikutus B-soluihin voidaan analysoida myös muo-30 dostamalla ES-soluja, jonka kumpikin raskasketjualleeli on kohdennettu, joita käytetään sen jälkeen kimeeristen hiirten synnyttämiseen, jotka sisältävät mutaation suhteen homotsy-goottisen imusolupopulaation.
35 Homotsygoottisia 5JH-ES-mutanttisoluja muodostettiin altistamalla yksi heterotsygoottisista ES-mutanttiklooneista, ES110-1, kohotettuihin G418-tasoihin (1,4 mg/ml), valikoiden siten kohdennetun alleelin homogenisaation suhteen. Seitsemän 43 eloonjääneistä pesäkkeistä seulottiin Southern-blottausana-lyysin avulla käyttäen Sacl-pilkontaa villityypin raskasket-jualleelin poistamiseksi ja toisen kohdennetun alleelin aikaansaamiseksi. Yhden näistä klooneista, ESDK207:n, osoi-5 tettiin menettäneen natiivin raskasketjualleelin, joka osoitettiin koettimien kyvyttömyydellä ilmaista villityypin 4, 0 kb fragmentti ja 3,4 kb kohdennetun fragmentin lisääntyneellä intensiteetillä. ESDK207:n karyotyyppianalyysi osoitti, että kuten emosolulinjalla ES110-1, noin 80 % soluista sisälsi 40 10 kromosomia, viitaten siihen, että kaksi kohdennettua alleelia oli läsnä. Homotsygoottiset ES-mutanttisolut mikroruiskutet-tiin C57BL/6J-blastokysteihin ja kimeerisiä hiiriä synnytettiin.
15 G. B-solujen analysointi homotsygoottisistä kimeereistä
Kimeeristen hiirien B-soluja analysoitiin JH-deleetion vaikutuksen määrittämiseksi B-solun kehittymiseen ja vasta-ainetuotantoon. ES-solulinjän (129/Ola) lymfosyytit voidaan erot-20 taa blastokystiperäisistä (C57BL/6J) lymfosyyteistä monoklo-naalisen vasta-aineen avulla Ly-9.1-markkeria vastaan, joita tavataan 129-peräisistä lymfosyyteistä mutta ei B6-peräisistä lymfosyyteistä. Kaksi kantaa eroavat lisäksi IgM-allotyypeiltään kuten edellä on kuvailtu.
25
Analysoidut kimairat oli saatu villityypin E14TG2a-ES-soluis-ta (WT) tai ES-soluista, jotka olivat heterotsygoottisia (ES110-1, ES65-1) tai homotsygoottisia (ESDK207) kohdennetulla JH-alueella. Perifeerisen veren mononukleaarisia soluja 30 värjättiin vasta-aineilla B-soluspesifistä B220-markkeria vastaan ja vasta-aineilla joko Ly-9.1- tai IgM-allotyyppejä vastaan, ja analysoitiin sen jälkeen kaksivärivirtaussytomet-rian avulla. T-solulinjan kimeerisyyden arvioimiseksi solut värjättiin vasta-aineella T-solumarkkeria Thy 1.2 vastaan ja 35 anti-Ly-9.1-vasta-aineella. Solujen värjääminen emohiirikan-noista toimi kontrollina määrityksen spesifisyydelle ja herkkyydelle .
44
Hiiriä, joilla oli samanlainen kimeerisyysaste, arvosteltuna karvan värin perusteella, vertailtiin toisiinsa. ES-peräisiä B- ja T-soluja todettiin kimeeristen hiirten perifeerisessä veressä, jotka oli synnytetty villityypin E14TG2a-soluista, 5 mikä varmisti tämän solulinjan kyvyn synnyttää imusoluja in vivo. Kimeeristen solujen analysointi, jotka oli synnytetty yksittäisistä JH-kohdennetuista ES65-1- ja ES110-l-soluista, osoitti B220+/IgMa+/Ly-9.l+-B-solujen läsnäolon, jotka sisälsivät yhden intaktin, ES-soluperäisen Ig-raskasketjulokuksen.
10 Päinvastaisesti kuin WT:llä ja yksinkertaisilla kimairoilla, hiiristä, jotka oli synnytetty homotsygoottisesta ESDK207-mutanttisolulinjasta, puuttuivat Ly-9.1+/B220+- tai Ig-Ma+/B22 0 + 1-B-solut perifeerisestä verestä. ESDK207-peräisten 15 B-solujen havaittu puuttuminen ei johtunut lymfopoeesin puuttumisesta, koska ES-peräiset Ly-9. l + /B220--solut edustivat 12 % perifeerisen veren mononukleaaristen solujen koko-naispoolista. Näistä suunnilleen puolet olivat Thy-1.2+-T-soluja. JH-alueen deleetio kummastakin alleelista estää siten 20 valmiiden, IgMa:ta tuottavien B-solujen kehittymisen. Samanlaisia havaintoja tehtiin kimeeristen pernasolujen suhteen.
Kimeiroista testattiin myös seerumin IgM:n läsnäolo, joka oli peräisin ES-soluista. IgMa-tasot olivat korkeat kimeiroissa 25 villityypin ES-soluista ja soluista, joissa oli yksi kohdennettu mutaatio, mutta eivät olleet todettavissa hiirissä, jotka olivat peräisin ESDK207-solulinjasta.
Jatkoanalyysi osoitti, että ESDK207-hiirten luuydin sisälsi 30 normaaleja IgMb+-B-soluja, jotka olivat peräisin blastokysti-isännästä, mutta siitä puuttuivat ES-peräiset IgMa+-B-solut. DK207-peräinen luuydin sisälsi kuitenkin solupopulaation, joka oli ES-soluista peräisin oleva B220dull/Ly-9.1+. Luuydin sisältää siten todennäköisesti alapopulaationa ES-soluperäi-35 siä B-soluprekursoreita, joiden maturaation estää Jn-alueen homotsygoottinen deleetio.
45
Luuydinsolut analysoitiin myös kolmivärivirtaussytometrialla käyttäen vasta-aineita Ly-9.1, B220 ja joko CD43 tai Thy-1.2. Tulosten mukaan suurin osa ES-peräisistä soluista oli CD43-positiivisia, joka vastaa kypsymisen aikaista estymistä. 5 Monet soluista olivat myös positiivisia Thy-1.2:n suhteen kuten oli odotettavissa hyvin aikaisista B-soluprekursoreis-ta. Nämä tulokset osoittavat, että JH-alueen poistaminen johtaa raskasketjulokuksen kyvyttömyyteen uudelleenjärjestellä ja tuottaa toiminnallista IgM:ää. IgH:n uudelleenjärjestelyn 10 puuttuminen johtaa B-solumaturaation estymiseen, mikä rajoittaa B-soluesisolut aikaiseen kehitysvaiheeseen.
Esimerkki III
Hiiren Ig-kappa-kevytketjun konstantin (CK) alueen deleetio 15 A. Kohdennetun vaihtovektorin konstruointi
Kappa-alue inaktivoitiin vaihtovektorin avulla, joka konstruoitiin poistamaan kappa-lokuksen konstanttialue ja korvaamaan 20 se G418-lääkeaineresistenssimarkkerilla homologisen rekombi-naation kautta. Homologista rekombinaatiota ohjasivat homolo-gia-alueet, jotka reunustavat konstanttialuetta (kuvio 5).
Genominen kirjasto 129/Ola-hiiren alkion maksan DNA:sta 25 (Stratagene), kloonattuna lambda-faagiin, seulottiin hiiren CK-geenin läsnäolon suhteen 1,6 kb Hpal/BamHI-fragmentin avulla (Steinmetz ja Zachau (1980) Nucleic Acids Research _8_: 16 93 — 1706), joka laajentaa hiiren kappa-konstanttialuetta. Lambda-faagiklooni, joka hybridisoitui tähän koettimeen, identifioi-30 tiin, sen jälkeen puhdistettiin ja käytettiin CK-DNA-lähteenä. Faagi-DNA:n analyysi osoitti, että kappa-konstanttialueen koetin hybridisoitui 5,6 kb SphI/BamHI-fragmenttiin. Tämä fragmentti sisälsi kappa-J-alueen geenit, intronitehostaja-osan ja kappa-konstanttialueen. Se eristettiin sen jälkeen ja 35 subkloonattiin plasmidin pUC218 Sphl- ja BamHI-kohtiin, jolloin saatiin plasmidi pUC218/5.6kappa.
46
Deleetiovektorin konstruoimiseksi fragmentit, jotka käsittivät kappa-konstanttialueen 5'-alueen, tymidiinikinaasigeenin negatiivista seulontaa varten, neomysiiniresistenssigeenin ja kappa-konstanttialueen 3'-homologia-alueen, liitettiin yhteen 5 (kuvio 6).
4.0 kb Sphl/Bsu361-fragmentti plasmidista pUC218/5.ökappa subkloonattiin vektorin pSK.A Sphl- ja Bsu361-kohtiin, jolloin saatiin plasmidi pSK.A/5'K. Vektori pSK.A on modifikaa- 10 tio pBluescript SK-:sta, joka sisältää synteettisen polylink-kerin: 5' GCATATGCCTGAGGTAAGCATGCGGTACCGAATTCTATAAGCTTGCGGCCGCA-
GCTCATGCGTATACGGACTCCATTCGTACGCCATGGCTTAAGATATTCGAACGCCGGCG
15 3 ' liitettynä pBluescriptin Kpnl- ja Sacl-kohtien väliin.
2,7 kb EcoRI/HindiII-fragmentti, joka sisältää herpeksen 20 tymidiinikinaasi (TK) -geenin hiiren fosfoglyseraatti-kinaasigeenin (PGK) promoottorin ohjauksessa plasmidista pKJtk (Tybulewicz et ad., (1991) Cell 6_5:1153-1163) , liitettiin pSK.A/5'K:n EcoRI- ja NotI-kohtiin käyttäen sekvenssin mukaista Hindlll/Notl-adaptoria: 25 5'AGCTGGAACCCCTTGCCCTTGGGGAACGCCCGG 3'.
Tuloksena olevassa plasmidissa pSK.A/5'K/TK, TK-geenin 5'-pää ja kappa-konstanttialueen geeni ovat lähekkäin toisiaan, 30 vastakkaisissa orientaatioissa (kopiointisuunnissa).
1.1 kb XhoI/BamHI-fragmentti pMClNeo:sta, joka sisältää nisäkkään valikoitavan lääkeainemarkkerin neomysiiniresis-tenssille, kloonattiin plasmidin pSK.B XhoI- ja BamHI-koh- 35 tiin, jolloin saatiin plasmidi pSK.B/Neo. Vektori pSK.B on modifikaatio pBluescript SK-:sta, joka sisältää synteettisen polylinkkerin: 47 5 ' GAGCTCGGATCCTATCTCGAGGAATTCTATAAGCTTCATATGTAGCTCATGCT- CGAGCCTAGGATAGAGCTCCTTAAGATATTCGAAGTATACA3' liitettynä pBluescriptin Kpnl- ja Sacl-kohtiin.
5 1,1 kb Bglll/BamHI-fragmentti plasmidista pUC218/5.6kappa, joka sisältää kappa-alueen 3'-pään homologin, kloonattiin BamHI:llä pilkottuun, alkalisella fosfataasilla käsiteltyyn pSK.C-vektoriin. pSK.C on pBluescript SK-:n modifikaatio, 10 joka sisältää synteettisen polylinkkerin: 5' AAGCTTATAGAATTCGGTACCTGGATCCTGAGCTCATAGCGGCCGCAGCT- CATGTTCGAATATCTTAAGCCATGGACCTAGGACTCGAGTATCGCCGGCG 3' 15 liitettynä pBluescriptin Kpnl- ja Sacl-kohtien väliin. Tuloksena oleva plasmidi on suunnattu siten, että transkriptio etenee Sacl-kohdasia plasmidipolylinkkerissä Kpnl-kohdan suuntaan.
20 Lopullinen kohdennettava plasmidi konstruoitiin kolmeosaisessa ligaatiossa käyttäen (A) 6,1 kb Notl/Ndel-fragmenttia pSK.A/5'K/TK:sta, (B) 1,2 kb Ndel/SacI-fragmenttia pSK.B/Neo:sta ja (C) 4,0 kb Sacl/NotI-fragmenttia pSK.C/3'K:sta, ligoiden plasmidin pK.TK/neo valmistamiseksi.
25 B. Kappa-deleetiovektorin elektroporaatio ES-soluihin
Puhdistettua plasmidi-DNA:ta pK.TK/Neo:sta leikattiin PvuI:-llä, uutettiin fenoli/kloroformilla ja saostettiin etanolil-30 la. DNA suspendoitiin uudelleen saostamisen jälkeen pitoisuuteen 1 mg/ml 10 mM Tris-HCl:ssa, 1 mM EDTA:ssa.
Alkiovaiheen kantasolulinjaa E14-1, E14-linjan subkloonia (Hooper et ai., (1987) Nature 326:292-295) viljeltiin DMEM:-35 ssä, joka sisälsi 4,5 g/1 glukoosia (J.R.H. Biosciences) ja 15 % lämpöinaktivoitua vasikan sikiön seerumia, hiiren leukemian inhibitiivistä yhdistelmätekijää (ESGRO Gibco BRL'ltä, 48 1000 U/ml) , 0,1 mM β-merkaptoetanolia, 2 mM glutamiinia ja 100 U/ml penisilliiniä 37°C:ssa 5 %:isessa C02:ssa.
Soluja viljeltiin mitomysiinillä käsitellyillä, primaarisia 5 alkiovaiheen fibroblastisyöttösoluja sisältävillä kerroksilla pääasiallisesti kuten on kuvailtu (Roller ja Smithies (1989) edellä). Alkiovaiheen fibroblastit preparoitiin 14 päivän ikäisistä alkioista, jotka sisälsivät β2-mikroglobuliinin homotsygoottisen kohdennetun mutaation (Roller ja Smithies 10 (1990) Science 248:1227-1230). Nämä syöttösolut kykenevät kasvamaan alustoissa, jotka sisältävät G418:aa.
80 %:n yhteenkasvutasolla ES-solut preparoitiin elektroporaa-tiota varten käsittelemällä trypsiinillä, väkevöimällä lyhyt-15 aikaisesti sentrifugoimalla ja suspendoimalla uudelleen HE-PES-puskuroituun saliiniin pitoisuudessa 2 x 107 solua/ml. Soluja tasapainotetaan huoneenlämpötilassa, ja lineaariseksi tehtyä, kohdentuvaa vektori-DNA:ta (20 pg) lisätään. Seos elektroporatoitiin käyttäen 960 pF kapasitanssia ja 250 V 20 jännitettä BioRadin Gene Pulser -laitteella. Solut jätettiin seisomaan huoneenlämpötilaan 10 minuutin ajaksi ennen maljaa-mista 4 x 10 cm:n maljoille, jotka sisälsivät mitomysiinillä käsiteltyjä fibroblastisyöttösoluja (3 x 106 syöttösolua/mal-ja) . 48 tunnin inkuboinnin jälkeen 37°C:ssa soluille syötet- 25 tiin alustoja, jotka sisälsivät 150 pg/ml G418:a neomysiini-resistenssin suhteen seulomista varten. Vielä 48 tunnin kuluttua soluille syötettiin alustoja, jotka sisälsivät 150 pg/ml G418:a ja 2 pM gansikloviiriä (Syntex) valikointia varten tymidiinikinaasigeenin menetyksen suhteen.
30 C. Rohdennettujen ES-solujen analysointi
Rymmenen päivää kestäneen lääkeainevalikoinnin jälkeen sekä G418:n että gansikloviirin kanssa yksittäisiä eloonjääneitä 35 pesäkkeitä poimittiin ja dissosioitiin trypsiinipisaralla 96-kaivoisella levyllä ja inkuboitiin sen jälkeen 37°C:ssa 2 minuutin ajan. Jokaisen pesäkkeen solut siirrettiin 24-kai-voisen levyn kaivoon, joka sisälsi mitomysiini C:llä käsitel- 49 tyjä syöttösoluja ja valikoivia alustoja mutta ei gansiklo-viiriä. Vielä 5-8 päivän kuluttua 20 % soluista kustakin kaivosta jäädytettiin ja loput käytettiin genomisen DNA:n valmistamiseksi. Solut hajotettiin 0,4 ml :11a liuosta, joka 5 sisälsi 10 mM Tris-HCl:ää (pH 7,5), 100 mM NaCl:a, 10 mM EDTA:aa, 1 % SDS:a ja proteinaasi K:ta (1 mg/ml), inkuboimal-la yli yön 50°C:ssa. DNA puhdistettiin fenoliuutolla ja etano-lisaostuksella, pestiin sen jälkeen 70 %:isella etanolilla ja suspendoitiin uudelleen 20 μΐ:aan 10 mM Tris-HCl:ää, 1 mM 10 EDTA:aa.
Southern-analyysi suoritettiin käyttäen Bglll:11a pilkottua genomista DNA:ta kustakin näytteestä. Koettimena käytettiin noin 1,2 kb BamHI/BglII-fragmenttia, joka sisältää alueen, 15 joka reunustaa 3'-homologiafragmenttia kohdentamisvektorissa. Natiivista ES-solulokuksesta saatiin noin 2,3 kb fragmentti, kun taas kohdennetusta ES-solulokuksesta saatiin noin 5,7 kb fragmentti. Koon kasvu johtuu Bglll-kohdan menetyksestä de-leetiovektorin konstruoinnin aikana.
20 166 kloonin Southern-analysointi toi esiin kaksi solulinjaa, jotka sisälsivät tarkoitetun mutaation. Nämä kloonit jatko-analysoitiin tutkimalla kalvot uudelleen noin 1,1 kb fragmentin kanssa, joka käsittää neo-geenin. Kuten oli odotettavis-25 sa, koetin hybridisoitui vain kohdennettuun alleeliin.
Kahden positiivisen kloonin, lL2-850:n ja lL2-972:n, jat-koanalyysi, sulattamisen ja monistamisen jälkeen, varmisti alkuhavainnot. Kolmatta koetinta, noin 1,7 kb HindiII/BglII-30 fragmenttia, joka käsitti kappa-J-alueen lokuksen, käytettiin oikean integraatiomallin tarkistamiseksi kohdentamisvektorin 5'-päästä. Käyttämällä tätä koetinta EcoRI:llä pilkotun genomisen DNA:n kanssa, noin 15 kb fragmentti todetaan natiivissa alleelissa ja noin 5 kb fragmentti kohdennetusta lokuksesta. 35 EcoRI-lisäkohta toimitetaan neo-geenin avulla homologisen rekombinaatiokohdentamisen aikana (kuvio 7).
50 D. Ituradan kimeirojen muodostaminen
Modifioimattomien E14-l-solujen on todettu vaikuttavan iturataan korkea-asteisesti ruiskuttamisen jälkeen C57BL/6J-blas-5 tokysteihin. Ituradan kimeirojen muodostamiseksi, jotka sisältävät kohdennetun kappa-alueen, kohdennettuja solulinjoja 1L2-850 ja 1L2-972 viljeltiin primaaristen syöttösolujen pinnalla, käsiteltiin sen jälkeen trypsiinillä ja suspendoi-tiin uudelleen injektioalustaan, joka sisältää DMEM:iä, johon 10 oli lisätty loppupitoisuuteen 15 % vasikan sikiön seerumia, 20 mM HEPES:iä (pH 7,3), antibiootteja ja β-merkaptoetanolia. ES-soluja ruiskutettiin kuhunkin blastokystiin ja ruiskutetut blastokystit siirrettiin sen jälkeen valeraskaan naarashiiren yhteen kohdunsarveen. Kimeeriset poikaset identifioitiin 15 kimeerisen karvavärin perusteella. Kimeeriset urokset risteytettiin C57BL/6J-naaraiden kanssa ja 129/Ola-peräisten ES-solujen siirtyminen ituradassa todettiin jälkeläistön agouti-karvavärin perusteella.
20 Yksi kimeerinen uros solulinjasta 1L2-972 (noin 40 % ES- soluperäisiä pääteltynä karvavärin perusteella), pariutetta-essa C57B1/6J-naaraiden kanssa, sai aikaan siirtymisen ituradassa frekvenssin ollessa 25 %, määritettynä agouti-jälke- läisten prosenttiosuuksina. Kimeeriset urokset, noin 40 %, 70 25 % ja 90 % kimeerisiä, solulinjasta 1L2-850 saivat aikaan ituradassa siirtymisen frekvenssien ollessa 90 %, 63 % ja vastaavasti 33 %. Agouti-jälkeläisten joukossa, jotka oli synnytetty 70 %:ista kimeerisiä uroksia lL2-850:stä, kahdeksan Fl-eläintä kahdestatoista testatusta todettiin heterotsy-30 goottisiksi kappa-lokuksessa kohdennetun CK-mutaation suhteen Southern-analyysin avulla (Bglll-pilkonta käyttäen edellä kuvailtua 1,2 kb BamHI/BglII-fragmenttia koettimena) käyttäen häntänäytteistä peräisin olevaa genomista DNA:ta. Koiraksen ja naaraksen jatkoristeytys tästä ryhmästä, joka käsitti 8 35 Fl-eläintä, ja joista kumpikin oli heterotsygoottisia CK-mutaation suhteen, tuotti yhden koirasjälkeläisen, joka todettiin homotsygoottiseksi tämän mutaation suhteen varmistettuna Southern-analyysin avulla.
51 E. B-solujen analysointi, jotka on saatu kappa-lokuksessa kohdennetuista hiiristä 5 Jos kappa (k) -kevytketjulokus on inaktivoitunut johtuen kevytketjun konstanttialueen (Ck), liitosalueen (Jk) tai sekä Οκ:η että Jn:n deleetiosta, siitä tulisi seurata κ-ilmentävi-en B-solujen kehittymisen täydellinen estyminen. Hiiren alkiovaiheen kantasoluja, jotka sisälsivät yhden kopion täydel-10 lisestä Cn-deleetiosta (ACk), toimitettiin hiiren blastokys-teihin kuten edellä on kuvailtu kimeeristen hiirien tuottamiseksi. Nämä kimeeriset hiiret risteytettiin sen jälkeen vil-lityyppisten C57BL/6 (B6) -hiirten kanssa, ja Fl-polven jäl keläisistä määritettiin ACn-mutaation läsnäolo häntä-DNA:n 15 Southern-blottauksen avulla. Fl-hiiriä, jotka sisälsivät ΔΟκ-mutaation, risteytettiin ja F2-jälkeläiset määritettiin vastaavalla tavalla ΔΟκ:η suhteen. Yhden viidestä F2-jälkeläisestä osoitettiin sisältävän homotsygoottisen Ck-deleetion ja toinen oli heterotsygoottinen, sisältäen sekä 20 ACk- että villityypin CK-alleelin. Kolme muuta jälkeläistä olivat villityyppisiä. κ-positiivisten B-solujen läsnäolo tai puuttuminen määritettiin perifeerisen veren B-solujen vir-taussytometria-analyysin avulla värjättyinä fluoresoivilla vasta-aineilla, jotka reagoivat yleis-B-solumarkkerin (B220) 25 kanssa tai κ-kevytketjun kanssa. Homotsygoottisen ΔΟκ F2-hiiren osalta κ-positiivisia B-soluja ei havaittu, ja hete-rotsygootissa esiintyi κ-positiivisissa B-soluissa frekvenssin alenemista, mikä vastasi villityypin alleelin ja ei-toi-minnallisen ACK-alleelin läsnäoloa. Nämä tulokset osoittavat, 30 että Οκ:η deleetio kromosomista estää κ-ilmentymisen hiiren B-soluissa.
52
Esimerkki IV
Hiiren immunoglobuliinin kappa-kevytketjun J-alueen ja kons-tanttialueen inaktivointi 5 A. Kohdentamaskokeen konstruointi
Kohdentamisvektori konstruoitiin vaihtotyyppiseksi vektoriksi alunperin konstanttialueen samoin kuin kappa-lokuksen J-alueen poistamiseksi ja sen korvaamiseksi kolmella osalla 10 homologisen rekombinaation välityksellä käyttäen konstant-tialuetta reunustavia homologia-alueita (kuvio 8). Difteriatoksiinin geeni (A-ketju), joka reunusti jompaa kumpaa tai kumpaakin homologia-aluetta, sisällytettiin joissakin tapauksissa negatiiviseksi valikoitavaksi markkeriksi. Kolme eleli menttiä käsittivät G418-lääkeaineen resistenssimarkkerin, hiivan DNA:n ylimääräisen DNA-homologiasekvenssin (ADH), joka on homologinen kappa-lokuksen suhteen, joka sijaitsee J-alueen yläpuolella, ja tymidiinikinaasigeenin. Seurauksena ADH-sekvenssin sisällyttämisestä vektoriin, tämä alkukohden-20 taminen sijoitti toisen ADH-kopion lokukseen. Tätä duplikaa-tiota käytettiin sen jälkeen määrätyn deleetion aikaansaamiseksi sekvensseihin osien välissä käyttäen valintapainetta. Tässä tapauksessa solu poistaa tymidiinikinaasigeenin, joka sijaitsee kahden osan välissä säilyäkseen elinkykyisenä gan-25 sikloviirivalikoinnista.
B. Kohdentamisvektorin konstruointi
Homologia-alueet olivat peräisin 129:n hiiren sikiön maksan 30 genomisesta kirjastosta (Stratagene), joka seulottiin käyttäen kahta koetinta, kuten esimerkissä III edellä on kuvailtu. Tämä subklooni sisälsi J-alueen, intronisen tehostajaosan ja kappa-kevytketjulokuksen konstantin alueen. Toinen koetin oli 0,8 kb EcoRI-fragmentti (Van Ness et ai., (1981), Cell 35 2_7: 593-602) , joka sijaitsee 2,8 kb J-alueen yläpuolella.
Faagi-DNA tämän koettimen suhteen positiivisesta lambda-kloonista osoitti, että koetin hybridisoitui 5,5 kb Sacl-fragmenttiin, joka subkloonattiin pBluescript SK~ (Stratagene) 53 -plasmidin Sacl-kohtaan, jolloin saatiin plasmidi pSK.5'kappa (kuvio 8).
Inaktivaatiovektorit, jotka sisälsivät 5'-homologia-alueen, 5 tymidiinikinaasigeenin, ADH:n, neomysiiniresistenssigeenin ja 3'-homologia-alueen (kuvio 9), joissain tapauksissa difte-riatoksiinigeenien reunustamana, konstruoitiin kolmesta plas-midista (kuvio 8), jotka sisälsivät: (a) 5'-homologiaf- ragmentin difteriatoksiinigeenin (DT) kanssa tai ilman, jota 10 ohjasi hiiren fosfoglyseraattikinaasigeenin (PGK) promoottori, negatiivisena valikoitavana markkerina, (b) herpeksen tymidiinikinaasigeenin (tk), jota ohjasi hiiren fosfoglyse-raattikinaasigeenin (PGK) promoottori negatiivisena valikoitavana markkerina yhdessä DSH:n ja G418:lla valikoitavan 15 neomysiini (neo) -geenin kanssa pMClNeo:sta (Thomas ja Capec-chi (1987), Cell _51:503-12), ja (c) 3'-homologiaf ragmentin PGK:n ohjaaman DT-geenin kanssa tai ilman. Nämä kolme plasmi-dia (kuvio 8) konstruoitiin pSK.A:sta, pSK.B:stä ja vastaavasti pSK.C:stä, kaikkien ollessa peräisin plasmidista 20 pBluescript SK”, polylinkkerin modifikaation avulla.
Plasmidin pBluescript SK” polylinkkeri modifioitiin kloonaamalla Kpnl- ja Sacl-kohtien väliin synteettinen polylinkkeri, jonka rajasivat oligonukleotidit 5'-GCATATGCCTGAGGG-25 TAAGCATGCGGTACCGAATTCTATAAGCTTGCGGCCGCAGCT-3' ja 5'-GCGGCC-GCAAGCTTATAGAATTCGGTACCGCATGCTTACCTCAGGCATATGCGTAC-3' plasmidin pSK.A muodostamiseksi, 5'-GAGCTCGGATCCTATCTCGAGGAATTCTA-TAAGCTTCATATGTAGCT-3' ja 5'-ACATATGAAGCTTATAGAATTCCTCGAGATAG-GATCCCGAGCTCGTAC-3' plasmidin pSK.8 muodostamiseksi, 5'-30 AAGCTTATAGAATTCGGTACCTGGATCCTGAGCTCATAGCGGCCGCAGCT-3' plasmidin pSK.B muodostamiseksi ja 5'-GCGGCCGCTATGAGCTCAGGATC-CAGGTACCGAATTCTATAAGCTTG TAC-3' plasmidin pSK.C muodostamiseksi .
35 Difteriatoksiinin geenikasetti muodostettiin, jossa geenin vieressä olivat PGK-promoottori ja naudan kasvuhormonin poly-adenylaatiosignaali (Woychik et ai., (1984), Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 8^:3944-3948; Pfarr et ai., (1986), DNA
54 5:115-122). 2,3 kb XbaI/EcoRI-fragmentti pTH-l:stä (Maxwell et ai., (1986), Cancer Res. _46:4660-4664) , joka sisälsi difteriatoksiinin A-ketjun, jota ohjasi ihmisen metallotione-iinin (hMTII) promoottori, kloonattiin Xbal:llä ja EcoRI:llä 5 katkaistuun pBluescript SK':een, jolloin saatiin plasmidi pSK.DT. pSK.DT:n hMTII-promoottori vaihdettiin PGK-promootto-riin pKJl:stä (Tybulewicz et ai., (1991), Cell 65:1153-1163) . 0,5 kb Xbal/Pstl-fragmentti pKJl:stä liitettiin 3,1 kb XbaI/NeoI-fragmenttiin pSK.DT:stä käyttäen PstI/Ncol- 10 adaptoria, joka on muodostettu oligonukleotideistä 5'-GGGAAG-CCGCCGC-3' ja 5'-CATGGCGGCGGCTTCCCTGCA-3', jolloin saadaan plasmidi pSK.pgkDT. 248 bp fragmentti, joka sisältää naudan kasvuhormonin polyadenylaatiosignaalin, joka on saatu naudan genomisen DNA:n PCR-monistuksessa käyttäen oligonukleoti-15 dialukeita 5'-CAGGATCCAGCTGTGCCTTCTAGTTG-3' ja 5'-CTGAGCTCTA-GACCCATAGAGCCCACCGCA-3', kloonattiin plasmidiin pCRIOOO (In-vitron Corp., San Diego, CA). Polyadenylaatiosekvenssi kloonattiin sen jälkeen DT-geenin taakse HindiII/PvuII-frag-menttina pSK.pgkDT:hen, joka oli katkaistu Hindlll:11a ja 20 Hpal:llä, jolloin saatiin plasmidi pSK.pgkDTbovGH. DT-geeni-kasetti pSK.pgkDTbovGH:sta siirrettiin 2,1 kb EcoRI/HindiII-fragmenttina pSK.A:han, joka oli katkaistu EcoRI:llä ja No-tl:llä, käyttäen HindiII/NotI-adaptoria, joka oli muodostettu oligonukleotideistä 5'-AGCTGGAACCCCTTGC-3' ja 5'-GGCCGCAAG-25 GGGTTCC-3', jolloin saatiin plasmidi pSK.A/DT. Kappa-lokuksen 5'-homologia-alue kloonattiin sekä pSK.A:n että pSK.A/DT:n Sphl- ja Bsu361-kohtien väliin. Tätä tarkoitusta varten 4,0 kb Sphl/Bsu361-fragmentti, joka on tuloksena plasmidisubkloo-nin pUC218/5.6kappa osittaisesta Bsu361-pilkonnasta, jota 30 seuraa täydellinen SphI-pilkonta, liitettiin pSK.A:han tai pSK.A/DT:hen, jolloin saatiin plasmidit pSK.A/5'K ja vastaavasti pSK.A/DT/5'K. Plasmidissa pSK.A/DT/5'K DT-geenin 5'-pää ja kappa-fragmentti olivat lähellä toisiaan edeten vastakkaisissa kopiointisuunnissa.
PGKtk-geeni plasmidista pKJtk (Tybulewicz et ai., (1991) Cell 6_5:1153-1163) kloonattiin 2,7 kb EcoRI / Hindi II-fragmenttina pSK.B:n uniikkeihin EcoRI- ja HindiII-kohtiin, jolloin saa- 35 55 tiin pSK.B/TK. ADH:hon käytetty 0,8 kb EcoRI-fragmentti kloonattiin pSK.5'kappa-plasmidista ja liitettiin pSK.B/TK:n EcoRI-kohtaan, jolloin saatiin pSK.B/(TK/0, 8K) siten, että tk-geenin 5'-pää ja kappa-fragmentti olivat toistensa vieres-5 sä edeten vastakkaisiin kopiointisuuntiin. 1,1 kb neo-geeni pMClNeo:sta kloonattiin XhoI/BamHI-fragmenttina samojen kohtien väliin pSK.B/(TK/0,8K):ssa, jolloin saatiin pSK.B/ (TK/0,8/Neo). Plasmidi pSK.C/3'K, joka sisälsi 3'-homo-logiafragmentin, konstruoitiin liittämällä BamHI:llä pilkottu 10 ja alkalisella fosfataasilla käsitelty pSK.C 1,1 kb BglII/BamHI-fragmenttiin, joka oli eristetty pUC218/5.6kappa-plasmidista. pSK.C/3'K:ssa kappa-fragmentti sijoittui siten, että transkriptio eteni Sacl-kohdasta plasmidin polylink-kerissä Kpnl-kohdan suuntaan. 2,1 kb DT-kasetti pSK.pgk-15 DTbovGH:sta kloonattiin EcoRI/HindiII-fragmenttina samoihin kohtiin pSK.C:ssä, jolloin saatiin pSK.C/3'K/DT.
Kolmiosaiset ligoinnit suoritettiin lopullisten kohdentamis-plasmidien konstruoimiseksi (kuvio 9). 4,0 kb NotI/Ndel- 20 fragmentti pSK.A/5'K:sta, 4,8 kb Ndel/SacI-fragmentti pSK.B/(TK/0.8/Neo):sta (saatu plasmidin osittaisella Sacl-pilkonnalla ja sen jälkeen Ndel-pilkonnalla), ja 4,0 kb Sa-cI/Notl-fragmentti pSK.C/3'K:sta eristettiin ja liitettiin yhteen, jolloin muodostui pK.(TK/0.8K/Neo). 6,1 kb Notl/Ndel-25 fragmentti pSK.A/DT/5'K:sta, 4,8 kb Ndel/SacI-fragmentti pSK.B/(TK/0.8K/Neo):sta ja 4,0 kb Sacl/NotI-fragmentti pSK.C/3'K:sta eristettiin ja liitettiin yhteen, jolloin muodostui pK.DT/(TK/0.8K/Neo). 6,1 kb NotI/Ndel-fragmentti pSK.A/DT/5'K:sta, 4,8 kb Ndel/Sacl-fragmentti pSK.B/ 30 (TK/0.8K/Neo):sta ja 6,1 kb Sacl/NotI-fragmentti pSK.C/ 3'K/DT:stä (saatu plasmidin osittaisella Sacl-pilkonnalla ja sen jälkeen NotI-pilkonnalla) eristettiin ja liitettiin yhteen, jolloin muodostui pK.DT/(TK/0.8K/Neo)/DT. Elektro-poraatiota varten, puhdistetut plasmidi-DNA:t katkaistiin 35 ensin PvuI:llä tai ApaLI:llä, uutettiin sen jälkeen feno-li/kloroformilla ja saostettiin lisäämällä etanolia ennen sentrifugointia. Tuloksena saadut DNA-pelletit suspendoitiin 56 uudelleen pitoisuudessa 1 mg/ml 10 mM Tris-HCl:ään, 1 mM EDTA(TE):hen.
C. DNA:n toimittaminen soluihin 5
Alkiovaiheen kantasolulinjaa E14-1 viljeltiin kuten edellä esimerkissä III on kuvailtu. Solut tasapainotettiin huoneenlämpötilassa ja PvuI:llä lineaariseksi tehtyä DNA:ta (20 pg/ml) (kuten edellä on kuvailtu) lisättiin. Seos elektropo-10 ratoitiin kuten edellä esimerkissä III on kuvailtu.
D. Konstanttialuekohdistettujen ES-solujen analysointi 7-10 päivän kuluttua G418-lääkeaineen valintapaineessa, kukin 15 erillinen elinkykyinen pesäke poimittiin ja dissosioitiin trypsiinipisarassa kuten edellä esimerkissä III on kuvailtu.
Southern-analyysi suoritettiin käyttäen Bglll:11a pilkottua genomista DNA:ta kustakin näytteestä. 2,3 kb fragmentti to-20 dettiin natiivista ES-solulokuksesta, kun taas suurempi 4, 9 kb fragmentti todettiin kohdennetusta ES-solulokuksesta (kuvio 11), käyttäen koettimena 1,2 kb BamHI/BglII-fragmenttia, joka oli eristetty alkuperäisestä faagi-DNA:sta, joka reunusti fragmenttia, jota käytettiin 3'-homologiaan kohdentamis-25 vektorissa. Fragmentin koko kasvoi, koska Bglll-kohta Bglll/BamHI-fragmentissa menetettiin kohdentamisplasmidissa johtuen Bglll-kohdan liittymisestä BamHI-kohtaan ligaatiossa ja uusi, tymidiinikinaasigeenissä sijaitseva Bglll-kohta toimitetaan kohdelokukseen.
30
Edellä kuvaillusta Southern-analyysin avulla suoritetusta seulonnasta, kaikkiaan 103 kloonista, jotka saatiin kokeista, joissa käytettiin kolmea erilaista kohdentamisplasmidia, 5 solulinjaa identifioitiin, jotka sisälsivät tavoitellun mu-35 taation (taulukko 1).
57
Taulukko 1 CK-kevytketjun kohdentamistulokset E14-l:ssä
Rakenne Souther- Varmis- Klooni- Kohdentu- nilla tettujen tunnus misfrek- seulottu kohden- venssi määrä nettujen kloonien määrä pK.(TK/0.8K- 44 2 625.691 1/22 /Neo) pK.DT(TK/- 42 2 604.611 1/21 0.8/Neo) pK.DT(TK/- 17 1 653 1/17
0.8K/Neo)DT
5
Jatkoanalyysi genomisesta DNA:sta, joka oli tuotettu neljästä positiivisesta kloonista (kloonit 625, 604, 611 ja 653) sulatuksen ja monistamisen jälkeen, varmisti alkuhavainnot. Käyttämällä toista koetinta, 1, 7 kb HindiII/BglII-fragmenttia, 10 joka ulottui kappa-lokuksen J-alueeseen, oikea integraa-tiotulos tarkistettiin homologisen kohdentumisen osalta koh-dentamisvektorin 5'-päässä. Käyttäen siten tätä koetinta genomisen DNA:n EcoRI-hydrolysaatin yhteydessä, 15 kb fragmentti todettiin modifioimattomasta alleelista. Päinvastai-15 sesti, 7,8 kb fragmentti kohdennetusta alleelista havaittiin uuden EcoRI-kohdan toimittamisen seurauksena tymidiiniki-naasigeeniin homologisen integroitumisen aikana (kuvio 11).
E. J-alueen DNA:n in vitro -leikkaus kohdennetuista kloo-20 neista
Halutun deleetion aikaansaamiseksi homologisesti kohdennetusta kappa-lokuksesta, kloonin 653 soluja maljattiin syöttösolujen päälle tiheydessä 0,5-1 x 106 solua/10 cm:n malja, kun 25 läsnä oli sekä gansikloviiriä (2 μΜ) ja G418:aa (150 pg/ml) .
Viisi päivää kestäneen kasvatuksen jälkeen kummankin lääkeaineen läsnäollessa, klooneja poimittiin kuten edellä on kuvailtu 24-kaivoisille levyille ja kasvatettiin vain G418-valintapaineessa. Vielä 5-8 päivän jälkeen 20 % jokaisen 58 kaivon soluista jäädytettiin ja loput käytettiin genomisen DNA:n preparointiin kuten edellä on kuvailtu.
F. ES-solujen analysointi, joista puuttuvat J/konstantti-5 alueet
Southern-analyysi suoritettiin käyttäen BamHI:llä pilkottua genomista DNA:ta kustakin näytteestä. Käyttämällä koettimena 0,8 kb EcoRI-fragmenttia, jota käytettiin ADH:na kohdentamisiin vektoreissa, 12, 7 kb fragmentti todettiin natiivissa ES-solu-lokuksessa, kun taas suurempi suurempi 15,8 kb fragmentti todettiin konstanttialuekohdistetusta ES-solulokuksesta (kuvio 11) käyttäen kloonin 653 DNA:ta. Fragmentin koko kasvoi johtuen tk-geeni-insertiosta, ADH-insertiosta ja neo-geeni-15 insertiosta 12,7 kb BamHI-fragmenttiin. Neo-geenin 3'-päähän oli liitetty myös uusi BamHI-kohta. Käyttämällä solujen DNA:ta, joista puuttui J/konstanttialue, 5,5 kb fragmentti todettiin modifioidusta lokuksesta 12,7 kb fragmentin lisäksi kohdentamattomasta alleelista, restriktiokartta-analyysin 20 mukaan arvioituna. Tästä Southern-analyysin avulla suoritetusta seulonnasta 2 kloonia, jotka oli tuotettu maljatuista 1,5 x 106 ES-soluista (klooni 653), yksi solulinja (klooni 653B) identifioitiin, joka sisälsi tavoitellun J- ja konstantt ialueiden deleetion.
25
Kloonista 653B tuotetun genomisen DNA:n jatkoanalyysi sulatuksen ja monistuksen jälkeen varmisti lähtöhavainnot. Käyttämällä 0,8 kb fragmenttia, deleetio tarkistettiin kahdella toisella restriktiopilkonnalla, joiden pitäisi katkaista 30 leikatun alueen ulkopuolella kohdentamisvektorin 5'- ja 3'-päissä. Käyttäen siten tätä koetinta genomisen DNA:n Bglll-pilkonnan yhteydessä leikkaamattomasta kloonista 653, 2,6 kb fragmentti todettiin sekä modifioimattomista että modifioiduista alleeleista, kun taas ylimääräinen 4,9 kb fragmentti 35 havaittiin vain kohdennetusta alleelista (kuvio 11). Tämä 4,9 kb fragmentti oli sama kuin se, joka todettiin edellä käytetyn 1,2 kb BamHI/BglII-fragmentin kanssa. Käyttäen kloonin 653B DNA:ta, Bglll-pilkonta osoitti 5,8 kb fragmentin 2,6 kb 59 fragmentin lisäksi modifioimattomasta alleelista. Kloonin 653 DNA:n Sacl-pilkonta, tutkittuna 0,8 kb EcoRI-fragmentin avulla, osoitti 5,5 kb fragmentin sekä modifioimattomasta että modifioidusta alleelista, ja 3,1 kb fragmentin vain kohdenne-5 tusta alleelista (kuvio 11). 5,5 kb fragmentti todettiin myös kloonin 653B DNA:ssa ja 2,0 kb lisäfragmentti. 5,8 kb Bglll-fragmentti ja 2,0 kb Scal-fragmentti vastasivat analyysiä arvioidusta restriktiokartasta koskien tarkkaa katkaisuvai-hetta, jossa 10,3 kb DNA:sta poistettiin mukaan lukien J-10 alue, tk-alue ja yksi ADH-kopio.
G. Ituradan kimeirojen muodostaminen
Modifioimattomat E14-l-solut vaikuttivat iturataan korkeata-15 soisesti ruiskuttamisen jälkeen C57BL/6J-blastokysteihin. Kohdennetun ES-solulinjan 691 soluja, joissa vain kappa-konstanttialue on poistettu homologisen rekombinaation avulla ilman negatiivista valikointia, mikroruiskutettiin ja kimee-risiä eläimiä synnytettiin kuten edellä esimerkissä III on 20 kuvailtu. Kohdennetun ES-solulinjan 653B soluja, joista sekä kappa-konstanttialue että J-alue oli poistettu, mikroruisku-tetaan myös ja kimeerisiä eläimiä synnytetään kuten edellä on kuvailtu. Kimeeriset poikaset identifioidaan kimeerisen kar-vavärin perusteella. Modifioidun ES-solun siirtyminen itura-25 dassa ilmaistaan Fl-polven jälkeläisten agouti-karvavärin avulla.
Esimerkki V
Ihmisen raskasketjulokuksen kloonaus käyttäen hiivan kei-30 notekoisia kromosomeja A. Hiivan keinotekoisen kromosomin (YAV) tuottaminen, joka sisältää ihmisen raskasketjun 35 Spel-fragmentti, joka kattaa ihmisen raskasketjun VH6-D-J-Cp- C5-alueen (Berman el: ad., (1988), EMBO J. 1_: 727-738; kuvio 15), eristetään ihmisen YAC-kir jastosta (Burke, et. ai., Science, 236:806-812) käyttäen Bermanin et ad. kuvailemia 60 DNA-koettimia, (1988) EMBO J. Τ_:Ί2Ί-Ί38. Yksi klooni saadaan, jonka pituudeksi arvioidaan noin 100 kb. Eristetty YAC-klooni karakterisoidaan pulssikenttägeelielektroforeesin avulla (Burke et ai., edellä; Brownstein et ai., Science, 244:1348-5 1351) käyttäen radioleimattuja koettimia ihmisen raskasket- julle (Berman et ai., edellä).
B. YAC-kloonien toimittaminen alkioihin tai ES-soluihin 10 Suurimolekyylipainoista DNA:ta preparoidaan agaroositulppiin hiivasoluista, jotka sisältävät kiinnostuksen kohteena olevan YAC:n (so., YAC:n, joka sisältää edellä mainitun Spel-frag-mentin IgH-lokuksesta). DNA fraktioidaan koon mukaan CHEF-geelilaitteella ja YAC-vyöhyke leikataan irti alhaalla sula-15 vasta agaroosigeelistä. Geelifragmentti tasapainotetaan poly-amiinien kanssa ja sulatetaan sitten ja käsitellään agaraasin kanssa agaroosin pilkkomiseksi. Polyamiinilla pinnoitettu DNA ruiskutetaan sen jälkeen hedelmöityneiden hiiren alkioiden koiraspuoliseen esitumaan, jotka alkiot siirretään sen jäl-20 keen kirurgisesti valeraskaan naaraan kohtuun kuten edellä on kuvailtu. Vastasyntyneiden siirtogeeninen luonne analysoidaan hännistä eristetyn DNA:n slot-blottauksella ja ihmisen ras-kasketjun tuotanto analysoidaan ottamalla pieni määrä seerumia ja testaamalla siitä Ig-ketjujen läsnäolo kanin anti-25 ihminen-vasta-aineilla.
Vaihtoehtona mikroruiskutukselle YAC DNA siirretään hiiren ES-soluihin ES-solu : hiivaprotoplast if uusion avulla (Traver el: ai., (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 8_6:5898-5902; Pachnis 30 et ai., (1990), ibid. 8_7:5109-5113) . Ensiksi, neomysiinire- sistenssigeeni pMClNeo:sta tai HPRT tai muu nisäkkään valikoitava markkeri ja hiivan valikoitava markkeri liitetään epäolennaisiin YAC-sekvensseihin plasmidissa. Tätä rakennetta käytetään hiivakannan transformointiin, joka sisältää IgH 35 YAC:n, ja pMClNeo (tai muu valikoitava markkeri) integroidaan IgH YAC:n vektorisekvensseihin homologisen rekombinaation avulla. Modifioitu YAC siirretään sen jälkeen ES-soluun pro-toplastifuusion avulla (Traver et ad., (1989); Pachnis et 61 ai., 1990), ja tuloksena saatavia G418-resistenttejä ES- soluja (tai muun valikoitavan fenotyypin omaavia ES-soluja), jotka sisältävät intakteja ihmisen IgH-sekvenssejä, käytetään kimeeristen hiirten synnyttämiseen. Vaihtoehtoisesti puhdis-5 tettu YAC transfektoidaan, esimerkiksi lipofektion avulla tai kalsiumfosfaattivälitteisen DNA-siirron avulla ES-soluihin.
Esimerkki VI
Ihmisen Iq-geenien toimittaminen hiiriin 10 A. Ihmisen Ig-geenien kloonaus hiivaan 1. Ihmisen IgH YAC -kloonin identifiointi ja karakterisointi, joka sisältää VH-, D-, JH-, mu-(μ) ja deltasekvenssit: 15 PCR-alukkeita ihmisen VH6-geenille (V6A= 5' GCA GAG CCT GCT GAA TTC TGG CTG 3' ja V6B= 5' GTA ATA CAC AGC CGT GTC CTG G 3' ) käytettiin DNA-poolien seulomiseksi the Washington Universityn ihmisen YAC-kirjastosta (Washington University, St. Louis, MO). Positiiviset poolit seulottiin sen jälkeen pesä-20 kehybridisaation avulla ja yksi positiivinen mikrotitrausle-vykaivo, A287-C10, identifioitiin. Kaksi erikokoista (205 kb ja 215 kb) VH6-sisältävää YAC:tä eristettiin nikrotitraus-kaivosta. VH6:n lisäksi pienempi kahdesta IgH YAC:stä, A287-C10 (205 kb) hybridisoitui koettimiin seuraavien sekvenssien 25 suhteen: delta, mu (μ), JH, D, VH1 ja VH4. Suurempi kahdesta
IgH YACrstä, A287-C10 (215 kb), hybridisoitui seuraaviin koettimiin: delta, JH, D, VH1, VH2 ja VH4 mutta ei mu:hun.
YAC:t sisälsivät sekvenssejä vähintään viidestä VH-geenistä, mukaan lukien kaksi VHl-geeniä, yksi VH2-geeni, yksi VH4-30 geeni ja yksi VH6-geeni. Restriktiopilkontojen analysointi osoitti, että 205 kb YAC sisältää deleetion (noin 20 kb kooltaan) , joka poistaa jonkin verran mutta ei kaikkea D-geenirypäleestä, loppuosan YAC:stä näyttäen olevan intakti ja ituratakonfiguraatiossa. 205 kb YAC:n PCR ja yksityiskohtai- 35 nen restriktiopilkonta-analyysi osoitti useiden erilaisten D-geeniperheen jäsenten läsnäolon. 215 kb YAC näytti sisältävän täydellisen pääasiallisen D-geenirypäleen mutta sisälsi deleetion (noin 10 kb), joka poisti mu-geenin. Tämä deleetio ei 62 näytä vaikuttavan JH-rypäleeseen eikä tehostajaan, joka sijaitsee JH- ja mu-geenien välissä.
Edellä mainittujen kahden, toisiaan muistuttavan IgH YAC:n 5 oletettua esimuotoa, noin 225-230 kb YAC:tä, joka sisälsi koko genomisen alueen VH2-geenin ja delta-geenin välissä (Shin et ai., 1991, edellä) (kuvio 15), ei oltu identifioitu A287-C10-mikrotitrauskaivossa. Tästä syystä aikaisempaa erää A287-C10-mikrotitrauslevyn kaivosta tutkittiin YAC:n esimuo-10 don löytämiseksi olettaen, että se oli menetetty kirjastoa seulottaessa. A287-C10-mikrotitrauskaivon sisältö levitysvil-jeltiin (Washington University, St. Louis, MO) ja 2 kymmenestä analysoidusta kloonista sisälsi 230 kb IgH YAC:n toisen, ilmeisesti yhteen kuulumattoman YAC:n kanssa. Klooni 1 sisäl-15 si lisäksi IgH YAC:n, suunnilleen 220 kb YAC:n, ja klooni 3 sisälsi lisäksi suunnilleen 400 kb YAC:n. IgH YAC sisälsi mu:n, täydellisen D-profiilin (perustuen BamHI-pilkontaan, jäljempänä) ja JH:n. IgH YAC kloonista 1 erotettiin fysikaalisesti asiaan kuulumattomasta YACrstä meioottisen segre-20 gaation avulla risteytyksessä A287-C10/AB111380:n ja YPH857:n välillä (genotyyppi = MATa ade2 lys2 ura3 trpl HIS5 CAN1 his3 leu2 cyh2, jolloin saatiin A287-C10 (230 kb)/MP 313 (isännän genotyyppi = MATa ade2 leu2 lys2 his3 ura3 trpl canl cyh2).
25 2. A287-C10 kb YAC:n kohdentaminen nisäkkään valikoitavan markkerin, HPRT:n kanssa: pLUTO (15,6 kb) -niminen YAC:n oikeanpuoleisen käsivarren kohdentamisvektori muodostettiin subkloonaamalla ihmisen 30 HPRT-minigeeni, joka sijaitsi 6,1 kb BamHI-fragmentissa (Reid et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:4299-4303 (1990)), polylinkkerin pLUS BamHI-kohtaan (Hermanson et ai., Nucleic Acids Research 1_9: 4943-4938 (1991)). A287-C10/AB1380-vil jel- mä, joka sisälsi sekä 230 kb IgH YAC:n että erillisen YAC:n, 35 transformoitiin lineaariseksi tehdyn pLUTO:n kanssa ja Lys+-transformantit valikoitiin. Lys+-kloonit seulottiin pesäke-hybridisaation avulla mu:n läsnäolon suhteen. Yksi klooni 63 identifioitiin, joka sisälsi yhden, suunnilleen 245 kb YAC:n, joka hybridisoitui mu:n, HPRT:n ja LYS2:n koettimiin.
230 kb A287-C10:n pLUTO:11a kohdennetun YAC:n Southern-ana-5 lyysi suoritettiin käyttäen useita koettimia ihmisen kloonatun IgH-sekvenssien intaktin, uudelleenjärjestelemättömän luonteen osoittamiseksi. Useimmissa tapauksissa BamHI-, Hin-dlll- ja EcoRI-pilkontoja verrattiin Wl38:n restriktiotu-loksiin (ihmisen alkiovaiheisen sikiön keuhkoperäinen solu-10 linja), A287-C10:n 205 kb ja 215 kb deleetiojohdannaisiin ja julkaistuihin arvoihin. Diversiteetti (D) -geeniprofiili, määritettynä hybridisaation avulla D-alueen koettimen kanssa (0,45 kb NcoI/Pstl-fragmentti; Berman et ai., 1988), osoitti odotetut neljä D-geeniosaa (D1-D4)(Siebenlist et ai., 1981; 15 Nature 294:631-635) . Esimerkiksi BamHI:n yhteydessä, neljä restriktiof ragmentt ia, 3,8 kb, 4,5 kb, 6,9 kb ja 7,8 kb, havaittiin A287-C10:ssä ja Wl38:ssa. WI38 käsitti yhden suuremman lisävyöhykkeen, joka oli oletettavasti lähtöisin kromosomin 16 D5-alueesta (Matsuda et ai., 1988, EMBO J. T_:1041-20 1051). PCR- ja Southern-analyysit D-perhespesifisten alukkei- den ja koettimien kanssa osoitti 215 kb YAC-delee- tiojohdannaisessa (joka näytti sisältävän intaktin D-alueen, jolla oli sama restriktiokuvio kuin 230 kb YAC:llä) 2-4 jäsenen läsnäolon seuraavista D-geeniperheistä: DM, DN, DK, DA, 25 DXP ja DLR. Introninen J-mu-tehostaja, joka sekvensoitiin kloonatuista PCR-tuotteista A287-C10:n 230 kb YAC:stä (aluk-keet EnA = 5' TTC CGG CCC CGA TGC GGG ACT GC 3' ja EnBl = 5' CCT CTC CCT AAG ACT 3') ja todettiin intaktiksi, muodosti myös yksinkertaisia, suunnilleen odotetunkokoisia restrik-30 tiofragmentteja BamHI:llä, EcoRI:llä ja Hindlll:11a, tutkittaessa 480 bp PCR-tuotteen kanssa. JH-alue arvioitiin suunnilleen 6 kb BamHI/Hindlll-koetinfragmentin kanssa, joka kattoi DHQ52:n ja koko JH-alueen (Ravetch et ai., 1981, Cell 21_: 583-591) . A287-C10 muodosti suunnilleen odotetunkokoisia 35 restriktiofragmentteja. Sen lisäksi todettiin samankokoisia restriktiofragmentteja tehostajan ja JH-koettimien kanssa (Ravetch et ai., edellä; Shin et ai., 1991, edellä). A287-C10:ssä ja Wl38:ssa todettu suunnilleen 18 kb BamHI-JH-frag- 64 mentti hybridisoitui myös 0,9 kb mu-koetinsekvenssiin (Ra-vetch et ai., edellä). Hybridisaatiossa mu-koettimen 0,9 kb EcoRI-fragmentin kanssa (Ravetch et ai., edellä) esiintyi suunnilleen odotetunkokoisia restriktiofragmentteja (Ravetch 5 et ad., edellä; Shin et ai., edellä): > 12 kb BamHI (suunnilleen 17 kb odotettu); 0,9 kb EcoRI (0,9 kb odotettu) ja suunnilleen 12 kb HindiII (suunnilleen 11 kb odotettu) . WI38 tuotti samankokoisen BamHI-fragmentin kuin A287-C10. JH- ja DHQ52-alueet sekvensoitiin kummastakin YAC-deleetiojohdannai-10 sesta ja kumpikin olivat ituratakonfiguraatiossa. Delta analysoitiin eksoni l:n PCR-tuotteen kanssa (joka sisälsi suunnilleen 160 bp alueen alukkeiden DIB = 5' CAA AGG ATA ACA GCC CTG 3' ja DID = 5' AGC TGG CTG CTT GTC ATG 3' välissä); restriktiof ragmentit A287-C10:lle olivat lähellä kirjallisuuden 15 perusteella odotettavia (Shin et ai., edellä) ja lähellä Wl38:lle määritettyjä fragmentteja. YAC:n 3'-kloonauskohta voi olla ensimmäinen EcoRI-kohta deltan 3'-puolella (Shin et ai., edellä) tai toinen EcoRI-kohta edempänä 3'-päästä. VH-geenikoettimia VHlrlle, VH4:lle ja VH6:lle (Berman et ai., 20 edellä) ja VH2:lle (takahashi et ai., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8_1:5194-5198) käytettiin YAC: n variaabeligeenisisäl-lön arvioimiseksi. A287-C10 sisältää kaksi VHl-geeniä, jotka ovat likimäärin odotetunkokoisia (Shin et ai., edellä; Matsu-da et ai., 1993, edellä); restriktioanalyysi kolmella entsyy-25 millä tuotti likipitäen odotetut fragmenttikoot; esim. EcoRI :llä todetut vyöhykkeet ovat 3,4 ja 7,8 kb (odotetut koot ovat 3,4 ja 7,2 kb). Ennustetut EcoRI-fragmenttikoot VH4:lle (5,3 kb todettu, 5,1 kb odotettu) ja VH6:lle (0,8 kb todettu, 0,9 kb odotettu) (Shin et ai., edellä; Matsuda et ai., edel-30 lä) tavattiin A287-C10:ssä. Odotettu EcoRI-fragmenttikoko havaittiin VH2:lle (5,5 kb todettu, 5,4 kb odotettu) mutta BamHI- ja HindiII-fragmentit poikkesivat ennustetuista. Bam-HI- ja HindiII-fragmenttien yhtäaikainen hybridisaatio pBR322-koettimen kanssa viittasi siihen, että EcoRI-kohta, 35 joka on VH2-geenin 5'-päässä (Shin et ai., edellä), on 5'-kloonauskohta eliminoiden siten luonnolliset 5'-pään HindiII-kohdan ja BamHI-kohdat. YAC-insertin kokonaiskoko (estimoituna suunnilleen 220 kb) sopii hyvin yhteen ennustetun koon kanssa intaktille, uudelleenjärjestetylle osalle, joka alkaa VH2-geenin 5'-päästä lähinnä 3'-päätä ja ulottuu EcoRI-koh- taan delta-lokuksen 3'-puolella (Shin et ai., edellä).
65 5 3. IgK YAC:n identifiointi ja karakterisointi, jotka sisältä vät CK ja VK-sekvenssit:
Kaksi YAC:tä identifioitiin seulottaessa pulssikenttägeeli (PFG) -pooleja Washingtonin yliopiston (St. Louis, MO) ihmi-10 sen YAC-kirjastosta ihmisen kappa-konstanttialue (CK) -geenin koettimella (2,5 kb EcoRI-fragmentti ATCC n:o 59173, Parklawn Rd., Rockville, MD). YAC:t, joita merkitään tunnuksilla A80-C7 (170 kb) ja A276-F2 (320 kb), sisältävät poistavan kappa-elementin kde, CK:n, JK:n ja intronisen C-J-tehostajän ja 15 ulottuvat kde:n 3'-puolelle. Ulottuen JK:n 5'-puolelle, YAC:t sisältävät myös Bl-, B2- ja B3-VK-geenit, määritettynä hybri-disaation avulla ja /tai PCR:n avulla, ja mahdollisesti muita VK-sekvenssejä. A80-C7/AB1380-kanta sisälsi IgK YAC:n lisäksi erillisen, samankokoisen YAC:n. Näiden YAC:iden erottamiseen 20 käytettiin sen vuoksi meioottista segregaatiota; A80-C7 risteytettiin YPH857:n kanssa ja meioosituote saatiin, joka sisälsi vain IgK YAC:n (MP8-2; isännän genotyyppi = a ade2 leu2 his3 his5 lys2 ura3 trpl canl cyh2). A80-C7- ja A276-F2-YAC:t on kohdennettu pLUTO:n kanssa ihmisen HPRT-minigeenin 25 toimittamiseksi YAC:n oikeanpuoleiseen vektorikäsivarteen.
IgK YAC:iden A80-C7 ja A276-F2:n restriktioanalyysi, käyttäen muutamia entsyymejä, tukee johtopäätöstä, jonka mukaan kumpikin YAC on uudelleenjärjestelemätön (so., ituratakonfiguraa-30 tiossa). Esimerkiksi BamHI-pilkonta, jota seuraa hybridisoin-ti CK-koettimella, osoittaa odotetun 13 kb restriktiofragmen-tin (Klobeck et ai., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 370:1007-1012 (1989)). Samankokoinen vyöhyke hybridisoituu JK-koettimeen (1,2 kb PCR-tuote käytettäessä alukesarjaa JKl-5-alueen mo-35 nistamiseksi), genomisen kartan mukaan arvioituna (Klobeck et ai., edellä) . B3:n, ryhmän IV geeni (koetin on 123 bp PCR- tuote B3-geenistä) tuottaa 4,9 kb BamHI- ja 2,2 kb Bglll-fragmentin, lähellä julkaistuja arvoja 4,6 kb ja vastaavasti 66 2,3 kb (Lorenz et ai., Molec. Immunol. 2_5:479-484 (1988)).
Kummankin IgK YAC:n PCR-analyysi samoin kuin ihmisen genomi-sen DNA:n seuraaville kappa-lokussekvensseille osoitti arvioidut vyöhykekoot: Kde (120 bp), CK (304 bp), introninen C-J-5 tehostaja (455 bp) , JK1-5 (1204 bp) , B3 VK (123 bp) ja B1 VK
-pseudogeeni (214 bp). Sekvenssit, joita käytettiin PCR-alukkeiden konstruointiin CK-, JK- ja C-J-tehostaja-alueille, ovat julkaisusta Whitehurst et ai., Nucl. Acids Res. 20:4929-4930 (1992); Kde on julkaisusta Klobeck ja Zachau, Nucl.
10 Acids Res. 1_4 : 4591-4603 (1986); B3 on julkaisusta Klobeck et ai., Nucl. Acids Res. M3: 6515-6529 (1985) ja B1 on julkaisusta Lorenz et ai., edellä.
B. 680 kb yHPRT YAC:n toimittaminen ES-soluihin 15 1. yHPRT-hiivakannan viljely ja hiivasferoplastien valmista minen 680 kb yHPRT on YAC, joka sisältää toiminnallisen kopion ihmisen hypoksantiinifosforibosyylitransferääsi (HPRT) 20 geenistä kloonattuna YAC-kirjastosta kuten Huxley et ai., (1991) on kuvaillut, Genomics 9^:742-750. yHPRT:n sisältävää hiivakantaa kasvatettiin niukasti urasiilia ja tryptofaania sisältävissä nestemäisissä alustoissa kuten Huxley et ai., (1991), edellä on kuvaillut.
25
Hiivasferoplastien valmistamiseksi 400 ml hiivaviljelmää, joka sisältää yHPRT:n, sentrifugoitiin ja hiivapelletti pestiin kertaalleen vedellä ja kertaalleen 1 M sorbitolilla. Hiivapelletti suspendoitiin uudelleen SPEM:iin (1 M sorbito-30 li, 10 mM natriumfosfaatti pH 7,5, 10 mM EDTA pH 8,0, 30 mM
β-merkaptoetanoli) pitoisuudessa 5 x 108 hiivasolua/ml. Zymo-lase 20T:tä lisättiin pitoisuudessa 150 pg/ml hiivasoluja ja viljelmää inkuboitiin 30°C:ssa kunnes 90 % soluista oli sfero-plasteja (tavallisesti 15-20 minuutin ajan). Solut pestiin 35 kahdesti STC:ssä (1 M sorbitoli, 10 mM Tris pH 7,5, 10 mM
CaCl2) ja suspendoitiin uudelleen STC:hen pitoisuudessa 2,5 x 108/ml.
67 2. E14TG2a ES -solujen viljely HPRT-negatiivista ES-solulinjaa El4TG2a viljeltiin kuten edellä on kuvailtu.
5 3. ES-solujen ja hiivasferoplastien fuusio
Eksponentiaalisesti kasvavia El4TG2a-ES-soluja, joita kasvatettiin gelatiinipinnoitetuilla maljoilla, käsiteltiin tryp-10 siinillä ja pestiin kolme kertaa seerumivapaalla DMEM:llä.
2,5 x 108 hiivasferoplastia käsittävä pelletti peitettiin varovasti 5 x 106 ES-solulla, jotka sentrifugoitiin hiivapel-letin päälle. Yhdistetty pelletti suspendoitiin uudelleen 0,5 ml:aan joko 50 %:ista polyetyleeniglykolia (PEG) 1500 tai 50 15 %:ista PEG 4000:tta (Boehringer Mannheim), joka sisälsi 10 mM CaCl2:a. Inkuboinnin kestettyä 1,5 minuuttia huoneenlämpötilassa tai 37°C:ssa, 5 ml seerumivapaata DMEM:iä lisättiin hitaasti ja solut jätettiin huoneenlämpötilaan 30 minuutin ajaksi. Solut sentrifugoitiin sen jälkeen ja suspendoitiin 20 uudelleen 10 ml:aan ES-solujen täydellistä alustaa (jota edellä on kuvailtu) ja maljattiin yhdelle 100 mm:n maljalle, joka oli pinnoitettu syöttösoluilla. 24 tunnin kuluttua alusta korvattiin tuoreella alustalla. Neljäkymmentäkahdeksan tuntia fuusion jälkeen HAT-valikointi toteutetiin (ES-alus-25 tat, jotka sisälsivät lxlO-4 M hypoksantiinia, 4xl0~7 M amino-pteriiniä, Ι,βχΙΟ-5 M tymidiiniä). Hat-resistentit pesäkkeet todettiin 7-10 päivää fuusion jälkeen maljoilla molemmissa käytetyissä eri fuusio-olosuhteissa. yHPRT-ES ("ESY") -fuu-siopesäkkeitä poimittiin ja siirrostettiin syöttösolupinnoi-30 tetuihin kaivoihin ja kasvatettiin jatkoanalyysiä varten.
4. yHPRT-ES-fuusioklooneihin integroituneen YAC DNA:n analysointi 35 23:sta yHPRT-ES-fuusiopesäkkeestä uutettu DNA pilkottiin Hindin :11a ja analysoitiin Southern-blottauksella (kuvio 12) käyttäen koettimia: ihmisen repetitiivinen Alu-sekvenssi (A); pBR322-spesifiset sekvenssit oikeanpuoleisille (B) ja vasem- 68 manpuoleisille (C) YAC-vektorikäsivarsille; hiivan repetitii-vinen Ty-sekvenssi (D); hiivan yksikopiogeeni LYS2 (E). Ihmisen HPRT-koetinta, 1,6 kb täyspitkää cDNA:ta (Jolly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8^:477-481 (1983)) käytettiin 5 ihmisen HPRT-geenin läsnäolon varmistamiseksi ESY-klooneissa. Alu-koetin oli 300 bp BamHI-fragmentti BLUR8 Alu-elementistä pBP63A:ssa (Pavan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1300-1304 (1990)). Oikeanpuoleiset ja vasemmanpuoleiset vektorikä-sivarsikoettimet olivat pBR322-peräisiä BamHI-PvuII 1,7 ja 10 vastaavasti 2, 7 kb fragmentteja, jotka vastaavat vektorisek-venssejä pYAC4:ssä (kaavio a, b (Burke et al. : Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Guthrie ja Fink, editorit, Academic Press, 194:251-270 (1991)).
4,5 kb fragmentti, jonka ilmaisi oikeanpuoleinen käsivarsi-15 koetin, kattaa alueen välillä Hindlll-kohta telomeerin 5'-päässä ja ensimmäinen HindiII-kohta ihmisen insertissä (kaavio a). 3 kb ja 4,1 kb fragmentit, jotka vasemmanpäänpuolei-nen koetin ilmaisi, vastaavat aluetta välillä Hindlll-kohta telomeerissä ja hiivasekvenssien 5'-puoleinen Hindlll-kohta, 20 ja aluetta, joka ulottuu HindiII-kohdasta sentromeerin 3'-puolella vastaavasti ihmisen inserttiin (kaavio b) . Ero näiden kahden vyöhykkeen hybridisaatiointensiteetissä liittyy eroon homologian määrässä näiden fragmenttien ja koettimen välillä. Hiivan repetitiivinen Ty-koetin (Philippsen et al., 25 Gene Expression in Yeast, Proceedings of the Alko Yeast Symposium, Helsinki, Korhola ja Väisänen, editorit, Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research, _1:189-200 (1983)) oli 5,6 kb fragmentti, joka oli eristetty Tyl:n sisältävästä pJEF742:sta, joka kykeni ilmaisemaan myös Ty2:n 30 3' HindiII-fragmentin, johtuen homologiasta kahden elementin välillä. LYS2-geenikoetin oli 1,7 kb BamHI-fragmentti pLUS:sta (Hermanson et al., Nucl. Acids Res. 19:4943-4948 (1991)) .
35 Hybridisaatio ihmisen HPRT-koettimen kanssa (täyspitkä 1,6 kb cDNA-koetin) osoitti, että kaikki analysoidut kloonit sisälsivät samat 15, 7 ja 5 kb eksonin sisältävät fragmentit ihmi sen HPRT-geenistä kuin yHPRT YAC. Samojen blottien uudelleen- 69 tutkiminen ihmisen repetitiivisellä 300 kb Alu-sekvenssi-koettimella osoitti, että kaikki analysoidut kloonit sisälsivät, useimmat elleivät kaikki, yHPRT:ssä läsnäolevat Alun sisältävät fragmentit (kuvio 12A) . Nämä tulokset osoittavat, 5 että useimmissa analysoiduissa klooneissa 680 kb ihmisen insertti ei ollut ilmaistavasti uudelleenjärjestelty tai sitä ei oltu poistettu integraation yhteydessä ES-solugenomiin. YAC-vektorisekvenssien integroitumista tutkittiin käyttäen vektorikäsivarsille spesifisiä koettimia. Samojen blottien 10 uudelleenhybridisointi oikeanpuoleisen YAC-vektorikäsivarren koettimen kanssa, joka ilmaisi 4,5 kb HindiII-fragmentin, osoitti, että 10:ssä kloonissa 23:sta analysoidusta kloonista oikeanpuoleinen YAC-käsivarsi telomeeriin asti oli yhä intak-ti ja uudelleenjärjestelemätön ja kytkettynä ihmisen insert-15 tiin (kuvio 12B) , ollen siten lisäosoituksena YAC:n eheydelle näissä klooneissa. Vasemmanpuoleisen käsivarren koetin ilmaisi 3 kb ja 4, 1 kb HindiII-yHPRT-fragmentit kahdeksassatoista kloonissa 20:stä analysoidusta kloonista (kuvio 12C), mikä osoitti vasemmanpuoleisen käsivarren retention korkean frek-20 venssin.
yHPRT:n rakenteellinen eheys ESY-klooneissa jatkoarvioitiin kahden kloonin osalta (ESY 5-2 ja 8-7) käyttäen pulssikent-tägeeli-restriktioanalyysiä. Hiivassa, joka sisälsi yHPRT:n, 25 viisi suunnilleen seuraavankokoista Sfi-fragmenttia määriteltiin eri koettimien avulla: 315 kb (Alu, vasen käsivarsi), 145 kb (Alu, HPRT); 95 kb (Alu, oikea käsivarsi), 70 ja 50 kb (vain Alu). Molemmissa ES-klooneissa sisäiset HPRT-fragmentit ja Alu-spesifiset fragmentit olivat kooltaan samanlaiset 30 yHPRT-fragmenttien suhteen. Kummallakin kloonilla ilmaistut loppupään fragmentit olivat suuremmat kuin yHPRT:llä kuten oli odotettavissa hiiren kromosomiin integroituneen YAC:n osalta: 185 ja vastaavasti 200 kb oikeanpuoleisen pään frag mentilla ja yli 800 kb vasemmanpuoleisen pään fragmentilla 35 kummallakin kloonilla. Nämä tulokset yhdessä Alu-profiilin kanssa ovat lisäosoituksena YAC:n rakenteellisen eheyden retentiosta näissä klooneissa. Näitä tutkimuksia täydennettiin in situ fluoresenssihybridisaation avulla, joka suorite- 70 tiin ESY 8-7 (kuvio 13 A, B) ja ESY 8-6 metafaasin kromosomi-levitteillä, joissa yksi integroitumiskohta todettiin ihmisen sekvensseille. Mikrovalokuvat tyypillisistä metafaasilevit-teistä (kuvio 13 A, B, C) tai interfaasitumista (kuvio 13 D) 5 ESY 8-7 -soluista (kuvio 13 A, B) , hybridisoituina biotiny-loitujen ihmisen genomisten sekvenssien kanssa ja ESY 8-6 -soluista (kuvio 13 C, D) , hybridisoituina biotinyloitujen hiivan DNA:n toistosekvenssien kanssa. Ihmisen koetin muodostettiin ihmisen genomisesta istukan DNA:sta (Clontech, Palo 10 Alto, CA) . Hiivakoetin käsitti DNA-fragmenttiseoksen, jotka koodittivat hiivan toistoelementtejä; delta (pdelta6:n 1,08 kb Sau3A-fragmentti (Gafner et ai., EMBO J. 2_:583-591 (1983)) ja Ty (p29:n 1,35 kb EcoRI-Sall-fragmentti (Hermanson et ai., Nucl. Acids Res. 1_9:4943-4948 (1991)), rDNA: t (4,6 kb Bglllk-15 A L90 ja 4,4 kb BglII-B L92 -fragmentti (Keil ja Roeder, Cell 3_9:377-386 (1984)) ja Y' -telomeerielementit (pl98:n 2,0 kb ja 1,5 kb BglII-HindiII-fragmentit (Chan ja Tye, Cell 33:563-573 (1983)). Kromosomin metafaasilevitteissä olevien sekvenssien hybridisoituminen biotinyloitujen koettimien kanssa ja il-20 maiseminen avidiini-FITC:n avulla, jota seurasi biotiini-anti-avidiini- ja avidiini-FITC-monistaminen, suoritettiin kuten Trask ja Pinkel ovat kuvailleet, Methods Cell Biol. 3_0:383-400 (1990), käyttäen Zeiss Axiophot -mikroskooppia.
Kromosomit vastavärjättiin propidiumjodidilla. Esitetyt mik-25 rovalokuvat edustavat 95 % metafaasilevitteistä tai inter- faasitumista skannattuina kolmessa itsenäisessä kokeessa, jotka suoritettiin ihmisen tai hiivan koettimilla. Yksi in-tegraatiokohta todettiin ihmisen sekvensseillä.
30 Samat blotit tutkittiin myös hiivan repetitiivisen Ty-ele-menttisekvenssin kanssa hiivan genomisten DNA-sekvenssien läsnäolon ilmaisemiseksi ESY-klooneissa (kuvio 12 D) . Samalla kun joidenkin kloonien todettiin sisältävän suurimman osan Ty:n sisältävistä fragmenteista, jotka olivat läsnä emohiiva-35 kannassa, joidenkin kloonien todettiin sisältävän hyvin pienen fraktion jos sitäkään Ty:n sisältävistä fragmenteista. Nämä tulokset osoittavat, että joissakin ES-klooneissa, vaikka YAC DNA on integroitunut intaktina, vain vähän tai ei 71 lainkaan hiivan genomisesta DNA:sta oli integroitunut. Sen määrittämiseksi, oliko hiivan kromosomaalinen DNA integroitunut yhdessä tai monessa kohdassa ES-solugenomiin, fluoresoiva in situ -hybridisaatio suoritettiin ESY-kloonilla 8-6, joka 5 sisälsi täydellisen Ty-profiilin. Yksi integraatiokohta todettiin käyttäen yhdistettyä hiivan repetitiivistä koetinta (kuvio 13 C, D), mikä osoitti sen, että erotuskyvyn puitteissa kaikki hiivan DNA-fragmentit integroituvat yhtenä ryhmänä.
10 Käyttämällä ES-solujen kykyä läpikäydä in vitro säännönmukainen erilaistuminen, YAC:n pysyvyys ja integroidun DNA:n vaikutus ES-solujen pluripotenssiin tutkittiin. Neljällä ES-kloonilla, jotka sisälsivät erilaisia hiivan DNA-määriä (ESY 5-2, 3-6, 8-6 ja 8-7) esiintyi erilaistumismalli, jota ei 15 voinut erottaa fuusioitumattomien ES-solujen mallista: alkio-vaiheen osasten muodostuminen, joka synnytti useita erilaistuneita solutyyppejä (kuvio 14 A) . Southern-blottausanalyysi suoritettiin DNA:11a, joka oli uutettu erilaistuneesta ESY 5-2:sta, 3-6:sta, 8-5:stä ja 8-6:sta (20 pg) ja yHPRT:stä 20 AB1380:ssä (40 ng) , käyttäen (a) ihmisen Alu-koetinta; (b) hiivan Ty-sekvenssejä. ES-kloonit indusoitiin muodostamaan alkiovaiheen osasia viljelemällä aggregaatteina suspensiossa 10-14 päivän ajan kuten Martin ja Evans ovat kuvailleet, Cell 6_:467-474 (1975). Uudelleenkiinnittymisen jälkeen kudosvilje- 25 lyalustaan ESY-peräiset alkiovaiheen osaset synnyttivät erilaistuneita solutyyppejä. YAC- ja hiivasekvenssit säilyivät erilaistuneiden ES-kloonien yhteydessä 40 päivän viljely-aikana ei-valikoivassa alustassa, mikä osoitti, että pysyvästi integroitunut vieras DNA ei huonontanut ES-solujen pluri-30 potenssia (kuvio 14 B) . Erilaistuneissa viljelmissä säilyi ihmisen toiminnallinen HPRT-geeni, minkä osoitti niiden normaali kasvu ja erilaistuminen siirrettäessä HAT-valikoivaan alustaan.
35 5. Kimeeristen hiirten synnyttäminen yHPRT-ES-solulinjoista ESY-solujen kyky asettua uudelleen hiiriin, mukaan lukien iturata, osoitettiin mikroruiskuttamalla ES-soluja hiiren 72 blastokysteihin ja muodostamalla kimeerisiä hiiriä. ESY-soluja mikroruiskutettiin C57BL/6J hiiren blastokysteihin ja kimeerisiä hiiriä synnytettiin kuten edellä on kuvailtu. Kimeerisiä koiraita pariutettiin C57BL/6J-naaraiden kanssa ja 5 siirtyminen ituradassa määritettiin agouti-jälkeläisten läsnäolon perusteella. Kimeeristen hiirten hännistä preparoidusta genomisesta DNA:sta analysoitiin yHPRT DNA:n läsnäolo hiiren genomissa PCR-analyysin avulla. YAC:n vasemman käsivarren läsnäolo analysoitiin käyttäen kahta alukeoligonukleo-10 tidiä, 5' TTCTCGGAGCACTGTCCGACC ja 5' CTTGCGCCTTAAACCAACTTGG-TACCG, jotka saatiin pBR322-sekvensseistä ja vastaavasti SUP4-geenistä YAC:n vasemman vektorikäsivarren alueelta. 259 bp PCR-tuote saatiin hiivan analysoinnista, joka sisälsi yHPRT- ja ESY-solulinjät. PCR-analyysissä hännän DNA:sta, 15 joka oli preparoitu 18 kimeerisestä hiirestä, synnytettyinä ESY-solulin joista ESY 3-1, ESY 3-6 ja ESY 5-2, saatiin odotettu PCR-tuote, mikä siten osoitti YAC:n vasemman vektorikäsivarren läsnäolon kimeeristen hiirten genomissa.
20 6. yHPRTrn siirtyminen ituradassa
Kimeerisiä uroksia, joiden karvavärikimeerisyys oli 30-60 %, ja jotka olivat peräisin ESY-solulinjoista ESY 3-1 ja ESY 5-2, valmisteltiin pariuttamista varten siirtymisen arviointia 25 varten ituradassa, so. sen määrittämiseksi, oliko geneettinen modifikaatio siirtynyt itusolujen (sperma tai munasolut) välityksellä eläinten jälkeläisiin. Kolme kimeerisistä, ESY 3-1 -peräisistä uroksista, 394/95-1, 394/95-2 ja 411-1 siirsi ES-solugenomin jälkeläisilleen frekvenssin ollessa 20 %, 30 % ja 30 vastaavasti 30 %. Agouti-poikasten häntä-DNA:n Southern-blot-tausanalyysi osoitti yHPRT:n läsnäolon kolmen hiiren genomissa, 4-2, 4-3 ja 5-1, jotka olivat peräisin 394/395-2-kimei- rasta. Sellaisesta analyysistä saatu Alu-profiili oli erottamaton kantasolulinjan ES 3-1 vastaavasta (kuvio 14 C) , mikä 35 osoitti, että 680 kb ihmisen insertti oli siirtynyt tarkasti hiiren ituradan välityksellä.
73 Käyttäen ihmisen HPRT-spesifistä PCR-määritystä mRNA-peräi-seen cDNArhan yHPRT:n sisältävistä jälkeläisistä, ihmisen HPRT-geenin ilmentyminen kaikissa testatuissa kudoksissa todettiin (kuvio 15 A ja B) , mikä osoitti siten, että siirty-5 nyt YAC säilytti funktionsa tarkasti. Tässä kokeessa ihmisen HPRT mRNA ilmaistiin käänteistranskriptio (RT) -PCR:n avulla ES-, ESY 3-1 - ja Hut 78 (ihmisen) -soluissa, pernassa ja maksassa kontrollihiirestä (C) tai 4-3-agouti-jälkeläisissä (peräisin 394/95-2-kimairasta) ja näytteestä, joka ei sisäl-10 tänyt templaatti-DNA:ta (osoitettu "-":11a kuviossa 15A). Poly (A+) RNA:n käänteistranskriptio ja spesifisten cDNA-sekvenssien PCR-monistus suoritettiin käyttäen cDNA Cycle Kit'iä (Invitrogen). 626 bp fragmentin spesifinen monistami nen ihmisen HPRT cDNA:sta hiiren HPRT cDNA:n läsnäollessa 15 suoritettiin kuten Huxley et ai., edellä, ovat kuvailleet. Kaikkien RNA-näytteiden yhtenäisyys osoitettiin cDNA:n PCR-monistuksella hiivan γ-interferonin reseptorista. 359 bp fragmentin monistamiseen käytetyt alukkeet olivat: GTATGTG- GAGCATAACCGGAG ja CAGGTTTTGTCTCTAACGTGG. Ihmisen HPRT:n ja γ-20 interferonin reseptorin alukkeet konstruoitiin eliminoimaan mahdollisuus saada PCR-tuotteita genomisen DNA:n kontaminaatiosta. PCR-tuotteet analysoitiin elektroforeesin avulla ja visualisoitiin etidiumbromidilla. Kokomarkkereina oli 1 kb markkerisarja (BRL). Kuviossa 15 B on esitetty tulokset hii-25 ren γ-interferonin reseptorin mRNA:n ilmaisemisesta RT-PCR:n avulla edellä kuvailluista näytteistä. Ihmisen spesifinen HPRT mRNA ilmaistiin myös muissa testatuissa kudoksissa (aivot, munuaiset ja sydän), jotka olivat peräisin 4-3-hiirestä. Vastaavia vakaatilan tasoja hiiren ja ihmisen HPRT mRNA:sta 30 todettiin yHPRT:n sisältävien jälkeläisten maksasta. Nämä tulokset osoittavat, että niinkin paljon kuin 13 megaemäksen sisäänotto hiivan genomista DNA:ta ei ollut haitallista oikealle kehittymiselle, siirtymiselle ituradassa tai geenin ilmentymiselle.
Edellä olevat tulokset osoittavat, että hiivan sferoplastit ovat tehokas vehikkeli yksikopioisen suurimolekyylipainoisen DNA-fragmentin toimittamiseksi ES-soluihin, ja että sellaiset 35 74 molekyylit siirtyvät pysyvästi ja toiminnallisina hiiren ituradan läpi. Alu-profiilit, täydennettyinä PFGE-analyysillä ja in situ hybridisaatiolla joidenkin ES-kloonien osalta, vakuuttavat voimakkaasti, että suurin osa klooneista sisälsi 5 tosiasiassa koko ihmisinsertin uudelleenjärjestelemättömässä muodossa (so. "ituratakonfiguraatiossa"), suuren kloonimäärän (40 %) käsittäessä myös molemmat YAC-käsivarret. Hiivan geno-misen DNA:n merkittävä sisäänotto ei ollut haitallista ES-solujen oikealle erilaistumiselle in vitro ja in vivo, eikä 10 estänyt siirtymistä ituradassa eikä geenin ilmentymistä. Näiden menetelmien avulla voidaan siirtää genomisen DNA:n suuria fragmentteja insertteinä hiiren genomiin, jossa inser-tit voidaan siirtää intakteina ituratasiirtymisen välityksellä. Useanlaista ksenogeenista DNA:ta voidaan sillä tavalla 15 toimittaa hiiri-isäntiin, jotka voivat antaa uusia fenotyyppejä tai uusia genotyyppejä. Hiiriin voidaan esimerkiksi toimittaa geenejä nisäkkäästä kuten ihmisestä, taudin etiologian tutkimiseksi, ihmisgeenien vasteeseen useanlaisille aineille. Vaihtoehtoisesti on mahdollista toimittaa suuria 20 lokuksia hiiri-isäntään muiden lajien tuotteiden tuottamiseksi, esimerkiksi ihmisten, ihmisproteiinien proteiinisekvens-sien toimittamiseksi kuten immunoglobuliinien, T-soluresepto-reiden, tärkeimpien histokompatibiliteettikompleksiantigeeni-en jne.
25
Raskasketjun YAC A287-C10 ja kappa-ketjun YAC A80-C toimittaminen ES-soluihin ja -alkioihin
Hiivasta, joka sisälsi ihmisen raskasketjun YAC A287-C10 30 kohdistettuna pLUTO:11a (yA287-C10) tehtiin sferoplasteja ja fuusioitiin HPRT-vajaan ES-solulinjän E14.1TG3Bl:n kanssa kuten edellä on kuvailtu. HAT-resistenttejä ES (ESY) -klooneja (2B, 2C, 2D, 3A, 3B, 5C, 1125A, 100/1500 ja 100/4000) poimittiin ja kasvatettiin DNA-analyysiä varten. Integroituni neen YAC:n määrittäminen suoritettiin näiden kloonien Hindll-I:lla pilkotun DNA:n Southern-blottausanalyysin avulla käyttäen ihmisen raskasketjukoettimia D-, JH-, μ- ja VH2-alueille, joita edellä on kuvailtu. Kaikkien ESY-kloonien todettiin 75 sisältävän odotettuja > 10 kb JH- ja μ-fragmentteja. Kaikkien ESY-kloonien, lukuun ottamatta 2D- ja 5C-klooneja, todettiin sisältävän 4,8 kb VH2 kb fragmentin. Kaikkien ESY-kloonien paitsi 2D:n ja 3B:n todettiin sisältävän odotetut 10 ja 7,6 5 kb D-geenifragmentit. Hiivan genomiset sekvenssit todettiin hybridisaation avulla hiivan repetitiiviseen Ty-elementtiin kaikissa ESY-klooneissa paitsi 2B:ssä, 2D:ssä, 100/1500:ssa ja 5C:ssä. ESY-kloonit 2B, 3A ja 5C mikroruiskutettiin C57B/6 blastokysteihin, joita edellä on kuvailtu, ja kimeerisiä 10 hiiriä (10 2B-kloonista, 1 3A-kloonista ja 1 5C-kloonista) synnytettiin. Southern-blottausanalyysi häntä-DNA:sta kymmenestä näistä kimeerisistä hiiristä osoitti suurimman osan ellei kaikkien selvien 10 Alu-fragmentin läsnäolon, ilmaisi yA287-C10:n hiivassa, samoin kuin VH2- ja D-geenifragmentit. 15 Synnytettyjä kimeerisiä hiiriä risteytettiin C57BL16J-hiirten kanssa ituratasiirtymisen arvioimiseksi. Kimeerinen uros 78K-3 2B-kloonista siirsi ES-solugenomin jälkeläisilleen frekvenssillä 100 %. Häntä-DNA:n Southern-analyysi 4:Itä 6:sta agouti-hiirenpoikasista osoitti ihmisen raskasketjusekvenssi-20 en läsnäolon.
Fuusiokokeet hiivalla, joka sisälsi ihmisen kappa-ketjun YAC A87-C7 kohdennettuna pLUTOrlla (yA80-V7) E14.1TG3B1 ES-solu- jen yhteydessä, tuottivat 2 HAT-resistenttiä ESY-kloonia: 25 M4.4.1 ja M5.2.1. Southern-blottausanalyysi näiden kloonien HindiII-pilkotusta DNA:sta osoitti kaikkien selvien 10 Alu-fragmentin läsnäolon todettuna yA80-C7:ssä hiivassa. Kummassakin kloonissa hiivan genomiset sekvenssit olivat integroituneet. ESY-klooneja mikroruiskutettiin C57Bl/6J-blastokys-30 teihin ja kimeerisiä hiiriä synnytettiin.
Esimerkki VII
Ihmisen Ig:n tuottaminen kimeerisillä hiirillä toimittamalla ihmisen Ig käyttäen homologista rekombinaatiota 35
Vaihtoehtona esimerkeissä I-VI esitetyille lähestymistavoille ihmisen Ig-geenejä toimitetaan hiiren Ig-lokukseen korvaamalla hiiren raskas- ja kevytketjuimmunoglobuliinien lokukset 76 suoraan fragmenteilla ihmisen raskas- ja kevytketjulokuksista käyttäen homologista rekombinaatiota. Tätä seuraa kimeeristen siirtogeenisten eläinten synnyttäminen, joissa alkiovaiheen kantasoluperäiset solut myötävaikuttavat iturataan.
5 A. Ihmisen raskasketjun vaihtovektorin konstruointi
Ihmisen sekvenssien vaihtaminen käsittää genomisen DNA:n Spel 100 kb fragmentin, joka sisältää ihmisen VH6-D-J-Cp-C5-ras-10 kasketjualueen eristettynä ihmisen YAC-kirjastosta, jota edellä on kuvailtu. Geeninviereiset hiiren raskasketjusek-venssit, jotka ohjaavat korvaustapahtuman homologista rekombinaatiota, sisältävät hiiren Cs-Ca-raskasketjun 10 kb BamHI-fragmentin ja 5' J558-fragmentin, joka käsittää hiiren ras-15 kasketjun variaabelialueen J558-fragmentin 5'-puoliskon ihmisen sekvenssien 3'- ja vastaavasti 5'-päissä (kuvio 16). Nämä hiirisekvenssit eristetään hiiren alkion genomisesta kirjastosta käyttäen Tuckerin et ai. kuvailemia koettimia (1981), PNAS USA, 7_8.: 7684-7688 ja vastaavasti Blankensteinin ja Kra-20 winkelin kuvailemia koettimia (1987), edellä. 1150 bp Xhol-BamHI-fragmentti, joka sisältää neomysiiniresistenssigeenin, jota ohjaavat herpes simplex -viruksen tymidiinikinaasigeenin (HSV-tk) promoottori ja polyoomatehostajasekvenssi, eristetään pMClNeos:sta (Koller ja Smithies, 1989, edellä). Syn-25 teettänen adaptori lisätään tähän fragmenttiin Xhol-pään muuttamiseksi BamHI-pääksi, ja tuloksena saatava fragmentti liitetään BamHI hiiren Cs-Cocaan plasmidissa.
YAC-kloonista, joka sisältää ihmisen raskasketjulokuksen, 30 DNA-sekvenssejä insertin kummastakin päästä otetaan talteen joko käänteisen PCR:n avulla (Silverman et a_L., (1989), PNAS, _86_: 7485 — 7489) tai plasmidivapautuksen avulla E. colissa, (Burke et ai., (1987); Garza et ai., (1989) Science, 246:641-646; Traver et ai., 1989) (kuvio 8) . Eristetty ihmisen sek-35 venssi YAC:n 5' V6-päästä liitetään hiiren J558-sekvenssiin plasmidissa ja vastaavalla tavalla ihmisen sekvenssi YAC:n 3' Cd-päästä liitetään Neo-geeniin plasmidissa, joka sisältää edellä kuvaillut Neo:n ja Cs-Cocn. Ihmisen V6-hiiri J558- 77 segmentti subkloonataan sen jälkeen puoli-YAC-kloonausvekto-riin, joka sisältää hiivan valikoitavan markkerin (HIS3), joka ei ole läsnä alkuperäisessä IgH YAC:ssä, sentromeerin (CEN) ja yhden telomeerin (TEL). Ihmisen C5-Neo-hiiri Cs-Ca 5 subkloonataan vastaavalla tavalla erilliseen puoli-YAC-vekto-riin, jossa on erilainen hiivan valikoitava markkeri (LEU2) ja yksi TEL. Puoli-YAC-vektori, joka sisältää ihmisen V6-DNA:n, linearisoidaan ja sitä käytetään hiivakannan transfor-mointiin, josta on poistettu kromosomaaliset HIS3- ja LEU2-10 lokukset, ja joka sisältää IgH YAC:n. Histidiiniprototrofiän suhteen valikointi tuottaa hiivapesäkkeitä, joissa on tapahtunut homologista rekombinaatiota ihmisen V6 DNA -sekvenssien välillä, ja jotka sisältävät yhdistelmä-YAC:n. Puoli-YAC-vektori, joka sisältää ihmisen C5 DNA:n, tehdään sen jälkeen 15 lineaariseksi ja sitä käytetään edellisessä vaiheessa synnytetyn hiivakannan transformointiin. Leusiiniprototrofiän suhteen valikoinnista on seurauksena hiivakanta, joka sisältää kokonaisen IgH:n vaihto-YAC:n (kuvio 16). Molemmat koh-dentamistapahtumat suoritetaan edullisesti yhdessä trans-20 formaatiovaiheessa, valikoiden yhtäaikaisesti leusiini- ja histidiiniprototrofiän suhteen. Tämä on erityisen käyttökelpoista, kun alkuperäiset sentriset ja asentriset YAC-käsivar-ret ovat vastakkaisessa orientaatiossa kuviossa 16 esitettyyn nähden. Tämä YAC eristetään ja toimitetaan ES-soluihin mikro-25 ruiskutuksen avulla kuten edellä on kuvailtu alkioiden osalta.
Esimerkki VIII
Siirtogeenisten hiirien risteyttäminen 30 A. Ihmisen monoklonaalista vasta-ainetta tuottavien hiirten synnyttäminen
Hiiriä, jotka sisältävät ihmisen immunoglobuliinilokuksen, 35 pariutetaan hiirten kanssa, joiden hiiri-immunoglobuliinigee-nit on inaktivoitu, hiirten synnyttämiseksi, jotka tuottavat vain ihmisen vasta-aineita. Aloittaen neljällä heterotsygoottisella kannalla, kolme risteytyspolvea tarvitaan hiiren syn- 78 nyttämiseksi, joka on homotsygoottinen hiiren inaktiivisen kappa- ja kevytketjuimmunoglobuliinien suhteen ja heterotsygoottinen ihmisen raskasketju- ja kappa-kevytketjulokusten suhteen. Risteytyskaavio on esitetty kuviossa 17.
5
Esimerkki IX
Ihmisen monoklonaalisten vasta-aineiden tuottaminen A. Hiirten immunisointi 10
Ituratakimeerisiä hiiriä, jotka sisältävät ihmisen integroituneen DNA: n immunoglobuliinilokuksista, immunisoidaan ruiskuttamalla antigeeniä adjuvantissa. Hiiret tehosteruisku-tetaan antigeenillä 14 päivää primaari-immunisaation jälkeen, 15 toistaen 35 ja 56 päivän jälkeen. Immunisoiduista eläimistä otetaan verta immunisoivan antigeenin vastaisten seerumivas-ta-aineiden tiitterin testaamiseksi. Suurimman tiitterin omaava hiiri tapetaan ja perna poistetaan.
20 B. Splenosyyttien fuusio
Pernasolujen fuusiopartnerina käytettäviä myeloomasoluja sulatetaan kuusi päivää ennen fuusiota ja kasvatetaan kudos-viljelmässä. Yhtä päivää ennen fuusiota, solut jaetaan tuo-25 reisiin alutoihin, jotka sisältävät 10 % vasikan sikiön seerumia, pitoisuudessa 5 x 105 solua/ml. Fuusioaamuna solut laimennetaan yhtä suurella tilavuudella alustaa, joka sisältää 20 % vasikan sikiön seerumia ja 2X OPI-liuosta (3 mg/ml oksaaliasetaattia, 0,1 mg/ml natriumpyruvaattia ja 0,4 IU/ml 30 insuliinia).
Hiiren tappamisen jälkeen perna poistetaan aseptisesti ja sijoitetaan viljelyalustaa sisältävään maljaan. Solut sekoitetaan erileen kunnes perna revitään hienoiksi paloiksi ja 35 useimmat solut on poistettu. Solut pestään tuoreessa steriilissä alustassa ja kokkareiden annetaan laskeutua.
79
Splenosyytit jatkopestään kahdesti sentrifugoiden seerumiva-paassa alustassa. Toisen pesun aikana myeloomasolut pestään myös erillisessä putkessa. Viimeisen pesun jälkeen kaksi solupellettiä yhdistetään ja sentrifugoidaan yhdessä.
5
Liuosta, joka sisältää 50 % polyetyleeniglykolia (PEG) lisätään hitaasti solupellettiin sillä aikaa kun soluja uudel-leensuspendoidaan kahden minuutin kuluessa. 10 ml esilämmi-tettyä alustaa lisätään soluliuokseen sekoittaen hitaasti 3 10 minuutin ajan. Solut sentrifugoidaan ja supernatantti poistetaan. Solut suspendoidaan uudelleen 10 ml:aan alustaa, joka sisältääö 20 % vasikan sikiön seerumia, IX OPI-liuosta ja IX AH-liuosta (58 μΜ atsaseriiniä, 0,1 mM hypoksantiinia). Fuusioidut solut jaetaan 96-kaivoisiin levyihin ja viljellään 15 37°C:ssa yhden viikon ajan.
Supernatantti otetaan aseptisesti kustakin kaivosta ja asetetaan pooleihin. Näistä pooleista testataan reaktiivisuus immunisoivaa antigeeniä vastaan. Positiiviset poolit jatko-20 testataan yksittäisistä kaivoista. Kun positiivinen kaivo on identifioitu, solut siirretään 96-kaivoiselta levyltä 0,5 ml:aan alustaa, joka sisältää 20 % vasikan sikiön seerumia, IX OPI:a ja IX AH:ta 24-kaivoisella levyllä. Kun tuosta viljelmästä tulee tiheä, solutilavuus nostetaan 5 ml:ksi ja sen 25 jälkeen 10 ml:ksi. Tässä vaiheessa solut subkloonataan niin, että yhtä vasta-ainetta tuottava solu on viljelmässä.
Edellä esitettyjen menettelyjen mukaisesti voidaan tuottaa kimeeristä hiiri-isäntää, joka voidaan immunisoida tuottamaan 30 immunogeenispesifisiä ihmisen vasta-aineita tai analogeja. Tällä tavalla vältetään ongelmat, jotka liittyvät ihmisen monoklonaalisten vasta-aineiden aikaansaamiseen, koska siir-togeeninen eläin voidaan immunisoida immunogeeneilla, joita ei voitaisi käyttää ihmisisännässä. Sen lisäksi voidaan suo-35 rittaa tehosteruiskutuksia ja käyttää adjuvantteja, joita ei voitaisi sallia ihmisisännälle. Tuloksena saatavia B-soluja voidaan sitten käyttää immortalisointiin halutun vasta-aineen tuottamiseksi jatkuvatoimisesti. Immortalisoituja soluja voi- 80 daan käyttää geenien eristämiseen, jotka koodittavat immuno-globuliinia tai analogia ja modifioida molekulaarisesti edelleen menetelmillä kuten in vitro -mutatoinnilla tai muilla tekniikoilla vasta-aineiden ominaisuuksien modifioimiseksi. 5 Nämä modifioidut geenit voidaan sitten palauttaa immortali-soituihin soluihin transfektion avulla jatkuvatoimisen nisä-kässolulähteen aikaansaamiseksi halutuille vasta-aineille. Tämä keksintö koskee tarkoituksenmukaista ihmisen vasta-ainelähdettä, jossa ihmisen vasta-aineita tuotetaan vas-10 taavalla tavalla kuin vasta-aineita tuotetaan ihmisisännässä. Hiiri-isäntäsolut aktivoivat ja uudelleenjärjestelevät ihmisen DNA:n isäntäsoluissa ihmisvasta-aineiden tuottamiseksi.
Tämän keksinnön mukaisesti ihmisen vasta-aineita voidaan 15 tuottaa ihmisen immunogeeneja vastaan, esim. proteiineja vastaan, immunisoimalla hiiri-isäntä ihmisen immunogeeneilla. Tuloksena saatavat antiseerumit ovat spesifisiä ihmisen immu-nogeeneille ja voidaan ottaa talteen isännän seerumista. Immunisoituja isäntä-B-soluja voidaan käyttää immortalisoin-20 tiin, esim. myeloomasolufuusioon, transfektioon jne., jatkuvasti lisääntyvien solujen, esim. hybridoomien aikaansaamiseksi monoklonaalisten vasta-aineiden tuotantoa varten. Vasta-aineet, antiseerumi ja monoklonaaliset vasta-aineet glyko-lysoidaan vasta-ainetta tuottavan solulajin mukaan. Ig-lokuk-25 sen harvinaisia variaabelialueita voidaan täydentää tuotettaessa vasta-aineita niin, että voidaan saada harvinaisia variaabelialueita sisältäviä vasta-aineita.
Kaikki tässä selityksessä lainatut julkaisut ja patenttiko hakemukset on tässä sisällytetty viitteinä ikäänkuin jokainen yksittäinen julkaisu tai patenttihakemus olisi spesifisesti ja erikseen esitetty sisällytettäväksi viitteenä.
Vaikka edellä esiteltyä keksintöä on kuvailtu joiltakin yksi-35 tyiskohdilta valaisemisen vuoksi ja esimerkin vuoksi ymmärtämisen selventämiseksi, alaa tunteville tulisi olla selvää tämän keksinnön mukaisten selvitysten pohjalta, että tiettyjä 81 muutoksia ja modifikaatioita voidaan tehdä keksintöön poikkeamatta oheisten patenttivaatimuksien hengestä ja alueesta.

Claims (26)

82
1. Menetelmä hiiren alkiovaiheen kantasolun (ES) tuottamiseksi, joka sisältää ainakin osan ihmisen immunoglobuliinin ras- 5 kasketjun lokusta ja ainakin osan ihmisen immunoglobuliinin kevytketjun lokusta, jotka on integroitu pysyvästi mainitun hiiren alkiovaiheen kantasolun genomiin, jolloin mainittu ihmisen immunoglobuliinin raskasketjun lokuksen osa on riittävä koodaamaan ihmisen immunoglobuliinin raskasketjua ja mainittu 10 ihmisen immunoglobuliinin kevytketjun lokuksen osa on riittävä koodaamaan ihmisen immunoglobuliinin kevytketjua, jossa menetelmässä (a) mainittuja hiiren alkiovaiheen kantasoluja ja hii-15 vasteroplasteja yhdistetään fuusio-olosuhteissa, jolloin mai nitut hiivasieroplastit sisältävät yhtä tai useampaa hiivan keinotekoista kromosomia (YAC), joka käsittää mainitun ihmisen immunoglobuliinin raskasketjun lokuksen osan, ja mainitun ihmisen immunoglobuliinin kevytketjun lokuksen osan, jolloin 20 mainitut YAC:t sisältävät geenin, joka koodaa valikoitavaa markkeria, jolloin mainitut ihmisen immunoglobuliinilokusten osat integroituvat pysyvästi mainittujen alkiovaiheen kan-tasolujen genomiin; ja 25 (b) alkiovaiheen kantasolut, joiden genomi sisältää mainitut ihmisen immunoglobuliinin lokukset, valikoidaan mainitun markkerin tai markkerien avulla.
2. Hiiren alkiovaiheen kantasolu (ES), joka on tuotettu pa-30 tenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä, jolloin mainittu alkiovaiheen kantasolu sisältää ainakin osan ihmisen immunoglobuliinin raskasketjun lokusta ja ainakin osan ihmisen immunoglobuliinin kevytketjun lokusta, jotka on integroitu pysyvästi sen genomiin, jolloin mainittu ihmisen immunoglobu- 83 liinin raskasketjun lokuksen osa on riittävä koodaamaan ihmisen immunoglobuliinin raskasketjua ja mainittu ihmisen immu-noglobuliinin kevytketjun lokuksen osa on riittävä koodaamaan ihmisen immunoglobuliinin kevytketjua. 5
3. Menetelmä kimeerisen hiiren tuottamiseksi, joka sisältää ainakin osan ihmisen immunoglobuliinin raskasketjun lokusta ja ainakin osan ihmisen immunoglobuliinin kevytketjun lokusta, jotka on integroitu pysyvästi ainakin joidenkin sen solu- 10 jen genomiin, jolloin mainittu ihmisen immunoglobuliinin raskasketjun lokuksen osa on riittävä koodaamaan ihmisen immunoglobuliinin raskasketjua ja mainittu ihmisen immunoglobuliinin kevytketjun lokuksen osa on riittävä koodaamaan ihmisen immunoglobuliinin kevytketjua, jossa menetelmässä 15 (a) tuotetaan patenttivaatimuksen 2 mukainen hiiren alkiovaiheen kantasolu, ja (b) siirretään mainittu hiiren alkiovaiheen kantasolu 20 hiiri-isännän blastokystiin kimeerisen hiiren tuottamiseksi siitä.
4. Kimeerinen hiiri, joka on tuotettu patenttivaatimuksen 3 mukaisella menetelmällä, jolloin mainittu kimeerinen hiiri 25 sisältää ainakin osan ihmisen immunoglobuliinin raskasketjun lokusta ja ainakin osan ihmisen immunoglobuliinin kevytketjun lokusta, jotka on integroitu pysyvästi ainakin joidenkin sen solujen genomiin, jolloin mainittu ihmisen immunoglobuliinin raskasketjun lokuksen osa on riittävä koodaamaan ihmisen im-30 munoglobuliinin raskasketjua ja mainittu ihmisen immunoglobu-liinin kevytketjun lokuksen osa on riittävä koodaamaan ihmisen immunoglobuliinin kevytketjua. 84
5. Menetelmä siirtogeenisen hiiren ja sen jälkeläisten tuottamiseksi, jotka sisältävät ainakin osan ihmisen immunoglobu-liinin raskasketjun lokusta ja ainakin osan ihmisen immuno-globuliinin kevytketjun lokusta, jotka on integroitu pysyväs- 5 ti näiden somaattisten ja itusolujen genomiin, jolloin mainittu ihmisen immunoglobuliinin raskasketjun lokuksen osa on riittävä koodaamaan ihmisen immunoglobuliinin raskasketjua ja mainittu ihmisen immunoglobuliinin kevytketjun lokuksen osa on riittävä koodaamaan ihmisen immunoglobuliinin kevytketjua, 10 jossa menetelmässä (a) tuotetaan patenttivaatimuksen 4 mukainen kimeerinen hiiri, ja 15 (b) kasvatetaan mainittua kimeeristä hiirtä siirto geenisen hiiren ja sen jälkeläisten tuottamiseksi.
6. Siirtogeeninen hiiri tai sen jälkeläinen, jotka on tuotettu patenttivaatimuksen 5 mukaisella menetelmällä, jolloin 20 mainittu siirtogeeninen hiiri sisältää ainakin osan ihmisen immunoglobuliinin raskasketjun lokusta ja ainakin osan ihmisen immunoglobuliinin kevytketjun lokusta, jotka on integroitu pysyvästi sen somaattisten solujen ja itusolujen genomiin, jolloin mainittu ihmisen immunoglobuliinin raskasketjun lo- 25 kuksen osa on riittävä koodaamaan ihmisen immunoglobuliinin raskasketjua ja mainittu ihmisen immunoglobuliinin kevytketjun lokuksen osa on riittävä koodaamaan ihmisen immunoglobuliinin kevytketjua.
7. Jonkin patenttivaatimuksista 1, 3 tai 5 mukainen menetel mä, jolloin mainittu ihmisen immunoglobuliinin raskasketjun lokuksen osa on DNA-sekvenssi, joka on identtinen ihmisen kromosomin 14 iturata-DNA-sekvenssin kanssa alkaen ihmisen immunoglobuliinin raskasketjun lokuksen D-segmentin geeneistä 85 jatkuen läpi J-segmentin geenien ja vakioalueen geenien tämän lokuksen Cp:n kautta, jossa mainittu DNA-sekvenssi ei sisällä gammavakioaluetta, ja jossa mainittu DNA-fragmentti on liitetty toiminnallisesti vähintään yhteen ihmisen V-segmentin 5 geeniin.
8. Patenttivaatimuksen 1, 3, 5 tai 7 mukainen menetelmä, jolloin mainittu genomi sisältää lisäksi ainakin yhden inak-tivoidun endogeenisen immunoglobuliinin raskasketjun lokuk-10 sen, jolloin mainittu lokus on inaktivoitu lokuksen uudelleen järjestymisen estämiseksi ja immunoglobuliinin raskasketjun uudelleen järjestyneen lokuksen transkriptin muodostumisen estämiseksi.
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, jossa vähintään yksi endogeeninen immunoglobuliinin raskasketjun lokus on inaktivoitu poistamalla kaikki J-segmentin geenit.
10. Patenttivaatimuksen 8 tai 9 mukainen menetelmä, jolloin 20 mainittu genomi sisältää lisäksi ainakin yhden inaktivoidun endogeenisen immunoglobuliinin kevytketjun lokuksen, jolloin mainittu lokus on inaktivoitu lokuksen uudelleenjärjestymisen estämiseksi ja immunoglobuliinin kevytketjun uudelleen järjestyneen lokuksen transkriptin muodostumisen estämiseksi. 25
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, jossa vähintään yksi endogeeninen immunoglobuliinin kappakevytketjun lokus on inaktivoitu poistamalla CK-geeni.
12. Patenttivaatimuksen 2 mukainen hiiren alkiovaiheen kan- tasolu, jossa ihmisen immunoglobuliinin raskasketjun lokuksen osa on DNA-sekvenssi, joka on identtinen ihmisen kromosomin 14 iturata-DNA-sekvenssin kanssa alkaen ihmisen immunoglobuliinin raskasketjun lokuksen D-segmentin geeneistä jatkuen 86 läpi J-segmentin geenien ja vakioalueen geenien tämän lokuk-sen Cp:n kautta, jossa mainittu DNA-sekvenssi ei sisällä gam-mavakioaluetta, ja jossa mainittu DNA-fragmentti on liitetty toiminnallisesti vähintään yhteen ihmisen V-segmentin gee-5 niin.
13. Patenttivaatimuksen 2 tai 12 mukainen hiiren alkiovaiheen kantasolu, jossa hiiren alkiovaiheen kantasolun genomi sisältää lisäksi vähintään yhden inaktivoidun endogeenisen 10 immunoglobuliinin raskasketjun lokuksen, jolloin mainittu lo-kus on inaktivoitu lokuksen uudelleenjärjestymisen estämiseksi ja immunoglobuliinin raskasketjun uudelleen järjestyneen lokuksen transkriptin muodostumisen estämiseksi.
14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen hiiren alkiovaiheen kan tasolu, jossa vähintään yksi endogeeninen immunoglobuliinin raskasketjun lokus on inaktivoitu poistamalla kaikki J-segmentin geenit.
15. Patenttivaatimuksen 13 tai 14 mukainen hiiren alkiovai heen kantasolu, jolloin mainitun hiiren alkiovaiheen kantasolun genomi sisältää lisäksi vähintään yhden inaktivoidun endogeenisen immunoglobuliinin kevytketjun lokuksen, jolloin mainittu lokus on inaktivoitu lokuksen uudelleenjärjestymisen 25 estämiseksi ja immunoglobuliinin kevytketjun uudelleen järjestyneen lokuksen transkriptin muodostumisen estämiseksi.
16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen hiiren alkiovaiheen kantasolu, jossa vähintään yksi endogeeninen immunoglobuliinin 30 kappakevytketjun lokus on inaktivoitu poistamalla CK-geeni.
17. Patenttivaatimuksen 4 mukainen kimeerinen hiiri, jossa ihmisen immunoglobuliinin raskasketjun lokuksen osa on DNA-sekvenssi, joka on identtinen ihmisen kromosomin 14 iturata- 87 DNA-sekvenssin kanssa alkaen ihmisen immunoglobuliinin ras-kasketjun lokuksen D-segmentin geeneistä jatkuen läpi J-segmentin geenien ja vakioalueen geenien tämän lokuksen Cp:n kautta, jossa mainittu DNA-sekvenssi ei sisällä gammavakio-5 aluetta, ja jossa mainittu DNA-fragmentti on liitetty toiminnallisesti vähintään yhteen ihmisen V-segmentin geeniin.
18. Patenttivaatimuksen 4 tai 17 mukainen kimeerinen hiiri, jossa niiden solujen genomi, jotka sisältävät mainitun ihmi- 10 sen immunoglobuliinin raskasketjun lokuksen osan ja mainitun ihmisen immunoglobuliinin kevytketjun lokuksen osan, sisältää lisäksi vähintään yhden inaktivoidun endogeenisen immunoglobuliinin raskasketjun lokuksen, jolloin mainittu inaktivoitu endogeeninen immunoglobuliinin raskasketjun lokus on inakti-15 voitu lokuksen uudelleenjärjestymisen estämiseksi ja immuno-globuliinin raskasketjun uudelleen järjestyneen lokuksen transkriptin muodostumisen estämiseksi.
19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen kimeerinen hiiri, jossa 20 vähintään yksi endogeeninen immunoglobuliinin raskasketjun lokus on inaktivoitu poistamalla kaikki J-segmentin geenit.
20. Patenttivaatimuksen 18 tai 19 mukainen kimeerinen hiiri, jossa niiden solujen genomi, jotka sisältävät mainitun ihmi- 25 sen immunoglobuliinin raskasketjun lokuksen osan ja mainitun ihmisen immunoglobuliinin kevytketjun lokuksen osan, sisältää lisäksi vähintään yhden inaktivoidun endogeenisen immunoglobuliinin kevytketjun lokuksen, jolloin mainittu inaktivoitu endogeeninen immunoglobuliinin kevytketjun lokus on in-30 aktivoitu lokuksen uudelleenjärjestymisen estämiseksi ja immunoglobuliinin kevytketjun uudelleen järjestyneen lokuksen transkriptin muodostumisen estämiseksi. 88
21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen kimeerinen hiiri, jossa vähintään yksi endogeeninen immunoglobuliinin kappakevytket-jun lokus on inaktivoitu poistamalla CK-geeni.
22. Patenttivaatimuksen 6 mukainen siirtogeeninen hiiri, jos sa ihmisen immunoglobuliinin raskasketjun lokuksen osa on DNA-sekvenssi, joka on identtinen ihmisen kromosomin 14 itu-rata-DNA-sekvenssin kanssa alkaen ihmisen immunoglobuliinin raskasketjun lokuksen D-segmentin geeneistä jatkuen läpi J-10 segmentin geenien ja vakioalueen geenien tämän lokuksen Cp:n kautta, jossa mainittu DNA-sekvenssi ei sisällä gammavakio-aluetta, ja jossa mainittu DNA-fragmentti on liitetty toiminnallisesti vähintään yhteen ihmisen V-segmentin geeniin.
23. Patenttivaatimuksen 6 tai 22 mukainen siirtogeeninen hii ri, jossa somaattisten solujen ja itusolujen genomi sisältää lisäksi vähintään yhden inaktivoidun endogeenisen immunoglobuliinin raskasketjun lokuksen, jolloin mainittu inaktivoitu endogeeninen immunoglobuliinin raskasketjun lokus on inakti-20 voitu lokuksen uudelleenjärjestymisen estämiseksi ja immunoglobuliinin raskasketjun uudelleen järjestyneen lokuksen transkriptin muodostumisen estämiseksi.
24. Patenttivaatimuksen 23 mukainen siirtogeeninen hiiri, 25 jossa vähintään yksi endogeeninen immunoglobuliinin raskas- ketjun lokus on inaktivoitu poistamalla kaikki J-segmentin geenit.
25. Patenttivaatimuksen 23 tai 24 mukainen siirtogeeninen 30 hiiri, jossa somaattisten solujen ja itusolujen genomi sisältää lisäksi vähintään yhden inaktivoidun endogeenisen immunoglobuliinin kevytketjun lokuksen, jolloin mainittu inaktivoitu endogeeninen immunoglobuliinin kevytketjun lokus on inaktivoitu lokuksen uudelleenjärjestymisen estämiseksi ja immu- 89 noglobuliinin kevytketjun uudelleen järjestyneen lokuksen transkriptin muodostumisen estämiseksi.
26. Patenttivaatimuksen 25 mukainen siirtogeeninen hiiri, 5 jossa vähintään yksi endogeeninen immunoglobuliinin kappake-vytketjun lokus on inaktivoitu poistamalla Cic-geeni. 90
FI950277A 1992-07-24 1995-01-23 Geneettisesti muunnetut hiiret ihmisen vasta-aineiden tuottamiseen, ja menetelmät niiden valmistamiseksi FI121339B (fi)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US91929792A 1992-07-24 1992-07-24
US91929792 1992-07-24
US3180193 1993-03-15
US08/031,801 US6673986B1 (en) 1990-01-12 1993-03-15 Generation of xenogeneic antibodies
US9306926 1993-07-23
PCT/US1993/006926 WO1994002602A1 (en) 1992-07-24 1993-07-23 Generation of xenogeneic antibodies

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI950277A0 FI950277A0 (fi) 1995-01-23
FI950277A FI950277A (fi) 1995-03-21
FI121339B true FI121339B (fi) 2010-10-15

Family

ID=26707625

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI950277A FI121339B (fi) 1992-07-24 1995-01-23 Geneettisesti muunnetut hiiret ihmisen vasta-aineiden tuottamiseen, ja menetelmät niiden valmistamiseksi

Country Status (11)

Country Link
EP (1) EP0652950B1 (fi)
JP (2) JPH07509137A (fi)
AT (1) ATE381614T1 (fi)
AU (1) AU675661B2 (fi)
CA (1) CA2140638C (fi)
ES (1) ES2301158T3 (fi)
FI (1) FI121339B (fi)
NO (1) NO328075B1 (fi)
NZ (1) NZ255101A (fi)
SG (1) SG48760A1 (fi)
WO (1) WO1994002602A1 (fi)

Families Citing this family (795)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6713610B1 (en) 1990-01-12 2004-03-30 Raju Kucherlapati Human antibodies derived from immunized xenomice
DE69133566T2 (de) * 1990-01-12 2007-12-06 Amgen Fremont Inc. Bildung von xenogenen Antikörpern
US6150584A (en) * 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6657103B1 (en) 1990-01-12 2003-12-02 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) * 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) * 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5770429A (en) * 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US7084260B1 (en) 1996-10-10 2006-08-01 Genpharm International, Inc. High affinity human antibodies and human antibodies against human antigens
AU4906696A (en) * 1995-01-20 1996-08-07 Abgenix, Inc. Method to improve screening efficiency in fused cells
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6091001A (en) * 1995-03-29 2000-07-18 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6884622B1 (en) 1995-04-21 2005-04-26 Abgenix, Inc Method for preparing a mammalian cell deficient in HPRT
KR20050085971A (ko) * 1995-04-27 2005-08-29 아브게닉스, 인크. 면역화된 제노마우스 유래의 인간 항체
AU2008202860B9 (en) * 1995-04-27 2012-03-29 Amgen Fremont Inc. Human Antibodies Derived From Immunized Xenomice
AU4376400A (en) * 1995-04-27 2000-11-30 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
AU2466895A (en) * 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6156541A (en) * 1995-07-21 2000-12-05 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska Compositions and methods for catalyzing hydrolysis of HIV gp120
US6632976B1 (en) 1995-08-29 2003-10-14 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Chimeric mice that are produced by microcell mediated chromosome transfer and that retain a human antibody gene
US7888466B2 (en) 1996-01-11 2011-02-15 Human Genome Sciences, Inc. Human G-protein chemokine receptor HSATU68
US6497878B1 (en) 1996-04-23 2002-12-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Treatment of cerebral disorders by inhibition of IL-8 binding to receptor
US6420140B1 (en) 1996-10-11 2002-07-16 Abgenix, Inc. Production of multimeric protein by cell fusion method
US5916771A (en) * 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
EP2314625B1 (en) 1996-12-03 2014-05-07 Amgen Fremont Inc. Transgenic mammals having human Ig loci including plural VH and Vkappa regions and antibodies produced therefrom
ES2382488T3 (es) 1997-03-21 2012-06-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Un agente preventivo o terapéutico para enfermedades mediadas por células t sensibilizadas que comprende un antagonista de il-6 como ingrediente activo
US20020173629A1 (en) 1997-05-05 2002-11-21 Aya Jakobovits Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
PT1004315E (pt) 1997-08-15 2008-07-09 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Profilácticos e/ou medicamentos contendo anticorpos neutralizantes anti-receptor de il-6 para reduzir a excreção de proteínas urinárias no lúpus eritematoso sistémico
TWI255853B (en) * 1998-08-21 2006-06-01 Kirin Brewery Method for modifying chromosomes
ATE518949T1 (de) 1998-11-04 2011-08-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Neue serinproteasen der trypsin-familie
US7109003B2 (en) 1998-12-23 2006-09-19 Abgenix, Inc. Methods for expressing and recovering human monoclonal antibodies to CTLA-4
EA006972B1 (ru) 1998-12-23 2006-06-30 Пфайзер Инк. Моноклональное антитело человека к ctla-4 и способы его применения
US6682736B1 (en) 1998-12-23 2004-01-27 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to CTLA-4
US6914128B1 (en) 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
AU3674000A (en) 1999-04-09 2000-11-14 Chugai Research Institute For Molecular Medicine, Inc. Novel fetal genes
WO2000075314A1 (fr) 1999-06-02 2000-12-14 Chugai Research Institute For Molecular Medicine, Inc. Proteine receptrice d'hemopoietine
US6833268B1 (en) 1999-06-10 2004-12-21 Abgenix, Inc. Transgenic animals for producing specific isotypes of human antibodies via non-cognate switch regions
CA2382587A1 (en) 1999-08-23 2001-03-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Hm1.24 antigen expression potentiators
US7605238B2 (en) 1999-08-24 2009-10-20 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
EP1792991A1 (en) 1999-08-24 2007-06-06 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
WO2001018200A1 (fr) 1999-09-06 2001-03-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Gene de type tsg
US7459540B1 (en) 1999-09-07 2008-12-02 Amgen Inc. Fibroblast growth factor-like polypeptides
JP4838961B2 (ja) 1999-09-21 2011-12-14 中外製薬株式会社 トランスポーター遺伝子ｏａｔｐ−ｂ、ｃ、ｄ、およびｅ
KR20030008205A (ko) 1999-10-01 2003-01-24 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 혈액응고 관련 질환의 예방 및 치료
DE60135971D1 (de) 2000-01-24 2008-11-13 Haruo Sugiyama Mit wt1 interagierendes protein, wtip
AU2001236807A1 (en) 2000-02-10 2001-08-20 Abbott Laboratories Antibodies that bind human interleukin-18 and methods of making and using
US6653448B1 (en) 2000-03-29 2003-11-25 Curagen Corporation Wnt-7B-like polypeptides and nucleic acids encoding same
AU2001253339A1 (en) * 2000-04-10 2001-10-23 American Biogenetic Sciences Inc. Human immunoglobulin-producing gnotobiotics
EP1283057B2 (en) 2000-04-28 2012-05-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cell proliferation inhibitors
JP3597140B2 (ja) 2000-05-18 2004-12-02 日本たばこ産業株式会社 副刺激伝達分子ａｉｌｉｍに対するヒトモノクローナル抗体及びその医薬用途
AU7026601A (en) 2000-06-28 2002-01-08 Amgen Inc Thymic stromal lymphopoietin receptor molecules and uses thereof
US6596541B2 (en) * 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US7105348B2 (en) 2000-10-31 2006-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US20050144655A1 (en) 2000-10-31 2005-06-30 Economides Aris N. Methods of modifying eukaryotic cells
US6586251B2 (en) * 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
KR100882030B1 (ko) * 2000-11-17 2009-02-09 교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤 클로닝된 트랜스제닉 유제류에서 이종 (사람)면역글로블린의 발현
US7041870B2 (en) 2000-11-30 2006-05-09 Medarex, Inc. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
JP2004535765A (ja) 2000-12-07 2004-12-02 カイロン コーポレイション 前立腺癌においてアップレギュレートされた内因性レトロウイルス
OA12589A (en) 2001-01-05 2006-06-08 Abgenix Inc Antibodies to insulin-like growth factor i receptor.
US7931897B2 (en) 2001-02-07 2011-04-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Therapeutic agent for hematopoietic tumors
ES2328796T3 (es) 2001-03-14 2009-11-18 Myriad Genetics, Inc. Interaccion tsg101-gag y uso de la misma.
UA80091C2 (en) 2001-04-02 2007-08-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Remedies for infant chronic arthritis-relating diseases and still's disease which contain an interleukin-6 (il-6) antagonist
WO2002081639A2 (en) 2001-04-06 2002-10-17 Georgetown University Gene brcc2 and diagnostic and therapeutic uses thereof
AU2002258728A1 (en) 2001-04-06 2002-10-21 Georgetown University Gene brcc-3 and diagnostic and therapeutic uses thereof
WO2002081641A2 (en) 2001-04-06 2002-10-17 Georgetown University Gene scc-112 and diagnostic and therapeutic uses thereof
DK1385864T3 (da) 2001-04-13 2010-08-16 Human Genome Sciences Inc Anti-VEGF-2-antistoffer
CN100448992C (zh) 2001-05-11 2009-01-07 麒麟医药株式会社 含人抗体λ轻链基因的人类人工染色体
CA2447114A1 (en) 2001-05-16 2002-11-21 Abgenix, Inc. Human antipneumococcal antibodies from non-human animals
DK1572874T3 (da) 2001-05-25 2013-12-16 Human Genome Sciences Inc Antistoffer, der immunospecifikt binder til TRAIL receptorer
GB0115256D0 (en) * 2001-06-21 2001-08-15 Babraham Inst Mouse light chain locus
EP1283053A1 (en) 2001-08-09 2003-02-12 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Inhibitors of HER3 activity
US7981863B2 (en) 2001-09-19 2011-07-19 Neuronova Ab Treatment of Parkinson's disease with PDGF
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
WO2003047336A2 (en) 2001-11-30 2003-06-12 Abgenix, Inc. TRANSGENIC ANIMALS BEARING HUMAN Igμ LIGHT CHAIN GENES
EP3960855A1 (en) 2001-12-28 2022-03-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for stabilizing proteins
US20050118163A1 (en) 2002-02-14 2005-06-02 Hidefumi Mizushima Antibody-containing solution pharmaceuticals
US7662924B2 (en) 2002-02-22 2010-02-16 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Beta chain-associated regulator of apoptosis
CA2479730A1 (en) 2002-03-21 2003-10-02 Sagres Discovery, Inc. Novel compositions and methods in cancer
MXPA04009418A (es) 2002-03-29 2005-06-08 Schering Corp Anticuerpos monoclonales humanos par interleucina-5, y metodos y composiciones que comprenden los mismos.
US7666610B2 (en) 2002-03-29 2010-02-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Expressing transporters on viral envelopes
WO2004022597A1 (ja) 2002-09-04 2004-03-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Gpc3の血中可溶化ｎ端ﾍﾟﾌﾟﾁﾄﾞに対する抗体
US7244565B2 (en) 2002-04-10 2007-07-17 Georgetown University Gene shinc-3 and diagnostic and therapeutic uses thereof
NZ536420A (en) 2002-04-12 2008-04-30 Medarex Inc Methods of treatment using CTLA-4 antibodies
CN100532549C (zh) 2002-06-06 2009-08-26 肿瘤疗法科学股份有限公司 与人结肠癌相关的基因和多肽
CN101613405A (zh) 2002-06-06 2009-12-30 肿瘤疗法科学股份有限公司 与人结肠癌相关的基因和多肽
EP1532161B1 (en) 2002-06-13 2012-02-15 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Vectors for expression of hml-2 polypeptides
CN1688340A (zh) 2002-07-15 2005-10-26 韦思公司 调节t辅助(th)细胞发育和功能的方法和组合物
USRE47770E1 (en) 2002-07-18 2019-12-17 Merus N.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
PT2314629E (pt) 2002-07-18 2014-01-22 Merus B V Produção recombinante de misturas de anticorpos
US20060058511A1 (en) 2002-08-27 2006-03-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for stabilizing protein solution preparation
EA033750B1 (ru) 2002-09-06 2019-11-21 Amgen Inc Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело человека к рецептору интерлейкина-1, и ее применение
US20040171809A1 (en) 2002-09-09 2004-09-02 Korsmeyer Stanley J. BH3 peptides and method of use thereof
ES2626268T3 (es) 2002-09-11 2017-07-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Método de purificación de proteínas
TW200418988A (en) 2002-09-30 2004-10-01 Oncotherapy Science Inc Method for diagnosing prostate cancer
TW200413725A (en) 2002-09-30 2004-08-01 Oncotherapy Science Inc Method for diagnosing non-small cell lung cancers
CN100572535C (zh) 2002-10-22 2009-12-23 卫材R&D管理有限公司 在分裂停止后的产多巴胺型神经元前体细胞中特异性表达的基因
US7632935B2 (en) 2002-10-30 2009-12-15 Chungai Seiyaku Kabushiki Kaisha DNA encoding a mast cell-derived membrane protein
KR20050093761A (ko) 2002-11-08 2005-09-23 헤마테크, 엘엘씨 프리온 단백질 활성이 감소된 트랜스제닉 유제동물 및 그의용도
EP1572106B1 (en) 2002-11-15 2010-05-05 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Methods for preventing and treating cancer metastasis and bone loss associated with cancer metastasis
CA2537263C (en) 2002-11-27 2017-05-30 Minerva Biotechnologies Corporation Techniques and compositions for the diagnosis and treatment of cancer (muc1)
WO2004050683A2 (en) 2002-12-02 2004-06-17 Abgenix, Inc. Antibodies directed to tumor necrosis factor and uses thereof
US7282568B2 (en) 2002-12-16 2007-10-16 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies against interleukin 8 (IL-8)
EP2141235B1 (en) 2002-12-29 2014-06-11 Toudai Tlo, Ltd. Adiponectin receptor and gene coding for the same
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
US20070149449A1 (en) 2003-02-14 2007-06-28 Morris David W Therapeutic targets in cancer
US20040170982A1 (en) 2003-02-14 2004-09-02 Morris David W. Novel therapeutic targets in cancer
US7767387B2 (en) 2003-06-13 2010-08-03 Sagres Discovery, Inc. Therapeutic targets in cancer
EP3000886A1 (en) 2003-03-19 2016-03-30 Amgen Fremont Inc. Antibodies against t cell immunoglobulin domain and mucin domain 1 (tim-1) antigen and uses thereof
GB2401040A (en) 2003-04-28 2004-11-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for treating interleukin-6 related diseases
JP4705469B2 (ja) 2003-05-28 2011-06-22 武田薬品工業株式会社 抗ｂａｍｂｉ抗体、及びそれを含有する大腸癌及び肝臓癌の診断剤又は治療剤
US20100069614A1 (en) 2008-06-27 2010-03-18 Merus B.V. Antibody producing non-human mammals
ES2408582T3 (es) 2003-05-30 2013-06-21 Merus B.V. Biblioteca de Fab para la preparación de una mezcla de anticuerpos
EP2228445A1 (en) 2003-06-18 2010-09-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fucose Transporter
BRPI0411803A (pt) 2003-06-27 2006-05-23 Abgenix Inc anticorpos dirigidos aos mutantes de deleção de receptor de fator de crescimento epidérmico e seus usos
HN2004000285A (es) 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
US8029984B2 (en) 2003-08-08 2011-10-04 Licentia, Ltd. Materials and methods for colorectal cancer screening, diagnosis and therapy
MXPA06001353A (es) 2003-08-08 2006-05-04 Abgenix Inc Anticuerpos dirigidos a hormona paratiroides(pth) y usos de los mismos.
US20080153104A1 (en) 2003-08-08 2008-06-26 Hiroyuki Aburantai Gene Overexpressed in Cancer
AR045563A1 (es) 2003-09-10 2005-11-02 Warner Lambert Co Anticuerpos dirigidos a m-csf
AU2003271174A1 (en) 2003-10-10 2005-04-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Double specific antibodies substituting for functional protein
AU2003271186A1 (en) 2003-10-14 2005-04-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Double specific antibodies substituting for functional protein
US20050100965A1 (en) 2003-11-12 2005-05-12 Tariq Ghayur IL-18 binding proteins
US7750123B2 (en) 2003-11-25 2010-07-06 Dana Farber Cancer Institute, Inc. Antibodies against SARS-CoV and methods of use thereof
DE10355904A1 (de) 2003-11-29 2005-06-30 Merck Patent Gmbh Feste Formen von anti-EGFR-Antikörpern
WO2005054467A1 (ja) 2003-12-03 2005-06-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 哺乳類βアクチンプロモーターを利用した発現系
ES2324538T3 (es) 2003-12-05 2009-08-10 Multimmune Gmbh Anticuerpos anti-hsp terapeuticos y de diagnostico.
US7312320B2 (en) 2003-12-10 2007-12-25 Novimmune Sa Neutralizing antibodies and methods of use thereof
WO2005056605A1 (ja) 2003-12-12 2005-06-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ３量体以上の受容体を認識する改変抗体
PT2311873T (pt) 2004-01-07 2018-11-20 Novartis Vaccines & Diagnostics Inc Anticorpo monoclonal específico para m-csf e respetivos usos
AP2006003689A0 (en) 2004-01-09 2006-08-31 Pfizer Antibodies to MAdCAM
AU2005227313A1 (en) 2004-03-19 2005-10-06 Amgen Inc. Reducing the risk of human and anti-human antibodies through V gene manipulation
US7625549B2 (en) 2004-03-19 2009-12-01 Amgen Fremont Inc. Determining the risk of human anti-human antibodies in transgenic mice
EP2343384A3 (en) 2004-03-23 2012-01-04 Oncotherapy Science, Inc. Method for diagnosing non-small cell lung cancer
US7973139B2 (en) 2004-03-26 2011-07-05 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies against nogo receptor
NZ550106A (en) 2004-04-22 2009-06-26 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Transgenic animals and uses thereof
CA2568201C (en) 2004-05-24 2013-07-30 Universitat Zu Koln Identification of ergothioneine transporter and therapeutic uses thereof
EP1602926A1 (en) 2004-06-04 2005-12-07 University of Geneva Novel means and methods for the treatment of hearing loss and phantom hearing
EP2287195B1 (en) 2004-07-01 2019-05-15 Novo Nordisk A/S Pan-kir2dl nk-receptor antibodies and their use in diagnostik and therapy
CN111925445A (zh) 2004-07-09 2020-11-13 中外制药株式会社 抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体
WO2006008639A1 (en) 2004-07-16 2006-01-26 Pfizer Products Inc. Combination treatment for non-hematologic malignancies using an anti-igf-1r antibody
US20060024677A1 (en) 2004-07-20 2006-02-02 Morris David W Novel therapeutic targets in cancer
US20080199437A1 (en) 2004-07-22 2008-08-21 Eisai Co., Ltd. Lrp4/Corin Dopaminergic Neuron Progenitor Cell Markers
EP2336177A1 (en) 2004-08-04 2011-06-22 Amgen, Inc Antibodies to DKK-1
JP2008520186A (ja) 2004-10-01 2008-06-19 マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ 哺乳類ｅａｇ１イオンチャネルタンパク質に対する新規の抗体
AU2012200570A1 (en) * 2004-10-22 2012-02-23 Revivicor, Inc. Ungulates with genetically modified immune systems
NZ554824A (en) 2004-10-22 2010-10-29 Revivicor Inc Porcines that lack endogenous antibody chains and express exogenous immunoglobulins
US20080026457A1 (en) 2004-10-22 2008-01-31 Kevin Wells Ungulates with genetically modified immune systems
EP1824886B1 (en) 2004-11-17 2010-12-22 Amgen Inc. Fully human monoclonal antibodies to il-13
US7572444B2 (en) 2004-12-20 2009-08-11 Amgen Fremont Inc. Binding proteins specific for human matriptase
CN105085678B (zh) 2004-12-21 2019-05-07 阿斯利康公司 血管生成素-2的抗体及其应用
WO2006067847A1 (ja) 2004-12-22 2006-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha フコーストランスポーターの機能が阻害された細胞を用いた抗体の作製方法
CA2590164A1 (en) 2005-01-26 2006-08-03 Amgen Fremont Inc. Antibodies against interleukin-1 beta
PA8660701A1 (es) 2005-02-04 2006-09-22 Pfizer Prod Inc Agonistas de pyy y sus usos
EP2295601A1 (en) 2005-02-10 2011-03-16 Oncotherapy Science, Inc. Method of diagnosing bladder cancer
EP1849011A2 (en) 2005-02-14 2007-10-31 University of Pittsburgh of the Commonwealth System of Higher Education Use of il-17f in diagnosis and therapy of airway inflammation
EP1848743A2 (en) 2005-02-14 2007-10-31 Wyeth Interleukin-17f antibodies and other il-17f signaling antagonists and uses therefor
WO2006089141A2 (en) 2005-02-18 2006-08-24 Dana-Farber Cancer Institute Antibodies against cxcr4 and methods of use thereof
TWI406870B (zh) 2005-02-21 2013-09-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd A method of making a protein using hamster IGF-1
WO2006096490A2 (en) 2005-03-08 2006-09-14 Pharmacia & Upjohn Company Llc ANTI-MAdCAM ANTIBODY COMPOSITIONS
EP2527365A3 (en) 2005-03-30 2013-02-20 Minerva Biotechnologies Corporation Proliferation of MUC1 expressing cells
ES2720288T3 (es) 2005-03-30 2019-07-19 Minerva Biotechnologies Corp Proliferación de células que expresan MUC1
EP3623473A1 (en) 2005-03-31 2020-03-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for production of polypeptide by regulation of assembly
AU2006235276A1 (en) 2005-04-07 2006-10-19 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. CACNA1E in cancer diagnosis, detection and treatment
WO2006110585A2 (en) 2005-04-07 2006-10-19 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Cancer-related genes (prlr)
WO2006109592A1 (ja) 2005-04-08 2006-10-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 血液凝固第viii因子の機能代替抗体
GT200600148A (es) 2005-04-14 2006-11-22 Metodos para el tratamiento y la prevencion de fibrosis
US8604174B2 (en) 2005-04-20 2013-12-10 Amgen Inc. High affinity fully human monoclonal antibodies to interleukin-8
CA2605723A1 (en) 2005-04-25 2006-11-02 Pfizer Inc. Antibodies to myostatin
GEP20115226B (en) 2005-04-26 2011-06-10 Pfizer P-cadherin antibodies
MX2007014474A (es) 2005-05-17 2008-02-07 Univ Connecticut Composiciones y metodos para inmunomodulacion en un organismo.
CA2610987C (en) 2005-06-10 2013-09-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Stabilizer for protein preparation comprising meglumine and use thereof
CN101379085B (zh) 2005-06-30 2013-03-27 Abbvie公司 Il-12/p40结合蛋白
WO2007013479A2 (en) 2005-07-27 2007-02-01 Oncotherapy Science, Inc. Genes and polypeptides relating to prostate cancers
EP2311876A3 (en) 2005-07-28 2011-04-27 Novartis AG M-CSF-specific monoclonal antibody and uses thereof
KR20080039999A (ko) 2005-08-18 2008-05-07 젠맵 에이/에스 Ｃｄ４ 결합 펩티드 및 방사선을 이용한 치료
CN101379086B (zh) 2005-08-19 2013-07-17 惠氏公司 抗gdf-8的拮抗剂抗体以及在als和其他gdf-8-相关病症治疗中的用途
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
BRPI0615026A8 (pt) 2005-08-19 2018-03-06 Abbott Lab imunoglobulina de domínio variável duplo e seus usos
EP2500359A3 (en) 2005-08-19 2012-10-17 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
UA94060C2 (ru) 2005-09-07 2011-04-11 Эмджен Фримонт Инк. Моноклональное антитело, которое специфически связывает alk-1
ES2400520T3 (es) 2005-09-29 2013-04-10 Eisai R&D Management Co., Ltd. Molécula de adhesión a las células T y anticuerpo contra la molécula
EP1928905B1 (de) 2005-09-30 2015-04-15 AbbVie Deutschland GmbH & Co KG Bindungsdomänen von proteinen der repulsive guidance molecule (rgm) proteinfamilie und funktionale fragmente davon sowie deren verwendung
WO2007043641A1 (ja) 2005-10-14 2007-04-19 Fukuoka University 膵島移植における移植膵島障害抑制剤
RU2450830C2 (ru) 2005-10-21 2012-05-20 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Средства для лечения кардиопатии
EP1957115B8 (en) 2005-11-10 2014-03-05 Celldex Therapeutics, Inc. Method of treating ovarian and renal cancer using antibodies against t cell immunoglobulin domain and mucin domain 1 (tim-1) antigen
JP5398987B2 (ja) 2005-11-14 2014-01-29 セルミド リミテッド 調節性ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の治療方法及び予防方法
AR057582A1 (es) 2005-11-15 2007-12-05 Nat Hospital Organization Agentes para suprimir la induccion de linfocitos t citotoxicos
KR20080084818A (ko) 2005-11-25 2008-09-19 각고호우징 게이오기주크 전립선암 치료제
PL1954718T3 (pl) 2005-11-30 2015-04-30 Abbvie Inc Przeciwciała skierowane przeciwko A globulomerowi, ich reszty wiążące antygeny, odpowiednie hybrydomy, kwasy nukleinowe, wektory, komórki gospodarze, sposoby wytwarzania tych przeciwciał, kompozycje zawierające te przeciwciała, zastosowania tych przeciwciał i sposoby stosowania tych przeciwciał
KR101667623B1 (ko) 2005-11-30 2016-10-19 애브비 인코포레이티드 아밀로이드 베타 단백질에 대한 모노클로날 항체 및 이의 용도
EP1979379B1 (en) 2005-12-02 2013-09-18 Dana-Farber Cancer Institute Carbonic anhydrase ix (g250) antibodies and methods of use thereof
EP1954311A4 (en) 2005-12-07 2009-12-23 Medarex Inc CTLA-4 ANTIBODY DOSAGE ESCALATION THERAPY
EP1979001B1 (en) 2005-12-13 2012-04-11 Medimmune Limited Binding proteins specific for insulin-like growth factors and uses thereof
US9084777B2 (en) 2005-12-28 2015-07-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Stabilized antibody-containing formulations
AR056857A1 (es) 2005-12-30 2007-10-24 U3 Pharma Ag Anticuerpos dirigidos hacia her-3 (receptor del factor de crecimiento epidérmico humano-3) y sus usos
DK2463305T3 (en) 2006-01-12 2016-08-29 Alexion Pharma Inc Antibodies to OX-2 / CD200 and uses thereof
CA2638117A1 (en) 2006-01-25 2007-08-30 Erasmus University Medical Center Rotterdam Generation of heavy-chain only antibodies in transgenic animals
CA2637917C (en) 2006-01-27 2015-11-24 Keio University Therapeutic agents for diseases involving choroidal neovascularization
EP1982181B1 (en) 2006-02-06 2010-12-15 Rhode Island Hospital Gpr30 estrogen receptor in breast cancers
JP2009529915A (ja) 2006-03-20 2009-08-27 ゾーマ テクノロジー リミテッド ガストリン物質に対して特異的なヒト抗体および方法
JP5624276B2 (ja) 2006-03-31 2014-11-12 中外製薬株式会社 抗体の血中動態を制御する方法
WO2007123791A2 (en) 2006-03-31 2007-11-01 Dana-Farber Cancer Institute Methods of determining cellular chemosensitivity
US9670269B2 (en) 2006-03-31 2017-06-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of modifying antibodies for purification of bispecific antibodies
JP5754875B2 (ja) 2006-04-07 2015-07-29 国立大学法人大阪大学 筋再生促進剤
WO2007118214A2 (en) 2006-04-07 2007-10-18 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Antibody compositions and methods for treatment of neoplastic disease
TW200813091A (en) 2006-04-10 2008-03-16 Amgen Fremont Inc Targeted binding agents directed to uPAR and uses thereof
TW200813231A (en) 2006-04-13 2008-03-16 Novartis Vaccines & Diagnostic Methods of treating, diagnosing or detecting cancer
JP5242382B2 (ja) 2006-04-14 2013-07-24 株式会社医学生物学研究所 エフェクター機能を有するポリペプチド変異体
AU2007240614B2 (en) 2006-04-20 2013-09-12 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Incorporated Methods and compositions based on Shiga toxin type 1 protein
WO2007129457A1 (ja) 2006-04-25 2007-11-15 The University Of Tokyo アルツハイマー病および癌の治療薬
KR101557603B1 (ko) 2006-06-08 2015-10-06 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 염증성 질환의 예방 또는 치료제
MX2008015975A (es) 2006-06-14 2009-03-26 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agentes para promocionar el crecimiento de celulas de vastago hematopoyeticas.
NZ573624A (en) 2006-06-23 2011-03-31 Myriad Genetics Inc Dpyd gene variants and use thereof
CA2657385A1 (en) 2006-07-13 2008-01-17 Naoki Kimura Cell death inducer
EP2574625B1 (en) 2006-07-21 2015-02-25 HuBit genomix, Inc. Remedy for renal disease
ES2746925T3 (es) 2006-08-03 2020-03-09 Medimmune Ltd Anticuerpos dirigidos hacia alfaVbeta6 y uso de los mismos
CL2007002225A1 (es) 2006-08-03 2008-04-18 Astrazeneca Ab Agente de union especifico para un receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (pdgfr-alfa); molecula de acido nucleico que lo codifica; vector y celula huesped que la comprenden; conjugado que comprende al agente; y uso del agente de un
CN101626783A (zh) 2006-08-04 2010-01-13 诺华有限公司 Ephb3-特异性抗体和其应用
WO2008019290A2 (en) 2006-08-04 2008-02-14 Astrazeneca Ab Human antibodies to erbb 2
EP2050466B1 (en) 2006-08-14 2015-10-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Diagnosis and treatment of cancer using anti-desmoglein-3 antibodies
EP2059535B1 (en) 2006-08-18 2013-11-06 Novartis AG Prlr-specific antibody and uses thereof
US20090053210A1 (en) 2006-09-01 2009-02-26 Roland Buelow Enhanced expression of human or humanized immunoglobulin in non-human transgenic animals
JP5087625B2 (ja) * 2006-09-01 2012-12-05 セラピューティック・ヒューマン・ポリクローナルズ・インコーポレーテッド 非ヒトトランスジェニック動物におけるヒトまたはヒト化免疫グロブリンの発現強化
CN101512008B (zh) 2006-09-08 2015-04-01 艾伯维巴哈马有限公司 白介素-13结合蛋白
WO2008032833A1 (fr) 2006-09-14 2008-03-20 Medical & Biological Laboratories Co., Ltd. Anticorps présentant une activité adcc accrue et son procédé de production
BRPI0719953B8 (pt) 2006-10-02 2021-05-25 Regeneron Pharma anticorpos humanos de alta afinidade para receptor de il-4 humano
US7608693B2 (en) 2006-10-02 2009-10-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity human antibodies to human IL-4 receptor
CA2664567C (en) 2006-10-04 2016-04-26 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Tumor immunity
NZ576855A (en) 2006-10-12 2012-08-31 Forerunner Pharma Res Co Ltd Diagnosis and treatment of cancer using anti-ereg antibody
EP2078731A4 (en) 2006-10-20 2012-08-01 Forerunner Pharma Res Co Ltd PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING ANTI-HB-EGF ANTIBODY AS ACTIVE INGREDIENT
EP2093237B1 (en) 2006-10-20 2015-12-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-cancer agent comprising anti-hb-egf antibody as active ingredient
AU2007315211B2 (en) 2006-11-03 2013-01-17 U3 Pharma Gmbh FGFR4 antibodies
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
WO2008070780A1 (en) 2006-12-07 2008-06-12 Novartis Ag Antagonist antibodies against ephb3
NO347649B1 (no) 2006-12-14 2024-02-12 Regeneron Pharma Humant antistoff eller antistoff fragment som spesifikt binder human deltaliknende ligand 4 (hDII4), nukleinsyremolekyl som koder for slike og vektor og vert-vektorsystemer, samt fremgangsmåte for fremstilling, sammensetning og anvendelse.
EP2103628A4 (en) 2006-12-14 2012-02-22 Forerunner Pharma Res Co Ltd MONOCLONAL ANTIBODY ANTI-CLAUDIN 3, AND TREATMENT AND DIAGNOSIS OF CANCER USING SUCH ANTIBODY
AU2007333635B2 (en) 2006-12-20 2014-02-20 Xoma (Us) Llc Treatment of IL-1-beta related diseases
SG177954A1 (en) 2007-01-05 2012-02-28 Univ Zuerich Method of providing disease-specific binding molecules and targets
US20100111851A1 (en) 2007-01-05 2010-05-06 The University Of Tokyo Diagnosis and treatment of cancer by using anti-prg-3 antibody
CN104524567A (zh) 2007-01-16 2015-04-22 阿布维公司 用于治疗银屑病的方法
CL2008000188A1 (es) 2007-01-23 2008-07-18 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agente para suprimir la reaccion de rechazo cronica que comprende como ingrediente activo un inhibidor de il-6; y uso del inhibidor de il-6.
EP2119777A4 (en) 2007-02-09 2011-05-25 Eisai R&D Man Co Ltd GABA NEURONS TEMPLATE MARKER 65B13
JP5241518B2 (ja) 2007-02-15 2013-07-17 国立大学法人九州大学 抗ｈｍｇｂ−１抗体を含む間質性肺疾患治療剤
EP2124952A2 (en) 2007-02-27 2009-12-02 Abbott GmbH & Co. KG Method for the treatment of amyloidoses
US8192740B2 (en) 2007-02-27 2012-06-05 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising anti-GRP78 antibody as active ingredient
CL2008000719A1 (es) 2007-03-12 2008-09-05 Univ Tokushima Chugai Seiyaku Agente terapeutico para cancer resistente a agentes quimioterapeuticos que comprende un anticuerpo que reconoce hla de clase i como ingrediente activo; composicion farmaceutica que comprende dicho anticuerpo; y metodo para tratar cancer resistente a
PT2457928T (pt) 2007-03-13 2017-08-17 Univ Zuerich Anticorpo monoclonal humano específico de tumores
WO2008112988A2 (en) 2007-03-14 2008-09-18 Novartis Ag Apcdd1 inhibitors for treating, diagnosing or detecting cancer
GEP20146112B (en) 2007-03-22 2014-06-25 Ucb Pharma Sa Binding proteins, including antibodies, antibody derivatives and antibody fragments, that specifically bind cd154 and usage thereof
MX2009010765A (es) 2007-04-02 2009-10-26 Amgen Fremont Inc Anticuerpos anti-ige.
JP5117765B2 (ja) 2007-05-28 2013-01-16 国立大学法人 東京大学 抗ｒｏｂｏ１抗体を含むｐｅｔ用腫瘍診断剤
NZ581396A (en) 2007-06-01 2012-07-27 Omt Inc Compositions and methods for inhibiting endogenous immunoglobulin genes and producing transgenic human idiotype antibodies
EP2175016A4 (en) 2007-06-25 2012-03-28 Forerunner Pharma Res Co Ltd ANTI-PROMININ-1 ANTIBODIES WITH ADCC ACTIVITY OR CDC ACTIVITY
US8536313B2 (en) 2007-07-10 2013-09-17 Shionogi & Co., Ltd. Monoclonal antibody having neutralizing activity against MMP13
EP2174667B1 (en) 2007-07-26 2017-01-04 Osaka University Agent for treatment of ophthalmia containing interleukin-6 receptor inhibitor as active ingredient
DK2185719T3 (en) 2007-08-02 2014-02-17 Novimmune Sa ANTI-RANTES ANTIBODIES AND PROCEDURES FOR USE THEREOF
ES2537323T3 (es) 2007-08-20 2015-06-05 Oncotherapy Science, Inc. Péptido CDCA1 y agente farmacéutico que lo comprende
CN104356225B (zh) 2007-08-20 2018-02-13 肿瘤疗法科学股份有限公司 Cdh3 肽以及含有cdh3 肽的药剂
EP4032899A1 (en) 2007-08-20 2022-07-27 Oncotherapy Science, Inc. Foxm1 peptide and medicinal agent comprising the same
WO2009026303A1 (en) 2007-08-21 2009-02-26 Amgen Inc. Human c-fms antigen binding proteins
JOP20080381B1 (ar) 2007-08-23 2023-03-28 Amgen Inc بروتينات مرتبطة بمولدات مضادات تتفاعل مع بروبروتين كونفيرتاز سيتيليزين ككسين من النوع 9 (pcsk9)
EP4248976A3 (en) 2007-08-23 2024-04-10 Amgen Inc. Antigen binding proteins to proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (pcsk9)
WO2009033743A1 (en) 2007-09-13 2009-03-19 University Of Zurich Prorektorat Forschung Monoclonal amyloid beta (abeta)-specific antibody and uses thereof
TW200918553A (en) 2007-09-18 2009-05-01 Amgen Inc Human GM-CSF antigen binding proteins
SG187477A1 (en) 2007-09-26 2013-02-28 U3 Pharma Gmbh Heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor antigen binding proteins
EP3689912A1 (en) 2007-09-26 2020-08-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in cdr
RU2445366C2 (ru) 2007-09-28 2012-03-20 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антитело против глипикана-3 с улучшенными кинетическими показателями в плазме
US8529895B2 (en) 2007-10-02 2013-09-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for suppressing the development of graft-versus-host-disease by administering interleukin 6 receptor antibodies
BRPI0818674B1 (pt) 2007-10-15 2023-01-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Métodos para produção de um anticorpo inteiro ou de um fragmento do mesmo e para preparação de fármacos, bem como vetor recombinante
CN101965365A (zh) 2007-10-19 2011-02-02 伊缪纳斯制药株式会社 能够特异性结合Aβ寡聚体的抗体及其应用
EP2230300A4 (en) 2007-10-24 2012-08-08 Otsuka Chemical Holdings Co Ltd POLYPEPTIDE WITH IMPROVED EFFECTOR FUNCTION
PE20091163A1 (es) 2007-11-01 2009-08-09 Wyeth Corp Anticuerpos para gdf8
CN103275227B (zh) 2007-11-12 2015-02-11 U3制药有限公司 Axl抗体
JP5676107B2 (ja) 2007-11-14 2015-02-25 中外製薬株式会社 抗ｇｐｒ４９抗体を用いる癌の診断および治療
EP2853544A1 (en) 2007-11-15 2015-04-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Monoclonal antibody capable of binding to anexelekto, and use thereof
EP2220247A4 (en) 2007-11-16 2011-10-26 Nuvelo Inc ANTIBODIES DIRECTED AGAINST LRP6
BRPI0821145B8 (pt) 2007-12-05 2021-05-25 Chugai Pharmaceutical Co Ltd uso de um anticorpo anti-nr10 como agente preventivo ou terapêutico para prurido
EP2236604B1 (en) 2007-12-05 2016-07-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-nr10 antibody and use thereof
EP2222701B1 (en) 2007-12-06 2017-11-01 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Antibodies against influenza virus and methods of use thereof
US20110262425A1 (en) 2007-12-12 2011-10-27 National Cancer Center Therapeutic agent for mll leukemia and moz leukemia of which molecular target is m-csf receptor, and use thereof
MX2010006823A (es) 2007-12-20 2010-09-30 Xoma Technology Ltd Metodos para el tratamiento de la gota.
US8414893B2 (en) 2007-12-21 2013-04-09 Amgen Inc. Anti-amyloid antibodies and uses thereof
PE20091174A1 (es) 2007-12-27 2009-08-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Formulacion liquida con contenido de alta concentracion de anticuerpo
WO2009086514A1 (en) 2007-12-28 2009-07-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Humanized monoclonal antibodies and methods of use
EP2241578B1 (en) 2008-01-11 2016-04-20 The University of Tokyo Anti-cldn6 antibody
EP2803675A3 (en) 2008-01-25 2014-12-24 Amgen, Inc Ferroportin antibodies and methods of use
KR101616136B1 (ko) 2008-02-08 2016-04-27 이무나스 파마 가부시키가이샤 Ａβ 올리고머에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 이용
JO2913B1 (en) 2008-02-20 2015-09-15 امجين إنك, Antibodies directed towards angiopoietin-1 and angiopoietin-2 proteins and their uses
US8962803B2 (en) 2008-02-29 2015-02-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Antibodies against the RGM A protein and uses thereof
KR20100126515A (ko) 2008-03-18 2010-12-01 아보트 러보러터리즈 건선의 치료방법
CL2009000647A1 (es) 2008-04-04 2010-06-04 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Composicion farmaceutica para tratar o prevenir cancer hepatico que comprende una combinacion de un agente quimioterapeutico y un anticuerpo anti-glipicano 3; agente para atenuar un efecto secundario que comprende dicho anticuerpo; metodo para tratar o prevenir un cancer hepatico de un sujeto.
TWI564021B (zh) 2008-04-11 2017-01-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Repeated binding of antigen to antigen binding molecules
US9029508B2 (en) 2008-04-29 2015-05-12 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
AU2009246946B2 (en) 2008-05-01 2013-09-26 Amgen Inc. Anti-hepcidin antibodies and methods of use
ES2579554T3 (es) 2008-05-09 2016-08-12 Abbvie Deutschland Gmbh & Co Kg Anticuerpos para el receptor de productos terminales de glicación avanzada (RAGE) y usos de los mismos
EP2283862B1 (en) 2008-06-02 2018-08-08 The University of Tokyo Combination treatment of cancer comprising anti-mfg-e8 antibody
PE20100054A1 (es) 2008-06-03 2010-03-03 Abbott Lab Inmunoglobulina con dominio variable dual
PE20100092A1 (es) 2008-06-03 2010-03-12 Abbott Lab Inmunoglobulina con dominio variable dual y usos de la misma
JOP20190083A1 (ar) 2008-06-04 2017-06-16 Amgen Inc بولي ببتيدات اندماجية طافرة لـfgf21 واستخداماتها
EP2305306B1 (en) 2008-06-05 2016-02-10 National Cancer Center Neuroinvasion inhibitor
WO2009154025A1 (ja) 2008-06-20 2009-12-23 国立大学法人岡山大学 酸化LDL/β2GPI複合体に対する抗体及びその用途
RU2011104348A (ru) 2008-07-08 2012-08-20 Эбботт Лэборетриз (Us) Иммуноглобулины с двойным вариабельным доменом против простагландина е2 и их применение
EP2810654A1 (en) 2008-07-08 2014-12-10 AbbVie Inc. Prostaglandin E2 binding proteins and uses thereof
EP2321351B1 (en) 2008-08-18 2017-11-01 Pfizer Inc. Antibodies to ccr2
EP2328928A2 (en) 2008-08-25 2011-06-08 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Conserved influenza hemagglutinin epitope and antibodies thereto
WO2010032060A1 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Medimmune Llc Antibodies directed to dll4 and uses thereof
KR102362774B1 (ko) 2008-09-30 2022-02-15 아블렉시스, 엘엘씨 키메라 항체의 제조를 위한 인간 이외의 포유동물
KR20200133324A (ko) 2008-10-09 2020-11-27 미네르바 바이오테크놀로지 코포레이션 세포내에서 다능성을 유도하기 위한 방법
EA032727B1 (ru) 2008-10-10 2019-07-31 Амген Инк. Мутантный резистентный к протеолизу полипептид fgf21 и его применение
EP2348827B1 (en) 2008-10-27 2015-07-01 Revivicor, Inc. Immunocompromised ungulates
ES2940466T3 (es) 2008-11-10 2023-05-08 Alexion Pharma Inc Métodos y composiciones para tratar trastornos asociados al complemento
EP2949666B1 (en) 2008-12-19 2018-12-19 Biogen International Neuroscience GmbH Human anti-alpha-synuclein antibodies
EP2388320B1 (en) 2008-12-22 2017-02-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-hs6st2 antibodies and uses thereof
EP2377921B1 (en) 2008-12-22 2016-04-13 Eisai R&D Management Co., Ltd. Method for obtaining pancreatic progenitor cell using neph3
JO3382B1 (ar) 2008-12-23 2019-03-13 Amgen Inc أجسام مضادة ترتبط مع مستقبل cgrp بشري
US20120114667A1 (en) 2008-12-23 2012-05-10 Medimmune Limited TARGETED BINDING AGENTS DIRECTED TO a5BETA1 AND USES THEREOF
US9139647B2 (en) 2008-12-25 2015-09-22 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Diagnosis and treatment of cancer using anti-TM4SF20 antibody
MX2011006908A (es) 2008-12-26 2011-10-06 Univ Tokio Diagnosis y tratamiento del cancer utilizando el anticuerpo anti-lgr7.
US8309530B2 (en) 2009-02-04 2012-11-13 Washington State University Compositions and methods for modulating ghrelin-mediated conditions
RU2015132478A (ru) 2009-03-05 2015-12-10 Эббви Инк. Связывающие il-17 белки
JP2010210772A (ja) 2009-03-13 2010-09-24 Dainippon Screen Mfg Co Ltd 液晶表示装置の製造方法
EP3385279B1 (en) 2009-03-20 2020-02-26 Amgen Inc. Carrier immunoglobulins and uses thereof
WO2010119691A1 (ja) 2009-04-16 2010-10-21 国立大学法人東京大学 抗tmprss11e抗体を用いた癌の診断と治療
JP5812418B2 (ja) 2009-04-17 2015-11-11 イムナス・ファーマ株式会社 Ａβオリゴマーに特異的に結合する抗体およびその利用
KR20120051603A (ko) 2009-05-01 2012-05-22 고쿠리츠다이가쿠호징 도쿄다이가쿠 항카드헤린 항체
SG10201402038WA (en) 2009-05-05 2014-07-30 Amgen Inc FGF21 Mutants And Uses Thereof
US20120052069A1 (en) 2009-05-05 2012-03-01 Amgen Inc Fgf21 mutants and uses thereof
PE20120815A1 (es) 2009-05-05 2012-07-08 Novimmune Sa Anticuerpos anti il-17f y metodos de uso de los mismos
JP5808052B2 (ja) 2009-05-29 2015-11-10 中外製薬株式会社 Ｅｇｆファミリーリガンドのアンタゴニストを成分とする医薬組成物
US9445581B2 (en) 2012-03-28 2016-09-20 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
DK3028564T5 (da) 2009-07-08 2024-04-29 Kymab Ltd Dyremodeller og terapeutiske molekyler
US20120204278A1 (en) 2009-07-08 2012-08-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
WO2011013786A1 (ja) 2009-07-31 2011-02-03 Maeda Shin 癌の転移抑制剤
EP2287336A1 (fr) 2009-07-31 2011-02-23 Exhonit Therapeutics SA Procédés et méthodes de diagnostic de la maladie d'Alzheimer
US20120164659A1 (en) 2009-08-05 2012-06-28 Nexigen Gmbh Human hcv-interacting proteins and methods of use
US8613924B2 (en) 2009-08-06 2013-12-24 Immunas Pharma, Inc. Antibodies that specifically bind to A beta oligomers and use thereof
ES2624835T3 (es) 2009-08-06 2017-07-17 Immunas Pharma, Inc. Anticuerpos que se unen específicamente a los oligómeros A beta y uso de los mismos
AU2010285974A1 (en) 2009-08-17 2012-03-22 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising anti-HB-EGF antibody as active ingredient
WO2011024114A1 (en) 2009-08-25 2011-03-03 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Targeting extracellular matrix molecules for the treatment of cancer
CN102782148B (zh) 2009-08-28 2016-04-20 瑞泽恩制药公司 与多种cc趋化因子结合的抗因子抗体
EP3029070A1 (en) 2009-08-29 2016-06-08 AbbVie Inc. Therapeutic dll4 binding proteins
NZ598929A (en) 2009-09-01 2014-05-30 Abbvie Inc Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
WO2011032148A1 (en) 2009-09-14 2011-03-17 Abbott Laboratories Methods for treating psoriasis
TW201118166A (en) 2009-09-24 2011-06-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd HLA class I-recognizing antibodies
US8926976B2 (en) 2009-09-25 2015-01-06 Xoma Technology Ltd. Modulators
US9885711B2 (en) 2009-09-25 2018-02-06 Xoma Technology Ltd. Screening methods
EP2305285A1 (en) 2009-09-29 2011-04-06 Julius-Maximilians-Universität Würzburg Means and methods for treating ischemic conditions
AR078651A1 (es) 2009-10-15 2011-11-23 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
JO3244B1 (ar) 2009-10-26 2018-03-08 Amgen Inc بروتينات ربط مستضادات il – 23 البشرية
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
TW201121568A (en) 2009-10-31 2011-07-01 Abbott Lab Antibodies to receptor for advanced glycation end products (RAGE) and uses thereof
EP2496604B1 (en) 2009-11-06 2017-08-23 IDEXX Laboratories, Inc. Canine anti-cd20 antibodies
GB0919751D0 (en) 2009-11-11 2009-12-30 King S College Hospital Nhs Fo Conjugate molecule
CN102812045B (zh) 2009-11-13 2018-04-13 第一三共欧洲有限公司 用于治疗或预防人表皮生长因子受体‑3(her‑3)相关疾病的材料和方法
MX2012005864A (es) 2009-11-20 2012-08-31 Amgen Inc Proteinas de enlace al antígeno anti-orai 1 y usos de las mismas.
MX343747B (es) 2009-11-24 2016-11-22 Medimmune Ltd Agentes de union diana contra b7-h1.
US9420770B2 (en) 2009-12-01 2016-08-23 Indiana University Research & Technology Corporation Methods of modulating thrombocytopenia and modified transgenic pigs
UA109888C2 (uk) 2009-12-07 2015-10-26 ІЗОЛЬОВАНЕ АНТИТІЛО АБО ЙОГО ФРАГМЕНТ, ЩО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF І ЇХНІМИ КОМПЛЕКСАМИ
MX2012006560A (es) 2009-12-08 2012-10-05 Abbott Gmbh & Co Kg Anticuerpos monoclonales contra la proteina rgm a para utilizarse en el tratamiento de degeneracion de capa de fibra de nervio retinal.
JP6012473B2 (ja) 2010-01-11 2016-10-25 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 抗ｃｄ２００抗体を用いたヒトの処置における免疫調節効果のバイオマーカー
TWI609698B (zh) 2010-01-20 2018-01-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd 穩定化的含抗體溶液製劑
US8685524B2 (en) 2010-01-29 2014-04-01 Toray Industries, Inc. Polylactic acid-based resin sheet
HUE056313T2 (hu) 2010-01-29 2022-02-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-DLL3 antitest
US20130045492A1 (en) 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
US9796788B2 (en) 2010-02-08 2017-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
PT2505654T (pt) 2010-02-08 2016-11-18 Regeneron Pharma Rato de cadeia leve comum
JP5380553B2 (ja) 2010-02-10 2014-01-08 富士フイルムＲｉファーマ株式会社 放射性金属標識抗カドヘリン抗体
EP2536761B1 (en) 2010-02-19 2017-09-20 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Monoclonal antibodies that inhibit the wnt signaling pathway and methods of production and use thereof
WO2011105573A1 (ja) 2010-02-26 2011-09-01 株式会社未来創薬研究所 抗icam3抗体およびその用途
MY160628A (en) 2010-03-02 2017-03-15 Abbvie Inc Therapeutic DLL4 Binding Proteins
JP5889181B2 (ja) 2010-03-04 2016-03-22 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
TWI667257B (zh) 2010-03-30 2019-08-01 中外製藥股份有限公司 促進抗原消失之具有經修飾的ＦｃＲｎ親和力之抗體
WO2011123708A2 (en) 2010-03-31 2011-10-06 Ablexis Llc Genetic engineering of non-human animals for the production of chimeric antibodies
MX2012011986A (es) 2010-04-15 2013-03-05 Amgen Inc RECEPTOR FGF HUMANO Y PROTEINAS ENLAZADAS A ß-KLOTHO.
MX336196B (es) 2010-04-15 2016-01-11 Abbvie Inc Proteinas de union a amiloide beta.
SG185383A1 (en) 2010-04-30 2012-12-28 Alexion Pharma Inc Anti-c5a antibodies and methods for using the antibodies
KR101539683B1 (ko) 2010-05-14 2015-07-30 애브비 인코포레이티드 Ｉｌ－１ 결합 단백질
EP2578231B1 (en) 2010-05-28 2022-10-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antitumor t cell response enhancer
JP5904552B2 (ja) 2010-05-28 2016-04-13 国立研究開発法人国立がん研究センター 膵癌治療剤
CA2800531C (en) 2010-06-02 2021-05-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Humanized monoclonal antibodies and methods of use
KR20130036276A (ko) 2010-06-22 2013-04-11 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 콜로라도, 어 바디 코포레이트 보체 결합 3의 C3d 조각에 대한 항체들
WO2012006500A2 (en) 2010-07-08 2012-01-12 Abbott Laboratories Monoclonal antibodies against hepatitis c virus core protein
UY33492A (es) 2010-07-09 2012-01-31 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
MY160445A (en) 2010-08-03 2017-03-15 Abbvie Inc Dual Variable Domain Immunoglobulins And Uses Thereof
CA2815154A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 U3 Pharma Gmbh Use of her3 binding agents in prostate treatment
WO2012021648A1 (en) 2010-08-10 2012-02-16 Amgen Inc. Dual function in vitro target binding assay for the detection of neutralizing antibodies against target antibodies
MX358739B (es) 2010-08-14 2018-09-03 Abbvie Inc Star Proteinas de union a amiloide beta.
ES2910305T3 (es) 2010-08-19 2022-05-12 Zoetis Belgium S A Anticuerpos anti-NGF y su uso
JP2013539364A (ja) 2010-08-26 2013-10-24 アッヴィ・インコーポレイテッド 二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用
US9034333B2 (en) 2010-08-27 2015-05-19 University Of Zurich Method for target and drug validation in inflammatory and/or cardiovascular diseases
WO2012028697A1 (en) 2010-09-01 2012-03-08 Eth Zürich, Institute Of Molecular Biology And Biophysics Affinity purification system based on donor strand complementation
KR101879885B1 (ko) 2010-09-17 2018-07-18 박스알타 인코퍼레이티드 약산성 내지 중성 ｐｈ에서 히스티딘을 갖는 수성 제형을 통한 면역글로불린의 안정화
JP6159660B2 (ja) 2010-09-22 2017-07-05 アムジエン・インコーポレーテツド 担体としての免疫グロブリンおよびその使用
WO2012049570A1 (en) 2010-10-11 2012-04-19 Panima Pharmaceuticals Ag Human anti-tau antibodies
MX2013004679A (es) 2010-10-25 2014-02-20 Univ Minnesota Composicion terapeutica para el tratamiento de glioblastoma.
AR083740A1 (es) 2010-10-27 2013-03-20 Amgen Inc Anticuerpos dkk1 (dickkopf-1) y metodos de uso
EP3708586A1 (en) 2010-10-29 2020-09-16 Perseus Proteomics Inc. Anti-cdh3 antibody having high internalization capacity
MX355060B (es) 2010-11-17 2018-04-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molecula multiespecifica de union a antigeno que tiene funcion alternativa a la funcion del factor viii de coagulacion sanguinea.
MX365235B (es) 2010-11-30 2019-05-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molécula de unión a antígeno capaz de unir repetidamente a la pluralidad de moléculas de antígeno.
CN103429737B (zh) 2010-11-30 2020-07-14 中外制药株式会社 细胞毒诱导治疗剂
EP3628689A1 (en) 2010-12-17 2020-04-01 Neurimmune Holding AG Human anti-sod1 antibodies
TW201307388A (zh) 2010-12-21 2013-02-16 Abbott Lab Ｉｌ－１結合蛋白
BR112013015944A2 (pt) 2010-12-21 2018-06-19 Abbvie Inc imunoglobulinas de domínio duplo variável il-1 alpha e beta biespecífico e seus usos.
RU2603097C2 (ru) 2010-12-21 2016-11-20 Селексис Фармасьютикалс Корпорейшн Антитела к р-селектину и способы их применения и идентификации
EP2659270A4 (en) 2010-12-31 2014-05-21 Bioatla Llc GENERATION OF WHOLE MONOCLONAL ANTIBODIES
EP2665822A1 (en) 2011-01-18 2013-11-27 Amgen Inc. Nav1.7 knockout mice and uses thereof
SG192047A1 (en) 2011-01-24 2013-08-30 Univ Singapore Pathogenic mycobacteria-derived mannose-capped lipoarabinomannan antigen binding proteins
US9447187B2 (en) 2011-02-03 2016-09-20 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Use of an anti-CD200 antibody for prolonging the survival of allografts
WO2012104824A1 (en) 2011-02-04 2012-08-09 Ecole polytechnique fédérale de Lausanne (EPFL) Therapeutic antibodies targeting app-c99
WO2012113775A1 (en) 2011-02-21 2012-08-30 University Of Zurich Ankyrin g and modulators thereof for the treatment of neurodegenerative disorders
US20140093496A1 (en) 2011-02-25 2014-04-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fc-gamma-RIIb-SPECIFIC Fc ANTIBODY
WO2012118903A2 (en) 2011-03-01 2012-09-07 Amgen Inc. Bispecific binding agents
EP2500073A1 (en) 2011-03-17 2012-09-19 ChromaCon AG Method for identification and purification of multi-specific polypeptides
WO2012129520A1 (en) 2011-03-24 2012-09-27 Texas Tech University System Tcr mimic antibodies as vascular targeting tools
EP3825325A3 (en) 2011-03-30 2021-10-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Retention of antigen-binding molecules in blood plasma and method for modifying immunogenicity
MX356426B (es) 2011-04-04 2018-05-29 Univ Iowa Res Found Metodos para mejorar inmunogenicidad de vacuna.
CA2831957A1 (en) 2011-04-07 2012-10-11 Amgen Inc. Novel egfr binding proteins
WO2012142164A1 (en) 2011-04-12 2012-10-18 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Human monoclonal antibodies that bind insulin-like growth factor (igf) i and ii
US20140193420A1 (en) 2011-04-18 2014-07-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Diagnosis and treatment of cancer using anti-itm2a antibody
EP2702077A2 (en) 2011-04-27 2014-03-05 AbbVie Inc. Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
JOP20200043A1 (ar) 2011-05-10 2017-06-16 Amgen Inc طرق معالجة أو منع الاضطرابات المختصة بالكوليسترول
CN103842383B (zh) 2011-05-16 2017-11-03 健能隆医药技术（上海）有限公司 多特异性fab融合蛋白及其使用方法
WO2012158989A2 (en) 2011-05-19 2012-11-22 The Regents Of The University Of Michigan Integrin alpha-2 binding agents and use thereof to inhibit cancer cell proliferation
EP2530088A1 (en) 2011-05-30 2012-12-05 Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München Means and methods for diagnosing and treating multiple sclerosis
CN108424451B (zh) 2011-06-03 2022-09-09 佐马技术有限公司 对TGF-β具有特异性的抗体
US9574002B2 (en) 2011-06-06 2017-02-21 Amgen Inc. Human antigen binding proteins that bind to a complex comprising β-Klotho and an FGF receptor
AU2012271329A1 (en) 2011-06-17 2013-12-19 Amgen Inc. Method of treating or ameliorating metabolic disorders using Clec-2
DK2723379T3 (en) 2011-06-23 2018-10-15 Biogen Int Neuroscience Gmbh ANTI-ALPHA SYNUCLEIN BINDING MOLECULES
DK2728002T3 (da) 2011-06-30 2022-04-04 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Heterodimeriseret polypeptid
DE202011103324U1 (de) 2011-07-12 2012-01-02 Nekonal S.A.R.L. Therapeutische anti-TIRC7 Antikörper für die Verwendung in Immun und anderen Krankheiten
MX2014000531A (es) 2011-07-13 2014-12-05 Abbvie Inc Metodos y composiciones para el tratamiento del asma usando anticuerpos anti-il-13.
WO2013012022A1 (ja) 2011-07-19 2013-01-24 中外製薬株式会社 アルギニンアミドまたはその類似化合物を含む安定なタンパク質含有製剤
WO2013017656A1 (en) 2011-08-02 2013-02-07 Medizinische Universität Wien Antagonists of ribonucleases for treating obesity
WO2013017691A1 (en) 2011-08-04 2013-02-07 Medizinische Universität Innsbruck Cahgt1p inhibitors for use in the treatment of candidiasis
EP3865581A1 (en) 2011-08-05 2021-08-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized universal light chain mice
WO2013027802A1 (ja) 2011-08-23 2013-02-28 中外製薬株式会社 抗腫瘍活性を有する新規な抗ｄｄｒ１抗体
EP2749641B1 (en) 2011-09-07 2021-06-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cancer stem cell isolation
DK2757875T3 (en) 2011-09-19 2018-01-08 Kymab Ltd MANIPULATION OF IMMUNOGLOBULIN GENE DIVERSITY AND MULTI-ANTIBODY THERAPEUTICS
EP2761008A1 (en) 2011-09-26 2014-08-06 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
CA2791109C (en) 2011-09-26 2021-02-16 Merus B.V. Generation of binding molecules
TW201817745A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
US20150050269A1 (en) 2011-09-30 2015-02-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities
EP2760471B9 (en) 2011-09-30 2017-07-19 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Therapeutic peptides
SG11201401101XA (en) 2011-09-30 2014-08-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-binding molecule for promoting loss of antigens
CA2850322C (en) 2011-09-30 2023-10-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule inducing immune response to target antigen
WO2013046722A1 (ja) 2011-09-30 2013-04-04 中外製薬株式会社 イオン濃度依存性結合分子ライブラリ
US20140248294A1 (en) 2011-10-05 2014-09-04 University Of Bremen Wnt4 and med12 for use in the diagnosis and treatment of tumor diseases
EP2765192A4 (en) 2011-10-05 2015-04-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd ANTIGEN BINDING MOLECULE FOR PROMOTING THE PLASMA CLAIR OF AN ANTIGEN COMPRISING A SACCHARIDIC CHAIN TYPE RECEPTOR BINDING DOMAIN
CN103998598A (zh) 2011-10-17 2014-08-20 米纳瓦生物技术公司 用于干细胞增殖和诱导的培养基
CN104011068A (zh) 2011-10-21 2014-08-27 奥古雷克斯生命科学公司 衍生自瓜氨酸化的14-3-3的抗原及其在风湿性关节炎诊断中的用途
RS20140203A1 (en) 2011-10-24 2014-10-31 Abbvie Inc. IMMUNOVELING PROTEINS AGAINST TNF
SG11201401791WA (en) 2011-10-24 2014-08-28 Abbvie Inc Immunobinders directed against sclerostin
JP6291254B2 (ja) 2011-10-28 2018-03-14 中外製薬株式会社 癌幹細胞特異的分子
US11851476B2 (en) 2011-10-31 2023-12-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule having regulated conjugation between heavy-chain and light-chain
KR20140076602A (ko) 2011-11-08 2014-06-20 화이자 인코포레이티드 항-m-csf 항체를 사용한 염증성 장애의 치료 방법
KR20140091064A (ko) 2011-11-16 2014-07-18 암젠 인크 표피 성장 인자 결실 돌연변이체 vⅲ 관련 장애를 치료하는 방법
US20150056182A1 (en) 2011-11-30 2015-02-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Drug containing carrier into cell for forming immune complex
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
CA2858572C (en) 2011-12-08 2023-01-17 Amgen Inc. Human lcat antigen binding proteins and their use in therapy
EP2602621A1 (en) 2011-12-08 2013-06-12 Julius-Maximilians-Universität Würzburg LASP-1, a novel urinary marker for transitional cell carcinoma detection
CN104136462B (zh) 2011-12-14 2017-06-09 艾伯维德国有限责任两合公司 用于诊断和治疗铁相关病症的组合物和方法
AU2012352168C1 (en) 2011-12-14 2018-01-25 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Composition and method for the diagnosis and treatment of iron-related disorders
WO2013096516A1 (en) 2011-12-19 2013-06-27 Xoma Technology Ltd. Methods for treating acne
US20150030602A1 (en) 2011-12-23 2015-01-29 Phenoquest Ag Antibodies for the treatment and diagnosis of affective and anxiety disorders
CA2861793C (en) 2011-12-28 2023-08-01 Immunoqure Ag Method of providing monoclonal auto-antibodies with desired specificity
TWI593705B (zh) 2011-12-28 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Humanized anti-epiregulin antibody and cancer therapeutic agent containing the antibody as an active ingredient
EP2797955A2 (en) 2011-12-30 2014-11-05 AbbVie Inc. Dual variable domain immunoglobulins against il-13 and/or il-17
IL297229A (en) 2012-01-27 2022-12-01 Abbvie Inc The composition and method for the diagnosis and treatment of diseases related to the degeneration of nerve cells
DK2812443T3 (da) 2012-02-06 2019-08-26 Inhibrx Inc Cd47-antistoffer og fremgangsmåder til anvendelse deraf
SG11201404751UA (en) 2012-02-09 2014-09-26 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Modified fc region of antibody
EP2816893A1 (en) 2012-02-22 2014-12-31 Amgen Inc. Autologous mammalian models derived from induced pluripotent stem cells and related methods
TW202015731A (zh) 2012-02-24 2020-05-01 日商中外製藥股份有限公司 經FcγRIIB促進抗原消失之抗原結合分子
US20140013456A1 (en) 2012-03-16 2014-01-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Histidine Engineered Light Chain Antibodies and Genetically Modified Non-Human Animals for Generating the Same
NZ730271A (en) 2012-03-16 2022-09-30 Regeneron Pharma Non-human animals expressing ph-sensitive immunoglobulin sequences
WO2013138681A1 (en) 2012-03-16 2013-09-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice that produce antigen-binding proteins with ph-dependent binding characteristics
LT2883449T (lt) 2012-03-16 2018-05-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Histidinu modifikuoti lengvosios grandinės antikūnai ir juos gaminantys genetiškai modifikuoti graužikai
US10251377B2 (en) 2012-03-28 2019-04-09 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
WO2013147153A1 (ja) 2012-03-29 2013-10-03 株式会社未来創薬研究所 抗ｌａｍｐ５抗体およびその利用
HUE037613T2 (hu) 2012-03-29 2018-09-28 Novimmune Sa Anti-TLR4 antitestek és azok felhasználása
CN103382223B (zh) 2012-04-01 2015-06-10 上海益杰生物技术有限公司 针对表皮生长因子受体隐蔽表位和t细胞抗原的多功能抗体多肽
CN104220595A (zh) 2012-04-04 2014-12-17 株式会社英仙蛋白质科学 抗cdh3(p-钙粘着蛋白）抗体的药剂偶联物
WO2013155447A1 (en) 2012-04-13 2013-10-17 Children's Medical Center Corporation Tiki inhibitors
US9181572B2 (en) 2012-04-20 2015-11-10 Abbvie, Inc. Methods to modulate lysine variant distribution
US9334319B2 (en) 2012-04-20 2016-05-10 Abbvie Inc. Low acidic species compositions
NZ772318A (en) 2012-04-20 2023-06-30 Merus Nv Methods and means for the production of ig-like molecules
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
IL307989A (en) 2012-04-27 2023-12-01 Novo Nordisk As Human CD30 ligand antigen-binding proteins
EA039663B1 (ru) 2012-05-03 2022-02-24 Амген Инк. Применение антитела против pcsk9 для снижения сывороточного холестерина лпнп и лечения связанных с холестерином расстройств
AU2013256010B2 (en) 2012-05-04 2018-01-04 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Affinity matured anti-CCR4 humanized monoclonal antibodies and methods of use
US9249182B2 (en) 2012-05-24 2016-02-02 Abbvie, Inc. Purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography
DK2857419T3 (da) 2012-05-30 2021-03-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-bindende molekyle til eliminering af aggregerede antigener
CA2874721A1 (en) 2012-05-30 2013-12-05 Tomoyuki Igawa Target tissue-specific antigen-binding molecule
AR092325A1 (es) 2012-05-31 2015-04-15 Regeneron Pharma Formulaciones estabilizadas que contienen anticuerpos anti-dll4 y kit
EP2859018B1 (en) 2012-06-06 2021-09-22 Zoetis Services LLC Caninized anti-ngf antibodies and methods thereof
US11142563B2 (en) 2012-06-14 2021-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule containing modified Fc region
JP2015521625A (ja) 2012-06-22 2015-07-30 シトムクス セラピューティクス，インコーポレイティド 抗−Ｊａｇｇｅｄ１／Ｊａｇｇｅｄ２交差反応性抗体、活性化可能抗−Ｊａｇｇｅｄ抗体及びそれらの使用方法
EP2876160B1 (en) 2012-07-06 2020-05-13 Kyoto Prefectural Public University Corporation Differentiation marker for and differentiation control for ocular cells
AR091755A1 (es) 2012-07-12 2015-02-25 Abbvie Inc Proteinas de union a il-1
EP3597747B1 (en) 2012-08-24 2023-03-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Mouse fcgammarii-specific fc antibody
MX371442B (es) 2012-08-24 2020-01-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd VARIANTE DE LA REGION FC ESPECIFICA PARA FCyRIIB.
EP3718556A3 (en) 2012-08-31 2020-12-30 University Of Virginia Patent Foundation Target peptides for immunotherapy and diagnostics
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
KR20150043523A (ko) 2012-09-02 2015-04-22 애브비 인코포레이티드 단백질 불균일성의 제어 방법
AU2013312529A1 (en) 2012-09-05 2015-04-16 The University Of Birmingham Target peptides for colorectal cancer therapy and diagnostics
JP6352924B2 (ja) 2012-09-19 2018-07-04 ダナ−ファーバー キャンサー インスティテュート， インコーポレイテッド ダイナミックｂｈ３プロファイリング
EP2711016A1 (en) 2012-09-21 2014-03-26 Covagen AG Novel IL-17A binding molecules and medical uses thereof
EA031631B1 (ru) 2012-09-27 2019-01-31 Чугаи Сеияку Кабушики Каиша Способ лечения или предупреждения злокачественного новообразования, способ отбора пациента, способ тестирования предрасположенности к злокачественному новообразованию у субъекта, гибридный полипептид и его применения
US11078518B2 (en) 2012-09-28 2021-08-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for evaluating blood coagulation reaction
CA3139031A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Human monoclonal anti-pd-l1 antibodies and methods of use
KR20210111353A (ko) 2012-11-01 2021-09-10 애브비 인코포레이티드 항-ｖｅｇｆ／ｄｌｌ4 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
HUE039920T2 (hu) 2012-11-08 2019-02-28 Univ Miyazaki Transzferrin receptor specifikusan felismerni képes antitest
CA2892585C (en) 2012-12-03 2022-07-05 Novimmune S.A. Anti-cd47 antibodies and methods of use thereof
US20160000893A1 (en) 2012-12-13 2016-01-07 University Of Virginia Patent Foundation Target peptides for ovarian cancer therapy and diagnostics
LT2935326T (lt) 2012-12-21 2020-12-10 Biogen Ma Inc. Žmogaus antikūnai prieš tau baltymą
WO2014104165A1 (ja) 2012-12-27 2014-07-03 中外製薬株式会社 ヘテロ二量化ポリペプチド
CA2896824A1 (en) 2012-12-31 2014-07-03 Neurimmune Holding Ag Recombinant human antibodies for therapy and prevention of polyomavirus-related diseases
EP2948478B1 (en) 2013-01-25 2019-04-03 Amgen Inc. Antibodies targeting cdh19 for melanoma
JO3519B1 (ar) 2013-01-25 2020-07-05 Amgen Inc تركيبات أجسام مضادة لأجل cdh19 و cd3
SG10201706383XA (en) 2013-02-06 2017-09-28 Inhibrx Lp Non-platelet depleting and non-red blood cell depleting cd47 antibodies and methods of use thereof
SG11201507230PA (en) 2013-03-12 2015-10-29 Abbvie Inc Human antibodies that bind human tnf-alpha and methods of preparing the same
CN105228649B (zh) 2013-03-14 2019-01-18 雅培制药有限公司 Hcv抗原-抗体组合测定和方法以及用在其中的组合物
US8921526B2 (en) 2013-03-14 2014-12-30 Abbvie, Inc. Mutated anti-TNFα antibodies and methods of their use
MX2015012824A (es) 2013-03-14 2016-06-24 Abbott Lab Antigenos recombinantes ns3 del vhc y mutantes de los mismos para la deteccion mejorada de anticuerpos.
WO2014159242A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Novartis Ag Notch 3 mutants and uses thereof
KR20160043927A (ko) 2013-03-14 2016-04-22 파카쉬 길 세포 표면 grp78에 결합하는 항체를 사용하는 암 치료
US20140271629A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Amgen Inc. Chrdl-1 antigen binding proteins and methods of treatment
US9371374B2 (en) 2013-03-14 2016-06-21 Abbott Laboratories HCV core lipid binding domain monoclonal antibodies
US9499614B2 (en) 2013-03-14 2016-11-22 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosaccharides
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
EP3683237A1 (en) 2013-03-15 2020-07-22 Amgen Inc. Human pac1 antibodies
WO2014144553A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Inc. Secreted frizzle-related protein 5 (sfrp5) binding proteins and methods of treatment
US9469686B2 (en) 2013-03-15 2016-10-18 Abbott Laboratories Anti-GP73 monoclonal antibodies and methods of obtaining the same
EP2970459A2 (en) 2013-03-15 2016-01-20 AbbVie Inc. Dual specific binding proteins directed against il-1beta and il-17
JP6397886B2 (ja) 2013-03-15 2018-09-26 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド 治療用ペプチド
US9505849B2 (en) 2013-03-15 2016-11-29 Amgen Research (Munich) Gmbh Antibody constructs for influenza M2 and CD3
ES2753950T3 (es) 2013-03-15 2020-04-15 Amgen Res Munich Gmbh Moléculas de unión monocatenarias que comprenden ABP del extremo N
US9920377B2 (en) 2013-03-15 2018-03-20 Sutter West Bay Hospitals FALZ for use as a target for therapies to treat cancer
AU2014227909C1 (en) 2013-03-15 2021-11-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Flavivirus neutralizing antibodies and methods of use thereof
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
EP3783017A1 (en) 2013-04-02 2021-02-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fc region variant
US9783618B2 (en) 2013-05-01 2017-10-10 Kymab Limited Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics
US11707056B2 (en) 2013-05-02 2023-07-25 Kymab Limited Animals, repertoires and methods
US9783593B2 (en) 2013-05-02 2017-10-10 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
CN107460201A (zh) 2013-05-08 2017-12-12 科济生物医药（上海）有限公司 编码gpc‑3嵌合抗原受体蛋白的核酸及表达gpc‑3嵌合抗原受体蛋白的t淋巴细胞
WO2014185550A1 (en) 2013-05-16 2014-11-20 Kyoto University Method for determining prognosis of cancer
WO2014197885A2 (en) 2013-06-07 2014-12-11 Duke University Inhibitors of complement factor h
EP3009518B1 (en) 2013-06-11 2020-08-12 National Center of Neurology and Psychiatry Method for predicting post-therapy prognosis of relapsing-remitting multiple sclerosis (rrms) patient, and method for determining applicability of novel therapy
BR112015032414A2 (pt) 2013-06-24 2017-11-07 Chugai Pharmaceutical Co Ltd agente terapêutico compreendendo anticorpo antiepirregulina humanizado como ingrediente ativo para carcinoma de pulmão de célula não pequena excluindo adenocarcinoma
JP6267792B2 (ja) 2013-06-28 2018-01-24 アムジエン・インコーポレーテツド ホモ接合性家族性高コレステロール血症の治療方法
US10112995B2 (en) 2013-07-03 2018-10-30 Immunoqure Ag Human anti-IFN-α antibodies
EP2820947A1 (en) 2013-07-05 2015-01-07 B Cell Design Transgenic non-human mammal for producing chimeric human immunoglobulin E antibodies
US10077304B2 (en) 2013-08-14 2018-09-18 The Governing Council Of The University Of Toronto Antibodies against frizzled receptor
TW201605896A (zh) 2013-08-30 2016-02-16 安美基股份有限公司 Gitr抗原結合蛋白
JP6663852B2 (ja) 2013-09-19 2020-03-13 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド Ｂｈ３プロファイリングの方法
WO2015041310A1 (ja) 2013-09-20 2015-03-26 中外製薬株式会社 抗プロテインｃ抗体による出血性疾患の治療
DK3050896T3 (da) 2013-09-27 2021-07-19 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fremgangsmåde til fremstilling af en polypeptid-heteromultimer
EP3794941A1 (en) 2013-10-01 2021-03-24 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9598667B2 (en) 2013-10-04 2017-03-21 Abbvie Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
US8946395B1 (en) 2013-10-18 2015-02-03 Abbvie Inc. Purification of proteins using hydrophobic interaction chromatography
CN113278076A (zh) 2013-11-11 2021-08-20 中外制药株式会社 含有改变了抗体可变区的抗原结合分子
US20150139988A1 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
SG11201604495PA (en) 2013-12-04 2016-07-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-binding molecules, the antigen-binding activity of which varies according to the concentration of compounds, and libraries of said molecules
BR112016012358A2 (pt) 2013-12-06 2017-09-26 Dana Farber Cancer Inst Inc peptídios terapêuticos
TW201609093A (zh) 2013-12-27 2016-03-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Ｆｇｆｒ門控蛋白變異基因及以其爲標的之醫藥
BR112016014824A2 (pt) 2013-12-27 2017-09-19 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Método para purificar anticorpo que tem ponto isoelétrico baixo
CN103865920B (zh) * 2013-12-31 2016-06-01 广州达恩基因科技有限公司 胚胎干细胞特有小分子多肽es61编码基因的克隆方法
TW201532513A (zh) * 2014-01-10 2015-09-01 Alfur Fu-Hsin Hung 能產生比小鼠ＩgＥ量高出許多的人源化ＩgＥ之基因轉殖動物
CN104774264B (zh) 2014-01-15 2018-09-14 上海易乐生物技术有限公司 抗人proBDNF单克隆抗体及其在疼痛中的作用
DK3105252T3 (da) 2014-02-12 2019-10-14 Michael Uhlin Bispecifikke antistoffer til anvendelse ved stamcelletransplantation
CA2939006A1 (en) 2014-03-14 2015-09-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Vaccine compositions and methods for restoring nkg2d pathway function against cancers
WO2015143194A2 (en) 2014-03-19 2015-09-24 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Immunogenetic restriction on elicitation of antibodies
EP3119194B1 (en) 2014-03-21 2021-04-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that make single domain binding proteins
SG10201808565QA (en) 2014-03-31 2018-11-29 Debiopharm Int Sa Fgfr fusions
EP4112070A1 (en) 2014-04-25 2023-01-04 Dana Farber Cancer Institute, Inc. Middle east respiratory syndrome coronavirus neutralizing antibodies and methods of use thereof
ES2750648T3 (es) 2014-04-30 2020-03-26 Klinikum Rechts Der Isar Der Technischen Univ Muenchen Diagnóstico de esclerosis múltiple
MX2016014761A (es) 2014-05-16 2017-05-25 Amgen Inc Ensayo para detectar poblaciones celulares linfocitos t colaboradores 1 (th1) y linfocitos t colaboradores (th2).
EP3145953A1 (en) 2014-05-21 2017-03-29 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for treating cancer with anti bip or anti mica antibodies
TWI695011B (zh) 2014-06-18 2020-06-01 美商梅爾莎納醫療公司 抗ｈｅｒ２表位之單株抗體及其使用之方法
TWI831106B (zh) 2014-06-20 2024-02-01 日商中外製藥股份有限公司 用於因第viii凝血因子及/或活化的第viii凝血因子的活性降低或欠缺而發病及/或進展的疾病之預防及/或治療之醫藥組成物
CN112979828A (zh) 2014-07-17 2021-06-18 恺兴生命科技(上海)有限公司 靶向cld18a2的t淋巴细胞及其制备方法和应用
TW201609811A (zh) 2014-07-31 2016-03-16 安美基研究（慕尼黑）公司 具有增強之組織分布之雙特異性單鏈抗體構築體
AR101669A1 (es) 2014-07-31 2017-01-04 Amgen Res (Munich) Gmbh Constructos de anticuerpos para cdh19 y cd3
WO2016016859A1 (en) 2014-07-31 2016-02-04 Amgen Research (Munich) Gmbh Optimized cross-species specific bispecific single chain antibody constructs
EP4056993A1 (en) 2014-08-20 2022-09-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for measuring viscosity of protein solution
WO2016040767A2 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Amgen Inc. Chrdl-1 epitopes and antibodies
MX2017003247A (es) 2014-09-15 2017-11-30 Amgen Inc Proteina de union a antigenos, bi-especificos del receptor anti-cgrp/receptor pac1 y usos de las mismas.
WO2016044588A1 (en) 2014-09-19 2016-03-24 The Regents Of The University Of Michigan Staphylococcus aureus materials and methods
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
SG10201902850TA (en) 2014-09-30 2019-04-29 Neurimmune Holding Ag Human-derived anti-dipeptide repeats (dprs) antibody
RU2017115315A (ru) 2014-10-03 2018-11-08 Дана-Фарбер Кэнсер Инститьют, Инк. Антитела к рецептору глюкокортикоид-индуцированного фактора некроза опухоли (gitr) и способы их применения
WO2016057488A1 (en) 2014-10-06 2016-04-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Humanized cc chemokine receptor 4 (ccr4) antibodies and methods of use thereof
AU2015332577B2 (en) 2014-10-15 2021-12-23 Amgen Inc. Promoter and regulatory elements for improved expression of heterologous genes in host cells
CN107406503B (zh) 2014-11-18 2021-07-16 詹森药业有限公司 Cd47抗体、方法和用途
US10093733B2 (en) 2014-12-11 2018-10-09 Abbvie Inc. LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins
EP3034620A1 (en) 2014-12-17 2016-06-22 Diaxonhit Compositions and methods for diagnosing thyroid cancer
FR3030758A1 (fr) 2014-12-19 2016-06-24 Inst Nat De La Rech Agronomique (Inra) Marqueurs diagnostiques de la maladie de crohn
EA201791754A1 (ru) 2015-02-05 2019-01-31 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся АНТИТЕЛА, СОДЕРЖАЩИЕ ЗАВИСЯЩИЙ ОТ КОНЦЕНТРАЦИИ ИОНОВ АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ДОМЕН, ВАРИАНТЫ Fc-ОБЛАСТИ, IL-8-СВЯЗЫВАЮЩИЕ АНТИТЕЛА И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
KR101892883B1 (ko) 2015-02-27 2018-10-05 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 Il-6 관련 질환 치료용 조성물
EP3265491A1 (en) 2015-03-03 2018-01-10 Xoma (Us) Llc Treatment of post-prandial hyperinsulinemia and hypoglycemia after bariatric surgery
RU2733496C2 (ru) 2015-03-16 2020-10-02 Гельмгольц Центрум Мюнхен - Дойчес Форшунгсцентрум Фюр Гезундхайт Унд Умвельт (Гмбх) Триспецифические связывающие молекулы для лечения вирусной инфекции гепатита в и связанных состояний
AU2016232749B2 (en) 2015-03-18 2021-09-23 The Johns Hopkins University Novel monoclonal antibody inhibitors targeting potassium channel KCNK9
US11111314B2 (en) 2015-03-19 2021-09-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that select for light chain variable regions that bind antigen
CN108136001B (zh) 2015-04-03 2022-07-29 佐马技术有限公司 使用TGF-β抑制剂和PD-1抑制剂治疗癌症
EP3280730B1 (en) 2015-04-08 2024-01-03 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Humanized influenza monoclonal antibodies and methods of use thereof
HUE061730T2 (hu) 2015-04-17 2023-08-28 Amgen Res Munich Gmbh Bispecifikus antitest-konstrukciók CDH3-hoz és CD3-hoz
AU2016248817A1 (en) 2015-04-17 2017-08-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with coagulation factors and multispecific antibodies
AU2016252609B2 (en) 2015-04-20 2022-06-30 Sumitomo Pharma Oncology, Inc. Predicting response to alvocidib by mitochondrial profiling
JOP20200116A1 (ar) 2015-04-24 2017-06-16 Amgen Inc طرق لعلاج أو الوقاية من الصداع النصفي
US10761086B2 (en) 2015-04-27 2020-09-01 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. High throughput BH3 profiling: a rapid and scalable technology to BH3 profile on low numbers of cells
EP3584260A1 (en) 2015-04-28 2019-12-25 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Rgma binding protein and use thereof
CN107849134B (zh) 2015-05-01 2022-05-03 达纳－法伯癌症研究所公司 用抗ccr4抗体介导细胞因子表达的方法
CN107849073B (zh) 2015-05-18 2020-04-03 特雷罗药物股份有限公司 具有增加的生物利用度的阿伏西地前药
FR3036287A1 (fr) 2015-05-19 2016-11-25 Univ Bordeaux Traitement et detection des trypanosomes
SI3303395T1 (sl) 2015-05-29 2020-03-31 Abbvie Inc. Protitelesa proti CD40 in njihove uporabe
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
TWI796283B (zh) 2015-07-31 2023-03-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｍｓｌｎ及ｃｄ３抗體構築體
TWI793062B (zh) 2015-07-31 2023-02-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｄｌｌ３及ｃｄ３抗體構築體
TWI717375B (zh) 2015-07-31 2021-02-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｃｄ７０及ｃｄ３抗體構築體
TWI744242B (zh) 2015-07-31 2021-11-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Egfrviii及cd3抗體構築體
TWI829617B (zh) 2015-07-31 2024-01-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體
KR20180034538A (ko) 2015-08-03 2018-04-04 톨레로 파마수티컬스, 인크. 암의 치료를 위한 병행 요법
US10253101B2 (en) 2015-08-06 2019-04-09 Xoma (Us) Llc Antibody fragments against the insulin receptor and uses thereof to treat hypoglycemia
MA45352A (fr) 2015-08-07 2018-06-13 Univ Birmingham Identification de glycopeptides associés à mhc de catégorie i comme cibles d'immunothérapie de cancer
AU2016323440B2 (en) 2015-09-15 2023-07-13 Amgen Inc. Tetravalent bispecific and tetraspecific antigen binding proteins and uses thereof
KR102538745B1 (ko) 2015-09-18 2023-06-01 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 Il-8에 결합하는 항체 및 그의 사용
MX2018004041A (es) 2015-10-01 2018-11-09 Amgen Inc Tratamiento de trastornos de acidos biliares.
JP6931329B2 (ja) 2015-11-18 2021-09-01 中外製薬株式会社 免疫抑制機能を有する細胞に対するｔ細胞リダイレクト抗原結合分子を用いた併用療法
US11649293B2 (en) 2015-11-18 2023-05-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for enhancing humoral immune response
WO2017091952A1 (zh) 2015-11-30 2017-06-08 谢彦晖 Akt2在诊断和治疗肿瘤中的用途
US10822408B2 (en) 2015-12-15 2020-11-03 Amgen Inc. PACAP antibodies and uses thereof
MX2018007859A (es) 2015-12-23 2018-11-09 Amgen Inc Metodo para tratar o mejorar trastornos metabolicos con proteinas de union para el receptor peptidico inhibidor gastrico (gipr) en combinacion con agonistas de glp-1.
US20200270363A1 (en) 2015-12-25 2020-08-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody having enhanced activity, and method for modifying same
CR20180420A (es) 2016-02-03 2018-12-05 Amgen Inc Constructos de anticuerpo biespecíficos para bcma y cd3 que se ligan a células t
EA039859B1 (ru) 2016-02-03 2022-03-21 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3
SI3411404T1 (sl) 2016-02-03 2023-01-31 Amgen Research (Munich) Gmbh Konstrukti bispecifičnih protiteles PSMA in CD3, ki aktivirajo T celico
EP3411713B1 (en) 2016-02-05 2021-06-30 NanoView Biosciences, Inc. Detection of exosomes having surface markers
TW202214700A (zh) 2016-03-14 2022-04-16 日商中外製藥股份有限公司 用於癌之治療的細胞傷害誘導治療劑
WO2017157305A1 (en) 2016-03-15 2017-09-21 Generon (Shanghai) Corporation Ltd. Multispecific fab fusion proteins and use thereof
EP4302782A3 (en) 2016-03-15 2024-03-27 Mersana Therapeutics, Inc. Napi2b-targeted antibody-drug conjugates and methods of use thereof
JOP20170091B1 (ar) 2016-04-19 2021-08-17 Amgen Res Munich Gmbh إعطاء تركيبة ثنائية النوعية ترتبط بـ cd33 وcd3 للاستخدام في طريقة لعلاج اللوكيميا النخاعية
JP2018035137A (ja) 2016-07-13 2018-03-08 マブイミューン ダイアグノスティックス エイジーＭａｂｉｍｍｕｎｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ａｇ 新規な抗線維芽細胞活性化タンパク質（ｆａｐ）結合薬剤およびその使用
JP7092744B2 (ja) 2016-07-22 2022-06-28 アムジエン・インコーポレーテツド Ｆｃ含有タンパク質を精製する方法
RU2019104896A (ru) 2016-07-22 2020-08-24 Дана-Фарбер Кэнсер Инститьют, Инк. Антитела к глюкокортикоид-индуцированному рецептору фактора некроза опухоли (gitr) и способы их использования
CN109803680B (zh) 2016-08-01 2024-05-17 佐马美国有限公司 甲状旁腺激素受体1(pth1r)抗体和其用途
CA3035081A1 (en) 2016-09-02 2018-03-08 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Composition and methods of treating b cell disorders
US20190233505A1 (en) 2016-09-06 2019-08-01 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods of treating or preventing zika virus infection
CN109661241A (zh) 2016-09-06 2019-04-19 中外制药株式会社 使用识别凝血因子ix和/或活化凝血因子ix以及凝血因子x和/或活化凝血因子x的双特异性抗体的方法
TW201825674A (zh) 2016-09-09 2018-07-16 美商艾斯合顧問有限公司 表現雙特異性接合分子的溶瘤病毒
JP2019534710A (ja) 2016-09-28 2019-12-05 ゾーマ （ユーエス） リミテッド ライアビリティ カンパニー インターロイキン２に結合する抗体およびその使用
JP2019530875A (ja) 2016-10-03 2019-10-24 アボット・ラボラトリーズＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 患者サンプルにおけるｕｃｈ−ｌ１状況を評価する改善された方法
JP2020503256A (ja) 2016-11-04 2020-01-30 ノビミューン エスアー 抗ｃｄ１９抗体およびそれを使用する方法
US20230137351A1 (en) 2016-11-14 2023-05-04 Amgen Inc. Bispecific or biparatopic antigen binding proteins and uses thereof
WO2018094275A1 (en) 2016-11-18 2018-05-24 Tolero Pharmaceuticals, Inc. Alvocidib prodrugs and their use as protein kinase inhibitors
KR102533814B1 (ko) 2016-11-28 2023-05-19 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 리간드 결합 활성을 조정 가능한 리간드 결합 분자
MX2019007332A (es) 2016-12-19 2019-11-18 Tolero Pharmaceuticals Inc Péptidos indicadores y métodos para caracterizar sensibilidad.
US11773182B2 (en) 2017-01-05 2023-10-03 The Johns Hopkins University Development of new monoclonal antibodies recognizing human prostate-specific membrane antigen (PSMA)
AU2018206279B2 (en) 2017-01-06 2020-09-03 Abl Bio Inc. Anti-alpha-syn antibody and use thereof
JOP20190177A1 (ar) 2017-01-17 2019-07-16 Amgen Inc طريقة لعلاج أو تحسين اضطرابات أيضية باستخدام مساعدات مستقبل glp-1 مقترنة بمناهضات لمستقبل ببتيد مثبط معوي (gipr)
US12016313B2 (en) 2017-01-19 2024-06-25 Omniab Operations, Inc. Human antibodies from transgenic rodents with multiple heavy chain immunoglobulin loci
JOP20190189A1 (ar) 2017-02-02 2019-08-01 Amgen Res Munich Gmbh تركيبة صيدلانية ذات درجة حموضة منخفضة تتضمن بنيات جسم مضاد يستهدف الخلية t
US11016092B2 (en) 2017-03-23 2021-05-25 Abbott Laboratories Methods for aiding in the diagnosis and determination of the extent of traumatic brain injury in a human subject using the early biomarker ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1
WO2018174274A1 (ja) 2017-03-24 2018-09-27 全薬工業株式会社 抗ＩｇＭ／Ｂ細胞表面抗原二重特異性抗体
US20210107994A1 (en) 2017-03-31 2021-04-15 Public University Corporation Nara Medical University Medicinal composition usable for preventing and/or treating blood coagulation factor ix abnormality, comprising multispecific antigen binding molecule replacing function of blood coagulation factor viii
US10722589B2 (en) 2017-04-03 2020-07-28 Covagen Ag FGFR3 binding molecules
JOP20190243A1 (ar) 2017-04-12 2019-10-13 Medimmune Llc علاج الربو بجسم مضاد لـ tslp
WO2018191531A1 (en) 2017-04-15 2018-10-18 Abbott Laboratories Methods for aiding in the hyperacute diagnosis and determination of traumatic brain injury in a human subject using early biomarkers
JOP20190248A1 (ar) 2017-04-21 2019-10-20 Amgen Inc بروتينات ربط مولد ضد trem2 واستخداماته
EP3617316A4 (en) 2017-04-27 2020-12-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha COAGULATION FACTOR IX WITH IMPROVED PHARMACOKINETICS
BR112019022476A2 (pt) 2017-04-28 2020-05-12 Abbott Laboratories Métodos para o auxílio no diagnóstico e determinação hiperagudos de lesão cerebral traumática usando biomarcadores iniciais em pelo menos duas amostras a partir do mesmo ser humano
WO2018203545A1 (ja) 2017-05-02 2018-11-08 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター Ｉｌ－６及び好中球の関連する疾患の治療効果の予測及び判定方法
US10865238B1 (en) 2017-05-05 2020-12-15 Duke University Complement factor H antibodies
AR111773A1 (es) 2017-05-05 2019-08-21 Amgen Inc Composición farmacéutica que comprende constructos de anticuerpos biespecíficos para almacenamiento y administración
AU2018272054A1 (en) 2017-05-25 2019-09-26 Abbott Laboratories Methods for aiding in the determination of whether to perform imaging on a human subject who has sustained or may have sustained an injury to the head using early biomarkers
AU2018272311A1 (en) 2017-05-26 2019-12-19 Novimmune Sa Anti-CD47 x anti-mesothelin antibodies and methods of use thereof
JP7269182B2 (ja) 2017-05-30 2023-05-08 アボット・ラボラトリーズ 心臓トロポニンｉ及び早期バイオマーカーを使用する、ヒト対象における軽度外傷性脳損傷を診断及び査定する一助となるための方法
JOP20190259A1 (ar) 2017-05-31 2019-10-31 Amgen Inc بروتينات ربط مولد ضد مضادة لـ jagged1
WO2018237097A1 (en) 2017-06-20 2018-12-27 Amgen Inc. METHOD OF TREATING OR REDUCING METABOLIC DISORDERS USING GASTRIC INHIBITING PEPTIDE RECEPTOR BINDING PROTEINS (GIPR) IN ASSOCIATION WITH GLP-1 AGONISTS
BR112020000698A2 (pt) 2017-07-14 2020-07-14 Pfizer Inc. anticorpos contra madcam
CA3071852A1 (en) 2017-08-04 2019-02-07 Amgen Inc. Method of conjugation of cys-mabs
WO2019055579A1 (en) 2017-09-12 2019-03-21 Tolero Pharmaceuticals, Inc. TREATMENT REGIME FOR CANCERS THAT ARE INSENSITIVE TO BCL-2 INHIBITORS USING THE MCL-1 ALVOCIDIB INHIBITOR
WO2019078344A1 (ja) 2017-10-20 2019-04-25 学校法人兵庫医科大学 抗ｉｌ－６受容体抗体を含有する術後の癒着を抑制するための医薬組成物
BR112020010248A2 (pt) 2017-11-28 2020-11-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha molécula de ligação do ligante tendo atividade de ligação do ligante ajustável
US11365250B2 (en) 2017-11-29 2022-06-21 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods for cancer therapy
AU2018378084A1 (en) 2017-12-09 2020-05-14 Abbott Laboratories Methods for aiding in diagnosing and evaluating a traumatic brain injury in a human subject using a combination of GFAP and UCH-L1
WO2019113525A2 (en) 2017-12-09 2019-06-13 Abbott Laboratories Methods for aiding in the diagnosis and evaluation of a subject who has sustained an orthopedic injury and that has or may have sustained an injury to the head, such as mild traumatic brain injury (tbi), using glial fibrillary acidic protein (gfap) and/or ubiquitin carboxy-terminal hydrolase l1 (uch-l1)
EA202091422A1 (ru) 2017-12-11 2020-08-28 Эмджен Инк. Способ непрерывного производства продуктов на основе биспецифических антител
US11667713B2 (en) 2017-12-28 2023-06-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
UY38041A (es) 2017-12-29 2019-06-28 Amgen Inc Construcción de anticuerpo biespecífico dirigida a muc17 y cd3
JP7339262B2 (ja) 2018-01-12 2023-09-05 アムジェン インコーポレイテッド Ｐａｃ１抗体及びその使用
JP2021510697A (ja) 2018-01-12 2021-04-30 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ がん処置のための坑ｉｌ−８抗体及び坑ｐｄ−１抗体を用いる組合せ治療
US20210363238A1 (en) 2018-01-31 2021-11-25 Motokazu Kato Therapeutic agent for asthma containing il-6 inhibitor
AU2019234213A1 (en) 2018-03-12 2020-09-03 Zoetis Services Llc Anti-NGF antibodies and methods thereof
CA3093330A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Novimmune Sa Anti-cd3 epsilon antibodies and methods of use thereof
CN112512480A (zh) 2018-05-21 2021-03-16 中外制药株式会社 被封入玻璃容器的冷冻干燥制剂
WO2019225787A1 (ko) 2018-05-24 2019-11-28 에이비엘바이오 주식회사 항-b7-h3 항체 및 그 용도
CN108707599A (zh) * 2018-05-31 2018-10-26 东北农业大学 一种小鼠胚胎干细胞单细胞融合方法
EP3803332A1 (en) 2018-06-01 2021-04-14 NanoView Biosciences, Inc. Compositions, systems, and methods for enhanced label-free and fluorescence - based detection of nanoparticles
AU2019301336B2 (en) 2018-07-10 2022-11-24 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Prevention or treatment method for peripheral neuropathy or pain accompanying disease in which peripheral neuropathy or astrocyte disorder is recognized
US20210301017A1 (en) 2018-07-30 2021-09-30 Amgen Research (Munich) Gmbh Prolonged administration of a bispecific antibody construct binding to cd33 and cd3
MA53330A (fr) 2018-08-03 2021-06-09 Amgen Inc Constructions d'anticorps pour cldn18.2 et cd3
JP2021534779A (ja) 2018-08-27 2021-12-16 アフィメッド ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツンク 抗体構築物がプレロードされた凍結保存ｎｋ細胞
AU2019356564A1 (en) 2018-10-11 2021-04-29 Amgen Inc. Downstream processing of bispecific antibody constructs
US11034710B2 (en) 2018-12-04 2021-06-15 Sumitomo Dainippon Pharma Oncology, Inc. CDK9 inhibitors and polymorphs thereof for use as agents for treatment of cancer
US20220089770A1 (en) 2019-01-24 2022-03-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Novel cancer antigens and antibodies of said antigens
EP3917515A1 (en) 2019-01-29 2021-12-08 Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Treating the causative agent in adhesiogenesis
WO2020160402A1 (en) 2019-02-01 2020-08-06 NanoView Biosciences, Inc. Systems and methods for vesicle cargo labeling and detection
JP6821230B2 (ja) 2019-02-04 2021-01-27 国立大学法人愛媛大学 ＣＡＲライブラリおよびｓｃＦｖの製造方法
US11028176B2 (en) 2019-02-13 2021-06-08 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Anti-peripheral lymph node addressin antibodies and uses thereof
WO2020175689A1 (ja) 2019-02-28 2020-09-03 学校法人順天堂 切断型の変異型Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎに結合する抗体、及び骨髄増殖性腫瘍の診断、予防又は治療薬
US20220153875A1 (en) 2019-03-19 2022-05-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule containing antigen-binding domain of which binding activity to antigen is changed depending on mta, and library for obtaining said antigen-binding domain
US11793802B2 (en) 2019-03-20 2023-10-24 Sumitomo Pharma Oncology, Inc. Treatment of acute myeloid leukemia (AML) with venetoclax failure
CN113906042A (zh) 2019-04-10 2022-01-07 中外制药株式会社 用于纯化fc区修饰抗体的方法
TW202110477A (zh) 2019-04-17 2021-03-16 國立大學法人廣島大學 以組合投予il-6 抑制劑與ccr2 抑制劑為特徵之泌尿器官癌的治療劑
WO2020243477A2 (en) 2019-05-30 2020-12-03 Amgen Inc. Engineering the hinge region to drive antibody dimerization
EP4023230A4 (en) 2019-06-05 2023-11-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTIBODY CLEAVAGE SITE BINDING MOLECULE
TW202045711A (zh) 2019-06-13 2020-12-16 美商安進公司 生物製品製造中基於生物量之自動灌注控制
CA3143524A1 (en) 2019-06-28 2020-12-30 Amgen Inc. Anti-cgrp receptor/anti-pac1 receptor bispecific antigen binding proteins
CA3148591A1 (en) 2019-07-26 2021-02-04 Amgen Inc. Anti-il13 antigen binding proteins
US20220306741A1 (en) 2019-09-10 2022-09-29 Amgen Inc. Purification Method for Bispecific antigen-binding Polypeptides with Enhanced Protein L Capture Dynamic Binding Capacity
CN115175680A (zh) 2019-10-18 2022-10-11 加利福尼亚大学董事会 Plxdc激活剂及其用于治疗血管病症的用途
CA3160482A1 (en) 2019-11-08 2021-05-14 Amgen Inc. Engineering charge pair mutations for pairing of hetero-igg molecules
CA3156683A1 (en) 2019-11-13 2021-05-20 Amgen Inc. METHOD FOR REDUCING AGGREGATE FORMATION IN DOWNSTREAM PROCESSING OF BI-SPECIFIC ANTIGEN-BINDING MOLECULES
AU2020386005A1 (en) 2019-11-19 2022-05-26 Amgen Inc. Novel multispecific antibody format
CA3164129A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Amgen Inc. Mesothelin-targeted cd40 agonistic multispecific antibody constructs for the treatment of solid tumors
AR120898A1 (es) 2019-12-26 2022-03-30 Univ Osaka Agente para tratar o prevenir neuromielitis óptica en fase aguda
EP4081554A1 (en) 2019-12-27 2022-11-02 Affimed GmbH Method for the production of bispecific fcyriii x cd30 antibody construct
US20230055626A1 (en) 2020-01-15 2023-02-23 Osaka University Agent for prevention or treatment of diabetic autonomic neuropathy
CA3168209A1 (en) 2020-01-15 2021-07-22 Osaka University Prophylactic or therapeutic agent for dementia
WO2021150824A1 (en) 2020-01-22 2021-07-29 Amgen Research (Munich) Gmbh Combinations of antibody constructs and inhibitors of cytokine release syndrome and uses thereof
BR112022017924A2 (pt) 2020-03-10 2022-12-20 Massachusetts Inst Technology Composições e métodos para imunoterapia de câncer npm1c-positivo
EP4118113A1 (en) 2020-03-12 2023-01-18 Amgen Inc. Method for treatment and prophylaxis of crs in patients comprising a combination of bispecifc antibodies binding to cds x cancer cell and tnfalpha or il-6 inhibitor
AU2021240028A1 (en) 2020-03-19 2022-09-15 Amgen Inc. Antibodies against mucin 17 and uses thereof
EP4129333A4 (en) 2020-03-27 2024-06-12 PhotoQ3 Inc. PHARMACEUTICAL MEDICINAL PRODUCT FOR THE DESTROYING OF TUMOR CELLS
WO2021206078A1 (ja) 2020-04-06 2021-10-14 株式会社ＰｈｏｔｏＱ３ 腫瘍細胞を死滅させるための医薬
WO2021211331A1 (en) 2020-04-13 2021-10-21 Abbott Point Of Care Inc. METHODS, COMPLEXES AND KITS FOR DETECTING OR DETERMINING AN AMOUNT OF A ß-CORONAVIRUS ANTIBODY IN A SAMPLE
JP2023106635A (ja) 2020-04-17 2023-08-02 中外製薬株式会社 二重特異性抗原結合分子ならびに、それに関連する組成物、組成物の製造のための使用、キット、および方法
CA3183756A1 (en) 2020-05-19 2021-11-25 Amgen Inc. Mageb2 binding constructs
JPWO2021235537A1 (fi) 2020-05-22 2021-11-25
JP2023527972A (ja) 2020-05-29 2023-07-03 アムジエン・インコーポレーテツド Ｃｄ３３及びｃｄ３に結合する二重特異性コンストラクトの有害作用軽減投与
US20230235080A1 (en) 2020-06-03 2023-07-27 Bionecure Therapeutics, Inc. Trophoblast cell-surface antigen-2 (trop-2) antibodies
CA3183316A1 (en) 2020-06-18 2021-12-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Activin a antibody formulations and methods of use thereof
EP4174071A1 (en) 2020-06-24 2023-05-03 The University of Tokyo Photosensitizing dye
WO2022006562A1 (en) 2020-07-03 2022-01-06 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Multispecific coronavirus antibodies
CA3189336A1 (en) 2020-07-24 2022-01-27 Amgen Inc. Immunogens derived from sars-cov2 spike protein
TW202220694A (zh) 2020-07-28 2022-06-01 日商中外製藥股份有限公司 含有新穎之改變型抗體、具有針套的帶針頭預填充注射器製劑
KR20230048059A (ko) 2020-07-31 2023-04-10 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 키메라 수용체를 발현하는 세포를 포함하는 의약 조성물
WO2022031804A1 (en) 2020-08-04 2022-02-10 Abbott Laboratories Improved methods and kits for detecting sars-cov-2 protein in a sample
JP2023538897A (ja) 2020-08-20 2023-09-12 アムジエン・インコーポレーテツド Ｆａｂ領域中に非標準的なジスルフィドを有する抗原結合タンパク質
JPWO2022045247A1 (fi) 2020-08-27 2022-03-03
JP2023544769A (ja) 2020-10-07 2023-10-25 アムジエン・インコーポレーテツド 多重特異性抗体の構築のためのビルディングブロックの合理的選択
US20230365709A1 (en) 2020-10-08 2023-11-16 Affimed Gmbh Trispecific binders
US12006550B2 (en) 2020-10-12 2024-06-11 University Of South Carolina Targeting treatment for ADAM30 in pathological cells
CN116323671A (zh) 2020-11-06 2023-06-23 安进公司 具有增加的选择性的多靶向性双特异性抗原结合分子
TW202225188A (zh) 2020-11-06 2022-07-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 與ｃｄ３結合的多肽構建體
CA3199976A1 (en) 2020-11-06 2022-05-12 Amgen Research (Munich) Gmbh Polypeptide constructs selectively binding to cldn6 and cd3
KR20230098335A (ko) 2020-11-06 2023-07-03 암젠 인크 클리핑 비율이 감소된 항원 결합 도메인
TW202233663A (zh) 2020-11-10 2022-09-01 美商安進公司 多特異性抗原結合結構域之新穎的連接子
WO2023102384A1 (en) 2021-11-30 2023-06-08 Abbott Laboratories Use of one or more biomarkers to determine traumatic brain injury (tbi) in a subject having received a head computerized tomography scan that is negative for a tbi
WO2022119841A1 (en) 2020-12-01 2022-06-09 Abbott Laboratories Use of one or more biomarkers to determine traumatic brain injury (tbi) in a subject having received a head computerized tomography scan that is negative for a tbi
EP4271998A1 (en) 2020-12-30 2023-11-08 Abbott Laboratories Methods for determining sars-cov-2 antigen and anti-sars-cov-2 antibody in a sample
CN117320749A (zh) 2021-03-12 2023-12-29 中外制药株式会社 用于治疗或预防重症肌无力的药物组合物
CA3212056A1 (en) 2021-03-22 2022-09-29 Xavier CHAUCHET Bispecific antibodies targeting cd47 and pd-l1 and methods of use thereof
IL305828A (en) 2021-03-22 2023-11-01 Novimmune Sa Bispecific antibodies targeting CD47 and PD-L1 and methods of using them
WO2022212831A1 (en) 2021-04-02 2022-10-06 Amgen Inc. Mageb2 binding constructs
JP2024515301A (ja) 2021-04-20 2024-04-08 アムジエン・インコーポレーテツド 多重特異性及び一価のｉｇｇ分子の会合における鎖対形成の静電ステアリングにおけるバランスのとれた電荷分布
WO2022232376A1 (en) 2021-04-29 2022-11-03 Amgen Inc. Methods for reducing low molecular weight species of recombinantly-produced proteins
EP4334354A1 (en) 2021-05-06 2024-03-13 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Antibodies against alk and methods of use thereof
CA3217180A1 (en) 2021-05-06 2022-11-10 Amgen Research (Munich) Gmbh Cd20 and cd22 targeting antigen-binding molecules for use in proliferative diseases
BR112023024169A2 (pt) 2021-05-18 2024-02-06 Abbott Lab Métodos para avaliar lesão cerebral em um indivíduo pediátrico
EP4356129A1 (en) 2021-06-14 2024-04-24 Abbott Laboratories Methods of diagnosing or aiding in diagnosis of brain injury caused by acoustic energy, electromagnetic energy, an over pressurization wave, and/or blast wind
WO2023007023A1 (en) 2021-07-30 2023-02-02 Affimed Gmbh Duplexbodies
WO2023034777A1 (en) 2021-08-31 2023-03-09 Abbott Laboratories Methods and systems of diagnosing brain injury
WO2023048231A1 (ja) 2021-09-24 2023-03-30 株式会社PhotoQ3 腫瘍細胞を死滅させるための医薬
WO2023056268A1 (en) 2021-09-30 2023-04-06 Abbott Laboratories Methods and systems of diagnosing brain injury
CN118043031A (zh) 2021-10-04 2024-05-14 诺华股份有限公司 表面活性剂稳定剂
JPWO2023058723A1 (fi) 2021-10-08 2023-04-13
CA3233696A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 Joachim Koch Bispecific cd16a binders
CA3237018A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 Joachim Koch Bispecific cd16a binders
AU2022383057A1 (en) 2021-11-05 2024-05-16 Abviro Llc Human broadly crossreactive influenza monoclonal antibodies and methods of use thereof
CA3238936A1 (en) 2021-11-24 2023-06-01 Wayne A. Marasco Antibodies against ctla-4 and methods of use thereof
AU2022413677A1 (en) 2021-12-17 2024-06-27 Abbott Laboratories Systems and methods for determining uch-l1, gfap, and other biomarkers in blood samples
WO2023114543A2 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Platform for antibody discovery
WO2023114544A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Antibodies and uses thereof
WO2023129942A1 (en) 2021-12-28 2023-07-06 Abbott Laboratories Use of biomarkers to determine sub-acute traumatic brain injury (tbi) in a subject having received a head computerized tomography (ct) scan that is negative for a tbi or no head ct scan
WO2023150652A1 (en) 2022-02-04 2023-08-10 Abbott Laboratories Lateral flow methods, assays, and devices for detecting the presence or measuring the amount of ubiquitin carboxy-terminal hydrolase l1 and/or glial fibrillary acidic protein in a sample
WO2023178357A1 (en) 2022-03-18 2023-09-21 Evolveimmune Therapeutics, Inc. Bispecific antibody fusion molecules and methods of use thereof
WO2023218027A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Amgen Research (Munich) Gmbh Multichain multitargeting bispecific antigen-binding molecules of increased selectivity
WO2024006876A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Abbott Laboratories Magnetic point-of-care systems and assays for determining gfap in biological samples
WO2024039672A2 (en) 2022-08-15 2024-02-22 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Antibodies against msln and methods of use thereof
WO2024039670A1 (en) 2022-08-15 2024-02-22 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Antibodies against cldn4 and methods of use thereof
WO2024059675A2 (en) 2022-09-14 2024-03-21 Amgen Inc. Bispecific molecule stabilizing composition
WO2024059708A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Abbott Laboratories Biomarkers and methods for differentiating between mild and supermild traumatic brain injury
WO2024084052A1 (en) 2022-10-21 2024-04-25 Novimmune Sa Pd-l1xcd28 bispecific antibodies for immune checkpoint-dependent t cell activation

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69133566T2 (de) * 1990-01-12 2007-12-06 Amgen Fremont Inc. Bildung von xenogenen Antikörpern
KR100272077B1 (ko) * 1990-08-29 2000-11-15 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물
GB9119338D0 (en) * 1991-09-10 1991-10-23 Inst Of Animal Physiology And Control of gene expression
NZ253943A (en) * 1992-06-18 1997-01-29 Genpharm Int Transfering polynucleotides into eukaryotic cells using co-lipofection complexes of a cationic lipid and the polynucleotide

Also Published As

Publication number Publication date
JP2007125020A (ja) 2007-05-24
EP0652950A1 (en) 1995-05-17
AU4781993A (en) 1994-02-14
AU675661B2 (en) 1997-02-13
EP0652950B1 (en) 2007-12-19
FI950277A (fi) 1995-03-21
NO328075B1 (no) 2009-11-23
JPH07509137A (ja) 1995-10-12
CA2140638A1 (en) 1994-02-03
NO950244D0 (no) 1995-01-23
FI950277A0 (fi) 1995-01-23
CA2140638C (en) 2010-05-04
ATE381614T1 (de) 2008-01-15
EP0652950A4 (en) 1997-05-07
WO1994002602A1 (en) 1994-02-03
SG48760A1 (en) 2003-03-18
NZ255101A (en) 1997-08-22
NO950244L (no) 1995-03-23
ES2301158T3 (es) 2008-06-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI121339B (fi) Geneettisesti muunnetut hiiret ihmisen vasta-aineiden tuottamiseen, ja menetelmät niiden valmistamiseksi
US6114598A (en) Generation of xenogeneic antibodies
US6162963A (en) Generation of Xenogenetic antibodies
JP2938569B2 (ja) 異種免疫グロブリンを作る方法及びトランスジェニックマウス
CA2432133C (en) Transgenic animals comprising a humanized immune system
US20040010810A1 (en) Generation of xenogeneic antibodies
US10149461B2 (en) Immunocompromised ungulates
JPH10512449A (ja) 融合細胞のスクリーニング効率を改良する方法
JP2008136494A (ja) 異種抗体の生産

Legal Events

Date Code Title Description
PC Transfer of assignment of patent

Owner name: AMGEN FREMONT INC.

Free format text: AMGEN FREMONT INC.

FG Patent granted

Ref document number: 121339

Country of ref document: FI